CN101111598A - 结合加压素的l-核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合加压素的核酸，所述核酸的特征在于该核酸具有片段Box1和片段Box2，其中Box1具有序列GUGGW并且W＝A或U，优选W＝U，并且其中Box2具有约18－24个核苷酸，优选21个核苷酸的序列，并且(G)n四次包含于该序列中，其中n＝2、3或4。

Description

结合加压素的L-核酸
本发明涉及核酸、它们用于生产药物以及诊断剂的用途、由核酸和加压素形成的复合物，以及用于筛选加压素拮抗剂和加压素激动剂的方法。
人加压素，也称为(精氨酸8)-加压素(AVP)或称为抗利尿激素(ADH)，并且和催产素一样是环状的、9个氨基酸长的肽激素。这些是神经肽，其在下丘脑中合成后从前体蛋白加工产生。结合至10kDa载体蛋白，它们通过胞内运输进入存储它们的脑垂体后叶，并且在合适的刺激后经分泌进入血流，其中所述的载体蛋白从产生相应激素的相同前体蛋白加工而成。从氨基端开始，AVP具有序列：Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2(SEQ.ID.NO.1)，分子量为1085Da。催产素的序列只在位置3(Ile)和位置8(Lys)与AVP不同，并具有1007Da的分子量。除下丘脑和脑垂体以外，AVP和催产素还位于脑其它区域中的神经元中。同时，它们作为神经递质的作用已经得以确定(Reghunandanan V等，1998 Indian.J.Exp.Biol.36：635-43，Raggenbass M等，1998 Prog.Brain.Res.119：263-273)。
在周边，肽激素通过结合至特异性受体来表现它们的生理功能，所述的特异性受体都源于G-蛋白偶联的7-跨膜螺旋受体大家族，但是它们的药理学性质以及它们的细胞内“第二信使”不同(Michell RH等，1979 Biochem.Soc.Trans.7：861-865；Thibonnier M等，1998Advantage.Exp.Med.Biol449：251-276)。
AVP的主要生理功能在于调节肾游离水的吸收并从而维持体液的渗透压和血容量。其抗利尿作用通过AVP结合至肾V2受体来调节，所述的肾V2受体在集合小管上皮细胞的基底外侧膜处表达。AVP结合至受体后，G蛋白GS在细胞内结合，导致腺苷酸环化酶的激活并导致合成第二信使cAMP。在这之后，蛋白激酶A激活，其使蛋白磷酸化，这接着最初导致水通道蛋白-2-水通道(AQP-2)插入进上皮细胞细胞膜面向集合小管内侧的一边内。其次，引起了AQP-2mRNA的转录和这种蛋白的生物合成(HayashiM等，1994 J.Clin.Invest.94：1778-1783)。细胞膜内的AQP-2引起将水从尿再吸收进入生物体中。从而，尿量减少而尿的渗透压增加。如果没有再吸收机制，水的丧失将在非常短的时间内导致生物体脱水和死亡。AVP结合肾V2受体的解离常数是0.4nM(Lolait J L等，1992 Nature357：336-339)。
AVP的许多其它生理功能通过结合至V1受体来介导。位于血管平滑肌细胞表面的血管V1受体通过血管肌细胞肌收缩后的血管收缩来参与对血压的调节。在结合至受体并激活偶联的G蛋白后，磷脂酶C、D和A2激活，导致形成第二信使二酰基甘油和肌醇三磷酸。同时，激活了多种蛋白激酶，导致细胞内钙的动员，引起细胞外钙的流入，并导致钠+-H+通道的激活(Thibonnier M等，2000Am.J.Physiol.279：H2529-2539)。
激酶的激活导致细胞核内转录因子的激活，所述的转录因子在诱导早期立即反应基因后导致蛋白质含量增加并导致细胞增殖(Geisterfer A A T等1989 Hypertension 14：413-420)。除了血管平滑肌细胞外，AVP的这种促有丝分裂作用还发现于多种永久细胞系中和肾小球系膜细胞、肝细胞和肾上腺皮质的肾小球细胞中。
除了位于血管外，V1受体还发现于肝脏中(在那里AVP激活后发生糖原分解)、发现于肾上腺皮质中(在那里AVP激活后分泌醛固酮)、发现于胰腺中(在那里发生胰岛素分泌)、发现于心脏心房的心肌细胞中(在那里发生心房钠尿肽的释放)、发现于血小板中(在那里发生血小板集聚)、发现于脾、肾、脑、子宫、脂肪细胞和多种细胞培养系中(Jard S 1998 In：ZinggH H等eds 449：1-13，ThibonnierM等，2001 Annu.Rev.Pharmacal.Toxicol.41：175-202)。AVP与血管V1受体结合的解离常数是1.2nM(Thibonnier M等，1994J.Biol.Chem.269：3304-3310)。这种受体只在肾V2受体已经完全得以激活的AVP浓度下反应。
第三种加压素受体V3位于脑垂体的内部脑叶中。在促肾上腺皮质细胞中，它通过AVP激活后可调节促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌。V3受体能够激活多种信号转导途径，通过腺苷酸环化酶形成cAMP作为第二信使的途径，以及通过磷脂酶C的途径，其导致细胞内的钙动员(Thibonnier M1997 Endocrinology138：4109-4122)。
催产素通过结合至催产素受体来调节它的外周作用，所述的催产素受体位于子宫、卵巢、乳腺和肾中。催产素刺激乳房的乳液分泌，并且在分娩过程中积极作用于子宫的收缩。催产素受体，在结合配体以及AVP V1受体后引起钙的细胞内动员。
充血性心力衰竭(CHF)是许多不同医学疾病晚期的特征，主要由高血压和冠心病(心肌梗塞、心绞痛)引起，特征是弱的心脏泵送能力，其随着疾病严重性增加伴随有强度运动时的呼吸暂停、水储留于肺和组织中、低钠血和静止时的呼吸困难。除老年人以外，特别受影响的那些人包括先前有心肌梗塞的患者。如果未经治疗，该疾病将在其发作后短期内导致死亡，因为由于心肌细胞肥大而存在心脏结缔组织持续变形，其中心脏功能愈加衰减。一旦心脏功能开始衰退，将引起神经激素的反调节，其中交感神经系统(SNS)和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活而直接导致血管收缩。心输出量从而开始上升，但是在一定时期后持续的血管收缩超过了心肌负荷，并且心肌细胞和肥大细胞的死亡导致增加了上面已经谈及的心肌的结缔组织变形。
显著增加的AVP血浆水平也发现于CHF中，这最可能是由激活的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(血管紧张素II刺激AVP分泌)和刺激下丘脑中AVP合成的激活的交感神经系统引起(Schrier R W等，1998 Adv.Exp.Med.Biol.449：415-426，Schrier R W等，1999N.Engl.J.Med.341：577-585)。上升的AVP血浆水平导致肾中水的反向再吸收加强，使患者具有前面提及的后果。
因此，肽激素是最新治疗这种医学疾病的一个明显靶标，因为使用AVP受体拮抗剂能够达到利尿效果，其通过减小水负荷以及减小外周血管阻力并从而减小对心脏的胁迫来达到。AVP的直接血管收缩作用，其可能较小程度地引起充血性心力衰竭，也能够用AVP拮抗剂来控制。此外，有证据证明，AVP基于它的促有丝分裂作用而对心肌的肥大结缔组织的变形起直接作用(Nakamura Y等，2000Eur.J.Pharmacol.391：39-48)。从而，AVP拮抗剂不仅能够在短期治疗急性充血性心力衰竭中起作用，而且从长远观点来看可通过抑制AVP介导的肥大而能够改善心肌状况。
因为CHF是唯一最普遍的心肌疾病，它的发生频度在近年来已经增长并且对医疗保健系统施加了巨大压力，因此急切需要改良的治疗。一旦意识到充血性心力衰竭和激活的RAAS和SNS之间的联系，目前的标准治疗包括提供调节激活的RAAS的血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，并且包括提供抑制激活的SNS的β阻断剂，也包括施用利尿剂，如噻嗪类、髓袢利尿剂和保钾利尿剂。尽管存活概率通过联合治疗而明显增加，但是患者不可避免地必须再住院治疗，所以非常需要改良的疗法。利尿剂的长期施用可能会损害肾并导致电解质平衡失调。
直接靶向AVP的作用的治疗CHF的新方法是基于使用对抗上面提及的V1和V2受体的受体拮抗剂(Lee C R 2003 Am.Heart J.146：9-18)。存在一系列的苯并氮杂类的非肽类受体拮抗剂，其可以经口施用并能够高亲合性(抑制常数Ki为0.5nM-3nM，Thibonnier M等，2001Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41：175-202)地特异性结合V1和V2受体之一或两者。一些受体拮抗剂在成功的动物研究和小型临床试验后正在进一步开发。
V2受体拮抗剂托伐普坦在对同时接受标准治疗的CHF患者的安慰剂对照双盲试验中显示，其明显减轻了水潴留增加的患者的水肿和体重减轻(Gheorghiade M等，2000 Circulation 102：592)。在低钠血患者中，存在血浆中钠浓度的正常化作用(Gheorgbiade M等，2002J.Am.Coll.Cardiol.39：171)。
最广泛开发的V1/V2受体拮抗剂考尼伐坦也已经证明对CHF患者是有效的。在单次静脉内施用后，所谓的“肺毛细血管楔压”减小表明心脏的压力减小。另外据报道，在用考尼伐坦治疗后尿量增加而尿的渗透压减小(Udelson J E等，2001 Circulation 104：2417-2423)。
考尼伐坦对CHF患者中存在的心脏肥大的可能积极效果在原代心肌细胞的细胞培养研究中得以证明，其中通过V1受体由AVP而诱导的蛋白质合成可以以剂量依赖性的方式受到抑制(Tahara A等，1998Cardiovasc.Res.38：198-205)。
在用AVP受体拮抗剂长期治疗CHF患者后有关安全性、发病率和死亡率的数据和试验仍然没有，这表示还不能够正确评估先前试验中发现的治疗充血性心力衰竭的积极效果的真正价值(Russel S D2003Am.J.Cardiovasc.Drugs 3：13-20)。
因而，本发明的目的是提供用于治疗归因于或由上升的AVP血浆水平引起的病症的试剂。本发明的另一目标是提供作为AVP受体拮抗剂替代品的新AVP拮抗剂，所述的新AVP拮抗剂能够特别用作AVP受体拮抗剂的备选品。然而本发明的另一个目的是提供对AVP具有高特异性的拮抗剂。
在第一个方面，本发明目的通过加压素拮抗剂来实现，其中拮抗剂是核酸。在优选实施方案中，所述的核酸是结合加压素的核酸，特别是L-核酸。在进一步的实施方案中，加压素是在此描述的人加压素。然而在另一实施方案中，核酸是与本发明多个方面有关的已经在这里公开了的核酸。在进一步的实施方案中，根据本发明第一个方面的这种核酸包括经描述了的与本发明多个方面有关的一个或多个特征。
在第二个方面，本发明目的通过加压素受体系统的拮抗剂实现，其中拮抗剂是优选通过结合至配体(Arg8)-加压素来显示其作用的核酸。在一个实施方案中，所述核酸包含至少一种L-核苷酸，并且优选该核酸包含L-核酸。在进一步的实施方案中，核酸是与本发明多个方面有关的已经在这里公开了的核酸。然而在另外的实施方案中，根据本发明第一个方面的这种核酸包括已经描述与本发明多个方面有关的一个或多个特征。在优选实施方案中，加压素受体系统是加压素受体V2(Lolait J L等，1992 Nature 357：336-339)、加压素受体V1(Thibonnier M等，1994 J.Biol.CheM.269：3304-3310)或加压素受体V3(Thibonnier M 1997 Endocrinology 138：4109-4122)。
在第二个方面，所述目的通过结合加压素的核酸实现，其中核酸包含序列Box1和序列Box2，
其中Box1包含序列GUGGW并且W＝A或U，优选W＝U，并且
其中Box2包含约18-24个核苷酸的序列，优选包含21个核苷酸，并且一组(G)n四次包含于该序列中，其中n＝2、3或4。
在第三个方面的实施方案中，考虑在5’-3’方向的第一组(G)n中n＝4，在5’-3’方向的第二组(G)n中n＝3，在5’-3’方向的第三组(G)n中n＝2，并且在5’-3’方向的第四组(G)n中n＝3。
在第三个方面的实施方案中，设想Box2包含序列GGGGUAGGGMUUGGAHGGGHA，
其中
M在所有情况下并独立地是A或C，并且
H在所有情况下并独立地是A、C或U。
在第三个方面的优选实施方案中，考虑U或C，优选U存在于位置H上。
在第三个方面的实施方案中，考虑核酸包含序列Helix1和序列Helix2，其中Helix1和Helix2在所有情况下都包含5-9个核苷酸，优选6-7个核苷酸并且更优选7个核苷酸，并且序列Helix1和Helix2彼此互补并优选形成双链螺旋。
第三个方面的一个优选实施方案中，考虑双链螺旋是在末端形成。
第三个方面的实施方案中，考虑核酸包含W序列，其中W序列包含0-10，优选6-9个核苷酸，或备选包含0-7个核苷酸。
在第三个方面的优选实施方案中，考虑W序列(a)只由一个或多个A和/或U组成，或者(b)由一个或多个A和/或U以及G组成。
在第三个方面的实施方案中，考虑W序列包含PEG基团。
在第三个方面的优选实施方案中，考虑PEG基团位于W序列的5’-末端或位于W序列的3’-末端或在W序列的两个核苷酸之间。
在第三个方面的实施方案中，考虑核酸包含PEG基团。
在第四个方面，目的通过根据式(I)的核酸，优选为根据第一个、第二个或第三个方面的核酸实现
Figure A20058004737900171
(式I)
其中
Helix1包含7个核苷酸
Helix2包含7个核苷酸
Helix1和Helix2彼此互补并形成末端双链螺旋。
Box1是GUGGW，其中W＝A或U，优选为U。
W序列WWDWDDWWW包含6-9个核苷酸，其中
D单独且独立地可以是A、G或U，并且其中优选W序列(a)只由一个或多个A和/或U组成，或者(b)由一个或多个A和/或U以及G组成。
Box2是约18-24个核苷酸，优选为21个核苷酸的序列，并且一组(G)n四次包含于Box2的序列中，其中n＝2、3或4。
从式(I)可以看出，根据本发明的核酸在一个实施方案中具有共有结构。就此而论，共有结构包含两个互补区，即在5’-末端的Helix1和在3’-末端的Helix2，其作为核酸一级结构相互配对的结果而在共有结构内形成末端双链螺旋。更优选地，螺旋具有7个配对核苷酸的长度。在5’-3’-方向，紧跟第一个互补区域之后的是Box1，所述的Box1优选由序列GUGGW的5个核苷酸组成，其中W表示A或U，其中优选U存在于该位置。紧跟这个序列之后的是6-9个核苷酸长的富含A和富含U的区域，称为W序列，其中主要存在有W，很少存在G并且不存在C。然后紧跟所述区域之后的是21个核苷酸长的Box2，其优选具有下列序列，即GGGGUAGGGMUUGGAHGGGHA，其中M表示A或C，并且H表示A或C或U，其中H出现的位置上它优选表示U或C，并且更优选表示U。Box2的一个典型特征是四个严格保守的G出现2到4次。在5’-3’-方向，紧跟Box2之后的是第二个互补区，称为Helix2，其与位于5’-末端的互补区形成末端双链螺旋。
式(I)
共有序列：
Figure A20058004737900181
在第五个方面，所述目的通过根据式(II)的核酸，优选为根据第一个、第二个或第三个方面的核酸实现。
Figure A20058004737900182
其中
Figure A20058004737900183
表示PEG基团，
t和u彼此单独且独立地是0、1、2、3、4或5，其中t+u是0、1、2、3、4或5；并且
其中
Helix1、Helix2、Box1和Box2如第四个方面相关的定义；并且
W＝A或U。
从式(II)可以看出，根据本发明的核酸在一个实施方案中具有如式(I)中的共有结构，不同的是在Box1和Box2之间的富含A和富含U的序列由PEG-(六乙二醇)间隔物和0-5个W组合而成，并且PEG间隔物在富含A和富含U的序列中的位置是可自由改变的。在根据式(II)的根据本发明的核酸中这个序列称为PEG+W。
式(II)
共有序列：
Figure A20058004737900191
Figure A20058004737900192
：PEG间隔物
在第六个方面，目的通过根据式(III)的核酸，优选根据第一个、第二个或第三个方面的核酸实现。
Figure A20058004737900193
其中
Figure A20058004737900194
表示PEG基团，并且
其中
Helix1和Helix2在各个情况中都包含6或7个核苷酸，优选为6个核苷酸，
Helix1和Helix2彼此互补并形成双链螺旋，
Box1和Box2如与第四个方面相关地定义，其中W序列WWWWWWW由0-7个W组成，其中W＝A或U，并且优选W不存在于式(III)中，并且
在5’-3’-方向中PEG基团位于Helix2和Helix1之间。
从式(III)可以看出，根据本发明的核酸在一个实施方案中包含如式(II)中的共有结构，但是具有下列的不同。改变了5’-末端和3’-末端的位置，使得根据本发明核酸的5’-末端处于富含A和富含U的序列中，并且3’-末端位于Box1的末端。W序列由0-7个W，优选为0个W组成。Box1和Box2包含如式(I)和(II)中说明的序列，由5和21个核苷酸组成。互补区域Helix1和Helix2在所有情况下都由6或7个核苷酸，优选为6个核苷酸组成，它们形成双链螺旋。PEG间隔物不再处于富含A和富含U的序列中，而是从5’-3’-方向看位于Helix2末端和Helix1起始端之间。紧跟Helix1之后是Box1，如已经提到的，Box1的3’末端形成根据本发明核酸的3’-末端。
式(III)
共有序列：
Figure A20058004737900201
Figure A20058004737900202
：PEG-间隔物
：PEG间隔物
根据本发明的核酸还包括在下列表中列出的核酸，其也在此确定为根据本发明的核酸。就此而论，使用的缩写和符号与在本文中定义的那些一致。
Figure A20058004737900211
其中---表示PEG基团，如于此定义的。
在第六个方面的实施方案中，考虑在5’-3’方向的第一组(G)n中n＝4，在5’-3’方向的第二组(G)n中n＝3，在5’-3’方向的第三组(G)n中n＝2，并且在5’-3’方向的第四组(G)n中n＝3。
在从第一至第六个方面，特别是第四至第六个方面的实施方案中，考虑PEG基团具有约172-688Da，优选约344Da的分子量。
在从第一至第六个方面的实施方案中，考虑序列选自包含SEQ.ID.NO.2至SEQ.ID.NO.50的序列。
在第四至第六个方面的实施方案中，考虑所述核酸结合加压素。
在一个优选的实施方案中，考虑所述的加压素是人加压素。
在第一至第六个方面的实施方案中，考虑所述的加压素具有根据SEQ.ID.NG.1的氨基酸序列。
在第一至第六个方面的实施方案中，考虑核酸包含修饰。
在一个优选的实施方案中，考虑修饰选自HES化和PEG化。
在一个优选的实施方案中，考虑PRG化通过直链或支链的PEG实现，其中PEG的分子量是约20-100kDa，优选约30-80kDa，并且更优选约40kDa。
在一个优选的实施方案中，考虑HES化由HES实现，其中HES的分子量是约10-130kDa，优选约30-80kDa并且更优选约50kDa。
在第一至第六个方面的实施方案中，考虑所述核酸完全由L-核苷酸组成。
在第七个方面，所述目标通过包含根据1-6个方面之一的核酸和任选的其它成分的药物组合物来实现，其中其它成分选自可药用载体。
在第八个方面，所述目标通过使用根据1-6方面之一的核酸来生产药物而得以实现。
在第九个方面，所述目标通过使用根据1-6方面之一的核酸来生产诊断剂而得以实现。
在第九个方面的实施方案中，考虑所述药物用于治疗和/或预防充血性心力衰竭，优选用于短期治疗，并且更优选用于治疗和/或预防急性失代偿性的充血性心力衰竭。
在第九个方面的一个备选实施方案中，考虑药物用于治疗和/或预防疾病，其中疾病是选自高血压、冠心病、心肌梗塞和心绞痛(anginapectoris)的病症的后遗症。
在第九个方面的实施方案中，考虑患者是老年人或以前患有心肌梗塞的患者。
在第九个方面的一个备选实施方案中，考虑药物是用于预防和/或治疗高血压的药物。
在第九个方面的其它备选实施方案中，考虑药物是用于治疗和/或预防心肌肥大，更特别地是通过(精氨酸8)-加压素调节的心肌肥大的药物。
在第九个方面的一个实施方案中，考虑药物是用于预防和/或治疗水肿的药物。
在第九个方面的一个实施方案中，考虑药物是用于减轻水潴留(water retention)增加的患者的体重的药物。
在第九个方面的一个实施方案中，考虑药物是用于治疗患有低钠血的患者或用于预防低钠血的药物。
在第九个方面的一个实施方案中，考虑药物是用于治疗和/或预防ADH分泌不足的综合征的药物。
在第九个方面的一个优选实施方案中，考虑ADH分泌不足的综合征伴随有至少一种其它的症状，其中其它的症状选自抗利尿、低钠血和体液摩尔渗透性浓度降低。
在第九个方面的一个实施方案中，考虑ADH分泌不足综合征具有至少一个原因，其中原因选自肿瘤的异常ADH分泌、药物引起的ADH分泌、肺部疾病，以及在颅-脑外伤或脑膜炎后中枢渗透压感受器变化。
在第九个方面的一个备选实施方案中，考虑药物是用于预防和/或治疗与肝硬化相关的低钠血的药物。
在第九个方面的一个备选实施方案中，考虑药物是用于治疗和/或预防脑水肿尤其是在颅-脑外伤或在中风后的脑水肿的药物。
在第九个方面的一个备选实施方案中，考虑药物是用于治疗和/或预防颅-脑外伤和/或中风的药物。
在第九个方面的一个备选实施方案中，考虑药物是用于治疗和/或预防肿瘤的药物。
在第九个方面的一个优选实施方案中，考虑至少某些形成肿瘤的细胞表达至少一种受体，其中受体选自V1受体、V2受体和V3受体。
在第九个方面的进一步优选的实施方案中，考虑肿瘤选自ACTH分泌瘤、小细胞支气管癌和乳腺癌。
在第九个方面的一个备选实施方案中，考虑药物是用于预防早产的药物。
在第九个方面的其它备选实施方案中，考虑药物用于预防和/或治疗原发性痛经。
在第十个方面，所述目标通过包含加压素和根据1-6方面之一的核酸的复合物来实现。
在第十一个方面，所述目标通过包含催产素和根据1-6方面之一的核酸的复合物来实现。
在第十二个方面，所述目标通过用于筛选加压素拮抗剂或加压素激动剂的方法来实现，所述的方法包括下列步骤：
-提供候选加压素拮抗剂和/或候选加压素激动剂，
-提供根据1-6方面之一的核酸，
-提供在有加压素拮抗剂和/或加压素激动剂的情况下产生信号变化的测试体系，并
-测定候选加压素拮抗剂是否为加压素拮抗剂，和/或候选加压素激动剂是否为加压素激动剂。
在一个实施方案中，考虑加压素是(精氨酸8)-加压素。
在第十三个方面，本发明通过用于筛选加压素激动剂和/或加压素拮抗剂的方法来实现，所述的方法包括下列步骤：
-提供某种相形式的加压素，优选固相，
-提供根据1-6方面之一的核酸，优选根据1-6方面之一的经标记的核酸，
-加入候选加压素激动剂和/或候选加压素拮抗剂，并
-测定候选加压素激动剂是否为加压素激动剂和/或候选加压素拮抗剂是否为加压素拮抗剂。
在一个实施方案中，考虑测定通过确定核酸是否由候选加压素激动剂置换来完成。
在第十四个方面，所述目标通过包含根据1-6方面之一的核酸的，用于检测加压素和/或催产素，优选为精氨酸-加压素的试剂盒来实现。
本发明人已经惊讶地发现，能够筛选特异性结合至(Arg8)-加压素的核酸，并且特别是L-核酸。根据本发明的核酸优选为核糖核酸并且更优选为L-核糖核酸。根据本发明的结合(Arg8)-加压素的核酸分子与现有技术中描述的结合加压素的DNA分子比较具有令人惊讶的改进(Williams K.P等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：11285-11290)，因为现有技术中描述的DNA分子在体外只具有0.9μM的解离常数。在细胞培养试验中，现有技术的这种DNA分子具有大约3μM的IC50并因而由于其与加压素弱结合从而作为可能有希望的治疗剂大打折扣。最后，根据现有技术的结合(Arg8)-加压素的DNA分子与根据本发明的核酸比较也不是有利的，因为其具有55个核苷酸长度，这将涉及相当大的生产力度和花费。与这种DNA分子比较，根据本发明的核酸具有好于数个量级的提高的亲合力(解离常数：1.5nM，通过等温量热仪测量；在cAMP细胞培养试验中的IC50：1nM)，短多达17个核苷酸，并且，如实施例中更详细的描述中显示的，其在体内并在37℃下也是有活性的。根据这些，本发明者已经证明专家们基于现有技术一般持有的观点，即结合(Arg8)-加压素的核酸不适合用于治疗目的，是不成立的。
此外，本发明人已经惊讶地确定，迄今已经证明了的AVP受体拮抗剂的所有积极作用，例如增加利尿而不破坏电解质平衡、减轻心脏压力或可能抑制心肌肥大，用根据本发明的化合物也能够达到。
根据本发明的核酸的其它优势在于，与根据现有技术的AVP受体拮抗剂比较，它们有利于长期的治疗。在使用根据现有技术的AVP受体拮抗剂的治疗中，可能发生伴有血浆中AVP浓度升高的反调节，这在长期的治疗情况中最终可能会减小拮抗剂的作用。即使该反应在使用根据本发明的核酸时会发生，但相对高的剂量能够自身中和非生理性的高AVP血浆水平。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的核酸也包括与此处特定公开的序列基本同源的那些核酸。术语“基本同源”在这里优选理解为，同源性是至少75％，优选85％，更优选90％并且最特别优选大于95、96、97、98或99％。
根据本发明的核酸优选为由核糖核苷酸组成的那些核酸。然而，在本发明范围内单个核苷酸作为2’-脱氧核糖核苷酸或其它变体，例如2’-O-甲基核糖核苷酸，或LNA核苷酸存在于分子中是可能的。然而，如果核酸完全由核糖核苷酸组成是最优选的。
根据本发明的核酸优选以小于10nM的解离常数Kd(通过等温量热仪测量)在37℃下的溶液中结合至加压素。
根据本发明的核酸在一个优选的实施方案中还可以结合至催产素。
在本发明范围内，在一个实施方案中根据本发明的核酸还包括是更长的核酸的一部分的那些核酸，其中这些更长的核酸可以包含多个部分，至少一个部分是根据本发明的核酸或其部分。这些更长的核酸的另一部分或其它部分可以是D-核酸或L-核酸。每一部分和任何组合可以与本发明协同使用并用于如在这里公开的有关根据本发明核酸的目的和用途。更长的核酸的这一另外的部分或这些其它部分可能具有异于结合，并特别异于结合至加压素和/或催产素的功能。一种可能的功能是例如，为了固定、交联、测定、扩增或修饰而允许与其它分子相互作用，或者是增加分子量。
在另外的方面，本发明涉及由根据本发明的至少一种核酸和一种或多种其它核酸组成的药物组合物，其中所述其它核酸优选结合靶分子而不是(Arg8)-加压素，或者其发挥与根据本发明核酸不同的作用。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸以经修饰的形式存在。特别优选的修饰形式是PEG化或HES化。这涉及通过聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)或其它基团的结合来修饰根据本发明的核酸，这已经在欧洲专利申请EP 1 306 382中描述并在这里参考和引入其公开内容。
优选地，以这种方式修饰(即PEG化)的根据本发明的核酸的分子量是约2,000-200,000Da.，优选40,000-120,000Da。
核酸的HES化例如在德国专利申请DE1 2004 006 249.8中描述。在这方面使用的羟乙基淀粉(HES)优选具有数均分子量3-100,000Da，并更优选为5,000-60,000Da。
使用生理学可接受的高分子量聚合物(例如聚乙二醇(PEG)或羟乙基淀粉(HES))来修饰根据本发明的核酸的优势是，根据本发明的核酸的排泄动力学得以改变。不希望受任何理论来束缚，已经以这种方式修饰了的根据本发明的核酸的这种行为是基于这样的事实：由于由此而修饰的根据本发明的核酸的分子量增加以及它们的代谢活性降低，特别是如果这些酸是作为L-核酸存在，它们从生物体，特别是哺乳动物生物体的排泄得以减缓。由于排泄通常通过肾发生，则现在假定肾对已经以这种方式修饰的根据本发明的核酸的肾小球滤过率与未修饰核酸的根据本发明的肾小球滤过率比较明显减小，这导致与对应的但未经修饰的根据本发明的核酸，特别是未修饰的L-核酸比较，经修饰的根据本发明的核酸，特别是经修饰的根据本发明的L-核酸的滞留时间(即生物学半衰期)延长。在这方面特别值得注意的是这样的事实，即尽管修饰存在于优选的实施方案中，但是以这种方式修饰的根据本发明的核酸没有明显地丧失它们的特异性。因此，根据本发明的核酸，特别是它们的修饰形式，十分令人惊讶地显示出通常不能另外在其它药学活性化合物(即例如储库制剂形式的广泛的盖仑制剂)中实现的特性，所述的特性是可以省去连续释放活性成分，取而代之的是对讨论的活性成分的实行直接修饰而不会使其生物学活性(特别表示为与各个靶分子的反应或形成复合物的特异性)受到不利影响。采用储库制剂形式的经修饰的根据本发明的核酸是在本发明范围之内。
以未修饰的形式存在，即不含修饰的根据本发明的核酸也在本发明范围之内，这减少了在它们的生产中涉及的工作和花费。尤其在对特别医护中的急性失代偿性充血性心力衰竭的治疗(包括静脉内输注)中，根据本发明核酸的这个实施方案在剂量可以很好控制方面是特别有利的并且它可以在希望达到通过利尿来迅速排泄或血浆中短的半衰期的情况下使用。
由于根据本发明核酸的高度稳定性，尤其在其中这些作为L-核酸存在的实施方案中，直接施用根据本发明的核酸来治疗需要该治疗的患者是可能的。优选地，根据本发明的核酸可作为用于局部或全身施用的生理溶液。优选地，药物组合物用于静脉内施用。然而，在本发明范围内，这种药物组合物通过肌内、腹膜内或皮下施用也是可能的。根据本发明的核酸优选包含或溶解于可药用溶剂中。这样的溶剂特别是选自生理盐溶液、PBS或葡萄糖溶液，特别是5％的葡萄糖溶液的那些溶剂。
根据本发明的核酸可以用来生产药物也可用来生产诊断剂。诊断应用或使用在这方面是基于根据本发明核酸和加压素(尤其是(Arg8)-加压素和/或催产素，它们全体或个别地在这里也表示为靶分子)之间的特异性相互作用。由于在这里描述的多种病症和疾病中涉及的加压素和/或催产素与根据本发明核酸的用途方面(用于生产药物)相关，在本发明范围内使用根据本发明的核酸来确诊这些病症是可能的。在相应的诊断方法的内容中，靶分子浓度优选通过与根据本发明的一种或多种核酸的相互作用来确定。这种相互作用可以例如通过这样的事实检测：在用于测定体液中的(Arg8)-加压素浓度的竞争性试验测定法中，经标记的加压素示踪物与根据本发明核酸的结合与源于体液的(Arg8)-加压素竞争。
根据本发明的核酸可用于治疗的病症直接或间接地与接受治疗的生物体，特别是哺乳动物并优选为人中上升的加压素水平(与正常生理条件比较)有关。优选地，上升的加压素水平是指体液中加压素的滴定度增加，体液优选为血液。
根据本发明的核酸可用于治疗的病症是CHF。在这种情况中，使用根据本发明的核酸来短期治疗充血性心力衰竭是本发明范围内的。通过根据本发明的核酸治疗或预防的另一种类型的心力衰竭是急性失代偿性的充血性心力衰竭。
使用根据本发明的核酸来治疗高血压、冠心病、心肌梗塞和心绞痛也在本发明范围内。在一个特别优选的实施方案中，高血压、冠心病、心肌梗塞和心绞痛是最终导致充血性心力衰竭的病症，在该方面，其可以构成这些疾病的晚期。在一个优选实施方案中，在此描述的实施方案中的充血性心力衰竭以及其它提及的病症，特别是冠心病、心肌梗塞、心绞痛和高血压，是尤其存在于老年患者或已经患有一种或多种心肌梗塞的患者中的病症。在一个优选实施方案中，老年患者特别是他们的身体能力/表现与最大能力/表现比较由于年龄而减小的那些患者。
其中根据本发明的药物可以用于治疗和/或预防的其它医学疾病包括心肌肥大，尤其是通过精氨酸-加压素调节的心肌肥大、水肿和低钠血。
可以使用根据本发明的核酸治疗或预防的其它疾病是ADH分泌不足综合征。
在ADH分泌不足综合征(SIADH、Schwartz-Bartter综合征)中，血浆中AVP浓度由于多种原因而持久增加，这些原因是例如肿瘤的异常ADH分泌，通过施用不同的精神治疗剂例如卡马西平、精神安定药、三环抗抑郁药或选择性5羟色胺再吸收抑制剂诱导的药物引起的异常ADH分泌，肺部疾病，例如肺结核或支气管癌，或者在颅-脑外伤或脑膜炎后中枢渗透压感受器变化，导致抗利尿和低钠血以及体液摩尔渗透压降低(Baylis P H 2003 Int.J.Biochem.Cell Biol.35：1495-1499)。由于疾病症状最初与血浆中AVP浓度增加有关，因而根据本发明的核酸可用于治疗和/或预防ADH分泌不足和ADH分泌不足综合征。V2受体拮抗剂治疗这种病症的效力已经在动物试验和SIADH患者中显示(Saito T等，1997 J.Clin.Endocrinol.Metab.82：1054-1057)。
在另外的方面，本发明涉及根据本发明的核酸的用途，用于生产用于治疗和/或预防肝硬化和低钠血的药物。
在肝硬化中，外周血管扩张导致AVP的血浆浓度明显增加，由于随后水的排泄减少而导致低钠血和体液摩尔渗透压降低。由于用于肝硬化的标准治疗是使用甚至可能会加剧低钠血的利尿剂，因而根据本发明的核酸是有利的，因为与V2受体拮抗剂一样，由于AVP的作用机制它们仅特异性地加强水的排泄并使存在的体液摩尔渗透压降低和低钠血正常化。在患有肝硬化的患者中，在单次施用V2受体拮抗剂之后发现尿量明显增加并且尿渗透压减少。然而，发现AVP血浆水平的增加是剂量依赖性的，其在长期治疗的情况下可能会抵消受体拮抗剂的利尿效果(Inoue T等，1998 Clin.Pharmacol.Ther.63：561：570)。本发明人目前的观点是，根据本发明的核酸用于治疗肝硬化中的低钠血不会引起AVP血浆水平的任何增加，从而与V2受体拮抗剂比较将显示出重大的优势。
在另外的方面，根据本发明的核酸能够用于预防和/或治疗脑水肿。在这种情况中，在本发明范围内根据本发明的核酸也能够用于治疗颅-脑外伤或用于治疗中风。在本发明范围内，使用根据本发明的核酸来治疗和/或预防尤其是颅-脑外伤或中风导致的脑水肿是可能的。
在对颅-脑外伤或中风后的脑水肿的治疗中，髓袢利尿剂例如呋塞米在现有技术中可用作支持性疗法。然而，这些药物可能会由于它们的作用模式而干扰体液的电解质平衡并从而导致低钠血和/或低钾血，所述的作用模式涉及增加Na+、K+和Cl-的丧失。当使用也具有利尿效果的根据本发明的核酸时，不存在对电解质平衡的干扰，因为由于对肾集合小管中水反向再吸收的抑制，不存在离子的丧失而只是增加水排泄。在颅-脑外伤后的脑水肿动物模型中，脑水肿的形成能够用V2受体拮抗剂以剂量依赖性的方式停止(Lazlo F F 1999 Eur.J.Pharmacol.364：115-122)。
在另外的方面，本发明涉及根据本发明核酸的用途，用于治疗和/或预防肿瘤。肿瘤特别是表达选自V1受体、V2受体和V3受体的一种或多种受体的类型。
在分泌ACTH的脑垂体的肿瘤中，以及在异位ACTH综合征中，V3受体是过度表达的(De Keyser Y 1996 J.Clin.Invest.97：1311-1318)。由于已知AVP对所有范围的细胞类型有促有丝分裂作用(见上文)，但其通过V1受体调节，因而AVP通过经由V3受体的刺激而涉及ACTH分泌瘤的肿瘤发生。作为这种作用机制以及根据本发明核酸的作用机制的结果，后者可用于抑制肿瘤发生。
在小细胞支气管癌(支气管癌的亚型)中，其在西方社会是男性由于癌症死亡的主要原因并且是女性死亡的另一个最常见的原因，所有三种已知的AVP受体和AVP自身得以表达。这对于乳腺癌也同样是事实，所述的乳腺癌是妇女最常见的恶性疾病之一(North W G 1000Exp.Physiol.85：27-40)。在上述肿瘤中AVP和所有三种AVP受体的存在是本发明主题的基础，即AVP在这些肿瘤的生理学中起重要作用。因此，根据本发明的核酸也能够用于抑制肿瘤并且特别是上述肿瘤。
在另外的方面，本发明涉及使用根据本发明的核酸来预防早产。
AVP和催产素通过子宫中它们各自的受体来刺激子宫收缩，并在起始分娩过程中起决定性作用。这两种激素都同样涉及早产，所述的早产在一方面存在对早产儿的巨大健康风险并且在另一方面对公共卫生保健制度施加了巨大压力。然而，早产能够通过阻断V1受体以及催产素受体的催产素类似物阿托西班来有效预防(Akerlund M 2002 Prog.Brain.Res.139：359-365)。这形成了在预防早产中使用根据本发明的核酸的依据。
在另外的方面，本发明涉及根据本发明核酸用于治疗和/或预防原发性痛经的用途。
原发性痛经伴随有由行经过程中并在某种程度上在行经之前子宫的有力收缩引起的类似绞痛的下腹-子宫疼痛。患有这种疾病的妇女具有上升的AVP血浆水平。在治疗上的积极效果可以通过使用同样阻断V1受体和催产素受体的合成的催产素类似物阿托西班和非肽类受体拮抗剂SR 49059来达到(Akerlund M 2002 Prog.Brain.Res.139：359-365)。这形成了使用根据本发明的核酸来治疗和/或预防原发性痛经的依据。
此外，根据本发明的核酸还可以作为用于设计药学活性物质(药物设计)的起始物质。大体上，存在的两种可能的设计方法。一种方法在于筛选化合物库，化合物的这些库优选为低分子量化合物(低分子或小分子)库。这些库是该领域中的那些技术人员熟知的。备选地，根据本发明，所述的核酸可以用于活性物质的理性设计。
活性物质的理性设计可以将任何根据本发明的核酸作为它的出发点，并涉及结构，特别是三维结构，所述的结构与根据本发明的核酸或酸的结构相似或者与调节与加压素和催产素结合的根据本发明核酸或酸的那部分结构相同。在任一种情况下，这种结构仍然显示出与根据本发明的核酸或酸相同或至少相似的结合行为。在另外的步骤或作为备选的步骤中，在活性物质的理性设计中，优选结合至加压素或催产素的核酸的那些部分的三维结构通过化学基团来模拟，所述的化学基团优选与核苷酸和核酸不同。通过这种模拟，也称为模仿(mimicry)，能够构建与活性物质的理性设计中用作起始材料的核苷酸或核酸不同的化合物。这种化合物或活性物质优选是小分子或肽。
在使用本领域那些技术人员已知的竞争性试验来筛选化合物库的情形中，可以发现合适的加压素类似物、加压素激动剂、加压素拮抗剂、催产素类似物、催产素激动剂或催产素拮抗剂。这种竞争性测定法可以如下创建。将根据本发明的核酸，优选spiegelmer(即结合靶分子的L-核酸)优选结合至固相上。为了鉴定加压素类似物，将拥有标记的加压素加入至试验系统中。备选地，也可以将加压素结合至固相上并且可以标记根据本发明的核酸。可能的类似物或可能的激动剂或拮抗剂将与结合至spiegelmer的加压素分子竞争，这将导致从相应标记获得的信号的减少。筛选激动剂或拮抗剂可以包括使用本领域那些技术人员已知的细胞培养试验系统。原则上，使用催产素时也可以采用相同的方法。
在另外的方面，根据本发明的核酸因它们对加压素或催产素的特征性的结合行为而可以用于靶标确认。根据本发明的核酸可以在离体器官模型中使用以便研究加压素和催产素的功能。原则上，存在可检测加压素激动剂/拮抗剂的离体模型，例如器官浴槽中分离的，经灌注的肾或分离的大动脉。
根据本发明的试剂盒可以包括至少一种或多种根据本发明的核酸。另外，试剂盒还可以包括至少一种或多种阳性或阴性对照。作为阳性对照，可能会使用例如优选为注体形式的，利用它根据本发明核酸得以筛选或与其结合的加压素或催产素。作为阴性对照，可能尤其会使用在生物物理特性方面以类似加压素和催产素的方式作用的肽，但该肽不能通过根据本发明的核酸识别，或者使用具有与加压素和催产素相同的氨基酸组成但序列不同的肽。
另外，该试剂盒可以包括一种或多种缓冲剂。多种组成物可以以干燥或冻干的形式，或者溶解于液体中的形式存在于试剂盒中。试剂盒可以包括一个或多个容器，而所述的容器又可以装有试剂盒的一种或多种组分。优选地，容器装有用该试剂盒的一种或多种组分来单次实施试验所需的一批反应物。
在本发明范围内，还可以使用根据本发明的核酸检测靶分子例如加压素或催产素。为此目的，而且一般而言，根据本发明的核酸可以直接或间接地标记。优选地，标记选自放射性示踪剂、荧光标记或适合磁性树脂光谱法的标记，例如铕。
本发明通过下面的图和实施例来在下文中更详细地描述，其它特性、实施方案和优势可以从所述的图和实施例获得。在图中：
图1是自动化RNA选择的示意图；
图2是使用的体外选择自动机的工作区示意图；
图3显示在自动化体外选择后结合AVP的克隆的序列；
图4显示在自动化体外选择后结合AVP的克隆的序列和共有序列；
图5显示序列CHF-15-B4和CHF-134-A9的结合行为的比较，表示为作为核酸浓度的函数的结合AVP的百分比；
图6显示序列在使用内部PEG间隔物部分定点修饰和截短后的变体以及源于其的共有序列，其中变体具有未改变的5’-和3’-末端；
图7显示序列在使用内部PEG间隔物部分定点修饰和截短后的变体以及源于其的共有序列，其中变体具有改变的5’-和3’-末端；
图8是结合AVP的spiegelmer CHF-F-037的二级结构模型的图示；
图9是3’-氨基-修饰的spiegelmer CHF-F-037-3’NH2的色谱，所述的色谱通过IEX-HPLC获得；
图10是3’-氨基-修饰的spiegelmer CHF-F-037-3’NH2的质谱，所述的质谱通过MALDI-TOF获得；
图11是3’-氨基-修饰的spiegelmer的电泳图谱，所述的电泳图谱通过CGE(毛细管凝胶电泳)获得。
图12是用40kDa PEG修饰的spiegelmer CHF-F-037-3’PEG的色谱，所述的色谱通过RP-HPLC获得；
图13显示了spiegelmer CHF-F-037和CHF-F-037-3’PEG对AVP-V2受体相互作用的抑制，表示为作为spiegelmer浓度的函数的cAMP生物合成的减少，其中所述的减少是用1nM AVP刺激的cAMP/孔的减少。
图.14A显示了CHF-F-037对AVP-V1受体相互作用的抑制，表示为作为spiegelmer浓度的函数的细胞内钙释放的百分比减少，所述的减少是用5nM AVP刺激时100％释放的百分比的减少；
图.14B显示了CHF-F-037-3’PEG对AVP-V1受体相互作用的抑制，表示为作为spiegelmer浓度的函数的细胞内钙释放的百分比减少，所述的减少是用5nM AVP刺激时100％释放的百分比的减少；
图15是显示不同组的大鼠在施用物质后不同时段的尿量的图；
图16是显示不同组的大鼠在物质施用后不同时段的耗水量的图；
图17是显示不同组的大鼠在施用物质后不同时段的尿渗透压的图；以及
图18是显示不同组的大鼠在施用物质后不同时段尿中Na含量的图。
实施例1：自动化的D-AVP选择
A.材料
精细化学药品和酶
NTP和dNTP从Larova，柏林获得。T7 RNA聚合酶(50U/μl)从Stratagene，海德堡获得；DNase I购自Sigma-Aldrich，Taufkirchen；热稳定Vent exo-DNA聚合酶(2U/μl)购自New England Biolabs；SuperScript II逆转录酶(200U/μl)以及RNase Out RNase抑制剂(40U/μl)购自Invitrogen。用于自动化选择的RT-PCR的试剂从Qiagen，Hilden获得。
靶分子人D-AVP[D-(Arg8)-加压素]
九肽D-AVP(氨基酸序列：Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly)通过BACHEM，Heidelberg合成。该分子在羧基末端Gly上经由另外插入的赖氨酸携带有生物素基团以便能够用亲合色谱材料(例如NeutrAvidin琼脂糖或Streptavidin-UltraLink(Pierce))通过生物素-链霉亲和素的相互作用来把未结合的核酸与结合的核酸分离。
核酸文库和寡核苷酸引物
采用的起始库DE5-7.34通过NOXXON Pharma AG合成，并且用于RT-PCR的寡核苷酸引物DE5.T7和DE5.R使用标准亚磷酰胺化学在IBAGmbH，Gttingen合成：
文库DE5-7.34；合成的反义链
5’-GTGGAACCGACTCACCTGAGCG-N34-CGCTGCTGTTGTCTAAGCTCC-3’
正向引物DE5.T7
5’-TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTTAGACAACAGCAG-3’
反向引物DE5.R
5’-GTGGAACCGACTCACCTGAG-3’
富集的库的克隆和测序通过AGOWA，Berlin来进行。
起始库的产生
为了产生用于第一轮选择的起始库，将4nmol合成的单链DNA(ssDNA；DE5-7.34初始库，反义链)，其对应大约2×1015个分子的组合体，补足成有3倍过剩DE5.T7引物的20×100μl体积的Taq聚合酶缓冲液，通过用400单位的Taq聚合酶(5U/μl)在63℃下孵育2小时而形成双链DNA(dsDNA)。从合成的双链T7-RNA聚合酶启动子开始，在2ml反应体积中将T7转录缓冲液(80mM HEPES pH7，5；22mM MgCl2；1mM亚精胺；10mM二硫苏糖醇；4mM的每种GTP、ATP、CTP和UTP；120μg/ml BSA)中的4nmol dsDNA转录成相应的RNA起始文库。在转录反应后(关于细节参见C部分-酶促反应)，用DNase I消化模板DNA，通过8％变性聚丙烯酰胺凝胶纯化RNA，用醇沉淀，并干燥。
B.选择步骤
RNA的变性和折叠
选择的所有非酶促步骤，除在与靶分子D-AVP接触之前使RNA变性之外，都在选择缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4；150mM NaCl；5mM KCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；0.1％[w/vol]吐温20)中进行。变性在没有CaCl2和MgCl2的选择缓冲液中于95℃下进行5分钟。变性后，在冰上冷却RNA，加入CaCl2和MgCl2，并将混合物在37℃下另外孵育5-15分钟。首先，手动的第一轮，使用4-8nmol的RNA-文库，并且在随后自动化的轮次中使用0.2nmol的RNA-文库。
结合基质的RNA序列的结合和分离
在折叠后，首先将RNA与基质(Streptavidin-UltraLink Plus或NeutrAvidin-Agarose；两种基质都来自Pierce)，没有肽，在37℃下摇晃孵育15分钟。这种所谓的预选用于除去潜在的基质结合物。该孵育步骤后，通过离心使未结合的RNA与基质分离，移出上清液，并用两倍柱体积的选择缓冲液洗涤基质。合并上清液和洗涤级分并且用于进一步的选择。在自动化方法中，基质仅通过让其沉淀而除去，并且仅将上清液用于进一步使用。
结合D-AVP的核糖核酸的选择
对于与D-AVP的结合反应，将不同浓度的生物素化D-AVP加入至剩下的核酸序列中并且在37℃下孵育1-3小时。接着将10-80μl结合生物素的基质加入至所述的结合批次，并再次在37℃下摇晃孵育10-15分钟。然后用选择缓冲液洗涤基质以便从结合序列中除去未结合的RNA序列。用于此目的的洗涤体积在最初的手动的三轮中是基质体积的两倍，并且在随后的轮次中达到固相体积的135倍。
洗脱
在最初三次手动完成的选择轮次过程中，通过将具有结合的RNA的基质颗粒在变性条件下于37℃在150μl 4M胍-硫氰酸(Roth)中孵育两次15分钟来洗脱。在移出上清液后于65℃下再次重复该过程。合并的上清液中的洗脱的RNA用水-饱和苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)萃取一次，又用氯仿/异戊醇(24∶1)萃取两次，在-20℃下用1体积的异丙醇沉淀30分钟，用70％EtOH洗涤，并干燥。
在进一步的自动化轮次过程中，洗脱通过在95℃的RT-PCR缓冲液(Qiagen)中加热基质颗粒10分钟来完成。
C.酶促反应
转录-产生用于选择的RNA
转录在100μl体积的T7反应缓冲液(80mM HEPES pH7.5；22mM MgCl2；1mM亚精胺；10mM二硫苏糖醇；每种4mM的GTP、ATP、CTP和UTP；120μg/ml BSA；0.8M甜菜碱)中用100 U T7 RNA-聚合酶和25-40 U RNase Out RNase抑制剂来进行。每100μl反应，将50-100pmol RT-PCR产物(手动选择轮次)和具有在这里形成的双链DNA的10-30μl RT-PCR反应物(自动化选择轮次)用作转录模板。
在37℃下孵育反应混合物3-12小时并且然后加入DNase I以便消化模板DNA。然后将形成的RNA用具有8M脲的8％聚丙烯酰胺凝胶在变性条件下手动分离，或者使用非嵌入式NTP超滤设备通过超滤来以自动化方式分离。将超滤纯化的RNA从过滤器中洗出，而凝胶纯化的RNA从切下的凝胶条洗脱，用乙醇沉淀，干燥，并吸收于水中。
逆转录-手动轮次1-3
沉淀的RNA通过逆转录作用转录成单链DNA。最多每40μl反应混合物8pmol用1μM DE5.R引物变性并且该引物通过冷却杂交于RNA上。然后加入8μl5×RT缓冲液(第一链缓冲液，Invitrogen)、10mMDTT、0.5mM dNTP、0.8M甜菜碱并在48℃下孵育2分钟。随后用5U Superscript II逆转录酶起始逆转录并在热循环仪中于48℃下孵育30分钟；于50℃下孵育20分钟；于55℃下孵育10分钟并在70℃下孵育15分钟。将因此而形成的cDNA用作下游PCR的模板。
逆转录-自动化轮次4-16
将其上结合有靶分子和RNA序列的洗涤的基质颗粒再悬浮于120μl Qiagen OneStep RT-PCR缓冲液(引物浓度，每种为1μM)中并在95℃下孵育10分钟。使反应混合物最初缓慢冷却至63℃并最后至50℃后，在每种情况中通过加入4μl酶混合物(来自Qiagen的OneStep RT-PCR试剂盒组分)来起始反应。在RT中的温度谱如下：在50℃下20分钟；在53.3℃下2分钟；在56.6℃下2分钟；在60℃下10分钟。
PCR-手动轮次1-3
在每种情况中将10μl RT反应溶液用作3次PCR的模板，每次PCR为100μl体积(10μl 10×Vent缓冲液[New England Biolabs]；1μl 50mM MgSO4；2μl 10mM dNTP-混合物；3μl 100μM DE5.T7引物；3μl 100μM DE5.R引物；16μl 5M甜菜碱；2.5μl Vent exoDNA聚合酶)。扩增通过具有以下参数的热循环程序进行：在95℃下1分钟；在63℃下1分钟；在72℃下1分钟；总共6-10次循环。在反应后，扩增进程在非变性聚丙烯酰胺凝胶上检验。随后PCR反应物用醇沉淀，并且用70％乙醇洗涤沉淀颗粒并干燥。将DNA溶解于H2O中并且它的50-100pmol用作下一轮选择的转录模板。
PCR-自动化轮次4-16
PCR通过在95℃下孵育OneStep RT-PCR批次15分钟起始。这之后为7-16个热循环(在95℃下30秒；在63℃下30秒；在72℃下30秒)。
在自动化轮次中，PCR进程通过荧光测量PCR反应物的等份样品来监控，并且在已经达到所需的阈值后中止PCR(参见D部分，自动化选择中PCR进程的监控)。
D.自动化选择中PCR进程的监控
在PCR过程中双链DNA的增加进行半定量的监控。这用于保持PCR循环数尽可能少。这样，只实施获得足够用于T7反应的模板所需的PCR循环。因此在PCR过程中，在一定数量的循环后从PCR批次中移出等份样品并加入至90μl PicoGreen溶液中(在TE[10mM Tris-HCl，pH8；1mM EDTA]中以1∶400稀释)。PicoGreen是在溶液中游离时几乎不发荧光，但当结合至双链DNA时强烈发出荧光(Ex：485nm；Em：520nm)的一种荧光染料。测量与没有热稳定性聚合酶的非循环对照相比的荧光能够非常准确地评估获得的PCR进程。在已经达到阈值(循环的荧光/未循环的荧光＞2)后，RT-PCR反应的等份试样可用作体外转录的模板。
E.自动化操作
从第三轮开始，非正确执行的凝胶纯化步骤除外，所有的操作都在移液自动机(pipetting robot)上以完全自动化的方式完成。自动机工作区上用于该目的的组件的排列在图2中显示。采用了下列组件：
·用于在PCR过程中检测扩增进程的荧光仪。其中已经产生足够DNA的样品以全自动化方式暂时存储并且不进行进一步的热循环
·双真空室，其具有用于分离结合基质的RNA序列和未结合的RNA序列的室A，以及用于在起始各自的下一轮之前纯化转录反应物的室B
·吸管端(pipette tip)的固定器
·用于实施PCR程序以及用于多个孵育步骤的热循环仪
·用于在结合缓冲液或反应缓冲液中使基质悬浮的震荡器
·50℃工作站，以便能够在该温度直接起始酶促反应(热启动)并能够使PCR反应物不会在荧光对照的取样过程中冷却太快
·用于暂时存储PCR和转录反应物的4℃工作站
·用于存储热敏感性试剂例如酶或制备的反应混合物的4℃试剂架(reagent stands)
·用于存储洗涤缓冲液的RT/37℃试剂架
·用于进行大多数操作的RT/37℃工作站
·用于制备用于荧光测量的样品的荧光板工作站
·用于存储当前不处理的板的空间
·用过的吸管端的清理点
单个组件在选择过程中的参与在该实施例的内容中描述以及它们的使用顺序在图1中显示。
F.结果
选择过程
从第4轮开始的每一次选择轮次中，三种不同严格性的批次以及无D-AVP的空柱作为靶分子操作。严格性通过改变使用的洗涤体积的量并且还通过采用低的D-AVP浓度来增加。
第1-3轮手动完成，因为用于结合这些初始轮次浓度(必然高)中的D-AVP所需的大量基质不再能够通过自动化移液装置可靠地进行。从第4轮开始选择过程完全自动化。
一般而言，具有最高严格性(即最低肽浓度和最大洗涤体积)的选择的RNA，其在扩增中依然产生了零对照以上的明显信号，将其用于下一轮次。将达到阈值所需的循环次数用作对这种信号的量度(见“PCR进程的监控”)。进行了全部16次选择轮次。
克隆来自第14轮次(D-AVP浓度：30nM)和来自第16轮次(D-AVP浓度：10nM)的dsDNA分子群，并且将全部的48个克隆测序，其在序列比对后可能会分成几个家族。具有最好结合特性的分子家族在图3中显示。这一家族的所有克隆具有在图3中序列对比下面显示的一般性共有序列，其具有下列元件。第一，在5’-末端和在3’-末端的两个互补区(Helix1和Helix2)，所述的两个互补区形成7个碱基对长的双链螺旋；第二，5个核苷酸长的序列(Box1)GUGGW；第三，其中不存在C并且每段序列至多存在一个G的7-9个核苷酸长的富含A和富含U的W序列；以及第四，21个核苷酸长的序列(Box2)GGGGUAGGGMUUGGAWGGGWA。Box2的主要典型特征是出现两次至四次的四个严格保守的G。所有列举的分子都结合AVP并且最优结合的是分子CHF-134-A9。除了在图3中描述的AVP-结合分子以外，在自动化选择过程中富集了具有完全不同的序列的其它分子(未显示)。这些分子具有明显差的结合特性。
实施例2：通过手动的，诱变的高严格性选择来在自动化选择后对结合D-AVP的适体(aptamer)的筛选
A.材料
精细化学药品和酶
参见实施例1
靶分子人D-AVP[D-(Arg8)-加压素]
九肽D-AVP(氨基酸序列：Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly，SEQ.ID.No.：1)通过BACHEM，Heidelberg合成两种变体。两种变体都在羧基末端携带有生物素基团以便能够通过生物素-抗生物素蛋白或链霉抗生物素的相互作用用亲合色谱材料基质NeutrAvidin-Agarose(NAag)和Streptavidin-UltraLink：+(SAul+)(都购自Pierce)把结合至所述肽的核酸与未结合的核酸分离。生物素经由另外插入的赖氨酸结合至羧基末端的Gly上并且对于两种变体将不同连接物结合至肽部分。亲水性PEG桥，由氨基-乙氧基-乙氧基-乙酰氨基-乙氧基-乙氧基-乙酰基(AEEA-AEEA连接物)组成，产生生物素化的D-AVP(C-Lys)。更疏水的ε-氨基己基-ε-氨基己基桥产生生物素化的D-AVP(C-LC-LC)。
选择不同靶分子变体的原因是这样的事实：小肽例如AVP的物理化学特性通过用化学部分(例如生物素)修饰比大分子的情况要有相对更大程度的改变。在选择过程中，与天然靶分子的不同可能导致不期望的适体，其需要连接物用于高亲合性结合。因此，在高严格性选择中，该过程在具有上面提及的两种抗生物素蛋白基质的恒定交替(constant alternation)和交替组成(alternating composition)中，使用两种不同的AVP衍生物完成，以便避免需要用于结合肽的连接序列区域的分子的富集并防止以高亲合力方式仅结合纯肽的不希望的分子的富集。
核酸文库和寡核苷酸引物
参见实施例1
起始文库
手动的，诱变的高严格选择用来自自动化选择第16轮次的双链文库DNA起始。为此目的，将10pmol的来自第16轮的文库DNA用Ventexo-热稳定性DNA聚合酶通过诱变PCR扩增，并且用T7 RNA聚合酶体外转录。所述的RNA通过具有8M尿素的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳在变性条件下纯化、洗脱、用醇沉淀，并吸收于水中用于选择(关于细节参见酶促反应)。
B.选择步骤
RNA的变性和折叠；RNA的使用量
参见实施例1。在用诱变扩增选择的开始，将500pmol诱变处理的文库RNA用于第17轮选择。在选择过程中，随着严格性逐渐增加，使用逐渐减少的RNA(在第29轮时为5pmol)。
结合基质的RNA序列的结合和分离
参见实施例1
结合D-AVP的核糖核酸的选择
对于与D-AVP的结合反应，将不同浓度的生物素化D-AVP(其在选择过程中逐渐变少)加入至剩余的RNA序列并在37℃下孵育30分钟。之后，根据使用的肽的量以及采用的基质，将3-20μl基质加入至结合批次并在37℃下再次孵育10-15分钟，同时摇晃。然后用选择缓冲液洗涤基质以便从结合序列中除去未结合的RNA序列。用于该目的的洗涤体积是基质体积的50至200倍。
洗脱
参见实施例1。洗脱与在自动化选择的最初三次手动实施的选择轮次中的一样进行。
C.酶促反应
转录-产生用于选择的RNA
参见实施例1。产生的RNA在变性条件下通过凝胶电泳专门手动制备。
逆转录：
参加实施例1；逆转录-手动轮次1-3
PCR-非诱变的
首先将可逆转录的RNA在非诱变条件下系统地扩增(参见实施例1；PCR-手动轮次1-3)，以便然后在诱变PCR条件下直接体外转录或预先扩增。
PCR-诱变的
在其中热稳定性DNA聚合酶具有高错误率的反应条件下使用两阶段PCR方法扩增DNA，并突变DNA。(Fromant等，1995 Anal.Biochem.224：347-353)。将标准条件下扩增的1pmol DNA在具有8U Taq DNA聚合酶的100μl反应体积(10mM Tris，pH8.7；50mM KCl；5μg/mlBSA；4.82mM MgCl2；0.8M甜菜碱；0.5mM Mncl2；3.85mM dTTP；0.55mM dGTP；0.12mM dATP；0.1mM dCTP；2μM DE5.R引物；2μMDE5.T7引物)内扩增直到达到饱和，该扩增使用下列温度谱：在95℃下1分钟；在63℃下1分钟；在72℃下3分钟；总共10-16次循环。扩增过程在反应后在非变性的8％聚丙烯酰胺凝胶上检验。将在诱变条件下扩增的1pmol DNA在上面提及的条件下再次扩增。在第二次诱变性PCR扩增后用醇沉淀DNA并将其体外转录。
D.选择过程
对诱变PCR的手动高严格性选择进行13轮(自动化选择中的17-29轮)。用于所述选择的参数在表1中显示。
表1
 轮次 抗生物素蛋 白基质 D-AVP (C-Lys) D-AVP (C-LC-LC) 突变的 RNA文库 未突变的 RNA文库 信号/对 照比率
 17181920212223242526272829  NAagNAagSAul+SAul+NAagNAagSAul+SAul+NAagNAagNAagSAul+NAag 5nM1nM20pM5pM1pM0.4pM  5nM200pM40pM4pM1pM1pM0.4pM  10nM10nM10nM10nM10nM2nM100pM 10nM4nM2nM100pM100pM333pM  384525310181.81.3大于1大于1大于1大于1大于1
就此而论，在选择过程中作为高严格性参数的肽浓度减少至0.4pM。使用过量的RNA，以便通过结合剂之间的竞争仅选择最好的分子。在每一轮中，通过选取的选择参数和通过洗涤程序(在固定肽-RNA复合物后用50-200倍的固定柱床体积洗涤基质)达到大于10,000的耗损因子(depletion factor)。
高严格选择的目的是，通过突变和选择来从在16轮自动化选择后存在的结合D-AVP的RNA文库中产生更优选的结合剂。一般而言，在每一轮中，结合反应用不同的肽浓度(信号)实施并且，与之对照，一个反应在完全无肽的情况下进行(对照)。在最低肽浓度时依然显示出大于1的信号/对照比率的反应用于后面的选择轮次。表只显示出这些结合反应的参数。
在最初四个选择轮次的每一个中诱变处理DNA，以便使结合文库产生尽可能大的多样性。在后面的轮次中，将DNA交替地进行非诱变和诱变扩增以便在每次情况中在进一步突变之前富集改良的结合剂。最后三个轮次不进行进一步的突变而完成。在第29轮后，克隆DNA并测定24个克隆的序列。
序列
序列分析的结果(不存在对结合在功能上不需要的两种引物的恒定区)显示于图4中的比对，在24个克隆中(它们的长度(不包括两侧区域)在46和49nt之间)，三个序列是完全一致的。所有的其它序列具有非常高的序列同源性，具有非常高的序列同源性的它们是自动化选择后的最好的结合剂家族的成员。在自动化选择后依然存在的剩余家族在诱变的高严格选择的选择条件下已经消失。所有选择的分子具有已经在图3中阐明的典型共有序列，具有四个组件：在5’-末端和3’-末端的Helix1和Helix2、Box1、富含A和富含U的W序列，以及Box2。在高严格选择条件下，这四个组件如下改变。Helix1和Helix2包含改变的且不同的但仍然互补的序列。Box1的第五个位置只是U而不是如先前的W(即不再有A)。在富含A和富含U的W序列中，每段序列至多一个G的存在减少。在自动化选择后，15个克隆中有9个克隆(即60％)仍然每个序列包含一个G，然而在高严格选择后24个中仅6个克隆(即25％)的每个序列包含一个G。在Box2中，在自动化选择后两个位置出现了一个W，在高严格选择后A不再存在于任何分子的这些位置上，而是，除了U之外，C存在于一些分子的这些位置上。总的来说，由于在这些位置上从未存在G，在共有序列中H位于两者的这些位置上。因而，在图4中显示的结合L-(Arg8)-加压素的L-RNA的共有序列从克隆的序列分析获得，所述的克隆来自手动的高严格选择后的第29轮和自动化选择后的第16轮。
等级评定
检验了克隆有关它们与AVP的结合。所有克隆显示出与该肽结合。通过比较，克隆CHF-157-B4显示为最好的结合。在竞争试验中，与来自自动化选择后第16轮的最理想克隆(CHF-A9)比较，测量了CHF-157-B4。在该试验中，CHF157-B4结合至生物素化AVP的解离常数是9.5nM，而对于CHF-134-A9，解离常数为120nM，其在图5中显示。由于诱变的高严格选择，结合质量改善了近12倍。
实施例3：通过整合内部PEG间隔部分来发展和截短结合AVP的适体
方法学
在两阶段选择过程(自动化选择和手动的诱变的高严格选择)后，基于最理想的结合剂特异性构建并化学合成了变体，所述变体中核苷位置在中间通过整个PEG间隔部分或PEG基团(六乙二醇)替代。这样，截短了该分子并且它的结合特性将进一步优化。适体CHF-157-B4(称为CHF-F-000，用于进一步发展)已经证明是所有选择的分子中最理想的结合剂。从这种47nt长的适体开始，将合成的变体在竞争性等级检测中互相比较并与起始分子比较，并且合成最好的、截短了的分子作为spiegelmer，即作为L-核酸。
PEG间隔变体的合成
构建并检验了的变体由NOXXON Pharma AG通过标准亚磷酰胺化学用六乙二醇亚磷酰胺合成并且，在去保护后，通过制备级变性凝胶电泳(12％PAA，8M尿素，tris-硼酸盐-EDTA缓冲液)纯化并随后电洗脱。
竞争性等级评定检测法
该试验基于放射性标记适体与未标记适体对结合AVP的竞争。在试验中，将标记的适体与本身(未标记的)的竞争强度用作参考，相对于该参考测量了变体的质量。将通过比较竞争最强且比参考更好的分子在分析其它变体时用作新参考。
参考适体通过T4多核苷酸激酶(Invitrogen)在5’-末端用[γ-32P](400 ATP Ci/mmol；Hartmann Analytic，Brunswick)标记达到60,000-120,000cpm/pmol的比放射性。然后将0.2nM该适体与生物素化D-AVP(0.5nM)，连同过量未标记适体或无未标记适体(作为对照)在选择缓冲液中孵育1小时。在固定于1μl SAul+基质后，移除上清液并用50-100μl选择缓冲液洗涤基质，在闪烁计数器(Beckman，美国)中测量结合反应物。
结合AVP的适体CHF-F-000的PEG间隔变体
基于来自自动化选择后第16轮和随后的高严格选择后的第29轮的所有克隆的序列分析，在Box1和Box2之间富含腺苷/尿苷的W序列证明是其中最可能出现由内部PEG间隔物取代核苷的区域，以便截短分子而不影响它的功能性。图6显示了其中5’-末端和3’-末端保持不变的试验变体。与所有其它试验变体比较，变体CHF-F-008和CHF-F-009根本未显示任何结合，因为这里PEG间隔物处于该分子显然必需的Box2中。44个核苷酸长的变体CHF-F-003证明是最好的，虽然其内部截短了三个核苷酸但对AVP的结合与47个核苷酸长的起始分子CHF-F-000一样好。
除具有未改变的分子末端的变体以外，还检验了许多变体，所述变体中5’-末端和3’-末端位于富含腺苷/尿苷的W序列中并且PEG间隔物转移到螺旋的底部，如图7中描述的。现在逐次截短开放的富含腺苷/尿苷的W序列并与此同时截短螺旋最外面的碱基对。在所有依然结合AVP的试验分子中，CHF-F-033(40nt)和CHF-F-037(38nt)证明是最好的。它们与参考分子CHF-F-003和CHF-F-000结合得一样好。其中在Box13’-末端除去了U的四种变体结合明显变差，这强调了该Box1的重要性并显示了，对于完整的功能性，这段序列必须由GUGGU组成。与此比较，在富含A和富含U的序列3’-末端的U(见CHF-F-033和CHF-F-037)可以除去而不影响功能。CHF-F-037(它的二级结构模型在图8中显示)具有38个核苷酸，是结合质量没有任何损失的最短的检验分子，其可生产作为spiegelmer，并且进行了生物物理和细胞培养试验范围内的分析以便最终证明在动物试验中的效力。
实施例4：3’-末端PEG化的spiegelmer CHF-F-037-3’PEG的化学合成和制备
将Spiegelmer在3’-末端共价偶联至40kDa大的聚乙二醇(PEG)上，以便在动物试验中施用后减慢肾对spiegelmer的排泄。由于因此而增大的spiegelmer，获得了明显更长的滞留时间并从而延长了因此而增大的spiegelmer在血浆中的作用。
化学固相合成
Spiegelmer经由2’TBDMS RNA亚磷酰胺化学，通过在ktaPilot100合成仪，Amersham Biosciences(General ElectricHealthcare，Freiburg)中的固相合成来制备(M.J.Damha，K.K.Ogilvie，Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols foroligonucleotides and analogues，ed.S.Agrawal，p.81-114，Humana Press Inc.1993)。L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-、L-rU-和六乙二醇亚磷酰胺从ChemGenes Corp.，Wilmington，MA(美国)获得。合成在具有1000孔径的3’-氨基-修饰的C-6CPG，ChemGenes Corp.，Wilmington，MA(美国)上完成。将乙腈中的0.3M苄硫基四唑(CMS-Chemicals，Abingdon(UK))溶液、乙腈中3.5当量的相应的0.1M亚胺溶液用于结合，结合时间15分钟。采用氧化封端循环。其它用于寡核苷酸合成的标准溶剂和试剂从Biosolve(Valkenswaard，NL)获得。合成spiegelmer(DMT-ON)并在去保护后使用Source15RPC基质，Amersham Biosciences，通过制备级RP-HPLC(Wincott F等，1995 Nucleic Acids Res.23：2677)纯化。用80％醋酸除去5’DMT基团(30分钟，RT)。在加入含水的2M NaOAc溶液后，用5K再生纤维素膜通过正切流动过滤，Millipore Corp.Bedford，MA(美国)来使spiegelmer脱盐。纯化的3’-氨基-修饰的spiegelmer的产率为60-75 OD/μmol。纯化的spiegelmer的IEX-HPLC、MALDI-TOF和CGE分析在图9、10和11中显示。
PEG化
对于PEG化(参考欧洲专利申请案EP 1 306 382)，将纯化的3’-氨基-修饰的spiegelmer(18μmol)溶解于水(2.5ml)、DMF(5ml)和5ml缓冲液A的混合物中。缓冲液A的制备：加入水至柠檬酸一水化物(7.00g)、硼酸(3.54g)、磷酸(2.26ml)和1M氢氧化钠(343ml)的混合物中产生1升的储液。通过加入1M盐酸来调节该储液至pH8.4。
Spiegelmer溶液的pH值通过加入1M氢氧化钠来调节至8.5。将40kDa PEG-NHS酯(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL(美国))在37℃下0.6当量/30分钟的分批加入直到在2.4当量时达到75-85％的最大转化。在加PEG-NHS酯的过程中，反应混合物的pH通过加入1M氢氧化钠来保持在8.0-8.5之间的值。
PEG化spiegelmer使用Source15RPC基质，AmershamBiosciences，和水(缓冲液B)以及乙腈(缓冲液C)中的0.1M三乙基醋酸铵梯度来通过RP-HPLC纯化。在注射进HPLC柱之前，加入8M尿素(4ml)、缓冲液A(4ml)和缓冲液B(4ml)至反应混合物中并且在95℃下加热15分钟。过量的PEG在5％缓冲液中洗脱。PEG化spiegelmer在10-15％的缓冲液C中洗脱。合并HPLC纯度＞95％的产物级分并加入2M NaOAc(40ml)。用5K再生纤维素膜，MilliporeCorp.Bedford，MA(美国)，通过正切流动过滤脱盐后以35-50％的产率获得纯化的PEG化spiegelmer。从240mg的3’-氨基-修饰的spiegelmer获得390mg的PEG化spiegelmer。纯化的40kDa PEG化spiegelmer CHF-F-037-3’PEG的IEX-HPLC分析在图12中显示。
实施例5：通过等温量热仪(ITC)的spiegelmer CHF-F-037的生物物理学鉴定
方法学
用于测定解离常数的量热学测量用VP-ITC微热量计(MicroCal，Northampton，MA)进行。将要测量的spiegelmer和配体溶液在测量缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4；150mM Nacl；5mM KCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2)中真空下于37℃除去气体。加入2-6μM量的spiegelmer至仪器的测量池(池容积：1.43ml)中，并且将25μM配体吸入注射器(注射器容积：0.25ml)中。在初始3μl注射后，配体溶液在所有情况下用6秒的时间以7.5μl的等份量注入测量室中。测量温度是37℃并且两次连续注射之间的时间在每种情况中是5分钟。
结果
非PEG化spiegelmer CHF-F-037和PEG化spiegelmerCHF-F-037-3′PEG对L-AVP的测量结果以及CHF-F-037-3’PEG对催产素的测量结果在表2中总结。
表2
测量 Spiegelmer 肽 Kd 活性
1[110]2[120]3[193] CHF-F-037CHF-F-037-3’PEGCHF-F-037-3’PEG L-AVPL-AVPL-催产素 1.7nM1.3nM16nM 46.8％59.1％69.8％
PEG化和非PEG化形式的spiegelmer的解离常数都是1.5nM。因此，该spiegelmer以非常高的亲合力结合至AVP，这表示它可以用于治疗其中涉及AVP的医学疾病。类似物质催产素以大概小十倍的亲合力结合。可是，该亲合力也足够能使spiegelmer在涉及催产素的医学疾病中获得满意效果。结合AVP的spiegelmer的1.5nM的解离常数与现有技术中已知的DNA spiegelmer的解离常数(Williams KP等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：11285-11290)比较，大约要好600倍。
实施例6：spiegelmer CHF-F-037在细胞培养中的生物学特性鉴定
A.方法学
结合(Arg8)-加压素的spiegelmer对(Arg8)-加压素结合V2受体的抑制的分析
该方法的原理是对AVP-V2受体相互作用以及随后cAMP的形成的抑制。表达肾V2受体的猪肾上皮细胞系LLC-PK1的细胞(ATCC-CL-101)以每孔6×104的量接种于96-孔微量滴定板中，并在培养基199(Invitrogen，Karlsruhe)中于37℃和5％CO2下培养过夜，所述的培养基另外含有10％热灭活的胎牛血清(FCS)、4mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(GLUTAMAX)、50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素。
将spiegelmer与1nM L-AVP(Calbiochem)一起在0.2ml低架96-孔板中，于RT或37℃在汉克平衡盐液(HBSS)+1mg/ml BSA中孵育15-60分钟。在加入结合批次至细胞前不久加入2μl 50mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(购自Calbiochem的IBMX溶液)。细胞在加入AVP/spiegelmer批次之前20分钟用1mM IBMX预处理。
为了实现刺激，将培养基从细胞吸出并加入预先孵育的结合批次。在37℃下孵育30分钟后，吸出细胞上清液并且在37℃下用50μl/孔的溶解缓冲液溶解细胞30分钟。溶解缓冲液是“cAMP-ScreenTMSystem”试剂盒(Applied Biosystems，Darmstadt)的组成部分，使用该试剂盒，提取物的cAMP含量得以测量。在每种情况中将10μl提取物用于该检验。该检验根据生产商的说明书实施：
在检测平板(用山羊抗-兔IgG包被)中，将10μl/孔的溶解产物加入至50μl溶解缓冲液中并与30μl/孔的cAMP-碱性磷酸酶缀合物混合，所述的缀合物根据生产商的说明书稀释。此后，加入由试剂盒提供的60μl/孔的cAMP抗体。孵育在RT下摇晃进行1小时。之后，从孔中移除溶液并用提供的洗涤缓冲液将其洗涤6次。为了检测，加入100μl/孔的CSPD/Sapphire-II RTU底物，在RT下孵育30分钟，并且在POLARstar Galaxy multidetection plate reading instrument(BMG LABTECH，Offenburg)中测量发光。
结合(Arg8)-加压素的spiegelmer对(Arg8)-加压素结合V1受体的抑制的分析
该方法的原理是对AVP-V1受体相互作用以及随后钙的细胞内释放的抑制。表达血管V1受体的A7r5细胞系(来自大鼠大动脉的平滑肌细胞，ATCC-CRL-144)在具有透明底部的黑色96-孔微量滴定板(Greiner Bio-One，Frickenhausen)中以4×104每孔的量接种，并且在DMEM中于37℃和5％CO2下培养过夜，所述的DMEM另外含有10％胎牛血清、4mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(GLUTAMAX)、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素。
将spiegelmer于RT或37℃下，在0.2ml低架96-孔板中的汉克平衡盐液(HBSS)中与5nM L-AVP(Calbiochem，Schwalbach)一起孵育15-60分钟。用1μg/ml BSA、5mM羧苯磺胺和20mM HEPES补充HBSS(HBSS+)。
在加入钙指示剂染料Fluo-4之前，将细胞都用200μl HBSS+洗涤一次。然后加入50μl指示剂缓冲液(HBSS+中的10μM Fluo-4(Molecular Probes，Eugene，OR)、0.08％Pluronic 127(MolecularProbes))并在37℃下孵育60分钟。之后，每次使用180μl HBSS+洗涤细胞三次。然后每孔加入90μl HBSS+。
荧光信号的测量在POLARstar Galaxy multidetection平板读取仪(BMG LABTECH)中在485nm激发波长和520nm的发射波长下进行。
对于平行测量多种样品，在所有情况中96-孔平板的一(列)行的孔共同测量。为此，首先以4-秒间隔记录用于设定基线的三个测量值。然后中断测量，将平板从读取仪器中移出，用多道吸液管将来自其中进行了预孵育的低架96-孔板的10μl刺激溶液加入至要测量的行的孔中。然后将平板重新插入读取仪器中并继续测量(4-秒间隔共计20次测量)。
根据获得的测量曲线，每个单独的孔的最大荧光信号和在刺激之前的荧光信号之间的差异得以测定并且相对于spiegelmer浓度绘图。
B.结果
AVP-V2受体相互作用的抑制
PEG化和非PEG化spiegelmer CHF-F-037对AVP与LLC-PK1细胞上的V2受体的相互作用的抑制在图13中显示。形成的cAMP的量相对于spiegelmer的浓度绘图。图形评定在两种情况下给出了约1nM的IC50值，所述的IC50值是仅形成50％存在于对照中的cAMP量时的spiegelmer浓度。因此，与现有技术中已知的结合AVP的DNAspiegelmer的效力(Williams K P等，1997 Proc.Natl.Acad.SciUSA94：11285-11290)比较，获得了约3000倍的改进，其中所述已知DNA spiegelmer在相同的试验中发现IC50为约3μM。
AVP-V1受体相互作用的抑制
PEG化和非PEG化spiegelmer CHF-F-037对AVP与A7r5细胞上V1受体的相互作用的抑制在图14中显示。用5nM AVP或用已经在37℃下与不同浓度的spiegelmer预孵育的AVP刺激A7r5细胞，并且测量由此引起的钙的细胞内释放。该图显示信号随着spiegelmer的浓度增加而百分比减小。信号设定为100％，这是在没有spiegelmer的情况下测量的(％对照)。非PEG化spiegelmer以大约6nM的半-最大有效浓度(IC50)抑制AVP引起的钙的细胞内释放。PEG化spiegelmer以大约7nM的IC50值抑制。
实施例7：施用spiegelmer CHF-F-037后的大鼠的利尿试验
A.实验方法
为了体内检验spiegelmer CHF-F-037及其具有40kDa PEG残基的变体CHF-F-037-3′PEG的效力，在aurigon GmbH(Tutzing)用239-290g体重的雄性Sprage-Dawley大鼠(Elevage Janvier，LeGenest St.Isle，France)来进行利尿试验。
试验方法包括每组包含5只动物的7个不同的组，其将经静脉内或腹膜内接受不同浓度的PEG化和非PEG化spiegelmer以及无活性的对照spiegelmer和纯缓冲液(载体)作为对照，如在表3中描述。
组   组的 大小  物质   剂量 [mg/kg] 剂量 [nmol/kg] 容积 [ml/kg]   施用
ABCDE     55555  PBS(pH7.4)对照SPM-5’PEGCHF-F-037-3’-PEGCHF-F-037-3’-PEGCHF-F-037-3’-PEG     -105.94.221.2106   -2000804002000   22222   静脉内静脉内静脉内静脉内静脉内
AB     55  对照SPMCHF-F-037     25.525.9   20002000   22   腹膜内腹膜内
在真正试验之前，总计35只动物在第-5天(开始试验之前)适应实验条件并且在第-2天于22±3℃和30-70％大气湿度下单独置于代谢笼中。动物一直都能自由非限制获得无菌水和干的食物(R/M标准食物，高压灭菌；Ssniff Spezialditen GmbH，Soest)。在第-1天，测量每组一只动物在0-6h和6-24h期间的耗水量，以及在0-2h、2-4h、4-6h和6-24h期间的尿量。
在第0天，将所述物质以2ml/kg体重的剂量静脉内(i.v)推注施用至组A至E的动物的尾部静脉中。所述物质以2ml/kg体重的剂量腹膜内(i.p.)注射入组a和b的动物中。所有动物在注射之前直接称重并计算相应的注射量。在施用所述试验物质后(第0天)，测量所有动物在0-6h和6-24h期间的耗水量并且测量在0-2h、2-4h、4-6h和6-24h期间的尿量。收集的尿在2-8℃下储存并且同样测量在0-2h、2-4h、4-6h和6-24h期间的尿的渗透压和钠含量。该试验设计通过当地的监管部门检查和批准；Registration No.209.1/211-2531.2-14/02。
B.结果
利尿和耗水量
静脉内施用CHF-F-037-3’PEG显示，与组A(只有载体)和B(2000nmol/kg量的无活性的spiegelmer)比较，组C、D和E的尿量以剂量依赖性的方式增加，如图15中显示的。该效果在施用后的0-2小时期间保持，并且，对于高剂量组(400和2000nmol/kg)还在后面的期间内保持(2-4h和4-6h)。腹膜内施用非PEG化spiegelmer CHF-F-037(组b，2000nmol/kg)同样在开始的两个时间段内引起尿量的增加。在0-6h期间动物的耗水量很大程度上与利尿作用相关；换而言之，在这期间大鼠饮用越多的水测量到尿量就越多，如在图16中显示的。关于尿量和耗水量参数，在后面的6-24h期间，在单独的组之间不再存在任何明显的变化。
尿的渗透压和Na含量
与对照组动物比较，在已经静脉内接受活性PEG化spiegelmer和腹膜内接受活性非PEG化spiegelmer的动物中尿的渗透压以及Na含量以剂量依赖性的方式明显减少，如在图18和19中显示的。在静脉内施用PEG化spiegelmer后以及在腹膜内施用非PEG化spiegelmer后的情况中，在最高剂量下在6-24h期间这里仍然能够看到与对照动物相比较的不同。渗透压和Na含量的减小是spiegelmer特异性作用的证据。AVP-V2受体相互作用的抑制引起肾集合小管中水的再吸收减少。作为这样的结果，排泄出更多的水。然而，由于不再排泄电解质，在用活性spiegelmer处理后尿以剂量依赖性的方式明显更稀释。结合AVP的spiegelmer从而，正如V2受体拮抗剂一样，不用作利尿剂而是用作促水排泄剂(aquaretic)。
在前面的描述和权利要求以及附图中公开的本发明特点可以是基本独立地以及以任何任意组合用于在其多个实施方案中实现本发明。
序列表
<110>NOXXON Pharma AG
<120>结合加压素的L-核酸
<130>N 10045 PCT
<160>50
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>加压素
<400>1
Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly
 1         5
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<223>结合剂
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<211>38
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>结合剂
<400>49
gggguagggc uuggaugggu aguacacgug ugcguggu    38
<210>50
<211>37
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>misc_feature
<223>结合剂
<400>50
gggguagggc uuggaugggu aguacacgug ugcgugg     37

Claims (54)

1.结合加压素的核酸，所述核酸的特征在于该核酸包含序列Box1和序列Box2，
其中Box1包含序列GUGGW并且W＝A或U，优选W＝U，并且
其中Box2包含约18-24个核苷酸的序列，优选包含21个核苷酸，并且(G)n组四次包含于该序列中，其中n＝2、3或4。
2.根据权利要求1所述的结合加压素的核酸，所述核酸的特征在于在5’-3’方向的第一组(G)n中n＝4，在5’-3’方向的第二组(G)n中n＝3，在5’-3’方向的第三组(G)n中n＝2，并且在5’-3’方向的第四组(G)n中n＝3。
3.根据权利要求1或2所述的结合加压素的核酸，其特征在于Box2包含序列GGGGUAGGGMUUGGAHGGGHA，
其中
M在所有情况中独立地是A或C，并且
H在所有情况中独立地是A、C或U。
4.根据权利要求3所述的结合加压素的核酸，其特征在于U或C优选U存在于H位置上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的结合加压素的核酸，其特征在于该核酸包含序列Helix1和序列Helix2，其中Helix1和Helix2在所有情况下都包含5-9个核苷酸，优选包含6-7个核苷酸并且更优选包含7个核苷酸，并且序列Helix1和Helix2彼此互补并优选形成双链螺旋。
6.根据权利要求5所述的结合加压素的核酸，其特征在于所述的双链螺旋是在末端形成。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的结合加压素的核酸，其特征在于该核酸包含W序列，其中W序列包含0-10个，优选6-9个核苷酸，或0-7个核苷酸。
8.根据权利要求7所述的结合加压素的核酸，其特征在于W序列(a)只由一个或多个A和/或U组成，或者(b)由一个或多个A和/或U以及G组成。
9.根据权利要求7或8所述的结合加压素的核酸，其特征在于W序列包含PEG基团。
10.根据权利要求9所述的结合加压素的核酸，其特征在于PEG基团位于W序列的5’-末端或位于W序列的3’-末端或在W序列的两个核苷酸之间。
11.根据权利要求1-10，特别是根据权利要求1-7中任一项所述的结合加压素的核酸，其特征在于该核酸包含PEG基团。
12.根据式(I)的核酸，优选为根据权利要求1-11中任一项所述的核酸，
Figure A2005800473790003C1
(式I)
其中
Helix1包含7个核苷酸
Helix2包含7个核苷酸
Helix1和Helix2彼此互补并形成末端双链螺旋
Box1是GUGGW，其中W＝A或U，优选为U，
W序列WWDWDDWWW包含6-9个核苷酸，其中
D单独且独立地可以是A、G或U，并且其中优选W序列(a)只由一个或多个A和/或U组成，或者(b)由一个或多个A和/或U以及G组成，
Box2是约18-24个核苷酸，优选为21个核苷酸的序列，并且(G)n组四次包含于Box2的序列中，其中n＝2、3或4。
13.根据式(II)的核酸，优选根据权利要求1-11任一项的核酸
Figure A2005800473790004C1
其中
Figure A2005800473790004C2
表示PEG基团，
t和u彼此单独且独立地是0、1、2、3、4或5，其中t+u是0、1、2、3、4或5；并且
其中
Helix1、Helix2、Box1和Box2如权利要求12中定义；并且
W＝A或U。
14.根据式(III)的核酸，优选根据权利要求1-11任一项的核酸
Figure A2005800473790004C3
其中表示PEG基团，并且
其中
Helix1和Helix2在所有情况下都包含6或7个核苷酸，优选为6个核苷酸，
Helix1和Helix2彼此互补并形成双链螺旋，
Box1和Box2如权利要求12中定义，其中W序列WWWWWWW由0-7个W组成，其中W＝A或U，并且优选W不存在于式(III)中，并且
PEG基团在5’-3’方向排列于Helix2和Helix1之间。
15.根据权利要求14所述的核酸，其特征在于在5’-3’方向的第一组(G)n中n＝4，在5’-3’方向的第二组(G)n中n＝3，在5’-3’方向的第三组(G)n中n＝2，并且在5’-3’方向的第四组(G)n中n＝3。
16.根据权利要求1-15特别是12-15中任一项的核酸，其特征在于PEG基团具有约172-688Da，优选约344Da的分子量。
17.核酸，优选为根据权利要求1-16中任一项的核酸，所述核酸具有选自SEQ.ID.NO.2至SEQ.ID.NO.50的核酸序列。
18.根据权利要求12-17的核酸，其特征在于该核酸结合加压素。
19.根据权利要求18的核酸，其特征在于加压素是人加压素。
20.根据权利要求1-19中任一项的核酸，其特征在于加压素包含根据SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列。
21.根据权利要求1-20中任一项的核酸，其特征在于该核酸包含修饰。
22.根据权利要求21的核酸，其特征在于修饰选自HES化和PEG化。
23.根据权利要求22的核酸，其特征在于PEG化由直链或支链的PEG实现，其中PEG的分子量是约20-120kDa，优选约30-80kDa，并且更优选约40kDa。
24.根据权利要求22所述的核酸，其特征在于HES化通过HES完成，其中HES的分子量是约10-30kDa，优选约30-80kDa，并且更优选约50kDa。
25.根据权利要求1-24中任一项的核酸，其特征在于该核酸完全由L-核苷酸组成。
26.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-25中任一项的核酸和任选的其它成分，其中其它成分选自可药用载体。
27.根据权利要求1-25中任一项的核酸用于生产药物的用途。
28.根据权利要求1-25中任一项的核酸用于生产诊断剂的用途。
29.根据权利要求27所述的用途，其中药物用于治疗和/或预防充血性心力衰竭，优选用于后者的短期治疗，并且优选用于治疗和/或预防急性失代偿性的充血性心力衰竭。
30.根据权利要求27所述的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防医学疾病，其中所述疾病是选自高血压、冠心病、心肌梗塞和心绞痛的疾病的后遗症。
31.根据权利要求27-30中任一项的用途，其中患者是老年人或早先患有心肌梗塞的患者。
32.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于预防和/或治疗高血压的药物。
33.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于治疗和/或预防心肌肥大，优选为通过(精氨酸8)-加压素介导的心肌肥大的药物。
34.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于预防和/或治疗水肿的药物。
35.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于减轻水潴留增加的患者的体重的药物。
36.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于治疗患有低钠血症的患者或用于预防低钠血症的药物。
37.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于预防和/或治疗ADH分泌不足综合征的药物。
38.根据权利要求37的用途，其中所述ADH分泌不足综合征伴随有至少一种其它的症状，其中其它的症状选自抗利尿、低钠血和体液摩尔渗透压浓度降低。
39.根据权利要求37或38的用途，其中所述ADH分泌不足综合征具有至少一个原因，其中所述原因选自肿瘤的异位ADH分泌、药物引起的ADH分泌、肺部疾病，以及在颅-脑外伤或脑膜炎后中枢渗透压感受器变化。
40.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于预防和/或治疗与肝硬化相关的低钠血的药物。
41.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于治疗和/或预防脑水肿，尤其是在颅-脑外伤或在中风后的脑水肿的药物。
42.根据权利要求27的用途，其特征在于该药物用于治疗和/或预防颅-脑外伤和/或中风。
43.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于预防和/或治疗肿瘤的药物。
44.根据权利要求43的用途，其中至少一些形成肿瘤的细胞表达至少一种受体，所述受体选自V1受体、V2受体和V3受体。
45.根据权利要求43或44的用途，其中所述肿瘤选自ACTH分泌性肿瘤、小细胞支气管癌和乳腺癌。
46.根据权利要求27的用途，其中所述药物是用于预防早产的药物。
47.根据权利要求27的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗原发性痛经。
48.复合物，所述的复合物包含加压素和根据权利要求1-27中任一项的核酸。
49.复合物，所述的复合物包含催产素和根据权利要求1-27中任一项的核酸。
50.用于筛选加压素拮抗剂或加压素激动剂的方法，所述的方法包括下列步骤：
-  提供候选加压素拮抗剂和/或候选加压素激动剂，
-  提供根据权利要求1-25中任一项的核酸，
-  提供在有加压素拮抗剂和/或加压素激动剂的情况下产生信号变化的试验系统，以及
-  测定所述候选加压素拮抗剂是否为加压素拮抗剂，和/或所述候选加压素激动剂是否为加压素激动剂。
51.根据权利要求50的方法，其中所述加压素是(精氨酸8)-加压素。
52.用于筛选加压素拮抗剂或加压素激动剂的方法，所述的方法包括下列步骤：
-  提供某种相形式优选固相的加压素，
-  提供根据权利要求1-25中任一项的核酸，优选经标记的根据权利要求1-25中任一项的核酸，
-  加入候选加压素激动剂和/或候选加压素拮抗剂，以及
-  测定所述候选加压素激动剂是否为加压素激动剂和/或所述候选加压素拮抗剂是否为加压素拮抗剂。
53.根据权利要求52的方法，其特征在于所述测定通过确定核酸是否由所述候选加压素激动剂置换来完成。
54.用于检测加压素和/或催产素，优选精氨酸加压素的试剂盒，所述的试剂盒包含根据权利要求1-25中任一项的核酸。
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