WO2011150897A2 - Método para la terapia del cáncer - Google Patents

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Julio Raúl FERNÁNDEZ MASSÓ
Alexis Musacchio Lasa
Jeovanis GIL VALDÉS
Osvaldo Reyes Acosta
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Definitions

  • the present invention falls within the field of biomedicine, in particular with cancer therapy, by revealing a new therapeutic target for the development of antitumor drugs. These drugs, due to their greater selectivity and efficacy, contribute to the improvement in the current treatments of the cancer patient.
  • a method for the treatment of cancer by nuclear expression and accumulation of the COMMD1 protein is described. Chemical modifications introduced to the primary structure of the HARIKPTFRRLKWKYKGKFW peptide, increase the nuclear localization of COMMD1 and increase the antitumor activity of the peptide in vitro and in vivo.
  • Peptides are being of great interest as new therapeutic drugs, for their role as mediators of important biological functions and their unique intrinsic properties that make them particularly attractive therapeutic agents. Peptides show high biological activity, associated with low toxicity and high specificity. The benefits due to these characteristics include a high specificity of target binding, minimize drug-drug interactions and manifest a lower accumulation in tissues reducing the risk of complications due to intermediate metabolites (Vlieghe et al., 2010, Drug Discovery Today, 15: 40-56).
  • these therapies may be aimed at inhibiting a certain function of a protein, such as: Inhibitors of thermal stress proteins (known as HSPs, from the English Heat Shock Proteins) (Subbarao et al., 2004, Pharmacology & Therapeutics, 101: 227-257); Tyrosine kinase inhibitors (Garrido et al., 2007, Rev Med Chil, 10: 1327-1332) and as the main event cause apoptosis of the cancer cell.
  • HSPs thermal stress proteins
  • the drug binds to a target protein that may or may not be aberred in the malignant process compared to normal tissue, in this case signaling pathways that are activated in the malignancy process are affected, for example: Inhibitors of deoxyribonucleic acid (DNA) replication, inhibitors of microtubule assembly and inhibitors of NFkB transcriptional factor.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • the first scenario is highly effective in certain hematopoietic malignancies, most have limited effectiveness in the complexity of solid tumors.
  • the second scenario includes some of the most effective and even more toxic drugs of the cancer pharmacopoeia.
  • the COMMD1 protein previously known as MURR1 (van de Sluis et al., 2002, Human Molecular Genetic, 1 1: 165-173) belongs to a new family of proteins, known by its acronym COMMD (Copper Metabolism gene MURR1 Domain) , abbreviated COMMD).
  • the ten family member proteins are highly conserved in multicellular organisms and ubiquitously expressed, but the biological functions of most of their members are unknown.
  • the main feature of this family is the presence of the COMM (from the English Copper Metabolism Murrl Domain) domain, conserved and unique, comprised between amino acid residues 110-190 of the C-terminal (Burstein et al., 2005, The Journal of Biological Chemistry, 280: 22222-22232).
  • COMMD1 has been implicated in various biological processes such as: control of copper metabolism (Tao et al., 2003, Journal of Biological Chemistry, 278: 41593-41596); regulation of intracellular sodium transport (Biasio et al., 2004, Journal of Biological Chemistry, 279: 5429-5434); NFkB transcriptional factor inhibition (Maine et al., 2007, The EMBO Journal, 26: 436-447); inhibition of the expression of genes regulated by the hypoxia-induced factor HIF-1a (van de Sluis et al., 2007, Molecular and Cellular Biology, 27: 4142-4156).
  • COMMD1 has physical interaction with the RelA subunit (p65) of the NFkB transcriptional factor, with the catalytic- ⁇ subunit of the HIF-1a factor, and with Delta ENaC in the sodium epithelial channels. In all cases, this interaction leads to the degradation of these "client” proteins through a mechanism that involves ubiquitination and degradation via proteasome.
  • the COMM domain has been shown to be involved in protein-protein interactions, both for "customer" proteins of COMMD1, as well as interactions between family members.
  • COMMD1 The baseline expression of COMMD1 is controlled in the cell by a process of ubiquitination and proteasomal degradation, through a series of leucine residues, located in the COMM domain (Maine et al., 2009, Biochemical Journal, 417: 601-609 ). Recently, it has been described that COMMD1 presents a constitutive mechanism of cytoplasm-nucleus transport through nuclear export signals (in English Nuclear Export Signáis, abbreviated NES) also located in its COMM domain. It has been reported that a disruption in the sequences of leucine and / or agents that inhibit proteasomal degradation, cause an increase in the expression of COMMD1 in the cell. In addition, disruption of NES sequences in COMMD1 increases repression of the transcriptional activity of NFkB and HIF-1a factors (Muller et al., 2009, Traffic, 10: 514-527).
  • the open neoplastic cell over-expresses different anti-apoptotic proteins, such as the XIAP apoptosis inhibitor protein and the clusterin protein (CLU), which accelerates the progression of prostate cancer to androgen independently. Both proteins favor the ubiquitination and proteasomal degradation of COMMD1, facilitating the activation of NFkB and the survival of the tumor cell. It is reported that proteasome inhibitors, such as MG132 (Shirley et al., 2005, Neoplasia, 7: 1104-1111; Zhou et al., 2009, Cancer Research, 21: 333-339), have an antitumor effect to inhibit the mechanism of ubiquitination and proteasomal degradation.
  • proteasome inhibitors such as MG132 (Shirley et al., 2005, Neoplasia, 7: 1104-1111; Zhou et al., 2009, Cancer Research, 21: 333-339), have an antitumor effect to inhibit the mechanism of ubiquitin
  • RNA interfering ribonucleic acid
  • the essence of the invention relates to peptides from region 32-51 of the LALF protein (in English, Limulus anti-lipopolysaccharide ⁇ , in which amino acid substitutions have been made which guarantee the dissociation of the bacterial lipopolysaccharide (LPS) binding capacity, and have an antitumor and immunomodulatory effect.
  • LALF protein in English, Limulus anti-lipopolysaccharide ⁇ , in which amino acid substitutions have been made which guarantee the dissociation of the bacterial lipopolysaccharide (LPS) binding capacity, and have an antitumor and immunomodulatory effect.
  • LPS bacterial lipopolysaccharide
  • the mechanism of action thereof is not revealed or suggested.
  • the present invention solves the aforementioned problem, by describing a method for the treatment of cancer by increasing the nuclear localization of the COMMD1 protein. Said increase causes the decrease or blockage of cancer cell proliferation.
  • this invention it is revealed, for the first time, that the L2 peptide (whose sequence is HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, SEQ ID No. 1) and COMMD1 interact in cancer cells, and that the nuclear location of COMMD1 is associated with the death of the cancer cell .
  • the present invention provides a use of the COMMD1 protein, in the identification of compounds with antitumor activity that facilitate the accumulation and nuclear localization of COMMD
  • the data provided in this invention demonstrate that the L2 antitumor peptide interacts with COMMD1, specifically in the region between amino acids 110-190 thereof.
  • peptide L2 produces nuclear accumulation of COMMD1.
  • the expression of the COMMD1 protein carrying nuclear localization sequences is sufficient to induce the death of the cancer cell. Therefore, the present invention demonstrates the use of COMMD1, for the first time, as a therapeutic target in the treatment of cancer.
  • the L552 peptide (SEQ ID No. 3), from the sequence of the L2 peptide (SEQ ID No. 1), is optimized to cause an accumulation of COMMD1 in the nucleus, and increase the antitumor effect in vitro and in live of said peptide.
  • the optimization is based on chemical modifications, by substitutions of natural amino acids for unnatural amino acids (D-amino acids) in specific positions (represented in lowercase and bold in the sequence included above) and the protection of the N-terminal end by acetylation (indicated as Ac- in the sequence included above).
  • D-amino acids unnatural amino acids
  • acetylation indicated as Ac- in the sequence included above.
  • agents that increase the nuclear localization of the COMMD1 protein in the manufacture of a medicament is also an object of the present invention.
  • Agents or compounds that facilitate the nuclear accumulation of COMMD1 may include, for example: proteins (including antibodies), muteins, peptides, polynucleotides, aptamers, nucleic acids, and small organic molecules. Said compounds may be isolated from natural sources, synthetically or recombinantly made, or any combination thereof.
  • the agent that increases the nuclear localization of the COMMD1 protein is peptide L552 (SEQ ID No. 3).
  • the agent that increases the nuclear localization of the MD1 CO protein may be nucleic acid type, such as an expression vector in mammalian cells containing a DNA sequence encoding the NLS containing COMMD1 protein. This type of vector can be used as gene therapy.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising an agent that increases the nuclear localization of the COMMD1 protein is part of the invention.
  • the pharmaceutical composition comprises an effective amount of the agent that increases the nuclear localization of the COMMD1 protein (determined by its inhibitory concentration 50 (IC50)) and pharmaceutically acceptable excipients or carriers.
  • IC50 inhibitory concentration 50
  • the composition can be administered parenterally, or topically.
  • the administration of a pharmaceutical composition comprising an agent that increases the nuclear localization of the COMMD1 protein is a method for treating or preventing a solid tumor in a subject, where the method comprises the administration of the agent that facilitates the nuclear localization of COMMD1. in an effective amount, to decrease or block the growth of the tumor cell.
  • the agent that increases the nuclear localization of the COMMD1 protein can be administered to patients with leukemia, specifically myelocytic leukemia, blocking the proliferation of the cancer cell, even in the presence of inflammatory stimuli.
  • the present invention demonstrates that the L552 peptide can be used in combination with standard chemotherapy to produce a synergistic effect and reduce the dose of cytostatics, such as cisplatin and 5-Fluorouracil (5-FU). Therefore, a pharmaceutical combination for the treatment of cancer comprising one or more agents that increase the nuclear localization of the COMMD1 protein, and one or more specific drugs for standard cancer chemotherapy is also the subject of the present invention.
  • said agent is the L552 peptide and the specific drug for standard chemotherapy is selected from cisplatin and 5-FU.
  • the agents and drugs that are part of it can be administered simultaneously, separately or sequentially during the same treatment.
  • the relationship between inflammation and cancer is today an accepted fact.
  • the inflammatory microenvironment is cataloged as a tumor trait, which is classified into the six most important characteristics of cancer, described by Hanahan and Weinbergs (Perwez et al., 2007, Int J Cancer, 121: 2373-2380).
  • the data provided in this invention indicate that the L552 peptide is effective in blocking the growth of the cancer cell in the presence of an inflammatory stimulus.
  • the expression of the GFP-NCOMMD1 protein that carries NLS facilitates the same effect in the cancer cell. More specifically, the results demonstrate that the L552 peptide facilitates the death of the cancer cell in the presence of inflammatory stimuli such as LPS and tumor necrosis factor (abbreviated Tumor Necrosis Factor a, abbreviated TNF- ⁇ ).
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • in vivo experimental data demonstrate the effectiveness of the peptide in a murine model of colon tumor, in which mice were challenged with an inflammatory stimulus by injection of LPS.
  • the invention also provides a method for the inhibition of the development of tumors associated with inflammation and their metastases, which comprises the administration of the L552 peptide to a subject in need.
  • tumors associated with inflammation and their metastases are, for example, the following types of cancer: colorectal, esophagus, lung, prostate, breast, pancreas and liver.
  • L552 peptide can be used prophylactically to prevent the development of cancer associated with chronic inflammation, such as in Crohn's disease, ulcerative colitis, pancreatitis, cirrhosis, etc. Therefore, it is also an object of the present invention, a method for the prevention of cancer associated with chronic inflammation characterized in that the L552 peptide or a composition comprising said peptide is administered to an individual in need thereof.
  • the dose and treatment scheme to be followed with the compositions comprising the L552 peptide as an agent that increases the nuclear localization of COMMD1, a person with skills can easily determine the dose and treatment scheme (prophylactic or therapeutic).
  • the effective amounts may vary depending on the relative potency of the individual compositions, and can be calculated based on the molecular weight of the peptide and the IC 5 or in vitro or in animal studies. For example, given the molecular weight of the compound (chemical structure) and an effective experimental dose (IC50), a dose in mg / kg of weight can be calculated routinely. In general, the doses are 0.2-4 mg / kg of weight.
  • the peptide or the composition containing it can be administered once or several times, weekly or even for several months.
  • the invention also relates to the use of COMMD1 as a new prognostic marker for the cancer patient, by determining the presence or absence of nuclear localization of COMMD1 in a sample.
  • the L552 peptide provides an active agent to treat diseases where COMMD proteins play a role or intervene in disease progression. This is possible, for example in those diseases where the amount of a member of the COMMD family is increased or decreased and / or their activity is increased or decreased, and this causes the disease.
  • Figure 1 Illustrates the physical interaction between the L2 peptide and the COMMD1 protein using the technique of two yeast hybrids. Negative controls used were the pairing of the yeast strain AH109 transformed with the empty vector pGBKT7 and each construct of the COMMD1 fragments transformed into strain Y187. For the identification of the interaction, the mating of the AH109 strain transformed with the vector carrying the L2 sequence and each construct of the COMMD1 fragments transformed into the Y187 strain was performed. How positive control mating pCL1 that carries the transcription factor GAL4 was used. As noted, the interaction occurs with the plasmids that carry the complete gene sequence for COMMD1 and the construct that contains amino acids 110-190 of the COMMD1 protein.
  • FIG. 1 Illustrates the validation of the interaction of the L2 peptide with COMMD1 by the immunoprecipitation technique (pulldown) in SW948 cells.
  • PT total proteins
  • COMMD1 r recombinant COMMD1 protein obtained in Escherichia coli
  • PM molecular weight standard
  • FIG. 1 Illustrates the greater nuclear accumulation of COMMD1 by the optimized L552 peptide.
  • B The interaction between L552 and COMMD15 protein in different tumor lines is shown in immunoprecipitation experiments (pulldown).
  • FIG. 6 Illustrates that the expression of the COMMD1 protein containing nuclear localization sequences is sufficient to induce cell death.
  • the percentage of non-viable cells stained with Ethidium bromide is shown at 72 hours, as a result of the transfection of the constructs that carry the green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, abbreviated GFP) as a negative control, GFP-COMMD1 and the construction of nuclear location GFP-N-0 COMMD1.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • FIG. 7 (A) Chemosensitivity to 5-FU is shown in HT-29 colon carcinoma cells transfected with the GFP-NCOMMD1 construct. The Cl 50 values. (B) The effect of an inflammatory environment by adding LPS and TNF- ⁇ on Cl 50 is illustrated.
  • Figure 8 Illustrates the effect of the L552 peptide on the proliferation of the cancer cell in the presence of different inflammatory stimuli. Determination of Cl 50 in human myelocytic leukemia cells (THP-1) (A) and murine colon carcinoma (CT-26) (B), treated with LPS and TNF-cc.
  • FIG. 9 Antitumor effect of the L552 peptide in a colon cancer model in BALB / c mice subjected to an inflammatory stimulus by injection of LPS.
  • A The cumulative percentage of survival of the different experimental groups is shown.
  • B The average volume of tumor mass for each experimental group is shown.
  • 5x10 8 AH109 cells containing plasmid pGBKL2-1 were grown with 5x10 8 Y187 cells containing the human liver DNA library, for 4 hours in YPDA solid medium at 30 ° C.
  • YPDA solid medium 10 ml of sterile water was added to its surface, and the cells were carefully resuspended with spatulas and transferred to 15 plates of SD-Trp-Leu-His-Ade minimum medium and grown at 30 ° C by 7 days.
  • the resulting 74 colonies were transferred to SD-Trp-Leu liquid medium in 96-well deep plates. After observing growth in liquid medium, the yeast DNA was purified.
  • Each of the DNAs was individually transformed into E.coli strain DH10B, its DNA purified and stored at -20 ° C. Each individual clone was transformed into yeast strain Y187 and the interaction was verified by mating with the strain of AH109 transformed with plasmids pGBKT7 and pGBKL2-1. The DNA of the positive clones was sequenced. An analysis of the sequences by the BLAST program (AltschuI et al., 1990.
  • J Mol Biol, 215: 403-410) revealed that one of the clones (L2-21) corresponds to the sequence of the gene coding for amino acids 6-190 of the COMMD1 protein, and that this clone is capable of interacting with the plasmid that contains the L-2 peptide sequence.
  • deletions were made to the construction of plasmid pGBKL2-1, generating clones pGBKL2 (6-110), pGBKL2 (6-70), pGBKL2 (71-190), pGBKL2 (110-190).
  • the synthetic peptide L2 (SEQ ID No. 1), synthesized using a solid phase procedure, was biotinylated and used as a "bait” attached to a streptavidin sepharose resin.
  • a "prey” an extract of proteins from the tumor line SW948 (human colon carcinoma) was used. These experiments are known as "pulldown".
  • the protein extract was obtained from 2 x 10 7 cells using extraction buffer (0.5% Triton X-100; 25 mM HEPES, pH 7.5; 100 mM NaCI; 1 mM EDTA; 10% glycerol; 1 mM Dithiothreitol (DTT), and a protease inhibitor.
  • Biotinylated peptide 300 pg was incubated with 50 ⁇ L ⁇ of streptavidin sepharose resin (GE Healthcare), for one hour and washed with phosphate buffered saline (1X PBS) plus 1 mM DTT. Subsequently, 500 ⁇ g of total proteins were incubated with 50 ⁇ _ of resin containing the biotinylated peptide, at room temperature for 5 hours, the resin is then washed extensively with 1X PBS and 1 mM DTT.
  • streptavidin sepharose resin GE Healthcare
  • the proteins that remain bound to the resin are those that interact with the peptide, and are resuspended in 25 pL of electrophoresis buffer (Tris HCI 62.5 mM; pH 6.9; 0.1 M DTT, 20% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10% glycerol and 0.01% blue bromophenol).
  • the protein of interest was electrophoresed in acrylamide gel (7.5%), followed by immunodetecci n by "Western blot".
  • an anti-COMMD1 monoclonal antibody Sigma, clone 2A12 was used.
  • a total protein extract (100 ⁇ g) and the recombinant protein COMMD1 obtained in E. coli were used.
  • the results presented in Figure 2A demonstrate that the L2 peptide concentrates the COMMD1 protein in the "pulldown" experiment when compared to the total protein extract. This is indicative of the interaction between L2 and COMMD1.
  • the peptides of the invention were synthesized using a solid phase procedure.
  • the crude peptide is extracted with a 30% acetic acid solution, lyophilized and subsequently purified by RP-HPLC reverse phase chromatography.
  • the molecular mass of the purified peptides is verified by mass spectrometry.
  • the resulting preparation is non-antigenic, non-pyrogenic and pharmaceutically acceptable for administration in animals and humans. Substitutions were made promptly, introducing D-configuration amino acids at specific positions in the sequence of the original L2 peptide, whose sequence is HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ ID No. 1), as shown in Table 1. In one case, it was blocked. also the N-terminal end by acetylation.
  • amino acids in bold and lowercase mean changes by D-amino acids
  • Example 4 Illustrates the increase in the antiproliferative effect of the L552 peptide in tumor cell lines.
  • human tumor cells H-82 small lung cancer cells
  • H-125 non-small lung cancer cells
  • MCF-7 breast adenocarcinoma
  • MDA-MB231 breast adenocarcinoma positive for epidermal growth factor receptor
  • LS174T colonrectal adenocarcinoma
  • HT-29 chemotherapy-resistant colorectal adenocarcinoma
  • the peptides were added to the culture medium in a dose range between 9 ⁇ and 300 ⁇ . Incubation was carried out for 48 hours in the presence of 5% C0 2 and at the end of it it was revealed with 3- (4,5-dimethylthiazol-2- yl) 2.5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Gray MJ et al., 2008, Nati Cancer Inst, 100: 109-20). Finally, the plate was read at an absorbance of 492 nm. Each point was performed in duplicate, and the experiments were carried out at least twice independently. Cl 50 values were obtained from the respective cell proliferation curves. The results are presented in Figure 4.
  • Example 5 Antitumor effect of the L552 peptide in a murine model of TC-1 tumor.
  • TC-1 cells derived from malignant C57BLJ6 lung epithelial cells were used, which were resuspended in saline (PBS).
  • An amount of 5 x 10 4 cells in a volume of 200 ⁇ was inoculated to the mice subcutaneously in the right hind leg.
  • Five doses of the peptides (L2, L552 and L551) were administered at 2-day intervals, subcutaneously on the right flank, once the tumors reached 100 mm 3 in volume. In this test, a dose of 0.2 mg of peptide was evaluated per kg of weight (4 ⁇ g / mouse).
  • the parameters evaluated to measure the antitumor effect of the peptides of interest were animal survival and tumor mass, as can be seen in Figure 5A and Figure 5B.
  • the L552 peptide was more effective in terms of the ability to inhibit tumor progression and increase the survival of mice with respect to L2 and L551 peptide.
  • L552 modifications introduced to the peptide of this invention
  • Statistical analysis to determine significant differences between groups was performed by the Log Rank method.
  • the results show that the L552 peptide significantly increases ( * p ⁇ 0.05) the survival of the animals compared to the other peptides tested.
  • Example 6 Illustrates that the expression of the COMMD1 protein carrying nuclear localization sequences is sufficient to induce cell death.
  • pGFP-COMMD1 plasmids pGFP-COMMD1 were generated, which expresses COMMD1 fused to the GFP, and pGFP-NCOMMD1, which also contains the PKKKRKV nuclear localization peptide sequence.
  • pGFP-COMMD1 Polymerase chain reaction was performed using the oligonucleotides:
  • oligonucleotides were used:
  • Recombinant clones were analyzed by restriction and DNA sequence. Both constructs and the pEGFP control were transfected independently on HT-29 and HEK293 cell lines transiently using Polyethyleneimine (Sigma, USA) (Boussif, O et al., 1995, Proc Nati Acad Sci, 92: 7297-7301 ), in plates of 24 wells in duplicate. At 72 hours one of the wells was used to evaluate the expression of recombinant proteins using an Axiovert 40 fluorescence microscope (Zeiss, Germany) and the APIan 10X objective.
  • the culture medium was removed from the remaining well and stained with a mixture of Acridine Orange / Ethidium Bromide (AO / BE) at a concentration of 5 pg / mL in PBS, for the identification of apoptosis (Rible D, er a /., 2005, BMC Biotechnology, 5: 12-15), and were observed in the Axiovert 40 microscope and the APIan 40X objective.
  • AO / BE Acridine Orange / Ethidium Bromide
  • AO crosses the membrane of the living cells and stains the nuclei green and the cytoplasm orange, while the BE only penetrates the cells with loss of the integrity of the membranes and stains the nuclear DNA red.
  • the fluorescence of BE dominates the fluorescence of AO.
  • AO / EB staining shows viable cells stained with AO with their green nuclei and orange cytoplasm in transfections with GFP and GFP-COMMD1. Only in the case of cells transfected with the GFP-NCOMMD1 construct, were cells with the nucleus stained by BE observed, indicating that they are in a late apoptosis phase.
  • Figure 6 shows the graph of the percentage of cells with the red-stained nucleus of three independent fields by experimental condition.
  • Example 7 Illustrates the effect of nuclear localization of the COMMD1 protein on cytostatic sensitivity 5-FU and inflammatory stimuli in the HT-29 cell.
  • the HT-29 cell line temporarily transfected with the constructs described above were seeded in 96-well plates (Costar) at a density of 1 x 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium (Gibco) supplemented with Bovine Fetal Serum ( Gibco). After 24 hours, the cytostatic 5-FU was added to the culture medium in a dose range between 0.025 ⁇ and 2500 ⁇ , in serial dilutions of 1: 10. The incubation was carried out for 48 hours in the presence of 5% CO2 and at the end of it it was revealed with MTT. Finally, the plate was read at an absorbance of 492 nm. Each point was performed in duplicate, and the experiments were carried out at least twice independently.
  • Cl 50 values were obtained from the respective cell proliferation curves.
  • the results presented in Figure 7A demonstrate that the expression of COMMD1 protein with NLS (GFP-NCOMMD1) causes a greater sensitivity of the cancer cell to the action of the cytostatic 5-FU. It is demonstrated in this example by a reduction in Cl 50 with respect to cells expressing GFP or GFP-COMMD1.
  • GFP-NCOMMD1 COMMD1 protein with NLS
  • COM D1 nuclear localization of COMMD1 induces chemosensitivity to conventional cytostatics.
  • Example 8 Illustrates the effect of the L552 peptide on the cell proliferation of the cancer cell subjected to an inflammatory stimulus.
  • Example 9 Illustrates the antitumor effect of the L552 peptide in a colon cancer model in BALB / c mice undergoing an inflammatory stimulus by injection with LPS.
  • CT-26 cells isolated from a colon carcinoma in BALB / c mice were used.
  • An amount of 7 x 10 4 cells, resuspended in a volume of 200 ⁇ of 1X PBS, were inoculated to the mice by intracutaneous subcutaneous route.
  • the animals received an injection of 10 ⁇ g LPS / mouse (serotype 055: B5, Sigma) in 1X PBS and administered intraperitoneally.
  • one group received 5 doses of peptide L552 (0.2 mg / kg of weight) on alternate days, another group received 5-FU in doses of 20 mg / kg of weight.
  • the parameters of interest evaluated in this experiment were the survival of the animals and the increase in the volume of the tumor mass.
  • the results presented in Figure 9 show the efficacy of the L552 peptide in a model of colon carcinoma in which an inflammatory scenario has been added, by injection of LPS.
  • A The results show that the L552 peptide was more effective in increasing the survival (* p ⁇ 0.05) of the animals in comparison with the group treated with 5-FU, when an inflammatory scenario is added to the development of the tumor.
  • Statistical analysis to determine significant differences between groups was performed by the Log Rank method.
  • the L552 peptide was more effective in terms of the ability to inhibit tumor progression. The result presented in this example demonstrates that the L552 peptide is effective in the treatment of cancer associated with inflammation.
  • Example 10 Illustrates the synergistic effect of the combination of the L552 peptide and standard chemotherapy.
  • HT-29 and H-125 tumor cells were seeded in 96-well plates (Costar) at a density of 1 x 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium (Gibco) supplemented with Bovine Fetal Serum (Gibco). After 24 hours, the peptide was added to the culture medium in a dose range between 9 ⁇ and 300 ⁇ and the cytostatics in a dose range that included serial dilutions of 1: 10 above and below its IC 5 or reported for each cell line. The incubation was carried out for 48 hours in the presence of 5% CO2 and at the end of it it was revealed with MTT.

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Abstract

La presente invención describe un método para el tratamiento del cáncer mediante el incremento de la localización nuclear de la proteína COMMD1, lo cual se asocia con la disminución o bloqueo de la proliferación de la célula de cáncer. La invención se relaciona, además, con el uso de agentes que incrementan la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la fabricación de un medicamento para la terapia del cáncer. Dichos agentes pueden ser péptidos o proteínas, entre otros compuestos. La invención también se relaciona con la optimización de un péptido, proveniente de la secuencia HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, para incrementar la localización nuclear de la proteína COMMD1 y, de esa forma, aumentar el efecto antitumoral de dicho péptido.

Description

METODO PARA LA TERAPIA DEL CANCER
Campo de la técnica
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina, en particular con la terapia del cáncer, al revelar una nueva diana terapéutica para el desarrollo de fármacos antitumorales. Dichos fármacos, debido a su mayor selectividad y eficacia, contribuyen a la mejora en los tratamientos actuales del paciente con cáncer. Se describe un método para el tratamiento del cáncer mediante la expresión y acumulación nuclear la proteína COMMD1. Modificaciones químicas introducidas en la estructura primaria del péptido HARIKPTFRRLKWKYKGKFW, aumentan la localización nuclear de COMMD1 e incrementan la actividad antitumoral del péptido in vitro e in vivo.
Estado de la técnica anterior
A pesar de los grandes avances en la terapia del cáncer, existe un gran interés en el desarrollo de nuevos agentes antitumorales con un nuevo modo de acción, debido al desarrollo de resistencia por las células tumorales hacia los actuales fármacos anticancerígenos. Los péptidos están siendo de gran interés como nuevos fármacos terapéuticos, por su papel como mediadores de importantes funciones biológicas y sus propiedades intrínsecas únicas que los hacen agentes terapéuticos particularmente atractivos. Los péptidos muestran una alta actividad biológica, asociada con baja toxicidad y alta especificidad. Los beneficios debidos a estas características incluyen una elevada especificidad de unión al blanco deseado, minimizan las interacciones fármaco- fármaco y manifiestan una menor acumulación en tejidos reduciendo el riesgo de complicaciones debido a metabolitos intermediarios (Vlieghe et al., 2010, Drug Discovery Today, 15:40-56). En la actualidad existen terapias anti-cáncer que utilizan péptidos y/o pequeñas moléculas, con selectividad de unión a una determinada proteína diana, que tiene una función biológica importante en el desarrollo del cáncer. En un primer escenario, estas terapias pueden estar dirigidas a inhibir determinada función de una proteína, como por ejemplo: Inhibidores de las proteínas de estrés térmico (conocidas como HSPs, del inglés Heat Shock Proteins) (Subbarao et al., 2004, Pharmacology & Therapeutics, 101:227-257); Inhibidores de la tirosina kinasa (Garrido et al., 2007, Rev Med Chil, 10:1327-1332) y como principal evento provocan la apoptosis de la célula de cáncer. En la mayoría de las situaciones estas proteínas están aberradas en el proceso maligno, si se comparan con el tejido normal. En un segundo escenario, el fármaco se une a una proteína diana que puede o no estar aberrada en el proceso maligno comparado al tejido normal, en este caso se afectan vías de señalización que son activadas en el proceso de malignidad, por ejemplo: Inhibidores de la replicación del ácido desoxirribonucleico (ADN), inhibidores del ensamblaje de los microtúbulos e inhibidores del factor transcripcional NFkB. Mientras que el primer escenario es altamente efectivo en determinadas malignidades hematopoyéticas, la mayoría tiene limitada efectividad en la complejidad de los tumores sólidos. Por el contrario, el segundo escenario incluye algunos de los más efectivos y aún más tóxicos fármacos de la farmacopea oncológica. Por esta razón, se necesita avanzar en la búsqueda de nuevos fármacos que sean cada vez más selectivos y efectivos, minimizando su toxicidad. En este sentido la identificación de nuevas dianas terapéuticas y la comprensión de su papel en el desarrollo del cáncer, ayudará a identificar nuevos mecanismos de resistencia a fármacos y facilitará el diseño de nuevos medicamentos que retengan una mayor actividad y puedan combinarse con los ya existentes, disminuyendo la toxicidad de ios mismos y aumentando la calidad de vida del paciente con cáncer. La proteína COMMD1 , previamente conocida como MURR1 (van de Sluis et al., 2002, Human Molecular Genetic, 1 1 :165-173) pertenece a una nueva familia de proteínas, conocidas por sus siglas COMMD (del inglés Copper Metabolism gene MURR1 Domain, abreviado COMMD). Las diez proteínas miembros de la familia son altamente conservadas en organismos pluricelulares y ubicuamente expresadas, pero las funciones biológicas de la mayoría de sus miembros se desconocen. La principal característica de esta familia es la presencia del dominio COMM (del inglés Copper Metabolism Murrl Domain), conservado y único, comprendido entre los residuos de aminoácidos 110-190 del extremo C-terminal (Burstein et al., 2005, The Journal of Biological Chemistry, 280:22222-22232). COMMD1 ha sido implicada en diversos procesos biológicos como son: control del metabolismo del cobre (Tao et al., 2003, Journal of Biological Chemistry, 278:41593-41596); regulación del transporte ¡ntracelular de sodio (Biasio et al., 2004, Journal of Biological Chemistry, 279:5429-5434); inhibición del factor trascripcional NFkB (Maine et al., 2007,The EMBO Journal, 26:436-447); inhibición de la expresión de genes regulados por el factor inducido por hipoxia HIF-1a (van de Sluis et al., 2007, Molecular and Cellular Biology, 27:4142-4156).
COMMD1 presenta interacción física con la subunidad RelA(p65) del factor transcripcional NFkB, con la subunidad catalítica-α del factor HIF-1a, y con Delta ENaC en los canales epiteliales de sodio. En todos los casos esta interacción conlleva a la degradación de estas proteínas "clientes" a través de un mecanismo que involucra la ubiquitinación y la degradación vía proteasoma. Se ha demostrado que el dominio COMM está involucrado en las interacciones proteína-proteína, tanto para proteínas "clientes" de COMMD1 , así como interacciones entre los miembros de la familia. Existe la propuesta de estructura tridimensional para la región del extremo N-terminal de COMMD1 , pero no existe aún una estructura terciaria para el dominio COMM (Sommerhalter et al., 2007, Journal of Molecular Biology, 365:715- 721).
La expresión basal de COMMD1 es controlada en la célula mediante un proceso de ubiquitinación y degradación proteasomal, a través de una serie de residuos de leucina, ubicados en el dominio COMM (Maine et al., 2009, Biochemical Journal, 417:601-609). Recientemente, se ha descrito que COMMD1 presenta un mecanismo constitutivo de transporte citoplasma-núcleo a través de señales de exportación nuclear (del inglés Nuclear Export Signáis, abreviado NES) ubicadas también en su dominio COMM. Se ha reportado que una disrupción en las secuencias de leucina y/o agentes que inhiban la degradación proteasomal, producen un aumento de la expresión de COMMD1 en la célula. Además, la disrupción de las secuencias NES en COMMD1 incrementan la represión de la actividad transcripcional de los factores NFkB y HIF-1a (Muller et al., 2009, Traffic, 10:514-527).
La célula neoplásica aberrada sobre-expresa diferentes proteínas anti-apoptóticas, como por ejemplo la proteína inhibidora de la apoptosis XIAP y la proteína clusterina (CLU), la cual acelera la progresión del cáncer de próstata a andrógeno independiente. Ambas proteínas favorecen la ubiquitinación y degradación proteasomal de COMMD1 , facilitando la activación de NFkB y la supervivencia de la célula tumoral. Se reporta que inhibidores del proteasoma, como por ejemplo el MG132 (Shirley et al., 2005, Neoplasia, 7:1104-1111; Zhou et al., 2009, Cáncer Research, 21 :333-339), presentan efecto antitumoral por inhibir el mecanismo de ubiquitinación y degradación proteasomal. Compuestos que se unen a XIAP inducen apoptosis, por bloquear el efecto inhibitorio de esta proteína sobre la activación de la caspasa-3 y caspasa-9 (Vogler et al., Cáncer Research, 2009, 69:2425-2434). Se propone que ácido ribonucleico (ARN) de interferencia (ARNi) diseñado para inhibir la función de CLU tiene efecto antitumoral, por estabilizar un inhibidor citoplasmático del factor NFkB conocido como 1-kB (Zoubeidi et al., 2010, Molecular Cáncer Research, 8:19-30).
En la solicitud de patente internacional WO 07/095867, la esencia de la invención se relaciona con péptidos provenientes de la región 32-51 de la proteína LALF (del inglés, Limulus anti- lipopolisaccharide ίθθίοή, en los que se han realizado sustituciones de aminoácidos que garantizan la disociación de la capacidad de unión al lipopolisacárido (LPS) bacteriano, y tienen efecto antitumoral e inmunomodulador. Uno de esos péptidos es el nombrado péptido L2. Además, en otra invención (Solicitud internacional PCT/CU2008/000006) se revela la capacidad de penetración a células de los péptidos anteriormente mencionados. Sin embargo, en dichas invenciones no se revela ni se sugiere el mecanismo de acción de los mismos.
En la actualidad existe un gran número de terapias dirigidas al tratamiento del cáncer (quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, etc.), muchas de las cuales se encuentran en fase de ensayos clínicos. Sin embargo, aún persisten desventajas asociadas a estas terapias como son: la poca selectividad, la toxicidad y el desarrollo de resistencia al fármaco. Otro aspecto importante a tener en cuenta en este campo es la selección de biomarcadores, útiles como diagnostico y/o predictores de eficacia de un fármaco. Por lo tanto, aún existe la necesidad de investigar y descubrir nuevas moléculas que sean útiles en el tratamiento y/o diagnóstico del cáncer, y el diseño de fármacos cada vez más selectivos y eficaces con menor toxicidad.
Explicación de la invención
La presente invención resuelve el problema antes mencionado, al describir un método para el tratamiento del cáncer mediante el incremento de la localización nuclear de la proteína COMMD1. Dicho incremento provoca la disminución o bloqueo de la proliferación de la célula de cáncer. En esta invención se revela, por primera vez, que el péptido L2 (cuya secuencia es HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, SEQ ID No. 1) y COMMD1 interaccionan en células de cáncer, y que la localización nuclear de COMMD1 se asocia con la muerte de la célula cancerígena. De este modo, la presente invención proporciona un uso de la proteína COMMD1, en la identificación de compuestos con actividad antitumoral que facilitan la acumulación y localización nuclear de COMMD
Los datos aportados en esta invención demuestran que el péptido antitumoral L2, interacciona con COMMD1 , específicamente en la región comprendida entre los aminoácidos 110-190 de la misma. Además, el péptido L2 produce la acumulación nuclear de COMMD1. Asimismo, por primera vez se reporta en esta invención que la expresión de la proteína COMMD1 portando secuencias de localización nuclear (del inglés Nuclear Localization Sequence, abreviado NLS) es suficiente para inducir la muerte de la célula cancerígena. Por tanto, la presente invención demuestra el uso de COMMD1 , por primera vez, como diana terapéutica en el tratamiento del cáncer.
Además, se optimiza el péptido L552 (SEQ ID No. 3), a partir de la secuencia del péptido L2 (SEQ ID No. 1), para provocar una acumulación de COMMD1 en el núcleo, y aumentar el efecto antitumoral in vitro e in vivo de dicho péptido. El péptido L552 (SEQ ID No. 3), descrito en esta invención, que fue optimizado para facilitar la localización nuclear de COMMD1, presenta la siguiente secuencia:
Ac-HARIKpTFRRIKWKYKGKFW SEQ ID No. 3
La optimización está basada en realizar modificaciones químicas, mediante sustituciones de aminoácidos naturales por aminoácidos no naturales (D- aminoácidos) en posiciones específicas (que se representan en minúsculas y negritas en la secuencia incluida arriba) y la protección del extremo N-terminal mediante acetilación (indicado como Ac- en la secuencia incluida arriba). Estas modificaciones, realizadas a la secuencia del péptido L2 (SEQ ID No. 1), y que dan lugar al péptido L552 (SEQ ID No. 3), garantizan una mayor acumulación de COMMD1 en núcleo y un aumento en la actividad antitumoral del péptido L552, respecto al péptido original L2. Por lo tanto, el péptido L552 es una nueva clase de moléculas que interacciona con COMMD1 , facilitando su localización nuclear y produciendo la inhibición de la proliferación de la célula de cáncer.
Es también objeto de la presente invención el uso de agentes que incrementan la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la fabricación de un medicamento para la terapia del cáncer. Entre los agentes o compuestos que facilitan la acumulación nuclear de COMMD1 pueden incluirse, por ejemplo: proteínas (incluyendo anticuerpos), muteínas, péptidos, polinucleótidos, aptámeros, ácidos nucleicos, y pequeñas moléculas orgánicas. Dichos compuestos pueden ser aislados de fuentes naturales, elaborados de forma sintética o recombinante, o cualquier combinación de los mismos. En una realización particular, el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 es el péptido L552 (SEQ ID No. 3). En el contexto de esta invención tienen el mismo significado aumentar o incrementar la localización nuclear de COMMD1 y acumular la proteína COMMD1 en el núcleo de la célula. En otra realización particular, el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína CO MD1 puede ser tipo ácido nucleico, tal como un vector de expresión en células de mamíferos que contiene una secuencia de ADN que codifica para la proteína COMMD1 conteniendo NLS. Este tipo de vector puede ser empleado como terapia génica.
Además, es parte de la invención una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende un agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1. En una realización de la invención, la composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva del agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 (determinada por su concentración inhibitoria 50 (CI50)) y excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. La composición puede ser administrada por ruta parenteral, o por vía tópica.
La administración de una composición farmacéutica que comprende un agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 se constituye en un método para tratar o prevenir un tumor sólido en un sujeto, donde el método comprende la administración del agente que facilite la localización nuclear de COMMD1 en una cantidad efectiva, para disminuir o bloquear el crecimiento de la célula tumoral.
En una realización de la invención, el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 puede ser administrado a pacientes con leucemias, específicamente leucemia mielocítica, bloqueando la proliferación de la célula de cáncer, incluso en presencia de estímulos inflamatorios.
En la presente invención se demuestra que el péptido L552 puede emplearse combinado con la quimioterapia estándar para producir un efecto sinérgico y reducir la dosis de los citostáticos, como por ejemplo cisplatino y 5-Fluorouracilo (5-FU). Por tanto, es también objeto de la presente invención una combinación farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende uno o varios agentes que incrementan la localización nuclear de la proteína COMMD1 , y uno o varios fármacos específicos para quimioterapia estándar del cáncer. En una materialización de la invención, dicho agente es el péptido L552 y el fármaco específico para la quimioterapia estándar se selecciona entre cisplatino y 5-FU. En dicha combinación farmacéutica los agentes y fármacos que forman parte de la misma se pueden administrar de forma simultánea, separada o secuencial en el curso de un mismo tratamiento.
Por otro lado, la relación entre la inflamación y el cáncer es hoy un hecho aceptado. En la actualidad se cataloga el microambiente inflamatorio como un rasgo del tumor, que clasifica dentro de las seis características más importantes del cáncer, descritas por Hanahan y Weinbergs (Perwez et al., 2007, Int J Cáncer, 121 :2373-2380).
Los datos aportados en esta invención indican que el péptido L552 es efectivo en bloquear el crecimiento de la célula de cáncer en presencia de un estímulo inflamatorio. De igual manera, la expresión de la proteína GFP-NCOMMD1 que porta NLS, facilita el mismo efecto en la célula de cáncer. Más específicamente, los resultados demuestran que el péptido L552 facilita la muerte de la célula de cáncer en presencia de estímulos inflamatorios como el LPS y el factor de necrosis tumoral (del inglés Tumor Necrosis Factor a, abreviado TNF-α). De igual forma los datos experimentales in vivo demuestran la efectividad del péptido en un modelo murino de tumor de colon, en el cual los ratones fueron retados con un estímulo inflamatorio por inyección de LPS.
Es por ello que la invención también provee un método para la inhibición del desarrollo de tumores asociados a la inflamación y sus metástasis, que comprende la administración del péptido L552 a un sujeto que lo necesita. Dentro de los tumores asociados a la inflamación y sus metástasis se encuentran, por ejemplo, los siguientes tipos de cáncer: colorectal, esófago, pulmón, próstata, mama, páncreas e hígado.
Asimismo, la administración del péptido L552 puede emplearse, de manera profiláctica, para prevenir el desarrollo de cáncer asociado a la inflamación crónica, como por ejemplo en la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, pancreatitis, cirrosis, etc. Por tanto, es también un objeto de la presente invención, un método para la prevención del cáncer asociado a inflamación crónica que se caracteriza porque se administra el péptido L552 o una composición que comprende dicho péptido a un individuo que lo necesita.
En cuanto a la dosis y esquema de tratamiento a seguir con las composiciones que comprenden el péptido L552, como agente que incrementa la localización nuclear de COMMD1 , una persona con habilidades puede fácilmente determinar la dosis y esquema de tratamiento (profiláctico o terapéutico). Las cantidades efectivas pueden variar en dependencia de la potencia relativa de las composiciones individuales, y puede ser calculada basada en el peso molecular del péptido y la CI5o in vitro o en estudios animales. Por ejemplo, dado el peso molecular del compuesto (estructura química) y una dosis experimental efectiva (CI50) se puede calcular rutinariamente una dosis en mg/Kg de peso. En general las dosis son de 0,2-4 mg/Kg de peso. El péptido o la composición que lo contiene puede ser administrada una vez o varias veces, semanalmente o aún por varios meses.
La invención también se relaciona el uso de COMMD1 como nuevo marcador pronóstico para el paciente con cáncer, mediante la determinación de la presencia o ausencia de localización nuclear de COMMD1 en una muestra.
Igualmente, el péptido L552 proporciona un agente activo para tratar enfermedades donde las proteínas COMMD tengan un papel o intervengan en la progresión de la enfermedad. Esto es posible, por ejemplo en aquellas enfermedades donde la cantidad de algún miembro de la familia COMMD esté aumentada o disminuida y/o esté aumentada o disminuida su actividad, y esto cause la enfermedad. La capacidad del péptido L552 de unirse al dominio COMM, comprendido entre los residuos de aminoácidos 110-190 del extremo C-terminal de las proteínas COMMD, sustenta esta actividad terapéutica del mismo.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Ilustra la interacción física entre el péptido L2 y la proteína COMMD1 utilizando la técnica de dos híbridos de levadura. Como controles negativos se utilizó el apareamiento de la cepa de levadura AH109 transformada con el vector vacío pGBKT7 y cada construcción de los fragmentos de COMMD1 transformados en la cepa Y187. Para la identificación de la interacción se realizó el apareamiento de la cepa AH109 transformada con el vector que porta la secuencia de L2 y cada construcción de los fragmentos de COMMD1 transformada en la cepa Y187. Como control positivo se utilizó el apareamiento pCL1 que porta el factor de transcripción GAL4. Como se observa, la interacción ocurre con los plasmidios que portan la secuencia completa del gen para COMMD1 y la construcción que contiene los aminoácidos 110-190 de la proteína COMMD1.
s Figura 2. (A) Ilustra la validación de la interacción del péptido L2 con COMMD1 por la técnica de inmunoprecipitación (pulldown) en células SW948. En el experimento se adicionan 100 μg de proteínas totales (PT) y la proteína COMMD1 recombinante obtenida en Escherichia coli (COMMD1 r), PM (patrón de peso molecular).
(B) Ilustra la localización sub-celular de COMMD1 en células SW948 tratadas con elo péptido L2. Expresión de COMMD1 en núcleo (N), expresión de COMMD1 en citoplasma (C), células no tratadas (NT). Beta Actina control de la fracción citoplasmática, hnRPN control de la fracción nuclear.
Figura 3. (A) Ilustra la mayor acumulación nuclear de COMMD1 por el péptido optimizado L552. (B) Se muestra la interacción entre el L552 y la proteína COMMD15 en diferentes líneas de tumor, en experimentos de inmunoprecipitación {pulldown).
No se detecta interacción con la proteína cullina7 (CUL7). Se muestra la presencia de Beta Actina en extracto de proteínas totales en las diferentes líneas celulares. Figura 4. Efecto antiproliferativo de los péptidos en células tumorales de diferentes orígenes histológicos, L0 (linfocitos humanos aislados de sangre periférica).
0 Figura 5. Efecto antitumoral del péptido L552 en el modelo de tumor TC-1. (A) Se muestran las curvas de inhibición del crecimiento de la masa tumoral. (B) Se muestra el porciento acumulativo de sobrevida de los diferentes grupos experimentales.
Figura 6. Ilustra que la expresión de la proteína COMMD1 conteniendo secuenciass de localización nuclear es suficiente para inducir la muerte celular. Se muestra el porciento de células no viables teñidas con bromuro de Etidio a las 72 horas, como resultado de la transfección de las construcciones que portan la proteína verde fluorescente (del inglés Green Fluorescent Protein, abreviado GFP) como control negativo, GFP-COMMD1 y la construcción de localización nuclear GFP-N-0 COMMD1.
Figura 7. (A) Se muestra la quimiosensibilidad al 5-FU en células de carcinoma de colon HT-29 transfectada con la construcción GFP-NCOMMD1. Se indican los valores de Cl50. (B) Se ilustra el efecto de un ambiente inflamatorio por adición de LPS y TNF-α sobre la Cl50.
Figura 8. Ilustra el efecto del péptido L552 sobre la proliferación de la célula de cáncer en presencia de diferentes estímulos inflamatorios. Determinación de la Cl50 en células de leucemia mielocítica humana (THP-1) (A) y carcinoma de colon murino (CT-26) (B), tratadas con LPS y TNF-cc.
Figura 9. Efecto antitumoral del péptido L552 en un modelo de cáncer de colon en ratones BALB/c sometidos a un estímulo inflamatorio por inyección de LPS. (A) Se muestra el porciento acumulativo de sobrevida de los diferentes grupos experimentales. (B) Se muestra el promedio del volumen de la masa tumoral para cada grupo experimental.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización
Ejemplo 1. Interacción física entre el péptido L2 y COMMD1.
Para identificar las interacciones péptido antitumoral L2-proteínas se utilizó el sistema de dos híbridos de levadura. Para el clonaje de las secuencias correspondientes al péptido se diseñaron los siguientes oligonucleótidos:
L2F:
CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGAAGTACAAGG GTAAGTTCTGGTAA
L2R:
GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTT GATTCTAGCGTG
que corresponden a la secuencia peptídica L2: HARIKPTFRRLKWKYKGKFW
Para el clonaje de estas secuencias en el vector pGBKT7 Λ/col- BamH\, se adicionaron en los extremos de los oligonucleótidos secuencias complementarias a estos sitios. El plásmido recombinante pGBKL2-1 , que porta la secuencia del péptido L2 fue verificado por análisis de restricción y secuenciación. El plásmido fue transformado en la cepa de levadura AH109, por el método de acetato de litio y sembrado en el medio SD-Trp. Se verificó que no era capaz de autoactivarse al ser sembrado en placas SD-Trp-His. Para el tamizaje de las interacciones se utilizó una librería proveniente de ADN complementario de hígado humano transformada en la cepa Y187. Para la formación de los diploides y la selección de las interacciones 5x108 células de AH109 que contienen el plásmido pGBKL2-1 fueron crecidas con 5x108 células de Y187 que contienen la librería de ADN de hígado humano, durante 4 horas en medio sólido YPDA a 30°C. A las placas de medio YPDA se le añadieron 10 mi de agua estéril en su superficie, y las células fueron resuspendidas cuidadosamente con espátulas y transferidas a 15 placas de medio mínimo SD-Trp- Leu-His-Ade y crecidas a 30°C por 7 días. Las 74 colonias resultantes fueron transferidas a medio líquido SD-Trp-Leu en placas de 96 pocilios profundos. Después de observar crecimiento en medio líquido se procedió a la purificación del ADN de levaduras. Cada uno de los ADN fue transformado individualmente en la cepa de E.coli DH10B, sus ADN purificados y conservados a -20°C. Se procedió a la transformación de cada uno de los clones individuales en la cepa de levadura Y187 y se verificó la interacción mediante apareamiento con la cepa de AH109 transformada con los plásmidos pGBKT7 y pGBKL2-1. Se secuenció el ADN de los clones positivos. Un análisis de las secuencias por el programa BLAST (AltschuI et al., 1990. J Mol Biol, 215:403-410) reveló que uno de los clones (L2-21) se corresponde con la secuencia del gen que codifica para los aminoácidos 6-190 de la proteína COMMD1 , y que este clon es capaz de interactuar con el plásmido que contiene la secuencia del péptido L-2. Para identificar específicamente la región de la proteína COMMD1 responsable de la interacción se realizaron deleciones a la construcción del plásmido pGBKL2-1 , generándose los clones pGBKL2 (6-110), pGBKL2 (6-70), pGBKL2 (71-190), pGBKL2 (110-190). Como se aprecia en la Figura 1 , la interacción se conserva solo en el plásmido pGBKL2 (1 10-190) que contiene el dominio COMM responsable de las interacciones descritas para las proteínas de la familia COMMD. Este resultado ilustra que el péptido L2 se une específicamente a la región comprendida entre los aminoácidos 110-190.
Ejemplo 2. Experimentos de inmunoprecipitación con el péptido L2 y acumulación nuclear de COMMD1.
Los experimentos se dividieron en dos bloques:
(A) El péptido sintético L2 (SEQ ID No. 1), sintetizado usando un procedimiento en fase sólida, fue biotinilado y utilizado como "cebo" unido a una resina de estreptavidina sefarosa. Como "presa" se utilizó un extracto de proteínas de la línea tumoral SW948 (carcinoma de colon humano). Estos experimentos se conocen como "pulldown" (del inglés). El extracto de proteína se obtuvo a partir de 2 x 107 células utilizando buffer de extracción (Tritón X-100 0,5%; 25 mM HEPES, pH 7,5; 100 mM NaCI; 1 mM EDTA; 10% glicerol; 1 mM Ditiotreitol (DTT), y un inhibidor de proteasas. El péptido biotinilado (300 pg) se incubó con 50 μL· de resina estreptavidina sefarosa (GE Healthcare), durante una hora y se realizaron lavados con tampón fosfato salino (PBS 1X) más DTT 1 mM. Posteriormente, se incubaron 500 μg de proteínas totales con 50 μΙ_ de resina conteniendo el péptido biotinilado, a temperatura ambiente durante 5 horas. Posteriormente, la resina se lava extensivamente con PBS 1X y DTT 1 mM. Las proteínas que permanecen unidas a la resina son aquellas que interaccionan con el péptido, y son resuspendidas en 25 pL de buffer para electroforesis (Tris HCI 62,5 mM; pH 6,9; 0,1 M DTT, Dodecilosulfato de sodio (SDS) 20%, glicerol 10% y bromofenol azul 0,01%). Para detectar la proteína de interés se realizó una electroforesis en gel de acrilamida (7,5%), seguido de inmunodetección por "Western blot". Para detectar la proteína COMMD1 , se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-COMMD1 (Sigma, clon 2A12). Se utilizó un extracto de proteínas totales (100 μg) y la proteína recombinante COMMD1 obtenida en E. coli. Los resultados presentados en la Figura 2A demuestran que el péptido L2 concentra la proteína COMMD1 en el experimento de "pulldown" cuando se compara con el extracto de proteínas totales. Esto es indicativo de la interacción entre el L2 y COMMD1.
(B) Las células SW948 (3x106 células) se incubaron durante 5 horas a 37°C y 5% C02 con el péptido L2 (50 μΜ). Posteriormente, se realizó el fraccionamiento celular de las proteínas citosólicas y nucleares, según reporta (Vancurova et al., 2001 , Journal of Biological Chemistry, 276: 19746-19752). La detección de COMMD1 se realizó por "Western blot", utilizando un anticuerpo anti-COMMD1. La Figura 2B demuestra la localización nuclear de COMMD1 en células SW948 tratadas con el péptido L2. Para controlar el fraccionamiento celular se utilizó la Beta Actina como control de la fracción citoplasmática y la ribonucleoproteína humana (hnRNP) como control de la fracción nuclear. Ejemplo 3. Optimización del péptido L552 para la acumulación nuclear de COMMD1.
Teniendo como premisa que el péptido L2 y la proteína COMMD1 interaccionan y esto se asocia con la localización nuclear de COMMD1 , se diseñaron diferentes péptidos a partir de L2 (SEQ ID No. 1), con el objetivo de potenciar la acumulación nuclear de COMMD1 en las variantes peptídicas.
Los péptidos de la invención se sintetizaron usando un procedimiento en fase sólida. El péptido crudo se extrae con una solución de ácido acético al 30%, se liofiliza y posteriormente se purifica por cromatografía de fase reversa RP-HPLC. La masa molecular de los péptidos purificados se verifica mediante espectrometría de masa. La preparación resultante es no antigénica, no pirogénica y farmacéuticamente aceptable para su administración en animales y humanos. Las sustituciones se realizaron puntualmente, introduciendo aminoácidos de configuración-D en posiciones puntuales en la secuencia del péptido original L2, cuya secuencia es HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ ID No. 1), tal como se muestra en la Tabla 1. En un caso, se bloqueó además el extremo N-terminal por acetilación.
Tabla 1. Secuencia de los péptidos utilizados en la invención
Figure imgf000014_0001
Nota: los aminoácidos en negritas y minúsculas significan cambios por D-aminoácidos
En este experimento el objetivo fue identificar un péptido que produjera la mayor acumulación nuclear de COMMD1. Las células SW948 (3x106 células) se incubaron durante 5 horas a 37°C y 5% C02 con los péptidos L2, L551, L552, L553 y L554 (50 μΜ). Posteriormente, se realizó el fraccionamiento celular de las proteínas citosólicas y nucleares según reporta Vancurova et al., igual que en el Ejemplo 2. La detección de COMMD1 se realizó por "Western blot", utilizando un anticuerpo anti- COMMD1. La Figura 3A demuestra la localización nuclear de COMMD1 en células SW948 tratadas con los péptidos antes mencionados. Los resultados indican que el péptido L552 produjo la mayor acumulación en núcleo de COMMD1. Además, se demuestra la interacción entre el péptido L552 y COMMD1 mediante experimentos de inmunodetección {pulldown) en diferentes líneas de tumor, Figura 3B. Con estos experimentos se valida la interacción entre el péptido L552 y la proteína COMMD1. Asimismo, la interacción se relaciona con la facilitación de la acumulación nuclear de COMMD1.
Ejemplo 4. Ilustra el incremento del efecto antiproliferativo del péptido L552 en líneas celulares de tumor.
Para este ensayo las células tumorales de origen humano H-82 (células pequeñas de cáncer de pulmón), H-125 (células no pequeñas de cáncer de pulmón), MCF-7 (adenocarcinoma de mama), MDA-MB231 (adenocarcinoma de mama positivo para el receptor del factor de crecimiento epidérmico), LS174T (adenocarcinoma colorectal) y HT-29 (adenocarcinoma colorectal resistente a la quimioterapia), se sembraron en placas de 96 pocilios (Costar) a una densidad de 1 x 104 células/mí¬ en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con Suero Fetal Bovino (Gibco). Al cabo de 24 horas, los péptidos fueron adicionados al medio de cultivo en un rango de dosis entre 9 μΜ y 300 μΜ. La incubación se realizó por espacio de 48 horas en presencia de C02 al 5% y al término de la misma se reveló con 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)2,5 bromuro difeniltetrazolio (MTT) (Gray MJ et al., 2008, Nati Cáncer Inst, 100:109-20). Finalmente, se realizó la lectura de la placa a una absorbancia de 492 nm. Cada punto se realizó por duplicado, y los experimentos fueron llevados a cabo al menos dos veces de manera independiente. Los valores de Cl50 se obtuvieron de las respectivas curvas de proliferación celular. Los resultados se presentan en la Figura 4. Los resultados demuestran que la acetilación en el extremo N-terminal y la sustitución por D-aminoácidos, en posiciones específicas, garantizan un incremento en el efecto antiproliferativo del péptido L552. Sin embargo, ningún efecto se observó en linfocitos humanos aislados de sangre periférica (L0 humanos). Este resultado demuestra que el péptido L552, objeto de esta invención, incrementa su efecto citotóxico selectivo sobre células tumorales sin provocar aumento de la toxicidad en células sanas. Los resultados aportados demuestran que el péptido L552 ha sido optimizado para interaccionar con la proteína COMMD1, facilitar su mayor acumulación en núcleo y aumentar el efecto antiproliferativo selectivo sobre las células de cáncer.
Ejemplo 5. Efecto antitumoral del péptido L552 en un modelo murino de tumor TC-1.
En estos ensayos se utilizaron ratones C57BL/6 de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos (/?=10 animales por grupo experimental). Para la implantación del tumor en este modelo, se usaron las células TC-1 derivadas de células epiteliales de pulmón de C57BLJ6 malignizadas, las cuales fueron resuspendidas en solución salina (PBS). Una cantidad de 5 x 104 células en un volumen de 200 μΐ fue inoculada a los ratones por vía subcutánea en la pata posterior derecha. Se administraron 5 dosis de los péptidos (L2, L552 y L551) con intervalos de 2 días, por vía subcutánea en el flanco derecho, una vez que los tumores alcanzaron 100 mm3 de volumen. En este ensayo se evaluó una dosis de 0,2 mg de péptido por Kg de peso (4 μg/ratón). Los parámetros evaluados para medir el efecto antitumoral de los péptidos de interés fue la sobrevida de los animales y la masa tumoral, como se puede observar en las Figura 5A y Figura 5B. El péptido L552 fue más efectivo en cuanto a la capacidad de inhibir la progresión del tumor y aumentar la sobrevida de los ratones respecto al péptido L2 y L551. Estos resultados evidencian que las modificaciones introducidas al péptido de esta invención (L552) aumentan la eficacia antitumoral en un modelo de tumor sólido. El análisis estadístico para determinar diferencias significativas entre los grupos se realizó por el método de Log Rank. Los resultados evidencian que el péptido L552 aumenta significativamente (*p< 0,05) la sobrevida de los animales en comparación a los otros péptidos ensayados. Estos resultados demuestran que sustituciones por D-aminoácidos, en posiciones específicas, y bloqueo del extremo N-terminal por acetilación, incrementan significativamente la capacidad antitumoral del péptido.
Ejemplo 6. Ilustra que la expresión de la proteína COMMD1 portando secuencias de localización nuclear es suficiente para inducir la muerte de la célula.
Para confirmar el papel de la localización nuclear de COMMD1 en la inhibición de la proliferación celular, se generaron los plásmidos recombinantes pGFP-COMMD1, que expresa COMMD1 fusionada a la GFP, y pGFP-NCOMMD1 , que contiene además la secuencia peptídica de localización nuclear PKKKRKV. Para el clonaje de pGFP-COMMD1 se realizó la reacción en cadena de la Polimerasa utilizando los oligonucleótidos:
CF: TTCTGCAGTCGACCTTGAGGGTGGCAAA
CR: CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT
Para la amplificación del gen que codifica para COMMD1 con la introducción de NLS se utilizaron los oligonucleótidos:
NF: TGCAGTCGACCCGAAAAAGAAAGGGAAACTTGAGGGTGGCAAACCC CR:
CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT.
Los clones recombinantes fueron analizados por restricción y secuencia de ADN. Ambas construcciones y el control pEGFP fueron transfectados de forma independiente en las líneas celulares HT-29 y HEK293 de forma transiente utilizando Polietilenimina (Sigma, USA) (Boussif, O et al., 1995, Proc Nati Acad Sci, 92: 7297-7301 ), en placas de 24 pocilios por duplicado. A las 72 horas uno de los pocilios fue utilizado para evaluar la expresión de las proteínas recombinantes utilizando un microscopio de fluorescencia Axiovert 40 (Zeiss, Alemania) y el objetivo APIan 10X. Al pocilio restante se le eliminó el medio de cultivo y se realizó una tinción con una mezcla de Naranja de Acridina/Bromuro de Etidio (AO/BE) a una concentración de 5 pg/mL en PBS, para la identificación de la apoptosis (Rible D, er a/., 2005, BMC Biotechnology, 5:12-15), y fueron observadas en el microscopio Axiovert 40 y el objetivo APIan 40X.
Con este tipo de tinción la AO atraviesa la membrana de las células vivas y tiñe verde los núcleos y naranja el citoplasma, mientras que el BE solo penetra las células con pérdida de la integridad de las membranas y tiñe el ADN nuclear de rojo. La fluorescencia del BE domina sobre la fluorescencia de la AO. La tinción AO/EB muestra las células viables teñidas con AO con sus núcleos verdes y el citoplasma naranja en las transfecciones con GFP y GFP-COMMD1. Solamente en el caso de las células transfectadas con la construcción GFP-NCOMMD1 se observaron las células con el núcleo teñido por el BE, lo que indica que se encuentran en una fase de apoptosis tardía. La Figura 6 muestra la gráfica del porciento de células con el núcleo teñido de rojo de tres campos independientes por condición experimental. Se representan los valores y las desviaciones estándar. Estos resultados demuestran que la introducción de NLS en la proteína COMMD1 , es suficiente para la inducción de la apoptosis en las líneas celulares evaluadas. Asimismo, estos resultados demuestran el uso de COMMD1 como nueva diana terapéutica para fármacos antitumorales, a través de compuestos que faciliten su acumulación y localización nuclear. De esta manera se demuestra que la optimización del péptido L2, que da lugar al péptido L552, en cuanto a la acumulación nuclear de COMMD1 está correlacionada con un aumento del efecto antitumoral.
Ejemplo 7. Ilustra el efecto de la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la sensibilidad al citostático 5-FU y a estímulos inflamatorios en la célula HT-29.
(A) La línea celular HT-29 transfectada temporalmente con las construcciones anteriormente descritas fueron sembradas en placas de 96 pocilios (Costar) a una densidad de 1 x 104 células/mL en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con Suero Fetal Bovino (Gibco). Al cabo de 24 horas, el citostático 5-FU fue adicionado al medio de cultivo en un rango de dosis entre 0,025 μΜ y 2500 μΜ, en diluciones seriadas de 1 :10. La incubación fue realizada por espacio de 48 horas en presencia de CO2 al 5% y al término de la misma se reveló con MTT. Finalmente, se realizó la lectura de la placa a una absorbancia de 492 nm. Cada punto se realizó por duplicado, y los experimentos fueron llevados a cabo al menos dos veces de manera independiente. Los valores de Cl50 se obtuvieron de las respectivas curvas de proliferación celular. Los resultados presentados en la Figura 7A demuestran que la expresión de la proteína COMMD1 con NLS (GFP-NCOMMD1) provoca una mayor sensibilidad de la célula de cáncer a la acción del citostático 5-FU. Se demuestra en este ejemplo por una reducción en la Cl50 con respecto a las células que expresan GFP o GFP-COMMD1. Estos resultados también demuestran el uso de COM D1 como nueva diana terapéutica para fármacos antitumorales. Además, demuestra que la localización nuclear de COMMD1 induce quimiosensibilidad a los citostáticos convencionales.
(B) La línea celular HT-29 transfectada temporalmente con la construcción GFP- NCOMMD1 fue sometida a diferentes estímulos inflamatorios, como por ejemplo
LPS (40 μg/mL) y TNF-a (20 ng/mL) durante 30 min. Posteriormente la Cl50 fue evaluada como se explica en el Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Figura 7B. Ejemplo 8. Ilustra el efecto del péptido L552 sobre la proliferación celular de la célula de cáncer sometida a un estimulo inflamatorio.
Para este ensayo, células de leucemia mielocítica aguda de origen humano (THP-1) y células de carcinoma de colon murina (CT-26) fueron sembradas en placas de 96 pocilios (Costar) a una densidad de 1 x 104 células/mL en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10 % de Suero Fetal Bovino (SFB). Las células se mantuvieron durante 24 hrs a 37°C y 5%C02. Pasado este tiempo se añadió LPS (40 μg/mL) o TNF-a (20 ng/mL) durante 30 min. La Figura 8 presenta el cálculo de la Cl50 de las líneas celulares THP-1 y CT-26 en presencia o no de los estímulos anteriormente mencionados. Los resultados demuestran que el péptido L552 inhibe la proliferación celular en las líneas de cáncer THP-1 y CT-26, en presencia de diversos estímulos inflamatorios. Este resultado demuestra que el péptido L552 es efectivo en bloquear la proliferación de células de cáncer sometidas a diferentes agentes inflamatorios. Ejemplo 9. Ilustra el efecto antitumoral del péptido L552 en un modelo de cáncer de colon en ratones BALB/c sometidos a un estímulo inflamatorio por inyección con LPS.
En estos ensayos se utilizaron ratones BALB/c de sexo femenino y entre 8 y 10 semanas de nacidos, (n=10 animales por grupo experimental). Para la implantación del tumor en este modelo, se usaron las células CT-26 aisladas de un carcinoma de colon en ratones BALB/c. Una cantidad de 7 x 104 células, resuspendidas en un volumen de 200 μΐ de PBS 1X, fueron inoculadas a los ratones por vía subcutánea intra-axilar. Pasados 11 días, los animales recibieron una inyección de 10 μg LPS/ratón (serotipo 055:B5, Sigma) en PBS 1X y administrada por vía intraperitoneal. Una vez que los tumores alcanzaron 100 mm3 de volumen, un grupo recibió 5 dosis de péptido L552 (0.2 mg/Kg de peso) en días alternos, otro grupo recibió 5-FU en dosis de 20 mg/Kg de peso. Los parámetros de interés evaluados en este experimento fueron la sobrevida de los animales y el aumento del volumen de la masa tumoral.
Los resultados presentados en la Figura 9 evidencian la eficacia del péptido L552 en un modelo de carcinoma de colon en el cual se ha adicionado un escenario inflamatorio, por inyección de LPS. (A) Los resultados evidencian que el péptido L552 fue más efectivo en aumentar la sobrevida (*p<0,05) de los animales en comparación con el grupo tratado con 5-FU, cuando al desarrollo del tumor se adiciona un escenario inflamatorio. El análisis estadístico para determinar diferencias significativas entre los grupos se realizó por el método de Log Rank. (B) El péptido L552 fue más efectivo en cuanto a la capacidad de inhibir la progresión del tumor. El resultado presentado en este ejemplo demuestra que el péptido L552 es efectivo en el tratamiento del cáncer asociado a la inflamación.
Ejemplo 10. Ilustra el efecto sinérgico de la combinación del péptido L552 y la quimioterapia estándar.
Para este ensayo las células tumorales HT-29 y H-125 se sembraron en placas de 96 pocilios (Costar) a una densidad de 1 x 104 células/mL en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con Suero Fetal Bovino (Gibco). Al cabo de 24 horas, el péptido fue adicionado al medio de cultivo en un rango de dosis entre 9 μΜ y 300 μΜ y los citostáticos en un rango de dosis que abarcara diluciones seriadas de 1 :10 por encima y por debajo de su CI5o reportada para cada línea celular. La incubación fue realizada por espacio de 48 horas en presencia de CO2 al 5% y al término de la misma se reveló con MTT. El efecto del tratamiento concomitante péptido-citostático se analizó según el programa computarizado CalcuSyn para el estudio de combinaciones de fármacos (Ting-Chao Chou, 2006, Pharmacological Reviews, 58: 621-681). Los datos presentados en la Tabla 2 demuestran que la combinación péptido-citostático permite reducir la cantidad de estos últimos, dado por los valores mostrados en el índice de Reducción (IR) del fármaco. Estos resultados indican que el péptido puede ser administrado en unión con la quimioterapia estándar para proporcionar un tratamiento efectivo (fracción de células afectadas entre 89%-94%) con una menor cantidad del fármaco convencional. La combinación 5-FU + péptido L552 permite una reducción (IR) del citostático de 20 veces en la línea celular HT-29. Para la combinación cisplatino + péptido L552 la reducción del citostático es de 5 veces en la línea celular H-125. Estos resultados indican que el péptido puede ser administrado en combinación con el tratamiento estándar para cáncer de pulmón y cáncer de colon, facilitando una reducción en la dosis del citostático. De este modo se pueden disminuir los efectos adversos asociados a la quimioterapia. Tabla 2. Sinergismo de la terapia combinada entre el péptido L552 y los citostáticos 5-FU y cisplatino, para dos líneas celulares de tumor humano.
Figure imgf000021_0001
HT-29 89% 0.3 5000 700 20 5
Figure imgf000021_0002
H-125 94% 0.5 273 308 5 3 Una Cl < 1 significa sinergismo; Cl = 1 significa aditividad; Cl >1 significa antagonismo. Además, se muestra el Indice de Reducción (IR) del fármaco en combinación.

Claims

REIVINDICACIONES METODO PARA LA TERAPIA DEL CANCER
1. Método para la terapia del cáncer caracterizado porque se incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula de cáncer lo que causa la disminución o bloqueo de la proliferación de dicha célula.
2. El método según la reivindicación 1 caracterizado porque se contacta la célula de cáncer con un agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula de cáncer o se administra a un sujeto una composición que comprende el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula de cáncer.
3. El método según la reivindicación 2 caracterizado porque el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula de cáncer comprende un péptido con la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3.
4. El método según la reivindicación 3 caracterizado porque se inhibe el desarrollo de tumores asociados a la inflamación y sus metástasis.
5. El método según la reivindicación 4 caracterizado porque el tumor asociado a la inflamación, y sus metástasis, está localizado en colon, recto, esófago, pulmón, próstata, mama, páncreas o hígado.
6. El método según la reivindicación 2 caracterizado porque el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula de cáncer comprende un vector de expresión en células de mamíferos que contiene una secuencia de ADN que codifica para la proteína COMMD1 conteniendo secuencias de localización nuclear (NLS).
7. Uso de un agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la fabricación de un medicamento para la terapia del cáncer.
8. El uso según la reivindicación 7 donde el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 es una proteína, un péptido sintético, un ácido nucleico o un vector para terapia génica.
9. El uso según la reivindicación 8 donde el péptido sintético es un péptido con la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3.
10. El uso según la reivindicación 8 donde el vector para terapia génica es un vector de expresión en células de mamíferos que comprende una secuencia de ADN que codifica para la proteína COMMD1 conteniendo NLS.
11. Composición farmacéutica para la terapia del cáncer que comprende uno o varios agentes que incrementan la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula de cáncer y excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
12. La composición de la reivindicación 11 donde el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula de cáncer es el péptido con la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3.
13. La composición de la reivindicación 11 donde el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula de cáncer es un vector de expresión en células de mamíferos que comprende una secuencia de ADN que codifica para la proteína COMMD1 conteniendo NLS.
14. Combinación farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende uno o varios agentes que incrementan la localización nuclear de la proteína CO MD1 , y uno o varios fármacos específicos para la quimioterapia estándar del cáncer.
15. La combinación farmacéutica de la reivindicación 14 donde el agente que incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 comprende el péptido con la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3 y el fármaco específico para la quimioterapia estándar se selecciona entre cisplatino y 5-FU.
16. La combinación farmacéutica de la reivindicación 14 donde los agentes y fármacos que forman parte de la misma se administran de forma simultánea, separada o secuencial en el curso de un mismo tratamiento.
17. Método para la prevención del cáncer asociado a inflamación crónica caracterizado porque se incrementa la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula.
18. El método de la reivindicación 17 donde el incremento de la localización nuclear de la proteína COMMD1 en la célula se logra administrando el péptido con la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3 o una composición que comprende dicho péptido a un individuo que lo necesita.
19. Método para determinar el pronóstico de un paciente con cáncer que se caracteriza porque se emplea COMMD1 como marcador pronóstico, medíante la determinación de la presencia o ausencia de localización nuclear de COMMD1 en una muestra de dicho paciente.
20. Péptido con capacidad de unión al dominio COMM que se caracteriza porque tiene la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 3.
21. Uso del péptido de la reivindicación 20 para el tratamiento de enfermedades donde un miembro de la familia COMMD interviene en la progresión de la enfermedad.
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