KR20130051362A - 저산소 조건에 노출된 암세포에서 항암타깃 에이치에스피 90 알파의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저산소 조건에 노출된 암세포에서 항암타깃 Hsp 90 알파의 용도에 관한 것이다.

Description

저산소 조건에 노출된 암세포에서 항암타깃 에이치에스피 90 알파의 용도{Use of Hsp90 alpha in cancer cells in Hypoxia condition}

본 발명은 저산소 조건에 노출된 암세포에서 항암타깃 Hsp 90 알파의 용도에 관한 것이다.

암 또는 신생물은 신체의 어느 부위에서도 발생하는 악성의 신생 증식이다. 이는 세포의 조절되지 않는 증식을 특징으로 하며, 추정되는 세계적인 신규 발병율이 년간 약 6백만명에 이르는 커져가는 공중 보건 문제이다. 대부분의 국가의 경우, 암은 사망 원인으로서 심장 질환에 이어 두 번째이다. 이는 신체의 임의의 장기에서 발생할 수 있지만, 유방,후두, 장, 백혈구 등과 같은 일부 부위는 다른 부위 보다 공격당하기 쉬운 경향이 있다. 각각의 암은 특정 단계에서 분열하는 하나의 세포로부터 전파되며, 이는 이의 영역적 속박으로부터 자유로워져서, 무제한으로 증식하는 세포의 패밀리를 형성하여 종양의 형태로 출현한다.

정상 세포가 종양 세포로 전이되는 동안, 종양 세포가 생물체내의 모든 정상 세포의 증식을 매우 정밀하게 지배하는 법칙과 거의 무관하게 이의 독자적인 활동을 결정할 수 있도록 하는 의미심장하고 유전성인 변화가 일어난다. 자율성으로서 알려져 있는 이러한 새롭게 획득된 특성은 종양 세포의 가장 중요한 하나의 특징인데, 이는 이러한 특징이 없는 경우에는 종양이 아니기 때문이다. 종양 세포의 또 다른 구별되는 특징은 완벽한 형태의 기능을 결여한다는 점이다.

암세포와 정상 세포 간의 차이점은 정상 세포와 비교하여 암세포가 a) 낮은 pH b) 보다 큰 자유 라디칼 특성 c) 종양 생성된 호르몬 펩티드 d) 종양 관련 항원 e) 보다 낮은 칼슘 이온 및 보다 높은 칼륨 이온 농도 f) 다양한 칼륨 이소토프 비 g) 상승된 양의 메틸화된 누클레오티드 h) 보다 높은 혈장 미세단백질 및 뮤코폴리사카라이드 농도 i) 외인성 아연에 대한 보다 높은 필요성 및 j) 높은 생체수 함량을 지닌다는 것이다.

한편, 유전적으로 이질적인 질환(heterogeneous disease)인 유방암은 여성에서 가장 일반적인 악성질환이다. 전세계에서 매년 약 80만건의 새로운 사례가 보고되고 있으며(Parkin DM, et al., (1999). CA Cancer J Clin 49:33-64), 현재에도 유방 절제술이 의료 처치를 위한 최선의 선택이다. 1차 종양을 외과적 시술을 통해 제거하더라도, 진단시 검출하기 힘든 미세 전이(micrometastasis)로 인하여 국소 또는 원거리 부위에서 재발할 가능성이 있다(Saphner T, et al., (1996). J Clin Oncol, 14, 2738-46). 이러한 잔존 세포 또는 전암(前癌) 세포를 사멸시키기 위하여 수술 후에는 통상 보조치료(adjuvant therapy)로서 세포독성 약제(Cytotoxic agents)를 투여한다. 전통적인 화학 치료는 종종 경험에 의존하거나 대부분 조직학적인 발암 요소를 근거로 삼고 있다. 특정한 역학적 지식이 없는 상태에서는, 표적 지향적 치료제가 유방암에 대한 기반 치료에 쓰이고 있다. 타목시펜(Tamoxifen) 및 아로마타제 저해제(aromatase inhibitors)은 상기 표적 지향적 치료제의 대표적인 종류이며, 전이성 유방암 환자에서 보조제 또는 화학예방법으로서 사용하는 경우 효과적이라는 보고가 있다(Fisher B, et al., (1998). J Natl Cancer Inst, 90, 1371-88; Cuzick J (2002). Lancet 360, 817-824).

관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020040096595호는 '암 진단과 관련된 재료 및 방법'에 관한 것으로, 유방 종양 세포의 특징적인 발현 프로필의 생성 방법에 있어서,(a) 상기 유방 종양 세포 및 정상 유방 세포로부터 발현 산물을 단리하는 단계;(b) 종양 및 정상 유방 세포 둘 모두에 있어서의 상기 발현 산물을 표 2의 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 복수개의 결합 부재와 접촉시켜 종양 세포 및 정상 세포 둘 모두에 있어서의 상기 유전자의 발현 프로필을 생성하는 단계;(c) 종양 세포 및 정상 세포의 발현 프로필을 비교하는 단계; 및 (d) 유방 종양 세포의 특징적인 발현 프로필을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 기재되어 있으며,

다른 관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020040072646호는 '암치료용 약초 화학 조성물'에 관한 것으로, 유방암, 자궁경부암, 신경모세포종, 결장암, 간암, 폐암, 구강암, 난소암 및 전립선암에 대하여 항암 활성을 나타내는, 세드루스 데오드라(Cedrus deodra)의 식물 추출물로부터 수득된 리그난의 신규한 상승작용성 조성물이 기재되어 있고, 상기 조성물은 9 내지 13 중량%의 (-)- 마타이레시놀, 75 내지 79 중량%의 (-)- 위크스트로몰, 7 내지 11 중량%의 디벤질부티로락톨 및 2.6 내지 3 중량%의 미확인 물질을 포함하고; 추가로, 리그난의 상승작용성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 유방, 자궁경부, 신경모세포종, 결장, 간, 폐, 구강, 난소 및 전립선 조직으로부터 선택된 다양한 인간 암 세포주의 성장을 억제하는데 사용된다고 기재되어 있다.

또 다른 관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020070103057호는 '암 치료를 위한 ＭＤＡ-7을 포함하는 조성물'에 관한 것으로, 암 환자에게 흑색종 분화-관련 유전자 7 (melanoma differentiation-associated gene 7: MDA-7) 및 사이클로옥시게나제 2 (cyclooxygenase 2: COX-2) 억제제를 제공함을 포함하여, 암 환자를 치료하는 방법이 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 열충격 단백질 90 알파를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 열충격 단백질 90 알파는 도 8의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 해당 서열에 하나 이상의 치환, 역위, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 모든 서열번호 1의 돌연변이체 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.

또 본 발명은 열충격 단백질 90 알파를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 열충격 단백질 90 알파를 코딩하는 유전자는 도 8의 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나 유전자 코도의 디제너러시를 고려하여 해당 염기서열과 80% 이상의 상동성을 가지거나, 해당 서열에 하나 이상의 치환, 역위, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성할 수 있는 모든 상기 서열번호 1의 돌연변이체 단백질을 코딩하는 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다.

한가지 구체예에서, 본 발명에서는 대상체에서 Hsp90 alpha 유전자의 레벨을 측정하고, Hsp90 alpha 및/또는 다른 공동-조절된 발현 유전자(예를 들어 STAT5b: Signal transducer and activator of transcription 5b)의 레벨이 대상체에서 상향-조절된 경우에는, 다른 공동-조절된 발현 유전자 또는 유전자들에 대한 억제제와 함께 Hsp90 alpha 억제제 자체에 의한 대상체의 치료를 제공함으로써, 대상체에서 적어도 하나의 공동-조절된 발현 유전자에 대한 억제제 또는 활성화제와 함께 Hsp90 alpha 억제제에 의해서 치료할 수 있는 질병을 확인하는 방법이 제공된다.

일부의 구체예에서, 적어도 Hsp90 alpha를 포함하는 공동-조절된 발현 유전자의 레벨의 확인은 시험 기술을 포함한다.

일부의 구체예에서, 시험 기술은 적어도 Hsp90 alpha를 포함하는 공동-조절된 발현 유전자의 발현의 레벨을 측정한다.

일부의 구체예에서, 샘플은 인간 정상 샘플, 종양 샘플, 모발, 혈액, 세포, 조직, 기관, 뇌 조직, 혈액, 혈청,객담, 타액, 혈장, 유두 흡인물, 활액, 뇌척수액, 땀, 소변, 대변, 췌장액, 소주액 (trabecular fluid), 뇌척수 액, 눈물, 기관지 세척액, 스와빙 (swabbing), 기관지 흡인물, 정액, 전립선액, 전경부액 (precervicular fluid), 질액 및 사정 전액으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

또한, 본 발명에서는 질병을 진단하거나 병기결정하기 위한 키트가 제공되며, 이 키트는 조직 샘플 내의 Hsp90 alpha의 발현 레벨을 측정하는 수단, Hsp90 alpha와 공동-조절되는 것으로 미리 확인된 유전자의 발현 레벨을 측정하는 수단;및 Hsp90 alpha 및 공동-조절된 유전자의 상기 발현 레벨을 기준 샘플과 비교하는 수단 (여기에서, 기준 샘플과 비교되는 발현의 레벨은 질병의 존재 또는 질병 병기를 시사한다)을 포함한다. 또한, 본 발명에는 Hsp90 alpha 억제제에 민감한 질병의 치료를 위한 키트가 포함되며, 이 키트는 조직 샘플 내의 Hsp90 alpha의 발현 레벨을 측정하는 수단 (여기에서, 기준 샘플에 비해서 Hsp90 alpha의 발현 레벨이 증가하는 것은 Hsp90 alpha 억제제에 민감한 질병을 시사한다); Hsp90 alpha와 공동-조절되는 것으로 미리 확인된 유전자의 발현 레벨을 측정하는 수단 (여기에서, 상기 공동-조절된 유전자의 발현의 증가는 상기 질병의 치료에 있어서의 상기 공동-조절된 유전자에 대한 억제제의 사용을 시사한다); 및 상기 질병의 치료를 위한 Hsp90 alpha 및 상기 공동-조절된 유전자에 대한 억제제를 포함한다

또 본 발명은 서열번호 1 내지 4에 기재된 염기서열을 가지는 siRNA을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 백혈병, 비-소세포 암종 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택된 암인 것이 바람직하고, 유방암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 "암"은 정상의 조절이 상실된 독특한 성향이 새로운 특성, 예컨대 조절되지 않은 성장, 분화의 결핍, 국소 조직 침습 및 전이를 초래하는 세포의 증식으로서 정의된다. 이의 예로는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 백혈병, 비-소세포 암종 및 폐암 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 "약학적 허용 담체"의 예로는 임의의 표준 약학적 담체, 예컨대 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼 및 각종 유형의 습윤제 등이 있다. 또한, 이러한 용어는 사람을 비롯한 동물에 사용하기 위하여 한국 정부의 관리 기관에 의하여 승인되거나 또는 약전에 제시된 임의의 제제를 포함한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 "치료"는 특이적 질병 또는 상태의 예방, 특이적 질병 또는 증상과 관련된 증상의 완화 및/또는 상기 증상의 예방 또는 배제를 포함한다. "예방"은 질환의 징후를 나타내지 않거나 또는, 질환과 관련하여 진행중인 병리학의 우려를 감소시키기 위한 질환의 초기 징후만을 나타내는 개체에게 투여하는 치료이다.

"치료"는 이러한 징후를 감소시키거나 또는 배제시키기 위한 병리학적 징후를 나타내는 개체에게 투여하는 치료이다.

화합물의 "치료적 유효량"은 화합물을 투여하고자 하는 개체에게 이로운 효과를 제공하기에 충분한 화합물의 함량이다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 "치료하다"라는 것은 특이적 질환, 질병, 또는 상태의 예방, 또는 특이적 질환, 질병, 또는 상태와 관련된 증상의 완화 및/또는 상기 증상의 예방 또는 배제를 포함한다.

한 구체예에 의하면, 본 발명의 siRNA를 1 이상의 약학적 허용 담체와 혼합하여 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 표준 경로에 의하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 혼합물은 국소, 경피, 경구, 직장 또는 비경구 (예, 정맥내, 피하 또는 근육내) 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 siRNA를 경구 투여할 경우, 화합물은 액제, 분말, 정제, 캡슐 또는 로젠지로서 투여된다. 화합물은 정제, 캡슐, 로젠지 및 기타의 경구 투여 가능한 형태로 사용되는 1 이상의 통상의 약학적 첨가제 또는 부형제와 혼합하여 사용될 수 있다.

비경구, 보다 바람직하게는 정맥내 주사로 투여할 경우, 본 발명의 유도체를 염수 용액 및/또는 통상의 IV 용액과 혼합할 수 있다. 또한, 혼합물을 화합물의 지연 방출을 가능케 하는 생분해성 중합체에 혼입될 수 있으며,

한 구체예에서, 전달 비이클은 약물 전달을 희망하는 부위, 예를 들면 종양 부위의 부근에 착상된다. 본 발명에 사용하기에 적절한 생분해성 중합체는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌[Brem et al., J.Neurosurg. 74: 441-446 (1991)]에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 siRNA의 투여량은 치료하고자 하는 상태, 특정의 화합물 및 기타의 임상적 요인, 예컨대 사람 및 동물의 체중 및 상태 및, 화합물의 투여 경로에 따라 달라진다. 본 발명은 사람 및 수의적 용도 모두에 대한 적용예를 갖는 것으로 이해하여야 한다. 사람에게의 투여와 관련된 한 구체예에서, 약 0.1 내지 300 ㎎/㎏/일, 또는 약 0.5 내지 50 ㎎/㎏/일, 또는 약 1 내지 10 ㎎/㎏/일의 투여량이 일반적으로 충분하다.

본 발명의 siRNA 이외에, 본 발명의 조성물은 가용화제, 불활성 충전제, 희석제, 부형제 및 향미료를 포함할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 열충격 단백질 90 alpha (Hsp90α)가 저산소 조건에 노출된 암세포에서 STAT5b를 통한 발현의 효과적인 발현조절을 특징으로 하는 암질환 예방 및 효과적인 치료방법 모색에 관한 것이다.

저산소증은 유방암을 포함하여 고형종양들의 대표적인 현상이며 세포 전사인자 단백질인 STAT5b는 사람의 고형암 세포의 성장, 분화 및 생존을 조절하는데 이 단백질이 암치료에 중요한 접근방법 중 하나이다. 따라서 본 발명은 저산소 조건에서 Hsp90α가 Jak2/STAT5b pathway를 통하여 조절됨을 확인하고 Jak2/STAT5b의 저해를 통해서 Hsp90α를 효과적으로 저해시킬 수 있음을 규명한 것이다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 Hsp90α의 조절은 Jak2/STAT5b pathway를 통하여 이루어진다는 새로운 사실을 발견함과 동시에 새롭게 주목받고 있는 항암 타겟인 Hsp90α의 저해방법에 대한 새로운 방법을 제시함으로써 보다 효과적인 항암치료에 관한 분자의학적 기전을 규명하였다.

도 1은 Hsp90알파 발현이 저산소 조건에서 공격적인 암 세포주에서 더 발현이 증가한다는 것을 나타낸 그림으로, A, 24시간 동안 정상 및 저산소 조건에서 공격적인 암세포주에서 Hsp90알파의 발현(인간 유방암 세포: MDA-MB 231, SK-BR-3; 인간 방광암 세포: 253J-BV). B, 24시간 동안 정상 및 저산소 조건에서 비-공격적인 암세포주에서 Hsp90알파의 발현(인간 유방암 세포주: MCF7; 인간 간암 세포: HepG2; 인간 방광암 세포: T24). 전체 세포 추출물은 10% SDS-PAGE로 분리하고 면역불럿을 실시예에 기재된 것과 같이 수행하였으며, 베타-액틴을 단백질 로딩의 대조군으로 사용하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험 중 한 대표 데이터이다.
도 2는 저산소증이 인 비보에서 Hsp90알파 발현을 업-레귤레이트한다는 것을 나타낸 그림으로, 이종이식을 절단하여 STAT5b, Hsp90알파 및 HIF-1알파에 대하여 특이적인 1차 항체로 처리하였다. 검출은 2차 항체, Alexa Fluor 488 (토끼) 및 Alexa Fluor 594 (마우스)를 사용하여 수행하였다. 핵 수준에서 STAT5b, Hsp90알파 및 HIF-1 알파의 발현의 증가를 확인하였다. A, STAT5b/Hsp90알파에 특이적인 IHC 및 B, STAT5/HIF-1알파에 특이적인 IHC, C, Hsp90알파 및 HIF-1알파에 특이적인 조직 추출물의 면역블럿, D, 단백질의 상대적인 발현 수준(밀도/액틴). 데이터는 적어도 독립적인 3회 실험의 평균, 평균±SEM. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 통계적으로 유의적인 감소를 나타냄(***p<0.001). scale bar: 50 ㎛. O, 유방암 이종이식ㅇ의 외부(Outer part). I¹ 및 I², 유방암 이종이식의 각 내부(separated inner part).
도 3은 저산소증이 시간 의존적 형태로 Hsp90 알파 및 STAT5b 및 HIF-1알파의 발현을 업-레귤레이트한다는 것을 나타낸 그림. A 및 B, MDA-MB 231 및 MCF-7 세포의 저산소증 조건 하에서 Hsp90알파, STAT5b 및 HIF-1알파의 시간 의존적인 발현. 면역불럿은 상기와 같이 수행. C, 시간 의존적 형태에서 단백질의 상대적인 발현 수준(밀도/액틴). 데이터는 세 번의 독립적인 실험 중 한 대표 데이터이다.0 h, 정상산소조건(normoxia).
도 4는 저산소증이 STAT5b/Hsp90알파 프로모터 활성을 증가한다는 것을 나타낸 그림으로, A, Hsp90 알파 루시퍼레이즈 재조합 지노믹 DNA 구축물의 지도. 그 재조합 루시퍼레이즈 DNA 구축물은 리포터 유전자 어세이에 대한 인간 Hsp90알파 서열을 포함하여 제조. 그 재조합 벡터는 그 제한 효소 및 라이게이션 효소로 pLUX F3 벡터를 처리하고 라이게이션한 후에 1.8kb 사이즈를 가지는 인간 Hsp90알파 서열을 포함. B, Hsp90알파STAT5b 프로모터 활성을 정상 및 저산소 조건하에서 12 시간 동안 비교. COS-7 세포를 Hsp90 알파 및 STATb 루시퍼레이즈 리포터 유전자로 동시-트랜스펙션시킨 후, 12시간 동안 정상 및 저산소 조건에서 노출한 혈청없는 배지에서 배양. 세포 파쇄액을 luminometer를 사용하여 루시퍼레이즈 활성에 대하여 분석. 데이터는 적어도 독립적인 3회 실험의 평균, 평균±SEM. 별표는 정상 및 저산소 조건 사이에 Student's t-test에 의한 의한 통계적으로 유의적인 증가를 나타냄(***p < 0.001).
도 5는 저산소증이 Hsp90 알파 프로모터에서 컨센서스 서열에 대한 STAT5의 결합을 증가한다는 것을 나타낸 그림으로, A, 인간 Hsp90 알파 유전자 프로모터의 서열(NCBI GenBank U25822gi/793941/gb/U25822.1/HSU25822, TESS). Hsp90 알파 유전자의 GAS 엘리먼트는 강조표시되고 뉴크레오타이드 서열 140-148에 존재. B,Hsp90 알파 유전자 프로모터에 STAT5 결합은 저산소 조건하에서 더 증가된 활성을 나타냄. C, 핵 단백질 추출물(NE)을 분리하고 나이트로셀루로스 막에 불럿팅을 한 것에서 정상 및 저산소 조건에서 Hsp90알파 및 STAT5b의 발현 감소를 나타냄. 데이터는 세 독립적인 실험의 한 대표값이다.
도 6은 Hsp90알파의 발현이 저산소 조건 하에서 STAT5b siRNA로 암세포의 트랜스펙션에 의하여 현저하게 감소된 것을 나타낸 그림으로 A, MDA-MD 231 세포에서 정상 또는 저산소 조건 하에서 Hsp90알파의 발현의 감소를 나타냄. MDA-MD 231 세포를 정상 및 저산소 조건 하에서 스크램블(비-타겟팅 siRNA) 또는 siSTAT5b (인간 STAT5b siRNA)로 처리하고, 12시간 후에 면역블럿에 의한 Hsp90알파, STAT5b 및 베타-액틴의 어세이를 위하여 세포를 수집. B, 정상 및 저산소 조건 하에서 넉-다운 STAT5b 후에 Hsp90알파, 및 STAT5b의 패턴. 별표는 ANOVA 테스트에 의한 siRNA STAT5b 후 Hsp90알파, 및 STAT5b의 통계적으로 유의적인 감소를 나타냄(***p<0.001). 에러바는 세 실험 중 표준 편차를 나타낸다. Con, 대조군. SC, 스크램블. siSTAT5b, STAT5b siRNA.
도 7은 전이성 유방암 세포에서 Hsp90알파의 도식적인 표현을 나타냄: 저산소증에 의하여 HIF-1알파 발현이 유도되고 이것이 Jak2 및 STAT5b의 활성화를 수반함. 그 다음 이 STAT5b가 핵으로 이동하여 Hsp90알파 프로모터의 GAS 엘리먼트에 결합하고, 이것이 Hsp90알파의 발현을 증가시키고 혈관신생, 침윤, 전이 및 다른 생리적인 기능을 야기한다.
도 8은 Hsp90알파의 아미노산 서열과 염기서열을 나타낸 그림.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 세포배양

MDA-MB-231 인간 유방암세포,COS-7 원숭이 신장세포를 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 10% FBS(fetal bovine serum), 2mM 글루타민 및 100U/㎖ 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Gibco-BRL, USA)에서 배양하였다. MCF-7, SK-BR3 인간 유방암세포,HepG2 인간 간암세포, 253-BV, T24 인간 방광암세포(한국 세포주 은행 ;Korean Cell Line Bank)를 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 10% FBS(fetal bovine serum), 2mM 글루타민 및 100U/㎖ 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 RPMI-1640 (Gibco-BRL, USA)에서 배양하였다.

상기 배양된 세포들은 실험시마다, 2.5×10⁵cells/㎖ 밀도로 적당한 배지에 재현탁하여 사용하였다.

저산소 조건 유도를 위해서 air tight chamber에 넣고 5% CO₂/95% 질소 혼합을 산소 포화도가 2% 이하로 감소하도록 노출하였다.

실시예 2: 웨스턴블롯 실험 결과 저산소 조건 하에서 Hsp90α의 발현은 비공격적인 성향의 암세포보다 공격적인 성향의 암세포에서 보다 증가 조사

본 발명은 저산소 조건에서 Hsp90α가 각기 다른 부위와 각기 다른 성향을 가지고 있는 종양의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 다음과 같은 웨스턴블롯(Western Blot)을 실시하였다.

즉, 공격적인 성향을 가지고 있는 암세포인 MDA-MB 231, SK-BR3, 253J-BV와 반면에 비공격적인 성향을 가지고 있는 암세포인 MCF-7, HepG2,T24로 나누어 각각 저산소조건의 유도하여 Hsp90α의 발현 정도를 측정하였다.

그 결과 암세포의 공격적 성향에 관계없이 저산소 조건에 따라 Hsp90α의 발현이 up-regulation 됨을 확인하였다. 성향별로 구분하여 비교하자면, 공격적인 성향의 암세포들이 비공격적인 암세포들에 비하여 Hsp90α의 발현 정도가 더 높은 것으로 나타났다(도1-a와 1-b). 공격적 성향의 암세포(도 1-a). 비공격적 성향의 암세포(도 1-b).

실시예 3: 동물실험 결과 Xenogrft Nude 생쥐에서 저산소 조건 하에서 Hsp90 α의 발현은 정상산소 조건에서 보다 증가 조사

본 발명은 세포주 단위에서 확인 한 결과를 동물모델에서도 확인해 보기 위하여 다음과 같은 동물실험(xenograft)을 실시하였다. 즉, Balb/c 마우스종을 실험동물생산 전문업체((주)오리엔트바이오, 한국)로부터 구입하여 6주 동안 양 옆구리에 대표적인 사람 유방암세포주인 MDA-MB 231 세포를 주입하여 종양을 생성하였다. 그 다음 마우스를 경추탈구 하여 사람의 유방종양을 분리해낸 다음, 다음과 같은 실험방법으로 종양 조직에서의 여러 가지 항암타겟 지표를 측정하였다.

① Western blotting

② immunohistochemistry

이 이종이식 생쥐 조직을 5 두께로 자른 다음 STAT5b, Hsp90α, HIF-1α 특이적 1차 항체를 붙인 후, 2차 항체(Alexa Fluor 488 (rabbit)과 Alexa Fluor 594 (mouse))를 사용하여 검출하였다. STAT5b/Hsp90α 특이적 면역조직화학방법으로 핵 손상 없이 STATb/Hsp90α 수준이 전체 종양 조직에서 상대적으로 저산소 조건인 안쪽부위가 상대적으로 정상산소 조건인 바깥부위보다 증가함을 보여주는 결과를 얻었다(도 2-a).

STAT5b/HIF-1α 특이적 면역조직화학방법으로 핵 손상없이 STAT5b/HIF-1α level 이 전체 종양 조직에서 상대적으로 저산소 조건인 안쪽부위가 상대적으로 정상산소 조건인 바깥부위보다 증가함을 보여주는 결과를 얻었다(도 2-b).

그리고 동물실험 결과 이종이식 nude 생쥐의 인간 유방종양 조직의 단백질을 추출하여 실험한 결과 Hsp90α, STAT5b 및 HIF-1a 단백질의 발현량이 안쪽부위가 바깥부위에 비해 증가되었다(도 2-c, d).

이러한 결과 이종 이식된 조직 내 부분적 저산소 스트레스는 Hsp90α와 관련된 분자의 발현을 유도하여 Hsp90α의 발현도 증가 시켰음을 알 수 있다.

실시예 4: 저산소 조건 하에서 공격적인 암세포와 비공격적인 암세포의 Hsp90 α가 시간대 별로 발현되는 양상 조사

저산소 조건에 의해 발현되는 Hsp90α의 시간대 별 변화와 Hsp90α를 조절할 것이라 생각되는 다양한 단백질의 발현이 어떤 양상을 띠는지 조사하기 위하여, 아래와 같이 실험하였다.

본 발명에서 본 발명자들은 각 구간별 시간마다 세포 전체 단백질을 추출하여 Hsp90α, STAT5b, HIF-1α의 발현을 측정한 결과 공격적 성향의 암세포는 시간 의존적으로 각 단백질들의 발현양이 증가함을 확인하였다(도 3-a, c).

반면에, 비공격적 성향의 암세포는 각 단백질들이 다소 증가하는 경향을 보이다가 결국엔 감소함을 확인하였다(도 3-b, c).

실시예 5: 저산소 조건 유도 자극에 의한 STAT5b 와 Hsp90 α의 프로모터의 활성 조사

저산소 조건 하에서 STAT5b 단백질에 의해 Hsp90α프로모터가 활성화되는지 여부를 조사하기 위하여, COS-7 cell을 사용하여 정상산소 조건과 저산소 조건을 유도한 세포에서 STAT5b/Hsp90α(Dr. Carrie Shemanko, Calgary University, Canada; 도 4-a)의 활성화 정도를 조사하였다.

구체적으로, 저산소 조건으로 자극한 세포와 정상 세포와의 STAT5b/Hsp90α의 프로모터의 활성화 정도를 상대적인 루시페라제 활성을 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 4-b에 나타난 바와 같이, 저산소 조건에 의해 STAT5b/Hsp90α 프로모터의 활성이 감소되는 것을 알 수 있었다.

실시예 6: STAT5b 단백질과 Hsp90 α 유전자간의 결합 부위 및 상호 결합력의 증가 조사

MDA-MB 231 세포주에서 Hsp90α 단백질 합성이 이루어지기 위해서는 반드시 특정 자극 물질이 필요하다. 이전의 프로모터 활성 조사에서 STAT5b와 Hsp90α간에 바인딩이 이루어진다는 것을 확인하여 Hsp90α의 발현 프로모터를 조사해본 결과, STAT5b 단백질이 Hsp90α gene promoter에 binding하는데 그 binding motif(결합부위)의 염기서열을 최초로 발견하게 되었다(도 5-a).

상기 합성된 STAT5b 단백질은 핵 안으로 들어와 Hsp90α의 STAT5 binding site에 결합하여 활성을 나타내는데, STAT5와 Hsp90α 결합활성(binding activity)을 확인하고자 EMSA(electrophoretic mobility shift assay, kit: Panomics, AY2002)를 실시하였다.

저산소 조건에 따라 Hsp90α의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 저산소 조건 유도를 12 h 동안 실시하였다. 그 결과, 저산소 조건에 의해 Hsp90α 유전자와 STAT5b 결합력이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 5-c). 또한 핵단백질 상에서 Hsp90α, STAT5b 단백질의 발현이 저산소 조건에 의해 증가되는 것을 알 수 있었다(도 5-c).

실시예 7: siRNA 방법을 이용한 STAT5b 유전자 발현의 silencing 으로 인한 Hsp90 α단백질발현의 감소 조사

저산소 조건 하에서 Hsp90α의 발현 조절이 STAT5b 단백질에 의해 활성화되는지 여부를 조사하기 위하여, STAT5b siRNA를 사용하여 세포 내로 주입을 시킨 후 저산소 조건을 유도한 세포에서 STAT5b와 Hsp90α의 발현 정도를 조사하였다.

본 발명에 사용된 siRNA는 Dharmacon 사의 On-TARGETplus SMARTpool Human STAT5B 5nmol 제품을 사용하였으며 Control로는 On-TARGETplus non-targeting siRNA를 사용하였다.

이들의 정보는 다음과 같다.

Target Seq.(서열번호 1): GAAUUUACCAGGACGGAAU Mol. Wt. :13,414.8 (g/mol)

Target Seq.(서열번호 2): GGACACAGAGAAUGAGUUA Mol. Wt. :13,414.9 (g/mol)

Target Seq.(서열번호 3) : GGGCAGAGUCGGUGACAGA Mol. Wt. :13,474.9 (g/mol)

Target Seq.(서열번호 4) : UCUCAAGCCUCAUUGGAAU Mol. Wt. :13,414.7 (g/mol)

품번: L-010539-00-0005 (STAT5B) / D-001810-01-05 (non-target RNA)

구체적으로, STAT5b의 유전자를 siRNA로 silencing후에 저산소 조건으로 자극한 세포에서 STAT5b와 Hsp90α의 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 6-a에 나타난 바와 같이, STAT5b의 유전자는 12시간 배양조건에서 silence되었다. 이는 효율적이고 특이적인 Hsp90α의 발현 감소로 이어졌다. STAT5b의 상대적인 발현과 저산소 조건에 따른 Hsp90α 발현비교를 확인하였다(도 5-B).

상기 결과를 바탕으로 확인할 수 있는 사실은 공격적 성향의 암세포와 이종이식된 종양 조직에서 Hsp90α발현은 JaK2/STAT5b를 통하여 조절됨을 알 수 있다 (도 7).

저산소 스트레스는 HIF-1α의 발현을 유도하고 HIF-1α는 Jak2를 통하여 STAT5b의 활성화를 가져오고 이에 따라 Hsp90α의 조절자인 STAT5b는 Hsp90α의 프로모터에 결합하여 Hsp90α단백질 발현을 증가시킨다.이는 Jak2/STAT5b 신호전달 경로가 Hsp90α의 발현조절에 기여함을 알 수 있다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Use of Hsp90 alpha in cancer cells in Hypoxia condition <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 gaauuuacca ggacggaau 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 ggacacagag aaugaguua 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 gggcagaguc ggugacaga 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 ucucaagccu cauuggaau 19

Claims (10)

1. 열충격 단백질 90 알파를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 열충격 단백질 90 알파는 도 8의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 암은 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 백혈병, 비-소세포 암종 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
5. 열충격 단백질 90 알파를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 열충격 단백질 90 알파를 코딩하는 유전자는 도 8의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
7. 제 5항에 있어서,
   상기 암은 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 백혈병, 비-소세포 암종 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
8. 제 5항에 있어서,
   상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
9. 서열번호 1 내지 4에 기재된 염기서열을 가지는 siRNA을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물.
10. 제 9항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 조성물.

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