ES2619571T3 - Método para la terapia del cáncer - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un método para el tratamiento del cáncer mediante el incremento de la localización nuclear de la proteína COMMD1, lo cual se asocia con la disminución o bloqueo de la proliferación de la célula de cáncer. La invención se relaciona, además, con el uso de agentes que incrementan la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la fabricación de un medicamento para la terapia del cáncer. Dichos agentes pueden ser péptidos o proteínas, entre otros compuestos. La invención también se relaciona con la optimización de un péptido, proveniente de la secuencia HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, para incrementar la localización nuclear de la proteína COMMD1 y, de esa forma, aumentar el efecto antitumoral de dicho péptido.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la terapia del cancer Campo de la tecnica

La presente invencion se enmarca dentro del campo de la biomedicina, en particular con la terapia del cancer, al revelar una nueva diana terapeutica para el desarrollo de farmacos antitumorales. Estos farmacos, debido a su mayor selectividad y eficacia, contribuyen a la mejora en los tratamientos actuales del paciente con cancer. En la presente descripcion se describe un metodo para el tratamiento del cancer mediante la expresion y acumulacion de la protema COMMD1 en el nucleo de las celulas tumorales. Las modificaciones qmmicas introducidas en la estructura primaria del peptido HARIKPTFRRLKWKYKGKFW aumentan la localizacion nuclear de COMMD1 y la actividad antitumoral in vitro e in vivo de este peptido.

Estado de la tecnica anterior

A pesar de los grandes avances en la terapia del cancer, existe un gran interes en el desarrollo de nuevos agentes antitumorales con un modo de accion novedoso, debido al desarrollo de resistencia a los farmacos anticancengenos existentes por las celulas tumorales. Los peptidos son de gran interes como nuevos farmacos terapeuticos, por su papel como mediadores de funciones biologicas importantes y sus propiedades intnnsecas unicas que los hacen agentes terapeuticos particularmente atractivos. Los peptidos muestran una alta actividad biologica, que se asocia con baja toxicidad y alta especificidad. Los beneficios que se obtienen de estas caractensticas incluyen una elevada especificidad de union a la diana deseada, una reduccion de las interacciones adversas farmaco a farmaco y la menor acumulacion en los tejidos, lo que reduce el riesgo de complicaciones debido a metabolitos intermediarios (Vlieghe y otros, 2010, Drug Discovery Today, 15:40-56). En la actualidad existen terapias anticancer que utilizan peptidos y/o pequenas moleculas, con selectividad de union a una protema diana espedfica, la cual tiene una funcion biologica importante en el desarrollo del cancer. En un primer escenario, estas terapias pueden dirigirse a inhibir una funcion espedfica de una protema y causar la apoptosis de la celula tumoral, por ejemplo: Los inhibidores de las protemas de estres termico (HSPJ (Subbarao y otros, 2004, Pharmacology & Therapeutics, 101:227-257); Inhibidores de la tirosina quinasa (Garrido y otros, 2007, Rev Med Chil. 10:1327-1332). En la mayona de las situaciones estas protemas se consideran aberrantes en el proceso maligno, cuando se comparan con el tejido normal.

En un segundo escenario, el farmaco se une a una protema diana que puede o no ser aberrante en el proceso maligno comparado al tejido normal, en este caso se afectan las vfas de senalizacion que estan activas en el proceso de malignidad, por ejemplo: inhibidores de la replicacion del acido desoxirribonucleico (ADN), inhibidores del ensamblaje de los microtubulos e inhibidores del factor transcripcional NFkB.

Mientras que el primer escenario es altamente efectivo en determinadas neoplasias malignas hematopoyeticas, la mayona de estas terapias tiene efectividad limitada en la complejidad de los tumores solidos Por el contrario, el segundo escenario incluye algunos de los farmacos mas efectivos para el cancer y mas toxicos en la farmacopea oncologica. Por esta razon, se necesita avanzar en la busqueda de nuevos farmacos que sean cada vez mas selectivos y efectivos, y al mismo tiempo que minimicen su toxicidad.

En este sentido la identificacion de nuevas dianas terapeuticas y la comprension de su papel en el desarrollo del cancer, ayudara a identificar nuevos mecanismos de resistencia a farmacos y facilitara el diseno de nuevos farmacos que retengan una mayor actividad y puedan combinarse con los ya existentes, para reducir su toxicidad e incrementar la calidad de vida del paciente con cancer. La protema COMMD1, previamente conocida como MURR1 (van de Sluis y otros, 2002, Human Molecular Genetic, 11:165-173) pertenece a una nueva familia de protemas, conocidas por su acronimo COMMD (Dominio del gen MURR1 del Metabolismo del Cobre, abreviado COMMD). Los diez miembros de la familia de protemas son altamente conservados en organismos pluricelulares y se expresan ubicuamente, pero las funciones biologicas de la mayona de sus miembros se desconocen. La caractenstica principal de esta familia es la presencia del dominio COMM (Dominio Murr1 del Metabolismo del CobreJ conservado y unico, que comprende los residuos de aminoacidos 110-190 de la region C-terminal (Burstein y otros, 2005, The Journal of Biological Chemistry, 280:22222-22232). COMMD1 se asocia a diversos procesos biologicos tales como: el control del metabolismo del cobre (Tao y otros, 2003, Journal of Biological Chemistry, 278:41593-41596); la regulacion del transporte intracelular de sodio (Biasio y otros, 2004, Journal of Biological Chemistry, 279:5429-5434); la inhibicion del factor trascripcional NFkB (Maine y otros, 2007,The EMBO Journal, 26:436-447); la inhibicion de la expresion de genes regulados por el factor inducible por hipoxia HIF-1a (van de Sluis y otros, 2007, Molecular and Cellular Biology, 27:4142-4156).

COMMD1 presenta interaccion ffsica con la subunidad RelA (p65) del factor transcripcional NFkB, con la subunidad catalftica-a del factor HIF-1a, y con Delta ENaC en los canales epiteliales de sodio. En todos los casos esta interaccion conlleva a la degradacion de estas protemas “clientes” a traves de un mecanismo que involucra la ubiquitinacion y las vfas de degradacion en el proteosoma. Se demostro que el dominio COMM esta involucrado en las interacciones protema a protema, tanto para protemas “clientes” de COMMD1, asf como interacciones entre los miembros de la familia. Existe una propuesta para la estructura tridimensional de la region N-terminal de COMMD1,

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pero aun no existe una estructura terciaria para el dominio COMM (Sommerhalter y otros, 2007, Journal of Molecular Biology, 365:715- 721).

La expresion basal de COMMD1 en la celula se controla mediante un proceso de ubiquitinacion y degradacion proteosomal, a traves de una serie de residuos de leucina, que se localizan en el dominio COMM (Maine y otros, 2009, Biochemical Journal, 417:601-609). Recientemente, se describio que COMMD1 tiene un mecanismo constitutivo de transporte de citoplasma a nucleo a traves de senales de exportacion nuclear (NES) que se ubican, ademas, en su dominio COMM. Se describe que una disrupcion en las secuencias de leucina y/o agentes que inhiban la degradacion proteosomal, producen un aumento de la expresion de COMMD1 en las celulas. Ademas, la disrupcion de las secuencias nEs en COMMD1 incrementan la represion de la actividad transcripcional de los factores NFkB y HIF-1a (Muller y otros, 2009, Traffic, 10:514-527).

Las celulas tumorales sobreexpresan diferentes protemas, tales como la protema XIAP (Inhibidor de apoptosis ligado al X) y clusterina secretoria (sCLU). Ambas protemas promueven la degradacion de COMMD1 y facilitan la activacion de NFkB y la supervivencia de la celula tumoral. Se reporta que inhibidores del proteosoma, tal como MG132 (Shirley et al, 2005, Neoplasia 7:1104-1111; Zhou y otros, 2009, Cancer Research, 21:333-339), presentan efecto antitumoral mediante la inhibicion del mecanismo de ubiquitinacion y degradacion proteosomal. Compuestos que se unen a XIAP inducen apoptosis, porque bloquean el efecto inhibitorio de esta protema sobre la activacion de la caspasa-3 y la caspasa-9 (Vogler y otros, Cancer Research, 2009, 69:2425-2434). Se propone que el acido ribonucleico de interferencia (ARNi) disenado para inhibir la funcion de sCLU tiene efecto antitumoral, por estabilizar un inhibidor citoplasmatico del factor NFkB conocido como I-kB (Zoubeidi y otros, 2010, Molecular Cancer Research, 8:19-30).

En la solicitud de patente internacional WO 07/095867, la esencia de la invencion se relaciona con peptidos derivados de la region 32-51 de la protema LALF (factor antilipopolisacaridos de Limulus), en los que se realizaron sustituciones de aminoacidos para asegurar la disociacion de la capacidad de union al LPS e incrementar las actividades antitumoral e inmunomoduladora. Uno de esos peptidos es el nombrado peptido L2. Ademas, en otra Invencion (Solicitud internacional PCT/CU2008/000006) se revela la capacidad de penetracion en celulas de los peptidos anteriormente mencionados. Sin embargo, en tales invenciones no se describe ni se sugiere el mecanismo de accion de tales peptidos. Vallespi y otros, J Pept Sci. 2010 Enero;16(1):40-47 se refiere a un peptido que modifica la expresion genica de las celulas tumorales y exhibe un efecto antitumoral.

Van de Sluis y otros, J Clin Invest. 2010 Junio; 120(6):2119-30 se refiere a COMMD1 y a la invasion de las celulas tumorales.

En la actualidad existe un numero de terapias para el tratamiento del cancer (quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, etc.), muchas de las cuales se encuentran en fase de ensayos clmicos. Sin embargo, aun persisten desventajas asociadas a estas terapias tales como: la poca selectividad, la toxicidad y el desarrollo de resistencia al farmaco. Otro aspecto importante a tener en cuenta en este campo es la seleccion de biomarcadores utiles como diagnostico y/o predictores de eficacia de un farmaco. Por tanto, aun existe la necesidad de investigar y descubrir nuevas moleculas que sean utiles en el tratamiento y/o diagnostico del cancer, y el diseno de farmacos mas selectivos y eficaces con menor toxicidad.

Descripcion de la invencion

La presente invencion resuelve el problema mencionado anteriormente, porque proporciona un agente o una composicion que comprende el agente, para usar de conformidad con la reivindicacion 1. En la presente descripcion se describe un metodo para el tratamiento del cancer mediante el incremento de la localizacion nuclear de la protema COMMD1. Este incremento causa la reduccion o el bloqueo de la proliferacion de las celulas tumorales.

En esta invencion se describe, por primera vez, que el peptido L2 (con secuencia HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, Sec. con num. de ident. 1) y COMMD1 interaccionan en las celulas, y que la localizacion nuclear de COMMD1 se asocia con la muerte de la celula tumoral. De este modo, en la presente descripcion se describe el uso de la protema COMMD1, en la identificacion de compuestos con actividad antitumoral que facilitan la acumulacion y localizacion nuclear de COMMD1.

Los datos proporcionados en la presente descripcion demuestran que el peptido L2 interacciona con COMMD1, espedficamente en la region comprendida entre los aminoacidos 110-190. Ademas, el peptido L2 produce la acumulacion nuclear de COMMD1. Adicionalmente, se reporta por primera vez que la expresion de la protema COMMD1 que contiene secuencias de localizacion nuclear (NLS) es suficiente para inducir la muerte celular. Por tanto, en la presente descripcion se describe el uso de COMMD1, como diana terapeutica en el tratamiento del cancer.

Ademas, el peptido L552 (Sec. con num. de ident. 3) se optimizo a partir de la secuencia del peptido L2 (Sec. con num. de ident. 1), para favorecer la acumulacion de COMMD1 en el nucleo de las celulas tumorales, e incrementar el efecto antitumoral de este peptido. El peptido L552 (Sec. con num. de ident. 3), descrito en esta invencion, que se optimizo

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para facilitar la localizacion nuclear de COMMD 1, tiene la siguiente secuencia:

Ac-HARIKpTFRRIKWKYKGKFW Sec. con num. de ident. 3

La optimizacion se baso en modificaciones qmmicas, que se realizaron mediante sustituciones de aminoacidos naturales por aminoacidos no naturales (D- aminoacidos) en posiciones espedficas (que se representan en minusculas y negritas en la secuencia que se incluyo anteriormente) y mediante la proteccion del extremo N-terminal mediante acetilacion (que se indica como Ac- en la secuencia que se incluyo anteriormente). Estas modificaciones que se realizaron al peptido L2 (Sec. con num. de ident. 1), y que dan lugar al peptido L552 (Sec. con num. de ident. 3), garantizan la acumulacion mas alta de la protema COMMDl en el nucleo de las celulas y un incremento en la actividad antitumoral del peptido L552, con respecto al peptido original L2. Por tanto, el peptido L552 es una nueva clase de molecula que interacciona con COMMD1, que facilita su localizacion nuclear e inhibe la proliferacion de las celulas tumorales.

Ademas, en la presente descripcion se describe el uso de agentes que incrementan la localizacion nuclear de la protema COMMD1 en la fabricacion de farmacos para la terapia del cancer. Entre los agentes o compuestos que facilitan la acumulacion nuclear de COMMD1 se incluyen, por ejemplo: protemas (que incluye los anticuerpos), mutemas, peptidos, polinucleotidos, aptameros, acidos nucleicos y pequenas moleculas organicas. Estos compuestos pueden aislarse de fuentes naturales, prepararse sinteticamente o mediante la tecnologfa recombinante, o cualquier combinacion de estas. En la invencion, el agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 es el peptido L552 (Sec. con num. de ident. 3). En el contexto de esta invencion, incrementar o favorecer la acumulacion nuclear de la protema COMMD1 en el nucleo de las celulas, tiene el mismo significado. Ademas, en la presente descripcion se describe que el agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 puede ser del tipo acido nucleico, como un vector de expresion de celulas de mairnferos que contiene una secuencia de DNA que codifica para la protema COMMD1 a la que se introdujeron secuencias NLS. Este tipo de vector puede usarse como terapia genica.

La invencion proporciona, ademas, una composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 6.

En la presente descripcion se describe una composicion farmaceutica para el tratamiento del cancer que comprende un agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1. Ademas, en la presente descripcion se describe la composicion farmaceutica que comprende una cantidad efectiva del agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 (determinada por su concentracion inhibitoria 50, (IC50) y excipientes o veldculos farmaceuticamente aceptables. La composicion puede administrarse por via parenteral o topica.

La administracion de una composicion farmaceutica que comprende un agente que incremente la localizacion nuclear de la protema COMMD1 constituye una composicion o agente para usar en un metodo para el tratamiento o la prevencion de un tumor solido en una persona, en donde el metodo comprende la administracion de una cantidad efectiva de un agente que facilite la localizacion nuclear de COMMD1, para reducir o bloquear el crecimiento de las celulas tumorales.

En la presente descripcion se describe que el agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 puede administrarse a paciente con leucemia, espedficamente leucemia mielodtica, para bloquear la proliferacion de las celulas tumorales. Este agente puede ser efectivo, incluso en la presencia de un estfmulo inflamatorio tal como el lipopolisacarido bacteriano (LPS).

La invencion proporciona, ademas, una combinacion farmaceutica para el tratamiento del cancer de conformidad con la reivindicacion 8.

Se muestra que el peptido L552 puede usarse en combinacion con la quimioterapia estandar para producir un efecto sinergico y para reducir la dosis de los citostaticos tales como cisplatino y 5-fluoracilo (5-FU). En la presente descripcion se describe una combinacion farmaceutica para el tratamiento del cancer que comprende uno o varios agentes que incrementan la localizacion nuclear de la protema COMMD1, y una o varios farmacos espedficos para la quimioterapia del cancer. En una modalidad de la invencion, tal agente es el peptido L552 y el farmaco espedfico para la quimioterapia estandar se selecciona entre cisplatino y 5-FU. En esta combinacion farmaceutica los agentes y los farmacos que se incluyen en esta pueden administrarse simultaneamente, separadamente, o secuencialmente durante el tratamiento.

Por otra parte, datos recientes difundieron el concepto de que la inflamacion es un componente cntico de la progresion tumoral. Actualmente el microambiente inflamatorio se cataloga como un rasgo caractenstico del tumor, el cual se encuentra dentro de las seis caractensticas mas importantes del cancer, descrito por Hanahan y Weinbergs (Perwez y otros, 2007, Int J Cancer, 121:2373-2380).

Los datos que proporciona la presente descripcion indican que el peptido L552 es efectivo en bloquear el crecimiento de las celulas tumorales en presencia de un estfmulo inflamatorio. Similarmente, la expresion de la protema GFP-N-

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COMMD1 (que contiene Secuencias de Localizacion Nuclear) que se transfecta transitoriamente en las celulas tumorales, proporciona el mismo efecto que el peptido L552. Mas espedficamente, los resultados demuestran que el peptido L552 promueve la muerte de la celula tumoral en presencia de estimulos inflamatorios tales como el LPS y el TNF (factor de necrosis tumoral a). Similarmente, los datos experimentales demuestran la efectividad del peptido en un modelo murino de tumor de colon, en el cual los ratones se retaron con un estfmulo inflamatorio mediante la inyeccion de LPS.

Por esta razon, ademas, la presente descripcion describe un metodo para inhibir el desarrollo de los tumores asociados con inflamacion y sus metastasis, que comprende la administracion del peptido L552 a una persona que lo necesite. Entre los tumores que se asocian con inflamacion y metastasis se encuentran, por ejemplo, los siguientes canceres: colorectal, esofago, pulmon, prostata, mama, pancreas e dgado.

Ademas, la administracion del peptido L552 puede usarse, profilacticamente, para prevenir el desarrollo de cancer asociados con inflamacion cronica, tales como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, pancreatitis, cirrosis, etc. Por tanto, ademas, la presente descripcion describe un metodo para la prevencion del cancer asociado con inflamacion cronica, que se caracteriza por la administracion del peptido L552 o una composicion que comprende dicho peptido a una persona que lo necesite.

Respecto a la dosis y esquema de tratamiento a seguir con las composiciones que comprenden el peptido L552, como un agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1, un experto puede determinar facilmente las dosis y el esquema de tratamiento (profilactico o terapeutico). Las cantidades efectivas pueden variar en dependencia de la potencia relativa de las composiciones individuales, y pueden calcularse basada en el peso molecular del peptido y la IC50 in vitro o en estudios animales. Por ejemplo, dado el peso molecular del compuesto (estructura qmmica) y la dosis experimental efectiva (IC50) una dosis en mg/kg puede calcularse rutinariamente. En general las dosis son de 0,24 mg/kg de peso. El peptido o la composicion que lo contiene pueden administrarse una vez o varias veces, semanalmente o aun por varios meses.

Ademas, en la presente descripcion se describe el uso de COMMD1 como un marcador pronostico novedoso para los pacientes con cancer, mediante la determinacion de la presencia o ausencia de la localizacion nuclear de la protema COMMD1 en una muestra.

Similarmente, el peptido L552 proporciona un agente activo para tratar enfermedades donde las protemas COMM tienen un papel, o toman parte, en la progresion de la enfermedad. Esto es posible, por ejemplo, en enfermedades donde la cantidad de cualquiera de los miembros de la familia de protemas COMMD esta aumentada o disminuida y/o sus actividades se aumenten o se reduzcan, y esto cause la enfermedad. La capacidad del peptido L552 para unirse al dominio COMM, comprendido entre los residuos de los aminoacidos 110-190 del extremo C terminal de las protemas COMMD, sustentan la actividad terapeutica de estos.

La invencion ademas proporciona un peptido de conformidad con la reivindicacion 11.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. La figura 1 ilustra la interaccion ffsica entre el peptido L2 y COMMD1. Esto se realizo mediante la tecnica de dos dbridos de levadura. Como controles negativos se uso el apareamiento de la cepa de levadura AH109 transformada con el vector vado (pGBKT7) y los fragmentos de COMMD1 transformados en la cepa Y187. Para la identificacion de la interaccion se realizo el apareamiento de la cepa AH109 transformada con el vector que contiene la secuencia de L2 y cada fragmento de COMMD1 transformado en la cepa Y187. Como un control positivo, se utilizo el apareamiento pCL1 que contiene el factor de transcripcion GAL4. Como puede observarse, la interaccion ocurre con los plasmidos que contienen la secuencia completa del gen de COMMD1 y la construccion que contiene los aminoacidos 110-190 de la protema COMMD1.

Figura 2. (A) La figura ilustra la validacion de la interaccion del peptido L2 con COMMD1 mediante la inmunoprecipitacion (pulldown) en celulas SW948. En este experimento se muestran 100 |jg de protemas totales (PT), la protema COMMD1 recombinante que se obtiene en Escherichia coli (COMMD1 r), y el patron de peso molecular (PM). (B) La figura ilustra la localizacion subcelular de COMMD1 en celulas SW948 tratadas con el peptido L2: Expresion de COMMD1 en nucleo (N), expresion de COMMD1 en citoplasma (C), celulas no tratadas (NT). La Beta Actina se muestra como un control de la fraccion citoplasmatica, y la protema humana ribonuclear (hnRNP) como un control de la fraccion nuclear.

Figura 3. (A) La figura ilustra la mayor acumulacion nuclear de COMMD1 por el peptido L552 optimizado. Las protemas Beta Actina y la hnRNP se usaron como control de la fraccion del citosol y nuclear respectivamente. (B) La figura muestra la interaccion entre el peptido L552 y la protema COMMD1 en diferentes lmeas de celulas tumorales, en experimentos de inmunoprecipitacion (pulldown). No se detecto interaccion con la protema Culina7 (CUL7). La presencia de Beta Actina se muestra en extractos de protemas totales de numerosas lmeas celulares.

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Figura 4. Efecto antiproliferativo de los peptidos en celulas tumorales de diferentes ongenes histologicos, L0 (linfocitos humanos aislados de sangre periferica).

Figura 5. Efecto antitumoral del peptido L552 en el modelo de tumor TC-1. (A) Se muestran las curvas de inhibicion del crecimiento del tumor. (B) Se muestra el porcentaje acumulativo de supervivencia de los diferentes grupos experimentales.

Figura 6. La expresion de la protema COMMD1 que contiene secuencias de localizacion nuclear (NLS) es suficiente para inducir la muerte celular. Se muestra el porcentaje de celulas no viables que se transfectaron transitoriamente con: la protema verde fluorescente (GFP) como un control negativo y con las construcciones geneticas GFP-COMMD1 y GFP-N-COMMD1.

Figura 7. (A) Se muestra la quimiosensibilidad al 5-FU en celulas de carcinoma de colon HT-29 que se transfectaron con GFP-N-COMMD1. Se indican los valores de IC50. (B) Se ilustra el efecto de un ambiente inflamatorio mediante la adicion de LPS y TNF-a sobre la IC50.

Figura 8. Ilustra el efecto del peptido L552 sobre la proliferacion de celulas tumorales en presencia de diferentes estfmulos inflamatorios. (A) Celulas de leucemia mieloide humana (THP-1) y (B) celulas de carcinoma de colon murino (CT-26) tratadas con LPS y TNF-a. Se muestran los valores de IC50.

Figura 9. Efecto antitumoral del peptido L552 en un modelo de cancer de colon en ratones BALB/c sometidos a un estfmulo inflamatorio por inyeccion de LPS. (A) Se muestra el porcentaje acumulativo de supervivencia de los diferentes grupos experimentales. (B) Se muestra el promedio del volumen tumoral para cada grupo experimental.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Interaccion ffsica entre el peptido L2 y COMMD1.

Para identificar las interacciones del peptido antitumoral L2 con las protemas se utilizo el sistema de dos hforidos de levadura. Para el clonaje de las secuencias correspondientes al peptido se disenaron los siguientes oligonucleotidos:

L2F:

CATGCACGCT AGAAT CAAGCCAACCTT CAGAAGATTG AAGT GG AAGTACAAGG

GTAAGTT CTGGT AA

L2R:

GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTT

GATTCTAGCGTG

que corresponden a la secuencia peptfdica de L2: HARIKPTFRRLKWKYKGKFW

Para el clonaje de estas secuencias en el vector pGBKT7 Ncol-BamHI, se adicionaron en los extremos de los oligonucleotidos secuencias complementarias a estos sitios. El plasmido recombinante pGBKL2-1, que contiene la secuencia del peptido L2 se verifico por analisis de restriccion y secuenciacion. La cepa de levadura AH 109 se transformo con el plasmido, por el metodo de acetato de litio, y se cultivo en el medio SD-Trp. Se verifico que no era capaz de autoactivarse al sembrarse en placas SD-Trp-His. Para el tamizaje de las interacciones se utilizo una libreria proveniente de ADNc de Imgado humano con la cual se transformo la cepa Y187. Para la formacion de los diploides y la seleccion de las interacciones 5x108 celulas de AH109 que contienen el plasmido pGBKL2-1 se cultivaron con 5x108 celulas de Y187 que contienen la librena de ADNc de hngado humano, durante 4 horas en medio solido YPDA a 30 °C. A las placas de medio YPDA se le anadieron 10 ml de agua esteril en su superficie, y las celulas se suspendieron cuidadosamente con espatulas, se transfirieron a 15 placas de SD-Trp- Leu-His-A de medio mrnimo y se crecieron a 30 °C durante 7 dfas. Las 74 colonias resultantes se transfirieron a medio lfquido SD-Trp-Leu en placas de 96 pocillos profundos. Despues de observar el crecimiento en medio lfquido se realizo la purificacion del ADN de levaduras. Cada uno de los ADN se transformo individualmente en la cepa de E.coli DH10B, se purificaron los ADN y se conservaron a - 20 °C. Con cada uno de los clones individuales se transformo la cepa de levadura Y187 y se verifico la interaccion mediante el apareamiento con la cepa de AH109 transformada con los plasmidos pGBKT7 y pGBKL2-1. Se secuencio el ADN de los clones positivos. El analisis de las secuencias que se realizo mediante el uso del programa BLAST (Altschul y otros, 1990. J Mol Biol, 215:403-410) revelo que uno de los clones (L2-21) se corresponde con la secuencia del gen que codifica para los aminoacidos 6-190 de la protema COMMD1, y que este clon es capaz de interaccionar con el plasmido que contiene la secuencia del peptido L-2. Para identificar espedficamente la region de la protema COMMD1 responsable de esta interaccion se realizaron deleciones a la construccion del plasmido pGBKL2-1, lo que genero los clones pGBKL2 (6-110), pGBKL2 (6-70), pGBKL2 (71-190), pGBKL2 (110-190). Como se aprecia en la Figura 1, la interaccion se conserva solo en el plasmido pGBKL2 (110-190) que contiene el dominio COMM responsable de las interacciones descritas para las protemas de la familia COMMD. Este resultado ilustra que el peptido L2 se une

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espedficamente a la region entre los aminoacidos 110-190.

Ejemplo 2. Experimentos de inmunoprecipitacion (pulldown) y determinacion de la localizacion nuclear de COMMD1 en celulas tumorales tratadas con el peptido L552.

Los experimentos se dividieron en dos bloques:

(A) El peptido sintetico L2 (Sec. con num. de ident. 1), se sintetizo mediante un procedimiento en fase solida, se biotinilo y se uso como “cebo” unido a una resina de estreptavidina sefarosa. Como “presa” se utilizo un extracto de protemas totales de SW948 (lmea celular de carcinoma de colon humano). Estos experimentos se conocen como “pulldown". El extracto de protemas totales se obtuvo a partir de 2 x 107 celulas mediante el uso de tampon de extraccion (Triton X-100 0,5 % 25 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCI; 1 mM EDTA; 10 % glicerol; 1 mM Ditiotreitol (DTT), y un inhibidor de proteasas. El peptido biotinilado (300 |jg) se incubo con 50 jl de la resina estreptavidina sefarosa (GE Healthcare), durante una hora y se realizaron lavados con tampon fosfato salino (PBS 1 X) mas DTT 1 mM. Posteriormente, se incubaron 500 jl de protemas totales con 50 jl de resina que contiene el peptido biotinilado, a temperatura ambiente durante 5 horas. Posteriormente, la resina se lavo extensivamente con PBS 1X y DTT 1 mM. Las protemas que permanecen unidas a la resina son aquellas que interaccionan con el peptido, y se diluyeron en 25 jl de tampon para electroforesis (Tris HCI 62,5 mM; pH 6,9; 0,1M DTT, Dodecilosulfato de sodio (SDS) 20 %, glicerol 10 % y bromofenol azul 0,01 %). Para detectar la protema de interes se realizo una electroforesis en gel de poliacrilamida (7,5 %), seguido por la inmunodeteccion por “Western blot”. Para detectar la protema COMMD1, se utilizo un anticuerpo monoclonal contra la protema COMMD1 (Sigma, clon 2A12). Como controles positivos se usaron un extracto de protemas totales (100 jg) y la protema recombinante COMMD1 que se obtuvo en E. coli. Los resultados que se muestran en la Figura 2A demuestran que el peptido L2 concentra la protema COMMD1 en el experimento de inmunoprecipitacion cuando se compara con el extracto de protemas totales. Esto indica la interaccion entre L2 y COMMD1.

(B) Las celulas SW948 (3x106 celulas) se incubaron durante 5 horas a 37 °C y 5 % CO2 con el peptido L2 (50 jM). Posteriormente, se obtuvieron las protemas citoplasmaticas y nucleares, como se describe (Vancurova y otros, 2001, Journal of Biological Chemistry, 276: 19746-19752). La deteccion de COMMD1 se realizo por “Western blot”, mediante el uso de un anticuerpo anti-COMMD1. La Figura 2B demuestra la localizacion nuclear de COMMD1 en celulas SW948 tratadas con el peptido L2. La Beta Actina se utilizo como control de la fraccion citoplasmatica y la ribonucleoprotema humana (hnRNP) como un control de la fraccion nuclear.

Ejemplo 3. Optimizacion del peptido L552 para la acumulacion nuclear de COMMD1.

Al considerar que el peptido L2 y COMMD1 tienen una interaccion ffsica, y esto se asocia con la localizacion nuclear de COMMD1, se disenaron varios peptidos a partir de L2 (Sec. con num. de ident. 1), para potenciar la acumulacion nuclear de COMMD1. Los peptidos descritos en la presente descripcion se sintetizaron mediante el uso de un procedimiento en fase solida. El peptido crudo se extrae con una solucion de acido acetico al 30%; se liofiliza y posteriormente se purifica por cromatograffa de fase reversa RP-HPLC. La masa molecular de los peptidos purificados se verifica mediante espectrometna de masa. La preparacion resultante no es antigenica, no es pirogenica y es aceptable farmaceuticamente para su administracion en animales y humanos. Las sustituciones se realizaron puntualmente, mediante la introduccion de D-aminoacidos en posiciones espedficas en el peptido original L2, cuya secuencia es HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (Sec. con num. de ident. 1), tal como se muestra en la Tabla 1. En un caso, se bloqueo, ademas, el extremo N-terminal por acetilacion.

Tabla 1. Secuencia de los peptidos utilizados en la invencion

Peptido

Secuencia aminoaddica Sec. Num. Ident. Caractensticas

L2

HARIKPTFRRLKWKYKGKFW 1 Peptido descrito previamente en la solicitud WO 07/095867

L551

HARIKpTFRRIKWKYKGKFW 2 Peptido con D- aminoacidos en las posiciones P-6 y L-11

L552

Ac- HARIKpTFRRIKWKYKGKFW 3 Peptido con D- aminoacidos en las posiciones P-6 y L-11, y acetilado en la N-terminal

L553

HARIKPTFRRIKW kYKgKFW 4 Peptido con D- aminoacidos en las posiciones K-14 y G-17

L554

HArlKpTFRRLKWKYKGKFW 5 Peptido con D- aminoacidos en las posiciones R-3 y P-6.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Nota: los aminoacidos en negritas y minusculas significan cambios por D-aminoacidos

En este experimento el objetivo fue identificar un peptido con alta capacidad para producir la acumulacion de COMMD1 en el nucleo de las celulas. Las celulas SW948 (3x106 celulas) se incubaron durante 5 horas a 37 °C y 5 % CO2 con los peptidos L2, L551, L552, L553 y L554 (50 |jM). Posteriormente, se realizo el aislamiento de las protemas citoplasmaticas y nucleares como se describe en el Ejemplo 2. La deteccion de COMMD1 se realizo por “Western blot”, mediante el uso de un anticuerpo anti-COMMDI. La Figura 3A demuestra la localizacion nuclear de COMMD1 en celulas SW948 tratadas con los peptidos mencionados anteriormente. Los resultados indican que el peptido L552 induce la mayor acumulacion de COMMD1 en el nucleo de las celulas tumorales. Adicionalmente, se demuestra la interaccion entre el peptido L552 y COMMD1 mediante experimentos de inmunodeteccion (pulldown,) en diferentes lmeas de tumor, Figura 3B. Estos resultados validan la interaccion entre L552 y COMMD1. Ademas, la interaccion se relaciona con la facilitacion de la acumulacion nuclear de COMMD1.

Ejemplo 4. Ilustra el incremento del efecto antiproliferativo del peptido L552 en diferentes lmeas tumorales.

Para este ensayo las celulas tumorales de origen humano H-82 (cancer de pulmon de celulas pequenas), H-125 (cancer de pulmon de celulas no pequenas), MCF-7 (adenocarcinoma de mama), MDA-MB231 (adenocarcinoma de mama positivo para el receptor del factor de crecimiento epidermico), LS174T (adenocarcinoma colorectal) y HT-29 (adenocarcinoma colorectal resistente a la quimioterapia), se sembraron en placas de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 1 x 104 celulas/ml en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero fetal bovino (Gibco). Despues de 24 horas, los peptidos se adicionaron al medio de cultivo en un intervalo de dosis entre 9 jM y 300 jM. La incubacion se realizo durante 48 horas en presencia de CO2 al 5 % y pasado este tiempo se revelo con 3-(4,5-dimetiltiazol-2-iI) 2,5 bromuro de difeniltetrazolio (MtT) (Gray MJ y otros, 2008, Natl Cancer Inst, 100:109-20).

Finalmente, se realizo la lectura de la placa a una absorbancia de 492 nm. Cada punto se realizo por duplicado, y los experimentos se realizaron al menos dos veces de manera independiente. Los valores de IC50 se obtuvieron de las curvas de proliferacion celular respectivas. Los resultados se muestran en la Figura 4. Los resultados demuestran que la acetilacion en el extremo N-terminal y la sustitucion por D-aminoacidos, en posiciones espedficas, garantizan un incremento en el efecto antiproliferativo del peptido l552. Sin embargo, no se observo ningun efecto en linfocitos humanos aislados de sangre periferica. Este resultado demuestra que el peptido L552, objeto de esta invencion, incrementa su efecto citotoxico selectivo sobre celulas tumorales sin provocar aumento de la toxicidad en celulas sanas. Los resultados aportados demuestran que el peptido L552 se optimizo para su interaccion con la protema COMMD1, para facilitar su acumulacion adicional en el nucleo y para aumentar el efecto antiproliferativo selectivo sobre las celulas tumorales.

Ejemplo 5. Efecto antitumoral del peptido L552 en un modelo murino de tumor TC-1.

En estos ensayos se usaron ratones C57BL/6 hembras, entre 8 y 10 semanas de edad (n=10 animales por grupo experimental). Para la implantacion del tumor en este modelo, usamos las celulas TC-1 derivadas de celulas epiteliales de pulmon de C57BL/6 malignizadas, en forma de suspension en solucion salina (PBS). Una cantidad de 5 x 104 celulas en un volumen de 200 jl se inoculo en los ratones por via subcutanea en la pata posterior derecha. Una vez que los tumores alcanzaron 100 mm3 de volumen, se administraron cinco dosis de los peptidos (L2, L552 y L551) con intervalos de 2 dfas, por via subcutanea en la pata posterior derecha. En este estudio se evaluo una dosis de 0,2 mg de peptido por kilogramo de peso (4 jg/raton). Los parametros que se evaluaron para medir el efecto antitumoral de los peptidos de interes fueron la supervivencia de los animales y la masa tumoral, como se muestra en las Figura 5A y Figura 5B. El peptido L552 fue mas efectivo en terminos de la capacidad para inhibir la progresion del tumor e incrementar la supervivencia de los ratones en comparacion con los peptidos L2 y L551. Estos resultados evidencian que las modificaciones que se introdujeron en el peptido L552 aumentaron la eficacia antitumoral in vivo. El analisis estadfstico para determinar diferencias significativas entre los grupos se realizo por el metodo log rank. Los resultados demuestran que el peptido L552 aumento significativamente (*p< 0,05) la supervivencia de los animales en comparacion con los otros peptidos evaluados. Estos resultados demuestran que las sustituciones por D-aminoacidos, en posiciones espedficas, y el bloqueo del extremo N-terminal por acetilacion, incrementan significativamente la capacidad antitumoral del peptido.

Ejemplo 6. Ilustra que la expresion de la protema COMMD1 que contiene secuencias de localizacion nuclear es suficiente para inducir la muerte celular.

Para confirmar el papel de la localizacion nuclear de COMMD1 en la inhibicion de la proliferacion celular, se generaron los plasmidos recombinantes pGFP-COMMD1, que expresa COMMD1 fusionada a la GFP, y pGFP-N-COMMD1, que contiene, ademas, la secuencia peptfdica de localizacion nuclear PKKKRKV. Para el clonaje de pGFP-COMMD1 se realizo la reaccion en cadena de la polimerasa mediante el uso de los oligonucleotidos:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

imagen1

Para la amplificacion del gen que codifica para COMMD1 con la introduccion de NLS se usaron los oligonucleotidos:

NF: TGCAGTCGACCCGAAAAAGAAAGGGAAACTTGAGGGTGGCAAACCC

CR: CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT.

Los clones recombinantes se analizaron por restriccion y secuencia de ADN. Ambas construcciones y el control pEGFP se transfectaron transitoriamente en las lmeas celulares HT-29 y HEK293 de forma transitoria mediante el uso de Polietilenimina (Sigma, USA) (Boussif, O y otros, 1995, Proc Nati Acad Sci, 92: 7297-7301), en placas de 24 pocillos, por duplicado. Despues de 72 horas uno de los pocillos se utilizo para evaluar la expresion de las protemas recombinantes mediante el empleo de un microscopio de fluorescencia Axiovert 40 (Zeiss, Alemania) y el objetivo APIan 10X. Al pocillo restante se le elimino el medio de cultivo y se realizo una tincion con una mezcla de Naranja de Acridina/Bromuro de Etidio (AO/BE) a una concentracion de 5 mg/ml en PBS, para la identificacion de la apoptosis (Rible D, y otros, 2005, BMC Biotechnology, 5:12-15), y las celulas se observaron en el microscopio Axiovert 40 y con el objetivo APIan 40X. Con este tipo de tincion la AO atraviesa la membrana de las celulas vivas y tine los nucleos y el citoplasma de las celulas en verde y en naranja, respectivamente, mientras que el BE solo penetra las celulas con perdida de la integridad de las membranas y tine el ADN en rojo. La fluorescencia del BE domina sobre la fluorescencia de la AO.

La tincion AO/EB muestra las celulas viables tenidas con AO en las transfecciones con GFP y GFP-COMMD1. Solamente en el caso de las celulas que se transfectaron con la construccion GFP-N-COMMD1 se observaron las celulas con el nucleo tenido por el BE, lo que indica que se encuentran en una fase tardfa de apoptosis. La Figura 6 muestra la grafica del porcentaje de celulas con el nucleo tenido de rojo, de tres campos independientes por condicion experimental. Se representan los valores y las desviaciones estandar. Estos resultados demuestran que la introduccion de NLS en la protema COMMD1, es suficiente para la induccion de la apoptosis en las celulas. Estos resultados demuestran, ademas, la utilidad de COMMD1 como nueva diana terapeutica.

Ejemplo 7. Ilustra el efecto de la localizacion nuclear de la protema COMMD1 en la sensibilidad a 5-FU como a estfmulos inflamatorios en la lmea celular HT-29.

(A) La lmea celular HT-29 que se transfecto transitoriamente con las construcciones descritas anteriormente se sembraron en placas de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 1 x 104 celulas/ml en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero fetal bovino (Gibco). Despues de 24 horas, el citostatico 5-FU se adiciono al medio de cultivo en un intervalo de dosis entre 0,025 |jM y 2500 |jM, en diluciones seriadas de 1:10. La incubacion se realizo durante 48 horas en presencia de CO2 al 5 % y al termino de la misma se revelo con MTT. Finalmente, se realizo la lectura de la placa a una absorbancia de 492 nm. Cada punto se realizo por duplicado, y se realizaron al menos dos experimentos de manera independiente. Los valores de IC50 se obtuvieron de las respectivas curvas de proliferacion celular. Los resultados que se presentan en la Figura 7 A demuestran que la expresion de COMMD1 con NLS (GFP-N-COMMD1) produce un aumento de la sensibilidad de las celulas tumorales al 5-FU. En este ejemplo se demuestra una reduccion en la IC50 en las celulas que expresan GFP-N-COMMD1 en comparacion con las celulas que expresan GFP o GFP- COMMD1. Estos resultados demuestran, ademas, la utilidad de COMMD1 como nueva diana terapeutica. Esto demuestra, ademas, que la localizacion nuclear de COMMD1 induce quimiosensibilidad a los citostaticos convencionales.

(B) La lmea celular HT-29 que se transfecto transitoriamente con la construccion GFP- N-COMMD1 se sometio a diferentes estfmulos inflamatorios, por ejemplo, LPS (40 jg/ml) y TNF-a (20 ng/ml) durante 30 minutos. Posteriormente la IC50 se evaluo como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Figura 7B.

Ejemplo 8. Ilustra el efecto del peptido L552 sobre la proliferacion de celulas tumorales sometidas a un estfmulo inflamatorio.

Para este ensayo, celulas de leucemia mielocftica aguda de origen humano (THP-1) y celulas de carcinoma de colon murino (CT-26) se sembraron en placas de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 1 x 104 celulas/ml en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS). Las celulas se mantuvieron durante 24 horas a 37 °C y 5 % de CO2. Despues de este tiempo se anadieron LPS (40 jg/ml) o TNF-a (20 ng/ml) durante 30 minutos. La Figura 8 presenta los valores de la IC50 de las lmeas celulares THP-1 y CT-26 en presencia o ausencia de los estfmulos anteriormente mencionados. Los resultados demuestran que el peptido L552 inhibe la proliferacion celular en las lmeas de cancer THP-1 y CT-26, en presencia de diversos estfmulos inflamatorios. Este resultado demuestra que el peptido L552 es efectivo en bloquear la proliferacion de las celulas tumorales sometidas a diferentes agentes inflamatorios.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ejemplo 9. Ilustra el efecto antitumoral del peptido L552 en un modelo de cancer de colon en ratones BALB/c sometidos a un estimulo inflamatorio por inyeccion con LPS.

En estos ensayos se usaron ratones BALB/c hembras, entre 8 y 10 semanas de edad (n=10 animales por grupo experimental). Para la implantacion del tumor en este modelo, se usaron las celulas CT-26 aisladas de un carcinoma de colon en ratones BALB/c. Un numero de 7 x 104 celulas en suspension, en 200 pl de PBS 1X, se inocularon por via subcutanea en la region axilar de los ratones. Despues de 11 dfas, los animales recibieron una inyeccion, que se administro por via intraperitoneal, de 10 pg LPS/raton (serotipo 055: B5, Sigma) en PBS. Una vez que los tumores alcanzaron 100 mm3 de volumen, un grupo recibio 5 dosis de peptido L552 (0.2 mg/kg de peso) en dfas alternos, un grupo recibio 5-FU en dosis de 20 mg/kg de peso. Los parametros de interes que se evaluaron en este experimento fueron la supervivencia de los animales y el aumento del volumen de la masa tumoral.

Los resultados presentados en la Figura 9 demuestran la eficacia del peptido L552 en un modelo de carcinoma de colon en el cual se adiciono una faceta inflamatoria, por inyeccion de LPS. (A) Los resultados demuestran que el peptido L552 fue mas efectivo en aumentar la supervivencia (*p<0,05) de los animales en comparacion con el grupo tratado con 5-FU, cuando se adiciona el LPS. El analisis estadfstico para determinar diferencias significativas entre los grupos se realizo por el metodo log rank. (B) El peptido L552 fue mas efectivo en terminos de capacidad para inhibir la progresion tumoral. El resultado que se presenta en este ejemplo demuestra que el peptido L552 es efectivo en el tratamiento de la inflamacion asociada al cancer.

Ejemplo 10. Ilustra el efecto sinergico de la combinacion entre el peptido L552 y la quimioterapia estandar.

Para este ensayo, las celulas tumorales HT-29 y H-125 se sembraron en placas de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 1 x 104 celulas/ml en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero fetal bovino (Gibco). Despues de 24 horas, se adiciono el peptido al medio de cultivo en un intervalo de dosis entre 9 pM y 300 pM y el farmaco citostatico se adiciono en un intervalo de dosis de diluciones seriadas de 1:10 por encima y por debajo de la IC50 reportada para cada lmea celular. La incubacion se realizo durante 48 horas en presencia de CO2 al 5 % y, se revelo con MTT. El efecto del tratamiento concomitante peptido y citostatico se analizo segun el programa computarizado CalcuSyn para el estudio de combinaciones de farmacos (Ting-Chao Chou, 2006, Pharmacological Reviews, 58: 621-681). Los datos que se presentan en la Tabla 2 demuestran que la combinacion del peptido con el citostatico puede reducir la cantidad de los citostaticos, dado por los valores que se muestran en el mdice de la tasa de reduccion del farmaco (RI). Estos resultados indican que el peptido puede administrarse en union con la quimioterapia estandar para proporcionar un tratamiento efectivo (fraccion de celulas afectadas entre 89 % - 94 %) con una menor cantidad del farmaco convencional. La combinacion 5-FU + peptido L552 permite una reduccion (IR) del citostatico de 20 veces en la lmea celular HT-29. Para la combinacion cisplatino + peptido L552 la reduccion del citostatico es de 5 veces en la lmea celular H-125. Estos resultados indican que el peptido puede administrarse en combinacion con el tratamiento estandar para cancer de pulmon y cancer de colon, lo que facilita la reduccion en la dosis del citostatico. Esto puede disminuir los efectos adversos asociados a la quimioterapia.

Tabla 2. Sinergismo de la terapia combinada entre el peptido L552 y los citostaticos 5-FU y cisplatino, para dos lmeas celulares de tumores humanos.

Lmea

Af Farmaco Farmaco RI RI

celular

(fraccion afectada) IC 5-FU ([Ml L552 (MM (5-FU) (L552)

HT-29

89 % 0,3 5000 700 20 5

Af (fraccion afectada) IC Farmaco cisplatino (MM) Farmaco L552(MM) RI (cisplatino) RI (L552)

H-125

94 % 0,5 273 308 5 3

Una IC < 1 significa sinergismo; IC = 1 significa aditividad; IC >1 significa antagonismo. Ademas, se muestra el Indice de Reduccion (RI) del farmaco en combinacion.

Claims (11)

1. Reivindicaciones

   1. Un agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 en una celula tumoral, o una composicion que comprende el agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 en una celula tumoral, para usar en un metodo para el tratamiento del cancer, en donde el agente comprende un peptido con la secuencia de aminoacidos de la Sec. con num. de ident. 3.
2. 2. Un agente para usar de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 en una celula tumoral comprende un peptido con la secuencia de aminoacidos identificada como Sec. con num. de ident. 3.
3. 3. Un agente para usar de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde el cancer es un tumor asociado con inflamacion y metastasis
4. 4. Un agente para usar de conformidad con la reivindicacion 3, en donde el tumor asociado con inflamacion y metastasis se localiza en el colon, recto, esofago, pulmon, prostata, mamas, pancreas o tugado.
5. 5. Un agente para usar de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el agente es un peptido con la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident. 3.
6. 6. Una composicion farmaceutica para la terapia del cancer que comprende uno o varios agentes que incrementan la localizacion nuclear de la protema COMMD1 en la celula tumoral, y excipientes o vehmulos farmaceuticamente aceptables, en donde el agente es un peptido con la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident. 3.
7. 7. La composicion de la reivindicacion 6, en donde el agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 en la celula tumoral es un peptido con la secuencia de aminoacidos identificada como Sec. con num. de ident. 3.
8. 8. Una combinacion farmaceutica para el tratamiento del cancer que comprende uno o varios agentes de conformidad con la reivindicacion 1 que incrementan la localizacion nuclear de la protema COMMD1, y uno a varios farmacos espedficos para la quimioterapia estandar del cancer.
9. 9. La combinacion farmaceutica de la reivindicacion 8, en donde el agente que incrementa la localizacion nuclear de la protema COMMD1 comprende un peptido con la secuencia de aminoacidos identificada como Sec. con num. de ident. 3, y el farmaco espedfico para la quimioterapia estandar del cancer se selecciona entre cisplatino y 5- FU.
10. 10. La combinacion farmaceutica de la reivindicacion 8, en donde los agentes y los farmacos que forman parte de la combinacion se administran simultaneamente, separadamente, o secuencialmente durante el curso del mismo tratamiento.
11. 11. Un peptido con capacidad de union al dominio COMM caracterizado porque tiene la secuencia de aminoacidos identificada como Sec. con num. de ident. 3.