JP5103187B2 - バソプレッシン結合性のｌ体核酸 - Google Patents

Description

本発明は核酸に関するものであって、前記核酸の薬剤および診断薬の製造のための使用、核酸とバソプレッシンから形成される複合体、およびバソプレッシンの拮抗薬と作動薬のスクリーニングのための方法に関する。

ヒトのバソプレッシンは、（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン（ＡＶＰ）、もしくは抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）としても知られており、そしてオキシトシンと同様に環状で９個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである。これらは神経ホルモンであり、視床下部において産生されたのち、前駆タンパクからプロセッシングされる。当該ホルモンが由来する同じ前駆タンパクからプロセッシングされた１０ｋＤａの担体タンパクに結合し、細胞内輸送を経て脳下垂体後葉へ移動し、脳下垂体後葉で蓄えられ、そして、適切な刺激の後、血流へ分泌される。ＡＶＰは 、アミノ端から開始して、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２（配列番号１）の配列を持ち、１０８５Ｄａの分子量を持つ。オキシトシンはＡＶＰと３番目（Ｉｌｅ）および８番目（Ｌｙｓ）でのみ配列が違い、１００７Ｄａの分子量を持つ。視床下部と脳下垂体後葉から離れて、ＡＶＰおよびオキシトシンは脳の他の部位のニューロンにもまた局在する。その一方で、これらの分子の神経伝達物質としての役割も確認されてきた（非特許文献１および２）。

末梢において、このペプチドホルモンは特異的な受容体に結合することによって生理作用を示し、前記特異的な受容体はすべてＧ蛋白質共役型７回膜貫通へリックス受容体の大きなファミリーに由来するが、薬理学的特性はならびに前記受容体の細胞内の２次メッセンジャーは異なっている（非特許文献３および４）。

ＡＶＰの主な生理学的機能は腎臓での自由水の吸水の調節にあり、それゆえに体液および血液容量のオスモル濃度の維持にある。抗利尿作用の根底にある機序は、ＡＶＰが集合管の上皮細胞の基底外側に発現している腎臓のＶ_２受容体に結合することが媒介する。受容体にＡＶＰが結合した後、ＧたんぱくであるＧｓが細胞内で結合し、このことによってアデニリル・シクラーゼが活性化し、２次メッセンジャーであるｃＡＭＰが合成される。これに続いてプロテインキナーゼＡが活性化され、これによって蛋白質をリン酸化し、結果的にアクアポリン−２水チャンネル（ＡＱＰ−２）が上皮細胞の集合管に面した細胞膜に組み込まれることが最初に起こる。次に、ＡＱＰ−２のｍＲＮＡの転写およびこの蛋白質の生合成が誘導される（非特許文献５）。細胞膜のＡＱＰ−２は尿から有機的組織体への水の吸収を導く。この結果、尿量が減少し、尿のオスモル濃度が上昇する。吸収機構がなければ水の喪失によって非常に短期間で脱水症状および死を生命体にもたらす。ＡＶＰが腎臓のＶ_２受容体に結合する際の解離定数は０．４ｎＭである（非特許文献６）。

ＡＶＰの別の生理学的機能の大部分はＶ_１受容体への結合が媒介する。血管の血管平滑筋細胞の表面に局在する血管Ｖ_１受容体は、血管筋細胞による筋収縮に続いて起こる血管収縮による血圧の調整に必要とされる。ホスホリパーゼＣ、Ｄ、およびＡ_２は、受容体の結合と共役するＧタンパクの活性化の結果、２次メッセンジャーであるジアシルグリセロールとイノシトール三リン酸．を生じる。同時に様々なプロテインキナーゼが活性化され、結果として細胞内カルシウムの流動化、細胞外カルシウムの流入およびＮａ^＋−Ｈ^＋チャンネルの活性化を引き起こす（非特許文献６）。

キナーゼの活性化によって細胞の核内の転写因子の活性化が起こり、初期応答遺伝子群の誘導に続いてタンパクの量の上昇および細胞増殖が引き起こされる（非特許文献８）。このＡＶＰによる細胞増殖性の活性は、血管平滑筋細胞以外でも、様々な永久細胞株、メ
サンギウム腎細胞、肝細胞、糸球体細胞、および副腎皮質で見られた。

Ｖ_１受容体は、血管への局在以外でも、ＡＶＰによる活性化に続いてグリコーゲン分解が起こる肝臓、ＡＶＰによる活性化に続いてアルドステロンの分泌が起こる副腎皮質、インシュリンの分泌が起こるすい臓、心房性ナトリウム利尿因子の放出が起こる心臓の心房心筋細胞、血小板凝集が起こる血小板、脾臓、腎臓、脳、子宮、含脂肪細胞、およびさまざまな培養細胞株で見られる（非特許文献８および９）。ＡＶＰが血管のＶ_１受容体に結合する際の解離定数は１．２ｎＭである（非特許文献１０）。この受容体はＶ_２受容体がすでに完全に活性化されるようなＡＶＰの濃度になって初めて反応する。

３番目のバソプレッシンの受容体Ｖ_３受容体は脳下垂体前葉に局在する。副腎皮質刺激細胞の中でこの受容体はＡＶＰによる活性化に続いて起こる副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）の分泌を媒介する。Ｖ_３受容体は種々のシグナル伝達経路を活性化することができ、その経路には２次メッセンジャーとしてのｃＡＭＰの生成を伴うアデニリルシクラーゼを介した経路および細胞内カルシウムの流動を引き起こすホスホリパーゼＣを介した経路の両方がある（非特許文献１１）。

オキシトシンは主たる作用を、子宮、卵巣、乳腺、および腎臓にあるオキシトシン受容体への結合によって媒介する。オキシトシンは胸部においては乳の分泌を活性化し、また、分娩時には子宮の収縮に積極的に関与している。オキシトシン受容体はＡＶＰのＶ_１受容体と同様、リガンドと結合したあと、カルシウムの細胞内の流動化を誘導する。

うっ血性心不全（ＣＨＦ）は、高血圧や冠状動脈性心臓病（心筋梗塞、狭心症）によって主に引き起こされる多くの異なった病状の最終的な段階として特徴づけられ、心臓の拍出能力の低下、症状の重篤化は激しい活動による無呼吸状態、肺や組織への水の滞留、低ナトリウム血および安静時の呼吸困難などに随伴する。高齢化以外にも、特に影響を受けるものとして、陳旧性心筋梗塞の患者が含まれる。心筋細胞の肥大化のために進行性の心臓結合組織の化生があり、心臓の効率が次第に低下するので、もし、処置をしなければ、その病状は始まりから非常に短い間に死に至る。一度心臓の機能が低下し始めると神経ホルモンの拮抗的調節が導かれ、ここでは交感神経系（ＳＮＳ）とレニン・アンギオテンシン・アルドステロン系（ＲＡＡＳ）が活性化され、すぐに血管収縮が導かれる。心臓の拍出量はそれゆえ当初は上昇するが、いくらかの時間が経つと、継続する血管収縮が心臓に負荷を与え、心筋細胞の死と肥大化した細胞の死は、上に記述した通り、心筋の進行性の心臓結合組織の化生を導く。

血漿中のＡＶＰの濃度の有意な上昇はＣＨＦでもまた見られ、レニン‐アンジオテンシン‐アルドステロン系でアンジオテンシンＩＩがＡＶＰの分泌を促進することおよび交感神経系の活性化により視床下部におけるＡＶＰの生合成を促進することによって主に引き起こされる（非特許文献１２および１３）。血漿中のＡＶＰの濃度上昇は腎臓における水の激しい逆吸収をもたらし、患者に上記の結果をもたらす。

従って、ペプチドホルモンはこの病状に対する新しい治療の明らかな標的である。なぜなら、ＡＶＰの受容体の拮抗薬を用いることで、利尿作用が達成でき、ここで、水負荷を減少させることによって、末梢血管の抵抗もまた減少し、そのことで心臓の緊張を低減できるからである。これはおそらく一部分はうっ血性心不全の原因であるＡＶＰの直接的な血管収縮作用はＡＶＰの拮抗薬によって制御出来る。さらに、ＡＶＰが自身の細胞増殖作用によって心筋の結合組織での肥大性の形質転換に直接的な役割を果たしているという証拠がある（非特許文献１４）。このようにＡＶＰの拮抗作用はうっ血性心不全の短期間の治療のみならず、ＡＶＰを介する肥大を阻害することによって心筋の状態を長期間にかけて改善することもできる。

ＣＨＦは一つのもっとも蔓延した病気であり、その頻度は近年増加していて、保健医療制度に莫大な負担をかけていることから、改良された治療の緊急の必要性がある。うっ血性心不全と活性化したＲＡＡＳとＳＮＳの関連が認識されて以来、当時の標準的な治療法は活性化したＲＡＡＳを和らげるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の投与、活性化したＳＮＳを抑えるβ遮断薬の投与、およびチアジド、ループ系利尿薬およびカリウム保持性利尿薬などの利尿薬の投与にあった。併用療法によって生存の可能性は優位に上昇したのであるが、患者は不可避的に再入院しなければならないため治療の改善の必要性が高い。利尿剤の長期の投与は腎臓に損傷を与え、電解質平衡の異常をもたらす可能性がある。

ＡＶＰの作用を直接的な標的とするＣＨＦの治療の新たな取り組みは、上述したＶ_１およびＶ_２受容体に対する受容体拮抗薬の使用に基づくものである（非特許文献１５）。一連のベンザゼピン系の非ペプチド受容体阻害薬が存在し、経口で投与出来、阻害定数Ｋｉが０．５ｎＭ〜３ｎＭ（非特許文献９）という高い親和性を持って、特異的にＶ_１およびＶ_２受容体のどちらか一方あるいは両方に結合する。いくつかの受容体阻害薬は成功裏の動物実験や小規模な臨床研究などを経て更なる発展をしている。

Ｖ_２受容体の拮抗薬であるトルバプタン（Ｔｏｌｖａｐｔａｎ）は同時に標準的な治療を施されているＣＨＦ患者に対するプラセボ比較二重盲検臨床試験において水滞留の上昇を持つ患者での浮腫や体重減少が顕著に低減することが見られた（非特許文献１６）。低ナトリウム血症を持つ患者では血漿中のナトリウム濃度の正常化が見られた（非特許文献１７）。

もっとも広範に開発されたＶ_１／Ｖ_２受容体の拮抗薬であるコニバプタン（Ｃｏｎｉｖａｐａｎ）もまたＣＨＦの患者に有効であることが証明された。一度の静脈内投与ののちのいわゆる肺毛細血管楔入圧の減少は心臓の負荷が減少したことを示している。更に、コニパブタンによる処置のあと、尿中オスモル濃度の減少をともない、尿量が増加することも記録された（非特許文献１８）。

ＣＨＦ患者で起こる心臓肥大へのコニバプタンの好ましい効果の可能性は初代心筋細胞の細胞培養実験において、ＡＶＰによるＶ_１受容体を介したタンパク合成が濃度依存的に阻害されることによって示された（非特許文献１９）。

ＣＨＦ患者のＡＶＰ受容体拮抗薬による長期間の治療ののちの安全性、発病率、死亡率に関するデータや研究成果はいまだ得られてなく、このことはこれまでの研究に見られるうっ血性心不全の治療に対する好ましい効果の真の価値が正確に評価されていないことを意味する（非特許文献２０）。

Ｒｅｇｈｕｎａｎｄａｎａｎ Ｖ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｉｎｄｉａｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３６：６３５−４３ Ｒａｇｇｅｎｂａｓｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．１１９：２６３−２７３ Ｍｉｃｈｅｌｌ ＲＨ ｅｔ ａｌ．１９７９ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．７：８６１−８６５ Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ａｄｖａｎｔａｇｅ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ ４４９：２５１−２７６ Ｈａｙａｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１７７８−１７８３ Ｌｏｌａｉｔ Ｊ Ｌ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５７：３３６−３３９ Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０００ Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｈ２５２９−２５３９ Ｊａｒｄ Ｓ １９９８ Ｉｎ：Ｚｉｎｇｇ Ｈ Ｈｅｔ ａｌ ｅｄｓ ４４９：１−１３ Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．２００１ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１：１７５−２０２ Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．ｌ９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３３０４−３３１０ Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒ Ｍ １９９７ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８：４１０９−４１２２ Ｓｃｈｒｉｅｒ Ｒ Ｗ ｅｔ ａｌ １９９８ Ａｄｖ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４４９：４１５−４２６ Ｓｃｈｒｉｅｒ Ｒ Ｗ ｅｔ ａｌ ｌ９９９ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：５７７−５８５ Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９１：３９−４８ Ｌｅｅ Ｃ Ｒ ２００３ Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．１４６：９−１８ Ｇｈｅｏｒｇｈｉａｄｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２：５９２ Ｇｈｅｏｒｇｂｉａｄｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３９：１７１ Ｕｄｅｌｓｏｎ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０４：２４１７−２４２３ Ｔａｈａｒａ Ａ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ．３８：１９８−２０５ Ｒｕｓｓｅｌ Ｓ Ｄ ２００３ Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇｓ ３：１３−２０

本発明の目的はそれゆえ、血漿中のＡＶＰ濃度の上昇によって引き起こされるもしくは帰する症状を治療する薬剤を提供することである。本発明の別の目的はＡＶＰ受容体拮抗薬の代替物として、特にＡＶＰ受容体の拮抗薬として利用出来る新しいＡＶＰ拮抗薬を提供することである。さらに本発明の別の目的はＡＶＰに対して高い特異性を持った拮抗薬を提供することである。

１番目の態様として、発明の目的はバソプレッシンの拮抗薬によって達成され、ここで前記拮抗薬は核酸である。好ましい実施の態様として、上記核酸はバソプレッシン結合性の核酸、特にＬ体の核酸である。他の態様として、バソプレッシンは本明細書に記述されるヒトのバソプレッシンである。さらに他の態様として上記核酸は、本発明のさまざまな態様において関連性を持っているここに公開された上記核酸である。更に他の態様として、本発明の１番目の態様に記載の該核酸は本発明のさまざまな態様において関連性を持って記述された特徴を、１以上含んでいる。

２番目の態様として、本発明の目的はバソプレッシン受容体系の拮抗薬によって達成され、ここで前記拮抗薬は核酸で、好ましくはリガンドである（Ａｒｇ^８）−バソプレッシンへの結合によって作用を示す。一つの実施態様として該核酸は少なくとも１つのＬ体のヌクレオチドを含んでいて、好ましくは、核酸はＬ体の核酸を含んでいる。他の実施態様として、該核酸は本発明のさまざまな態様において関連性を持っているここに公開された前記核酸である。さらに別の実施態様として、本発明の１つ目の態様に記載の該核酸は本発明の様々な態様と関連性を持って記述された特徴を１つもしくはそれ以上含んでいる。好ましい実施態様としてバソプレッシン受容体系はバソプレッシンＶ_２受容体（Ｌｏｌａｉｔ Ｊ Ｌ ｅｔ ａｌ．ｌ９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５７：３３６−３３９）、バソプレッシンＶ_１受容体（Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３３０４−３３１０）、もしくはバソプレッシンＶ_３受容体（Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒ Ｍ １９９７ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３８：４１０９−４１２２）である。

２番目の態様において、目的はバソプレッシン結合性核酸によって達成され、ここで前記核酸はＢｏｘ１部分（ｓｔｒｅｔｃｈ Ｂｏｘ１）とＢｏｘ２部分（ｓｔｒｅｔｃｈ Ｂｏｘ２）を含み、
ここで、
前記Ｂｏｘ１が配列：ＧＵＧＧＷを含んでなり、そしてＷがＡもしくはＵ、好ましくはＷがＵであり、
Ｂｏｘ２が約１８〜約２４個のヌクレオチド、好ましくは２１個のヌクレオチドの配列を含んでなり、基（Ｇ）_ｎが配列中に４回含まれていてｎが２、３もしくは４である上記核酸である。

３番目の態様の実施態様において、５’端から３’端に向かう方向で１番目の基（Ｇ）_ｎのｎが４で５’端から３’端に向かう方向で２番目の基（Ｇ）_ｎのｎが３で、５’端から３’端に向かう方向で３番目の基（Ｇ）_ｎのｎが２で５’端から３’端に向かう方向で４番目の基（Ｇ）_ｎのｎが３であることが想定されている。

３番目の態様の実施態様において、前記Ｂｏｘ２が配列：ＧＧＧＧＵＡＧＧＧＭＵＵＧＧＡＨＧＧＧＨＡを含んでなり、ここで
Ｍはそれぞれ独立してＡまたはＣであり、
かつＨはそれぞれ独立してＡ、Ｃ、またはＵであることが想定されている。

３番目の態様の好ましい実施態様において、ＵまたはＣ、好ましくはＵがＨの位置に存在することが想定されている。

３番目の態様の実施態様において、前記核酸がＨｅｌｉｘ１部分とＨｅｌｉｘ２部分を含んでおり、前記Ｈｅｌｉｘ１とＨｅｌｉｘ２がそれぞれ５〜９個のヌクレオチド、好ましくは６〜７個のヌクレオチド、より好ましくは７個のヌクレオチドを含有し、前記Ｈｅｌｉｘ１部分とＨｅｌｉｘ２部分は互いに相補的で二本鎖ヘリックスを形成しやすいことが想定されている。

３番目の態様の実施態様において、前記二本鎖ヘリックスが末端に形成されることが想定されている。

３番目の態様の実施態様において、前記核酸がＷストレッチを含んでおり、前記Ｗストレッチは０〜１０個、好ましくは６〜９個のヌクレオチド、あるいは０〜７個のヌクレオチドを含有することが想定されている。

３番目の態様の実施態様において、前記Ｗストレッチが（ａ）１以上のＡおよび／もしくはＵのみからなる、もしくは（ｂ）１以上のＡおよび／もしくはＵと１個のＧからなることが想定されている。

３番目の態様の実施態様において、前記ＷストレッチがＰＥＧ基を含んでいることが想定されている。

３番目の態様の実施態様において、前記ＰＥＧ基がＷストレッチの５’末端もしくはＷストレッチの３’末端、もしくはＷストレッチの２つのヌクレオチドの間に存在することが想定されている。

３番目の態様の実施態様において、前記核酸がＰＥＧ基を含んでいることが想定されている。

４番目の態様として、式（Ｉ）

式中、
Ｈｅｌｉｘ１が７個のヌクレオチドを含み、
Ｈｅｌｉｘ２が７個のヌクレオチドを含み、
Ｈｅｌｉｘ１とＨｅｌｉｘ２とが互いに相補的で末端に二本鎖ヘリックスを形成し、
Ｂｏｘ１がＧＵＧＧＷでＷがＡもしくはＵ、好ましくはＵであり、
ＷストレッチのＷＷＤＷＤＤＷＷＷが６〜９個のヌクレオチドを含み、Ｄはそれぞれ独立してＡ、ＧもしくはＵであり、好ましくは、前記Ｗストレッチは（ａ）１以上のＡおよび／もしくはＵのみを、あるいは（ｂ）１以上のＡおよび／もしくはＵと１個のＧを含み、Ｂｏｘ２が約１８〜約２４個のヌクレオチド、好ましくは２１個のヌクレオチドの配列であり、そして基（Ｇ）_ｎがＢｏｘ２の配列中に４回含まれていてｎが２、３もしくは４である、
で表される核酸、好ましくは１番目、２番目もしくは３番目の態様に記載の核酸、によって目的が達成される。

式（Ｉ）から見ることができるように、本発明に記載の核酸は１つの態様として共通の構造を持つ。

ここに関連して、共通の構造は２つの相補的な領域を含み、５’端のものがＨｅｌｉｘ１と名付けられ、３’端のものがＨｅｌｘ２と名付けられ、核酸の一次構造のために、互いに対をなし、共通構造の中に末端の二本鎖ヘリックスを形成する。
より好ましくは、ヘリックスは７対のヌクレオチド長さを持つ。

５’端から３’端に向かう方向で最初の相補的な領域はＢｏｘ１によって追随され、ここで前記Ｂｏｘ１は好ましくは配列：ＧＵＧＧＷの５個のヌクレオチドからなり、ここで前記ＷはＡまたはＵを意味し、好ましくはこの位置にはＵが存在する。

この配列は６〜９個のヌクレオチド長のＡ−ｒｉｃｈ領域またはＵ−ｒｉｃｈ領域によって追随され、この領域はＷストレッチと名付けられていて、ここにはＷが主に存在し、Ｇはほとんど存在しておらず、Ｃは全く存在しない。これはこのあと、２１個のヌクレオチドの長さのＢｏｘ２によって追随され、前記Ｂｏｘ２は好ましくは以下の配列を持つ。
前記配列はＧＧＧＧＵＡＧＧＧＭＵＵＧＧＡＨＧＧＧＨＡであって、ＭがＡもしくはＣを示し、ＨがＡもしくはＣもしくはＵを示し、ここでＨが存在する位置には好ましくはＵまたはＣを、より好ましくはＵが存在する。Ｂｏｘ２の独特の特徴は４つの厳密に保存された複数のＧで２回から４回連なる。これは５’端から３’端に向かう方向で２番目の相補的領域で、５’端の相補的領域と共に末端に二本鎖ヘリックスを形成するＨｅｌｉｘ２と名付けられた領域によって追随される。

１番目の態様として、目的は、核酸、好ましくは１番目、２番目、あるいは３番目の態様に記載され、式（ＩＩ）

ここで、

がポリエチレングリコール基を示し、
ｔとｕがそれぞれお互い独立して０、１、２、３、４もしくは５であり、ここでｔとｕを足したものが０、１、２、３、４もしくは５で、
ここで、Ｈｅｌｉｘ１、Ｈｅｌｉｘ２、Ｂｏｘ１とＢｏｘ２が４番目の態様に記載のように定義され、ＷがＡもしくはＵである、
で表される核酸によって達成される。

式（ＩＩ）から見てとれるように、
１つの実施態様において本発明の核酸は式（Ｉ）におけるものと共通の構造を持ち、Ｂｏｘ１とＢｏｘ２の間のＡ−ｒｉｃｈ部分（ｓｔｒｅｔｃｈ）とＵ−ｒｉｃｈ部分（ｓｔｒｅｔｃｈ）がＰＥＧ−（ヘキサエチレングリコール）のスペーサーと組み合わせられる０〜５個のＷからなり、Ａ−ｒｉｃｈ部分とＵ−ｒｉｃｈ部分の中のポリエチレングリコールのスペーサーの位置は自由に変化できる点で異なる。式（ＩＩ）で表される本発明の核酸では、この部分をＰＥＧ＋Ｗと呼ぶ。

６番目の態様において、本目的は、核酸、好ましくは１番目、２番目、あるいは３番目の態様に記載され、式（ＩＩ）

ここで、

がＰＥＧ基を示し、
Ｈｅｌｉｘ１とＨｅｌｉｘ２がそれぞれ６個もしくは７個、好ましくは６個の核酸で、
Ｈｅｌｉｘ１とＨｅｌｉｘ２がお互いに相補的で二本鎖ヘリックスを形成し、
Ｂｏｘ１とＢｏｘ２は４番目の態様に関連性を持って定義され、Ｗストレッチ、ＷＷＷＷＷＷＷは０〜７個のＷからなり、ＷがＡまたはＵであり、好ましくは式（ＩＩＩ）にはＷが全く存在しなくて、そして
ＰＥＧ基は５’端から３’端へ向かう方向でＨｅｌｉｘ２とＨｅｌｉｘ１の間に配置されている、
で表される核酸によって達成される。

式（ＩＩＩ）に見て取れるように、本発明の核酸は、１つの実施態様において、式（ＩＩ）と共通の構造を含んでなるが、以下の点で異なる。

本発明の核酸の５’末端はＡ−ｒｉｃｈ部分とＵ−ｒｉｃｈ部分にあるために、５’末端の位置は変えられていて、３’末端はＢｏｘ１の終点に位置する。前記Ｗストレッチは０〜７個のＷからなり、好ましくは０個のＷである。

Ｂｏｘ１とＢｏｘ２は式（Ｉ）と（ＩＩ）に具体的に記載される配列を含み、５個と２１個の核酸からなる。

Ｈｅｌｉｘ１とＨｅｌｉｘ２の相補的な領域はそれぞれ６個もしくは７個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドからなり、二本鎖ヘリックスを形成する。ＰＥＧのスペーサーは決してＡ−ｒｉｃｈ部分とＵ−ｒｉｃｈ部分には無いが、しかし５’端から３’端に向かう方向で見て、Ｈｅｌｉｘ１の終点とＨｅｌｉｘ２の起点との間に位置する。Ｈｅｌｉｘ１はＢｏｘ１に追随され、前記Ｈｅｌｉｘ１の３’端は既に記載の通り、本発明の核酸の３’末端を形成する。

本発明の核酸は下記の表に列挙する核酸を包含していて、本発明の核酸として本明細書中では識別されている。これに関連して使用されている略語や記号は本明細書中で定義されるものと対応する。

６番目の態様の実施態様において、５’端から３’端に向かう方向で１番目の基（Ｇ）_ｎのｎが４で、５’端から３’端に向かう方向で２番目の基（Ｇ）_ｎのｎが３であり、５’端から３’端に向かう方向で３番目の基（Ｇ）_ｎのｎが２であり、５’端から３’端に
向かう方向で４番目の基（Ｇ）_ｎのｎが３であることが想定されている。

１番目から６番目の態様、好ましくは６番目の態様の実施態様において、ポリエチレングリコール基が約１７２〜６８８Ｄａ、好ましくは約３４４Ｄａの分子量を持つことが想定されている。

１番目から６番目の態様の実施態様において、上記配列は配列識別番号２から配列識別番号５０を含んでいる配列の群から選択されることが想定されている。

４番目から６番目の態様の実施態様において、上記核酸がバソプレッシンと結合することが想定されている。

好ましい実施態様としては、バソプレッシンがヒトのバソプレッシンであることが想定されている。

１番目から６番目の態様の実施態様において前記バソプレッシンが配列番号１に記載のアミノ酸配列を持つことが想定されている。

１番目から６番目の態様の実施態様において、前記核酸が修飾を含むことが想定されている。

好ましい実施態様として、前記修飾がＨＥＳ付加とＰＥＧ付加を含んでいる群から選択されていることが想定されている。

好ましい実施態様として、前記ＰＥＧ付加が直鎖あるいは分岐ＰＥＧによって行われるもので、前記ＰＥＧの分子量が約２０〜１２０ｋＤＡ、好ましくは約３０〜８０ｋＤａ、より好ましくは約４０ｋＤＡであることが想定されている。

好ましい実施態様として、前記ＨＥＳ付加がＨＥＳによって行われるもので、前記ＨＥＳの分子量が約１０〜１３０ｋＤａ、好ましくは約３０〜８０ｋＤａ、より好ましくは約５０ｋＤａであることが想定されている。

１番目から６番目の態様の実施態様において、核酸がすべてＬ体のヌクレオチドからなることが想定されている。

７番目の態様として、１番目から６番目の態様のいずれかの核酸と任意の追加的な構成要素を含んでいる医薬組成物によって目的は達成され、前記追加的な構成要素が製薬上許容される担体を含んでいる群の中から選択されたものであることが想定されている。

８番目の態様として、１番目か６番目の態様のいずれかの核酸の薬剤の製造のための使用によって目的が達成される。

９番目の態様として、１番目か６番目の態様のいずれかの核酸の診断用薬の製造のための使用によって目的が達成される。

９番目の態様の実施態様として、前記薬剤がうっ血性心不全の治療および／もしくは予防のための、好ましくは短期治療のための薬剤である上記使用法、より好ましくは急性非代償性うっ血性心不全の治療および／もしくは予防のためのものであることが想定されている。

９番目の態様の代替的な実施態様として、前記薬剤が、高血圧症、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞症、狭心症を含む群から選択され病態の続発症の疾病の治療および／もしくは予
防のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の実施態様として、前記患者が高齢者であるか、または陳旧性心筋梗塞に罹患していることが想定されている。

９番目の態様の実施態様として、前記薬剤が高血圧症の予防および／もしくは治療のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の代替的な実施態様として、前記薬剤が心筋肥大、特に（アルギニン^８）−バソプレシンを介した心筋肥大、の治療および／もしくは予防のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の実施態様として、前記薬剤が浮腫の治療および／もしくは予防のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の実施態様として、前記薬剤が水滞留の上昇を起こした患者の体重の軽減のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の実施態様として、前記薬剤が低ナトリウム血症の治療もしくは低ナトリウム血症の予防のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の実施態様として、前記薬剤がＡＤＨ分泌異常症の治療および／もしくは予防のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の好ましい実施態様として、前記ＡＤＨ分泌異常症が、抗利尿、低ナトリウム血症、低浸透圧を含む群から選択される少なくとも１つの別の症状を伴うことが想定されている。

９番目の態様の実施態様として、前記ＡＤＨ分泌異常症が、腫瘍による異所性のＡＤＨの分泌、薬剤誘発性のＡＤＨの分泌、肺疾患、および頭蓋−脳外傷の後もしくは髄膜炎の後の中枢性浸透圧受容体の変化を含有する群から選択される少なくとも１つの病因に起因することが想定されている。

９番目の態様の実施態様として、前記薬剤が肝硬変に合併して起こる低ナトリウム血症の予防および／もしくは治療のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の代替的な実施態様として、前記薬剤が脳水腫、特に頭蓋−脳外傷の後、もしくは脳卒中の後に起こる脳水腫の治療および／もしくは予防のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の代替的な実施態様として、前記薬剤が頭蓋−脳外傷および／もしくは脳卒中の治療および／もしくは予防のためのものであることが想定されている。

９番目の態様の代替的な実施態様として、前記薬剤が腫瘍の治療および／もしくは予防のための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の好ましい実施態様として、前記腫瘍を形成する細胞のうちの少なくともいくつかが、Ｖ_１受容体、Ｖ_２受容体およびＶ_３受容体を含む群の中から選択される受容体のうち少なくとも１つの受容体を発現していることが想定されている。

９番目の態様のより好ましい実施態様として、前記腫瘍がＡＣＴＨ産生性の腫瘍、気管小細胞癌および乳癌を含んでいる群から選択される腫瘍であることが想定されている。

９番目の態様の代替的な実施態様として、前記薬剤が早産を予防するための薬剤であることが想定されている。

９番目の態様の更なる代替的な実施態様として、前記薬剤が１次性月経困難症の予防および／もしくは治療のための薬剤であることが想定されている。

１０番目の態様として、１番目から６番目の態様のいずれかの核酸とバソプレッシンを含む複合体によって目的が達成される。

１１番目の態様として、１番目から６番目の態様のいずれかの核酸とオキシトシンを含む複合体によって目的が達成される。

１２番目の態様として、以下に記述のステップを含むバソプレッシンの拮抗薬もしくはバソプレッシンの作動薬をスクリーニングする方法によって目的が達成される。
− バソプレッシンの拮抗薬の候補および／もしくはバソプレッシンの作動薬の候補の
提供
− １番目から６番目の態様のいずれかの核酸の提供
− バソプレッシンの拮抗薬および／もしくはバソプレッシンの作動薬の存在時にシグ
ナルの変化を生じる試験系の提供および
− バソプレッシンの拮抗薬の候補がバソプレッシンの拮抗薬であるかどうかおよび／
もしくはバソプレッシンの作動薬の候補がバソプレッシンの作動薬であるかどうか
の判定。
実施態様として前記バソプレッシンがアルギニンバソプレッシンであることが想定されている。

１３番目の態様として、以下に記述のステップを含むバソプレッシンの拮抗薬および／
もしくはバソプレッシンの作動薬をスクリーニングする方法によって発明が達成さ
れる。
− バソプレッシンの相での、好ましくは固相での提供
− １番目から６番目の態様のいずれかの核酸、好ましく１番目から６番目の態様のい
ずれかの標識が付加された核酸の提供
− バソプレッシン作動薬の候補および／もしくはバソプレッシン拮抗薬の候補の添加
および
− バソプレッシンの拮抗薬の候補がバソプレッシンの拮抗薬であるかどうかおよび／
もしくはバソプレッシンの作動薬の候補がバソプレッシンの作動薬であるかどうか
の判定。
実施態様において、上記判定が、核酸がバソプレッシンの作動薬の候補と置き換えられるかどうかを立証することによって行われることが想定されている。

１４番目の態様として、バソプレッシンおよび／もしくはオキシトシン、好ましくはアルギニンバソプレッシンの検出用キットであって、１番目から６番目のいずれかの態様に記載の核酸を含有する上記キットによって目的が達成される。

発明者らは（Ａｒｇ^８）−バソプレッシンに結合する核酸、特にＬ体の核酸をスクリーンすることが可能であることを驚くべきことに発見した。本発明の核酸は好ましくはリボ核酸、より好ましくはＬ体リボ核酸である。本発明に記載の（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン結合性の核酸分子は従来技術（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｋ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１１２８５−１１２９０）に記述のバソプレッシン結合性のＤＮＡ分子と比べて驚くべき進歩を含んでいて、前記従来技術に記載のＤＮＡ分子はインビトロの測定において０．９μＭの解離定数しか持たない。細胞培養系の試験において、この以前の技術のＤＮＡ分子はおよそ３μＭの５０％阻害濃度を持ち、それゆえ、その分子のかんばしくないバソプレッシンへの結合のため、見込みある治療薬の候補としては軽視されていた。最後に、従来技術文献に記載の（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン結合性のＤＮＡ分子はまた、本発明の核酸に比べて有利ではない。なぜなら、そのＤＮＡ分子は５５個の長さのヌクレオチドを持つので、生産のためのかなりの努力と費用を必要とするからである。この核酸と比べて、本発明の核酸は数桁の単位（等温熱量測定によって測定された解離定数は１．５ｎＭで、ｃＡＭＰを用いた細胞培養試験におけるＩＣ５０が１ｎＭ）で優れている改善された親和力を持っていて、最大で１７ヌクレオチドも短くて、実施例において更に詳細に記述されるのが見られるように３７℃の生体内においても活性を持つ。この点で、本発明者は、（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン結合性の核酸が治療目的には適さないという従来技術に基づいて一般的に考えられる専門家の意見に対して反証出来た。

更に、本発明者は、これまでＡＶＰの受容体の拮抗薬によって証明されてきた、たとえば電解質平衡を乱さない利尿、心臓負担の軽減、心筋肥大を阻害する可能性のようなすべての好ましい効果が本発明に記述の化合物によってもまた達成されるということを驚くべきことに立証した。

本発明の核酸の更なる利点は、以前の技術に記載のＡＶＰ受容体の拮抗薬に比べて長期間の投薬療法において有利であることである。以前の技術に記載のＡＶＰ受容体の拮抗薬を用いた投薬療法では血漿中のＡＶＰ濃度の上昇にともなって相互拮抗的作用が起こる可能性があり、この相互拮抗性作用は長期間の投薬療法において最終的に拮抗薬の効果を減ずる可能性がある。

仮にもし、本発明の核酸を使用している時にこの反応が起こったとしても、
非生理学的に高い濃度の血漿中のＡＶＰに対応する高い濃度の投薬量それ自体によって中和出来る。

本発明の核酸は、好ましい実施態様においてまた具体的に本明細書中に開示されている配列と十分に相同である核酸を含む。ここで「十分に相同である」という術語は好ましくは、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、更に特に好ましくは９５、９６、９７、９８もしくは９９％以上の相同性があることをここでは意味すると理解されるべきである。

本発明の核酸は好ましくはリボヌクレオチドからなる核酸である。しかしながら、本発明の範囲の中で、個々のヌクレオチドが２’デオキシリボヌクレオチドもしくは、たとえば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドやＬＮＡヌクレオチドなどの他の変異体として分子の中に存在することもまた可能である。しかしながら核酸がすべてリボヌクレオチドからなるなら最も好ましい。

本発明の核酸は等温測定法によって測定された解離定数Ｋｄが１０ｎＭ未満で、３７℃において液体の中でバソプレッシンと好ましくは結合する。本発明の核酸はまた、好ましい実施態様においてオキシトシンと結合する。

本発明の範囲の中での実施態様において、本発明の核酸はまた、より長い核酸の中の一部分を含み、前記のより長い核酸は複数の部分を含んでも良く、少なくとも一部分は本発明の核酸、もしくはその一部である。他の部分もしくは前記より長い核酸の他の部分はＤ
体の核酸もしくはＬ体の核酸であって良い。それぞれのおよび任意の組み合わせは本発明と連動してならびに本発明の核酸のために本明細書で開示される目的や使用法のために使用しても良い。前記他の部分や前記より長い核酸の他の部分は結合以外、特に、バソプレッシンあるいは／またはオキシトシンへの結合以外の機能を持っていても良い。可能性のある機能は他の分子との相互作用を許すもので、例えば固相化、架橋、検出、増幅もしくは修飾の目的、または分子量を増す目的の分子である。

更なる態様として、本発明は医薬組成物に関するものであり、前記医薬組成物は少なくとも本発明の核酸の１つからなり、１つまたはそれ以上の他の核酸と組み合あわせられ、前記他の核酸もしくは複数の核酸は好ましくは（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン以外の標的分子に結合するかまたは本発明の核酸とは異なった機能を発揮する。

１つの実施態様において本発明の核酸は修飾された形で存在する。

特に好ましい修飾の型値はＰＥＧ付加もしくはＨＥＳ付加である。この修飾は本発明の核酸の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）もしくは他の基の結合による修飾を含んでいて、前記修飾はヨーロッパ特許出願ＥＰ １ ３０６
３８２の記述のもので、その開示はここに述べられそして含まれている。

好ましくはこの方法で、たとえば、ＰＥＧ付加によって修飾された本発明の核酸の分子量は約２０００〜２０００００Ｄａ、好ましくは４００００〜１２００００Ｄａである。

核酸のＨＥＳ付加はたとえばドイツ特許出願ＤＥ １ ２００４ ００６ ２４９．８に記載されている。好ましくは、この関連して使用されているヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）は３〜１０００００Ｄａ、より好ましくは５０００〜６００００Ｄａの数平均分子量を持つ。

本発明の核酸の、たとえばヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような生理学的に許容出来る高分子量の重合体による修飾の利点は本発明の核酸の排せつ速度論を変えられる点にある。何らかの理論によって制約を受けることを望まないが、この方法によって修飾された本発明の核酸の挙動は、そのように修飾された本発明の核酸の分子量の増加および、特にこれらの核酸がＬ体の核酸として存在していた場合の代謝活性の低下の結果として、生命有機体、特にほ乳動物からのこれらの排出は遅くなっているということ実に基づいているように思える。排出は通常は腎臓を通じて行われるので、現在では、この方法で修飾された本発明の記載の核酸に関する腎臓の糸球体ろ過量は、修飾されていない本発明の核酸のそれに比べて有意に低下していると仮定され、結果として、抵抗時間、すなわち、本発明の核酸、特に本発明に記載の修飾されたＬ体核酸の生物学的半減期の、対応している本発明の修飾されていない核酸の、特に修飾されていないＬ体の核酸の抵抗時間に比べての増加が見られる。本発明の特に注目に値する点は、好ましい実施例に見られる修飾にも関わらず、この方法で修飾された本発明の核酸はその特異性を目立っては失っていないということ実である。従って、本発明の核酸は、特に修飾された形において、他の薬学的な活性を持つ化合物において認識できることはないような性質をまったく驚くべきことに示す。すなわち、たとえば活性を持つ構成成分を連続的に放出する持続性薬剤の形において、大規模な生薬製剤を除外することが出来、代わりに問題になっている活性を持つ構成成分に、その分子の、特に反応の特異性もしくはそれぞれの標的分子との複合体形成として表わされる生物活性に悪影響を与えること無しに、直接的な修飾を施すことが出来る。

本発明の修飾された核酸が持続性薬剤の形を取ることは本発明の範囲に入る。本発明の核酸がその製造に含まれる費用や困難さを減ずるような修飾されていない、すなわち修飾
を持たない形、で存在することは本発明の範囲に入る。特に急性非代償性うっ血性心不全の治療において、静脈への注射を含む集中的な治療で、本発明の核酸のこの実施態様は、投与量がよく制御されていて、利尿を通じての迅速な排出もしくは血漿中の短い半減期が望まれる場合に使われる限りにおいて特に利点を持つ。

本発明の核酸の高い安定性の結果として、特にそれがＬ体の核酸として存在する実施態様において、本発明の核酸の、そのような治療を必要としている患者の治療のための直接的な投与が可能である。好ましくは、本発明の核酸は局所性もしくは全身性の適用のための医薬組成物として利用出来る。好ましくはこの医薬組成物は静脈注射の適応のためのものである。しかしながら、そのような医薬組成物は筋肉注射、腹腔内注射、もしくは皮下注射によって投与されることもまた本発明の範囲の中にあることが可能である。本発明の核酸は好ましくは、製薬学的に許容され得る溶媒中に含まれるか溶解される。このような溶媒としては、生理食塩水、ＰＢＳ、またはグルコース溶液、特に、５％グルコース溶液からなる群より選ばれるものを特に挙げることができる。

本発明の核酸を、医薬を製造するのと同じく診断薬を製造するのに用いてもよい。これに関連して、診断薬としての適用もしくは使用は本発明の核酸とバソプレッシン、特に（Ａｒｇ^８）−バソプレッシンおよび／もしくは全体としてもしくは個別に、ここで標的分子として意味するオキシトシンとの間の特異的な相互作用に基づく。本明細書に記述されるさまざまな症状や疾患へのバソプレッシンおよび／もしくはオキシトシンの関与の結果として、本発明の核酸の医薬の製造への使用の態様に関連して、本発明の核酸を用いる確定診断は本発明の範囲の中にあることが可能である。対応する診断の手段に関連して、標的分子の濃度は好ましくは１種類もしくはそれ以上の本発明の核酸との相互作用によって決定される。このような相互作用はたとえば、体液中の（Ａｒｇ^８）−バソプレッシンの濃度を決定するための競合的試験分析において、トレーサーである標識されたバソプレッシンの本発明の核酸への結合が体液由来の（Ａｒｇ^８）−バソプレッシンと競合ということ実によって検出される。

本発明の核酸が使用できる処置用の症状は、処置すべき器官、特に、哺乳動物、好ましくはヒトにおける正常な生理学的状態に比べて高いバソプレッシンレベルに直接的または非直接的に関連する。好ましくは、高いバソプレッシンレベルは、体液、好ましくは血液である体液中のバソプレッシンの高い力価である。

本発明の核酸を治療に用いることの出来る症状はＣＨＦである。この例では、本発明の核酸のうっ血性心不全の短期治療のための使用が本発明の範囲内にある。本発明の核酸によって治療もしくは予防することの出来る別の型の心臓疾患は急性非代償性うっ血性心不全である。

本発明の核酸の高血圧症、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞症および狭心症の治療のための使用もまた本発明の範囲内である。特に好ましい使用形態において、高血圧症、冠状動脈性心臓病、心筋梗塞症および狭心症は最終的にうっ血性心不全を引き起こす症状であり、この点でうっ血性心不全がこれらの症状の最終段階を構成要素となっても良い。好ましい実施態様として、本明細書に記載されている実施態様においてうっ血性心不全は他の記述された症状、特に冠状動脈性心臓病、心筋梗塞症、狭心症および高血圧症と同様、特に高齢の患者や１度もしくはそれ以上、心筋梗塞にかかったことがある患者に起こる症状である。好ましい実施態様として、高齢の患者は特にその身体能力もしくは身体の動作が最高時の身体能力もしくは身体動作に比べて加齢とともに減じている。

本発明の医薬が治療および／もしくは予防に用いられる別の症状は心筋肥大、特に心筋肥大、浮腫、アルギニンバソプレッシンにより媒介される低ナトリウム血症を含む。

本発明の核酸を用いて治療できるもしくは予防できる別の症状はＡＤＨ分泌異常症である。

ＡＤＨ分泌異常症症候群（ＳＩＡＤＨ、シュワルツ・バーター症候群）において、ＡＶＰの血漿中濃度は、たとえば腫瘍による異所性のＡＤＨの分泌、カルバマゼピン、神経弛緩薬、三環系抗うつ薬もしくは選択的セロトニン再取り込み阻害薬などの向精神薬の投与による薬剤誘発性の抗利尿ホルモンの分泌、たとえば結核もしくは気管支癌などの肺疾患、または、抗利尿ならびに低ナトリウム血症および高浸透圧血症をもたらす頭蓋−脳外傷の後もしくは髄膜炎の後の中枢性浸透圧受容体の変化のような様々な原因に寄って恒久的に上昇している（Ｂａｙｌｉｓ Ｐ Ｈ ２００３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：１４９５−１４９９）。病気の徴候はもともと血漿中のＡＶＰ濃度の上昇と関連しているので本発明の核酸はＡＤＨ分泌異常症およびＡＤＨ分泌異常症症候群の治療および／もしくは予防に用いることが出来る。この症状の治療におけるＶ_２受容体拮抗薬の有効性は動物実験およびＳＩＡＤＨ患者においてみられている（Ｓａｉｔｏ
Ｔ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８２：１０５４−１０５７）。

別の態様において、本発明は、本発明の核酸の肝硬変および低ナトリウム血症の治療および／もしくは予防のための医薬の製造への使用に関する。

肝硬変において、末梢血管の拡張はＡＶＰの血漿中濃度の有意な上昇をもたらし、続いて起こる水分の排出の減少のために低ナトリウム血症および高浸透圧血症を引き起こす。肝硬変の標準的な治療はさらに低ナトリウム血症の激しさを増す可能性のある利尿薬を用いるので、本発明の核酸は、ＡＶＰの作用機序によって、Ｖ_２受容体拮抗薬のように、それらは特異的に水分の排出のみを増強し、刺激的な低ナトリウム血症および高浸透圧血症を沈静化するので有利である。肝硬変の患者において、Ｖ_２受容体拮抗薬の単回投与ののち、尿量の有意な増加および尿中オスモル濃度の減少が検出された。しかしながら、ＡＶＰの血漿中濃度の増加は投与量依存的であることが認められていて、このことが、長期間の薬物治療において、受容体拮抗薬の利尿効果を無効にする可能性がある（Ｉｎｏｕｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６３：５６１：５７０）。本発明者らは、最近、肝硬変における低ナトリウム血症の治療に用いられる本発明の核酸はＡＶＰ血漿濃度の上昇をまったく作り出さず、それゆえＶ_２受容体拮抗薬に比べて大いなる利点を提供するという見解を有している。

別の態様において、本発明の核酸は脳浮腫の治療および／もしくは予防に用いることが出来る。この場合、本発明の範囲内で、本発明の記載の核酸はまた、頭蓋−脳外傷の治療もしくは脳卒中の治療に用いることが出来る。本発明の範囲内において、本発明の核酸を、特に頭蓋−脳外傷の治療もしくは脳卒中の結果起こる脳浮腫の治療および／もしくは予防に用いることが出来る。

頭蓋−脳外傷の治療もしくは脳卒中の結果起こる脳浮腫の治療において、従来技術文献では補助的な治療としてフロセミド（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）のようなループ利尿薬が用いられている。

これらの薬剤はしかし、そのＮａ^＋，Ｋ^＋およびＣｌ⁻の損失が増えることを含む作用機序のため、体液の電解質平衡を乱し、それゆえに低ナトリウム血症および／もしくは低カリウム血症を引き起こす可能性がある。本発明の核酸を用いた場合、同様に利尿効果を持ち、電解質平衡との干渉もなく、腎臓の集合管における水分の再吸収を阻害するために
、イオンの損失も無く、水分の排出を増加させるのみである。頭蓋−脳外傷のあとの脳浮腫の動物モデルにおいて、脳浮腫の形成がＶ_２受容体拮抗薬によって濃度依存的に止めることが出来た（Ｌａｚｌｏ Ｆ Ｆ １９９９ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６４：１１５−１２２）。

別の態様において、本発明は、本発明の核酸の腫瘍の治療および／もしくは予防のための使用に関する。この腫瘍は特に、Ｖ_１受容体、Ｖ_２受容体およびＶ_３受容体を含む群の中から選択される受容体のうち１つもしくはそれ以上の受容体を発現している型である。

ＡＣＴＨを分泌している脳下垂体の腫瘍において、あるいはまたは異所性ＡＣＴＨ症候群においてＶ３受容体は過剰発現している（Ｄｅ Ｋｅｙｓｅｒ Ｙ １９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１３１１−１３１８）。ＡＶＰの細胞増殖活性はＶ_１受容体を介してであるが、あらゆる種類の細胞におよぶことが知られている（上述参照）ので、ＡＣＴＨを分泌する腫瘍の腫瘍形成においてＡＶＰはＶ_３受容体を介した刺激に含まれている。本発明の核酸の作用機序と同様のこの作用機序のため、前記核酸は腫瘍形成の抑制に用いても良い。

気管支癌の部分群であり、西欧諸国において男性の癌での死亡の主な原因であり、女性の死亡の２番目に多い原因である気管支小細胞癌において、３種類の既知のＡＶＰ受容体とＡＶＰ自身が発現している。女性の最も多い悪性疾患の１つである乳癌にも同様のことがあてはまる（Ｎｏｒｔｈ Ｗ Ｇ １０００ Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：２７−４０）。ＡＶＰおよび３種類全部のＡＶＰ受容体の上記記載の腫瘍における存在は本発明の命題の根拠をなしており、これはすなわち、これらの腫瘍の生理学においてＡＶＰが重要な役割をしているという命題である。結果的に本発明の核酸はまた腫瘍、特に上記記載の腫瘍を抑制するのに使用することができる。

別の態様において、本発明は、本発明の核酸の早産の予防のための使用に関する。

ＡＶＰおよびオキシトシンは子宮のそれら固有の受容体を介して子宮収縮を刺激し、そして分娩過程の開始に決定機である。両方のホルモンは同じように早産に関与していて、早産は一方では早産の新生児に健康上の危険を与え、一方では公共の健康医療制度に莫大な負担をかける。しかしながら、早産は、Ｖ１受容体と同様にオキシトシンの受容体を阻害出来るオキシトシン類似体であるアトシバンによって効果的に防ぐことが出来る（Ａｋｅｒｌｕｎｄ Ｍ ２００２ Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．１３９：３５９−３６５）。このことは本発明の核酸が早産の予防に用いることができることの根拠を形成する。

別の態様において、本発明は、本発明の核酸の１次性月経困難症の予防および／もしくは治療のための利用に関する。

１次性月経困難症は生理の最中、およびある程度はすでに生理の前から、子宮の強力な収縮によって引き起こされる疝痛様の下腹部の痛みを伴う。この症状に悩まされる女性はＡＶＰ濃度が上昇した状態にある。治療的に好ましい効果は、いずれもＶ１受容体およびオキシトシン受容体を同じように阻害する、合成されたオキシトシンの類似体であるアトシバンおよび非ペプチド性受容体拮抗薬ＳＲ ４９０５９を使用することで達成される（Ａｋｅｒｌｕｎｄ Ｍ ２００２ Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．１３９：３５９−３６５）。このことは本発明の核酸の１次性月経困難症の治療および／もしくは予防のための使用の根拠を成す。

本発明の核酸はまた、治療的に活性のある物質の設計（ドラッグデザイン）の出発物質として使用しても良い。原則として、これには２種類の取り組み方の可能性がある。
１つの取り組み方は化合物のライブラリーのスクリーニングにありこのような化合物のライブラリーは好ましくは低分子化合物（低分子もしくは小分子）のライブラリーである。このようなライブラリーは当業者に周知である。他の取り組み方として、本発明に従って、核酸は、活性のある物質の合理的設計（ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）のために用いても良い。

活性のある物質の合理的設計は、本発明の核酸もしくは複数の核酸の構造と類似の核酸の構造、またはバソプレッシンおよびオキシトシンとの結合を媒介する本発明の核酸もしくは複数の核酸の構造の一部分と同一な核酸の構造、特に三次元構造を含む本発明の核酸のいずれを出発物質としても良い。いずれの場合にも、このような構造はまた本発明の核酸もしくは複数の核酸と同一のもしくは少なくとも類似の結合様式を示す。更なる段階もしくは代替の段階として、活性のある物質の合理的設計において、好ましくは、バソプレッシンもしくはオキシトシンと結合する核酸の一部分の三次元構造は、好ましくは核酸もしくは複数の核酸と異なる化学基によって模造される。模倣とも呼ばれるこの模造を用いて、活性のある物質の合理的設計の出発物質として用いられた核酸もしくは複数の核酸から異なった化合物が構築されても良い。このような化合物もしくは活性のある物質は好ましくは小分子もしくはペプチドである。

当業者に周知の競合的試験を用いて化合物ライブラリーをスクリーニングする場合、適切なバソプレッシン類似体、バソプレッシン作動薬、バソプレッシン拮抗薬、オキシトシン類似体、オキシトシン作動薬もしくはオキシトシン拮抗薬が発見されても良い。このような競合的な試験は以下のように組み立てられても良い。本発明の核酸、好ましくは鏡像異性体、すなわち、表的分子と結合するＬ体核酸は、好ましくは固相に結合している。バソプレッシンの類似体を同定するために、標識とともに供給されたバソプレッシンは試験系に加えられる。代替的に、バソプレッシンは固相に結合されて、本発明の核酸が標識を付加されても良い。類似体候補もしくは作動薬候補または拮抗薬は、鏡像異性体と結合したバソプレッシン分子と競合し、このことは対応する標識から得られるシグナルの減衰を引き起こす。作動薬もしくは拮抗薬のスクリーニングは当該分野に周知の細胞培養試験系の使用を含んでも良い。原則として、オキシトシンを用いる際にも同じ取り組み方はまた使用されても良い。

別の態様として、本発明の核酸は、バソプレッシンもしくはオキシトシンへの特徴的な結合様式の結果、標的の評価に用いられても良い。本発明の核酸はバソプレッシンおよびオキシトシンの機能を研究するための生体外器官モデルにおいて用いられても良い。原則として、バソプレッシンの作動薬もしくは拮抗薬を試験することの出来る生体外モデルは存在し、たとえば器官槽の中の分離され還流された腎臓もしくは分離された大動脈である。

本発明に記載のキットは少なくとも１つもしくはそれ以上の本発明の核酸を含んでいても良い。さらに、前記キットは少なくとも１つあるいはそれ以上の陽性コントロールもしくは陰性コントロールを含んでいて良い。陽性コントロールとして、たとえばバソプレッシンもしくはオキシトシンを用いても良く、それに対して本発明の核酸がスクリーニングされるかまたは、それに対して本発明の核酸が望ましくは溶液で結合する。陰性コントロールとして、とりわけ、生物物理的性質の点においてバソプレッシンおよびオキシトシンと同様の様式でふるまうが、本発明の核酸、またはバソプレッシンおよびオキシトシンと同じアミノ酸組成を持ちながら配列の異なったペプチドによって認識されないペプチドを用いても良い。

更に、キットは１つもしくはそれ以上の緩衝液を含んでいても良い。キット中の様々な
構成要素は、乾燥したもしくは凍結乾燥した状態で、または液体に溶解されて存在しても良い。キットは、それは次に１つまたはそれ以上のキットの構成要素を含んでも良いような１つまたはそれ以上の容器を含んでいて良い。好ましくは、前記容器は、１つまたはそれ以上のキットの構成要素を用いる実験の一回の実行に必要な一回分の反応剤を含んでいても良い。

本発明の核酸のバソプレッシンもしくはオキシトシンのような標的分子を検出のための使用は本発明の範囲内にあることが可能である。この目的のために、しかしまた一般的にも、本発明の核酸は直接的にもしくは間接的に標識を付加されても良い。好ましくは標識の付加は、放射性トレーサー、蛍光標識、もしくは、たとえばユウロピウムのような磁性レジン分光法にふさわしい標識を含む群から選択される。

本発明は、あとに続く図と例による補助と共に、より細かく下文に記述され、前記、図と例から更なる特徴、実施態様、利点が得られても良い。

図１は自動化されたＲＮＡの選別の概略図である。
図２は試験管内の選別ロボットの作業空間の概略図である。
図３は自動化された試験管内の選別に続いて生じたＡＶＰ結合性のクローンの配列を示す。
図４は試験管内の選別に続いて生じたＡＶＰ結合性のクローンの配列および共通配列を示す。
図５は配列ＣＨＦ−１５−Ｂ４およびＣＨＦ−１３４−Ａ９の結合様式の比較を示していて、核酸の濃度に応じたＡＶＰへの結合がパーセントで表わされている。
図６は、内部のＰＥＧのスペーサー部分を用いた部位特異的な修飾および切り捨てのあとの配列の変異系と、ここから生じたコンセンサス共通配列を示していて、ここで変異体は不変の５’端および３’端を持つ。
図７は、内部のＰＥＧのスペーサー部分を用いた部位特異的な修飾および切り捨てのあとの配列の変異系と、ここから生じた共通配列を示していて、ここで変異体は不変の５’端および３’端を持つ
図８はＡＶＰ結合性の鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７の２次構造モデルの描写である。図９は３’端をアミノ基で修飾した鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＮＨ_２の、ＩＥＸ−ＨＰＬＣの方法によって取得されたクロマトグラムである。
図１０は３’端をアミノ基で修飾した鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＮＨ_２の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって得られた質量スペクトルである。
図１１は３’端をアミノ基で修飾した鏡像異性体の、（ＣＧＥ）キャピラリーゲル電気泳動によって得られた電気記録図である。
図１２は４０ｋＤａのＰＥＧによって修飾された鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧの、ＲＰ−ＨＰＬＣによって得られたクロマトグラムである。
図１３は、鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７およびＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧによるＡＶＰとＶ_２受容体の相互作用の阻害を示していて、鏡像異性体の濃度に応じたｃＡＭＰの生合成の減少が１ｎＭのＡＶＰの刺激に際のウェル当たりのｃＡＭＰの量で表わされている。
図１４ＡはＣＨＦ−Ｆ−０３７によるＡＶＰとＶ_１受容体の相互作用の阻害を示していて、鏡像異性体の濃度に応じた、５ｎＭＡＶＰの刺激による放出を１００％としたパーセントでの、カルシウムの放出のパーセンテージの減少が示されている。
図１４ＢはＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧによるＡＶＰとＶ_１受容体の相互作用の阻害を示していて、鏡像異性体の濃度に応じた、５ｎＭＡＶＰの刺激による放出を１００％としたパーセントでの、カルシウムの放出のパーセンテージの減少が示されている。
図１５は薬剤の投与の後のいろいろな期間の後の様々なラットの群の尿量を示した図表である。
図１６は薬剤の投与の後のいろいろな期間の後の様々なラットの群の水消費を示した図表である。
図１７は薬剤の投与の後のいろいろな期間の後の様々なラットの群の尿中のオスモル濃度を示した図表である。
図１８は薬剤の投与の後のいろいろな期間の後の様々なラットの群の尿中ナトリウム量を示した図表である。

Ｄ−ＡＶＰの自動化された選別
Ａ． 材料
精密化学製品および酵素
ＮＴＰとｄＮＴＰはベルリンのＬａｌｏｖａ社から得た。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／μｌ）はハイデルベルクのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から得た。ＤＮアーゼＩはタウフキルヒェンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｌｉｃｈ社から得た。Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ⁻）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ）はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から得た。スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）はＲＮａｓｅ ＯＵＴ^TM（ＲＮアーゼ阻害剤）と同様にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得た。自動選択に関連してＲＴ−ＰＣＲに必要な試薬はヒルデンのＱｉａｇｅｎ社より得た。

標的分子であるヒトのＤ−ＡＶＰ［Ｄ−（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン］
９個のアミノ酸からなるペプチド、Ｄ体のＡＶＰ（アミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｎｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）はハイデルベルクのＢＡＣＨＥＭ社によって合成された。この分子はカルボキシ末端のＧｌｙに、付加的に挿入されたリシンを介してビオチン基を持っているため、たとえばニュートラアビジンアガロースもしくはストレプトアビジン−ウルトラリンク（Ｐｉｅｒｃｅ社）などの親和性クロマトグラフィーの材料とのビオチン−ストレプトアビジン相互作用の方法によって結合した核酸を結合していない核酸から分離することが出来る。

核酸ライブラリーとオリゴヌクレオチドプライマー
用いられた出発プールＤＥ５−７．３４はＮＯＸＸＯＮ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ社によって合成され、ＲＴ−ＰＣＲに用いられたオリゴヌクレオチドプライマーＤＥ５．Ｔ７とＤＥ５．６はゲッチンゲンのＩＢＡ ＧｍｂＨ社によって標準的なホスホアミダイト化学反応によって合成された：
ライブラリーＤＥ５−７．３４；合成されたリバース鎖
５’−ＧＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＣＧ−Ｎ^３４−ＣＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＣＴＡＡＧＣＴＣＣ−３’
フォワードプライマー ＤＥ５．Ｔ７
５’−ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＣＴＴＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧ−３’
リバースプライマーＤＥ５．Ｒ
５’−ＧＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧ−３’
濃縮されたプールのクローニングと配列はベルリンのＡＧＯＷＡ社に外注することによって実行された。

出発プールの産生
１回目の選別ラウンドのための出発プールの産生のために、約２Ｘ１０^１５分子の複雑さに相当する４ナノモルの合成された１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ；ＤＥ５−７．３４開始プール、リバース鎖）は、２０Ｘ１００μｌのＴａｑポリメラーゼバッファー、３倍量のＤＥ５．Ｔ７プライマーと共に、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を作るために４００ユニットのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）と２時間、６３℃でインキュベートすることによ
って作成された。結果的に生じた２本差のＴ７−ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターから開始して、２ｍｌの反応容量のＴ７転写バッファー（８０ｍＭ ヘペス ｐＨ７．５；２２ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１ｍＭスペルミジン；１０ｍＭ ジチオスレイトール；各４ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ；１２０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に入った４ナノモルのｄｓＤＮＡから対応するＲＮＡ開始プールが転写された。転写反応（より詳しくはセクションＣ−酵素反応を参照）が終了してから鋳型ＤＮＡはＤＮアーゼＩによって消化され、ＲＮＡは８％の変性ポリアクリルアミドゲルを用いて精製され、アルコールによって沈殿され、乾燥された。

Ｂ． 選別段階
ＲＮＡの変性とフォールディング
選別の非酵素段階のすべては、標的分子であるＤ−ＡＶＰの接触前のＲＮＡの変性を除いて、選別バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％［ｗ／ｖｏｌ］Ｔｗｅｅｎ−２０）に中で行われた。変性は、ＣａＣｌ２とＭｇＣｌ２を除いた選別バッファーの中で９５℃、５分行われた。変性ののち、ＲＮＡは氷上で冷やされ、ＣａＣｌ_２とＭｇＣｌ_２が加えられ、混合物はさらに５〜１５分間３７℃でインキュベートされた。最初に、手動のラウンドで、４〜８ナノモルのＲＮＡプールが用いられ、のちの自動化されたラウンドで０．２ｎｍｏｌ用いられた。

マトリックスに結合したＲＮＡ種の結合と分離
フォールヂングに続いて、一番初めにＲＮＡは３７℃で１５分間ペプチド無しで、基質（Ｐｉｅｒｃｅ社から得たストレプトアビジン−ウルトラリンクもしくはニュートラアビジンアガロース）と共にインキュベートされた。このいわゆること前選択はマトリックスと結合する可能性のあるものを除くためにある。このインキュベート段階の後、結合しなかったＲＮＡはマトリックスから遠心によって分離され、上清は取り除かれ、マトリックスは２カラム体積の遠別バッファーによって洗浄された。上清と洗浄画分は合わせられ、更なる選別に用いられた。自動化過程にいて、マトリックスは単に沈殿させることによって取り除かれ、上清のみが更に用いられた。

Ｄ−ＡＶＰ結合性のリボヌクレオチド核酸の選別
Ｄ−ＡＶＰとの結合反応のため、様々な濃度のビオチン付加されたＤ−ＡＶＰは残った核酸種へと加えられ、１〜３時間、３７℃でインキュベートされた。次に１０〜８０μｌのビオチン結合性のマトリックスが結合バッチへと加えられ、さらに１０〜１５分間、３７℃において撹拌しながらインキュベートされた。マトリックスはそののち、非結合のＲＮＡ種を結合した種から取り除くために選別バッファーによって洗浄された。この目的のために用いられた洗浄容量は最初の３回の手動のラウンドではマトリックスの容量の２倍で、引き続いて行われたラウンドでは固相容量の１３５倍になった。

溶出
最初の３回の手動によって行われた選別のラウンドでは結合したＲＮＡは、結合したＲＮＡとマトリックス粒子を１５０μｌの４Ｍグアニジンチオシアネート（Ｒｏｃｈｅ社）で２回、１５分、３７℃の変性条件でインキュベートすることによって溶出された。この手順は、上清を取り除いたあと、６５℃で再び繰り返された。集められた上清の中の溶出したＲＮＡは、水飽和したフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）によって１度溶出され、２度、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）によって溶出され、等量の−２０℃のイソプロパノールによって沈殿され、７０％のエタノールで洗浄され、乾燥された。更に自動化したラウンドの過程では、溶出はマトリックス粒子をＲＴ−ＰＣＲバッファー（Ｑｉａｇｅｎ社）の中で９５℃１０分間熱することによって達成された。

Ｃ． 酵素反応
転写−選別で用いるＲＮＡの産生
転写は１００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと２５〜４０ＵのＲＮａｓｅ Ｏｕｔ ＲＮａｓｅ阻害剤の入ったＴ７反応バッファー（８０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、２２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ジチオスレイトール、各４ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰとＵＴＰ、１２０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、０．８Ｍベタイン）で１００μｌの容量で行われた。１００μｌの反応液中、５０〜１００ピコモルのＲＴ−ＰＣＲの産物（手動選別ラウンド）および２本鎖のＤＮＡが中で作られた１０〜３０μｌのＲＴ−ＰＣ産物（自動選別ラウンド）が転写の鋳型として用いられた。

反応混合液は３〜１２時間３７℃でインキュベートされ、ＤＮアーゼＩが鋳型ＤＮＡを分解するために加えられた。形成されたＲＮＡは手動では８Ｍの尿素入りの８％ポリアクリルアミドゲルを用いた変性条件によって、自動化した方法ではＮＴＰが含まれない限外ろ過ユニットを用いて限外ろ過を用いて分離された。限外ろ過によって精製されたＲＮＡはフィルターから現れ、ゲルによって精製されたＲＮＡはゲルの切り出した断片から溶出され、エタノールで沈殿され、乾燥され、水に溶解された。

逆転写−手動ラウンド１〜３
沈殿されたＲＮＡは逆転写の手段によって１本鎖ＤＮＡに転写された。４０μｌの反応混合液中の多くても８ピコモルのＲＮＡは１μＭのＤＥ５．Ｒのプライマーと共に変性され、プライマーは冷却することによってＲＮＡとハイブリッド形成をされた。８μｌの５ＸＲＴバッファー（１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．８Ｍベタインが加えられ、４８℃において２分間、インキュベートされた。逆転写は５ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素と共に開始され、４８℃で３０分、５０℃で２０分、５５℃で１０分、７０℃で１５分、サーマルサイクラーでインキュベートされた。

逆転写−自動化ラウンド４〜１６
標的分子とＲＮＡ種がそこに結合した洗浄されたマトリックス粒子は１２０μｌのＱｉａｇｅｎ社のＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲバッファー（それぞれ１μＭのプライマー濃度）に再けん濁され、９５℃１０分インキュベートされた。反応混合液を最初は６３℃に最終的に５０℃にゆっくりと冷やしてから、４μｌの酵素混合液（Ｑｉａｇｅｎ社のＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットの構成物）が加えられた。逆転写の温度の概要は以下の通りである：５０℃で２０分、５３．３℃で２分、５６．６℃で２分、６０℃で１０分。

ＰＣＲ−手動ラウンド１〜３
１０μｌのＲＴ反応液がそれぞれの場合でそれぞれ１００μｌの容量（１０μｌ １０ＸＶｅｎｔバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｏｌａｂｓ社）、１μｌ ５０ｍＭ
ＭｇＳＯ_４、２μｌ １０ｍＭ ｄＴＰ−ｍｉｘ、３μｌ １００μｌ ＤＥ５．Ｔ７プライマー、３μｌ １００μｌＤＥ５．Ｒプライマー、１６μｌ ５Ｍベタイン、２．５μｌ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ ＤＮＡポリメラーゼ）の３回のＰＣＲの鋳型に用いられた。増幅はサーマルサイクラーの後述の概要によって行われた：９５℃で１分間、６３℃で１分間、７２℃で１分、合計で６〜１０サイクル。増幅の進展は反応後の反応液をネイティブポリアクリルアミドで検定した。ＰＣＲ反応液はそののち、アルコールで沈殿され、ペレットは７０％のエタノールで洗浄されて乾燥された。ＤＮＡは水で溶解され、５０〜１００ｐｍｏｌのＲＮＡは次の選別ラウンドのための転写鋳型として用いられた。

ＰＣＲ−自動ラウンド４〜１６
ＰＣＲはＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲバッチを９５℃で１５分間インキュベートする
ことによって開始された。これは７〜１６回のサーモサイクル（９５℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で３０秒）によって追随される。自動化されたラウンドではＰＣＲのｃｏｕｒｓｅはＰＣＲ反応液の１部分の蛍光測定によって観測され、ＰＣＲは必要分の閾値を超えたら終了された（Ｄセクションの自動化された選別におけるＰＣＲの進捗の観測を参照）。

Ｄ． 自動化された選別におけるＰＣＲの進捗の観測
ＰＣＲにおける２本鎖ＤＮＡの増加は半定量的に追跡された。これはＰＣＲのサイクル数を可能な限り少なく保つ目的のために役立った。この方法においてＴ７反応に十分な鋳型を得るために必要なだけ数のＰＣＲサイクルが実施された。ＰＣＲの間、一定の回数のサイクルのあと、ＰＣＲの一部分はＰＣＲ反応液から取り除かれ、９０μｌのＰｏｃｏＧｒｅｅｎ溶液（１：４００の比率でＴＥ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８；１ｍＭ
ＥＤＴＡ］に希釈された）の中へ入れられた。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは蛍光の色素で溶液中に自由にいるときはほとんど蛍光でないが、２本鎖ＤＮＡと結合した時に強く蛍光する（励起：４８５ｎｍ；発光：５２０ｎｍ）。熱耐性ポリメラーゼを入れてなくてサイクルを経ていないコントロールと比較した蛍光の測定によってＰＣＲの進行状況の正確な推定が得られる。閾値に到達したら（サイクルを経た蛍光／サイクルを経ていない蛍光＞２）、ＲＴ−ＰＣＲ反応の一部分は試験管内転写の鋳型として役目を果たすことが出来る。

Ｅ． 自動化された操作
３回目のラウンドから、全ての操作は不正確に行われたゲル抽出の段階から離れ、ピペット・ロボットでの完全に自動化された方法で行われた。この目的に用いられたロボットの作業空間上の個々のモジュールの配置は図２に見られる。以下のモジュールが用いられた：
・ＰＣＲの間の増幅過程を確認するための蛍光読み取り機。ＤＮＡがすでに十分量産生さ
れた試料は自動化された方法によって一時的に貯蔵され、それ以上のサーモサイクルを
実行しない
・２つの真空チェンバーがあり、チェンバーＡは基質に結合したＲＮＡ種と結合しなかっ
たＲＮＡ種の分離のためで、チェンバーＢは個別の次のラウンドの開始の前の転写反応
の精製のためである
・ピペット用チップの容器
・種々のインキュベートの段階とＰＣＲプログラムの実行のためのサーマルサイクラー
・結合バッファーや反応バッファー内でのマトリックスのけん濁のための震盪機
・５０℃の作業空間、この温度で酵素反応を開始する（ホットスタート）ことと蛍光コン
トロールを採取する間に、ＰＣＲ反応が冷えるのが早くなりすぎないようにすることを
可能にするため
・ＰＣＲおよび転写反応の一時的な貯蔵のための４℃の作業空間
・酵素もしくは調整された反応混合液などの熱に敏感な試薬を貯蔵するための４℃の試薬
立て
・洗浄バッファーを貯蔵するための室温／３７℃試薬立て
・多くの操作を実行するための室温／３７℃作業空間
・蛍光測定のための試料を調整するための蛍光プレート作業空間
・現在処理されていないプレートを貯蔵するためのホテル（Ｈｏｔｅｌ）
・使用済みのピペット用チップを廃棄する所
この実施例の文中に記述された選別過程の個々のモジュールの関与はそれらの仕様の順番と同様に図１に見られる。

Ｆ 結果
選別過程
それぞれの選別過程において、４回目のラウンドから始まる３回の異なる厳しいバッチ
はＤ−ＡＶＰを含まない空のカラムと同様に標的分子のように操作された。ストリンジェンシーは用いられた洗浄の量の変化や低いＤ−ＡＶＰの濃度によっても上昇した。

（必然的に高い）濃度のＤ−ＡＶＰの結合に必要な最初のラウンドの大量の基質は、自動化されたピペット装置によって信頼出来る様に処理出来なかったので、ラウンド１〜３は手動で実行された。４ラウンドから、選別手順は完全に自動化された。

一般的に、最高のストリンジェンシーをもつ鎖の選別されたＲＮＡ、すなわち、増幅においてなおゼロコントロールよりも上の有意のシグナルを発する最低のペプチド濃度と最大の洗浄容量によって選ばれたＲＮＡが次のラウンドに用いられた。閾値に到達するのに必要なサイクル数が、シグナルの計測のために用いられた（ＰＣＲの進捗の観測を参照）。結局、１６の選別ラウンドが実施された。

１４ラウンド（Ｄ−ＡＶＰ濃度：３０ｎＭ）からおよび１６ラウンド（Ｄ−ＡＶＰ濃度：１０ｎＭ）からのｄｓＤＮＡの母集団がクローニングされ、合計４８個のクローンが得られ、配列決定され、配列のアラインメントのあと、いくつかの群に分類された。最も結合能の高い分子群は図３に示されている。この群の全てのクローンは図３の配列のアラインメントの下部に示されている一般的な共通配列を持っていて、以下のような要素を持つ。最初に５’末端と３’末端の２つの相補的な領域（Ｈｅｌｉｘ１およびＨｅｌｉｘ２）があり、７個の対の長さの２本鎖へリックス。２番目に、ＧｕＧＧＷの配列の５個の長さの部分（Ｂｏｘ２）。３番目に、７〜９個のヌクレオチドの長さのＡ−ｒｉｃｈおよびＵ−ｒｉｃｈストレッチで、Ｃは決して現れなく、多くても１つのストレッチ辺り１つのＧは現れる。４番目にＧＧＧＧＵＡＧＧＧＭＵＵＧＧＡＷＧＧＧＷＡの配列の２１個の長さの部分（Ｂｏｘ２）。Ｂｏｘ２の主な特性は４つの厳密に保存された連続したＧで、２〜４回起こる。すべての具体的に記載された分子はＡＶＰへ結合し、最もよく結合するのは分子ＣＨＦ−１３４−Ａ９である。図３に図解されるＡＶＰ結合性分子に加えて、まったく異なった配列を持つ更なる分子は自動化された選別の間に濃縮された（示されていない）これらの分子は有意に悪い結合能を持つ。

自動化された選別に続くＤ−ＡＶＰ結合性のアプタマーの、手動で、変異導入的である高いストリンジェンシーの選別によるスクリーニング

Ａ． 材料
精密化学製品および酵素
実施例１を参照のこと

標的分子であるヒトのＤ−ＡＶＰ［Ｄ−（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン］
９アミノ酸のペプチドＤ−ＡＶＰ（アミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、配列番号１）はハイデルベルクのＢＡＣＨＥＭ社によって２つのバリアントで作られた。どちらのバリアントも、Ｐｉｅｒｃｅ社のニュートラアビジンアガロース（ＮＡａｇ）もしくはストレプトアビジン−ウルトラリンク＋（ＳＡｕｌ＋）を用いて、ビオチン−アビジン、もしくはストレプトアビジンとの相互作用を利用して、ペプチドに結合した核酸を結合しなかった核酸から分離することができるようにするため、カルボキシ末端にビオチン基を持っている。ビオチンは追加的に挿入されたリシンを介してカルボキシ末端のＧｌｙに結合していて、二つのバリアントは異なったリンカーがペプチド部分に結合している。アミノ−エトキシ−エトキシ−アセチルアミノ−エトキシ−エトキシ−アセチル（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡリンカー）からなる親水性のポリエチレングリコールのブリッジはビオチン付加したＤ−ＡＶＰ（Ｃ−Ｌｙｓ）を生じ
た。より疎水性のε−アミノヘキシル−εブリッジはビオチン付加したＤ−ＡＶＰ（Ｃ−ＬＣ−ＬＣ）を生じた。

異なった標的分子のバリアントを選んだ理由は、ＡＶＰのような小ペプチドの物理化学的性質はたとえばビオチンのような化学的な部分の修飾によって、大きな分子の時よりも比較的大きく変化するということがあるからである。

自然の標的分子からの逸脱は、選別の過程にて、高い親和性のためにリンカーを必要とする様な望ましくないアプタマーを導く可能性がある。結果的に高いストリンジェンシーの選別のために、手順は２つの異なったＡＶＰの派生物を常に変化させて、上に書かれた２つのアビジンマトリックスの構成物も変化させて実施されたが、これはペプチドに結合するのにリンカー領域を必要として、純粋にペプチドに対してのみ高い親和性によって結合するような望ましい分子を濃縮するのを妨げるような分子の濃縮を避けるためである。

核酸ライブラリーとオリゴヌクレオチドプライマー
実施例１を参照のこと

開始プール
手動で、変異導入する高いストリンジェンシーの選別は、自動化された選別の１６ラウンドから回収した２本鎖のプールされたＤＮＡをもって開始された。この目的のために１０ｐｍｏｌの１６ラウンドからのプールされたＤＮＡがＶｅｎｔ ｅｘｏ〜熱耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いた変異導入ＰＣＲによって増幅され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって試験管内で転写された。ＲＮＡは変性条件下で８Ｍ尿素入り８％ポリアクリルアミドゲルから精製され、抽出されアルコールによって沈殿され、選別のために水に入れられた（詳しくは酵素反応を参照のこと）。

Ｂ． 選別段階
ＲＮＡの変性およびフォールディング；使用されたＲＮＡの量
実施例１を参照のこと。変異導入の増幅による選別の開始時に、５００ｐｍｏｌの変異導入されたプールされたＲＮＡは１７ラウンドに用いられた。選別のうちに、ストリンジェンシーが上昇するに従って使用されるＲＮＡが少なくなった（２９ラウンドで５ｐｍｏｌ）。

マトリックスに結合するＲＮＡ種の結合および分離
実施例１を参照のこと

Ｄ−ＡＶＰ結合性リボ核酸の選別
Ｄ−ＡＶＰへの結合反応のために、選別の間にだんだんと少なくなっていく様々な濃度のビオチン付加したＤ−ＡＶＰが残ったＲＮＡ種へと加えられ、３０分間３７℃においてインキュベートされた。これに続いて、ペプチド量と用いられたマトリックスに応じて、３〜２０μｌの基質が結合バッチへ加えられ、１０〜１５分間、３７℃で震盪しなら一度以上インキュベートされた。マトリックスはそののち、結合していないＲＮＡ種を結合したものから取り除くために選別バッファーによって洗浄された。この目的のために用いられた洗浄容量は基質容量の５０〜２００倍の間である。

溶出
実施例１参照のこと。溶出は、自動化した選別ラウンドの最初の３回の手動で行われたラウンドと同様に実施された。

Ｃ． 酵素反応
転写−選別に用いられるＲＮＡの産生
実施例１を参照のこと。生成されたＲＮＡはゲル電気泳動によって変性条件下にて手動で専ら調製された。

逆転写
実施例１；逆転写−手動ラウンド１〜３を参照のこと

ＰＣＲ−非変異導入的
逆転写されたＲＮＡはまず、非変異導入的条件で系統的に増幅され（実施例１；ＰＣＲ−手動ラウンド１〜３を参照のこと）、これは、試験管内において直接的に転写されるため、もしくはあらかじめ変異導入的ＰＣＲ条件において増幅されるためである。

ＰＣＲ−変異導入的
ＤＮＡは、熱耐性ＤＮＡ ポリメラーゼが高い失敗率を持つような反応条件での２段階ＰＣＲプロトコールを用いて増幅され、ＤＮＡは変異導入された（（Ｆｒｏｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：３４７−３５３）。標準的な条件で増幅された１ｐｍｏｌのＤＮＡは１００μｌの容量（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．７；５０ｍＭ ＫＣｌ；５μｇ／ｍｌ ＢＳＡ；４．８２ｍＭ ＭｇＣｌ_２；０．８Ｍ
ベタイン；０．５ｍＭ ＭｎＣｌ_２；３．８５ｍＭ ｄＮＴＰ；０．５５ｍＭ ｄＧＴＰ；０．１２ｍＭ ｄＡＴＰ；０．１ｍＭ ｄＣＴＰ；２μＭ ＤＥ５．Ｒプライマー；２μＭ ＤＥ５．Ｔ７プライマー）において８ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで飽和に達するまで以下の温度プロファイルで増幅された：９５℃１分、６３℃１分、７２℃３分、全部で１０〜１６サイクル。反応後の増幅の進捗は８％のネイティブ・ポリアクリルアミドゲルにて確認された。変異導入の条件で増幅された１ｐｍｏｌのＤＮＡは上記の条件で再増幅された。２回目の変異導入ＰＣＲでの増幅のあと、ＤＮＡはアルコールで沈殿され試験管内で転写された。

Ｄ． 選別の手段
変異導入的ＰＣＲによる手動の高いストリンジェンシーの選別は１３ラウンド行われた（１７〜２９ラウンドは自動化された選別の中）。この時の条件は表１に示される。

これに関連して、選別の過程で、ペプチドの濃度はパラメーターのストリンジェンシーが上昇するに従い０．４ｐＭまで減少した。結合するものの中での競合によって最適の分子のみを選ぶためにＲＮＡは過剰に用いられた。それぞれのラウンドにおいて、選別条件を選択することおよび洗浄過程（マトリックスは、ペプチド−ＲＮＡの複合体を固定後、固定されたベッド容量の５０〜２００倍で洗浄された）によって１００００以上の減少率は達成された。

高いストリンジェンシーの選別の目的は、１６ラウンドの自動化された選別のあとに存在するＤ−ＡＶＰ結合性のＲＮＡプールから変異導入と選別によってより最適化された結合物を生成するためである。一般的に、それぞれのラウンドにおいて結合反応は異なったペプチドの濃度によって実行され（シグナル）、それと比較して、１回の反応はペプチドをまったく無しで行われた（コントロール）。最も低いペプチド濃度でも１以上のシグナル／コントロール比率を示している反応があとに続く選別のラウンドに採用された。表はこれら結合反応の条件のみを示している。

最初の４回の選別ラウンドのそれぞれにおいて、結合プールに可能な限り多くの多様性を生成するために、ＤＮＡは変異導入された。あとに続くラウンドにおいてＤＮＡは、更なる変異導入の前に、それぞれの場合で改良された結合物を濃縮するために、非変異導入的と変異導入的の交互に増幅された。最後の３ラウンドは更なる変異導入無しに実施された。２９ラウンドのあと、ＤＮＡはクローニングされ２４クローンの配列は決定された。

配列
機能的に結合に必須でない両方のプライマー部分の一定の領域以外の配列解析の結果はアラインメントして図４に示されている。２４クローン中、隣接した領域を除外した長さは４６〜４９塩基の間であり、３クローンは完全に同一であった。残りのものは非常に高い配列相同性を持っていて、それらは自動化した選別のあとの最適の結合物の群の構成物を含んでいる。自動化した選別のあとにもまだ存在していた残りの群は、変異導入の高いストリンジェンシーの選別の選別条件において消失した。すべての選別した分子はすでに図３で図示された典型的な共通配列を持っていて、それは４つの要素で、５’末端および３’末端のＨｅｌｉｘ１およびＨｅｌｉｘ２、Ｂｏｘ１、Ａ−ｒｉｃｈおよびＵ−ｒｉｃｈｗストレッチ、ならびにＢｏｘ２である。高いストリンジェンシーの選別条件で４つの要素は以下のように変化した。Ｈｅｌｉｘ１とＨｅｌｉｘ２は変化して、異なるがしかしいまだ相補的な配列を含んでいる。Ｂｏｘ１の５番目の位置は以前のＷの代わりにＵのみである（それゆえ決してＡではない。）。Ａ−ｒｉｃｈならびにＵ−ｒｉｃｈ Ｗストレッチにおいて多くても１ストレッチあたり１個あるＧの発生は減少した。自動化した選別のあと、１５クローンのうち９クローン、すなわち６０％はいまだ１ストレッチ辺り１個のＧを持っていたが、高いストリンジェンシーの選別ののち、２４クローン中６クローン、すなわち２５％のみが１ストレッチ辺り１個のＧを持っていた。Ｂｏｘ２において、自動化された選別ののち、１つのＷが２つの位置に現れたが、高いストリンジェンシーの選別ののち、この部分においていずれの分子でも１つのＡももはや存在しなくなった。しかし代わりに、いくつかの分子のこの部分に、Ｕに加えてＣが存在する。全体を通じてこの部分には決してＧが現れなかったので共通配列の中にＨが両方のこの一に存在する。このように、図４に見られたＬ−（Ａｒｇ^８）バソプレッシン結合性のＬ−ＲＮＡのための共通配列は、手動の高いストリンジェンシーの選別のあと２９ラウンドからおよび自動化された選別の１６番目のラウンドのクローンの配列解析から得られた。

順位付け
クローンはＡＶＰへの結合に関して試験された。すべてのクローンはペプチドへの結合性を示した。クローンＣＨＦ−１５７−Ｂ４は比較上最適の結合を示した。競合試験にお
いてＣＨＦ−１５７−Ｂ４は自動化した選別のあとの１６番目のラウンドからの最適のクローン（ＣＨＦ−Ａ９）と比較されて測定された。図５にあるようにこの試験において、ＣＨＦ−１５７−Ｂ４のビオチン付加ＡＶＰへの結合の解離定数は９．５ｎＭであり、ＣＨＦ−１３４−Ａ９のそれは１２０ｎＭであった。変異導入の高いストリンジェンシーの選別によって結合の品質はおおまかに見積もって１２倍進歩した。

内部ＰＥＧスペーサー部分の結合によるＡＶＰ結合性アプタマーの開発と切断

方法論
２段階の選別の過程（自動化した選別と手動で変異導入的な高いストリンジェンシーの選別）のあと、最適の結合物を基にして、ヌクレオシドの位置はＰＥＧのスペーサー部分もしくはＰＥＧ基（ヘキサエチレングリコール）の結合によって内部的に交換され、変異物は特異的に構築され化学的に合成された。この方法によって分子は短縮されその結合能はさらに最適化された。アプタマーＣＨＦ−１５７−Ｂ４（さらなる開発のためにＣＨＦ−Ｆ−０００と呼ばれる）はすべての選別された分子の中で最適の結合物であると証明された。この４７塩基の長さのアプタマーから開始して、競合的順位付け試験によって、合成された変異物はお互いにおよび開始分子と比較され、最適の短縮した分子は鏡像異性体すなわちＬ体核酸として合成された。

ＰＥＧスペーサー変異物の合成
構築され試験された変異物はＮＯＸＸＯＮ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ社によってヘキサエチレングリコールホスホアミダイトを用いて標準的なホスホアミダイト化学反応で合成され、脱保護ののち、調整された変性ゲル電気泳動（１２％ ＰＡＡ、８Ｍ尿素、Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡバッファー）によって精製され、電気溶出された。

競合的順位付け試験
この試験は放射活性物質で標識したアプタマーと非標識のアプタマーのＡＶＰ結合の競合に基づいている。ここで、標識されたアプタマーのそれ自身（非標識）に対する競合の強さを基準にし、それに対して変異物の品質が測定された。比較上、最も強く、基準よりも良く競合した分子は、さらなる変異物を分析する際の新しい基準として用いた。

基準のアプタマーはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって５’端を［γ^３２−Ｐ］（４００ＡＴＰ Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ブランスウィックのＨｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ社）で標識され、６０，０００〜１２００００ｃｐｍ／ｐｍｏｌの特異的な放射活性である。０．２ｎＭのアプタマーはそののち、ビオチン付加したＤ−ＡＶＰ（０．５ｎＭ）と過剰量の非標識のアプタマーと共に、もしくはコントロールとして非標識のアプタマー無しで選別バッファー内において１時間インキュベートされた。１μｌのＳＡｕｌ＋基質上への固定ののち、上清を捨て、５０〜１００μｌの選別バッファーでマトリックスを洗浄し、結合反応はシンチレーションカウンター（米国のＢｅｃｋｍａｎ社）によって測定された。

ＡＶＰ結合性アプタマーＣＨＦ−Ｆ−０００のＰＥＧスペーサーバリアント
自動化した選別のあとの１６ラウンドおよびあとに続く高いストリンジェンシーの選別のあとの２９ラウンドからのすべてのクローンの配列解析に基づいてＢｏｘ１とＢｏｘ２の間にあるアデノシン／ウリジン−ｒｉｃｈのＷストレッチは結局、分子をその機能に影響を与えること無しに短縮するために、ヌクレオシドを内部のＰＥＧスペーサーによって置き換えるのにもっとも好ましい領域であることがわかった。図６は試験されたバリアントを示していて、そこでは５’末端および３’真端は不変のままである。バリアントＣＨＦ−Ｆ−００８およびＣＨＦ−Ｆ−００９は他の全ての試験されたバリアントとコントロール的に、結合を完全に示さない。なぜなら、ＰＥＧスペーサーが明らかに分子にとって重要であるＢｏｘ２に位置しているからである。４４ヌクレオチドの長さのバリアントＣＨＦ−Ｆ−００９は、内部で３つのヌクレオシドによって短縮され、４７ヌクレオチドの長さの開始分子ＣＨＦ−Ｆ−０００がＡＶＰと結合するのと同様の結合でしかないが、最適の分子であると証明された。

分子の末端が不変のバリアントから離れて、図７に描かれたような、５’末端と３’末端がアデニン／ウラジンの豊富なＷストレッチの中に置かれ、ＰＥＧスペーサーがヘリックスの塩基と取って代わられたようないくつかのバリアントもまた試験された。今やアデニン／ウラジンの豊富なＷストレッチは連続的に短縮され、これと平行してｈｅｌｉｘもまた最外部の塩基対で短縮された。ＡＶＰと結合する試験された分子のうちで、ＣＨＦ−Ｆ−０３３（４０ヌクレオチド）およびＣＨＦ−Ｆ−０３７（３８ヌクレオチド）が最適と証明された。それらはコントロール分子であるＣＨＦ−Ｆ−００３およびＣＨＦ−Ｆ−０００とちょうど同じだけ結合した。Ｂｏｘ１の３’末端のＵが除かれた４つのバリアントは有意に悪く、このことはＢｏｘ１の重要性を明確に示し、完全な機能のためにはこの部分はＧＵＧＧＵからなるべきであることを示している。これに反して、Ａ−ｒｉｃｈおよびＵ−ｒｉｃｈストレッチの３’末端のＵ（ＣＨＦ−Ｆ−０３３およびＣＨＦ−Ｆ−０３７を参照のこと）は機能に影響を与えること無しに取り除くことが出来る。図８に２次構造モデルが示されているＣＨＦ−Ｆ−０３７は３８ヌクレオチドで、結合の質にまったく損失がないテストされた中で最短の分子であるので、鏡像異性体として産生され、生物物理学的に分析され、そして細胞培養試験において最終的に動物試験の効果を証明するために分析された。

３’末端にＰＥＧ付加した鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧの化学合成と調製
鏡像異性体は、動物実験での適用ののち、鏡像異性体の腎臓における排出を遅くするために、３’末端において共有結合で４０ｋＤａの大きなポリエチレン（ＰＥＧ）へと結合された。これによって大きくなった鏡像異性体によって有意により長い抵抗時間が達成され、そのことで血漿中の大きくなった鏡像異性体の長くなった効果が達成された。

試薬の固相合成
鏡像異性体はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、フライブルク）のAｋｔａＰｉｌｏｔ１００ シンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）によって２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホアミダイト化学反応（Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ｅｄ．Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，ｐ．８１−１１４，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９３）を介して固相合成された。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−，Ｌ−ｒＣ（Ａｃ），−Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−，Ｌ−ｒＵおよびヘキサエチレングリコールホスホアミダイトはマサチューセッツ州ウィルミントンのＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．社から得られた。前記合成はマサチューセッツ州ウィルミントンのＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．社の１０００Åの孔径を持つ３’−ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃ６ ＣＰＧで行われた。アセトニトリル中０．３Ｍのアビンドン（Ａｂｉｎｇｄｏｎ）（ＵＫ）のＣＭＳ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社のベンジルチオテトラゾール、３．５当量のアセトニトリル中０．１Ｍアミダイト溶液に相当する溶液が１５分のカップリング時間でのカップリングに用いられた。酸化キャッピングサイクルが用いられた。オリゴヌクレオチド合成に用いられた他の標準的な溶媒や試薬はＢｉｏｓｏｌｖｅ社（オランダ、バルケンスワード）より得られた。鏡像異性体は合成され（ＤＭＴ−ＯＮ）、脱保護ののち、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＳｏｕｃｅ１５ＲＰＣ Ｍｅｄｉｕｍを用いた分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された（Ｗｉ
ｎｃｏｔｔ Ｆ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７）。５’端のＤＭＴ基は８０％酢酸（３０分間、室温）で取り除かれた。２Ｍの水性酢酸ナトリウム溶液を加えた後、鏡像異性体はマサチューセッツ州ベッドフォード‘ＵＳＡ）のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社の５Ｋ再生セルロース膜を用いたタンジェンシャルフローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって脱塩された。精製された３’−端がアミノ基で修飾された鏡像異性体の収量は６５〜７５ＯＤ／μｍｏｌの範囲内であった。精製された鏡像異性体のＩＥＸ−ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＣＧＥ分析は図９、１０および１１に表わされる。

ＰＥＧ付加
ＰＥＧ付加（たとえばヨーロッパ特許出願ＥＰ １ ３０６ ３８２を参照）のために、精製された３’端がアミノで修飾された鏡像異性体（１８μｍｏｌ）は水（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）および５ｍｌのバッファーＡの混合液で溶解された。バッファーＡの調製：水をクエン酸一水和物（７．００ｇ）、ホウ酸（３．５４ｇ）、リン酸（２．２６ｍｌ）および１Ｍ水酸化ナトリウム（３４３ｍｌ）の混合液に加え、１リットルのストック溶液を作製した。このストック溶液は１Ｍ塩酸を加えることでｐＨ８．４に調製された。

鏡像異性体のｐＨ値は１Ｍの水酸化ナトリウムを加えることで８．５に調製された。４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（アラバマ州（ＵＳＡ）ハンツビルのＮｅｋｔａｒ Ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）は３７℃、０．６当量／３０分で加えられ、２．４当量７５％〜８５％の最大の転換が達成されるまで続けられた。ＰＥＧ−ＮＨＳエステルが加えられる間、反応混合液のｐＨは１Ｍ水酸化ナトリウムを加えることで８〜８．５の値で維持された。

ＰＥＧ付加された鏡像異性体はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＳｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体を用いて０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム中の水（バッファーＢ）およびアセトニトリル（バッファーＣ）の間のグラディエントでＲＰ−ＨＰＬＣ法で精製された。ＨＰＬＣカラムへのインジェクションの前に８Ｍ尿素’（４ｍｌ）、バッファーＡ（４ｍｌ）およびバッファーＢ（４ｍｌ）が反応混合液へ加えられ、９５℃１５分間熱せられた。過剰量のＰＥＧは５％のバッファーで溶出された。ＰＥＧ付加された鏡像異性体は１０〜１５％のバッファーＣで溶出された。ＨＰＬＣの精製度が９５％を越える産物を含んだ分画は合わせられ２Ｍの酢酸ナトリウム（４０ｍｌ）が加えられた。マサチューセッツ州ベッドフォード‘ＵＳＡ）のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社の５Ｋ再生セルロース膜を用いたタンジェンシャルフローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって脱塩されたのち、精製されたＰＥＧ付加された鏡像異性体は３５〜５０％の収量で得られた。２４０ｍｇの３’端がアミノ修飾された鏡像異性体から始めて、３９０ｍｇのＰＥＧ付加された鏡像異性体が得られた。精製された４０ｋＤａのＰＥＧ付加された鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧのＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析は図１２に示される。

鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７の等温熱量計測による生物物理学的性質

方法論
解離定数を決定するための熱量測定はＶＰ−ＩＴＣマイクロ熱量計（マサチューセッツ州ノーサンプトンのＭｉｃｒｏＣａｌ社）を用いて実施された。測定すべき鏡像異性体およびリガンド溶液は測定バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；１５０ｍＭ Ｎａｃｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１ｍＭ ＣａＣｌ_２）中で、３７℃、真空下で脱気された。前記鏡像異性体は装置の測定セル（セル容量：１．４３ｍｌ
）に２〜６μＭの量で加えられ、２５μＭのリガンド溶液は３μｌのイニシャルインジェクションのあと、測定セルへ６秒ごとに７．５μｌずつインジェクションされた。測定温度は３７℃で２回の連続したインジェクションの間の時間はそれぞれ５分間であった。

結果
非ＰＥＧ付加の鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７およびＰＥＧ付加の鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧのＬＡＶＰに対する、ならびにＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧのオキシトシンに対する測定の結果は表２にまとめられる。

鏡像異性体の解離定数は、ＰＥＧ付加および非ＰＥＧ付加のどちらのフォームでも、１．５ｎＭである。結果として、鏡像異性体はＡＶＰと非常に高い親和性をもって結合する。このことはそれがＡＶＰが関与している病状での治療に使用出来ることを意味する。類似の基質であるオキシトシンもおおまかに１０倍低い親和性で結合した。しかしながらこの親和性もまた鏡像異性体を用いてオキシトシンが関与する病状において満足出来る結果を得るのに十分である。ＡＶＰ結合性鏡像異性体の１．５ｎＭの解離定数は、以前の技術において既に知られているＤＮＡ鏡像異性体の解離定数に比べて、約６００倍良い（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＫＰ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１１２８５−１１２９０）。

鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７の細胞培養による生物学的性質

Ａ． 方法論
（Ａｒｇ^８）−バソプレッシンのＶ_２受容体への結合の、（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン結合性鏡像異性体による阻害の分析
この方法の基礎となるのはＡＶＰ−Ｖ２受容体の相互作用および結果として起こるｃＡＭＰの形成の阻害である。腎臓のＶ_２受容体を発現しているブタの腎臓上皮細胞細胞株ＬＬＣ−ＰＫ１（ＡＴＣＣ−ＣＬ−１０１）の細胞は９６穴マイクロタイタープレートへ１ウェル辺り６Ｘ１０^４個播種され、そして３７℃でかつ５％ＣＯ_２存在下で、追加的に熱非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ），４ｍＭ Ｌ-ａｌａｎｙｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎ（ＧＬＵＴＡＭＡＸ））、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含んでいるｍｅｄｉｕｍ １９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスルーエ）で培養された。

鏡像異性体は１ｍＭのＬ−ＡＶＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）とともにハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡの中で室温もしくは３７℃で０．２ｍｌ ｌｏｗ ｐｒｏｆｉｌｅ ９６−ｔｕｂｅプレート内でインキュベートされた。２μｌの５０ｍＭ ３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｌｘａｎｔｈｉｎｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から得たＩＢＭＸ溶液）は結合バッチを細胞へ加える直前に加えられた。細胞はＡＶＰ
／鏡像異性体バッチを加える２０分前に１ｍＭ ＩＢＭＸで前処理された。

刺激を与えるため培地は細胞から吸引され予めインキュベートされた結合バッチが加えられた。３７℃３０分インキュベーションののち、細胞上清は吸引され、細胞は５０μｌ／ｗｅｌｌの溶解バッファーで３７℃３０分間溶解された。溶解バッファーは”ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ^ＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ”キット（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ダルムシュタット）の構成物であり、これを用いて抽出物のｃＡＭＰの含有量が測定された。１０μｌの抽出物がそれぞれの場合の試験で用いられた。試験は製造者の使用説明書に従って実施された：

アッセイプレート（抗ウサギＩｇＧヤギ抗体がコートされている）内で、１０μｌ／ｗｅｌｌのライセートが、５０μｌの溶解バッファーへ加えられ、製造者の使用説明書に従って希釈された３０μｌ／ｗｅｌｌのｃＡＭＰ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｕｇａｔｅと混合された。震盪しながら室温で１時間インキュベーションが行われた。これに続いて、溶液はウェルから取り除かれ、供給された洗浄バッファーで６回洗浄された。検出のため、１００μｌ／ｗｅｌｌのＣＳＰＤ／Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＩＩ
ＲＴＵ基質が加えられ、３０分間室温でインキュベートされ、そして発光はＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ マルチプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ社、オッフェンブルグ）によって測定された。

（Ａｒｇ^８）−バソプレッシンのＶ_１受容体への結合の（Ａｒｇ^８）−バソプレッシン結合性鏡像異性体による阻害の分析
この方法の基礎と鳴るのはＡＬＶ−Ｖ_１受容体の相互作用およびそれに続くカルシウムの細胞内の放出の阻害である。血管のＶ_１受容体を発現している細胞株Ａ７ｒ５（ラット大動脈の平滑筋細胞由来、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１４４）の細胞は、透明の底を持つ黒色の９６穴のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社、フリッケンハウゼン）へ１ウェル当たり４ｘ１０^４個播種され、そして、３７℃および５％ＣＯ_２存在下で、追加的に１０％ウシ胎児血清、４ｍＭ Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＬＵＴＡＭＡＸ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含んでいるＤＭＥＭで培養された。

鏡像異性体は、５ｎＭのＬ−ＡＶＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、シュヴァルバッハ）と共に、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で０．２ｍｌ ｌｏｗ ｐｒｏｆｉｌｅ ９６−ｔｕｂｅプレート内で１５〜６０分間室温もしくは３７℃で、インキュベートされた。ＨＢＳＳは１μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５ｍＭプロベニシドおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳが補充されていた（ＨＢＳＳ＋）。

カルシウム指示薬、Ｆｌｕｏ−４が加えられる前に、細胞はそれぞれ２００μｌのＨＢＳＳ＋によって１度洗浄された。５０μｌの指示薬バッファー溶液（ＨＢＳＳ＋中、１０μＭ Ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社，ユージーン，オレゴン州），０．０８％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社））が加えられ、そして６０分間３７℃でインキュベートされた。こののち、細胞は３回、それぞれ１８０μｌのＨＢＳＳ＋で洗浄された。

蛍光シグナルの測定は、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ マルチプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ社）で、４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍ発光波長において実施された。

複数のサンプルの並列測定のため、９６穴プレートの（垂直の）列のウェルはそれぞれの場合で一緒に測定された。このために、ベースラインを設定するための３回の測定の値
ははじめに４秒のインターバルで計測された。測定はそののち中断され、プレートリーダーからプレートは取り除かれ、プレインキュベーションがすでに行われたｌｏｗ−ｐｒｏｆｉｌｅ ９６−ｔｕｂｅプレートから１０μｌの刺激溶液がマルチチャネルピペットを用いて計測すべき列のウェルに加えられた。プレートはそののち、プレートリーダーに再び挿入され測定が継続された（４秒インターバルで合計２０回の測定）。

得られた測定カーブから、それぞれのウェルの最大蛍光シグナルと刺激前の蛍光シグナルの差が決定され、そして鏡像異性体の濃度に対してプロットされた。

Ｂ． 結果
ＡＶＰ−Ｖ_２受容体の相互作用の阻害
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞でのＰＥＧ付加および非ＰＥＧ付加の鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７によるＡＶＰとＶ_２受容体の相互作用の阻害は図１３に示されている。生成されたｃＡＭＰ量は鏡像異性体の濃度に対してプロットされている。図式評価はコントロールのｃＡＭＰの量の５０％のみが生成される鏡像異性体の濃度、すなわちＩＣ５０が両方のケースで１ｎＭであると示す。同様のテストで約３μＭのＩＣ５０が見出されている既存の技術Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｋ Ｐ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１１２８５−１１２９０）ですでに知られているＡＶＰ結合性のＤＮＡ鏡像異性体の効率に比べて約３０００倍の進歩が、このように得られた。

ＡＶＰ−Ｖ_１受容体の相互作用の阻害
Ａ７ｒ５細胞におけるＡＶＰとＶ１受容体の相互作用のＰＥＧ付加および非ＰＥＧ付加の鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７による阻害は図１４に示されている。Ａ７ｒ５細胞は５ｎＭもしくは異なった濃度の鏡像異性体とともに３７℃でプレインキュベートされたＡＶＰによって刺激され、そしてそれによって誘導された細胞内カルシウム放出が測定された。図は、鏡像異性体の濃度上昇の機能による、シグナルの減少のパーセンテージを示す。シグナルは、鏡像異性体が存在しない時に測定した値を１００％とした（コントロールの％）。非ＰＥＧ付加の鏡像異性体は、ＡＶＰによって誘導される細胞内カルシウム放出を約６ｎＭの半有効濃度（ＩＣ５０）で阻害する。ＰＥＧ付加鏡像異性体は約７ｎＭのＩＣ５０値で阻害する。

鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７を投与後のラットの利尿の研究

Ａ． 実験手順
鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７およびその変異物で４０ｋＤａのＰＥＧ残基とともに供給されたＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧの生体内での効果をテストするために、利尿研究が２３９〜２９０ｇの体重のオスのＳｐｒａｇｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅｌｅｖａｇｅ ｊａｎｖｉｅｒ社、ＬＥ ＧＥＮＥＳＴ ＳＴ ＩＳＬＥ）を用いてａｕｒｉｇｏｎ
ＧｍｂＨ社（トゥッイング）にて行われた。

実験手順は、表３に図示されるように、静脈内、もしくは腹腔内に異なった濃度のＰＥＧ付加および非ＰＥＧ付加の鏡像異性体ならびに不活性のコントロール鏡像異性体およびコントロールとして精製されたバッファー溶液（ビークル）を受けた、それぞれが５匹の動物を含む７つの異なったグループを含む。

実際の実験の前に、合計３５匹の動物は−５日（研究の開始前）に研究室の環境に慣らされ、そして−２日にそれぞれ、２２±３℃、３０〜７０％の待機湿度の代謝ケージに入れられた。動物は自由で制限無しでいつでも滅菌した水とドライフード（Ｒ／Ｍ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｉｅｔ，ａｕｔｏｃｌａｖｅｄ；Ｓｓｎｉｆｆ Ｓｐｅｚｉａｌｄｉａｅｔｅｎ ＧｍｂＨ社、ゾエスト）にアクセス出来た。−１日に０〜６時間および６〜２４時間の水消費ならびに０〜２時間、２〜４時間、４〜６時間および６〜２４時間の尿量がそれぞれのグループの１匹の動物で測定された。

０日に薬物がグループＡ〜Ｅの動物に尾静脈へ静脈注射（ｉ．ｖ．）で２ｍｌ／ｋｇ体重の容量でボーラス投与として投与された。薬物がグループａおよびｂの動物に２ｍｌ／ｋｇ体重の容量で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）された。すべての動物はインジェクションの直前に体重が量られ、そして対応する投与量は計算された。テスト薬物の投与（０日）後、すべての動物の０〜６時間および６〜２４時間の水消費ならびに０〜２時間、２〜４時間、４〜６時間および６〜２４時間の尿量が測定された。集められた尿は２〜８℃で貯蔵され、そのオスモル濃度とナトリウム含有量は同様に０〜２時間、２〜４時間、４〜６時間および６〜２４時間の器官で測定された。この実験計画はローカルな監査機関（Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．２０９．１／２１１−２５３１．２−１４／０２）によってチェックされ許可を得た。

Ｂ． 結果
利用と水消費
図１５に示されるように、静脈を介して投与されたＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧはグループＡ（ビークルのみ）およびグループＢ（２０００ｎｍ／ｋｇの量の不活性の鏡像異性体）に比べてグループＣ、ＤおよびＥにおいて、尿量の濃度依存的な上昇を示した。この効果は投与後０〜２時間の期間続き、高い投与量のグループ（４００および２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）もまたさらに続く期間（２〜４時間および４〜６時間）続いた。非ＰＥＧ付加鏡像異性体ＣＨＦ−Ｆ−０３７の腹腔内投与（ｇｒｏｕｐ ｂ、２０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で同様に最初の２つの期間において尿量の上昇を実現した。０〜６時間の期間の動物の水消費は利尿効果に大部分、連関している；言い換えると、図１６に示されるようにラットがより多くの水を飲んだ期間では、より多くの尿量が測定される。尿量と水消費
のパラメーターに関して、後に続く６〜２４時間の期間においてはそれぞれのグループ間で有意なさはもはやなかった。

尿のオスモル濃度とナトリウム含有量
図１８および１９に示されるように、尿のオスモル濃度並びにナトリウム含有量は、静脈注射で活性のあるＰＥＧ付加鏡像異性体および活性のある腹腔内注射で非ＰＥＧ付加鏡像異性体を投与された動物においてコントロールグループの動物と比較して、濃度依存的に有意に低い。ここに、コントロール動物と比較された差違は、ＰＥＧ付加鏡像異性体の場合の最高用量での静脈内投与、並びに非ＰＥＧ付加鏡像異性体の場合の腹腔内投与後の６〜２４時間において未だ見ることができる。オスモル濃度およびナトリウム含有量の減少は鏡像異性体の特異的な作用の証拠である。ＡＶＰ−Ｖ_２受容体の相互作用の阻害は腎臓の集合管における水の再吸収の減少を導く。この結果、より多い水は排出される。しかしながら電解質はもはや排出されないので、活性のある鏡像異性体の投与のあと、濃度依存的に尿は有意により希釈される。ＡＶＰ結合性鏡像異性体はこのように、Ｖ２受容体拮抗薬とまったく同じように、利尿薬ではなく、水利尿として働く。

先行する著述ならびに請求項および図面に開示される本発明の特徴は、個別にならびにさまざまな態様における発明の遂行を自由に組み合わせにおいて、本質であることが出来る。

図１は自動化されたＲＮＡの選別の概略図である。 図２は試験管内の選別ロボットの作業空間の概略図である。 図３は自動化された試験管内の選別に続いて生じたＡＶＰ結合性のクローンの配列を示す。 図４は試験管内の選別に続いて生じたＡＶＰ結合性のクローンの配列および共通配列を示す。 図５は配列ＣＨＦ−１５−Ｂ４およびＣＨＦ−１３４−Ａ９の結合様式の比較を示していて、核酸の濃度に応じたＡＶＰへの結合がパーセントで表わされている。 図６は、内部のＰＥＧのスペーサー部分を用いた部位特異的な修飾および切り捨てのあとの配列の変異系と、ここから生じたコンセンサス共通配列を示していて、ここで変異体は不変の５’端および３’端を持つ。 図７は、内部のＰＥＧのスペーサー部分を用いた部位特異的な修飾および切り捨てのあとの配列の変異系と、ここから生じた共通配列を示していて、ここで変異体は不変の５’端および３’端を持つ 図８はＡＶＰ結合性の鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７の２次構造モデルの描写である。 図９は３’端をアミノ基で修飾した鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＮＨ_２の、ＩＥＸ−ＨＰＬＣの方法によって取得されたクロマトグラムである。 図１０は３’端をアミノ基で修飾した鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＮＨ_２の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって得られた質量スペクトルである。 図１１は３’端をアミノ基で修飾した鏡像異性体の、（ＣＧＥ）キャピラリーゲル電気泳動によって得られた電気記録図である。 図１２は４０ｋＤａのＰＥＧによって修飾された鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧの、ＲＰ−ＨＰＬＣによって得られたクロマトグラムである。 図１３は、鏡像異性体、ＣＨＦ−Ｆ−０３７およびＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧによるＡＶＰとＶ_２受容体の相互作用の阻害を示していて、鏡像異性体の濃度に応じたｃＡＭＰの生合成の減少が１ｎＭのＡＶＰの刺激に際のウェル当たりのｃＡＭＰの量で表わされている。 図１４ＡはＣＨＦ−Ｆ−０３７によるＡＶＰとＶ_１受容体の相互作用の阻害を示していて、鏡像異性体の濃度に応じた、５ｎＭＡＶＰの刺激による放出を１００％としたパーセントでの、カルシウムの放出のパーセンテージの減少が示されている。 図１４ＢはＣＨＦ−Ｆ−０３７−３’ＰＥＧによるＡＶＰとＶ_１受容体の相互作用の阻害を示していて、鏡像異性体の濃度に応じた、５ｎＭＡＶＰの刺激による放出を１００％としたパーセントでの、カルシウムの放出のパーセンテージの減少が示されている。 図１５は薬剤の投与の後のいろいろな期間の後の様々なラットの群の尿量を示した図表である。 図１６は薬剤の投与の後のいろいろな期間の後の様々なラットの群の水消費を示した図表である。 図１７は薬剤の投与の後のいろいろな期間の後の様々なラットの群の尿中のオスモル濃度を示した図表である。 図１８は薬剤の投与の後のいろいろな期間の後の様々なラットの群の尿中ナトリウム量を示した図表である。

Claims (17)

1. 下記式で表される核酸。
   5' GGGGUAGGGCUUGGAUGGGUAGUACAC - PEG group- GUGUGCGUGGU 3'
   式中
   各ヌクレオチドはＬ−ヌクレオチドであり、かつ、
   PEG groupは分子量１７２〜６８８ダルトンのポリエチレングリコール基である。
2. 請求項１に記載の核酸であって、前記核酸がバソプレッシンに結合することを特徴とする上記核酸。
3. ポリエチレングリコール基が分子量３４４ダルトンであることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸。
4. 請求項２または３に記載の核酸であって、前記バソプレッシンがヒトのバソプレッシンであることを特徴とする上記核酸。
5. 請求項２〜４のいずれかに記載の核酸であって、前記バソプレッシンが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする上記核酸。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の核酸であって、前記核酸が修飾を含み、かつ、修飾がヒドロキシエチル澱粉付加（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））およびポリエチレングリコール付加（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を含んでなる群から選択されることを特徴とする上記核酸。
7. 請求項６に記載の核酸であって、前記ポリエチレングリコール付加が直鎖または分岐ポリエチレングリコールによって行われ、かつ、前記ポリエチレングリコールの分子量が２０〜１２０キロダルトンであることを特徴とする上記核酸。
8. 請求項７に記載の核酸であって、前記ポリエチレングリコールの分子量が３０〜８０キロダルトンである、上記核酸。
9. 請求項７に記載の核酸であって、前記ポリエチレングリコールの分子量が４０キロダルトンである、上記核酸。
10. 請求項６に記載の核酸であって、前記ヒドロキシエチル澱粉付加がヒドロキシエチル澱粉によって行われ、かつ、前記ヒドロキシエチル澱粉の分子量が１０〜８０キロダルトンであることを特徴とする上記核酸。
11. 請求項１０に記載の核酸であって、前記ヒドロキシエチル澱粉の分子量が３０〜８０キロダルトンである、上記核酸。
12. 請求項１０に記載の核酸であって、前記ヒドロキシエチル澱粉の分子量が５０キロダルトンである、上記核酸。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸および追加的な構成要素を含んでなり、前記追加的な構成要素が製薬上許容される担体を含んでなる群のなかから選択されることを特徴とする製薬学的組成物。
14. バソプレッシンと、請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸とを含む複合体。
15. オキシトシンと、請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸とを含む複合体。
16. 請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸を含んでなるバソプレッシンおよび／もしくはオキシトシンの検出のためのキット。
17. バソプレッシンがアルギニンバソプレッシンである請求項１６に記載のキット。

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