KR20120098436A - 신규한 암 치료 표적인 ｍａｐ７ｄ２ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 암 치료 표적인 MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 인체 암 조직의 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 구축하여 데이터마이닝 기법을 통해 신규한 표적화 항암 후보 표적을 발굴하였고, 이를 암 세포주에서의 유전자 발현 양상을 바탕으로, 적절한 암 세포주를 선정하여 표적 후보 유전자의 억제를 통해 실험적 검증을 하였고, 이를 통해 MAP7D2가 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암과 같은 다양한 암 조직 또는 암 세포에서 과발현되고, MAP7D2의 억제에 의해 암세포의 성장, 이동, 침윤 및 전이가 저해되고 세포사멸이 유도됨으로써, 신규한 항암제의 표적으로서 MAP7D2의 가능성을 확인하였으므로, MAP7D2의 발현 수준을 이용하여 암을 진단하거나, MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 암의 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용할 수 있다.

Description

신규한 암 치료 표적인 ＭＡＰ７Ｄ２ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the treatment of cancers or inhibition of metastasis containing the expression or activity inhibitors of MAP7D2, a novel cancer therapeutic target}

본 발명은 신규한 암 성장 또는 암 전이 치료 표적인 MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암 진행 과정은 암 유발 유전자(oncogene)의 활성화와 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene)의 비활성화를 필요로 하는 복합적인 과정이다. 최근에, 인간 암을 연구 또는 치료하기 위해 마우스 모델을 이용한 연구에서는, 종양 유지를 위해 특정 암 유발 유전자(예를 들어, H-ras, K-ras, Myc 등)들의 지속적인 발현이 필요하며, 이러한 단일 암 유발 유전자의 비활성화에 의해 암이 효과적으로 치료되는 현상이 확인되고 있다. 이는 암 유발 유전자 중독(oncogene addiction)으로 정의되고 있으며, 현재 항암 연구의 중요한 목표는, 암에서 이러한 중독된 암 유발 유전자를 찾기 위해 융합 유전체학(Integrative Genomics)와 시스템 생물학(systems biology)과 같은 새로운 방법들을 통합하여 효과적인 표적화 표적을 찾는 것이다.

허셉틴(Herceptin), 리툭산(Rituxan), 제피티닙(Gefitinib) 및 글리벡(Gleevec) 등 성공적인 표적화 항암 치료제가 임상에서 쓰이면서 표적화 항암제 시장은 큰 성장을 보이고 있으며, 다국적 제약회사들은 새로운 표적화 항암 치료제를 개발하기 위해 많은 연구 개발을 진행하고 있다. 현재 표적화 항암 표적에 대한 치료제가 개발되어 전임상 또는 임상 시험 단계에 있는 것이 다수 있으나, 여전히 각종 암에서 새로운 표적을 확보하려는 노력이 전세계적으로 진행되고 있다. 대표적인 연구로는 미국 NCI와 NHGRI가 공동으로 진행하고 있는 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 연구로 각종 암환자의 엑손 시퀀싱(exon sequencing)을 통해 암에서 빈번하게 발생하는 중요한 돌연변이를 찾는 방식으로 새로운 표적을 확보하려고 하고 있다.

암은 그 원인 및 진행 과정이 대단히 이질적인 질병으로서 형태학적, 병리학적으로는 비슷하지만 분자수준에서는 서로 현저히 다른 형태로 진행한다. 최근의 임상 경험도 이를 뒷받침 하는데, 허셉틴이나 제피티닙과 같이 임상에서 성공적으로 쓰이고 있는 약물들의 표적인 ERBB2 및 EGFR들은 전체 암환자 중 약 20~30% 정도의 일부 환자들에서만 돌연변이되거나 과발현되고 있다.

이와 같이, 암 진행 과정이 서로 이질적이기 때문에, 중요 표적들을 찾기 위해서는 가능한 한 많은 임상 시료를 확보, 분석하는 것이 필요하다. 현재 전 세계적으로도 몇몇 연구 그룹만이 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 확보하고 이를 이용해 표적화 암 치료 표적 발굴 연구를 진행하고 있으며, 국내의 많은 연구들은 아직 대규모 데이터베이스를 확보하지 못한 한계를 가지고 있다.

MAP7D2(MAP7 domain containing 2)는 FLJ14503, MGC104944, RP11-393H10.2의 다른 이름으로 불리는 단백질로, 미세소관 연관 단백질(microtubule-associated protein) 7 도메인의 한 종류이다.

현재까지 MAP7D2에 관한 연구는 자폐 스펙트럼 장애(Autism spectrum disorder, ASD)의 진단을 위한 연구에서 X-염색체(chromosome) 상에서 발현이 감소하는 유전자(미국공개특허 2010/0029009 A1), 또는 X-염색체 연관 정신지체(chromosome X-linked mental retardation)를 지닌 환자의 유전자 복제수 변이의 검출을 위한 X-chromosome의 발현 분석에서 Case 4 환자의 Xp22.12에서 검출되는 약 1Mb의 복제에 영향을 주는 유전자로 기재되어 있을 뿐(BMCGenomics, 2007, 8:443, 2007), 구체적으로 MAP7D2 유전자에 대한 정보, 이의 기능 및 암과의 연관성은 전혀 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 표적화 암 치료 표적을 발굴하기 위하여 연구를 진행한 결과, 암 조직의 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 구축하여 독창적인 데이터마이닝 기법을 통해, 새로운 표적화 항암 후보 표적으로서 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암에서 과발현되는 MAP7D2를 발굴하였고, MAP7D2의 발현 저해에 의해 암세포의 성장, 침윤 및 전이가 현저하게 억제됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 암 성장 또는 암 전이 치료 표적인 MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 MAP7D2를 이용하여, 암의 성장, 침윤 또는 전이 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 MAP7D2를 이용하여 개체 내 암을 모니터링 또는 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MAP7D2(MAP7 domain containing 2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

1) MAP7D2 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 MAP7D2 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 MAP7D2 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

1) MAP7D2 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 MAP7D2 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 MAP7D2 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계.

아울러, 본 발명은 MAP7D2 단백질을 이용한 암의 모니터링 또는 진단 방법을 제공한다:

1) 피검체 유래 시료에서 MAP7D2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

2) MAP7D2 단백질의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계.

본 발명에서는 인체 암 조직의 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 구축하여 데이터마이닝 기법을 통해 신규한 표적화 항암 후보 표적인 MAP7D2를 발굴하였고, 상기 MAP7D2는 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암의 조직 또는 세포에서 특이적으로 현저하게 과발현되며, MAP7D2의 억제에 의해 암 세포의 성장, 이동, 침윤 및 전이가 현저히 저해되고 세포사멸이 유도됨으로써, MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 암의 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 MAP7D2 유전자의 임상 조직에서의 발현 양상을 마이크로어레이 플랫폼 U133plus2로 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 MAP7D2 유전자의 암세포주에서의 발현 양상을 마이크로어레이 플랫폼 U133plus2로 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 RNA 양의 표준화를 위해 GAPDH를 내부 대조군으로서 사용하여, MAP7D2의 대장암 세포주에서의 발현 양상을 나타낸 그림이다.
도 4는 RNA 양의 표준화를 위해 GAPDH를 내부 대조군으로서 사용하여, MAP7D2의 간암 세포주에서의 발현 양상을 나타낸 그림이다.
도 5는 RNA 양의 표준화를 위해 GAPDH를 내부 대조군으로서 사용하여, MAP7D2의 폐암 세포주에서의 발현 양상을 나타낸 그림이다.
도 6은 폐암 환자들의 정상 조직과 폐암 조직에서 MAP7D2의 발현 양상을 비교하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과이다:
β-actin: 베타 액틴(대조군); N: 정상 조직; 및 T: 암 조직.
도 7은 간암 환자들의 정상 조직과 간암 조직에서 MAP7D2의 발현 양상을 비교하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과이다:
β-actin: 베타 액틴(대조군); N: 정상 조직; 및 T: 암 조직.
도 8은 siRNA에 의해, MAP7D2의 발현이 녹다운된 신장암 세포주 A498에서 MAP7D2 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 그림이다.
도 9은 siRNA에 의해, MAP7D2의 발현이 녹다운된 신장암 세포주 A498에서 세포 성장의 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 shRNA에 의해, MAP7D2의 발현이 녹다운된 폐암 세포주 NCI-H1703에서 MAP7D2 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 그림이다.
도 11는 MAP7D2의 발현을 녹다운한 5일 후, 폐암 세포주 NCI-H1703의 형태를 현미경(X100)을 통해 관찰한 그림이다(shCtrl: Nontarget shControl RNA).
도 12은 폐암 세포주 NCI-H1703에서 MAP7D2 유전자의 녹다운에 의한 세포 성장의 변화를 나타낸 그래프이다(bar: 표준편차).
도 13은 폐암 세포주 NCI-H1703에서 MAP7D2 유전자의 녹다운에 의한 세포 이동의 변화를 나타낸 그림이다:
A: shRNA로 형질도입한 NCI-H1703 세포의 트랜스웰 플레이트를 이용한 암세포 이동 실험을 현미경으로 관찰한 그림(X100 배율); 및
B: MAP7D2 발현 감소에 의한 NCI-H1703 이동 변화를 수치화한 그래프(X200 배율에서 임의적으로 고른 8 면의 세포수를 계수함, bar: 표준편차).
도 14는 폐암 세포주 NCI-H1703에서 MAP7D2 유전자의 녹다운에 의한 세포 침윤의 변화를 나타낸 그림이다:
A: shRNA로 형질도입한 NCI-H1703 세포의 트랜스웰 플레이트를 이용한 암세포 침윤 실험을 현미경으로 관찰한 그림(X100 배율); 및
B: MAP7D2 발현 감소에 의한 NCI-H1703 침윤 변화를 수치화한 그래프(X200 배율에서 임의적으로 고른 8개 필드(field)의 세포 수를 계수함, bar: 표준편차).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 MAP7D2(MAP7 domain containing 2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 MAP7D2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 폐암 또는 신장암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 MAP7D2 단백질의 발현 억제제는 MAP7D2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 MAP7D2 단백질의 활성 억제제는 MAP7D2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 siRNA는 인간 MAP7D2 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며,서열번호 4 또는 5인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al ., J. Natl. Cancer Inst ., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 MAP7D2 단백질의 결합 도메인을 억제하는 MAP7D2 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 미메틱스(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 미메틱스는 MAP7D2 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).

상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.

상기 항체는 MAP7D2에 특이적이고 직접적으로 결합하여 MAP7D2의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 MAP7D2에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 MAP7D2에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 MAP7D2 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 MAP7D2 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

상기 조성물은 암의 증식, 이동, 침윤 또는 전이의 저해 활성을 갖을 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 NCBI의 Gene Expression Omnibus와 EBI의 ArrayExpress의 유전자 발현 데이터로부터, 마이크로어레이 분석을 통해 인체 시료의 유전자 발현 데이터베이스를 구축하였고(표 1 참조), 상기 데이터베이스에는 정상 및 암 조직에 대한 유전자 발현 데이터가 포함되어있다(표 2 참조). 독자적으로 구축한 상기 암 유전자 발현 데이터베이스로부터 암 치료 표적을 발굴하기 위하여, 암 이상값 프로파일 분석(Cancer Outlier Profile Analysis, COPA)을 적용하였다(Tomlins et al. 2005)

본 발명자들은 구축된 유전자 발현 데이터베이스로부터 암 치료를 위한 후보 표적 유전자를 선별하기 위해 특정 암 조직에서 특이적으로 과발현되는 유전자를 선정하여 그 유전자가 일정 수준이상 높게 발현되는 세포주를 선별하였다. 이때, 상기 유전자는 암 관련하여 보고된 것이 거의 없는 신규한 표적 유전자인 것으로 선정된 것이며, 이와 같은 과정으로, MAP7D2를 표적화 항암 치료의 후보 표적 유전자로서 선별하여, MAP7D2의 발현을 마이크로어레이 분석을 통해 확인해 본 결과, 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암 등의 조직에서 정상조직 또는 다른 암 조직들에 비해 높게 발현되는 것으로 나타났고(도 1 참조), 이와 일치하게, 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암 세포주에서 비교적 높게 발현됨을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 마이크로어레이 분석 결과에서 정상조직 또는 다른 암들에서 보다 MAP7D2 발현이 현저히 높게 나타난, 대장암, 폐암 및 간암 세포주에서의 MAP7D2 유전자 발현을 확인한 결과, 상기 세포주에서 MAP7D2 유전자가 높게 발현됨을 확인하였다(도 3 내지 도 5 참조). 또한, 폐암 및 간암 조직에서도 정상 조직에 비해 MAP7D2가 높게 발현됨을 확인하였으며(도 6 및 도 7 참조), 이를 통해 MAP7D2가 대장암, 폐암 또는 간암의 표적 단백질로서 이용 가능함을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은, 특히 높은 MAP7D2의 발현량을 나타낸, 폐암 또는 신장암 세포주에 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)를 형질도입하여 MAP7D2 유전자의 발현을 억제시키고, 상기 세포주의 암 세포의 성장, 이동, 침윤 및 전이를 관찰하였다. 그 결과, shRNA 또는 siRNA의 암 세포내 도입에 의해 MAP7D2 유전자 발현이 억제됨을 확인하였고(도 8 및 도 10 참조), 암세포의 증식이 현저하게 감소하였고 세포사멸이 증가하였으며(도 9 및, 도 11 내지 도 12 참조), 암세포의 이동 및 침윤이 저해됨을 관찰하였다(도 13 및 도 14 참조). 따라서, MAP7D2의 발현 또는 활성 억제는 폐암 또는 신장암과 같은 암세포의 증식을 저해하고, 침윤 및 전이에 결정적인 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

따라서, MAP7D2는 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암의 조직 및 상기 암의 세포주에서 과발현하고 상기 유전자의 발현이 억제되면 암 세포의 성장, 이동 및 침윤이 저해됨으로, MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다.

바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법 또는 암 전이 억제 방법을 제공한다.

상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 암은 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 폐암 또는 신장암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인체 암 조직의 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 구축하여 데이터마이닝 기법을 통해 신규한 표적화 항암 후보 표적을 발굴하였다. 특히, MAP7D2가 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암의 조직 및 세포에서 과발현되고, MAP7D2의 억제에 의해 폐암 또는 신장암 세포의 성장, 이동, 침윤 및 전이가 저해되고 세포사멸이 유도됨으로써, 신규한 항암제의 표적으로서 MAP7D2의 가능성을 확인하였으므로, MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 암의 치료 또는 암전이 억제에 유용하게 이용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 MAP7D2 단백질을 이용한 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 암은 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 폐암 또는 신장암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 방법은

1) MAP7D2 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 MAP7D2 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 MAP7D2 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 세포주는 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 폐암 또는 신장암 세포주인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.

또 다른 방법은,

1) MAP7D2 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 MAP7D2 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 MAP7D2 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에서 구축한, 인체 암 조직의 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 바탕으로 하는 데이터마이닝 기법을 통해 신규한 표적화 항암 후보 표적인 MAP7D2를 선별하였고, 상기 MAP7D2는 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암의 조직 및 세포에서 과발현되고, MAP7D2가 억제된 암세포는 성장, 이동, 침윤 및 전이가 저해되고 세포사멸이 유도됨으로써, 이를 통해 MAP7D2가 암세포에 결정적인 역할을 하는 것을 확인하였으므로, MAP7D2 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 방법은 암의 치료 또는 암전이 억제용 물질을 스크리닝하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 MAP7D2 단백질을 이용한 암의 모니터링 또는 진단 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은

1) 피검체 유래 시료에서 MAP7D2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

2) MAP7D2 단백질의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 MAP7D2는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 암은 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 폐암 또는 신장암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에서 구축한, 인체 암 조직의 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 바탕으로 하는 데이터마이닝 기법을 통해 신규한 표적화 항암 후보 표적인 MAP7D2를 선별하였고, 상기 MAP7D2는 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암의 조직 및 세포에서 과발현되고, MAP7D2가 억제된 암세포는 성장, 이동, 침윤 및 전이가 저해되고 세포사멸이 유도됨으로써, 이를 통해 MAP7D2가 암세포에 결정적인 역할을 하는 것을 확인하였다. 이를 통해 MAP7D2의 발현 수준을 확인함으로써 암의 모니터링 또는 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 상기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 데이터베이스 구축 및 암 유발 유전자 중독( oncogene addiction )을 보이는 신규한 항암제 표적 유전자의 선별

<1-1> 대규모 인체 암 조직의 유전자 발현 데이터베이스

NCBI의 Gene Expression Omnibus 및 EBI의 ArrayExpress의 공개된 유전자 발현 데이터베이스로부터 450가지 이상의 데이터 세트를 수집 및 분석하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 33,000개 이상의 시료를 포함하는 차별화된 유전자 발현 데이터베이스를 구축하였다. 구체적으로는, 서로 다른 데이터 세트들을 통합하여 분석할 수 있도록 가능한 한 마이크로어레이 원시 데이터 파일로부터 일관된 방법으로 데이터들을 통합 및 정리하였다. 첫 번째로, Affymetrix human chip platform을 사용한 데이터들만 수집하였고, 두 번째로, 원시 데이터인 CEL 파일로부터 Affymetrix 고유 알고리즘인 MAS5(microarray suite 5) 방법을 적용하여, 각 유전자 수준에서의 발현값을 구하였고, 전반적인 평균 표준화(global mean normalization)를 동일하게 적용하여, 각 마이크로어레이 플랫폼(microarray platform, U133Plus2)으로 10,000개 이상의 시료를 하나로 통합하여 메타 분석하는 것이 가능하도록 하였다.

인체 시료 유전자 발현 데이터베이스 현황

플랫폼	U133Plus2	U133A	U95A	합계
데이터 세트	155	244	53	452
시료	12974	18035	2272	33,281
탐침	54613	22216	12558	-
데이터 포인트	708,549,062	400,647,525	28,531,776	1,137,728,363

상기 데이터베이스에는 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 거의 모든 조직으로부터 유래한, 22,000개 이상의 정상 및 암 조직에 대한 유전자 발현 데이터를 포함하고 있다.

조직	암	정상	합계
방광(Bladder)	126	23	149
혈액(Blood)	1416	1127	2543
골수(Bone Marrow)	1736	5	1741
뇌(Brain)	1285	2239	3524
유방(Breast)	3738	158	3896
자궁경부(Cervix_	138	46	184
대장(Colon)	1116	231	1347
자궁내막(Endometrium)	84	81	165
식도(Esophagus)	32	32	64
두경부(Head_Neck)	253	42	295
신장(Kidney)	928	166	1094
간(Liver)	354	83	437
폐(Lung)	1290	426	1716
림프절(Lymph node)	25	12	37
림프구(Lymphocyte)	180	175	355
근육(Muscle)	0	622	622
난소(Ovary)	977	17	994
췌장(Pancreas)	94	35	129
전립선(Prostate)	473	188	661
피부(Skin)	437	80	517
소장(Small intestine)	14	7	21
비장(Spleen)	4	10	14
위장(Stomach)	295	61	356
정소(Testis)	206	26	232
갑상선(Thyroid)	130	52	182
자궁(Uterus)	130	25	155
기타	410	268	678
합계	15454	6661	22115

<1-2> 암 이상값 프로파일 분석( Cancer Outlier Profile Analysis , COPA )을 사용한 암 환자에서의 유전자 발현변화 확인

상기 실시예 <1-1>과 같이, 독자적으로 구축한 암 유전자 발현 데이터베이스로부터 치료 표적을 발굴하기 위하여 기존의 접근법과는 차별화된 방법으로 COPA 분석을 적용하였다(Tomlins et al. 2005). 현재 임상에서 효과적으로 쓰이는 치료제의 표적화 항암 표적 유전자들은 전체 환자 중 일부에서만 유전자 돌연변이 또는 유전자 증폭에 의한 과발현이 관찰되고 있다. 예컨대, 허셉틴(Herceptin)의 표적인 ERBB2는 전체 유방암 환자 중 약 25~30% 정도에서만 과발현되는 것으로 나타났고, 이레사(Iressa) 또는 세툭시맵(Cetuximab)의 표적인 EGFR도 폐암 환자나 뇌종양 환자의 약 10~20% 정도에서만 유전자 돌연변이 또는 유전자 증폭에 의한 과발현이 관찰된다. 이와 같이, 효과적인 표적 유전자들은 전체 환자 중 일부 환자에서만 변이가 관찰되므로, 기존의 t-test와 같이 환자군과 정상인들의 평균을 비교하여 발현에 차이가 나는 유전자를 찾는 방법보다는 환자군 중 상위 10~20%와 정상인들의 평균을 비교하는 outlier 분석 방법이 더욱 효과적이므로, 이러한 암 이상값 프로파일 분석(Cancer Outlier Profile Analysis, COPA)를 실시하였다.

<1-3> 신규한 표적화 치료 표적 유전자의 선별

COPA 분석법을 적용하여 의약품이 될 만한(druggable) 표적인 수용체, 키나제, 수송체, 및 채널 단백질들 중에서 각 암에서 효과적인 표적화 치료의 표적이 될 수 있는 유전자들을 선별하였다. 현재까지 임상 시험에 들어가 있거나 주로 시판되고 있는 치료용 약물 표적들은 수용체, 채널 수송체, 키나제 및 세포부착분자(Cell adhesion molecules, CAMs) 등과 같은 세포표면분자들이 대부분이므로, 주로 이러한 것들을 위주로 분석하여 후보 표적 유전자를 발굴하였다. 후보 표적 유전자는 하기와 같은 기준으로 발굴하였다. ⅰ) 임상 조직에 대한 유전자 발현 데이터베이스 마이닝을 통해 정상조직에 비해 특정 암 조직에서 특이적으로 많이 발현되고 있는 후보 표적 유전자의 풀(pool)을 형성하였다. ⅱ) 형성된 유전자 풀 내에서 표적 유전자가 되도록 여러 암에서 특이적으로 과발현되어 있는 유전자를 선별하는데, 이는 여러 암에서 특정 표적 유전자가 많이 발현되어 있을수록 암 형성에 직접적이고도 중요한 유전자일 가능성이 높기 때문이다. ⅲ) 표적 유전자가 많이 발현되고 있는 임상 조직과 동일한 조직에서 유래한 암 세포주들 중에서 그 표적 유전자가 일정 수준이상 많이 발현되고 있는 세포주를 선별하였다. ⅳ) 선별된 후보 표적 유전자들에 대해 문헌 조사를 수행하여 되도록 암 관련하여 연구가 많이 진행되어 있지 않은 유전자를 선별하여 신규한 중독되는 암 유발 유전자(addicted oncogene)를 찾고자 하였다. 이와 같은 기준을 바탕으로 후보 표적 유전자들 중에서 MAP7D2를 표적화 항암 치료를 위한 일차 후보 표적 유전자로서 선택하여 검증하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 암 환자의 임상조직에서 MAP7D2의 발현 양상을 확인한 결과, 신장암(kidney), 폐암(lung), 대장암(colon), 간암(liver), 난소암(ovary) 및 위암(stomach) 등의 암 조직에서 정상조직에 비해 MAP7D2의 발현이 증가되어 있음을 관찰하였으며, 이를 통해 MAP7D2가 암 치료에 효과적인 치료 표적이 될 수 있음을 알 수 있었다(도 1).

< 실시예 2> MAP7D2 의 다양한 암에서의 발현량 확인

<2-1> 암 세포주에서 마이크로어레이 플랫폼을 통한 MAP7D2 발현량의 확인

다양한 암 세포주에서 MAP7D2의 발현 양상을 마이크로어레이 플랫폼 U133plus2A 유전자 칩을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, MAP7D2의 임상조직에서의 발현양상은, 도 1의 암 조직에서 확인한 결과와 일치하게 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암에서 유래한 암세포주들에서 비교적 높게 발현됨을 알 수 있었다(도 2).

그리고, 이러한 도 1 및 도 2의 결과를 토대로 하여, 실험에 사용할 암 세포주를 선별하기 위해, 각각의 세포주에 대한 유전자 발현 데이터베이스를 바탕으로 선별한 각 표적 암 별로 MAP7D2를 가장 잘 발현하는 세포주들을 확인하였으며, 이를 하기 [표 3]에 나타내었다.

기관	세포주	값
신장암	A498	2907
	CAL54	1164
폐암	NCI-H1703	2588
	A549	617
대장암	CAC02	1571
	SW480	1287
간암	SNU-475	1202
	SNU-449	680
	HepG2	643

<2-2> 암세포주에서 역전사 중합효소연쇄반응( Reverse Tanscription -Polymerase Chain Reaction , RT - PCR )을 통한 MAP7D2 발현량의 확인

MAP7D2가 다른 암에 비해 과발현되어 있던 대장암, 폐암 및 간암 세포주에서 MAP7D2의 발현 양상을 각각 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, 11종류의 다양한 암 세포주(대장암 4종류, 폐암 4종류,간암 3종류)에서 easy-BLUE^TM Total RNA Extraction kit (SolGent, Cat #: 17061)으로 총 RNA를 분리한 다음, 각각의 총 RNA 2㎍으로, DiaStar RT kit(SolGent, Cat#:DR13-R10K)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA를 멸균 증류수로 희석하여 2% cDNA를 제조한 후 10 pmole/㎕ Taq DNA 폴리머라제(polymerase)(한국 솔젠트사) 및 프라이머[정방향 프라이머(Forward primer): 5'-CTCGAGAGAACAGATTATG-3', 서열번호 2; 역방향 프라이머(Reverse primer): 5'- CTTCACTTGTGGAGACACATC-3', 서열번호 3]를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이 때, 겔 로딩 대조군(Gel loading control)으로써 GAPDH의 RT-PCR을 수행하였다. 이용된 PCR 프로그램은 하기 [표 4]와 같았다:

온도	시간	사이클(cycle)
95℃	2분
95℃	30초	25 사이클
53℃	30초
72℃	30초
72℃	10분

그 결과, 도 3 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 [표 3]의 결과와 유사하게, MAP7D2 유전자가 대장암, 폐암 및 간암 등의 세포주들에서 높게 발현되어 있음을 확인하였다(도 3 내지 도 5).

<2-3> 암 조직에서 역전사 중합효소연쇄반응을 통한 MAP7D2 발현량 확인

폐암 및 간암 조직에서 MAP7D2의 발현 양상을 확인하기 위하여, 폐암 또는 간암 환자의 정상 조직과 암 조직을 각각 분리하여, RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, 폐암, 간암의 인체자원은 부산 대학교 병원 한국 인체 자원 거점은행으로부터 공급받아 사용하였다. 각 조직을 액체질소를 사용하여 얼린 상태에서 막자사발을 이용하여 잘게 분쇄하였다. 분쇄한 조직을 RNeasyMini kit (Qiagene, Cat #: 74104)을 사용하여 명시된 방법대로, 총 RNA를 분리한 다음, 각각의 총 RNA 2으로, DiaStar RT kit(SolGent, Cat#:DR13-R10K)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA를 멸균 증류수로 희석하여 2% cDNA를 제조한 후 10 pmole/ Taq DNA 폴리머라제(polymerase)(한국 솔젠트사) 및 프라이머[정방향 프라이머(Forward primer): 5'-CTCGAGAGAACAGATTATG-3', 서열번호 2; 역방향 프라이머(Reverse primer): 5'- CTTCACTTGTGGAGACACATC-3', 서열번호 3]를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이 때, 겔 로딩 대조군(Gel loading control)으로써 β-actin의 RT-PCR을 수행하였으며, 이용된 PCR 프로그램은 상기 [표 4]와 같다.

그 결과, 정상 조직과 비교하였을 때, 폐암 조직에서는 25% 이상, 간암 조직에서는 33% 이상 MAP7D2가 높게 발현되어 있음을 확인하였다(도 6 및 도 7).

< 실시예 3> MAP7D2 유전자 발현 억제의 암세포 성장에 대한 영향 분석

MAP7D2를 가장 잘 발현하고 있는 세포주 중에서 비교적 빨리 자라고 전이력이 높은, 폐암 세포주인 NCI-H1703 및 신장암인 A498 세포주를 사용하여 MAP7D2 녹다운(knockdown) 방법을 이용하여 MAP7D2 유전자의 발현을 억제하고, MAP7D2 유전자 발현 억제에 의한 암 세포 성장에 대한 영향을 분석하였다.

<3-1> MAP7D2 유전자 발현 억제의 신장암 세포 성장에 대한 영향

MAP7D2 유전자 발현 억제가 신장암 세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, MAP7D2 siRNA를 이용하였다.

구체적으로, 2개의 MAP7D2 siRNA(#1 Duplex; 5'-GCAGGAGAUGUUGGGAAAGAA/UUCUUUCCCAACAUCUCCUGC-3', 서열번호 4 및 #2: Duplex; 5'-CCCAAAUUAUUAGCUCGGAAU/AUUCCGAGCUAAUAAUUUGGG-3', 서열번호 5)를 바이오니아에서 구입하여 이용하였다. 상기 언급한 siRNA는 대조군인 control siRNA(Bioneer CAT#: SN_1002)와 Amaxa를 함께 사용한 전기천공법을 통해 신장암 세포주 A498에 도입되었으며, 전기천공법을 수행한 지 24시간 후, MAP7D2의 발현 저해 정도에 따른 세포의 성장을 대조군과 비교하여 조사하였다. 세포 증식을 조사하기 위해, 우선 1~4 X 10⁴의 세포를 24-웰 플레이트(plate)에 분주하여 37℃/5% CO₂의 조건에서 배양한 후, 각각 48 시간 동안 배양하였으며, 배양이 끝난 세포를 회수하여 상기 <실시예 2-2>에 기재된 RT-PCR 방법을 이용하여 신장암 세포에서 MAP7D2 siRNA에 의한 MAP7D2 단백질의 발현 억제를 확인하였다.

또한, 정해진 시간이 경과한 후, 각각의 플레이트에 Cell Counting Kit-8(CCK-8,DOJINDO, Cat#: CK04-11) 용액 50 ul를 첨가하여 1시간 정도 어두운 상태에서 37^oC CO₂ 인큐베이터에서 반응시킨 다음, 100 ul씩 96 웰 플레이트로 옮기고, Victor microplate reader에서 450nm로 흡광도를 측정하여 세포 증식 정도를 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 siRNA #2를 500nM 처리한 경우, 내부 대조군(internal control)으로서 사용한 GAPDH에 대비하여 뚜렷한 MAP7D2 발현 억제효과를 나타냈다(도 8).

또한, 도 7에서 나타낸 바와 같이, 대조군으로 사용된 control siRNA와 비교하여 MAP7D2 siRNA로 그 발현이 저해된 경우, 신장암 세포주 A498에서는 48시간 후, 약 60% 정도의 뚜렷한 성장의 저해 및 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 9).

<3-2> MAP7D2 유전자 발현 억제의 폐암 세포 성장에 대한 영향

MAP7D2 유전자 발현 억제가 폐암 세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, MAP7D2 shRNA를 이용하였다.

구체적으로, TRC 렌티바이러스 플라스미드 벡터(lenticiral plasmid vecotr) pLKO.1-puro(Sigma)에 있는 MAP7D2 작은 헤어핀(small-hairpin) RNA 클론들은 Sigma사의 MISSION^TM shRNA clones libraries(SIGMA, Cat#: SHCLNG-NM_152780) 중에서 구입하여 사용하였다. 이것은 4종류의 shRNA 컨스트럭트(construct) 세트로 구성되어 있으며, 각각의 TRC 번호 TRCN0000108390, TRCN0000108391, TRCN0000108392 및 TRCN0000108394로, 각각 MAP7D2 shRNA#1부터 #4로 명명하여 사용하였다. 렌티바이러스(Lentiviral) MAP7D2 shRNA와 더불어, 음성 대조군으로 Nontarget shRNA Control Transduction particles(SIGMA, cat#: SHC002V)을 사용하였고, 형질도입 효율의 확인과 shRNA 전달을 최적화하기 위한 양성 대조군으로는 MISSON TurboGFP Control Transduction particles(SIGMA, Cat#: SHC003V)을 함께 사용하였다. 이후, Lipofectamine^TM 2000(invitrogen, Cat#:11668-027) 및 Enhancer Q^TM Transfection Enhancing Reagent(WelGene, Cat#: TR001-02)을 사용하여 293T에 상기 shRNA를 형질감염하여 바이러스 입자를 제조하였다. 48 시간 뒤, 바이러스 배양 상층액을 회수하여 syringe filter(millipore,Cat#: SLHP033RS)로 여과한 다음, 신선한 배양 배지와 1:1로 혼합하였고, 여기에 감염의 효과를 향상시키기 위하여, 4 μg/mL의 polybrene(SIGMA, Cat#:L107689)을 넣어 폐암 세포주 NCI-H1703과 신장암 세포주 A498에 각각 형질감염하였다. 16시간 후, 신선한 배지로 교체한 다음, 48시간 동안 배양하고, MAP7D2 shRNA가 형질감염된 NCI-H1703 또는 A498 세포를 선별하기 위하여 2 μg/ml의 퓨로마이신(puromycin)으로 3일 동안 처리하여 선별하였다. 이때, 선별 대조군으로 shRNA가 형질도입되지 않은 각각의 암 세포주에 동량의 퓨로마이신(puromycin)을 처리하여 관찰하였다. 퓨로마이신(puromycin) 선별 후, 배양이 끝난 세포를 회수하여 상기 <실시예 2-2>에 기재된 RT-PCR 방법을 이용하여 발현 저해 여부를 확인하고, MAP7D2 발현 저해 정도에 따른 세포 성장률을 대조군과 비교하여 조사하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 shMAP7D2 #1 내지 #4 모두, 내부 대조군(internal control)으로서 사용한 β-액틴(actin)에 대비하여 뚜렷한 MAP7D2 발현 억제효과를 나타냈다(도 10).

또한, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 폐암 세포주 NCI-H1703에 4종류의 MAP7D2 shRNA(#1~#4) 각각을 형질감염한 경우, shMAP7D2 #2 또는 #3을 형질감염한 폐암 세포주에서 대조군 (Nontarget shControlRNA)에 비해 세포 성장이 현저하게 감소하였고, 세포 사멸이 증가함을 확인하였다(도 11). 특히, MAP7D2 shRNA #2는 5일 동안 대조군에 비해 약 70%정도의 성장 저해 및 세포사멸 효과를 나타냄을 확인하였다(도 12).

이를 통해, 10% 혈청이 들어있는 정상 배지에서도, MAP7D2 발현 억제가 성장 인자의 의존성을 낮추고 세포 사멸을 유도하여, 최종적으로 세포 성장의 정도를 낮추었음을 확인할 수 있었으며, 따라서, MAP7D2는 신장암 및 폐암에서 유전자 중독(oncogene addiction)을 뚜렷하게 나타내므로, 신장암과 폐암에서 항암치료를 위한 좋은 타겟이 될 수 있다.

< 실시예 4> MAP7D2 발현 억제의 암세포 이동에 대한 영향 분석

MAP7D2의 발현 억제에 의해 암세포의 이동 억제 효과를 나타내는지를 확인하기 위하여, 트랜스웰(transwell)(coastar, 3422) 시스템을 이용하였고, 상기 실시예 <3-2>에 기재된 shRNA로 MAP7D2의 발현을 저해시킨 폐암 세포주 NCI-H1703를 사용하였다. 이때 CCK-8 실험과 동일하게, 세포에서 렌티바이러스 벡터 shRNA에 의한 비특이적인 반응을 배제하기 위하여, Nontarget shRNA Control Transduction particles을 음성 대조군 shRNA로 사용하였고, 형광물질이 부착된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입 효율을 예측하였다. 도입 효율은 약 80% 이상 수준이었고, 형질감염 48 시간 후, 2 ug/ml의 퓨로마이신(puromycin)을 처리하여 4일간의 선별을 거친 다음, 암세포를 회수하여 암세포의 이동 능력을 조사하였다.

구체적으로, 암세포의 이동 능력을 확인하기 위해, 트립신(trypsin)(Gibco 25300)으로 MAP7D2의 발현을 억제하고 퓨로마이신(puromycin)으로 선별한 NCI-H1703 세포를 수득한 다음, RPMI migration media(RPMI, 10mM HEPES, 0.5% BSA)로 2회 세척한 후에 4x10⁵세포수/ml 로 이동 배지에 세포를 현탁하였다. 이후, 24-웰 트랜스웰 플레이트는 인서트(insert) 아래쪽 면에 0.05% 젤라틴(Sigma G1393)을 사용하여 실온에서 한 시간 동안 코팅하고 한 시간이 지난 후, 인서트(insert)에 남아있는 젤라틴을 제거하고 PBS로 1회 세척하였다. 상기 과정이 끝난 후, 5% FBS가 첨가된 600 ul의 RPMI 이동 배지를 챔버(chamber)에 첨가하였다. 소독된 핀셋을 사용하여 인서트를 챔버에 넣은 다음, 미리 준비해둔, 세포를 인서트 안에 4x10⁴세포수/100 ul로 넣고, 37℃/5% CO²의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포의 이동을 측정하기 위해, 먼저 인서트의 위쪽 면을 PBS에 적신 면봉으로 닦아내고 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ul가 포함된 챔버에 인서트를 넣어서 실온에서 30분간 고정하였다. 그런 다음, 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)/100 mM 붕산나트륨(Sodium Borate, NaBorate) 500 ul에 30분간 염색하여 물로 세척한 후에 건조시켜서 현미경으로 x100 배율에서 세포수를 측정하였다.

그 결과, 도 11에서 나타낸 바와 같이, shRNA#2 및 #4에 의해 MAP7D2의 발현이 억제된 세포는 대조군으로 사용된 nontarget shRNA(shCtrl)가 도입된 세포와 비교하여 약 80% 정도의 뚜렷한 이동 저해 효과를 나타내었으며(도 13), 이를 통해, MAP7D2가 암세포의 이동에 있어 결정적인 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5> MAP7D2 발현 억제의 암세포 침윤에 대한 영향 분석

MAP7D2의 발현 억제의 암세포 침윤에 대한 영향을 분석하였다.

구체적으로, RPMI invasion media(RPMI, 10mM HEPES, 0.5% BSA)로 2회 세척한 후에 4x10⁵세포수/ml 로 침윤 배지에 세포를 현탁하였다. 24-웰 트랜스웰 플레이트(8 um 공극 크기, costar 3422)는 마트리겔(matrigel)(BD 354234)을 1 mg/ml로 serum-free media(RPMI, 10mM HEPES)에 희석하여 인서트 위쪽 면에 실온에서 한 시간 동안 코팅하였다. 한 시간 후, 인서트에 남아있는 마트리겔을 제거하고 무혈청 배지로 1회 세척하였다. 이후, 5% FBS가 첨가된 600 ul의 RPMI 침윤 배지를 첨가하였다. 소독된 핀셋을 사용하여 인서트를 배지가 들어있는 챔버에 넣은 다음, 미리 준비하여 둔 NCI-H1703 세포를 인서트 안에 100 ul 첨가하여 37℃/5% CO²의 조건에서 24시간 배양하였다. 마트리겔을 통과한 침윤된 세포를 측정하기 위해 인서트의 위쪽 면을 PBS에 적신 면봉으로 닦아내고 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ul(Sigma HT50)가 들어있는 챔버에 인서트를 넣고 실온에서 30분간 고정하였다. 그런 다음, 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)(Sigma C3886)/100 mM NaBorate(Sigma S9640) 500 ul에 30분간 염색하고 물로 세척한 후 건조시켜서 현미경으로 x100 과 x200 배율에서 사진을 찍고 세포 수를 세었다.

그 결과, 도 12에서 나타낸 바와 같이, shRNA#2 및 #4에 의해 MAP7D2의 발현이 억제된 세포는 대조군으로 사용된 nontarget shRNA(shCtrl)가 도입된 세포와 비교하여 약 70% 정도의 뚜렷한 침윤 저해 효과를 나타내었으며(도 14), 이를 통해, MAP7D2가 암세포의 침윤에 있어 결정적인 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

MAP7D2의 발현 또는 활성 억제제 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

MAP7D2의 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

MAP7D2의 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 주사제의 제조

MAP7D2의 발현 또는 활성 억제제 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 MAP7D2의 발현 또는 활성을 억제제를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

5. 환의 제조

MAP7D2의 발현 또는 활성 억제제 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

6. 과립의 제조

MAP7D2의 발현 또는 활성 억제제 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명을 통해 MAP7D2의 발현 또는 활성 억제제를 이용한 암 치료제 개발이 가능하고, MAP7D2를 바이오마커로 이용하여 암을 모니터링 또는 진단할 수 있는 방법을 개발할 수 있으며, 암 성장 또는 전이 억제제를 스크리닝하는데 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pharmaceutical composition for the treatment of cancers or inhibition of metastasis containing the expression or activity inhibitors of MAP7D2, a novel cancer therapeutic target <130> 12p-01-32 <150> 2011/0017247 <151> 2011-02-25 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 773 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gly Ser Arg Leu Glu Gly 1 5 10 15 Thr Ala Arg Gly Thr Ser Leu Pro Gly Lys Ile Ala Glu Pro Gly Ala 20 25 30 Val Arg Thr Ser Gln Pro Asn Tyr Arg Pro Gln Gly Met Glu Gly Phe 35 40 45 Leu Lys Ser Asp Glu Arg Gln Arg Leu Ala Lys Glu Arg Arg Glu Glu 50 55 60 Arg Glu Lys Cys Leu Ala Ala Arg Glu Gln Gln Ile Leu Glu Lys Gln 65 70 75 80 Lys Arg Ala Arg Leu Gln Tyr Glu Lys Gln Met Glu Glu Arg Trp Arg 85 90 95 Lys Leu Glu Glu Gln Arg Gln Arg Glu Asp Gln Lys Arg Ala Ala Val 100 105 110 Glu Glu Lys Arg Lys Gln Lys Leu Arg Glu Glu Glu Glu Arg Leu Glu 115 120 125 Ala Met Met Arg Arg Ser Leu Glu Arg Thr Gln Gln Leu Glu Leu Lys 130 135 140 Lys Lys Tyr Ser Trp Gly Ala Pro Leu Ala Ile Gly Pro Gly Gly His 145 150 155 160 Asp Ala Cys Asp Lys Leu Ser Thr Ser Thr Met Ser Leu Pro Lys Pro 165 170 175 Thr Glu Pro Pro Met Ser Lys Arg Leu Ser Ser Ser Thr Val Ala Ile 180 185 190 Ser Tyr Ser Pro Asp Arg Ala His His Met His Leu Ser Pro Met Glu 195 200 205 Ala Ile Leu Val Ser Arg Leu Leu Thr Pro Thr Gln Ser Ser Leu Ala 210 215 220 Arg Ser Arg Ala Ser Val Met Leu Ser Gly Gln Ala Asn Asp Ser Val 225 230 235 240 Phe His Val Cys Pro Arg Leu Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asn Pro Ser 245 250 255 Tyr Lys Ser Ser Pro Thr Arg Asn Ile Glu Lys Lys Lys Ala Thr Ser 260 265 270 Thr Ser Thr Ser Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys Glu Ala Leu Ser Gly 275 280 285 Gly Glu Ala Ser Leu Val Glu Lys Val Lys Arg Gly Gln Arg Thr Ala 290 295 300 Thr Ser Leu Pro Val Val Asn Phe Gly Ser Pro Leu Arg Arg Cys Glu 305 310 315 320 Phe Ser Gly Gly Ile Pro Lys Arg Pro Ser Ser Pro Val Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Pro Gln Ser Pro Lys Thr Thr Lys Pro Pro 340 345 350 Tyr Pro Gly Ser Pro Val Lys Tyr Arg Leu Pro Ala Leu Ser Gly Gln 355 360 365 Asp Met Pro Lys Arg Lys Ala Glu Lys Glu Lys Ser Asn Lys Glu Arg 370 375 380 Glu Gly Thr Leu Ala Gln Gln Ala Ala Gly Pro Gln Gly Glu Glu Ala 385 390 395 400 Leu Glu Lys His Val Val Asp Lys His Ala Ser Glu Lys His Ala Ala 405 410 415 Ala Ala Gly Gly Lys Ala Glu Asn Ser Ala Ala Leu Gly Lys Pro Thr 420 425 430 Ala Gly Thr Thr Asp Ala Gly Glu Ala Ala Lys Ile Leu Ala Glu Lys 435 440 445 Arg Arg Gln Ala Arg Leu Gln Lys Glu Gln Glu Glu Gln Glu Arg Leu 450 455 460 Glu Lys Glu Glu Gln Asp Arg Leu Glu Arg Glu Glu Leu Lys Arg Lys 465 470 475 480 Ala Glu Glu Glu Arg Leu Arg Leu Glu Glu Glu Ala Arg Lys Gln Glu 485 490 495 Glu Glu Arg Lys Arg Gln Glu Glu Glu Lys Lys Lys Gln Glu Gly Glu 500 505 510 Glu Lys Arg Lys Ala Gly Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Glu Glu Glu 515 520 525 Leu Leu Leu Lys Glu Lys Gln Glu Gln Glu Lys Gln Glu Lys Ala Met 530 535 540 Ile Glu Lys Gln Lys Glu Ala Ala Glu Thr Lys Ala Arg Glu Val Ala 545 550 555 560 Glu Gln Met Arg Leu Glu Arg Glu Gln Ile Met Leu Gln Ile Glu Gln 565 570 575 Glu Arg Leu Glu Arg Lys Lys Arg Ile Asp Glu Ile Met Lys Arg Thr 580 585 590 Arg Lys Ser Asp Val Ser Pro Gln Val Lys Lys Glu Asp Pro Lys Val 595 600 605 Gly Val Gln Pro Ala Val Cys Val Glu Lys Lys Thr Lys Leu Val Val 610 615 620 Pro Asn Lys Met Glu Ile Asn Gly Leu Asn Thr Cys Gln Glu Val Asn 625 630 635 640 Gly Val Asp His Ala Ala Pro Glu Thr Tyr Pro Gln Asp Ile Phe Ser 645 650 655 Asn Gly Leu Lys Pro Ala Gly Gly Leu Ile His Leu Asp Ala Leu Asp 660 665 670 Gly Lys Ser Asn Ser Leu Asp Asp Ser Thr Glu Glu Val Gln Ser Met 675 680 685 Asp Val Ser Pro Val Ser Lys Glu Glu Leu Ile Ser Ile Pro Glu Phe 690 695 700 Ser Pro Val Ser Glu Met Ile Pro Gly Val Ser Leu Asp Gln Asn Gly 705 710 715 720 Thr Gly Asn Ala Arg Ala Leu Gln Asp Leu Leu Asp Phe Thr Gly Pro 725 730 735 Pro Thr Phe Pro Lys Arg Ser Ser Glu Asn Leu Ser Leu Asp Asp Cys 740 745 750 Asn Lys Asn Leu Ile Glu Gly Phe Asn Ser Pro Gly Gln Glu Thr Pro 755 760 765 Leu Asn Thr Phe Cys 770 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP7D2 forward primer <400> 2 ctcgagagaa cagattatg 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP7D2 reverse primer <400> 3 cttcacttgt ggagacacat c 21 <210> 4 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP7D2 siRNA #1 <400> 4 gcaggagaug uugggaaaga auucuuuccc aacaucuccu gc 42 <210> 5 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP7D2 siRNA #2 <400> 5 cccaaauuau uagcucggaa uauuccgagc uaauaauuug gg 42

Claims (11)

1. MAP7D2(MAP7 domain containing 2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 MAP7D2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 MAP7D2 단백질의 발현 억제제는 MAP7D2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 MAP7D2 단백질의 활성 억제제는 MAP7D2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 암은 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
   
6. 1) MAP7D2 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
   2) 상기 세포주에서 MAP7D2 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
   3) 상기 MAP7D2 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법.
   
7. 제 6항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법.
   
8. 1) MAP7D2 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
   2) 상기 MAP7D2 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
   3) 상기 MAP7D2 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법.
   
9. 제 8항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 후보 물질의 스크리닝 방법.
   
10. 1) 피검체 유래 시료에서 MAP7D2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    2) MAP7D2 단백질의 발현 수준이 대조군보다 증가된 피검체를 암에 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
    
11. 제 6항, 제 8항 또는 제 10항에 있어서, 상기 암은 신장암, 폐암, 대장암, 난소암, 위암 및 간암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.

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