CN103443127A - 人组织因子抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够阻止组织因子(凝血因子F3)信号传导但不干扰因子VII结合或FX结合到组织因子且不延长凝血时间的人源化形式抗体。本发明的抗体在治疗病症(诸如肿瘤进展)中是有用的，其中缔合的细胞表达组织因子且发生组织因子信号传导。

Description

人组织因子抗体及其用途
优先权申请
本申请要求2011年3月15日提交的美国申请No.61／452,674的优先权，其全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及结合人组织因子、存在在包括肿瘤细胞的血管外组织上的抗原的人适应抗体，该抗体不抑制组织因子介导的血液凝固。本发明也涉及使用该抗体来治疗与人组织因子的存在和受体功能相关的病症(诸如恶性肿瘤)的方法。
背景技术
组织因子(TF)(也称为凝血因子III(F3)、组织促凝血酶原激酶、或CD142)是具有219个氨基酸的胞外域和短的胞内域的跨膜糖蛋白，所述胞外域包含两个III型纤连蛋白域，并且所述胞内域具有一个能够被磷酰化的丝氨酸残基。TF是FVII／FVIIa的细胞受体。
TF以细胞受体的形式表现出正常的脑、肺和胎盘中高水平以及脾、胸腺、骨骼肌和肝脏中低水平的组织特异性分布。其也存在于细胞来源的微粒中且以另外一种拼接的可溶形式。除了在正常组织中表达，已报道TF在大多数主要肿瘤类型中和许多肿瘤来源的细胞系中是过表达的(Ruf W JThromb Haemost.5：1584-1587，2007；Milsom等人，Arterioscler ThrombVasc Biol.29：2005-2014，2009)。
响应于损伤的血清蛋白凝固是对损伤的重要生理响应。血液暴露于包括胶原(内源性途径)和组织因子(外源性途径)的蛋白引发血小板和血浆蛋白纤维蛋白原、凝血因子的变化。血管受伤后，因子VII(FVII)离开循环并开始与在具有组织因子的细胞(间质成纤维细胞和白细胞)上表达的组织因子(TF)接触，从而形成激活的TF-FVIIa复合物。TF-FVIIa激活因子IX(FIX)和因子X(FX)。FVII可由TF变构激活，以及由凝血酶、FXIa、纤溶酶、FXII和FXa激活。TF-FVIIa与FXa形成三元复合物。
非血管细胞的组织因子(TF)表达在激发血液凝固的止血中起着不可或缺的作用。TF还与不同于止血的过程相关，并且与表达TF的细胞表面处的功能直接相关。血管和非血管细胞上的凝血蛋白酶的TF依赖性组装激活蛋白酶激活受体(PAR)，所述PAR是G蛋白偶联受体。因此，通过PAR(主要是PAR2)，TF：VIIa复合物能够诱导细胞信号传导(Camerer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：5255-5260，2000；Riewald和Ruf，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：7742-7747，2001；Ruf等人，J Thromb Haemost1：1495-4503，2003；Chen等人，Thromb Haemost86：334-45，2001)，从而促进肿瘤生成、血管生成、肿瘤进展和转移。
三元复合物TF／FVIIa／FXa由作用于FX的TF：VIIa复合物直接形成或在FIX至FIXa的TF：VIIa裂解之后间接形成，所述TF：VIIa裂解可将FX裂解为FXa。TF／FVIIa／FXa复合物的形成可引起信号传导或激活诸如PAR1-4的其他受体。TF／FVIIa／FXa复合物的形成导致白介素-8(IL-8)的诱导，所述IL-8可刺激肿瘤细胞迁移(Hjortor等人，Blood103：3029-3037，2004)。PAR1和PAR2均涉及肿瘤转移(Shi等人，Mol Cancer Res.2：395-402，2004)，然而，激活的二元和三元复合物(TF-VIIa和TF-VIIa-FXa)是PAR2的激活剂，所述PAR2也导致细胞信号传导(Rao和Pendurthi，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.25：47-56，2005)。因此，人们关注确定组织因子的致癌作用是否能与促凝血作用分离，也长期怀疑这涉及肿瘤迁移、外渗和转移机制。
诸如由Morrisey(1988，Thromb Res52(3)：247-261；US5223427)和Magdolen(1996Biol Chem379：157-165)描述的那些单克隆抗体与组织因子的关系已被用于探究配体结合位点的功能和免疫方面。能够结合组织因子的单克隆抗体可用于通过干扰TF形成或保持TF-VIIa复合物的能力、或通过阻断所述复合物激活FX的能力来阻断血栓形成事件。与组织因子结合且不阻断凝血的抗体也是已知的。TF引发因子VIIa的信号传导阻断但不是凝血阻断抗体(诸如抗体10H10)也已被描述(Ahamed等人，2006ProcNatl Acad Sci USA103(38)：13932-13937)，并且此类抗体已向研究具有此类活性的介质在实体肿瘤治疗中的作用和实用性提供机遇(Versteeg等人，2008Blood111(1)：190-199)。Ruf等人，已公布的申请WO2007056352A3中公开了抑制组织因子信号传导而不干扰患者止血的方法和组合物。
由于恶性肿瘤进展是多面的过程，人们期望能够阻断肿瘤细胞致癌、转移、血管生成和抗凋亡功能而不干扰患者止血的TF结合抗体的治疗候选物。
发明内容
本发明提供了用于人治疗的人适应的抗人组织因子特异性抗体，所述抗体保留了鼠抗体10H10的结合表位，该抗体不与组织因子竞争FVIIa结合并因此基本上不阻断促凝血、TF-VIIa复合物的酰胺分解活性但却阻断TF-VIIa介导的信号传导及下游致癌效应(诸如细胞因子IL-8释放)。
本发明的人适应抗体由人IgG可变域框架组合CDR变体残基构成，所述CDR变体残基通过参考10H10鼠抗体CDR序列且表示为SEQ ID NO：6-11和27的序列确定。提供了人框架FR1和FR2以及FR3与CDR和CDR变体、与FR4的组合，这允许了具有鼠抗体10H10的免疫特异性的抗体结合域的组装。在本发明的一个实施例中，由SEQ ID NO：6-11表示的六个CDR序列或由SEQ ID NO：6、8-11和27表示的组与人种系FR组合，所述人种系FR被定义为人IgG可变域的非CDR位置，选择所述人种系FR使得10H10对人TF的结合亲和力被保留。在一个方面，人HC可变区FR来源于由IMGT数据库表示的IGHV基因家族1、3或5成员。在一个方面，人LC可变区FR来源于人IGKV基因家族2或4成员。在一个实施例中，抗体Fv(HC可变区与LC可变区配对)包含选自SEQ ID NO：12-21的HC可变域和选自SEQ ID NO：22-26的LC可变域。
在具体实施例中，形成抗体Fv(HC可变区与LC可变区配对)的人FR包括IGHV5和IGKV2FR。本发明的抗体包含HC可变域，所述HC可变域具有：SEQ ID NO：8的H-CDR3；具有选自SEQ ID NO：6和62-83的序列的H-CDR1；具有选自SEQ ID NO：7、27和84-107的序列的H-CDR2；以及任选地，选自IGVJ4(SEQ ID NO：60)或其变体的HC FR4区。本发明的抗体还包含具有LC可变域的那些，所述LC可变域具有：具有选自SEQ ID NO：9、108-116的序列的L-CDR1；具有选自SEQ ID NO：10和117-120的序列的L-CDR2；和具有选自SEQ ID NO：11和121-128的序列的L-CDR3；以及任选地，选自IGKJ2(SEQ ID NO：61)或其变体的LC FR4区。在特定实施例中，人框架序列来源于IGHV5_a，并且所创建的可变域包括选自SEQ ID NO：19、129-155的序列。在另一个实施例中，人框架序列来源于IGKV2D40_O1，并且所创建的可变域包括选自SEQ ID NO：23、156-163的序列。
本发明的抗体的一种形式可表示为具有下列的抗体：被定义为非CDR位置的来源于IGHV5_a框架的结合域、具有序列SGYYGNSGFAY(SEQID NO：8)的H-CDR3，其中H-CDR-1位置处的序列由下式给出：
H-CDR1    GYTFX1X2X3WIE(I)    (SEQ ID NO：83)
其中X1选自A、D、G、I、L、N、P、R、S、T、V和Y；X2选自A、P、S和T；并且X3选自F、H和Y；或所述序列可为GFTFITYWIA(SEQ IDNO：81)；并且H-CDR2位置处的序列由下式给出：
H-CDR2    DIX1PGX2GX3TX4(II)    (SEQ ID NO：107)
其中X1选自I和L；X2选自S和T；X3选自A、F、H和w；并且X4选自D、H、I、L和N；除在H189中，其中H-CDR2为DILPASSSTN(SEQ IDNO：105)。
本发明的抗体表示为具有被定义为非CDR位置的来源于IGKV2D40_O1框架的结合域的抗体，并且其中L-CDR-1和／或LCDR-2以及L-CDR3处的序列具有由下式给出的序列：
L-CDR1    KSSQSLLX1X2X3X4QX5NYLT(III)    (SEQ ID NO：116)
其中X1选自F、P、S、T、W和Y；X2选自F、S、T、R和V；X3选自A、G、P、S、W、Y和V；X4选自G、N和T；X5选自K、R和S；
L-CDR2    X1ASTRX2S(IV)    (SEQ ID NO：120)
其中X1选自H和W；X2选自D、E和S；
L-CDR3    QNDX1X2X3PX4T    (V)    (SEQ ID NO：128)
其中X1选自D、F和L；X2选自S、T和Y；X3选自W和Y；X4选自L和M。
因此，所述抗体重链和轻链CDR残基基本上是来自鼠10H10的CDR修饰的。例如，根据上文所描述的，抗体重链可为仅70％(在CDR1中改变了3／10的残基)，和60％(在CDR2中改变了4／10的残基)这类似于鼠10H10的CDR(CDR3是未变化的)。轻链CDR残基为仅71％(5／17变化的)，(71％)(2／7变化的)，或55％(4／9变化的)，这类似于鼠10H10的CDR。
本发明还提供了竞争结合到人组织因子并因此结合到与鼠10H10抗体基本上相同的人TF-ECD表位的人适应抗体。本发明还提供了使用此类抗体来治疗患有病症的人受试者的方法，其中TF表达和由TF表达引起的局部生物活性与被治疗的病症直接或间接相关。
本发明还提供了制备抗体以及所述抗体的药学上可接受的制剂的方法、包含所述制剂的容器、和包括所述容器的试剂盒，其中本发明的抗体可针对使用方法制备以治疗人受试者。
附图说明
图1显示了由10H10Fab或与人适应变体(M1593Fab)和人TF-ECD残基5-208共结晶的X射线衍射分析展现的表位，其中显示了在M1593H-CDR1(T31P)和HCDR-2(S57F)中变化的两个接触残基。
图2是人(SEQ ID NO：1、1-219)、cyno(SEQ ID NO：2、1-220)、和小鼠TF-ECD(SEQ ID NO：3、1-221)氨基酸残基比对，从而显示了接触鼠抗体TF8-5G9(Huang等人，1998J Mol Biol275：873-94)和10H10以及已知与凝血因子FVII／VIIa和FX接触的那些残基的残基位置。
图3显示了具有接触5G9和10H10的互补位以及凝血因子FVII和FX指示的区域的人TF-ECD的三维投影，其中仅残基L104和T197与10H10和FX二者接触。
图4显示了鼠抗体10H10(分别为SEQ ID NO：4和5)、抗体M59的人框架适应序列(分别为SEQ ID NO：19和23)、以及两个选择的亲和力成熟的可变域序列H116(SEQ ID NO：133)和H171(SEQ ID NO：139)的重链(上部比对)和轻链(下部比对)可变域的氨基酸序列比对。
图5显示了与同种型对照B37相比，27个亲和力成熟的mAb对0.24ug／ml处FVIIa诱导MDB-MB-231乳腺恶性肿瘤细胞的IL-8释放的相对抑制百分比。
图6显示了在MDA-MB231肿瘤细胞植入免疫减弱的小鼠后一定天数内肿瘤体积的曲线图，其中给药M1593的组降低了已建立的肿瘤生长。
图7显示了在A431人鳞状肿瘤细胞植入免疫减弱的小鼠后一定天数内肿瘤体积的曲线图，其中给药M1593的组降低了已建立的肿瘤生长。
图8显示了人PBMC的靶细胞溶解百分比(MDA-MB231细胞)对鼠可变域-人IgG1(M1)、具有位置234和235处丙氨酸替换的鼠可变域-人IgG4、未修饰的CHO中产生的野生型IgG1的M1593、针对产生具有低岩藻糖含量的聚糖选择的CHO系中产生的M1593-LF、和具有S239D和1332E处Kabat位置替换的M1593-DE的MAb浓度的曲线图。
序列表描述
Figure BDA0000381789370000071
Figure BDA0000381789370000081
Figure BDA0000381789370000111
具体实施方式
缩写
TF＝组织因子，huTF＝人组织因子，muTF＝鼠组织因子，cynoTF＝食蟹猴组织因子，TF-FVIIa＝组织因子-因子VIIa复合物，TF／FVIIa＝组织因子-因子VIIa复合物，HC＝重链，LC＝轻链，v区＝可变区，VH＝重链可变区，VL＝轻链可变区，CCD＝电荷耦合装置，CDR＝互补决定区，CHES＝2-(N-环己基氨基)-乙磺酸，EDTA＝乙二胺四乙酸，ECD＝胞外域，HEPES＝N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2-乙磺酸，HEK＝人胚肾细胞，MES＝2-(N-吗啉代)乙磺酸，PAR＝蛋白酶激活受体，PBMC＝外周血单核细胞，PBS＝磷酸盐缓冲盐水，PDB＝蛋白数据库，PEG＝聚乙二醇，SDS PAGE＝十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SEC＝尺寸排阻层析，MAb＝单克隆抗体，FR＝抗体框架，HFA＝人框架适应。
定义和术语解释
如本文所用，“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段或其单链。因此，抗体包括任何包含如下分子的蛋白或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，诸如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区、或其任何部分、或可整合进本发明抗体中的结合蛋白的至少一部分。术语“抗体”还旨在涵盖抗体、其消化片段、指定部分及变体，包括抗体模拟物或包含模拟抗体或其指定片段或部分的结构和／或功能的抗体部分，包括单链抗体和单域抗体及其片段。功能片段包括针对预选靶标的抗原结合片段。涵盖于抗体的“抗原结合部分”术语中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH域组成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)由VH域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成的连接肽连接，所述连接肽使得它们可制成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成一价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science242：423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖于抗体的“抗原结合部分”术语中。使用本领域的技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选出效用方式与完整抗体相同的片段。相反地，可用scFv构造文库筛选抗原结合力，之后使用常规技术将其与编码人种系基因序列的其他DNA拼接在一起。此类文库的一个例子是“HuCAL：人组合抗体文库”(Knappik，A.等人，J MolBiol(2000)296(1)：57-86)。
术语“CDR”是指抗体的互补决定区或高变区氨基酸残基，这些氨基酸残基参与或负责抗原结合。人IgG抗体亚型的高变区或CDR包含来自轻链可变域中残基24-34(L-CDR1)、50-56(L-CDR2)和89-97(L-CDR3)以及重链可变域中残基31-35(H-CDR1)、50-65(H-CDR2)和95-102(H-CDR3)的氨基酸残基(如Kabat等人(1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.)所描述)和／或来自轻链可变域中高变环(即残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3))以及重链可变域中高变环26-32(H1)、52-56(H2)和95-101(H3)的那些残基(如(Chothia和Lesk，1987J.Mol.Biol.196：901-917)所描述)。Chothia和Lesk将结构保守的高变环称为“正则结构”。框架或FR1-4残基是那些可变域残基而不是且排除高变区。Chothia和Lesk的编号体系通过在以小写字母符号表示的指定残基处显示扩展来考虑环中残基的编号差别，例如30a、30b、30c等。最近，已发展并广泛采用了通用编号体系，即国际免疫遗传学信息体系(intemational ImMunoGeneTics information)(IMGT)(LaFranc等人，2005.Nucl Acids Res.33：D593-D597)。
本文中，CDR以氨基酸序列以及轻链或重链中的位置通过顺序编号来表示。由于CDR在免疫球蛋白可变域的结构中的“位置”在物种间是保守的且存在于称为环的结构中，因此通过使用根据结构特征对齐可变域序列的编号体系，容易鉴定CDR和框架残基。这种信息用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移接和置换到来自通常是人抗体的受体框架中。
本文所用的术语“Fc”、“含Fc的蛋白”或“含Fc的分子”是指具有至少一个免疫球蛋白CH2和CH3结构域的单体、二聚体或异二聚体蛋白质。CH2和CH3结构域可形成蛋白质／分子(例如抗体)的二聚体区的至少一部分。
术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征，以及比电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于与前者而不是后者的结合在变性溶剂存在的情况下会丧失。
如本文所用，KD是指解离常数，具体地讲，是指抗体对预定抗原的KD，并且是抗体对特定靶标的亲和力的测量。高亲和力抗体对预定抗原的KD为10-8M或更低，更优选10-9M或更低，并且更优选10-10M或更低。KD的倒数是KA，为缔合常数。如本文所用，术语“kdis”或“k2”或“kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。“KD”是解离速率(k2，也称为“解离率(off-rate)(koff)”)与缔合速率(k1)或“结合率(on-rate)(kon)”的比率。因此，KD等于k2／k1或koff／kon，并且以摩尔浓度(M)表示。它遵循下列原则，即KD越小，结合越强。因此与10-9M(或1nM)相比较，10-6M(或1微摩尔)的KD表明为弱结合。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位呈现出单一的结合特异性和亲和力。该术语也包括“重组抗体”和“重组单克隆抗体”，因为所有抗体都是通过重组方法制备、表达、生产或分离的，例如(a)从动物或杂交瘤分离的抗体，所述抗体通过抗体分泌动物细胞和融合配偶体来制备的；(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离；(c)从重组的、组合的人或其他物种的抗体文库分离的抗体以及(d)用任何其他方法制备、表达、生产或分离的抗体，所述方法涉及将免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列拼接。如本文所用，“分离的抗体”意指这样的抗体：基本上不含其他具有不同抗原特异性的抗体。然而，与人TF表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体对其他相关抗原(例如，来自其他物种(例如，TF物种同源物))可具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和／或化学物质。在本发明的一个实施例中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体组合被混合在成分明确的组合物中。
如本文所用，“特异性结合”、“免疫特异性结合”和“免疫特异性地结合”是指抗体与预定抗原的结合。通常，抗体以10-7M或更小的解离常数(KD)结合，并且与预定抗原结合的KD为其与除预定抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)结合的KD的至少1／2。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。如本文所用，“高度特异性”结合是指抗体对特定靶表位的相对KD为该抗体与其他配体结合的KD的至少1／10。
如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG)。一些抗体种类还包括亚类，所述亚类也是由重链恒定区编码的，并且还在恒定区结构域(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)内的特定残基处用低聚糖修饰，所述恒定区结构域还将生物功能赋予抗体。例如，在人抗体同种型中，IgG1、IgG3和现存较少的IgG2呈现出与鼠IgG2a抗体一样的效应子功能。
所谓“效应子”功能或“效应子阳性”是指抗体包含与抗原特异性结合域有所区别的域，该域能够与受体或其他血液组分(例如补体)相互作用，导致例如巨噬细胞募集，以及引起由抗体的抗原结合域所结合的细胞破坏的事件。抗体具有通过效应分子的结合而介导的几种效应子功能。例如，补体的C1组分结合抗体会激活补体系统。补体的激活对细胞病原体的调理和溶解是重要的。补体的激活会刺激炎症反应，并且还可涉及自身免疫性超敏反应。另外，抗体通过Fc区结合细胞，即抗体Fc区上的Fc受体位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有许多对不同种类的抗体有特异性的Fc受体，所述抗体包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)以及IgM(μ受体)。将抗体结合到细胞表面上的Fc受体会引发许多重要的和各式各样的生物反应，包括吞噬和破坏抗体包裹的颗粒，清除免疫复合物，杀伤细胞溶解抗体包裹的靶细胞(被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，或ADCC)，释放炎性介质，胎盘转移和调节免疫球蛋白产生。
术语“组织因子蛋白”、“组织因子”和“TF”用于指具有与如下所述的天然存在的人组织因子或重组组织因子对应的氨基酸序列的多肽。天然存在的TF包括人物种以及其他物种(诸如兔子、大鼠、猪、非人灵长类、马、鼠和绵羊)的组织因子(参见例如，Hartzell等人，(1989)Mol.Cell.Biol.，9：2567-2573；Andrews等人，(1991)Gene，98：265-269；和Takayenik等人，(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.，181：1145-1150)。人组织因子的氨基酸序列由UniProt记录P13726(SEQ ID NO：1)，食蟹猴(SEQ ID NO：2)和UniProt P20352的鼠(SEQ ID NO：3)给出。其他哺乳动物组织因子蛋白的氨基酸序列是众所周知的或可通过常规技术获得的。
本发明的抗体对于向人受试者施用或对于接触人组织是有用的，其中期望阻断由TF信号传导引起的细胞、组织、或器官上表达的人TF功能，并且其中也期望基本上不改变由TF：FVIIa复合物的形成引起的TF促凝血功能。此类用途可见于肿瘤的治疗，具体地，乳腺、前列腺、肺、胰腺和卵巢的原发性或继发性实体肿瘤。
本发明也包括编码本发明的抗体序列的核酸，所述抗体序列可与本领域已知的那些序列组合以用于通过重组方法或周围环境中抗体表达信息的转移的构建和制造，其中期望此类培养物中、原位和体内形成它们。能产生本发明抗体的此类核酸的操作方法是本领域的技术人员熟知的。
本发明还提供了诸如药学上可接受的制剂或用于分离形式的本发明抗体施用和储存的稳定制剂。
1.抗体组合物
性质
本发明基于称为10H10的与人TF结合的非凝血阻断鼠抗体的意外发现(Edgington等人，US5,223,427)，该鼠抗体能够废除某些细胞中TF信号传导(Ahmed等人，2006，上文引用的，WO2007／056352A2)。因此，本发明的抗体是保留鼠抗体10H10的结合表位的抗体，该抗体不与组织因子竞争FVIIa结合并且基本上不阻断促凝血、TF-VIIa复合物的酰胺分解活性却阻断TF-VIIa介导的信号传导及下游致癌效应(诸如细胞因子IL-8释放)。本发明的抗体适于在IMGT数据库中表示的人种系IgG基因，并且保留与人TF结合而不干扰人血浆中钙存在下TF引发凝血的能力。
通常，可通过评价以下能力来评价保留鼠抗体10H10结合表位的抗体：抗体与TF结合和与10H10竞争结合到人TF而同时与不存在所述抗体的类似人血浆样品相比，在人血浆存在下存在于包含TF的样品时，将基本上不延长TF引发血浆凝固所需的时间。在另一个方面，可使用本领域已知的技术对抗体的表位物理作图，包括但不限于删除诱变、替换诱变、肽片段鉴定后的抗体结合的TF的限制性蛋白水解、以及共结晶和X射线衍射方法以对TF主要结构的原子结构和抗体结合域邻近作图，从而定义了抗体和人TF之间的三维缔合(图1)。
因此，表位可被定义为与FVIIa结合位点不重叠(图2和3)。更具体地，本发明的抗体结合的表位可接触不接触FVII的TF的N域中一个或多个残基(由SEQ ID NO：1表示的成熟链的残基1-104)，诸如残基65-70，并且不接触C域中残基K165和K166，这对于基质结合(Kirchofer等人，2000Thromb Haemostat84：1072-81)而不干扰人血浆中钙存在下TF引发凝血的能力是重要的。
在一个实施例中，抗体的结合率(ka，1／M·s)大于1×10-5。在另一个实施例中，抗体对TF的解离率(kd，1／s)小于1.0×10-5，并且所得KD小于1×10-9M(小于1nM)。在具体实施例中，所述抗体为具有小于0.5×10-9M的KD的人种系基因适应抗体。在一个实施例中，所述抗体具有选自如表11所示的重链和轻链配对的那些结合域，诸如M1639、M1645、M1647、M1652、M1641、M1644、M1587、M1604、M1593、M1606、M1584、M1611、M1596、M1601、M1588、M1594、M1607、M1612、M1595、M1599、M1589、M1592、M1583和M1610。
抗体组合物还可表征为包含选自由SEQ ID NO：6-166给出的一个或多个氨基酸序列的结合域中的氨基酸残基序列。
具有改变的Fc功能的抗体变体
在通过重组方法扩增产生的治疗单克隆抗体时，探究了这些复合物组合物的特征和性质。虽然免疫特异性和抗原靶特征一般在可变域和亚域(诸如高变区(也称为CDR)的环端)中，复合物与由恒定域(诸如IgG的Fc部分)形成的结构提供的其他受体和血清组分的相互作用。
可通过若干个熟知的体外测定法比较抗体和其他含Fc的蛋白的功能。具体地，所关注的是Fcγ受体的FcγRI、FcγRII和FcγRIII家族的成员的亲和力。可使用重组可溶形式的受体或细胞缔合形式的受体进行这些测量。此外，例如可使用重组可溶性FcRn，通过BIAcore来测量FcRn的亲和力，FcRn这种受体起到延长lgG的循环半衰期的作用。利用基于细胞的功能性分析(例如ADCC测定法和CDC测定法)可深入了解特定变体结构的可能的功能结果。在一个实施例中，ADCC测定法被配置成将NK细胞作为主要的效应细胞，从而反映对FcγRIIIA受体的功能效应。吞噬作用测定法也可用于比较不同变体的免疫效应子功能，而测量细胞应答(例如过氧化物或炎性介质释放)的测定法也可用于进行比较。例如在使用抗CD3抗体的变体的情况中，也可使用体内模型来测量小鼠中T细胞活化，该活性依赖于接合特定配体(例如Fcγ受体)的Fc域。
2.组织因子信号-阻断抗体的生成
具有本申请描述的抗体的特征和生物活性的抗体可包括或来源于任何哺乳动物，例如但不限于人、小鼠、兔子、大鼠、啮齿动物、灵长类、山羊、或它们的任何组合，并且包括分离的人、灵长类、啮齿动物、哺乳动物、嵌合、人或灵长类适应的抗体、免疫球蛋白、裂解产物和其他特定部分及其变体。可由本领域已知的任何方法(诸如杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495-497))和使用永生的融合配偶体与B细胞融合的相关方法来制备单克隆抗体。本发明中使用的抗体通过克隆和表达由针对特异性抗体的产生选择的单个淋巴细胞生成的免疫球蛋白可变区cDNA，也可使用单个淋巴细胞抗体方法生成，例如描述于Babcook，J.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(15)：7843-78481；WO92／02551；WO2004／051268和国际专利申请号WO2004／106377中的方法。
如本文所述的包括靶结合域或亚域、恒定域和功能性非靶结合域(诸如Fc域)的抗体可源于本领域熟知的多个方法。在一个方面，天然存在的抗体域的序列能方便地从公布的或联机文献或数据库(诸如V-base(由MRC Centre for Protein Engineering提供)、国家生物信息中心(NCBI Igblast)，或由国际免疫遗传学信息体系(Intemational ImmunogeneticsInformation
Figure BDA0000381789370000181
)提供的ImMunoGeneTics(IMGT)数据库)获得。
人抗体
本发明还提供了结合人TF的人免疫球蛋白(或抗体)。这些抗体也可表征为工程化或适应获得的。所述免疫球蛋白具有基本上来自人种系免疫球蛋白的一个或多个可变区并且包括已知参与抗原识别的残基的定向变异，所述残基例如Kabat的CDR或结构上限定的高变环的残基。所述一个或多个恒定区(如果存在)也基本上来自人免疫球蛋白。人抗体表现出对TF至少约10-6M(1μM)、约10-7M(100nM)、10-9M(1nM)、或更小的KD。为了影响亲和力的变化，例如，改善人抗体对TF的亲和力或降低人抗体对TF的KD，可对CDR残基或其他残基进行替换。
用于产生结合TF的人抗体的来源优选为本文提供的序列，这些序列为包括选自SEQ ID NO：129-163的序列的可变区、选自SEQ ID NO：28-61的FR、和CDR，其中CDR选自使用展示在丝状噬菌体颗粒上的全套人源Fab鉴定为能够结合人TF并与食蟹猴TF交叉反应的SEQ ID NO：6-11、27、62-128的一个或多个。
任何非人CDR至任何人可变域FR的替换可能不允许来自CDR起源的亲本可变FR构象提供的相同空间取向。在最终Mab中将配对的重链和轻链可变框架区可以来源于相同或不同人抗体序列。人抗体序列可为天然存在的人抗体序列，来源于人种系免疫球蛋白序列，或可为几个人抗体和／或种系序列的共有序列。
合适的人抗体序列可通过计算机比较小鼠可变区的氨基酸序列与已知人抗体的序列来进行识别。分别进行重链和轻链的比较，但是每种比较的原则是相同的。
就实验方法而言，已发现它特别便于创建变体序列文库，可以根据所期望的活性、结合亲和力或特异性来对该变体序列文库进行筛选。用于创建此类变体文库的一种形式为噬菌体展示载体。作为另外一种选择，可使用编码可变域中靶残基的核酸序列的变异的其他方法生成变体。
确定是否需要进一步替换以及选择用于替换的氨基酸残基的另一种方法可使用计算机建模来完成。用来产生免疫球蛋白分子三维图像的计算机硬件和软件可广泛获得。通常，分子模型的产生起始于免疫球蛋白链或其域的已解算的结构。将要建模的链与已解算的三维结构的链或域进行氨基酸序列相似性的比较，并且选择表现出最高序列相似性的链或域作为分子模型构建的起始点。对已解算的起始结构进行修饰，以允许被建模的免疫球蛋白链或域中的实际氨基酸与起始结构中的那些实际氨基酸之间的不同。然后将修饰的结构组装进复合免疫球蛋白中。最后，通过能量最小化以及通过证实所有原子彼此处于合适的距离且键长和键角在化学可接受限度内来改良模型。
由于密码的简并性，多种核酸序列将编码每个免疫球蛋白氨基酸序列。所需的核酸序列可通过固相DNA从头合成或通过早期制备的所需多核苷酸的变体的PCR诱变产生。描述于本申请中的所有编码该抗体的核酸明确地包括在本发明中。
如本文所述产生的人抗体的可变片段通常连接到人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。所述抗体将包含轻链和重链恒定区二者。重链恒定区通常包含CH1、铰链、CH2、CH3域，并且有时还包含CH4域。
所述人抗体可包含来自任何抗体种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和来自任何亚类(同种型)，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的任何类型恒定域。当需要人源化抗体表现出细胞毒活性时，恒定域通常为补体结合性恒定域，并且种类通常为IgG1。当可不需要此类细胞毒活性时，恒定域可以为IgG2类。人源化抗体可包含来自不止一个种类或同种型的序列。
将任选地与恒定区连接的编码人源化轻链可变区和重链可变区的核酸插入表达载体中。轻链和重链可克隆在相同或不同的表达载体中。将编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。此类对照序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列(参见Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，10029(1989)；WO90／07861；Co等人，J.Immunol.148，1149(1992)，所述文献全文以引用方式并入本文中用于所有目的)。
抗体或其Fc或组分和域也可通过此类域或组分的文库(例如噬菌体文库)选择来获得。可通过插入随机寡核苷酸文库或包含所关注序列的多核苷酸文库创建噬菌体文库，诸如来自免疫的动物或人的B-细胞(Hoogenboom等人，2000，Immunol.Today21(8)371-8)。抗体噬菌体文库包含允许单链Fv片段或Fab片段表达的一个噬菌体中重(H)和轻(L)链可变区对(Hoogenboom等人，2000参见上文)。可操纵噬菌粒文库的多样性来增加和／或改变该文库中单克隆抗体的免疫特异性以产生且随后鉴定另外的期望的人单克隆抗体。例如，可将编码基因的重(H)链和轻(L)链免疫球蛋白分子随机混合(改组)以在组装的免疫球蛋白分子中创建新的HL对。另外，可在免疫球蛋白多肽可变区的互补决定区(CDR)中对编码基因的H和L链中的一者或两者进行诱变，并且随后进行筛选以获得期望的亲和力和中和能力。也可通过下列合成创建抗体文库：选择一个或多个人FR序列，以及引入来源于人抗体谱的CDR盒的集合或通过所设计的变型(Kretzschmar和von Ruden2000，Current Opinion in Biotechnology，13：598-602)。多样性的位置不限于CDR，而也可包括可变区的FR片段或可包括除抗体可变区之外的片段，诸如肽。
可包括除抗体可变区之外的靶结合或非靶结合组分的其他文库为核糖体展示、酵母展示和细菌展示。核糖体展示是一种将mRNA翻译为它们的同源蛋白的同时保持蛋白附接到RNA的方法。通过RT-PCR回收核酸编码序列(Mattheakis，L.C.等人，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，9022)。酵母展示是基于膜相关α-凝集素酵母粘着受体aga1和aga2的融合蛋白的构建，是杂交型系统的一部分(Broder等人，1997.Nature Biotechnology，15：553-7)。细菌展示是基于靶与输出的与细胞膜或细胞壁缔合的细菌蛋白的融合(Chen和Georgiou2002.Biotechnol Bioeng，79：496-503)。
本发明还提供编码本发明的组合物的核酸，其作为分离的多核苷酸或作为表达载体的部分，所述表达载体包括与所述组合物或其定向诱变剂的原核生物、真核生物或丝状噬菌体表达、分泌和／或展示相容的载体。
3.产生本发明抗体的方法
一旦根据本文所述的结构和功能特性鉴定了本发明的抗体分子，编码抗体链的所需部分、或整个抗体链的核酸序列可被克隆、复制或化学合成并且可被分离并用于通过常规方法表达抗体。本发明的抗体可通过本领域已知的免疫球蛋白分子纯化的任何方法来纯化，例如，通过层析(例如，离子交换、亲和以及尺寸柱层析)、离心、差别性溶解度，或通过蛋白纯化的任何其他标准技术。此外，本发明的抗体或其片段可与本文所述或换句话讲本领域已知的异源多肽序列融合以有利于纯化。
宿主细胞选择或宿主细胞工程改造
如本文所述，选择用于表达重组的含Fc的蛋白或单克隆抗体的宿主细胞对最终组成至关重要，包括但不限于免疫球蛋白CH2域中装饰蛋白质的低聚糖部分的组成的变化。因此，本发明的一个方面涉及选择适当的宿主细胞，用于使用和／或开发表达所需治疗性蛋白的生产细胞。
此外，宿主细胞可为哺乳动物来源，或可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2／0、293、海拉细胞、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或它们的任何衍生的、永生的或转化的细胞。
作为另外一种选择，宿主细胞可选自不能使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，诸如属于天然或经工程化改造的大肠杆菌属物种(E.coli spp.)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp.)、或假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)的原核细胞或生物体。
4.使用抗TF抗体的方法
通过任何上述方法生成的组合物(抗体、抗体变体、或片段)可用于诊断、治疗、检测或调节人疾病或细胞、组织、器官、体液或通常是宿主的具体病理。如本文教导的，修饰抗体的Fc部分、Fc融合蛋白、或Fc片段以提供更多靶结合后特异性合适的效应子功能范围，但其中抗体中保留初始靶性质将针对具体应用和治疗指示生成抗体变体。
可使用本发明提供的组合物进行治疗的疾病或病理包括但不限于：恶性肿瘤；包括原发性实体肿瘤和转移瘤；癌，腺癌，黑素瘤，液体肿瘤诸如淋巴瘤，白血病和骨髓瘤和恶性肿瘤进展形成的侵袭性肿块；软组织恶性肿瘤；肉瘤，骨肉瘤，胸腺瘤，淋巴肉瘤，纤维肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肪瘤，成胶质细胞瘤，astrosarcoma，前列腺、乳腺、卵巢、胃、胰腺、喉、食道、睾丸、肝脏、腮腺、胆道、结肠、直肠、子宫颈、子宫、子宫内膜、甲状腺、肺、肾、或膀胱的恶性肿瘤。
至于本发明的抗体通过阻断TF参与下游细胞因子(诸如炎性细胞因子，IL-8)释放的能力降低组织中前致癌周围环境，本发明的抗体可预防性地使用或与定向抑制肿瘤增殖和血管生成的其他治疗结合使用。大多数年龄相关的恶性肿瘤来源于可再生组织的上皮细胞。上皮组织的重要成分是间质，由细胞外基质和多个细胞类型(包括成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞)构成的上皮下层。恶性肿瘤间质对肿瘤生长和进展是关键的，并且在间质细胞以及恶性上皮细胞上可表达TF。因此，由间质中TF：VIIa信号传导引起的下游因子的存在可产生协同致癌突变的前致癌组织环境以驱使赘生性组织的形成。
类似地，当脂肪组织中表达TF，它可改变病症(诸如肥胖症，代谢综合征和糖尿病)组织功能。本发明的抗体通过阻断TF：VIIa信号传导在治疗这些病症中可以是有用的。一些TF：FVIIa信号传导下游产生的因子(包括IL-8和IL-6)是强大的炎性介质。因此，本发明的抗体的另外用途包括炎性病症(诸如但不限于：类风湿性关节炎，炎性肠疾病和哮喘)的治疗。
由于本发明的抗体抑制TF：VIIa信号传导并降低促进血管生成的下游效应，本发明的抗体可用于治疗除恶性肿瘤之外的涉及血管生成的其他疾病、失调、和／或病症。这些疾病、失调、和／或病症包括但不限于：良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；动脉粥样硬化斑块；眼睛的眼血管生成疾病，例如糖尿病性视网膜病，早产儿视网膜病，黄斑变性，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生，发红，成视网膜细胞瘤，葡萄膜炎和翼状胬肉(异常血管生长)；类风湿性关节炎；牛皮癣；延迟伤口愈合；子宫内膜异位；血管发生；肉芽发生；增生性瘢痕(瘢痕疙瘩)；骨折不愈合；硬皮病；沙眼；血管粘附；心肌血管生成；冠状动脉侧支；脑侧支；动静脉畸形；缺血性肢体血管生成；Osler-Webber综合征；斑块新血管形成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤；纤维肌性发育异常；伤口肉芽发生；克罗恩氏病；和动脉粥样硬化。
至于本发明的抗体抑制TF:VIIa信号传导，该抗体可用于治疗和/或诊断快速增生性疾病、失调、和/或病症，包括但不限于赘生物。该抗体可通过直接或间接相互作用抑制失调增殖。可由本发明的抗体治疗、和/或诊断的快速增生性疾病、失调、和/或病症的例子包括快速增生性疾病、失调、和/或病症(包括但不限于高丙种球蛋白血症、淋巴组织增生性疾病、诸如卡斯尔曼病的失调、和/或病变蛋白血症、紫癜、肉样瘤病、Sezary综合征、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、高歇氏病、组织细胞增多病的病症)和器官、组织或体液房室中的任何其他快速增生性疾病。
本发明的抗体的另外方面可用于治疗包括但不限于抗体的直接细胞毒作用(例如由互补序列(CDC)或由效应子细胞(ADCC)介导的)、或抗体的间接细胞毒作用(例如免疫交联物)。
虽然已用一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在下列实例中公开，所述实例不应理解为对本权利要求的范围的限制。在实验性描述中，某些试剂和工序用于产生蛋白或抗体或特定片段。下文描述了用于表征抗体的常规分析方法。
材料和方法
蛋白和抗体标准物
以两种形式构建人TF重组胞外域(ECD)：基于ELISA和Biacore的定向结合测定法，具有C末端His6-标记肽的哺乳动物系统中表达TF成熟链(SEQ ID NO：1)的氨基酸1-219；共晶体学研究，具有C末端His6-标记肽的细菌系统中表达SEQ ID NO：1的氨基酸5-213。使用蛋白上的NHS酯化学靶胺残基将人TF1-219生物素酰化。对于凝血测定，使用
Figure BDA0000381789370000241
(Dade Behring Inc.cat#B4212)、与用于诊断用途的磷脂、钙、缓冲液和稳定剂组合的冻干的重组人组织因子。
使用PCR从分离自食蟹猴睾丸组织(可从BioChain Institute(Hayward，CA)获得)的cDNA克隆食蟹猴(cyno)TF-ECD(SEQ IDNO：2)。
几个抗体被用作参照抗体：i)从初始杂交瘤TF9.10H10-3.2.2(US7223427)克隆的10H10；ii)10H10小鼠-人嵌合体，包括具有人IgG1／κ恒定区的SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，命名为M1；iii)M59，包含六个10H10的CDR并具有亲和力成熟的亲本抗体功能的人FR适应抗体，包括具有人IgG1和人k恒定区的SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：23；iv)鼠抗人组织因子抗体TF8-5G9(US7223427)；v)抗体5G9的人源化形式，称为CNTO860、人IgG1／κ(US7605235)；和vi)与无关抗原(RSV)结合的同种型对照(人IgG1／κ)抗体，称为B37。
抗体的表达和纯化
使用常规工序来表达和纯化所公开的抗体。对于初筛，96孔板HEK293E细胞中瞬时表达编码这些分子的DNA，并且转染后96小时测试上清液活性(结合)。针对中试规模表达和纯化鉴定和选择命中。中试规模表达在750ml体积的HEK293F细胞或CHO-S中瞬时完成。通过Protein A层析纯化收获的上清液，并且针对它们的亲和力和功能活性评价经纯化的蛋白。此外，通过SDS-PAGE、SE-HPLC和交叉相互作用层析(CIC)，生物物理表征经纯化的蛋白。也针对每个变体计算理论等电点(pI)。来自中试规模表征，在WAVE生物反应器中转染一组最终主要候选并通过Protein A层析纯化。
Fab产生和单克隆Fab ELISA
小量制备来自噬菌体淘选轮的甘油原液，并且通过NheI／SpeI消化离体pIX基因。重新连接后，将所述DNA转化到TG-1细胞中，并且使其在LB／琼脂平板上生长过夜。第二天，挑取菌落，使其生长过夜，并且所述培养物用于(i)菌落PCR和V区测序；以及(ii)诱导Fab产生。对于Fab产生，将过夜培养物在新培养基中稀释10-100倍并使其在37摄氏度下生长5-6小时，由包含IPTG的新鲜培养基添加诱导Fab产生，并且使培养物在30摄氏度下生长过夜。次日，停止旋转培养物，并且上清液(包含可溶性Fab蛋白)用于Fab ELISA。
对于Fab ELISA，通过多克隆抗Fd(CH1)抗体将Fab捕集到平板上。适当洗涤和封端后，以0.2nM浓度加入生物素酰化的hTF。这个浓度能分级Fab变体，其定义为亲本的百分比结合，其中以所有平板中对照存在的亲本Fab被定义为100％结合。通过HR交联的链霉抗生物素蛋白和在读板机中读出的化学发光检测生物素酰化的hTF。
基于TF-ECD结合Mab的ELISA
使用化学发光检测的溶液相定向TF结合ELISA用于从人框架适应文库分级首个结合子。96孔黑色maxisorp板用在pH9.4的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中稀释的100uL4ug／ml山羊抗人IgG FC涂覆，4℃下过夜，并且然后用缓冲液(具有0.05％Tween-20溶液的PBS)洗涤三次并用300μl1％BSA/10mM PBS溶液封端1小时，随后如之前一样洗涤。将样品或标准物在测定缓冲液中稀释至50ng／ml(PBS+05％Tween中1％BSA)且将100ul添加到测定平板，室温下摇动1小时。将所述平板洗涤三次，并且将100ul／孔具有His标记的人或食蟹猴TF-ECD以在测定缓冲液中稀释的100ng／ml添加，并且室温下孵育2小时。洗涤后，将100ul／孔交联五his的Qiagen过氧化物酶以在测定缓冲液中1：2000稀释度添加，并且室温下摇动孵育1小时。将BM ChemiLum Substrate(BM Chemilum，POD，Roche)以1：100稀释度新鲜配制成缓冲液，并且在最终洗涤后将100ul添加到平板。10分钟后，在Perkin Elmer Envision Reader，BM ChemiLum程序上读出板。
通过FACS的抗组织因子mAb的MDA-MB-231全细胞结合
该测定用于检测抗体与乳腺恶性肿瘤细胞表达的内源性人TF的定向结合。在FACS缓冲液(PBS中1％FBS)中平行方式制备四点滴度的测试mAb。以具有1：4稀释度的1,000ng／ml滴度开始。M1(亲本分子)用作阳性对照，而B37(抗RSV mAb)用作阴性／同种型对照。未破坏的细胞和第二抗体，FACS缓冲液1：200中Cy-5交联的山羊抗人IgG Fc抗体用作对照并在使用前立即制备。
使用标准组织培养物技术，用PBS(w／o Ca+2／Mg+2)冲洗培养瓶中附着的MDA-MB-231细胞一次。用维尔烯提升细胞并在聚苯乙烯V底板中计数细胞和种子200,000细胞／孔。FACS分析方案：组织因子结合。将细胞在Allegra X-15R离心机4℃下以450×g3分钟造粒，重悬于FACS缓冲液(PBS中2％FBS)且以200,000细胞／孔放置200uL。将细胞在4℃下以450×g3分钟造粒。弃去上清液并添加100uL／孔测试或对照mAb至指定的孔并冰上或4℃下孵育1小时(+／-10分钟)。将细胞在4℃下以450×g3分钟造粒。弃去上清液并在FACS缓冲液中洗涤细胞一次。以200uL／孔FACS缓冲液重悬细胞并将细胞在4℃下以450×g3分钟造粒。弃去上清液，并且添加100uL／孔第二抗体至指定的孔(triterate)并冰上孵育1小时(+／-10分钟)。将细胞在4℃下以450×g3分钟造粒。弃去上清液并在将细胞重悬于200uL／孔FACS缓冲液之前(triterate)在FACS缓冲液中洗涤细胞2次。将细胞在4℃下以450×g3分钟造粒。弃去上清液并将细胞重悬于100uL／孔CytoFix缓冲液中。通过流式细胞术(BD FACSArray)分析反应。通过入口未破坏的对照孔中的主要细胞群并将该入口应用到整个数据集，将FlowJo软件用于FACS数据分析。以所应用入口的红色通道中的几何平均荧光强度(MFI)表导出数据。
热荧光(Thermofluor)测定
热荧光技术是当分子被加热时，未折叠分子的动力学测量。当分子被加热时，染料(ANS)能够与分子(由于其未折叠)结合。当染料与分子结合时，所述染料将发出荧光，并且随时间测量这个荧光。在该测定中，从37-95℃测量并每0.5℃检测未折叠的抗体。也测量了鼠和嵌合体形式(10H10、M1、5G9和CNTO860)的二者亲本分子的Tm，以及具有被用作测定对照的已知Tm的2个mAb(Emmp4A5和Emmp5F6)。
该测定用于预测人框架适应文库变体的热稳定性。将纯化的抗体在PBS中稀释至0.5mg／mL，并且向每个孔添加2ul样品至总1ug样品／孔。平行方式添加每个样品。原液ANS为DMSO中500mM。将原液ANS1：12稀释到DMSO(至40mM)中；通过组合20ul40mM ANS溶液、2.8ul10％Tween和1.98mL PBS制备Dye／Tween溶液；添加2uL Dye／Tween溶液和2ul油。离心板(450rpm2min)。热荧光设置：将Shutter设定成手动，RampTemperature0.5C／s，Continuous Ramp，Temperature Ramp：50-95℃。在高T.，Exposure time10s／1rep.，Gain normal＝2，选择“Single SC Image／plate”下选择保持15。
交叉相互作用层析(CID)
为了确定多种抗体与其他人抗体的相互作用，使用与人IgG偶联的柱(Sigma Aldrich)进行层析实验。简而言之，按照制造商说明将50mg人IgG偶联到1ml NHS-Sepharose柱(GE Healthcare)。通过用0.1M Tris，pH8，0.5M NaCl洗涤来移除未偶联的IgG，并且用相同缓冲液封端未反应的NHS基团。通过测量未反应偶联缓冲液中剩余的蛋白浓度并使用Pierce’sCoomassie Plus Assay Kit(Thermo Pierce)洗涤且从之前固定的蛋白的量中减去来确定偶联效率。对照柱也使用相同方案仅没有将蛋白添加到树脂制备。
对照柱用PBS，pH7，0.1ml／min流量平衡后首先在Dionex UltiMate3000HPLC上运行。首先将201原液蛋白溶液注入以确保封端非特异性结合位点，然后注入20110％丙酮以检查柱的完整性。
将被分析的样品在PBS，pH7稀释至0.1mg／ml。将20μL每个样品注入到每个柱并且允许其以0.1ml／min运行30min。记录保留时间并且计算每个变体的保留因子(k’)。
k’计算为蛋白衍生化柱(IgG偶联柱)上保留时间tR和没有蛋白偶联到其上的柱的保留时间t0的差值。该计算也考虑两个柱上丙酮保留时间以使柱标准化。可接受的k’值小于0.3。
溶解度
为了确定多种抗体在室温下溶解度，使用离心过滤装置进行浓度实验。简而言之，在室温下将PBS中的抗体制剂添加到Vivaspin-15(15m1)离心过滤装置(30,000MWCO，Sartorius，Goettingen，Germany)。将过滤物在使用浮桶式转头的Beckman Allegra X15-R离心机中在20分钟间隔内以3000×g旋转。一旦体积降低至约2ml，将上清液转移到Vivaspin-4(4ml)过滤装置(30,000MWCO)并在20min间隔内以4,000×g离心。一旦体积降低至500l，将样品转移到Vivaspin-500过滤装置并以15,000×g在Eppendorf5424离心机中离心15分钟。重复该步骤直到蛋白浓度达到100mg／ml或更高。通过BioTek SynergyHT TM分光光度计上适当稀释液280nm和310nm处的吸光度来确定蛋白浓度。此时，停止离心，并将样品在室温下保持过夜以达到平衡。第二天早晨，检查样品的沉淀迹象。如果浓度大于100mg／ml，则此过程终止。
因子VIIA诱导的IL-8抑制测定
该测定用于测试TF结合抗体是否中和来自人细胞表达TF的FVIIa诱导的IL-8释放。使用标准细胞培养技术，将人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)(ATCC：HTB-26)(适于生长在DMEM和10％FBS(Gibco：cat#11995和cat#16140)中)以20000细胞／孔(100,000细胞／mL)的密度放置在96孔细胞培养板(Nunc：cat#167008)中。允许在抗体治疗开始两天前以2ug／mL且经历没有FBS的DMEM中1：2或1：4系列稀释度回收细胞。在用人FVIIa(Innovative Research：cat#IHFVIIa，lot：2824)治疗前一小时，以没有FBS的DMEM中50nM的最终浓度添加抗体。将所述细胞放置在培养箱中24小时。治疗后，收集上清液并根据制造方案(R&DSystems：cat#D8000C)通过ELISA检测IL-8的数量。简而言之，在450nm和540nm处读出每个治疗样品的光密度(OD)。使用根据制造方案绘制的IL-8标准曲线，540nm处的读数用于校正测定板中的光不完全性，而450nm处校正的读数(OD450减去OD540)用于计算IL-8含量。没有收到抗体和FVIIa治疗的细胞的孔用于定义内源性IL-8水平，而仅收到FVIIa的细胞的孔用于定义“没有抑制”IL-8水平，从而分别定义了IL-8水平的最小值和最大值。标准化至最大值和最小值IL-8水平的MAb滴度治疗样品如上文所定义和抑制百分比所表达。标准化数据表示在柱状图中或适合于适于提取每个MAb的EC50值的四参数对数曲线图。
凝血测定
该测定用于使用人血浆在钙存在下并添加重组人TF制剂(Innovin，Dade Behring Inc)确定所述抗人TF抗体在体外是否阻断凝血。将抗人TF抗体在HBSS(Gibco，cat#14175)中稀释至2mg／ml抗体。将与柠檬酸钠(George King Biomedical，Novi，MI)合并的人血浆以1000rpm缓慢旋转5min并将澄清血浆转移到新管。在干净的96孔测定板(NUNC，cat#439454)的每个孔中，将25ul稀释的抗体添加到100ul人血浆。该反应通过将具有22mM CaCl2的HBSS中1：500稀释的125μl Innovin(DadeBehring Inc.，cat#B4212)添加到包含血浆(具有或具有抗体)每个孔中引发。使用SpectraMax M2e reader(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，在OD405处动力学监控凝血反应，立即引发接着的反应并在37℃下持续30min。针对抗体，使用Softmax Pro Software其花费达到50％最大光密度的时间(秒)来确定T1/2Max。将样品的时间(秒)标准化至每个板上的参照，然而，统计学上在样品列表没有抗体、10H10、以及所有10H10来源的和人适应变体的样品的平均时间150s和200s之间没有差别。
实例1：10H10的测序
在The Scripps Research Institute，La Jolla，CA生成的称为10H10的鼠抗体(US5223427，Morrisey等人，1988Thromb Res.52(3)：247-261)是由杂交瘤TF9.10H10-3.2.2产生的。此前未曾报道过来自10H10杂交瘤克隆的抗体序列。
使用5’RACE方法(Focus25(2)：25-27，2003；Mamyama1994Gene138，171-174)鉴定该序列，其中使用分别与小鼠IgG1恒定区和小鼠k恒定区的序列互补的5’GeneRacerTM(InVitrogen)引物和3’共有引物扩增两条抗体链(VH和VL)。使用5’GeneRacer嵌套式引物和3’共有引物的嵌套式PCR扩增用于生成更适合于序列分析的VL产物。
选择至少16个克隆以鉴定每条链的可变区。通过未知插入区使用引物测序。从ABI DNA Sequencer to Vector NTI(Invitrogen Informax)下载原始序列数据用于序列分析。鉴定了一种功能性VH和一种功能性VL。还分析VH和VL二者的基因以找出它们的天然信号序列、FR、CDR和J片段。
按照Kabat定义(Kabat等人，第5版，Public Health Service，NIH，Washington，DC，1991)，将10H10FR和CDR顺序编号并分段，除了对应于VH CDR-1的区。对于该区，使用Kabat和Chothia定义的组合(Raghunathan，G.，US2009／0118127A1；Chothia和Lesk，J Mol Biol196(4)：901-17，1987)。
表1：10H10可变区序列及其序列结构
Figure BDA0000381789370000291
Figure BDA0000381789370000301
将克隆的V区用人IgG1／κ恒定区工程化并克隆到用于在HEK293或CHO细胞系中重组表达的哺乳动物表达载体中，从而创建了命名为M1的小鼠-人嵌合抗体，其用于作为参照抗体的分析研究。针对产生用于晶体结构分析中的10H10Fab的目的，也将HC V区仅用人IgG1CH1域和C末端六聚组氨酸工程化。
实例2：非抗凝性组织因子抗体的表位作图
通过人TF ECD和对应的Fab片段之间的复合物的晶体结构确定进行10H10表位作图。在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达His标记的人TFECD(SEQ ID NO：1的残基5-213)并分别使用HisTrap HP柱(GEHealthcare)与Q HP柱(GE Healthcare)通过亲和与离子交换层析纯化。在HEK细胞中表达His标记的嵌合型式(小鼠V区，人恒定域)的10H10Fab并使用亲和(TALON柱，GE Healthcare)与尺寸排阻(HiLoad Superdex200柱，GE Healthcare)层析纯化。
通过将Fab与人TF ECD以摩尔比1∶1.2(TF过量)混合来制备复合物。将该混合物在室温下孵育20min并上样于用20mM HEPES，pH7.5和0.1M NaCl平衡的Superdex200柱(GE Healthcare)。将对应于主峰的级份合并，调节浓度至10mg／mL并用于结晶。在20℃下通过蒸气扩散方法结晶该复合物。从包含18％PEG8000(处于0.1M CHES，pH9.5中)的溶液中结晶10H10：TF复合物。对于X射线数据采集，将该复合物的一种晶体在补充有20％甘油的母液中浸泡几秒并以100K氮流快速冷冻。使用配有Satum944CCD检测器和X-streamTM2000cryo冷却系统(Rigaku)的RigakuMicroMaxTM-007HF microfocus X-ray发生器测量X射线衍射强度。使用大分子晶体学CCP4程序包(Collaborative Computational Proj ect，Number4.1994.Acta Cryst.D50，760-763)，通过分子置换确定所述结构。
TF ECD由两个拓扑相同的具有免疫球蛋白折叠的域组成。所述N末端域跨越残基1-103，并且所述C末端域跨越残基104-210(属于ECD，SEQID NO：1)。人们发现10H10表位居中在ECD残基K149-D150，这得到了在10H10轻链和轻链可变域之间的深袋。10H10和TF之间的接触面是广阔的并涉及所有六个CDR环(图1)。
值得注意的发现是10H10的TF表位不与FVII和FX结合位点重叠(图2和3)。另外，10H10和5G9(另一个具有阻断凝血能力的鼠人TF结合抗体，并且此前公布了其表位，Huang等人，1998J Mol Biol275：873-94)的表位部分地重叠说明这两种抗体之间与人TF竞争结合(图2和3)。
人TF ECD：10H10接触面
10H10在ECD的N和C末端域之间的接触面处结合TF。TF的凸形表面适合于抗体的凹形CDR表面。复合物形成时每个相互作用分子上内埋的总面积超过
Figure BDA0000381789370000311
。包括了与TF直接接触(将接触定义为
Figure BDA0000381789370000312
原子间距)的所有六个CDR。总共有24个表位残基和25个互补位残基。CDRL1、H1和H3形成大多数接触。形成10H10：TF复合物的表位和互补位的残基示意性地示于图1中。
10H10表位包括来自N域的两个片段和来自TF ECD的C域的三个片段。来自N域的两个片段与抗体相互作用：残基65-70与H-CDR1和H-CDR3相互作用，并且残基104与H-CDR1相互作用。C域中的三个片段与抗体相互作用：残基195和197与H-CDR1和H-CDR2相互作用，残基171-174与L-CDR1和L-CDR3相互作用，并且残基129-150与L-CDR1、L-CDR3、H-CDR1和H-CDR3相互作用；TF残基K149-D150位于表位中心；得到在VL和VH域之间形成的深袋，其中它们主要的配偶体分别是10H10的LC可变区(SEQ ID NO：5)的D97和HC可变区(SEQ ID NO：4)的W33。
B.抗体特异性
图2中比对了人、食蟹猴(cyno)(SEQ ID NO：2)和小鼠TF ECD(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。人和食蟹猴TF ECD序列之间具有很高的相似性，并且此二者在10H10接触残基中仅有一个残基不同：SEQ ID NO：1的位置197，其在cyno序列中为R(Arg)。由于单个H-CDR2残基接触人序列中T197，本文10H10来源的抗体组观察到的高水平的交叉反应性是可解释的。
通过比对人和小鼠TF序列，确定10H10物种特异性的表位残基明显在表位残基中发生显著氨基酸差异：与人TF接触的10H10的24个残基中，人和小鼠序列差异在SEQ ID NO：1对SEQ ID NO：3的N域中位置68、69、70和104以及C域中位置136、142、145和197处。这些差异符合10H10对小鼠TF的减弱的结合亲和力。
图2基于理论3D模型(图3)也表明了针对FVII和FX的人TF相互作用位点，该理论3D模型描述了它们缔合为三元复合物(Norledge等人，Proteins，53：640-648，2003)。抗体5G9在与FX结合位点部分地重叠的表位处结合TF。因此，5G9与FX竞争，并且这引起凝血级联的阻断。10H10不同于5G9，其不阻断凝血，而其有效地关闭通过TF缔合的PAR的信号传导。基于三元TF／FVII／FX复合物模型，人们期望10H10表位可在TF游离表面且围绕残基K149-D150居中。通过诱变和这种情况的早期迹象提供肽表位作图来作图10H10的结合。
本文TF ECD和10H10Fab之间的复合物的晶体结构提供空间作图方式，其中所述抗体可结合TF而不阻止FVII和FX与TF或彼此相互作用。由结构显示的10H10表位覆盖TF游离表面，虽然其理论上存在在三元复合物中。此外，10H10表位与凝血阻断MAb、5G9表位(Huang1998参见上文)、K149和N171的普通残基部分地重叠。10H10或5G9二者均不阻断FVII与TF结合。10H10的表位和FX也不重叠，但在Fab恒定域和当前模型中FX的蛋白酶(球状)域之间发生空间位阻。然而，应该指出的是，FX取向事实上可不同于所述模型，并且FX和TF之间的缔合可允许蛋白酶域中的一些柔性。在Fab可变和恒定域之间的弯角中也具有相当大的柔性，这可允许避免10H10与三元复合物结合时的位阻。
实例3：针对在人中使用调整结合域
治疗蛋白的功效可限于不需要的免疫反应。非人单克隆抗体可具有直链氨基酸序列的基本延伸和引起人免疫应答的局部结构构象。负责非人MAb与人抗体支架的靶结合的免疫特异性的残基转移更不会引起对靶抗原结合亲和力的基本损失。从而，这对于使用设计原理以创建引起小型免疫原反应的抗体分子而在注射到人时保留亲本非人分子的结合和生物物理概况具有很高的价值。
如此前US20090118127A1中描述和Fransson等人，2010J Mol Biol398：214-231中例证，人源化并恢复或增强结合亲和力以生成本发明的抗体物种均使用两步法，其在接合人TF时表现出鼠抗体10H10的靶效应。两步法，称为人框架适应(HFA)，由下列组成：1)人框架选择和2)亲和力成熟步骤。
在HFA方法中，将结合位点残基(CDR)与基于序列相似性和结构考虑选择的人种系基因组合。针对抗体的CDR分配的两个系统为：Kabat定义，其基于抗体序列的可变性；以及Chothia定义，其基于抗体三维结构的分析。六个CDR中，一个或另一个系统可用在它们分开处。就轻链CDR而言，使用Kabat定义。
就重链CDR3而言，Kabat和Chothia二者定义是相同的。就重链CDR1而言，使用Chothia定义来定义开端并且使用Kabat定义来定义末端(由W接着诸如V、I或A的疏水性氨基酸定义的模式)。就VH-CDR2而言，使用Kabat定义。然而，在大多数抗体结构中，这种基于序列的定义将FR3的一部分分配为属于CDR2。因此，这个CDR的较短型式(其在这个CDR的C末端区提早结束七(7)个残基，本文称为Kabat-7)也可被使用。
人FR选择
人FR(被定义为在不包含在抗原结合位点中的V区中的区)选自功能性人种系IGHV和IGHJ基因的全部。人种系基因序列的全部是通过搜索IMGT数据库(Lefranc2005)且编译所有“01”等位基因获得的。由这个编译，将丰富基因(氨基酸水平处100％相同)和具有未配对的半胱氨酸残基的那些从编译移除。基因编译的最后升级于2007年10月1日完成。
针对VH的HFA的人序列的初始选择基于人VH种系基因与包括FR-1至3以及H-CDR-1和H-CDR-2的小鼠VH区的整个长度的序列相似性。在下一个阶段，使用考虑CDR长度以及小鼠CDR和人序列之间的序列相似性二者的得分对选择的人序列进行有序分级。标准突变矩阵，诸如BLOSUM62替换矩阵(Henikoff和Henikoff1992Proc Natl Acad Sci U S A15；89(22)：10915-9)用于评分小鼠CDR和人序列比对，并且如果CDR环中具有插入和／或缺失则应用大罚分。基于IGHJ种系基因(Lefranc2005)与小鼠10H10序列，IGHJ4(SEQ ID NO：60)的序列相似性选择人FR-4。
使用类似工序针对VL选择人FR。在这种情况下，使用相同工序选择的IGVK种系基因用于IGHV基因，选择FR1-3和L-CDR1-3的基因作用。人IGJ-K2基因(SEQ ID NO：61)选择为FR4用于所有变体。
选择十一个VH和七个VL种系链。选择的VH基因主要来自IGVH-1基因家族：来自具有与较长和较短H-CDR2一起使用的IGVH1-69和IGVH1-f的IGVH1的6序列、来自IGVH3的2、以及与长和短H-CDR2一起使用的一IGVH5基因。VL基因表示六个IGVK2和一个IGVK4基因家族。
因此，VH变体H15、H19和H21具有较长H-CDR2(SEQ ID NO：7)，其分别对应于H22、H23和H24，其中使用较短小鼠CDR-H2(SEQID NO：27)。前缀“s”代表测试变体在β链区具有较少小鼠残基和较多人残基。使用的V区名称和使用的基因序列示于下文表2和3中。
表2：
多肽ID 使用的IMGT基因
H13 VH-10H10
H14 IGHV1-2
H15 IGHV5-a
H16 IGHV1-46
H17 IGHV1-3
H18 IGHV3-74
H19 IGHV1-69
H20 IGHV1-18
H21 IGHV1-f
H22 s1_IGHV5-a
H23 s1_IGHV1-69
H24 s1_IGHV1-f
表3：
肽ID IMGT基因名称
L1 VL-10H10
L2 IGKV4-1_B3
L3 IGKV2D40_O1
L4 IGKV2D-28_A3
L5 IGKV2D-29_A2
L6 IGKV2-30_A17
L7 IGKV2-24_A232
L8 IGKV2D-26_A21
96个Mab的文库(表示11重链和7轻链人FR变体加上鼠10H10嵌合链)在96孔格HEK293E细胞中表达以提供用于初筛的上清液。对于初筛，使用标准重组方法，将编码选择的可变域的DNA重组以形成完整的MAb，其在96孔板HEK293E细胞中瞬时表达。转染后96小时，测试来自培养物的上清液流体活性(结合)。
选择十九个变体进行HEK293-F细胞中试规模表达并基于初筛结果纯化。中试规模表达在750ml体积的HEK293F细胞或CHO-S中瞬时完成。通过Protein A层析纯化收获的上清液，并且针对它们的亲和力与功能性活性评价纯化的蛋白。此外，通过SDS-PAGE、SE-HPLC和交叉相互作用层析(CIC)生物物理表征纯化的蛋白。也计算每个变体的理论等电点(pI)。由中试规模的表征，一组最终主要候选在WAVE生物反应器中转染，并且通过Protein A层析纯化。
结合评价
亲本嵌合抗体、M1和HFA变体与人和cyno TF二者的结合以使用化学发光标记检测的定向ELISA方式进行。对于粗上清液中文库变体、样品或对照的初筛经标准化至spent FreeStyle293HEK培养基(Gibco)中50ng／ml并且以单个浓度确定测定。在本测定中，抗体的浓度为5ng(使用0.1ml)，并且TF ECD和抗原为His6-TF-ECD1-219(以10ng/孔的最终浓度使用)。
整个组合文库筛选的结果表明除了H14，所有其他VH与hTF具有不同强度的结合。几个HFA变体给出比亲本10H10(H13，L1)更高的结合信号，尤其是一些L3和L5组合。H18和H21不与人抗原以及其他VH结合且显示了与cyno抗原无意义结合。VL、L6和L8中彼此抗原不结合，而其他的在检测水平处结合。H14和L8在与任何VL组合时也产生低表达。77个抗体(VH、VL组合)的50个显示TF结合，如表4中所示。
表4：50个人TF结合人FR变体的vH和vL序列ID
抗体ID 轻链肽ID 轻链SEQ ID NO： 重链肽ID 重链SEQ ID NO：
M1 L1 5 H13 4
M9 L2 22 H15 12
M10 L3 23 H15 12
M11 L4 24 H15 12
M12 L5 25 H15 12
M14 L7 26 H15 12
M16 L2 22 H16 13
M17 L3 23 H16 13
M18 L4 24 H16 13
M19 L5 25 H16 13
M21 L7 26 H16 13
M23 L2 22 H17 14
M24 L3 23 H17 14
M25 L4 24 H17 14
M26 L5 25 H17 14
M28 L7 26 H17 14
M30 L2 22 H18 15
M31 L3 23 H18 15
M32 L4 24 H18 15
M33 L5 25 H18 15
M35 L7 26 H18 15
M37 L2 22 H19 16
M38 L3 23 H19 16
M39 L4 24 H19 16
M40 L5 25 H19 16
M42 L7 26 H19 16
M44 L2 22 H20 17
M45 L3 23 H20 17
M46 L4 24 H20 17
M47 L5 25 H20 17
M49 L7 26 H20 17
抗体ID 轻链肽ID 轻链SEQ ID NO： 重链肽ID 重链SEQ ID NO：
M51 L2 22 H21 18
M52 L3 23 H21 18
M53 L4 24 H21 18
M54 L5 25 H21 18
M56 L7 26 H21 18
M58 L2 22 H22 19
M59 L3 23 H22 19
M60 L4 24 H22 19
M61 L5 25 H22 19
M63 L7 26 H22 19
M65 L2 22 H23 20
M66 L3 23 H23 20
M67 L4 24 H23 20
M68 L5 25 H23 20
M70 L7 26 H23 20
M72 L2 22 H24 21
M73 L3 23 H24 21
M74 L4 24 H24 21
M75 L5 25 H24 21
M77 L7 26 H24 21
使用ELISA，基于对TF的相对结合亲和力，选择十个变体扩大表达和纯化规模。由BIAcore测量的KD总结、ELISA测定数据、全细胞结合、通过50nM FVIIa、2ug／ml Mab来自MDA-MB231细胞的IL-8诱导抑制、和由Thermoflour测定测量的Tm示于表5中。
表5：
Figure BDA0000381789370000391
几个新的人MAb变体表现出比M1(具有10H10可变链：H13和L1)更高的TF亲和力，并且一些为较低的。M61的KD(0.21nM)低于鼠亲本MAb(KD＝0.56nM)2.5倍。表5中的数据包括四个具有H15的Mab和四个具有H22的Mab，二者均由相同的种系基因(IGHV5-a)构建。具有H22和较短H-CDR2的那些通常比具有H15的对应的分子表现出更高的结合亲和力。虽然许多新的变体结合cyno TF，cyno结合亲和力的分级不同于与人TF结合的分级。
小鼠10H10MAb Tm为74.2℃。选择的分子Tm范围75至82.2℃。因此，HFA方法引起具有新的Fd区的抗体构建，并且也产生具有人域的稳定完整抗体变体，所述新的Fd区对人和非人灵长类TF具有提高的结合亲和力。
新抗体构建体的另外表征证实了抗体能够识别起源于人肿瘤组织(MDA-MB231乳腺恶性肿瘤衍生的细胞)细胞上的自身TF并且降低通过抑制MDA-MB231的IL-8诱导在VIIa存在下测量的TF信号传导。
另外的生物物理表征(溶解度和交叉相互作用层析)和测定结果涉及M59的选择，针对亲和力成熟，由可变区H22和L3构成。
实例4：抗体成熟
在pIX噬菌体展示系统中构建Fab文库，所述pIX噬菌体展示系统描述于美国专利No.6,472,147(Scripps)和公布为WO2009／085462的申请人共同未决的申请，其具有对限制性酶位点的小修饰。
基于具有hTF的复合物中10H10实验结构，针对VL和VH二者的多样性，设计了具有H116(SEQ ID NO：19)和L3(SEQ ID NO：23)配对的M59起始的两个文库。该文库在靶向多样性位置方面、以及用于多样性靶向位置的氨基酸中是不同的。一个文库使总共八个表示每个CDR的位置多样性，此前显示与TF接触。设计重点放在L1、L3、H1和H2上。不使接触L2的位置与大部分H3中的位置多样性。避免不稳定的或反应的氨基酸(诸如Cys和Met)。
设计第二组文库以使通过计算易于结合和未结合Fab晶体结构的溶剂确定的抗原结合位点周围的氨基酸多样性。在结合而且与溶剂分子接触时针对多样性靶向内埋的残基。使用这个方法鉴定了总共12个残基(6个在VL中并且6个在VH中)，用降低的八个氨基酸组使其多样性，包括：Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Gly(G)、His(H)、Ser(S)、Trp(W)和Tyr(Y)。估计组合文库的大小为812或1010个变体，其可使用标准文库限制性克隆技术覆盖。
对于CDR接触残基文库，使用核苷酸二聚体(N二聚体)合成方法，用15个氨基酸(除了Met，Cys，Lys，Gln和Glu的所有)使位置多样性。
根据本领域已知的淘选方案，将噬菌体外壳蛋白IX上展示的Fab文库对生物素酰化hT-ECD淘选，通过选择较慢解离率(提高解离率值)或较快结合率(降低结合率值)、或使用两者定向增加亲和力。淘选使用人和cyno TF二者作为靶抗原。噬菌体通过辅助噬菌体感染产生。通过添加SA珠找回结合子以形成珠／抗原／噬菌体复合物。在最终洗涤后，通过感染指数生长的TG-1大肠杆菌细胞拯救噬菌体。再次产生噬菌体并经受另外轮的淘选。
pIX基因是通过从选择的克隆的NheI／SpeI消化离体的，重新连接后，将DNA转化到TG-1细胞中并使其在LB／Agar平板上生长过夜。过夜培养物用于(i)菌落PCR并针对V区测序；和(ii)可溶性Fab产生。通过多克隆抗Fd(CH1)抗体，将所述可溶性Fab蛋白捕集到平板上。适当洗涤和封端后，以0.2nM浓度添加生物素酰化hTF，并且通过HRP交联的链霉抗生物素蛋白和之前读出的化学发光检测生物素酰化hTF。在这个浓度的hTF处，Fab变体的分级(被定义为亲本的结合百分比，其中作为对照存在在所有平板中亲本Fab被定义为100％结合)是可能的。
通过这个判据，选择了相对于M59Fab，100％或更高结合人TF的381个Fab。
选择的克隆的分析，成功表明对应于V区(SEQ ID NO：4或19)的位置27和30-32的重链CDR1(SEQ ID NO：6)的Y2、I5、T6和Y7处的某些变化。尽管没有接触残基，仅允许位置27为芳族氨基酸(Tyr和Phe)。对于位置30-32，其与10H10Fab中人TF SEQ ID NO：1的K68、T101、Y103和L104直接接触(图1)，位置30相对宽松，但31和32严格(表6)。
L-CDR2(SEQ ID NO：7)中L3、S6和S8(对应于SEQ ID NO：4或19的位置L52、S55和S57)(其为与10H10Fab中人TF SEQ ID NO：1的P194、S195和T197直接接触的残基(图1))中的变化一定程度上限制了允许替换的组。
H-CDR3中，N6位置(SEQ ID NO：8)(对应于SEQ ID NO：4或19的N104)使得其与显示被限制的人TF-ED(SEQ ID NO：1)的F147、G148和K149直接接触。
允许的氨基酸在通过噬菌体淘选且针对使用0.2nM人TF-ECD1-219的固相捕集测定的相当的结合亲和力筛选选择的每个文库位置中变化示于表6中。
表6：
Figure BDA0000381789370000421
对于选择的克隆中的VL，L-CDR1(SEQ ID NO：9)的S9、G10、N11和K13(对应于LC可变区(SEQ ID NO：5或23)的位置32、33、34和36)(其通过对接触人TF SEQ ID NO：1的E174、D129、S142、R144和D145(图1)表位作图显示)中的变化相对宽松的示于表7中。对于L-CDR2，残基W1(SEQ ID NO：5或23(Kabat残基编号50)中位置56)是接触残基，尽管显示残基E61对替换容忍度有限。轻链CDR3(SEQ ID NO：9)(对应于SEQ ID NO：5或23的残基位置97-100)(其与人TF SEQ IDNO：1的K149、D150、N171和T172直接接触(图1))中位置D97(Kabat位置91)是受限制的。基于与使用宽松氨基酸的人TF-ECD1-219克隆结合的亲和力的选择总结于表7中。
表7：
Figure BDA0000381789370000431
概括地说，通过基于接触位置中氨基酸的CDR位置的定向变异构建噬菌体文库，所述接触位置具有抗原人TF可变域H22(SEQ ID NO：19)和L3(SEQ ID NO：23)，随后通过淘选和选择在与起始序列相比相当的或更好的结合筛选测定中具有亲和力的物种，鉴定了一系列亲和力改善的Fab变体。
总体上，可获得对选自设计的HFA文库的VH和VL配对亲和力的适度增加。然而，从多样性接触残基的VH文库，严格噬菌体淘选后重新选择亲本氨基酸。仅两个互补位位置是显著变化的，如结构分析说明。亲和力成熟期间引入CDR的这两个氨基酸置换(T31P和S57F)包括接触残基。5倍亲和力改善可归因于与TF的S195接触的F57接触面的增加。VL与TF的相互作用看起来是塑性的，从而允许接触残基以及相邻残基的许多变化。
对于381VH和VL配对，选择43个进行进一步表征。选择的43个MAb表示27个不同VH和8个VL(参见表8重链和轻链序列配对)并且可分类成三个子组：组1变体具有相同轻链(L3，SEQ ID NO：23)，并且组2和组3通过八个轻链与两个不同重链(H116和H171，分别为SEQ ID NO：131和67)配对来表示。
表8：
Figure BDA0000381789370000441
Figure BDA0000381789370000451
对于作为M59具有相同轻链(L3，SEQ ID NO：23)的27个抗体的组，27个重链不同：在H-CDR1中三个位置处(GYTFX1X2X3WIE(SEQID NO：83)，其中X1选自A、D、G、I、L、N、P、R、S、T、V、Y；并且X2选自A、P、S和T；并且X3选自F、H和Y)；除了H189，其中H-CDR1为GFTFITYWIA(SEQ ID NO：81)，以及在H-CDR2中四个位置处(DIX1PGX2GX3TX4(SEQ ID NO：107)，其中X1选自I和L；X2选自S和T；X3选自A、F、H和w；并且X4选自D、H、I、L和N；除了H189，其中H-CDR2为DILPASSSTN(SEQ ID NO：105))，而H-CDR3和FR由H22序列(SEQ ID NO：19)未改变并且为SGYYGNSGFAY(SEQID NO：8)。对于这27个Mab的独特的重链组合物在下文中给出(表9)。
表9：
Figure BDA0000381789370000461
与H116相比，H171(SEQ ID NO：139)包含H-CDR1和H-CDR2中另外的变化(I31A和S55T)。
两组Mab通过八个LC(表10)与两个不同HC(H22(SEQ ID NO：19)或重链H171(SEQ ID NO：139))中的一者或两者配对来表示。所述八个轻链都具有L3的FR(来源于IGKV240_O1)并且具有下列序列变化：L-CDR1中的五个位置中(KSSQSLLX1X2X3X4QX5NYLT(SEQ ID NO：116)，其中X1选自F、P、S、T、W和Y；X2选自F、S、T、R和V；X3选自A、G、P、S、W、Y和V；X4选自G、N和T；X5选自K、R和S)，L-CDR2中的两个(X1ASTRX2S(SEQ ID NO：120)，其中X1选自H和W；X2选自D、E和S)，以及L-CDR3中的四个(QNDX1X2X3PX4T(SEQ ID NO：128)，其中X1选自D、F和L；X2选自S、T和Y；其中X3选自W和Y；X4选自L和M)。八个LC的组合物示于表10中。
表10：
Figure BDA0000381789370000471
这些Mab中的一些进一步表征并且在体内移植瘤模型(实例5)中测试。
实例5：MAB的表征
按照人框架适应和基于包含单个LC可变区(L3，SEQ ID NO.23)和单个HC可变区(H22，SEQ ID NO：19)的M59(具有某些CDR残基中改变的残基)的变体文库的重新选择，将新型Mab用于生物物理和生物活性测定，并且一个对比M1587(具有改变的互补位残基)用于重新检查初始表征与TF-ECD(实例2)结合的10H10Fab的表位是否改变。
人TF ECD：M1587接触面
人适应且基于10H10CDR的亲和力成熟的抗体，具有TF ECD的M1587(L3和H116)的共结晶以10H10(实例3)相同方式进行，不同的是M1587-Fab：TF复合物从包含16％PEG3350、0.2M乙酸铵、0.1M乙酸钠，pH4.5的溶液中结晶。
人TF ECD与具有亲和力成熟的M1587Fab的共晶体结构比较表明人适应且亲和力成熟的10H10不具有变化的抗体表位占有面积，如图2所示，也不具有CDR构象改变。将三个氨基酸置换(T31P、S57F和N59T)导入H-CDR1和H-CDR2(分别为SEQ ID NO：6和27，使用描述于实例2的CDR定义)中，人框架适应且亲和力成熟(SEQ ID NO：6和7被SEQ IDNO：63和86置换)期间，包括H116(SEQ ID NO：133)残基31和57处的接触残基，其为T31P和S57F。五倍亲和力改善可归因于与TF的S195接触的F57接触面的增加。尽管H-CDR1和H-CDR2互补位残基发生了变化，具有M1587Fab的人TF ECD的结构确认了HFA期间保留了表位与亲和力成熟。
生物物理和生物测定结果
这些抗体的总结数据示于下文Biacore的KD分析(表11)、人TF的人血浆的凝血时间(表12)和来自FVIIa刺激后MD-MB-231细胞的IL8释放的EC50(表13、14和图5)。
43个选择的亲和力成熟的Mab的KD和包括鼠10H10和与具有来自10H10的未修饰CDR的选择的人框架适应变体MAb(M1)嵌合型式(M编号小于100)生成数据，示于表11中。因此，人框架选择和CDR残基替换的组合产生了具有80至950pM范围内的KD的人抗体，所述KD具有：2.2×10-5s-1至2.6×10-3s-1范围内的解离率(Koff)；和104M-1s-1至2.3×105M-1s-1范围内的结合率(Kon)。与初始鼠10H10或嵌合构建体的值相比，新型Mab具有低于平衡解离常数(KD)至多10倍，从0.77nM至0.08nM；展示了较快的结合率(Kon＞105M-1s-1)，或具有较慢的解离率(Koff＝105s-1)。这些性质可用于针对特定申请选择MAb的优势，其中渗透组织的停留时间或能力是期望的。
表11：
Figure BDA0000381789370000491
凝血
新型Mab通过结合人TF而不阻断钙存在下且外源添加人TF体外测量的人血浆凝固的能力来表征(表12)。测定了十七个HFA(M编号小于100)变体和38个亲和力成熟的变体(M1583及上述)，并且报道了T1/2Max(达到最大光密度50％的时间(秒))。
所有显示的应答类似于具有小于205秒的T1/2Max值的10H10(表12)观测到的，表明在与没有159+17(n＝14)的抗体的载体对照相比时，这些抗体不延长凝血时间。CNTO860，此前描述(US7605235B2)并且来源于鼠抗体5G9的人TF结合抗体(其阻断FX与TF结合)延长血小板凝聚且在相同测定1800s内从不凝血。描述于实例4的43个MAb中的五个，尽管具有改变的CDR，却没有进行凝血测定，因为它们的起始浓度小于2mg／ml。M1、M59和CNTO860值在多个测试中进行平均。
表12：
信号阻断活性
新型MAb也可以通过TF／FVIIa复合物阻断信号传导的能力方面描述。乳腺恶性肿瘤细胞的TF／VIIa／PAR2信号传导诱导广泛全面的促进血管生成因子(诸如VEGF25、Cyr61、VEGF-C、CTGF、CXCL1和IL-8)。此前报道了FVIIa诱导可检测MDA-MB-231？？？、表达TF的人乳腺恶性肿瘤细胞系(Albrektsen等人，J Thromb Haemost5：1588-1597，2007)中的IL-8。因此，该测定用作生物测定以评价变体抗体抑制IL-8产生的TF／VIIa诱导能力。
本文上文中给出了该测定的细节，并且实例3的H-FA(M10-M68)变体和实例4的29个CDR变体的测试19结果是针对TF单个浓度处(0.5μg／ml)抑制IL-8产生的能力测试的。不结合组织因子的抗RSV抗体(B37)用作阴性对照。在该浓度处，许多HFA Mab能够阻断多于67％的IL-8诱导(表13)。图5显示了27个MAb的IL8-释放的相对抑制，与10H10的那些(分别为SEQ ID NO：6和7)相比，这27个MAb共享L3轻链(SEQ ID NO：23)且具有H-CDR1或H-CDR2替换。此外；这些中的四个：M1584、M1611、TF7M1612和TF7M1607被放置在全滴度IL-8诱导测定以及M中。计算的相对IC50值进一步支持与M1、10H10的小鼠-人嵌合体相比，亲和力改善的变体更具潜力的观察(表14)。亲和力成熟的抗体的其他亲和力成熟组描述于类似结果产生的实例4中。
表13：
变体ID ％IL-8抑制 SD
10H10 93.9 8.0
M1 96.1 7.6
M9 102.7 4.5
M10 90.7 0.0
M11 87.9 9.4
M12 98.6 3.1
M16 98.3 6.2
M19 87.3 5.8
M26 79.1 1.3
M37 71.2 11.6
M42 86.0 20.1
M46 82.5 10.7
M51 71.5 9.4
M52 67.7 4.0
M58 88.5 8.5
M59 83.8 8.0
M60 99.6 4.5
M61 106.8 4.9
M68 89.8 11.1
表14：
MAb ID IC50(ug／ml)
M1 0.527
M59 0.382
M1584 0.332
M1607 0.395
M1611 0.398
M1612 0.413
实例6：抗体抗肿瘤活性
使用MDA-MB-231的小鼠移植瘤模型
将MDA-MB-231人乳腺恶性肿瘤细胞培养在具有10％FBS和1％LNN的DMEM培养基中，由胰蛋白酶化在对数期收获，并且以5×107细胞／mL重悬于无菌血清游离的DMEM培养基中。从Charles River Laboratories获得二十个雌性SCID Beige(C.B-17／IcrCrl-scid-bgBR)小鼠，并且实验前驯化14天。用2.5×106MDA-MB-231细胞植入大约八周龄的小鼠右腋乳房脂肪垫。当肿瘤为大约100mm3大小时，将小鼠由肿瘤大小分层为治疗组(N＝10／组)。用Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline(DPBS)或以10mg／kg体重的M1593的腹膜内注射治疗，在分层那天开始且对于总共六个剂量连续一周一次。一周一次记录肿瘤和体重。当每组平均肿瘤体积达到15001mn3时，研究结束。统计测试应用两种方法重复测量ANOVA(PRIZM4.0，GraphPad)。
MDA-MB-231移植瘤模型中，M1593在开始的第22天(*P＜0.01)显著抑制肿瘤生长且接下来直到第29天(**P＜0.001)，对照(DPBS治疗的)组在此点处实施安乐死。M1593治疗组在第36天实施安乐死。M1593在第29天抑制大约49％肿瘤生长。相对于DPBS治疗的对照组，M1593治疗组具有大约11天肿瘤生长延迟(图6)。
使用A431的小鼠移植瘤模型
将A431人鳞状细胞癌细胞培养在具有10％FBS和1％LNN的DMEM培养基中，由胰蛋白酶化在对数期收获，并且以1×107细胞／mL重悬于无菌HBSS中。从Charles River Laboratories获得二十个雌性SCID Beige(C.B-17／IcrCrl-scid-bgBR)小鼠，并且实验前驯化14天。用2×106A431细胞植入大约八周龄的小鼠右侧。当肿瘤为大约118mn3大小时，将小鼠由肿瘤大小分层为治疗组(N＝10／组)。用DPBS或以10mg／kg体重的M1593腹膜内注射治疗，分层那天开始且对于总共六个剂量连续一周一次。一周两次记录肿瘤和体重。当每组平均肿瘤体积达到1000mm3时，研究结束。统计测试应用两种方法重复测量ANOVA(PRIZM4.0，GraphPad)。
M1593在第22天(*P＝0.0067)显著抑制肿瘤生长，对照(DPBS治疗的)组在此点处实施安乐死。CNTO592治疗的组在第39天实施安乐死。CNT0592在第22天抑制大约54％肿瘤生长。相对于DPBS治疗的对照组，M1593治疗组具有大约17天肿瘤生长延迟(图7)。
实例7：具有改变的F C 的抗体组合物
天然存在的人Fc受体变体对人抗体的Fc部分基本上具有不同的亲和力。此外，临床研究已显示用Fc工程化的mAb治疗后改善的应答率和紧密结合Fc基因型的患者存活(Musolino等人，2008J Clin Oncol26：1789-1796(2008)；Bibeau等人，2009J Clin Oncol27：1122-1129)。
虽然期望TF信号传导的抑制降低导致肿瘤增殖、迁移和转移扩散的细胞响应，但事实上(TF抗原被展示在肿瘤细胞上)提供了通过抗体Fc与Fc受体接合相关的机制选择地杀死靶细胞的方法。已知聚糖组合物以及重链的一级序列影响抗体Fc域的表面特征，并且对聚糖组合物以及重链的一级序列中的一者或二者的修饰可改变Fc受体结合。
认定为M1593的MAb是作为低岩藻糖聚糖修饰的IgG1并且也作为IgG1-CH2域变体(S239D、1332E，其中编号属于Kabat EU系统)产生的。
MAb组合物及制备方法
具有低岩藻糖含量的抗体(M1593-LF)是通过将编码具有信号肽的M1593(IgG1／k)链(如下文所示)的载体电穿孔到针对来自CHO宿主细胞系的蛋白的低岩藻糖基化选择的CHO宿主细胞亚系中产生的。SEQ IDNO：165表示完整的轻链，所述轻链包含可变域残基1-113(SEQ ID NO：23加上FR4，SEQ ID NO：61，带下划线的)和人κ恒定轻域。具有野生型人IgG同种型1的重链包含可变域残基1-120(其包括SEQ ID NO：139和FR4，SEQ ID NO：60，带下划线的)、CH1、CH2和CH3，其中Kabat位置239和332(其为SEQ ID NO：167的242和335)是分别来自野生型残基S和D至D和E的修饰以形成变体M1593-DE。
M1593-轻链
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLSSGNQKNYLTWYLQKPGQSPQL LIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQNDYTYPLT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：165)
M1593-重链，其中Kabat位置S239为D且1332为E
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYTFAPYWIEWVRQMPGKGLEWMG DILPGTGFTTYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWS SLKASDTAMYYCARSG YYGNSGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：167)
CHO细胞是通过四轮阴性凝集素选择(不与结合凝集素的岩藻糖结合的选择)后的亚克隆和FACS分类以分离一池被用作宿主细胞系的天然存在的低岩藻糖细胞生成的。这个系来源于相同的宿主细胞，所述宿主细胞用于产生M1593，并且因此，将所述细胞以相同的方式严格培养和处理。使用protein G检测，通过甲基纤维素平板筛选转染的细胞，并且将菌落挑取到96孔板中。针对滴度扩大培养物至摇瓶。该批摇瓶培养中，首个亲本克隆产生至多708mg／L的M1593-LF(标准培养基中)。
在两个M1593-LF产生克隆(C2452B和C2452D)上进行LC-MS糖肽作图以确定岩藻糖基化百分比并评价随时间糖基化稳定性概况和产生方法(表15)。稳定性研究期间由分批补料的通道1和通道10批培养物收集样品并纯化。也分析了来自生物反应器的纯化样品。糖肽作图显示了有利的糖基化模式，其具有来自C2452B和C2452D的低总岩藻糖基化百分比。重要的是，岩藻糖基化百分比不随时间显著增加，这表明了宿主细胞的岩藻糖基化是稳定的。因此，M1593-LF的岩藻糖含量小于10％且通常小于5％，并且在某些制剂中小于2％。在非凝集素选择的宿主CHO细胞中产生的Mab包含聚糖基(其中大于80％被岩藻糖基化)。
表15：
克隆 ％岩藻糖基化 样品分析
C2452B 2.81 P1摇瓶分批补料
C2452B 1.83 p10批稳定性研究
C2452B 3.67 生物反应器
C2452D 2.20 P1摇瓶分批补料
C2452D 2.25 p10批稳定性研究
C2452D 7.31 生物反应器
对于M1593的突变Fc变体(M1593-DE)，使表达M1593的质粒具有定向诱变的位点。
生物活性
三个抗人TF Fc变体(M1593、M1593-LF和M1593-DE)对人和食蟹猴二者的Fc受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)具有亲和力。这些测定如申请人共同未决的申请(美国序列号61／426619)中所描述或通过使用基于结合测定的等离子体共振(Biacore)进行(？)。
这些测定的结果显示了与亲本、未修饰的IgG1M1593抗体相比，Fc修饰的抗TF抗体均与重组人FcγIIIa受体更紧密结合(18倍(M1593-LF)和40倍(M1593-DE))(表16)。
表16：抗TF抗体对人FcγIIIa受体的亲和力
Figure BDA0000381789370000561
通过FcγRIIIa接合刺激ADCC。ADCC测定法如此前所述执行(Scallon等人，Mol Immunol44：1524-15342007)。
使用人PBMC作为效应子细胞且人乳腺恶性肿瘤细胞系MDA-MB-231作为靶细胞的体外ADCC测定法在功能方面反映了改善的Fc受体结合(图8)。
Figure IDA0000381789420000011
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Claims (31)

1.一种分离的抗体，所述抗体与鼠抗体10H10竞争结合到人组织因子，其中所述抗体结合域适于人框架（FR）区，并且所述抗体具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3的结构，其中所述FR氨基酸序列未改变来自由人种系基因序列编码的氨基酸序列，其中所述种系在IMGT数据库中识别，并且所述CDR序列与所述由SEQ ID NO: 6-11和27表示的鼠10H10 CDR具有不小于50%序列同一性。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体不与FVIIa竞争组织因子结合并且基本上不阻断促凝血、TF-VIIa复合物的酰胺分解活性但却阻断通过MDA-MB-231细胞的细胞因子IL-8释放测量的TF-VIIa介导的信号传导。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述CDR序列中的一个或多个选自SEQ ID NO: 6-11和27的序列。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述三个轻链CDR序列，L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO: 9-11表示。
5.根据权利要求3所述的抗体，其中所述三个重链CDR序列，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO: 6-8或分别由SEQ ID NO: 6、27和8表示。
6.根据权利要求3所述的抗体，其中L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别由SEQ ID NO: 9-11表示；并且所述三个重链CDR序列，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别由SEQ ID NO: 6-8或分别由SEQ ID NO: 6、27和8表示。
7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述人HC可变区框架来源于由所述IMGT数据库表示的IGHV家族1、3或5成员。
8.根据权利要求7所述的抗体，包含选自SEQ ID NO: 12-21的HC可变区。
9.根据权利要求1所述的抗体，其中所述人LC可变区框架来源于人IGKV家族二或四成员。
10.根据权利要求9所述的抗体，包含选自SEQ ID NO: 22-26的LC可变区。
11.根据权利要求1所述的抗体，其中所述人HC可变区框架来源于选自IGHV5和IGKV2的人种系基因家族。
12.根据权利要求1所述的抗体，包含选自SEQ ID NO: 12-21的HC可变区和选自SEQ ID NO: 22-26的人LC可变区。
13.根据权利要求1所述的抗体，包含HC可变区，所述HC可变区具有：SEQ ID NO: 8的H-CDR3；具有选自SEQ ID NO: 6、62-83的序列的H-CDR1；具有选自SEQ ID NO: 7、27和84-107的序列的H-CDR2；以及任选地，选自IGVJ4（SEQ ID NO: 60）或其变体的HC FR4区。
14.根据权利要求1所述的抗体，包含LC可变区，所述LC可变区具有：具有选自SEQ ID NO: 9、108-116的序列的L-CDR1；具有选自SEQ ID NO: 10和117-120的序列的L-CDR2；和具有选自SEQ ID NO: 11和121-128的序列的L-CDR3；以及任选地，选自IGKJ2（SEQ ID NO: 61）或其变体的LC FR4区。
15.根据权利要求1所述的抗体，包含HC可变区和LC可变域，所述HC可变区具有：SEQ ID NO: 8的H-CDR3；具有选自SEQ ID NO: 6、62-83的序列的H-CDR1；具有选自SEQ ID NO: 7、27和84-107的序列的H-CDR2；以及任选地，选自IGVJ4（SEQ ID NO: 60）或其变体的HC FR4区，并且所述LC可变域具有：具有选自SEQ ID NO: 9、108-116的序列的L-CDR1；具有选自SEQ ID NO: 10和117-120的序列的L-CDR2；和具有选自SEQ ID NO: 11和121-128的序列的L-CDR3；以及任选地，选自IGKJ2（SEQ ID NO: 61）或其变体的LC FR4区。
16.根据权利要求1所述的抗体，其中所述HC人框架序列来源于IGHV5_a，并且所述HC可变区具有选自SEQ ID NO: 19、129-155的序列。
17.根据权利要求1所述的抗体，其中所述LC人FR序列来源于IGKV2D40_O1，并且所述LC可变区具有选自SEQ ID NO: 23、157-164的序列。
18.根据权利要求1所述的抗体，其中所述HC人框架序列来源于IGHV5_a，并且所述HC可变区具有选自SEQ ID NO: 19、129-155的序列；所述LC人FR序列来源于IGKV2D40_O1，并且所述LC可变域具有选自SEQ ID NO: 23、157-164的序列。
19.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体具有：被定义为非CDR位置的来源于IGHV5_a框架的结合域、具有序列SGYYGNSGFAY（SEQ ID NO: 8）的H-CDR3，并且其中H-CDR-1和/或H-CDR-2位置处的序列由下式给出：
H-CDR1   GYTFX1X2X3WIE （I）（SEQ ID NO: 83）
其中X1选自A、D、G、I、L、N、P、R、S、T、V和Y；X2选自A、P、S和T；并且X3选自F、H和Y；或所述序列可为GFTFITYWIA（SEQ ID NO: 81）；并且
H-CDR2   DIX1PGX2GX3TX4 （II）（SEQ ID NO: 107）
其中X1选自I和L；X2选自S和T；X3选自A、F、H和w；并且X4选自D、H、I、L和N；或其中H-CDR2为DILPASSSTN（SEQ ID NO: 105）。
20.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体具有结合域，其中非CDR位置来源于IGKV2D40_O1框架，并且其中L-CDR-1和/或LCDR-2以及L-CDR3处的序列具有由下式给出的序列：
L-CDR1   KSSQSLLX1X2X3X4QX5NYLT （III）（SEQ ID NO: 116）
其中X1选自F、P、S、T、W和Y；X2选自F、S、T、R和V；X3选自A、G、P、S、W、Y和V；X4选自G、N和T；并且X5选自K、R和S；
L-CDR2   X1ASTRX2S （IV）（SEQ ID NO: 120）
其中X1选自H和W；X2选自D、E和S；
L-CDR3   QNDX1X2X3PX4T （V）（SEQ ID NO: 128）
其中X1选自D、F和L；X2选自S、T和Y；其中X3选自W和Y；并且X4选自L和M。
21.一种治疗患有病症的人受试者的方法，其中TF表达和由所述TF表达引起的局部生物活性与被治疗的病症直接或间接相关，所述方法包括向需要此类治疗的此类受试者施用根据权利要求1、3、19或20所述的抗体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述病症是恶性肿瘤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述恶性肿瘤选自：原发性实体肿瘤，转移瘤，癌，腺癌，黑素瘤，液体肿瘤，淋巴瘤，白血病，骨髓瘤，软组织恶性肿瘤，肉瘤，骨肉瘤，胸腺瘤，淋巴肉瘤，纤维肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肪瘤，成胶质细胞瘤，astrosarcoma，前列腺、乳腺、卵巢、胃、胰腺、喉、食道、睾丸、肝脏、腮腺、胆道、结肠、直肠、子宫颈、子宫、子宫内膜、甲状腺、肺、肾或膀胱的恶性肿瘤。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述病症选自：良性肿瘤，血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼和化脓性肉芽肿；动脉粥样硬化斑块；眼睛的眼血管生成疾病，糖尿病性视网膜病，早产儿视网膜病，黄斑变性，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生，发红，成视网膜细胞瘤，葡萄膜炎和翼状胬肉（异常血管生长）；类风湿性关节炎；牛皮癣；延迟伤口愈合；子宫内膜异位；血管发生；肉芽发生；增生性瘢痕（瘢痕疙瘩）；骨折不愈合；硬皮病；沙眼；血管粘附；心肌血管生成；冠状动脉侧支；脑侧支；动静脉畸形；缺血性肢体血管生成；Osler-Webber综合征；斑块新血管形成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤；纤维肌性发育异常；伤口肉芽发生；克罗恩氏病；和动脉粥样硬化。
25.一种在治疗受试者中有用的药物组合物，包含药学上可接受的制剂的权利要求1、3、19或20的抗体。
26.一种试剂盒，包括稳定形式的根据权利要求1、3、19或20所述的抗体和使用说明。
27.一种分离的核酸，所述核酸编码根据权利要求1、3、19或20所述的抗体的抗体结合域中的一个或多个。
28.一种载体，包含至少一种权利要求27的多核苷酸。
29.一种宿主细胞，包含权利要求28的载体。
30.根据权利要求1、3、19或20所述的分离的抗体或片段，所述抗体或片段具有IgG1或IgG4同种型。
31.根据权利要求30所述的分离的抗体或片段，其中Fc区包括人IgG1同种型，其中Kabat位置239和332（其为SEQ ID NO: 167的242和335）是在所述Fc区中从野生型残基S和D至D和E的突变修饰的。
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