KR101847170B1

KR101847170B1 - 암 치료 방법

Info

Publication number: KR101847170B1
Application number: KR1020127033777A
Authority: KR
Inventors: 마리벨 구에라 벨리스피; 훌리오 라울 페르난데스 메쏘; 알렉시스 무사치오 라사; 죠바니스 길 발데스; 오스발두 레예스 아코스타; 브리젤다 메이린 올리비아 아귈레스
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2010-05-31
Filing date: 2011-05-31
Publication date: 2018-05-28
Also published as: EP2578227A2; JP2013530162A; RU2012157289A; EP2578227B1; BR112012030668B1; US9145554B2; WO2011150897A2; US8729226B2; AU2011260745A1; CA2799066A1; US20140206621A1; WO2011150897A3; US20130224313A1; JP5827322B2; CA2799066C; CN102917725B; KR20130089167A; MX2012013923A; AU2011260745B2; AR081259A1

Abstract

본 발명은 암세포 증식의 감소 또는 차단과 관련된 COMMD1 단백질의 핵 국소화(unclear localization)를 증가시켜 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 치료를 위한 약물 제조에 있어서 COMMD1 단백질의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 물질(agent)의 용도에 관한 것이다. 이러한 물질(agents)은 다른 화합물들 중, 펩티드 또는 단백질이 될 수 있다. 본 발명은 또한 펩티드의 최적화에 관한 것으로, 서열(sequence) HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW에서 생산되고, 단백질 COMMD의 핵 국소화를 증가시키며, 따라서 이러한 펩티드의 항암 효과(antitumor effect)를 높여준다.

Description

암 치료 방법 {CANCER THERAPY METHOD}

본 발명은 바이오 의약품 분야에 속하는 것으로, 특히 항암제 약물 개발을 위한 새로운 치료 목표를 공개하여 암 치료와 관련한 것이다. 보다 큰 선택성과 효능으로 인해 이러한 약물은 암 환자에게 현재 치료에 있어서 향상에 기여한다. 본 발명에서는 암세포의 핵에 있는 단백질 COMMD1의 발현(expression)과 축적(accumulation)을 통해 암을 치료하는 방법이 설명된다. HARIKPTFRRLKWKYKGKFW 펩티드의 1차 구조에 소개된 화학 수식(chemical modifications)은 펩티드(peptide)의 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo ), 단백질 COMMD1의 핵 국소화(nuclear localization) 및 항종양(antitumor)의 활동을 증가시킨다.

암치료에 대해 주요하게 발전하였음에도 불구하고, 종양 세포로 인한 현재 존재하는 항암 약물(anticancer drugs)에 대한 내성의 발달로 인해, 신규한 기능을 갖는 새로운 항암제(anticancer agent)의 개발에 큰 관심을 보이고 있다. 펩티드(peptide)는 특히 매력적인 치료제를 만드는데 있어서 중요한 생물학적 기능과 독특한 내인성 특성(unique intrinsic properties)의 매개체(mediators)로서의 역할 때문에, 새로운 치료 약물(therapeutic drugs)로 여전히 큰 관심을 받고 있다. 펩티드는 낮은 독성(toxicity) 및 높은 특이성과 관련된 고도의 생물학적 활동(biological activity)을 보여준다. 이러한 특징의 장점은 원하는 대상에 대해 높은 결합 특이성을 포함하고, 약물-약물(drug-drug) 상호 작용을 최소화하고 중간 대사물질(intermediate metabolites)로 인한 합병증(complications)의 위험을 줄여 더 낮은 조직 축적(lower tissue accumulation)이 보고되었다 (Vlieghe 외, 2010, Drug Discovery Today, 15:40-56). 현재 암 개발에 중요한 생물학적 기능을 갖는 특정 대상 단백질에 대한 결합의 선택성(selectivity of binding)과 함께 펩티드 및/또는 저분자(small molecules)를 사용하는 항암 치료가 있다.

첫 번째 시나리오로, 이러한 치료는 특정 단백질 기능을 억제하고 암세포의 세포자살(apoptosis)을 일으키는 표적이 될 수 있다. 예를 들어, 열 충격 단백질의 억제제 (HSP - Inhibitors of Heat Shock Proteins) (Subbarao 외, 2004, Pharmacology & Therapeutics, 101:227-257); 티로신 활성효소 억제제(Tyrosine kinase inhibitors) (Garrido 외, 2007, Rev Med Chil, 10:1327-1332). 일반 조직과 비교하면 상황의 대부분에서 이러한 단백질은 악성 프로세스(malignant process) 중 비정상적으로 간주한다.

두 번째 시나리오로, 약물(drugs)은 정상 조직에 비해 악성 프로세스(malignant process) 중 비정상(aberrant)이거나 아닐 수 있는 단백질에 결합하며, 이러한 경우 악성도(malignancy)의 과정에서 활성화되는 신호 경로가 발생한다. 예를 들면, 디옥시리보핵산(DNA - deoxyribonucleic acid) 복제의 억제, 미세소관(microtubule) 조립의 억제 및 NFkB 전사인자(transcription factor)의 억제이다.

상기 첫 번째 시나리오는 특정 조혈 악성종양(hematopoietic malignancy)에 있어서 매우 효과적이긴 하지만, 이러한 치료의 대부분은 고형종양(solid tumors)의 복잡성으로 효과가 제한된다.

대조적으로, 상기 두 번째 시나리오는 종양학의 약전(oncologic pharmacopoeia)에 있어서 가장 효과적이고 더 많은 독성 암 물질의 일부를 포함한다는 것이다. 이러한 이유로, 그 독성을 최소화하고, 더욱 선택적이고 효과적인 신약에 대한 향상된 연구가 필요하였다. 이 점에서 새로운 치료 대상의 동정(identification)과 암치료 개발에 있어서 그들의 역할을 이해한다는 것은 약제 내성에 대한 새로운 메커니즘(mechanisms)을 선별하고, 더 큰 활동도를 유지하고 기존의 것과 결합할 수 있는 새롭고 향상된 약물을 만드는데 도움이 될 것이고, 암 환자에게 삶의 질을 향상시켜 줄 수 있을 것이다. MURR1으로 이미 알려진 COMMD1 단백질(van de Sluis 외, 2002, 인간 분자 유전학(Human Molecular Genetics), 11:165-173)은 그 약자의 COMMD(Copper Metabolism gene MURR1 Domain, COMMD abbreviated)에 의해 알려진 단백질의 새로운 패밀리(family)에 속한다. 패밀리 단백질과(family proteins)의 10 가지 요소는 다세포성 생물(pluricellular organisms)로 보존되고 보편적으로 표현되지만, 그 요소 대부분의 생물학적 기능은 잘 알려지지 않았다. 이러한 단백질과의 주요한 특징은 COMM 도메인이(Copper Metabolism Murr1 Domain) 존재한다는 것이고, C-말단 영역(C-terminal region)의 아미노산 잔여물(amino acid residue) 110-190 (Burstein 외, 2005, The Journal of Biological Chemistry, 280:22222-22232)을 포함하여 보존되는 독특한 것이라는 것이다. COMMD1은 동대사(copper metabolism)의 조절 (Tao 외, 2003, Journal of Biological Chemistry, 278:41593-41596), 나트륨의 세포 내 수송 (intracellular transport)의 조절(Biasio 외, 2004, Journal of Biological Chemistry, 279:5429-5434), NFkB 전사 인자의 억제 (Maine 외, 2007,The EMBO Journal, 26:436-447), 저산소 혈증 유도인자(HIF: Hypoxia-Inducible Factor)-1α에 의해 조절된 유전자 발현에 대한 억제 (van de Sluis 외, 2007, Molecular and Cellular Biology, 27:4142-4156)와 같은 다양한 생물학적 과정에 연루되어 있음을 시사한다. COMMD1는 NFkB 전사 인자로부터의 RelA(p65) 서브유닛, HIF-1α로부터의 촉매-α 서브유닛(subunit), 및 상피 나트륨 통로(epithelial sodium channels)로 델타(Delta) ENaC와 함께 물리적 상호 작용하는 것을 보여준다.

이러한 상호 작용에 대한 모든 경우에는 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 프로테아솜(proteasome) 열화 경로(degradation pathways)를 수반하는 메커니즘(mechanism)을 통해 이러한 "클라이언트(client)" 단백질의 저하(degradation)로 이어질 수 있다. COMMD도메인(domain)은 COMMD1의 단백질 '클라이언트(client)'뿐만 아니라 패밀리 멤버(family members)간의 상호 작용에 대한 단백질-단백질 상호 작용(protein-protein interactions)과 관련한다는 것을 나타낸다. COMMD1의 N-터미널 영역(N-terminal region)의 3 차원 구조에 대한 제안이 있지만, 여전히 COMM 도메인(domain)에 대한 삼차 구조(tertiary structure)를 이용할 수 없다 (Sommerhalter 외, 2007, Journal of Molecular Biology, 365:715-721).

셀에 COMMD1 기저 발현(basal expression)은 COMM 도메인(domain)에 위치하며, 일련의 류신 잔기(leucine residues)를 통해 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 프로테아좀 분해(proteasomal degradation)에 의해 조절된다 (Maine외, 2009, Biochemical Journal, 417:601-609). 최근에, COMMD1는 또한 COMM 도메인(domain)에 있는 핵 유출 신호(NES - nuclear export signals)를 통해 수송 세포질-핵(transport cytoplasm-nucleus)의 구성 메커니즘(constitutive mechanism)을 갖는다는 것이 보고되었다. 세포에 COMMD1 발현의 증가를 생성하고, 프로테아좀 분해(proteasomal degradation)를 억제하는 물질 및/또는 류신 서열(leucine sequence)을 파괴한다는 것이 보고되었다. 또한, COMMD1에서 핵 유출 신호(NES) 서열의 파괴는 NFkB 및 HIF-1α 요소의 전사 활동(transcriptional activity)의 억제를 증가시켜준다.

암세포는 단백질 XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)와 분비형 클러스터린(secretory clusterin - sCLU)과 같은 서로 다른 단백질을 과도하게 발현시킨다. 두 단백질은 COMMD1의 저하를 촉진하고 NFkB와 종양 세포 생존의 활성화를 촉진시켜 준다. MG132(Shirley 외, 2005, Neoplasia, 7:1104-1111; Zhou 외, 2009, Cancer Research, 21:333-339)와 같은 프로테아좀(proteasome) 억제제는 프로테아좀의 저하 및 유비퀴틴화(ubiquitination)의 메커니즘(mechanism)을 억제하여 항종양 효과(antitumor effect)를 있음이 보고되었다. XIAP와 결합하는 화합물질(compounds)은 카스파제(caspase)-3 및 카스파제(caspase)-9의 활성화에 대해 단백질의 억제 효과를 차단하여 세포자살(apoptosis)을 유도한다(Vogler 외, Cancer Research, 2009, 69:2425-2434). I-kB로 알려진 NFkB 요소의 세포질 억제제(cytoplasmic inhibitor)를 안정화하여 sCLU의 기능을 억제하도록 디자인된 간섭 리보핵산(ribonucleic acid)(RNAi)은 항종양 효과(antitumor effect)를 가진다 (Zoubeidi외, 2010, Molecular Cancer Research, 8:19-30).

국제특허출원공개번호 제WO 07/095867호를 참조하면, 이 발명의 본질은 LALF(Limulus Anti-Lipopolysaccharide Factor) 단백질의 32-51 영역(region)에서 얻은 펩티드(peptides)에 관련한 것이며, 아미노산 치환은 LPS 결합능력의 해리(dissociation)를 보장하도록 만들어지고 항종양 및 면역조절활성을 향상시키기 위해 만들어졌다. 이러한 펩티드 중 하나는 L2 라는 이름을 가진 펩티드이다. 또한, 다른 발명 (국제특허 출원번호제 PCT/CU2008/000006호)는 위에서 언급한 펩티드의 세포 내 침투능력을 개시하고 있다. 하지만, 이러한 발명은 펩티드와 같은 작용의 메커니즘(mechanism)에 관한 것은 제안하거나 개시하지 않았다. 현재 암을 치료하는 요법 (화학요법 (chemotherapy), 방사선요법 (radiotherapy), 면역요법(immunotherapy) 등)이 있으며, 그 중 많은 요법들이 임상시험(clinical trials) 중에 있다. 그러나, 낮은 선택성(low selectivity), 독성(toxicity) 및 약물내성(drug resistance)에 관한 개발과 요법에 관련된 결점이 아직 존재하고 있다. 이 점에서 고려해야 할 또 다른 중요한 측면은 진단 및/또는 약물 효능의 예측변수와 같은 유용한 생체지표(biomarkers)의 선택이다. 따라서, 암의 치료 및/또는 진단에 유용한 새로운 분자를 조사하고 발견하는 것이 필요하고, 낮은 독성으로 더 많은 선택성과 효과적인 약물을 디자인하는 것이 과제로 남아 있었다.

본 발명은 상기한 문제점들을 해결하기 위해, 단백질 COMMD1의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시켜 암 치료를 위한 방법을 설명하기로 한다. 이러한 증가는 암세포 증식을 감소시키거나 막아준다.

본 발명에서는 L2 펩티드(서열 HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, SEQ ID No. 1)와 세포에서 COMMD1의 상호 작용, 그리고 COMMD1의 핵 국소화(nuclear localization)가 암세포 죽음과 연결된다는 것을 처음으로 개시하도록 한다. 따라서, 본 발명은 COMMD1의 핵 국소화와 축적을 용이하게 하고 항종양(antitumor)의 활동과 화합물을 식별하여 단백질 COMMD1의 사용을 제공한다.

본 발명에서 제공되는 데이터(data)는 L2 펩티드가 아미노산 110-190 사이의 영역(region)에서, 특히 COMMD1와 상호 작용하는 것을 나타낸 것이다. 또한, L2 펩티드는 COMMD1의 핵 축적을 생산한다. 뿐만 아니라, 처음으로 COMMD1 단백질과 관련한 핵 국소화 서열(NLS - nuclear localization sequences)의 발현은 세포 죽음을 유도하기에 충분하다고 말할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 치료에 있어서 치료 대상으로 COMMD1의 용도를 설명하도록 한다.

또한, 펩티드(peptides) L552(SEQ ID No. 3)는 L2 펩티드(SEQ ID No. 1)로 시작하여 최적화하였고, 암세포의 핵에 있는 단백질 COMMD1의 축적을 촉진하고, 이러한 펩티드의 항종양 효과(antitumor effect)를 높여준다. 본 발명에 설명된 펩티드(peptides) L552(SEQ ID No. 3)는 COMMD1의 핵 국소화가 용이하도록 개선하였고, 다음 서열을 갖는다:

Ac-HARIKpTFRRlKWKYKGKFW SEQ ID No. 3

최적화는 화학수식(chemical modifications)을 바탕으로 하고, 특정위치(위 수식에 포함된 서열에서 소문자로 굵게 표시한 것)에 부자연스러운 아미노산(D아미노산)에 의해 자연스러운 아미노산으로 대체하고, 아세틸화(acetylation)(위 수식에 포함된 서열에서 Ac- 표시한 것)에 의해 N-말단(N-terminal)을 보호하게 된다. 이러한 수식(modifications)은 L2 펩티드(SEQ ID No. 1)로 만들어졌고, 본래의 L2 펩티드와 관련하여, L552의 펩티드(SEQ ID No. 3)를 상승시켜 주었고, 세포의 핵에 있는 단백질 COMMD1의 가장 높은 축적과 항종양(antitumor) 활동의 증가를 보장한다. 따라서 L552펩티드는 핵 국소화를 용이하게 하고 암세포의 증식을 억제하는 COMMD1과 상호 작용하는 분자의 새로운 클래스(class)이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 단백질 COMMD1의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 물질(agents)을 사용한다는 것이다. COMMD1 핵 축적을 가능하게 하는 물질(agents) 또는 화합물 중에서 예를 들어: 단백질(항체 포함), 돌연변이단백질(muteins), 펩티드(peptides), 폴리뉴클레오티드(polynucleotides), 앱타머(aptamers), 핵산(nucleic acids), 작은 유기 분자(small organic molecules)를 포함한다. 이러한 화합물은 천연 자원으로부터 격리될 수 있으며, 합성되거나 재조합 기술(recombinant technology)에 의해 제조되거나, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시 예에서, 단백질 COMMD1의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 물질(AGENTS)은 L552 펩티드(SEQ ID No. 3)이다. 본 발명의 맥락에서, COMMD1 단백질의 핵 국소화를 증가시키거나 향상시킨다는 것과 세포의 핵에 COMMD1을 축적한다는 것은 동일한 의미를 지닌다. 또 다른 특정 실시 예에서, COMMD1 단백질의 핵 국소화를 증가시키는 물질(agents)은 NLS를 도입한 단백질 COMMD1을 암호화하여 DNA 서열을 포함하는 포유류의 세포에서 발현 벡터와 같은 핵산 형태(nucleic acid type)가 될 수 있다. 벡터의 이러한 형태는 유전자 치료요법으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 COMMD1 단백질의 핵 국소화를 증가시키는 물질(agents)을 포함하는 암 치료를 위한 약제학적 조성물(pharmaceutical composition)의 일부이다. 본 발명의 일 실시 예에서, 약제학적 조성물은 COMMD1 단백질 (그것의 억제 농도 50(IC₅₀))과 부형제(excipients) 또는 약물로 허용 가능한 전파체(vehicles)에 의해 결정되는 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 물질(agents)에 대한 효과적인 양을 포함한다. 상기 조성물은 비경구적(parenteral) 또는 국소투여(topical route)로 투여될 수 있다.

COMMD1 단백질의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 물질(agents)을 포함하는 약제학적 조성물의 투여(administration)는 사람에게 고형종양(solid tumor)을 예방하거나 치료하기 위한 방법으로 구성되며, 상기 방법은 COMMD1의 핵 국소화를 가능하게 하는 물질(agents)의 효과적인 양으로 투여되는 것을 포함하며, 종양세포의 성장을 감소시키거나 차단한다.

본 발명의 실시 예에서, COMMD1 단백질의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 물질(agents)은 백혈병 환자(leukemia patients), 특히 골수성 백혈병(myelocytic leukemia) 환자에 대해 암세포의 확산을 차단하기 위해 투여할 수 있다. 이러한 물질(agents)은 세균 지질다당체(lipopolysaccharide(LPS))와 같은 염증성 자극(inflammatory stimulus)에 대해서도 효과적일 수 있다.

본 발명에서는 L552 펩티드가 시너지 효과를 생산하고 시스프라틴(cisplatin)과 5-플루오로우라실(fluorouracil)(5-FU)과 같은 세포증식 억제제(cytostatics)의 복용량을 줄이기 위해 표준 화학 요법과 함께 사용할 수 있도록 해준다. 따라서, COMMD1 단백질의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 하나 또는 몇 가지 물질(agents), 그리고 하나 또는 암의 화학 요법에 대한 구체적인 하나 또는 몇 가지 약물(drugs)을 포함하는 암 치료를 위한 약제학적 조합 또한 본 발명의 목적이다. 본 발명의 실시 예에서, 이러한 물질(agents)은 L552 펩티드이며, 표준 화학 요법에 대한 특정 약물(drugs)은 시스플라틴(cisplatin)과 5-FU 사이에서 선택된다. 약제학적 조합물(pharmaceutical combination)에 있어서 물질(agents)와 약물(drugs)은 치료 기간 동안 개별적으로, 순차적으로, 또는 동시에 투여할 수 있다

한편, 최근 데이터는 염증(inflammation)이 종양 진행의 중요한 구성 요소라는 개념으로 확장되고 있다. 현재는 염증 미세환경(microenvironment)은 하나한(Hanahan)과 웨인버그스(Weinbergs)에 의해 개시된 암의 여섯 가지의 가장 중요한 특징 내에서 종양의 특징적 세부특징(characteristic feature)으로 분류된다(Perwez 외, 2007, Int J Cancer, 121:2373-2380).

본 발명에서 제공하는 데이터는 L552 펩티드가 염증성 자극의 존재에 암세포의 성장을 차단에 효과적이라는 사실을 나타낸다. 마찬가지로, 일시적으로 암세포에 형질 감염될 수 있는 GFP-NCOMMD1 단백질 (핵 국소화 서열을 결합하는 것)은 L552 펩티드와 동일한 효과를 제공한다. 보다 구체적으로, 결과는 L552 펩티드가 LPS와 TNF (종양 괴사 인자α)와 같은 염증성 자극이 있는 데서 암세포사(cancer cell death)를 촉진한다는 것을 보여준다. 마찬가지로, 실험 데이터는 생쥐가 LPS 주입에 의한 염증 자극하여 실험하였으며, 결장 종양(colon tumor)의 발진 모형(murine model)에서 펩티드의 효과를 보여준다.

이러한 이유로 본 발명은 또한 이를 필요한 사람에게 L552 펩티드의 투여법(administration)을 포함하며, 염증(inflammation) 및 전이(metastasis)와 관련된 종양의 억제하기 위한 방법을 제공한다. 염증과 전이와 관련된 종양 예를 들어, 대장암, 식도암, 폐암, 전립선암, 유방암, 췌장암 및 간암에서 발견된다.

또한, L552 펩티드의 투여는 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 췌장염(pancreatitis), 경변증(cirrhosis) 등과 같은 만성염증(chronic inflammation)과 관련한 암의 발달을 방지하기 위한 예방 방법(prophylactic manner)으로 사용될 수 있다. 따라서, 필요한 사람에게 L552 펩티드 또는 상기 펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하고, 만성 염증과 관련한 암을 방지하기 위한 방법을 제공하는 것 또한 본 발명의 또 다른 목적이다.

COMMD1 단백질의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 물질(agents)로서 L552 펩티드를 포함하는 조성물에 따라 복용량 및 치료 양생법(treatment regimen)과 관련하여, 숙련된 사람이라면 복용량 및 치료(예방 또는 치료) 일정을 쉽게 결정할 수 있다. 효과적인 양은 각각의 조성물의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있으며, 펩티드의 분자량 및 체외(in vitro) IC₅₀ 또는 동물 연구에 기초하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 주어진 화합물(화학적 구조)의 분자량 및 효과적인 실험 치사량(IC₅₀), mg/kg 치사량은 정기적으로 계산될 수 있다. 일반적으로 치사량은 0.2 내지 4 mg/kg이다. 펩티드 또는 펩티드를 포함하는 조성물은 한 번 또는 여러 번 투여될 수 있고, 매주 또는 심지어 몇 개월 동안 여러 번 시행할 수 있다.

또한, 본 발명은 샘플에 있는 COMMD1 단백질의 핵 국소화의 유무(presence or absence)를 결정하여 암 환자에 대한 새로운 예후 징후 표시자(prognostic marker)로서의 COMMD1 용도에 관한 것이다.

마찬가지로, L552 펩티드는 COMM 단백질이 역할을 재생하거나 질병의 진행에 참여하도록 질병을 치료하는 활성제(active agent)를 제공한다. 이는 예를 들어, COMMD 패밀리(family)에서 어떠한 요소의 양이 증가하거나 감소 및/또는 그에 대한 활동이 증가 또는 감소하게 되어 질병을 발생하게 되는데 이러한 질병에 대해 가능하게 한다. COMMD 단백질의 C-말단(terminal)의 아미노산 잔기(amino acid residues) 110-190 사이에 포함되는, COMM 도메인(domain)을 결합하는 L552 펩티드의 능력은 그것의 치료적 활동(therapeutic activity)을 지원해 준다.

도 1은 L2 펩티드와 COMMD1 사이의 물리적 상호 작용을 나타낸 것이다. 이것은 효모에 있는 두 가지 하이브리드(hybrids) 기술에 의해 수행되었다. 음성조절(negative controls)은 Y187 균주(strain)와 형질 전환된 COMMD1의 조각 및 빈 벡터(empty vector)(pGBKT7)로 형질 전환된 효모 균주(strain) AH109의 접합(mating)을 사용하였다. 상호 작용의 식별을 위해, 균주 Y187로 형질 전환된 각 COMMD1 조각 및 L2서열을 가진 벡터와 형질 전환된 균주AH109의 접합이 수행하였다. 양성조절(positive control)로, GAL4 전사 인자(transcription factor)를 결합하여 PCL1 접합이 사용되었다. 잘 알려진 바와 같이, 상호 작용은 COMMD1 단백질의 아미노산 110-190을 포함하는 구조(construction) 및 COMMD1 유전자의 완전한 염기서열을 수반하는 플라스미드(plasmids)와 함께 발생한다.
도 2의 A는 SW948 세포의 면역침강반응(immunoprecipitation)(풀다운 -pulldown)에 의한 COMMD1과 L2 펩티드의 상호 작용에 대한 유효성을 나타낸 것이다. 본 실험에서는, 총 단백질(TP)의 100 mg, 대장균(Escherichia coli) (COMMD1 r)에서 얻은 재조합(recombinant) COMMD1 단백질, 및 표준분자량(molecular weight standard-MW)을 나타낸 것이다. 도 2의 B는 L2 펩티드로 치료된 SW948 세포에 COMMD1 준세포 국소화(sub-cellular localization): 핵(N)에서 COMMD1 발현, 세포질(cytoplasm)에서 COMMD1 발현, 치료되지 않은 세포(NT)를 나타낸 것이다. 핵 분핵(nuclear fraction)의 조절로 인간의 리보핵(ribonuclear) 단백질 (hnRPN) 및 세포질 분획(cytoplasmic fraction) 조절로서의 베타 액틴(Beta Actin)을 나타낸 것이다.
도 3의 A는 L552로 인한 COMMD1의 높은 핵 축적을 나타낸 것이다. 베타 액틴(Beta Actin) 및 헤테로핵리보실단백질(hnRNP)은 서로 각각 세포기질(cytosol) 및 핵 분획을 조절하는 것으로 사용되었다. 도 3의 B는 L552 펩티드 및 역침강 반응실험(immunoprecipitation experiments)(pulldown)에서, 각각 다른 종양 세포주(tumor cell lines)에서 COMMD1 단백질 사이의 상호 작용을 나타낸 것이다. 상호 작용이 없는 것은 Cillin 7 (CUL7)이 발견되었다. 베타 액틴(Beta Actin)의 존재는 각각의 세포주의 총 단백질 추출물로 나타내었다.
도 4는 각각 다른 조직학적 기원 L

(말초혈액으로부터 고립된 인간의 림프구(lymphocytes))의 종양 세포에서 펩티드(peptide)의 항 증식성의 물질(Antiproliferative)의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 TC-1 종양 모델에서 L552 펩티드의 항종양 효과를 나타낸 것이다. 도5의 A는 종양 성장의 억제성에 대해 곡선으로 나타낸 것이다. 도 5의 B는 각각 다른 실험의 누계 생존율(cumulative percent survival)을 나타낸 것이다.
도 6은 핵 국소화 서열(NLS, nuclear localization sequences)을 결합하는 COMMD1 단백질의 발현이 세포의 죽음을 유도하기에 충분하다는 것을 나타낸 거이다. 음성조절(negative control) 및 유전적 구조 GFP-COMMD1과 GFP-N-COMMD1와 같은 녹색 형광 단백질(GFP: green fluorescent protein):과 일시적으로 형질 주입된(transfected) 비생균율(percentage of non viable cells)을 나타낸 것이다.
도 7의 A는 GFP-N-COMMD1와 형질 주입된 HT-29 결장암세포(colon carcinoma cell)에서 5-FU로 항암제민감성(chemosensitivity)을 나타낸 것이다. IC₅₀의 값을 나타낸 것이다. 도 7의 B는 IC₅₀에서TNF-a 및 LPS를 추가로 염증성 환경(inflammatory environment)의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 서로 다른 염증성 자극(stimulus)이 있는 암세포의 증식에 L552 펩티드의 효과를 나타낸 것이다. 도 8의 A는 인간의 골수성 백혈병 세포(myeloid leukemia cell)(THP-1)를 나타낸 것이고, B는 TNF-a 및 LPS로 치료된 쥐류 결장암(murine colon carcinoma)을 나타낸 것이고, IC₅₀의 값을 나타낸 것이다.
도 9는 LPS 주입으로 인한 염증성 자극(inflammatory stimulus)을 받도록 한BALB /c 생쥐에 대장암의 모델에 대한 LPS 522 펩티드의 항암효과(antitumor)를 나타낸 것이다. 도 9의 A는 서로 다른 실험 그룹의 누적 생존율을 나타낸 것이고, B는 각 실험 집단에 대한 평균 종양 볼륨을 나타낸 것이다.

실시 예

실시 예 1. L2 펩티드 및 COMMD1 사이의 물리적 상호 작용

항 종양(anti-tumor) L2 펩티드 단백질 상호 작용을 식별하기 위해 두 가지 하이브리드(hybrid) 효모 시스템이 사용되었다. 펩티드에 상응하는 서열을 복제하기 위해 올리고핵산염(oligonucleotides)이 다음과 같이 디자인되었다:

L2 펩티드 서열(peptide sequence): HARIKPTFRRLKWKYKGKFW에 상응하는

L2F

CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGAAGTACAAGGGTAAGTTCTGGTAA

L2R:

GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTTGATTCTAGCGTG

pGBKT7 Ncol-BamHi 벡터(vector)에서 이러한 서열을 복제하기 위하여, 이들 사이트(sites)에 보완적인 서열이 올리고핵산염(oligonucleotides)의 말단에 추가되었다. L2펩티드 서열을 수행하는 pGBKL2-1 재조합 플라스미드(recombinant plasmid)는 제한 분석(restriction analysis) 및 서열 결정(sequencing)에 의해 검증되었다. 플라스미드(plasmid)는 리튬 아세트산 방법(lithium acetate method)으로 AH109 효모 균주(yeast strain)로 형질전환 되었고 SD-Trp 배지(medium)에서 재배되었다. SD-Trp-His 판에서 성장하면 자가활성화 될 수 없음을 확인하였다. 상호 작용의 선별(screening)을 위해, Y187 균주에 형질 전환된 인간의 간 cDNA 라이브러리가 사용되었다. 이배체 형성(diploid formation) 및 상호 작용의 선택을 위해, pGBKL2-1 플라스미드(plasmid)를 포함하는 5x10⁸ AH109 세포는 30℃에서 고형 배지(solid medium) YPDA에 4시간 동안, 인간의 간 DNA 라이브러리를 포함하는 5x10⁸ Y187 세포로 성정시켰다. 멸균 물(sterile water)의 10ml가 YPDA 판의 표면에 추가되었고, 세포는 주걱(spatula)으로 조심스럽게 부유시켰고 SD-Trp-Leu-His-Ade 최소 배지의 15개의 판에 옮겨와 7일 동안 30℃에서 성장시켰다. 74 결과로 초래된 대장(colonies)은 96 딥-웰(deep well) 판에 액체 SD-Trp-Leu로 형질 전환되었다. 액체 배지에서의 성장을 관찰 한 후, 효모 DNA의 정화가 수행되었다. 각 개별 DNA는 -20℃에서 저장되고 정제된 그들의 DNA, DH10B E. 콜리 균주(coli stain)로 형질 전환되었다. 각 개체 복제(individual clone)는 Y187 효모 균주로 형질 전환되었으며, 상호 작용은 pGBKT7와 pGBKL2-1 플라스미드(plasmids)로 형질 변환된 AH109 균주(stain)와 접합되는 것으로 확인되었다. 양성복제(positive clones) DNA가 서열 되었다. 블라스트 프로그램(Blast program)(Altschul 외, 1990. J Mol Biol, 215:403-410)를 사용하여 서열 분석은 복제(L2-21) 중 하나가 COMMD1 단백질의 아미노산 6-190에 대한 유전자 부호화의 서열에 해당하는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 복제는 L-2 펩티드 서열을 포함하여 상호 작용할 수 있다. 특별히 이러한 상호 작용에 대한 COMMD1 단백질 부위(region)를 식별하기 위해, pGBKL2플라스미드(plasmid) 결실(deletions)이 복제: pGBKL2(6-110), pGBKL2(6-70), pGBKL2(71-190), pGBKL2(110-190)을 생성하여 수행되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 상호 작용은 COMMD 패밀리에 대해 설명된 단백질 상호 작용에 대해 책임이 있는COMM 도메인을 포함하는 플라스미드(plasmid) pGBKL2(110-190)에만 보존된다. 이러한 결과는 L2 펩티드가 구체적으로 아미노산 110-190 사이의 영역(region)을 특별히 결합하는 것을 보여준다.

실시 예 2. 역침강 반응실험( immunoprecipitation experiments )( pulldown ) 및 펩티드 L552 로 치료된 암세포에 COMMD1 의 핵 국소화의 결정.

실험은 두 개의 블록(blocks)으로 나뉘었다:

(A) 고상법(solid phase procedure)을 사용하여 합성화된 합성L2 펩티드 (SEQ ID No. 1)는 비오틴화(biotinylated)하였고, 스트렙타아비딘 세파로오스 수지(streptavidin sepharose resin)에 부착된 "베이트(bait)"로 사용되었고 되었다. SW948(인간의 결장암으로부터의 세포주)에서의 총 추출물 단백질은 "피식자(prey)"로 사용되었다. 이 실험은 '풀다운(pulldown)'로 알려져 있다. 총 추출물 단백질은 추출 완충제(extraction buffer)(트리톤(triton) X-100 0.5% 25 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤(glycerol), 1 mM 디티오트레이톨(DTT, dithiothreitol) 및 단백질 가수분해효소 억제제(protease inhibitor))를 사용하여 2x10⁷ 세포로부터 얻었다. 비오틴화된 펩티드(300 μg)는 1시간 동안, 스트렙타아비딘 세파로오스 수지(streptavidin sepharose resin)(GE 헬스케어) 50μL과 함께 배양하였고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline)(PBS 1X) 뿐만 아니라 1 mM 디티오트레이톨(DTT)로 세정을 완료하였다. 그런 다음, 총 단백질의 500 μＬ은 5 시간 동안 실온에서 비오틴화된 펩티드를 포함하는 50μＬ 수지와 함께 배양하였다. 그 후, 수지는 PBS 1X및 1 mM DTT와 함께 광범위하게 세정하였다. 수지에 부착된 남아 있는 단백질은 펩티드와 함께 상호작용하였으며, 전기 영동 완충제(electrophoresis buffer)(62.5 mM 트리스(Tris) HCL, pH 6.9, 0.1 M DTT, 20% 나트륨 도데실황산나트륨(SDS, sodium dodecyl- sulphate), 10% 글리세롤 및 0.01% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)의 25 μL로 부유시켰다(suspended). 관심(interest) 단백질을 감지하도록 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(polyacrylamide gel electrophoresis)(7.5%)이 수행되었고, 이어서 웨스턴 볼트(Western bolt)에 의한 면역감지(immunodetection)를 수행하였다. COMMD1 단백질을 감지하도록, COMMD1 단백질(시그마, 클론 2A12)에 대항하여 단일클론성 항체(monoclonal antibody)가 사용되었다. 총 단백질 추출물(100μg) 및 대장균(E. coli)에서 얻어진 재조합 COMMD1 단백질은 양성조절(positive control)로 채택하였다. 도 2A에서 나타낸 결과는 총 단백질 추출물에 비교할 때 L2 펩티드는 풀다운(pulldown) 실험에서 COMMD1 단백질을 농축시킨 것을 나타낸다. 이것은 L2및 COMMD1 사이의 상호 작용을 나타낸다.

(B) SW948 세포(3x10⁶ 세포)는 L2 펩티드(50μＭ)와 함께 5% CO₂ 를37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포질(cytosolic) 및 핵 단백질은 (Vancurova 외, 2001, Journal of Biological Chemistry, 276: 19746-19752)에서 보고된 바와 같이 획득하였다. COMMD1 검출은 항COMMD1 항체를 사용하여 웨스턴 볼트(Western bolt)에 의해 수행되었다. 도 2B는 L2 펩티드로 치료된 SW948 세포에 COMMD1 핵 국소화를 나타낸 것이다. 베타 액틴(beta actin)는 핵 분핵(nuclear fraction)의 조절로 인간의 리보핵 단백질(ribonucleoprotein) (hnRNP) 및 세포질 분획(cytoplasmic fraction)에 대한 조절로서 사용되었다.

실시 예 3. COMMD1 의 핵 축적을 위한 L552 펩티드의 최적화.

펩티드 L2 및 COMMD1가 물리적 상호작용이 있는지를 고려하여, 이 COMMD1의 핵 국소화와 상관관계와, 각각의 펩티드가 COMMD1의 핵 축적을 향상시키는 목적으로, L2 (SEQ ID No. 1)부터 디자인되었다. 본 발명의 펩티드는 고상법(solid phase procedure)을 사용하여 합성화하였다.

조펩티드(crude peptide)는 30% 아세트산의 용액으로 추출하였고; 동결 건조한 후 역상 크로마토그래피(RP-HPLC, reverse phase chromatography)에 의해 정화하였다. 정화된 펩티드의 분자량은 질량 분석법에 의해 확인하였다. 그 결과 비항원(non-antigenic), 비발열성(pyrogenic) 및 약제학적으로 동물과 인간에게 투여가 가능한 약물로 허용될 수 있다. 치환(Substitutions) 표 1에서 나타낸 바와 같이, 서열이 HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ ID No. 1)인 원시(original) L2 펩티드로 특정 위치에 D-아미노산을 도입하여 특정 포인트(certain points)에 만들어졌다. 한 경우에서, N-말단(terminal)은 아세틸화(acetylation )에 의해 차단되었다.

본 발명에서 사용된 펩티드 서열

펩티드 ( Peptide )	아미노산 서열 ( Amino acid sequence )	서열번호( SEQ ID No .)	특징 ( Features )
L2	HARIKPTFRRLKWKYKGKFW	1	WO 07/095 867에서 이미 개시된 펩티드
L551	HARIKpTFRRlKWKYKGKFW	2	P-6 및 L-11 위치에서 D-아미노산을 갖는 펩티드
L552	Ac - HARIKpTFRRlKWKYKGKFW	3	P-6 및 L-11 위치에서 D-아미노산 및 N-말단(terminal)에서 아세틸화를 갖는 펩티드
L553	HARIKPTFRRLKWkYKgKFW	4	K-14 및 G-17 위치에서 D-아미노산을 갖는 펩티드
L554	HArIKpTFRRLKWKYKGKFW	5	R-3 및 P-6 위치에서 D-아미노산을 갖는 펩티드

* 참고: 굵은 소문자로 표시한 아미노산(amino acids)은 D-아미노산 변화(D-amino acid changes)를 의미한다.

이 실험에서 목표는 세포의 핵에 COMMD1을 축적할 수 있는 높은 수용성을 갖는 펩티드를 식별하는 것이었다. SW948 세포 (3x10⁶ 세포)는 L2, L551, L552, L553및 L554 펩티드(50mM)와 함께 37℃에서 5%의 CO₂를 5시간 동안 배양하였다. 그 후에, 세포질(cytosolic)과 핵 단백질의 분리(isolation)가 실시 예 2에서 설명한 바와 같이 수행되었다. COMMD1 검출은 비(anti)-COMMD1 항체를 사용하여 웨스턴 볼트법(western bolt)으로 수행되었다. 도 3A는 위에서 언급한 펩티드로 치료된 SW948 세포에 COMMD1 핵 국소화를 나타낸 것이다. 그 결과 L552 펩티드가 암세포의 핵에서 COMMD1의 가장 큰 축적을 포함하는 것을 보여준다. 또한, 도 3B는 서로 다른 종양 주(tumor lines)에서 면역학적 블로팅 실험(immunoblotting experiments)(풀다운, pulldown)으로 L552 펩티드와 COMMD1 사이의 상호작용을 보여준다. 이러한 결과는 L552와 COMMD1 사이의 상호작용을 확인한다. 또한, 이러한 상호작용은 COMMD1의 핵 축적의 촉진과 관련이 있다.

실시 예 4. 서로 다른 종양 계통( tumor lines )에서 펩티드 L552 의 항증식성( antiproliferative ) 효과의 증가를 나타낸 것이다.

이러한 측정을 위해, 인간의 근본 종양 세포 H-82(작은 폐암 세포), H-125(작은 않은 폐암 세포), MCF-7(유방 선암, breast adenocarcinoma), MDA-MB231(유방 선암 수용체 양성 상피 성장 인자), LS174T(대장 선암)와 HT-29 (화학 요법에 내성이 있는 대장 선암)는 송아지 태아혈청(Gibco)으로 보충한 RPMI 1640(Gibco)에 1x10⁴ 세포(cells)/mL의 밀도에서 96-웰 플레이트(well plates)(Costar)에 시이드(seeded)되었다. 24 시간 후에, 펩티드는 9μＭ와 300μＭ 사이의 선량 범위(dose range)에서 배지(culture medium)에 추가되었다. 배양은 5%의 CO₂가 있을 때에는 48시간 동안 수행되었으며, 이 시간 이후, 그것은 3 - (4,5-디메틸시아졸(dimethylthiazol)-2-yl) 2.5 디페닐테트라조리움 (diphenyltetrazolium) 브로마이드(bromide) (MTT)임이 드러났다 (Gray MJ 외, 2008, Natl Cancer Inst, 100:109-20).

마지막으로, 플레이트(plate)는 흡광도(absorbance) 492nm 에서 판독 되었다. 각 점(point)은 복제로 수행되었으며, 실험은 최소한 두 번 독립적으로 수행되었다. IC₅₀ 값은 세포 증식(cell proliferation)의 각 곡선에서 얻었다. 그 결과는 도 4에서 보여준 바와 같다. 그 결과는 N-말단(terminal)에서 아세틸화(acetylation) 및 특정 위치에서 D-아미노산(amino acids)의 치환은 L552 펩티드의 반증식성(antiproliferative) 효과를 증대한다. 그러나, 어떤 효과가 말초 혈에서 분리된 인간 림프구(lymphocytes)에서 관찰되지 않았다. 이 결과는 본 발명의 목적인, L552 펩티드가 건강한 세포에 독성을 증가시키지 않고 종양 세포에서 선택적 세포 독성 효과를 향상시키는 것으로 나타났다. 이 결과는 L552 펩티드는 핵에서 더욱 축적을 촉진하기 위하여, COMMD1 단백질과 상호 작용하고 암세포에 선택적 반증식성(antiproliferative) 효과를 높이기 위해 최적화된 것으로 보여줬다.

실시 예 5. TC -1 종양의 생쥐 모델에 L552 펩티드의 항종양( antitumor ) 효과.

이 검사에서 8주 및 10주(n = 실험 그룹당 10 동물) 사이의 C57BL/6 암컷이 사용되었다. 이러한 모델에서 종양 착상(tumor implantation)을 위해, 우리는 염분(PBS)에 매달려 있는 C57BL/6악성(malignant)에서 폐 상피 세포(lung epithelial cel)로부터 파생된 TC-1 세포를 사용하였다. 200μＬ 볼륨(volumn)에 5x10⁴ 세포 양이 오른쪽 뒷다리에 마우스의 피하(subcutaneously)에 접종하였다. 종양이 볼륨에 있어서 100 mm3에 도달되면 펩티드의 다섯번 복용(L2, L552및 L551)이 오른쪽 뒷다리 피하에 2일 간격으로 실시하였다. 본 연구에서는 무게(4μg/mouse)의 펩티드/ 당kg의 0.2 mg의 복용량을 평가하였다. 도 5A 및 5B에서 나타낸 바와 같이, 관심 펩티드(peptides of interest)의 항종양(antitumor) 효과를 측정하기 위한 평가된 매개변수 (parameters)는 종양 덩어리와 동물의 생존율이었다. L552 펩티드는 종양의 진행을 억제하고 L2 및 L551 펩티드에 비해 쥐의 생존율을 향상시킬 수 있는 능력의 측면에서 훨씬 효과적이었다. 이러한 결과에 대한 증거는 L552에 도입된 변형(modifications)은 생체(in vivo)에 항종양(antitumor) 효능이 증가하였다. 통계 분석은 그룹 간의 큰 차이를 확인하기 위해 로그 순위 방법(log rank method)으로 수행되었다. 그 결과는 L552 펩티드가 테스트된 다른 펩티드에 비해 동물의 생존율을 크게 증가(^*P<0.05)된 것을 보여준다. 이러한 결과는 특정 위치에서 D-아미노산 치환(substitutions)하고, 아세틸화(acetylation)로 N-말단(terminal)을 차단하고, 펩티드의 항종양 수용력(antitumor capacity)을 증가시키는 것을 보여준다.

실시 예 6. 핵 국소화 서열을 운반하는 COMMD1 단백질의 발현이 세포사( cell death)를 유도하기에 충분한 것을 나타낸 것이다.

또한 PKKKRKV 핵 국소화 펩티드 서열(nuclear localization peptide sequence)을 포함하는 세포 증식, 재조합 플라스미드(recombinant plasmids) pGFP- COMMD1, GFP에 융합된 COMMD1의 발현, 및 pGFP-N- COMMD1가 생성되었다. pGFP-COMMD1 복제를 위해서, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)은 다음과 같은 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotides)를 사용하여 수행되었다:

CF: TTCTGCAGTCGACCTTGAGGGTGGCAAA

CR: CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT

NLS의 도입으로 COMMD1에 대해 암호화하여 유전자의 증폭(amplification)을 위해, 다음과 같은 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotides)가 사용되었다:

NF: TGCAGTCGACCCGAAAAAGAAAGGGAAACTTGAGGGTGGCAAACCC

CR: CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT.

재조합 클론(recombinant clones)은 복제로 24-웰 플레이트(24-well plates)에 DNA 서열과 제한효소(restriction)로 분석하였다. 구성 및 pEGFP 제어 모두는 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine) (시그마, USA) (Boussif, O 외, 1995, Proc Natl Acad Sci, 92: 7297-7301)을 사용하여 HT-29 및 HEK293 세포주에 일시적으로 형질주입 하였다. 72시간 후 웰형(wells) 중 하나는 형광 현미경 아시오버트(Axiovert) 40 (Zeiss, 독일)과 아플랜(APlan) 10X 대물(objective)을 사용하여 재조합 단백질의 발현을 평가하는 데 사용되었다.

배지(culture medium) 남아있는 웰(well)로부터 제거하였고, 염색(staining)은 세포자살(apoptosis)의 식별을 위해(Riblah D, 외, 2005, BMC Biotechnology, 5:12-15) PBS에 5 mg/mL의 농도로 아크리딘 오렌지/에티듐 브로마이드(acridine orange/ethidium bromide)(AO/EB)의 혼합과 함께 수행되었고, 그리고 아시오버트(Axiovert) 현미경과 아플랜(APlan) 40X 대물(objective)로 관찰되었다. 이러한 유형의 염색으로, BE가 막 무결성 손실로 세포만을 관통하고 빨간색으로 DNA를 염색하는 동안 AO는 살아있는 세포의 막(membrane)을 통과하고, 서로 각각 녹색과 오렌지에 있는 세포의 핵 및 세포질을 염색한다. BE의 형광(fluorescence)은 AO 형광을 통해 지배한다.

AO/EB를 염색하는 것은 GFP 및 GFP-COMMD1과 형질주입(transfections)으로 AO와 염색 가능한 세포를 나타낸 것이다. GFP-N-COMMD1와 형질 주입된(transfected) 세포의 경우에만, 세포들은 아포토시스(apoptosis)의 늦은 단계에 있는 것으로 나타내는 EB에 의해 염색된 핵과 함께 관찰되었다. 도 6은 실험 조건마다 세 가지 독립적인 분야의 붉은 핵을 세포의 비율을 그래프로 나타낸 것이다. 이 값 및 표준 편차를 나타낸 것이다. 이러한 결과는 단백질 COMMD1의 NLS의 도입이 세포에 아포토시스(apoptosis)의 유도를 위해 충분하다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 또한 새로운 치료 목표로 COMMD1의 유용성(utility)를 보여준다.

실시 예 7. 5 FU 뿐만 아니라 세포주 HT-29에서 염증성 자극(inflammatory stimuli )에 대한 민감도에 COMMD1 단백질의 핵 국소화 효과를 보여준다.

(A) 위에서 설명한 구조와 일시적으로 형질 주입시킨(transfected) HT-29 세포주는 송아지 태아 혈청(Gibco)을 보충한 RPMI 1640 (Gibco)에 1x10⁴ 세포(cells)/mL의 밀도에서 96-웰 플레이트(well plates) (Costar)에 씨이드 되게 하였다. 24 시간 후에, 세포분열 억제제(cytostatic) 5-FU가 1:10 단계희석(serial dilution)으로 0.025μM와 2500μM 사이의 선량 범위에 있는 배지를 추가하였다. 배양(incubation)은 CO₂ 5%가 있는 데서 48 시간 동안 수행되었고, 결국에는 그것은 MTT인 것으로 나타났다. 마지막으로, 492 nm의 흡광도(absorbance)에서 해독하는 플레이트(palte)가 수행되었다.

각 포인트(points)는 복제로 수행되었으며, 실험은 최소한 두 번 독립적으로 수행되었다. IC₅₀ 값은 세포 증식의 각 곡선에서 얻게 되었다. 도 7A에서 나타낸 바와 같이, 결과는 NLS(GFP-N-COMMD1)과 COMMD1의 발현은 5-FU에 암 세포의 증가한 감도(sensitivity)를 일으키는 원인이 된다는 것을 보여준다. 이러한 예에서 GFP 또는 GFP-COMMD1을 표현하는 세포에 비해 GFP-NCOMMD1을 표현하는 세포에서 IC₅₀의 감소를 보여주었다. 이러한 결과는 또한 새로운 치료 표적(target)으로 COMMD1의 유용성(utility)를 보여준 것이다. 또한 COMMD1의 핵 국소화(nuclear localization)는 기존의 세포분열억제(cytostatics)에 화학감도(chemosensitivity)를 유도하는 것으로 나타났다.

(B) 일시적으로 GFP-NCOMMD1와 형질 주입된(transfected) HT-29 세포주(cell lines)는 서로 다른 염증성 자극, 예를 들어 30분 동안 LPS (40 mg/mL) 및 TNF-a (20 nG/mL)을 받게 하였다. 그 후, IC₅₀은 실시 예 6에 설명된 바와 같이 평가하였다. 그 결과는 도 7B에서 표시된 바와 같다.

실시 예 8. 염증성 자극( inflammatory stimulus )을 받는 암 세포의 세포 증식에 L552 펩티드의 효과를 보여준다.

이 분석을 위해, 생쥐 결장암(colon carcinoma) (CT-26) 세포와 인간의 기원(origin) (THP-1)의 급성 골수성 백혈병 세포는 10%의 소태아혈청(FBS)를 보충한

RPMI 1640 (Gibco)에 밀도 1x10⁴에서 96-웰 플레이트(96-well plates) (Costar)에 놓았다. 셀은 37℃와 5%의 CO₂에서 24 시간 동안 유지되었다. 이 시간 후, LPS (40 μg/mL) 또는 TNF-a가 (20 ng/mL)가 30분 동안 추가되었다. 도 8은 위에서 언급한 자극의 유무에 THP-1과 CT-26 세포주에서 IC₅₀ 값을 나타낸 것이다. 결과치는 L552 펩티드가 다양한 염증성 자극이 있는 데서 THP-1과 CT-26 암 세포주에 있는 세포 증식을 억제한다는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 L552 펩티드가 서로 다른 염증성 물질(inflammatory agents)를 받게 하여 암 세포의 증식을 차단하는 것에 효과적이라는 사실을 보여준다.

실시 예 9. LPS 주입으로 염증성 자극을 받게 하여 BALB /c 쥐에 있어서 결장암 모델에서 L552 펩티드의 항종양( antitumor ) 효과를 보여준다.

이 검사에 8 및 10주 (n은 = 실험 집단당 10 동물) 사이에서의 BALB/c 암컷 쥐가 사용되었다. 이 모델에서 종양 착상(tumor implantation)을 위해, BALB/c에 결장암으로부터 분리된 CT-26 세포가 사용되었다. PBS 1X의 200μＬ에 떠있는 7x10⁴ 세포의 수는 피하의(subcutaneously) 액와 내(intraaxillary) 에 접종하였다. 11일 후, 동물은 PBS에서 복강내(intraperitoneally)로 투여되는 10 μg의 LPS/쥐(mouse)를 접종하였다 (혈청형(serotype) 055: B5, 시그마). 한번 종양이 100 mm³에 도달하면, 한 그룹은 이틀마다 L552 펩티드의5복용량(0.2 mg/kg 중량)을 받았고, 한 그룹은 20 mg/kg의 치사량으로 5-FU를 받았다. 이 실험에서 평가된 이익의 매개변수(parameters)는 동물의 생존률과 종양 덩어리(tumor mass)의 증가된 볼륨이었다.

도 9에서 나타낸 결과는 LPS의 주사로 염증 단계가 추가된 결장암의 모델에서 L552 펩티드의 효능을 나타낸 것이다. (A) 결과는 L552 펩티드는 LPS가 추가될 때 5-FU로 치료된 그룹에 비해 동물의 증가하는 생존율(*p<0.05)에 더 효과적인 것을 보여준다. 통계 분석(statistical analysis)은 그룹 간의 주요한 차이점을 확인하려면 로그 순위 방식(log rank method)에 의해 수행되었다. (B) L552 펩티드는 종양 진행(progression)을 억제할 수 있는 능력의 측면에서 훨씬 효과적이었다. 이 실시 예에서 제시한 결과는 L552 펩티드는 염증관련 암의 치료에 효과적이라는 사실을 보여준다.

실시 예 10. L552 펩티드와 표준 화학 요법( standard chemotherapy )의 조합의 시너지 효과를 보여준다.

이 검사의 경우, HT-29 및 H-125 종양 세포는 송아지 태아 혈청 (Gibco)을 보충한 RPMI 1640 (Gibco)에 1x10⁴ 세포(cells) mL의 밀도에서 96 -웰 플레이트(well plate) (Costar)에 시이드(seeded) 하였다. 24 시간 후에 펩티드는 9μＭ과 300μＭ사이에서의 복용 범위로 배지(culture medium)에 추가하였고, 세포분열 억제 약물(cytostatic drug)이 각 세포주에 대해 보고된 IC₅₀ 이상 및 이하를 1:10 단계희석(serial dilution)의 복용 범위에 추가되었다. 배양(incubation)은 CO₂ 5%가 있는 데서 48 시간 동안 수행되었고, 그것은 MTT인 것으로 나타났다. 수반하는 치료 세포분열 억제 펩티드(concomitant treatment cytostatic-peptide)의 효과는 약물 조합을 조사하기 위해 카쿠신(CalcuSyn) 컴퓨터 소프트웨어에 의해 분석되었다 (Ting-Chao Chou, 2006, Pharmacological Reviews, 58: 621-681). 표 2 에서 표시된 데이터는 펩티드-세포분열 억제 (cytostatic) 조합이 약물 감소 비율 지수(RI)로 표시된 값으로 주어진 세포분열 억제제(cytostatic)의 양을 줄일 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 펩티드는 기존 약물의 적은 양과 함께 효과적인 치료를 (89%-94% 사이에 영향을 받는 세포의 분획(fraction)을 제공하기 위해 표준 화학 요법과 함께 투여할 수 있음을 나타낸다. 5-FU + L552 펩티드의 조합은 HT-29 세포주에 세포분열 억제에 대해 20배 감소(RI) 할 수 있다. 시스플라틴(cisplatin) + L552 펩티드 조합을 위해, 세포분열 억제 감소율은 H-125 세포주에 5배이다. 이러한 결과는 펩티드가 세포분열 억제제의 복용량의 감소시켜주고, 폐암과 결장암에 대한 표준 치료와 결합하여 투여할 수 있음을 나타낸다. 이것은 화학 요법과 관련된 부작용을 줄일 수 있다.

인간 종양 세포주에 대한 L552 펩티드와 세포분열 억제제(cytostatic) 5-FU및 시스플라틴(cisplatin)의 조합 치료의 상승작용(synergism).

세포주 (Cell Line)	Af(Afected fraction)	CI	약물(Drug) 5-FU (mM)	약물(Drug) L552 (mM)	RI (5-FU)	RI (L552)
HT-29	89%	0,3	5000	700	30	5
	Af(Afected fraction)	CI	약물(Drug) 시스플라틴 ( cisplatin ) (μM)	약물(Drug) L552 (μM)	RI 시스플라틴 ( cisplatin )	RI (L552)
H-125	94%	0,5	273	308	5	3

Cl<1은 상승작용(synergism)을 의미하고, CI=1은 가성성(additivity)을 나타내고, CI>1은 길항작용(antagonism)을 나타낸다. 또한, RI는 조합에서 약물(drug)의 감소 지수를 나타낸다.

<110> Center for Genetic Engineering and Biotechnology <120> METHOD FOR CANCER THERAPY <130> peptide 552 <150> CU 2010-0113 <151> 2010-05-31 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Peptide described in application W0 07/095867 <400> 1 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Modified peptide including D amino acids <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> P6 is a D amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> L11 is a D amino acid <400> 2 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Modified peptide including D amino acids and acetylated in the N-terminal end <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATOIN <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> P6 is a D amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> L11 is a D amino acid <400> 3 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Modified peptide including D amino acids <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> K14 is a D amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> G17 is a D amino acid <400> 4 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Modified peptide including D amino acids <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> R3 is a D amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> P6 is a D amino acid <400> 5 His Ala Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys Trp Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Lys Phe Trp 20 <210> 6 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: oligonucleotide used for cloning <400> 6 catgcacgct agaatcaagc caaccttcag aagattgaag tggaagtaca agggtaagtt 60 ctggtaa 67 <210> 7 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: oligonucleotide used for cloning <400> 7 gatcttacca gaacttaccc ttgtacttcc acttcaatct tctgaaggtt ggcttgattc 60 tagcgtg 67 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: oligonucleotide for PCR <400> 8 ttctgcagtc gaccttgagg gtggcaaa 28 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: oligonucleotide for PCR <400> 9 cgctcgagac atcttcagtt aggctggctg atcagtgt 38 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: oligonucleotide for amplifying the gene coding for COMMD1 with NLS <400> 10 tgcagtcgac ccgaaaaaga aagggaaact tgagggtggc aaaccc 46 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: oligonucleotide for amplifying the gene coding for COMMD1 with NLS <400> 11 cgctcgagac atcttcagtt aggctggctg atcagtgt 38

Claims

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암세포에서 COMMD1 단백질의 핵 국소화를 증가시키는 물질(agents), 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제(excipients) 또는 전파체(vehicles)를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물에 있어서,
상기 COMMD1 단백질의 핵 국소화를 증가시키는 물질(agents)은 SEQ ID No. 3으로 식별되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인 것을 특징으로 하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
암세포에서 COMMD1 단백질의 핵 국소화를 증가시키는 물질(agents), 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제(excipients) 또는 전파체(vehicles)를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물에 있어서,
상기 COMMD1 단백질의 핵 국소화를 증가시키는 물질(agents)은, SEQ ID No. 3으로 식별되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 암호화하는 DNA서열을 포함하는 포유류 세포 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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암세포에서 COMMD1 단백질의 핵 국소화(nuclear localization)을 증가시키는 물질(agents), 및 암의 표준 항암화학요법(standard chemotherapy)을 위한 특정한 하나 이상의 약물(drugs)을 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 병용제제(pharmaceutical combination)에 있어서,
상기 COMMD1 단백질의 핵 국소화(nuclear localization)를 증가시키는 물질(agents)은 SEQ ID No. 3으로 식별되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인 것을 특징으로 하는 암을 치료하기 위한 약제학적 병용제제(pharmaceutical combination).
제 15항에 있어서, 상기 병용제제(combination)의 일부를 구성하는 물질(agents) 및 약물(drugs)은 같은 치료의 과정에서 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 암을 치료하기 위한 약제학적 병용제제(pharmaceutical combination).
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SEQ ID No. 3으로 식별되는 아미노산 서열로 이루어진, COMM 도메인(domain)에 결합능력을 갖는 펩티드.
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