CN116322713A - 使用抗组织因子抗体进行炎性疾病治疗 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于治疗炎性疾病的特异性结合至人组织因子(TF)的抗体、抗TF抗体‑药物缀合物(ADC)以及包含所述抗体或ADC的组合物。本文还提供了通过施用所述抗TF抗体或ADC治疗患有炎性疾病的受试者的方法。

Description

使用抗组织因子抗体进行炎性疾病治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月10日提交的美国临时专利申请号63/050,629的优先权和权益，所述申请的全部内容出于所有目的以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年7月8日，名称为ITI-005WO_SL.txt并且大小为466,223字节。
背景技术
血液凝固涉及导致血液凝结的一系列复杂过程。组织因子(TF)在这些凝固过程中起重要作用。TF是细胞表面受体。TF/FVIIa复合物催化非活性蛋白酶因子X(FX)转化为活性蛋白酶因子Xa(FXa)。FXa及其辅因子FVa形成凝血酶原酶复合物，所述凝血酶原酶复合物从凝血酶原生成凝血酶。凝血酶将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白链，并且催化许多其他凝固相关的过程。
炎性疾病包括大量以炎症(局部或全身)为特征的病症和疾患。在炎症过程中，血管动力学发生变化，并且先天性和适应性免疫细胞募集至损伤或疾病部位。炎症对于保护身体不受异物侵害是必要的并且对于伤口修复是必要的；然而，在自身免疫性和/或炎性疾病中，免疫系统在没有外来物质对抗的情况下触发炎性响应，并且身体的正常保护性免疫系统错误地攻击自身，从而影响其自身组织。炎性疾病由于终身衰弱性疾病、增加的死亡率以及治疗和护理的高成本而继续成为患者的负担。
TF被认为在以局部和全身炎症为特征的疾病中起作用，但迄今为止还没有批准的抗TF抗体指示用于治疗炎性疾病。本公开的抗TF抗体、抗TF抗体-药物缀合物(ADC)和包括使用所述抗TF抗体和ADC的方法的方面描述于国际PCT申请PCT/US2019/012427、美国实用申请号16/959,652和美国临时申请号62/713,797；62/713,804；62/646,788；62/613,545；和62/613,564中，所述申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
发明内容
本文提供了特异性结合人组织因子(TF)的抗体、抗TF抗体-药物缀合物及相关方法。本文提供了通过施用本公开的抗体或ADC来治疗炎性疾病的方法。
在一个方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用经分离的抗体，其中所述抗体结合至人组织因子(TF)的胞外结构域，其中所述抗体在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。
在一些实施方案中，病毒感染是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在一些实施方案中，所述炎性疾病选自：结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施方案中，所述炎性疾病是结肠炎。在一些实施方案中，所述炎性疾病是炎性肠病(IBD)。在一些实施方案中，所述炎性疾病是关节炎。在一些实施方案中，所述炎性疾病是急性肺损伤。在一些实施方案中，所述炎性疾病是ARDS。在一些实施方案中，所述炎性疾病是RSV。在一些实施例中，所述炎性疾病是心血管疾病或损伤。在一些实施方案中，心脏疾病或损伤是心肌梗死。在一些实施方案中，所述炎性疾病是与蛋白酶激活受体2(PAR-2)的上调相关的心血管疾病。
在一些实施方案中，所述抗体不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:821的VH序列和SEQ ID NO:822的VL序列的参考抗体相比，所述经分离的人抗体不抑制或在较低程度上抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中经分离的抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，所述经分离的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于所述经分离的抗体与SEQ IDNO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。在一些实施方案中，所述抗体包含来自表35中的抗体组的所有三个重链互补决定区(CDR)和所有三个轻链CDR，其中所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR来自同一抗体组。
在一些实施方案中，所述抗体包含来自表15-34中任一个中的抗体的所有三个重链互补决定区(CDR)和所有三个轻链CDR，其中所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR来自同一抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含来自以下抗体的所有三个重链互补决定区CDR和所有三个轻链CDR：定名为25A的抗体、定名为25A5的抗体、定名为25A5-T的抗体、定名为25G的抗体、定名为25G1的抗体、定名为25G9的抗体、定名为43B的抗体、定名为43B1的抗体、定名为43B7的抗体、定名为43D的抗体、定名为43D7的抗体、定名为43D8的抗体、定名为43E的抗体或定名为43Ea的抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含来自以下抗体的所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR：定名为43B的抗体、定名为43B1的抗体、定名为43B7的抗体、定名为43D的抗体、定名为43D7的抗体、定名为43D8的抗体、定名为43E的抗体或定名为43Ea的抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含来自以下抗体的所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR：定名为25A的抗体、定名为25A5的抗体、定名为25A5-T的抗体、定名为25G的抗体、定名为25G1的抗体或定名为25G9的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体包含来自表14的VH结构域序列和VL结构域序列，其中所述VH结构域序列和VL结构域序列来自表14中的同一组。在一些实施方案中，所述抗体包含来自表13的VH结构域序列和VL结构域序列，其中所述VH结构域序列和VL结构域序列来自表13中的同一克隆。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:797中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:798中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:799中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:800中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:801中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:802中列出的序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:571中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:572中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:573中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:574中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:575中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:576中列出的序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:609中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:610中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:611中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:612中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:613中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:614中列出的序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:769中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:770中列出的序列的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQID NO:569中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:570中列出的序列的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:607中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:608中列出的序列的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:924中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO:925中列出的序列的轻链。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:645中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:646中列出的序列的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:926中列出的序列的重链和包含SEQID NO:927中列出的序列的轻链。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:779中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:780中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:781中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:782中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:783中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:784中列出的序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:872中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:873中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:874中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:875中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:876中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:877中列出的序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:884中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:885中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:886中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:887中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:888中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:889中列出的序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:868中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:869中列出的序列的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQID NO:189中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:190中列出的序列的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:836中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:837中列出的序列的VL序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:920中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO:921中列出的序列的轻链。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:878中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:879中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:880中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:881中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:882中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:883中列出的序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:267中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:268中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:269中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:270中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:271中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:272中列出的序列的VL-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:870中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:871中列出的序列的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQID NO:303中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:304中列出的序列的VL序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:922中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO:923中列出的序列的轻链。
在一些实施方案中，所述抗体与以下抗体竞争结合至人TF：定名为25A的抗体、定名为25A5的抗体、定名为25A5-T的抗体、定名为25G的抗体、定名为25G1的抗体、定名为25G9的抗体、定名为43B的抗体、定名为43B1的抗体、定名为43B7的抗体、定名为43D的抗体、定名为43D7的抗体、定名为43D8的抗体、定名为43E的抗体或定名为43Ea的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体与以下抗体竞争结合至人TF：定名为43B的抗体、定名为43B1的抗体、定名为43B7的抗体、定名为43D的抗体、定名为43D7的抗体、定名为43D8的抗体、定名为43E的抗体或定名为43Ea的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体与以下抗体竞争结合至人TF：定名为25A的抗体、定名为25A5的抗体、定名为25A5-T的抗体、定名为25G的抗体、定名为25G1的抗体或定名为25G9的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体与由以下抗体结合的同一人TF表位结合：定名为25A的抗体、定名为25A5的抗体、定名为25A5-T的抗体、定名为25G的抗体、定名为25G1的抗体、定名为25G9的抗体、定名为43B的抗体、定名为43B1的抗体、定名为43B7的抗体、定名为43D的抗体、定名为43D7的抗体、定名为43D8的抗体、定名为43E的抗体或定名为43Ea的抗体。
在一些实施方案中，抗体与由以下抗体结合的同一人TF表位结合：定名为43B的抗体、定名为43B1的抗体、定名为43B7的抗体、定名为43D的抗体、定名为43D7的抗体、定名为43D8的抗体、定名为43E的抗体或定名为43Ea的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与由以下抗体结合的同一人TF表位结合：定名为25A的抗体、定名为25A5的抗体、定名为25A5-T的抗体、定名为25G的抗体、定名为25G1的抗体或定名为25G9的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；与同种型对照相比，不降低凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；与同种型对照相比，不增加从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；与同种型对照相比，不降低由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；与同种型对照相比，保持凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；与同种型对照相比，保持从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；与同种型对照相比，保留由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；并且不与FVIIa竞争结合至人TF。
在一些实施方案中，使用示例性、Kabat、Chothia、AbM、Contact或IMGT编号来确定所述三个重链CDR和所述三个轻链CDR。
在一些实施方案中，所述抗体特异性结合至食蟹猴TF。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合至小鼠TF。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合至兔TF。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合至猪TF。
在一些实施方案中，所述疾病涉及血管炎症。在一些实施方案中，所述疾病涉及局部炎症。在一些实施方案中，所述疾病涉及全身炎症。
在一些实施方案中，所述疾病涉及单个核细胞和/或粒细胞的浸润。在一些实施方案中，所述单个核细胞包括巨噬细胞和/或淋巴细胞。在一些实施方案中，所述粒细胞包括嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞。
在一些实施方案中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、呼吸道合胞病毒(RSV)、心肌梗死和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体减少总白细胞计数。在一些实施方案中，通过光学显微术测定总白细胞计数。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体减少粒细胞的总数。在一些实施方案中，所述粒细胞包括嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述粒细胞包括嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，通过免疫组织化学(IHC)分析或支气管肺泡灌洗(BAL)液分类细胞计数测定粒细胞的总数。在一些实施方案中，所述粒细胞在肺泡中。在一些实施方案中，所述粒细胞在间质液中。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体减少单个核细胞的总数。在一些实施方案中，所述单个核细胞包括巨噬细胞。在一些实施方案中，所述巨噬细胞包括M1巨噬细胞。在一些实施方案中，所述单个核细胞包括淋巴细胞。在一些实施方案中，所述单个核细胞包括单核细胞。在一些实施方案中，通过免疫组织化学(IHC)分析或支气管肺泡灌洗(BAL)液分类细胞计数测定单个核细胞的总数。在一些实施方案中，所述单个核细胞在肺泡中。在一些实施方案中，所述单个核细胞在间质液中。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述受试者相对于基线水平维持或增加体重。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂维持或增加体重。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减小脾大小或逆转脾肿大。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减小脾大小或逆转脾肿大。在一些实施方案中，使用触诊、叩诊、超声、计算机断层摄影术(CT)扫描或磁共振成像(MRI)来测定脾大小或脾肿大。
在一些实施方案中，所述炎性疾病是急性肺损伤或ARDS。在一些实施方案中，在施用于受试者时，所述抗体相对于基线水平增加净肺泡液清除率。在一些实施方案中，在施用于受试者时，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂增加净肺泡液清除率。在一些实施方案中，通过测量连续水肿液蛋白质浓度来测定净肺泡液清除率。在一些实施方案中，用ELISA测量连续水肿液蛋白质浓度。
在一些实施方案中，所述炎性疾病是SARS-Cov-2。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述受试者相对于基线水平维持或增加体重。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂维持或增加体重。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。在一些实施方案中，所述炎性细胞因子和趋化因子在支气管肺泡灌洗(BAL)样品中。在一些实施方案中，所述炎性细胞因子和趋化因子在肺匀浆样品中。在一些实施方案中，所述炎性细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、GM-CSF、TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL19、CCL20、CCL25、CXCL1、CXCL2和CXCL10。在一些实施方案中，使用ELISA或Luminex多重测定来测量所述炎性细胞因子和趋化因子。在一些实施方案中，所述炎性细胞因子和趋化因子包括VEGF。在一些实施方案中，所述炎性细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：GM-CSF、VEGF、IL17F、IL-1β、IL-6、IFNγ、IL-8和KC。
在一些实施方案中，所述炎性疾病是病毒感染。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平增加抗炎细胞因子和趋化因子。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂增加抗炎细胞因子和趋化因子。在一些实施方案中，所述抗炎细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：IL-10和IL27p28。在一些实施方案中，所述抗炎细胞因子和趋化因子在支气管肺泡灌洗(BAL)样品中。在一些实施方案中，使用多重电化学发光MSD测定来测量所述炎性细胞因子和趋化因子。在一些实施方案中，使用Luminex多重测定来测量所述炎性细胞因子和趋化因子。
在一些实施方案中，所述炎性疾病是RSV。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减少肺中的纤维化。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减少肺中的纤维化。在一些实施方案中，通过IHC分析或通过定量高分辨率计算机断层摄影术(qHRCT)测定纤维化。
在一些实施方案中，所述炎性疾病是关节炎。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。在一些实施方案中，所述炎性细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、GM-CSF、TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5CCL19、CCL20、CCL25、CXCL1、CXCL2和CXCL10。
在一些实施方案中，所述炎性疾病是结肠炎或炎性肠病。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体导致正常粪便稠度或使受试者的粪便稠度相对于基线水平变硬。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂导致正常粪便稠度或使受试者的粪便稠度变硬。在一些实施方案中，使用布里斯托粪便量表测定粪便稠度。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减少受试者粪便中的血液或使得受试者粪便中没有血液。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减少受试者粪便中的血液或使得受试者粪便中没有血液。在一些实施方案中，使用隐血测试测量受试者粪便中的血液。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。在一些实施方案中，所述炎性细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、GM-CSF、TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL19、CCL20、CCL25、CXCL1、CXCL2和CXCL10。
在一些实施方案中，所述炎性疾病是心肌梗死。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减小梗死面积。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减小梗死面积。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平增加左心室射血分数。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂增加左心室射血分数。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平降低左心室舒张末期容积。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂降低左心室舒张末期容积。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减少梗死心肌中的炎性细胞募集。在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减少梗死心肌中的炎性细胞募集。在一些实施方案中，所述炎性细胞选自CD45+、CD11b+、Ly6Chi、CD45+/CD90.2-/NK1.1-/CD11b+、CD45+/CD90.2-/NK1.1-/CD11b+/Ly6Chi和CD45+/CD90.2-/NK1.1-/CD11b+/Ly6Clo。在一些实施方案中，使用流式细胞术测量炎性细胞募集。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，所述抗体导致对全身性类固醇的需求减少。在一些实施方案中，所述不同的抗炎治疗剂包括以下中的一种或多种：非类固醇抗炎药物(NSAID)、类固醇抗炎药物、β-激动剂、抗胆碱能剂、抗组胺药和甲基黄嘌呤。在一些实施方案中，所述不同的抗炎治疗剂包括以下中的任一种：IL-6抑制剂、抗GM-CSF、抗TNFa、抗IL-1a、地塞米松、趋化因子和趋化因子受体拮抗剂以及JAK抑制剂。
在本公开的一些实施方案中，用本文提供的抗体或ADC治疗炎性疾病，所述抗体或ADC在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。还预期本文提供的抗体或ADC可用于治疗炎性疾病，所述抗体或ADC在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。例如，此类抗体可用于治疗以血栓形成为特征的炎性疾病。
在一些实施方案中，每天施用所述抗体。在一些实施方案中，每周施用所述抗体。在一些实施方案中，每两周一次施用所述抗体。在一些实施方案中，每月施用所述抗体。
附图说明
参考以下描述和附图将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中：
图1包括显示人类中急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的一些共同特征的表。
图2包括显示用于身体状况评分的定性系统的示意图。(参见实施例)。
图3包括显示在DSS-结肠炎模型研究中接受所指示治疗的小鼠的体重百分比的图。
图4包括显示在DSS-结肠炎模型研究中接受所指示治疗的小鼠的疾病活动性评分的图。
图5包括显示在DSS-结肠炎模型研究中接受所指示治疗的小鼠在研究过程中的身体状况评分的图。
图6包括显示在DSS-结肠炎模型研究中接受所指示治疗后在研究结束时小鼠的平均体重的图。
图7包括显示在ALI模型研究中接受所指示治疗的小鼠相对于基线水平体重的重量变化百分比的图。
图8A包括显示在ALI模型研究中接受所指示治疗后，在研究结束时来自小鼠的支气管肺泡灌洗(BAL)液样品中的总白细胞、总巨噬细胞和总淋巴细胞计数的图。图8B包括显示在ALI模型研究中接受所指示治疗后，在研究结束时来自小鼠的支气管肺泡灌洗(BAL)液样品中的总嗜中性粒细胞和总嗜酸性粒细胞计数的图。
图9包括显示组织病理学定性评分的结果的图，以比较ALI模型研究中来自接受所指示治疗的小鼠的间质以及肺泡和细支气管中的嗜中性粒细胞浸润以及单个核细胞向血管周围和细支气管周围组织中的浸润。
图10A和图10B包括显示ALI模型研究中来自接受所指示治疗的小鼠的BAL液中测量的平均炎性细胞因子和趋化因子浓度(±SEM)的图。
图11包括显示在呼吸道合胞病毒(RSV)模型研究中接受所指示治疗的小鼠中测量的平均BAL分类细胞计数(总白细胞)的图。
图12包括显示在呼吸道合胞病毒(RSV)模型研究中接受所指示治疗的小鼠中巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的BAL分类测量值的图。
图13包括显示DSS诱导的结肠炎模型的研究时间表的示意图。
图14包括显示接受所指示治疗的DSS小鼠的重量变化百分比的图。
图15包括显示所指示治疗对DSS模型中的疾病活动指数(DAI)评分的影响的图。
图16包括显示DSS模型中所指示治疗对结肠密度(即结肠重量/结肠长度)的影响的图。
图17包括显示DSS模型中所指示治疗对脾重量的影响的图。
图18A包括显示所指示治疗对聚I:C模型中的炎性细胞因子水平的影响的图。
图18B包括显示所指示治疗对聚I:C模型中的抗炎细胞因子水平的影响的图。
图19包括显示在聚I:C模型中所指示治疗对体重的影响的图。
图20包括显示抗TF抗体和同种型对照治疗对心肌梗死模型中的梗死面积的影响的超声心动图图像。
图21包括显示抗TF和同种型对照治疗对心肌梗死模型中的左心室射血分数和左心室舒张末期容积的影响的图。
图22和图23包括显示心肌梗死模型中用抗TF治疗减少炎性细胞的募集的图。
具体实施方式
1.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有领域术语、符号和其他科学术语旨在具有本领域技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为清楚和/或便于参考起见，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文此类定义的包括不必被解释为与本领域通常所理解的相比表示出不同。本文所描述或引用的技术和程序通常被很好地理解，且通过使用常规方法被本领域技术人员通常采用，诸如，例如，广泛使用的分子克隆技术描述于Sambrook等，Molecular Cloning:A Labor atory Manual第4版(2012)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY。适当时，通常根据制造商规定的方案和条件来实施包括使用市售试剂盒和试剂的工序，除非另外说明。
如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指示。除非另外明确指出，否则术语“包括”、“诸如”等旨在传达包括而不受限制。
如本文所用，除非另外明确指出，否则术语“包括”还具体包括实施方案“由所列举的要素组成”和“基本上由所列举的要素组成”。
术语“约”指示并涵盖指示值以及高于和低于该值的范围。在某些实施方案中，术语“约”指示指定值±10％、±5％或±1％。在某些实施方案中，在适用的情况下，术语“约”指示一个或多个指定值±该一个或多个值的一个标准偏差。
术语“组织因子”、“TF”、“血小板组织因子”、“因子III”、“凝血活酶”和“CD142”在本文中可互换用于指代TF或由细胞自然表达或由TF基因转染的细胞表达的TF的任何变体(例如，剪接变体和等位基因变体)、同工型和物种同系物。在一些方面，TF蛋白是由灵长类动物(例如，猴子或人)、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、狗、骆驼、猫、牛、山羊、马、猪或绵羊自然表达的TF蛋白。在一些方面，TF蛋白为人TF(hTF；SEQ ID NO:809)。在一些方面，TF蛋白为食蟹猴TF(cTF；SEQ ID NO:813)。在一些方面，TF蛋白为小鼠TF(mTF；SEQ ID NO:817)。在一些方面，TF蛋白为猪TF(pTF；SEQ ID NO:824)。TF是丝氨酸蛋白酶因子VIIa的细胞表面受体。它通常由血管周围和一些疾病环境中的某些细胞组成性表达。
术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”是指包含任选地通过一个或多个接头与一种或多种细胞毒性剂缀合的抗体的缀合物。术语“抗TF抗体-药物缀合物”或“抗TF ADC”是指包含任选地通过一个或多个接头与一种或多种细胞毒性剂缀合的抗TF抗体的缀合物。
本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂可为抗血管生成剂、促凋亡剂、抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷化剂、激素、激素激动剂、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶、抗代谢药、抗生素、生物碱或放射性同位素。示例性细胞毒性剂包括：刺孢霉素、喜树碱、卡铂、伊立替康、SN-38、卡铂、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、多柔比星、依托泊苷、伊达比星、拓扑替康、长春花生物碱、美登木素生物碱、美登木素生物碱类似物、吡咯并苯二氮杂
Figure BDA0004110303870000171
紫杉烷类、多米卡星、多拉司他汀、奥里斯他汀及其衍生物。
“接头”是指将一种组合物连接到另一种组合物(例如，将抗体连接到剂)的分子。本文所述的接头可将抗体缀合至细胞毒性剂。示例性接头包括不稳定的接头、酸不稳定的接头、光不稳定的接头、带电荷的接头、含二硫键的接头、肽酶敏感的接头、β-葡萄糖醛酸苷接头、二甲基接头、硫醚接头和亲水接头。接头可为可裂解或不可裂解的。
术语“免疫球蛋白”是指一类结构上相关的蛋白质，其通常包含两对多肽链：一对轻(L)链和一对重(H)链。在“完整的免疫球蛋白”中，所有这四条链由二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已被很好地表征。参见，例如Paul,Fundamental Immunology第7版,第5章(2013)Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。简而言之，每条重链通常包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区通常包含三个结构域，缩写为CH1、CH2和CH3。每条轻链通常包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个结构域，缩写为CL。
术语“抗体”在本文中以它的最广泛意义使用，并且包括包含一个或多个特异性结合抗原或表位的抗原结合结构域的某些类型的免疫球蛋白分子。抗体具体包括完整抗体(例如完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。
术语“替代支架”是指分子，其中一个或多个区域可多样化以产生一个或多个特异性结合抗原或表位的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域以类似于抗体的特异性和亲和力结合抗原或表位。示例性替代支架包括来源于以下的那些：纤连蛋白(例如，AdnectinsTM)、β三明治(例如，iMab)、脂质运载蛋白(例如，抗
Figure BDA0004110303870000181
)、EETI-II/AGRP、BPTI/LACI-D1/ITI-D2(例如，Kunitz结构域)、硫氧还蛋白肽适体、蛋白质A(例如，
Figure BDA0004110303870000182
)、锚蛋白重复序列(例如，DARPins)、γ-B-晶体蛋白/泛素(例如，人泛素(Affilins))、CTLD3(例如，四连接素(Tetranectins))、Fynomers和(LDLR-A模块)(例如，高亲和性多聚体(Avimers))。关于替代支架的附加信息提供于Binz等,Nat.Biotechnol.,2005 23:1257-1268；Skerra,Current Opin.in Biotech.,2007 18:295-304；和Silacci等,J.Biol.Chem.,2014,289:14392-14398中；其各自以引用的方式整体并入。
术语“抗原结合结构域”意指能够与抗原或表位特异性结合的抗体的部分。抗原结合结构域的一个实例是由抗体的VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。抗原结合结构域的另一个实例是通过由Adnectin的第十纤连蛋白III型结构域的某些环多样化而形成的抗原结合结构域。可在各种情况下发现抗原结合结构域，包括抗体和嵌合抗原受体(CAR)，例如来源于抗体或抗体片段(诸如scFv)的CAR。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换用于指代具有与天然存在的抗体结构基本上类似的结构，以及具有包含Fc区的重链的抗体。例如，当用于指代IgG分子时，“全长抗体”是包含两条重链和两条轻链的抗体。
术语“Fc区”意指免疫球蛋白重链的C端区域，其在天然存在的抗体中与Fc受体和补体系统的某些蛋白质相互作用。各种免疫球蛋白的Fc区的结构以及其中包含的糖基化位点在本领域中已知。参见Schroeder和Cavacini,J.Allergy Clin.Immunol.,2010,125:S41-52，其以引用的方式整体并入。Fc区可为天然存在的Fc区，或如本领域或本公开别处所述修饰的Fc区。
可将VH和VL区进一步细分为散布在更保守的区域中的高变的区域(“高变区(HVR)”；也称为“互补决定区”(CDR))。更保守的区域称为框架区(FR)。每个VH和VL通常包含三个CDR和四个FR，其以以下顺序(从N端到C端)排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR参与抗原结合，并且影响抗原特异性和抗体的结合亲和力。参见Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest第5版(1991)Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD，其以引用的方式整体并入。
“互补决定区(CDR)”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-片层框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)中的一个，或抗体VLβ-片层框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)中的一个。CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR在本领域中是众所周知的，并且已被例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内最具高变性的区域。参见Kabat等,J BiolChem,1977,252:6609-6616和Kabat,Adv Protein Chem,1978,32:1-75，其各自以引用的方式整体并入。CDR在结构上也被Chothia定义为不是保守的β-片层框架的部分的那些残基，并且因此能够适应不同的构象。参见Chothia和Lesk,J Mol Biol,1987,196:901-917，其以引用的方式整体并入。Kabat和Chothia命名法在本领域中是众所周知的。AbM、Contact和IMGT也定义了CDR。通过比较许多结构已确定了标准抗体可变结构域内的CDR位置。参见Morea等,Methods,2000,20:267-279和Al-Lazikani等,J Mol Biol,1997,273:927-48，其各自以引用的方式整体并入。由于高变区内的残基数在不同的抗体中不同，因此相对于标准位置的其他残基通常在标准可变结构域编号方案中的残基编号旁边用a、b、c等编号(Al-Lazikani等,同上)。此种术语是本领域技术人员众所周知的。
许多高变区描述正被使用，并且包括在本文中。Kabat CDR基于序列变异性，并且是最常用的。参见Kabat等(1992)Sequences of Proteins of Immunological Interest,DIANE Publishing:2719，其以引用的方式整体并入。相反，Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,同上)。AbM高变区表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。接触高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。来自这些高变区中的每个的残基在表1中指出。
最近，通用编号系统ImMunoGeneTics(IMGT)Information SystemTM已被开发和广泛采用。参见Lefranc等,Dev Comp Immunol,2003,27:55-77，其以引用的方式整体并入。IMGT是集成的信息系统，所述信息系统专门研究人和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TR)和主要组织相容性复合体(MHC)。IMGT CDR是指氨基酸序列和在轻链或重链内的位置。由于免疫球蛋白可变结构域的结构内CDR的“位置”在物种之间是保守的，并且存在于称为环的结构中，所以通过使用根据结构特征排列可变结构域序列的编号系统，CDR和框架残基易于识别。Kabat、Chothia和IMGT编号之间的对应关系在本领域中也是众所周知的(Lefranc等,同上)。本文所示的示例性系统组合了Kabat和Chothia CDR定义。
表1
Figure BDA0004110303870000201
来自任何脊椎动物物种的轻链可基于其恒定结构域的序列被分配为两种类型(kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。
来自任何脊椎动物物种的重链可被分配为五种不同类别(或同种型)中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别还分别定名为α、δ、ε、γ和μ。根据序列和功能的差异，IgG和IgA类别被进一步分为亚类。人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。术语是指免疫球蛋白分子的部分，相对于免疫球蛋白的另一部分(含有抗原结合位点的可变结构域)具有更保守的氨基酸序列。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域以及轻链的CL结构域。
当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如报告于Kabat等,同上中)。除非另外说明，否则EU编号方案用于提及本文所述的抗体重链恒定区中的残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段包括例如Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、scFv(sFv)片段和scFv-Fc片段。
“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接二聚体。
除了重链和轻链可变结构域，“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段可例如通过重组方法或通过木瓜蛋白酶消化全长抗体来产生。
“F(ab’)2”片段含有两个在铰链区附近由二硫键接合的Fab’片段。F(ab’)2片段可例如通过重组方法或通过胃蛋白酶消化完整抗体来产生。F(ab’)片段可例如通过用β-巯基乙醇处理来解离。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含单个多肽链中的VH结构域和VL结构域。VH和VL通常通过肽接头连接。参见Plückthun A.(1994)。可使用任何适合接头。在一些实施方案中，接头为(GGGGS)n(SEQ ID NO:823)。在一些实施方案中，n＝1、2、3、4、5或6。参见Antibodies from Escherichia coli。于Rosenberg M.&Moore G.P.(编),ThePharmacology of Monoclonal Antibodies第113卷(第269-315页)。Springer-Verlag,NewYork，其以引用的方式整体并入。
“scFv-Fc”片段包含scFv连接于Fc结构域。例如，Fc结构域可连接于scFv的C端。视scFv中的可变结构域的定向(即VH-VL或VL-VH)而定，Fc结构域可在VH或VL之后。可使用本领域中已知或本文所述的任何适合Fc结构域。
术语“单结构域抗体”是指其中抗体的一个可变结构域在不存在另一可变结构域下特异性结合抗原的分子。单结构域抗体及其片段描述于Arabi Ghahroudi等,FEBSLetters,1998,414:521-526以及Muyldermans等,Trends in Biochem.Sci.,2001,26:230-245中，其各自以引用的方式整体并入。单结构域抗体也被称为sdAb或纳米抗体。
“多特异性抗体”是包含两个或更多个共同地特异性结合两个或更多个不同表位的不同抗原结合结构域的抗体。两个或更多个不同表位可为同一抗原(例如由细胞表达的单一TF分子)上或不同抗原(例如TF分子和非TF分子)上的表位。在一些方面，多特异性抗体结合两个不同表位(即“双特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合三个不同表位(即“三特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合四个不同表位(即“四特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合五个不同表位(即“五特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合6个、7个、8个或更多个不同表位。每种结合特异性可以任何适合效价存在。在本公开别处提供了多特异性抗体的实例。
“单特异性抗体”是包含一个或多个特异性结合单一表位的结合位点的抗体。单特异性抗体的实例是天然存在的IgG分子，所述IgG分子虽然是二价的(即具有两个抗原结合结构域)，但在两个抗原结合结构域中的每个处识别相同表位。结合特异性可以任何适合效价存在。
术语“单克隆抗体”是指来自基本上同质抗体的群体的抗体。基本上同质抗体的群体包含基本上类似，并且结合一种或多种相同表位的抗体，例外之处是可通常在单克隆抗体的产生期间产生的变体。此类变体通常仅少量存在。单克隆抗体通常通过包括从多种抗体选择单一抗体的方法获得。例如，选择方法可为从多种克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其他重组DNA克隆的汇合物选择独特克隆。所选抗体可加以进一步改变，例如以使对靶标的亲和力改进(“亲和力成熟”)，以使抗体人源化，以使它在细胞培养中的产生改进，和/或以使它在受试者中的免疫原性降低。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源于不同来源或物种的抗体。
非人抗体的“人源化”形式是含有源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大体上是人抗体(接受者抗体)，其中来自一个或多个CDR的残基由来自非人抗体(供者抗体)的一个或多个CDR的残基替换。供者抗体可为具有所需特异性、亲和力或生物作用的任何适合非人抗体，诸如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物抗体。在一些情况下，接受者抗体的所选框架区残基由来自供者抗体的相应框架区残基替换。人源化抗体还可包含不见于接受者抗体或供者抗体中的残基。可进行此类修饰以进一步改进抗体功能。对于其他细节，参见Jones等,Nature,1986,321:522-525；Riechmann等,Nature,1988,332:323-329；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，其各自以引用的方式整体并入。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生或源于非人来源的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体，所述非人来源利用人抗体谱系或人抗体编码序列(例如从人来源获得或重新设计)。人抗体明确排除人源化抗体。
“经分离的抗体”或“经分离核酸”是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体或核酸分子。天然环境的组分可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质物质。在一些实施方案中，例如通过使用旋转杯测序仪，将经分离的抗体纯化至足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度。在一些实施方案中，在还原或非还原条件下通过凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)将经分离的抗体纯化至同质，并其中通过考马斯蓝染色或银染色检测。在一些实施方案中，经分离的抗体可包括在重组细胞内原位的抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分不存在。在一些方面，通过至少一个纯化步骤制备经分离的抗体或经分离核酸。在一些实施方案中，将经分离的抗体或经分离核酸纯化至按重量计至少80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，将经分离的抗体或经分离核酸纯化至按体积计至少80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，将经分离的抗体或经分离核酸提供为包含按重量计至少85％、90％、95％、98％、99％至100％抗体或核酸的溶液。在一些实施方案中，将经分离的抗体或经分离核酸提供为包含按体积计至少85％、90％、95％、98％、99％至100％抗体或核酸的溶液。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原或表位)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力可由解离平衡常数(KD)表示。以下更详细描述促成解离平衡常数的动力学分量。亲和力可通过本领域中已知的常用方法测量，所述方法包括本文所述的那些，诸如表面等离子体共振(SPR)技术(例如
Figure BDA0004110303870000241
)或生物层干涉测量术(例如
Figure BDA0004110303870000242
)。
关于抗体与靶标分子的结合，术语“结合”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位、与特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位“特异性结合”、“特异性结合”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位、“对特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位具有特异性”、“选择性结合”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位和“对特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位具有选择性”意指结合在可测量程度上不同于非特异性或非选择性相互作用(例如与非靶标分子的相互作用)。特异性结合可例如通过测量与靶标分子的结合以及将它和与非靶标分子的结合进行比较来测量。特异性结合还可通过与模拟在靶标分子上识别的表位的对照分子的竞争来测定。在那个情况下，如果抗体与靶标分子的结合由对照分子竞争性抑制，那么指示特异性结合。在一些方面，TF抗体对非靶标分子的亲和力小于对TF的亲和力的约50％。在一些方面，TF抗体对非靶标分子的亲和力小于对TF的亲和力的约40％。在一些方面，TF抗体对非靶标分子的亲和力小于对TF的亲和力的约30％。在一些方面，TF抗体对非靶标分子的亲和力小于对TF的亲和力的约20％。在一些方面，TF抗体对非靶标分子的亲和力小于对TF的亲和力的约10％。在一些方面，TF抗体对非靶标分子的亲和力小于对TF的亲和力的约1％。在一些方面，TF抗体对非靶标分子的亲和力小于对TF的亲和力的约0.1％。
在一些实施方案中，特异性结合是指亲和力小于1nM的抗体结合。在一些实施方案中，特异性结合是指亲和力小于10nM的抗体结合。在一些实施方案中，特异性结合是指亲和力小于50nM的抗体结合。在一些实施方案中，特异性结合是指亲和力小于100nM的抗体结合。在一些实施方案中，特异性结合是指亲和力小于200nM的抗体结合。在一些实施方案中，特异性结合是指亲和力小于300nM的抗体结合。在一些实施方案中，特异性结合是指亲和力小于200nM、300nM、400nM或500nM的抗体结合。在一些实施方案中，特异性结合是指亲和力小于0nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM的抗体结合。
如本文所用的术语“kd”(s-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。这个值也被称为k解离值。
如本文所用的术语“ka”(M-1×s-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。这个值也被称为k缔合值。
如本文所用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。KD＝kd/ka。在一些实施方案中，抗体的亲和力以关于此种抗体与它的抗原之间的相互作用的KD描述。为明晰起见，如本领域中所知，较小KD值指示较高亲和相互作用，而较大KD值指示较低亲和相互作用。
如本文所用的术语“KA”(M-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数。KA＝ka/kd。
“亲和力成熟的”抗体是相对于亲本抗体(即衍生或设计改变的抗体的抗体)具有一种或多种改变(例如，在一个或多个CDR或FR中)的抗体，与不具有一种或多种改变的亲本抗体相比，所述抗体导致抗体对其抗原的亲和力提高。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的多种方法来产生。例如，Marks等(Bio/Technology,1992,10:779-783，其以引用的方式整体并入)描述了通过VH和VL结构域洗牌的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机突变描述于例如Barbas等,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1994,91:3809-3813；Schier等,Gene,1995,169:147-155；Yelton等,J.Immunol.,1995,155:1994-2004；Jackson等,J.Immunol.,1995,154:3310-33199；和Hawkins等,J.Mol.Biol.,1992,226:889-896；其各自以引用的方式整体并入。
“Fc效应子功能”是指由抗体的Fc区介导的那些生物活性，所述活性可视抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括用以使补体依赖性细胞毒性(CDC)活化的C1q结合、用以使抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞性吞噬(ADCP)活化的Fc受体结合。
当在本文中在两个或更多个抗体的情形下使用时，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”指示所述两个或更多个抗体竞争结合抗原(例如TF)。在一个示例性测定中，将TF包被在表面上，并且使其与第一TF抗体接触，此后，添加第二TF抗体。在另一示例性测定中，将第一TF抗体包被在表面上，并且使其与TF接触，接着添加第二TF抗体。如果在任一测定中，第一TF抗体的存在使第二TF抗体的结合降低，那么抗体彼此竞争。术语“与……竞争”还包括抗体的组合，其中一种抗体使另一抗体的结合降低，但其中在以相反顺序添加抗体时无竞争被观察到。然而，在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体抑制彼此的结合，无论添加它们的顺序如何。在一些实施方案中，一种抗体使另一抗体与它的抗原的结合降低至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。熟练技术人员可基于抗体对TF的亲和力以及抗体的效价来选择抗体的在竞争测定中使用的浓度。这个定义中所述的测定是说明性的，并且熟练技术人员可利用任何适合测定来确定抗体是否彼此竞争。适合测定例如描述于Cox等,“Immunoassay Methods”,Assay Guidance Manual[Internet],2014年12月24日更新(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/；2015年9月29日访问)；Silman等,Cytometry,2001,44:30-37；以及Finco等,J.Pharm.Biomed.Anal.,2011,54:351-358中；其各自以引用的方式整体并入。如实施例8中提供的，第25组的抗体和第43组的抗体相互竞争结合至人TF，而来自第1组、第29组、第39组和第54组的抗体并不与第25组和第43组的抗体竞争结合至人TF。
如本文所用，当可在ForteBio Octet上用小鼠抗原测量KD值时，认为特异性结合人抗原的抗体与小鼠来源的相同抗原结合。当小鼠抗原的KD值不大于相应人抗原的对应KD值的20倍时，认为特异性结合人抗原的抗体与小鼠来源的相同抗原“交叉反应”。例如，以下抗体不结合小鼠TF：抗体M1593，所述抗体M1593描述于美国专利号8,722,044、8,951,525和8,999,333中，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文；人源化5G9抗体，所述人源化5G9抗体描述于Ngo等,2007,Int J Cancer,120(6):1261-1267，其以引用的方式整体并入；以及嵌合ALT-836抗体，所述嵌合ALT-836抗体描述于Hong等,2012,J Nucl Med,53(11):1748-1754，其以引用的方式整体并入。如实施例1和实施例6中所提供的，来自第25组和第43组的TF抗体结合小鼠TF，例如，TF抗体25G、25G1、25G9和43D8与小鼠TF交叉反应。
如本文所用，当食蟹猴抗原的KD值不大于相应人抗原的对应KD值的15倍时，认为特异性结合人抗原的抗体与食蟹猴来源的相同抗原“交叉反应”。如实施例1中所提供的，来自第1组、第25组、第29组、第39组、第43组和第54组的所有测试抗体与食蟹猴TF交叉反应。
术语“表位”意指抗原的由抗体特异性结合的部分。表位常常包括表面可及氨基酸残基和/或糖侧链，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于在变性溶剂存在下，与前者而非与后者的结合可丧失。表位可包含直接涉及于结合中的氨基酸残基以及不直接涉及于结合中的其他氨基酸残基。抗体结合的表位可使用用于表位确定的已知技术来确定，诸如像测试抗体与具有不同点突变的TF变体或与嵌合TF变体的结合。
多肽序列与参考序列之间的“同一性”百分比被定义为在比对序列并引入空位(如果需要的话)以实现最大百分比的序列同一性之后，多肽序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN(DNASTAR)、CLUSTALW、CLUSTAL OMEGA或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
“保守性取代”或“保守性氨基酸取代”是指用化学或功能类似的氨基酸取代氨基酸。提供类似氨基酸的保守性取代表在本领域中是众所周知的。以举例的方式，在一些实施方案中，表2至表4中提供的氨基酸基团被认为是彼此的保守性取代。
表2：在某些实施方案中，被认为是彼此的保守性取代的所选氨基酸组。
酸性残基 D和E
碱性残基 K、R和H
亲水性不带电荷的残基 S、T、N和Q
脂肪族不带电荷的残基 G、A、V、L和I
非极性不带电荷的残基 C、M和P
芳香族残基 F、Y和W
表3：在某些实施方案中，被认为是彼此的保守性取代的其他所选氨基酸组。
第1组 A、S和T
第2组 D和E
第3组 N和Q
第4组 R和K
第5组 I、L和M
第6组 F、Y和W
表4：在某些实施方案中，被认为是彼此的保守性取代的其他所选氨基酸组。
A组 A和G
B组 D和E
C组 N和Q
D组 R、K和H
E组 I、L、M、V
F组 F、Y和W
G组 S和T
H组 C和M
其他保守性取代可发现于例如Creighton,Proteins:Structures and MolecularProperties第2版(1993)W.H.Freeman&Co.,New York,NY中。通过对亲本抗体中的氨基酸残基进行一个或多个保守性取代而产生的抗体称为“保守性修饰的变体”。
术语“氨基酸”是指二十种常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另外的核酸增殖的核酸分子。术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及并入已经引入载体的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够引导与其可操作性连接的核酸的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且是指已经引入外源核酸的细胞，以及此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”(或“转化的细胞”)和“转染子”(或“转染的细胞”)，其各自包括原代转化或转染的细胞及其衍生的后代。此类后代的核酸含量不可能与亲代细胞完全相同，并且可能含有突变。
术语“治疗(treating)”(及其变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)是指试图改变对其有需要的受试者中疾病或疾患的自然进程的临床干预。可在预防上和在临床病理过程期间进行治疗。理想的治疗效果包括：防止疾病的发生或复发、缓解症状、消除疾病的任何直接或间接的病理学后果、防止转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当向受试者施用时有效治疗疾病或病症的抗体或药物组合物的量。有效量足以在受试者中实现所需的结果或益处。有效量可以一次或多次施用、施加或剂量来施用，并且不意图限于特定制剂或施用途径。
如本文所用，术语“基线水平”和“基线”是指治疗前即刻或治疗时参数(例如体重)的水平。
如本文所用，术语“受试者”意指哺乳动物受试者。示例性受试者包括人、猴子、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、山羊、兔子、猪和绵羊。在某些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，受试者患有可用本文提供的抗体治疗的疾病或疾患。在一些方面，疾病或疾患为炎性疾病。在一些方面，疾病或疾患涉及新生血管或血管炎症。
如本文所用，术语“有需要的受试者”是指表现出和/或被诊断患有如本文所述的炎性疾病的一种或多种症状或体征的受试者。
使用术语“包装说明书”是指通常在治疗或诊断产品(例如，试剂盒)的商业包装中包括的说明，其含有关于使用此类治疗或诊断产品的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“化疗剂”是指用于治疗癌症的化合物。化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用是调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用。
术语“细胞抑制剂”是指体外或体内阻滞细胞生长的化合物或组合物。在一些实施方案中，细胞抑制剂是减少S期细胞百分比的剂。在一些实施方案中，细胞抑制剂将S期细胞百分比减少至少约20％、至少约40％、至少约60％、或至少约80％。
术语“药物组合物”是指以允许包含在其中的活性成分的生物活性对治疗受试者有效的形式的制剂，并且在药物组合物中提供的量中，其不含有对受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
术语“调节(modulate/modulation)”是指降低或抑制，或替代地，活化或增加所叙述变量。
术语“增加”和“活化”是指所叙述变量增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，增加至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大。
术语“降低”和“抑制”是指所叙述变量降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，降低1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100，或降低更多。
术语“激动”是指使受体信号传导活化以诱导与受体的活化相关的生物响应。“激动剂”是结合受体以及使受体激动的实体。
术语“拮抗”是指使受体信号传导抑制以抑制与受体的活化相关的生物响应。“拮抗剂”是结合受体以及使受体拮抗的实体。
2.TF抗体
2.1.TF结合
本文提供了特异性结合TF的经分离的抗体。在一些方面，TF为hTF(SEQ ID NO:809)。在一些方面，TF为cTF(SEQ ID NO:813)。在一些方面，TF为mTF(SEQ ID NO:817)。在一些方面，TF为兔TF(SEQ ID NO:832)。在一些方面，TF为pTF(SEQ ID NO:824)。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性结合hTF(SEQ ID NO:809)、cTF(SEQ ID NO:813)、mTF(SEQ IDNO:817)、兔TF(SEQ ID NO:832)和pTF(SEQ ID NO:824)。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性结合hTF(SEQ ID NO:809)、cTF(SEQ ID NO:813)、mTF(SEQ ID NO:817)和pTF(SEQID NO:824)。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性结合hTF(SEQ ID NO:809)、cTF(SEQ ID NO:813)和mTF(SEQ ID NO:817)。在一些实施方案中，本文提供的抗体特异性结合hTF(SEQ ID NO:809)和cTF(SEQ ID NO:813)。在一些实施方案中，本文提供的抗体不结合mTF(SEQ ID NO:817)。在一些实施方案中，本文提供的抗体不结合pTF(SEQ ID NO:824)。在一些实施方案中，本文提供的抗体不结合兔TF(SEQ ID NO:832)。
在各种实施方案中，本文提供的抗体特异性结合人TF的胞外结构域(SEQ ID NO:810)。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。在一些实施方案中，SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变为K149N。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基68处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合大于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。在一些实施方案中，SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基68处的突变为K68N。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。在一些实施方案中，SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变为N171H和T197K。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基1至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基1至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基39至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基38至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基94至107被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基99至112取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基146至158被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基151至163取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至219被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至224取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至189被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至194取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基167至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基172至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与大鼠TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:838所示序列的氨基酸残基141至194被SEQ ID NO:810所示序列的人TF胞外结构域氨基酸残基136至189取代)之间的结合大于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基68处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合大于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基1至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基1至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基39至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基38至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基94至107被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基99至112取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基146至158被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基151至163取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且本文提供的抗体与大鼠TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:838所示序列的氨基酸残基141至194被SEQ ID NO:810所示序列的人TF胞外结构域氨基酸残基136至189取代)之间的结合大于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。在一些实施方案中，SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变为K149N；并且SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基68处的突变为K68N。
在一些实施方案中，如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，本文提供的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基68处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合大于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基1至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基1至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQID NO:810所示序列的氨基酸残基39至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基38至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基94至107被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基99至112取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基146至158被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基151至163取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至219被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至224取代)之间的结合小于抗体与SEQ IDNO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至189被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至194取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；本文提供的抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基167至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基172至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且本文提供的抗体与大鼠TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:838所示序列的氨基酸残基141至194被SEQ ID NO:810所示序列的人TF胞外结构域氨基酸残基136至189取代)之间的结合大于本文提供的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。在一些实施方案中，SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变为K149N；SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基68处的突变为K68N；并且SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变为N171H和T197K。
在一些实施方案中，与参考抗体M1593相比，本文提供的抗体在抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成上是惰性的，其中参考抗体M1593包含SEQ ID NO:821的VH序列和SEQ ID NO:822的VL序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。在某些实施方案中，本文提供的抗体允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。
在一些实施方案中，本文提供的抗体在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。在某些实施方案中，本文提供的抗体不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力。
在一些实施方案中，本文提供的抗体在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。在某些实施方案中，本文提供的抗体不与人FVIIa竞争结合至人TF。
在一些实施方案中，本文提供的抗体结合人TF的胞外结构域；在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；并且允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。
在一些实施方案中，本文提供的抗体结合人TF的胞外结构域；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；并且不与人FVIIa竞争结合至人TF。
在一些实施方案中，本文提供的抗体在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF的胞外结构域；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；并且不与人FVIIa竞争结合至人TF。
在一些实施方案中，本文提供的抗体抑制FVIIa依赖性TF信号传导。
在一些实施方案中，本文提供的抗体减少猪脉络膜新生血管(CNV)模型中的病变大小。
在一些实施方案中，本文提供的抗体在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF的胞外结构域；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；不与人FVIIa竞争结合至人TF；并且结合至食蟹猴和小鼠TF。
在一些实施方案中，本文提供的抗体在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF的胞外结构域；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；不与人FVIIa竞争结合至人TF；结合至食蟹猴、小鼠和猪TF；并且减少猪脉络膜新生血管(CNV)模型中的病变大小。
在一些实施方案中，本文提供的抗体结合人TF的胞外结构域；抑制FVIIa依赖性TF信号传导；并且结合至食蟹猴TF。
2.2.TF抗体的序列
2.2.1.VH结构域
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:37的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:75的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:113的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:151的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:189的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:836的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:227的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:265的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:303的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:341的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:379的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:417的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:455的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:493的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:531的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:569的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:607的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:645的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:683的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:721的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:759的VH序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含具有与SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759中提供的说明性VH序列至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759中提供的VH序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
2.2.2.VL结构域
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:38的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:76的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:114的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:152的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:190的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:837的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:228的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:266的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:304的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:342的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:380的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:418的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:456的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:494的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:532的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:570的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:608的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:646的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:684的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:722的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:760的VL序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含具有与SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760中提供的说明性VL序列至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760中提供的VL序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
2.2.3.VH-VL组合
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH序列以及选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:37的VH序列和SEQ ID NO:38的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:75的VH序列和SEQ ID NO:76的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:113的VH序列和SEQ ID NO:114的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:151的VH序列和SEQ IDNO:152的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:189的VH序列和SEQID NO:190的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:836的VH序列和SEQ ID NO:837的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:227的VH序列和SEQ ID NO:228的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:265的VH序列和SEQ ID NO:266的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:303的VH序列和SEQ ID NO:304的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:341的VH序列和SEQ ID NO:342的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:379的VH序列和SEQ ID NO:380的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ IDNO:417的VH序列和SEQ ID NO:418的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQID NO:455的VH序列和SEQ ID NO:456的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:493的VH序列和SEQ ID NO:494的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:531的VH序列和SEQ ID NO:532的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:569的VH序列和SEQ ID NO:570的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:607的VH序列和SEQ ID NO:608的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:645的VH序列和SEQ ID NO:646的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:683的VH序列和SEQ ID NO:684的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:721的VH序列和SEQ ID NO:722的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:759的VH序列和SEQ ID NO:760的VL序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含具有与SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759中提供的说明性VH序列至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VH序列以及具有与SEQ IDNO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760中提供的说明性VL序列至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759中提供的VH序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代，以及SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760中提供的VL序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
2.2.4.CDR
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域中的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域中的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域中的三个CDR。在一些方面，CDR为示例性CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为接触CDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，CDR是具有与SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的CDR。在一些实施方案中，CDR-H1是选自SEQ IDNO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR-H2是选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR-H3是选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为示例性CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为接触CDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，CDR是具有与SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的CDR。在一些实施方案中，CDR-L1是选自SEQ IDNO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR-L2是选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的CDR-L2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些实施方案中，CDR-L3是选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的一个至三个CDR以及选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的两个至三个CDR以及选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的三个CDR以及选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的三个CDR。在一些方面，CDR为示例性CDR。在一些方面，CDR为Kabat CDR。在一些方面，CDR为Chothia CDR。在一些方面，CDR为AbM CDR。在一些方面，CDR为接触CDR。在一些方面，CDR为IMGT CDR。
在一些实施方案中，CDR是具有与SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性以及与SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的CDR。在一些实施方案中，CDR-H1是选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-H2是选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H3是选自SEQ ID NO:37、75、113、151、189、227、265、303、341、379、417、455、493、531、569、607、645、683、721和759的VH结构域的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-L1是选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代；CDR-L2是选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且CDR-L3是选自SEQ ID NO:38、76、114、152、190、228、266、304、342、380、418、456、494、532、570、608、646、684、722和760的VL结构域的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3，如通过示例性编号系统所确定的。在一些方面，CDR-H3具有与SEQ ID NO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是选自SEQ IDNO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2，如通过示例性编号系统所确定的。在一些方面，CDR-H2具有与SEQ ID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H2是选自SEQ ID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1，如通过示例性编号系统所确定的。在一些方面，CDR-H1具有与SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H1是选自SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3以及选自SEQID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3、选自SEQ ID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2以及选自SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1。在一些实施方案中，CDR-H3具有与SEQ ID NO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H2具有与SEQ ID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；并且CDR-H1具有与SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是选自SEQ ID NO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H2是选自SEQ ID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；并且CDR-H1是选自SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3，如通过示例性编号系统所确定的。在一些方面，CDR-L3具有与SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L3是选自SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2，如通过示例性编号系统所确定的。在一些方面，CDR-L2具有与SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L2是选自SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。在一些方面，CDR-L1具有与SEQ ID NO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L1是选自SEQ ID NO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3以及选自SEQID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3、选自SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2以及选自SEQ ID NO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1。在一些实施方案中，CDR-L3具有与SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-L2具有与SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；并且CDR-L1具有与SEQ ID NO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-L3是选自SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L2是选自SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且CDR-L1是选自SEQ IDNO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含选自SEQ ID NO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3、选自SEQ IDNO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2、选自SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1、选自SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3、选自SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2、选自SEQ ID NO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1。在一些实施方案中，CDR-H3具有与SEQ ID NO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H2具有与SEQ ID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-H1具有与SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-L3具有与SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；CDR-L2具有与SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性；并且CDR-L1具有与SEQ ID NO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是选自SEQ IDNO:3、41、79、117、155、193、231、269、307、345、383、421、459、497、535、573、611、649、687和725的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H2是选自SEQ ID NO:2、40、78、116、154、192、230、268、306、344、382、420、458、496、534、572、610、648、686和724的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H1是选自SEQ ID NO:1、39、77、115、153、191、229、267、305、343、381、419、457、495、533、571、609、647、685和723的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L3是选自SEQ ID NO:6、44、82、120、158、196、234、272、310、348、386、424、462、500、538、576、614、652、690和728的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L2是选自SEQ ID NO:5、43、81、119、157、195、233、271、309、347、385、423、461、499、537、575、613、651、689和727的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且CDR-L1是选自SEQ ID NO:4、42、80、118、156、194、232、270、308、346、384、422、460、498、536、574、612、650、688和726的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，这个段落中所述的抗体在本文中被称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体不由本文提供的序列获得，并且可例如根据本文提供的用于获得抗体的方法来重新分离。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:1的CDR-H1、SEQ ID NO:2的CDR-H2、SEQ ID NO:3的CDR-H3、SEQ ID NO:4的CDR-L1、SEQ ID NO:5的CDR-L2和SEQ IDNO:6的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:39的CDR-H1、SEQ ID NO:40的CDR-H2、SEQ ID NO:41的CDR-H3、SEQ ID NO:42的CDR-L1、SEQ ID NO:43的CDR-L2和SEQID NO:44的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:77的CDR-H1、SEQ ID NO:78的CDR-H2、SEQ ID NO:79的CDR-H3、SEQ ID NO:80的CDR-L1、SEQ ID NO:81的CDR-L2和SEQID NO:82的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:115的CDR-H1、SEQ ID NO:116的CDR-H2、SEQ ID NO:117的CDR-H3、SEQ ID NO:118的CDR-L1、SEQ ID NO:119的CDR-L2和SEQ ID NO:120的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:153的CDR-H1、SEQ ID NO:154的CDR-H2、SEQ ID NO:155的CDR-H3、SEQ ID NO:156的CDR-L1、SEQ ID NO:157的CDR-L2和SEQ ID NO:158的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:884的CDR-H1、SEQ ID NO:885的CDR-H2、SEQ ID NO:886的CDR-H3、SEQ ID NO:887的CDR-L1、SEQ ID NO:888的CDR-L2和SEQ ID NO:889的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:191的CDR-H1、SEQ ID NO:192的CDR-H2、SEQ ID NO:193的CDR-H3、SEQ ID NO:194的CDR-L1、SEQ ID NO:195的CDR-L2和SEQ ID NO:196的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:229的CDR-H1、SEQ ID NO:230的CDR-H2、SEQ ID NO:231的CDR-H3、SEQ ID NO:232的CDR-L1、SEQ ID NO:233的CDR-L2和SEQ ID NO:234的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:267的CDR-H1、SEQ ID NO:268的CDR-H2、SEQ ID NO:269的CDR-H3、SEQ ID NO:270的CDR-L1、SEQ ID NO:271的CDR-L2和SEQ ID NO:272的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:305的CDR-H1、SEQ ID NO:306的CDR-H2、SEQ ID NO:307的CDR-H3、SEQ ID NO:308的CDR-L1、SEQ ID NO:309的CDR-L2和SEQ ID NO:310的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:343的CDR-H1、SEQ ID NO:344的CDR-H2、SEQ ID NO:345的CDR-H3、SEQ ID NO:346的CDR-L1、SEQ ID NO:347的CDR-L2和SEQ ID NO:348的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:381的CDR-H1、SEQ ID NO:382的CDR-H2、SEQ ID NO:383的CDR-H3、SEQ ID NO:384的CDR-L1、SEQ ID NO:385的CDR-L2和SEQ ID NO:386的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:419的CDR-H1、SEQ ID NO:420的CDR-H2、SEQ ID NO:421的CDR-H3、SEQ ID NO:422的CDR-L1、SEQ ID NO:423的CDR-L2和SEQ ID NO:424的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:457的CDR-H1、SEQ ID NO:458的CDR-H2、SEQ ID NO:459的CDR-H3、SEQ ID NO:460的CDR-L1、SEQ ID NO:461的CDR-L2和SEQ ID NO:462的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:495的CDR-H1、SEQ ID NO:496的CDR-H2、SEQ ID NO:497的CDR-H3、SEQ ID NO:498的CDR-L1、SEQ ID NO:499的CDR-L2和SEQ ID NO:500的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:533的CDR-H1、SEQ ID NO:534的CDR-H2、SEQ ID NO:535的CDR-H3、SEQ ID NO:536的CDR-L1、SEQ ID NO:537的CDR-L2和SEQ ID NO:538的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:571的CDR-H1、SEQ ID NO:572的CDR-H2、SEQ ID NO:573的CDR-H3、SEQ ID NO:574的CDR-L1、SEQ ID NO:575的CDR-L2和SEQ ID NO:576的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:609的CDR-H1、SEQ ID NO:610的CDR-H2、SEQ ID NO:611的CDR-H3、SEQ ID NO:612的CDR-L1、SEQ ID NO:613的CDR-L2和SEQ ID NO:614的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:647的CDR-H1、SEQ ID NO:648的CDR-H2、SEQ ID NO:649的CDR-H3、SEQ ID NO:650的CDR-L1、SEQ ID NO:651的CDR-L2和SEQ ID NO:652的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:685的CDR-H1、SEQ ID NO:686的CDR-H2、SEQ ID NO:687的CDR-H3、SEQ ID NO:688的CDR-L1、SEQ ID NO:689的CDR-L2和SEQ ID NO:690的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含SEQ ID NO:723的CDR-H1、SEQ ID NO:724的CDR-H2、SEQ ID NO:725的CDR-H3、SEQ ID NO:726的CDR-L1、SEQ ID NO:727的CDR-L2和SEQ ID NO:728的CDR-L1，如通过示例性编号系统所确定的。
2.2.5.共有序列
在一些实施方案中，本文提供了第一抗体家族，其中此种家族的抗体包含以下六个CDR序列：(a)具有序列G-F-T-F-S-X1-Y-A-M-X2(SEQ ID NO:773)的CDR-H1，其中X1为D或S并且X2为A或G；(b)具有序列X3-I-S-G-S-G-G-L-T-Y-Y-A-D-S-V-K-G(SEQ ID NO:774)的CDR-H2，其中X3为A或T；(c)具有序列PYGYYMDV(SEQ ID NO:775)的CDR-H3；(d)具有序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO:776)的CDR-L1；(e)具有序列KASSLES(SEQ ID NO:777)的CDR-L2；以及(f)具有序列QQYKSYIT(SEQ ID NO:778)的CDR-L3。在一些实施方案中，此种家族的抗体包含SEQ ID NO:761的VH序列和SEQ ID NO:762的VL序列。在一些实施方案中，本文提供了此种第一家族内的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了第二抗体家族，其中此种家族的抗体包含以下六个CDR序列：(a)具有序列G-Y-T-F-X1-X2-Y-G-I-S(SEQ ID NO:779)的CDR-H1，其中X1为D或R并且X2为S或V；(b)具有序列W-X3-A-P-Y-X4-G-N-T-N-Y-A-Q-K-L-Q-G(SEQ ID NO:780)的CDR-H2，其中X3为I或V并且X4为S或N；(c)具有序列D-A-G-T-Y-S-P-X5-G-Y-G-M-D-V(SEQ IDNO:781)的CDR-H3，其中X5为F或Y；(d)具有序列X6-A-S-X7-S-I-X8-X9-W-L-A(SEQ ID NO:782)的CDR-L1，其中X6为R或Q、X7为Q、E或H、X8为S、D或N并且X9为S或N；(e)具有序列X10-A-X11-X12-L-E-X13(SEQ ID NO:783)的CDR-L2，其中X10为K或S、X11为S或Y、X12为S、Y或N并且X13为S或Y；以及(f)具有序列Q-X14-F-Q-X15-L-P-P-F-T(SEQ ID NO:784)的CDR-L3，其中X14为Q、L或R并且X15为S或K。在一些实施方案中，此种家族的抗体包含SEQ ID NO:763的VH序列和SEQ ID NO:764的VL序列。在一些实施方案中，本文提供了此种第二家族内的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了第三抗体家族，其中此种家族的抗体包含以下六个CDR序列：(a)具有序列F-T-F-X1-S-X2-G-M-H(SEQ ID NO:785)的CDR-H1，其中X1为H或R并且X2为R或Y；(b)具有序列VITYDGINKYYADSVEG(SEQ ID NO:786)的CDR-H2；(c)具有序列DGVYYGVYDY(SEQ ID NO:787)的CDR-H3；(d)具有序列KSSQSVLFSSNNKNYLA(SEQ ID NO:788)的CDR-L1；(e)具有序列WASTRES(SEQ ID NO:789)的CDR-L2；以及(f)具有序列QQFHSYPLT(SEQ ID NO:790)的CDR-L3。在一些实施方案中，此种家族的抗体包含SEQ ID NO:765的VH序列和SEQ ID NO:766的VL序列。在一些实施方案中，本文提供了此种第三家族内的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了第四抗体家族，其中此种家族的抗体包含以下六个CDR序列：(a)具有序列GGTFSSNAIG(SEQ ID NO:791)的CDR-H1；(b)具有序列SIIPIIGFANYAQKFQG(SEQ ID NO:792)的CDR-H2；(c)具有序列DSGYYYGASSFGMDV(SEQ IDNO:793)的CDR-H3；(d)具有序列RASQSVSSNLA(SEQ ID NO:794)的CDR-L1；(e)具有序列GASTRAT(SEQ ID NO:795)的CDR-L2；以及(f)具有序列EQYNNLPLT(SEQ ID NO:796)的CDR-L3。在一些实施方案中，此种家族的抗体包含SEQ ID NO:767的VH序列和SEQ ID NO:768的VL序列。在一些实施方案中，本文提供了此种第四家族内的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了第五抗体家族，其中此种家族的抗体包含以下六个CDR序列：(a)具有序列G-G-S-X1-S-S-G-X2-Y-W-S(SEQ ID NO:797)的CDR-H1，其中X1为I或L并且X2为Q或Y；(b)具有序列E-I-X3-X4-S-G-S-T-R-Y-N-P-S-L-K-S(SEQ ID NO:798)的CDR-H2，其中X3为Y或G并且X4为Y或A；(c)具有序列D-X5-P-Y-Y-Y-X6-G-G-Y-Y-Y-Y-M-D-V(SEQ ID NO:799)的CDR-H3，其中X5为T或A并且X6为E、G或D；(d)具有序列R-A-S-X7-S-V-X8-S-S-X9-L-A(SEQ ID NO:800)的CDR-L1，其中X7为Q、E或D、X8为S或D并且X9为Y或F；(e)具有序列G-A-X10-X11-R-X12-X13(SEQ ID NO:801)的CDR-L2，其中X10为S、D、F或Y、X11为S或T、X12为A或Q并且X13为T或N；以及(f)具有序列Q-Q-X14-G-V-V-P-Y-T(SEQ ID NO:802)的CDR-L3，其中X14为V、A或D。在一些实施方案中，此种家族的抗体包含SEQ ID NO:769的VH序列和SEQ IDNO:770的VL序列。在一些实施方案中，本文提供了此种第五家族内的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了第六抗体家族，其中此种家族的抗体包含以下六个CDR序列：(a)具有序列GYTFANYYMH(SEQ ID NO:803)的CDR-H1；(b)具有序列IINPSGGITVYAQKFQG(SEQ ID NO:804)的CDR-H2；(c)具有序列GGSKVAALAFDI(SEQ ID NO:805)的CDR-H3；(d)具有序列QASQDISNSLN(SEQ ID NO:806)的CDR-L1；(e)具有序列DASNLET(SEQ ID NO:807)的CDR-L2；以及(f)具有序列QQYNFHPLT(SEQ ID NO:808)的CDR-L3。在一些实施方案中，此种家族的抗体包含SEQ ID NO:771的VH序列和SEQ ID NO:772的VL序列。在一些实施方案中，本文提供了此种第六家族内的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了第七抗体家族，其中此种家族的抗体包含以下六个CDR序列：(a)具有序列G-Y-T-F-D-X1-Y-G-I-S(SEQ ID NO:872)的CDR-H1，其中X1为V或A；(b)具有序列W-I-A-P-Y-X2-G-N-T-N-Y-A-Q-K-L-Q-G(SEQ ID NO:873)的CDR-H2，其中X2为N或S；(c)具有序列D-A-G-T-Y-S-P-F-G-Y-G-M-D-V(SEQ ID NO:874)的CDR-H3；(d)具有序列X3-A-S-X4-S-I-X5-X6-W-L-A(SEQ ID NO:875)的CDR-L1，其中X3为R或Q、X4为Q或E、X5为S或N并且X6为S或N；(e)具有序列K-A-X7-X8-L-E-X9(SEQ ID NO:876)的CDR-L2，其中X7为S或Y、X8为S或N并且X9为S或Y；以及(f)具有序列Q-X10-F-Q-X11-L-P-P-F-T(SEQ ID NO:877)的CDR-L3，其中X10为Q或L并且X11为S或K。在一些实施方案中，此种家族的抗体包含SEQ ID NO:868的VH序列和SEQ ID NO:869的VL序列。在一些实施方案中，本文提供了此种第七家族内的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了第八抗体家族，其中此种家族的抗体包含以下六个CDR序列：(a)具有序列G-Y-T-F-R-S-Y-G-I-S(SEQ ID NO:878)的CDR-H1；(b)具有序列W-V-A-P-Y-X1-G-N-T-N-Y-A-Q-K-L-Q-G(SEQ ID NO:879)的CDR-H2，其中X1为S或N；(c)具有序列D-A-G-T-Y-S-P-Y-G-Y-G-M-D-V(SEQ ID NO:880)的CDR-H3；(d)具有序列X2-A-S-X3-S-I-X4-S-W-L-A(SEQ ID NO:881)的CDR-L1，其中X2为R或Q、X3为Q或H、X4为S或D；(e)具有序列X5-A-S-X6-L-E-S(SEQ ID NO:882)的CDR-L2，其中X5为K或S、X6为S或Y；以及(f)具有序列Q-X7-F-Q-S-L-P-P-F-T(SEQ ID NO:883)的CDR-L3，其中X7为Q、L或R。在一些实施方案中，此种家族的抗体包含SEQ ID NO:870的VH序列和SEQ ID NO:871的VL序列。在一些实施方案中，本文提供了此种第八家族内的抗体。
2.2.6.抗体变体的功能特性
如上所述，以及在本公开别处所述，本文提供了基于与本文提供的说明性抗体序列的同一性百分比或与本文提供的说明性抗体序列相比氨基酸残基的取代定义的抗体变体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体对hTF具有特异性。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体对cTF具有特异性。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体对mTF具有特异性。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体对hTF和cTF具有特异性。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体对hTF和mTF具有特异性。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体对cTF和mTF具有特异性。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体对hTF、cTF和mTF具有特异性。
在一些实施方案中，来源于本文提供的说明性抗体序列的抗体的变体保留对hTF的亲和力，如通过KD所测量的，所述亲和力在此种说明性抗体的亲和力的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍内。在一些实施方案中，来源于本文提供的说明性抗体序列的抗体的变体保留对cTF的亲和力，如通过KD所测量的，所述亲和力在此种说明性抗体的亲和力的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍内。在一些实施方案中，来源于本文提供的说明性抗体序列的抗体的变体保留对mTF的亲和力，如通过KD所测量的，所述亲和力在此种说明性抗体的亲和力的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍内。在一些实施方案中，来源于本文提供的说明性抗体序列的抗体的变体保留对hTF和cTF的亲和力，如通过KD所测量的，所述亲和力在此种说明性抗体的亲和力的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍内。在一些实施方案中，来源于本文提供的说明性抗体序列的抗体的变体保留对hTF和mTF的亲和力，如通过KD所测量的，所述亲和力在此种说明性抗体的亲和力的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍内。在一些实施方案中，来源于本文提供的说明性抗体序列的抗体的变体保留对cTF和mTF的亲和力，如通过KD所测量的，所述亲和力在此种说明性抗体的亲和力的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍内。在一些实施方案中，来源于本文提供的说明性抗体序列的抗体的变体保留对hTF、cTF和mTF中的所有三个的亲和力，如通过KD所测量的，所述亲和力在此种说明性抗体的亲和力的约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍内。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体保留抑制TF信号传导的能力，如通过本文所述的一种或多种测定或生物学效应所测量的。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体保留血液凝固过程中TF的正常功能。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体与选自1F、1G、25A、25A3、25A5、25A5-T、25G、25G1、25G9、29D、29E、39A、43B、43B1、43B7、43D、43D7、43D8、43E、43Ea和54E的抗体竞争结合至TF，每个如本公开的表13中提供的。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体与选自25A、25A3、25A5、25A5-T、25G、25G1和25G9的抗体竞争结合至TF。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体与选自43B、43B1、43B7、43D、43D7、43D8、43E和43Ea的抗体竞争结合至TF。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体与选自25A、25A3、25A5、25A5-T、25G、25G1、25G9、43B、43B1、43B7、43D、43D7、43D8、43E和43Ea的抗体竞争结合至TF。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体与选自1F、1G、29D、29E、39A或54E的抗体竞争结合至TF。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体不与人FVIIa竞争结合至人TF。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体抑制FVIIa依赖性TF信号传导。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体结合小鼠TF(SEQ ID NO:817)。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体以比抗体对hTF的亲和力低的亲和力(如由较高的KD所指示)结合小鼠TF。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体不结合mTF。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体结合猪TF(SEQ ID NO:824)。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体以比抗体对hTF的亲和力低的亲和力(如由较高的KD所指示)结合猪TF。在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体不结合pTF。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的变体结合与此种抗体相同的TF表位。
2.2.7.抗体的其他功能特性
在一些实施方案中，本文提供的抗体具有以下(a)至(dd)中列出的特征中的一个或多个：(a)在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；(b)不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；(c)与同种型对照相比，不降低凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；(d)与同种型对照相比，不增加从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；(e)与同种型对照相比，不降低由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；(f)允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；(g)与同种型对照相比，保持凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；(h)与同种型对照相比，保持从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；(i)与同种型对照相比，保留由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；(j)在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；(k)不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；(l)不与人FVIIa竞争结合至人TF；(m)抑制FVIIa依赖性TF信号传导；(n)结合至食蟹猴TF；(o)结合至小鼠TF；(p)结合至兔TF；(q)结合至猪TF；(r)减少猪脉络膜新生血管(CNV)模型中的病变大小；(s)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(t)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基68处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(u)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(v)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基1至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基1至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(w)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基39至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基38至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(x)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基94至107被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基99至112取代)之间的结合大于抗体与SEQ IDNO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(y)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ IDNO:810所示序列的氨基酸残基146至158被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基151至163取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(z)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至219被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至224取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(aa)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至189被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至194取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(bb)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(cc)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基167至174被SEQ IDNO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基172至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且(dd)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与大鼠TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:838所示序列的氨基酸残基141至194被SEQ ID NO:810所示序列的人TF胞外结构域氨基酸残基136至189取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的两个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的三个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的四个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的五个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的六个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的七个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的八个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的九个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十一个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十二个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十三个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十四个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十五个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十六个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十七个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十八个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十九个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十一个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十二个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十三个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十四个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十五个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十六个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十七个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十八个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十九个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的所有三十个特征。
在一些实施方案中，本文提供的抗体具有以下(a)至(dd)中列出的特征中的一个或多个：(a)在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；(b)不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；(c)与同种型对照相比，不降低凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；(d)与同种型对照相比，不增加从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；(e)与同种型对照相比，不降低由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；(f)允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；(g)与同种型对照相比，保持凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；(h)与同种型对照相比，保持从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；(i)与同种型对照相比，保留由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；(j)在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；(k)不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；(l)不与人FVIIa竞争结合至人TF；(m)抑制FVIIa依赖性TF信号传导；(n)结合至食蟹猴TF；(o)结合至小鼠TF；(p)结合至兔TF；(q)结合至猪TF；(r)减少猪脉络膜新生血管(CNV)模型中的病变大小；(s)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变K149N的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(t)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变K68N的变体TF胞外结构域之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(u)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变N171H和T197K的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(v)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基1至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基1至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(w)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基39至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基38至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(x)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基94至107被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基99至112取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(y)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基146至158被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基151至163取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(z)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至219被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至224取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(aa)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至189被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至194取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(bb)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ IDNO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(cc)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ IDNO:810所示序列的氨基酸残基167至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基172至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且(dd)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与大鼠TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:838所示序列的氨基酸残基141至194被SEQ ID NO:810所示序列的人TF胞外结构域氨基酸残基136至189取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的两个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的三个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的四个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的五个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的六个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的七个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的八个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的九个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十一个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十二个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十三个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十四个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十五个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十六个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十七个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十八个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的十九个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十一个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十二个或更多个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十三个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十四个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十五个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十六个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十七个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十八个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的二十九个特征。在一些实施方案中，本文提供的抗体具有前述(a)至(dd)中列出的所有三十个特征。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出包含以下(a)至(dd)中列出的特征中的两个或更多个的组合：(a)在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；(b)不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；(c)与同种型对照相比，不降低凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；(d)与同种型对照相比，不增加从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；(e)与同种型对照相比，不降低由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；(f)允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；(g)与同种型对照相比，保持凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；(h)与同种型对照相比，保持从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；(i)与同种型对照相比，保留由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；(j)在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；(k)不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；(l)不与人FVIIa竞争结合至人TF；(m)抑制FVIIa依赖性TF信号传导；(n)结合至食蟹猴TF；(o)结合至小鼠TF；(p)结合至兔TF；(q)结合至猪TF；(r)减少猪脉络膜新生血管(CNV)模型中的病变大小；(s)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(t)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基68处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(u)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(v)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基1至77被SEQID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基1至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(w)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQID NO:810所示序列的氨基酸残基39至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基38至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(x)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基94至107被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基99至112取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(y)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基146至158被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基151至163取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(z)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至219被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至224取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(aa)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至189被SEQ IDNO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至194取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(bb)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(cc)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基167至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基172至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且(dd)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与大鼠TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:838所示序列的氨基酸残基141至194被SEQ IDNO:810所示序列的人TF胞外结构域氨基酸残基136至189取代)之间的结合大于抗体与SEQID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出包含以下(a)至(dd)中列出的特征中的两个或更多个的组合：(a)在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；(b)不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；(c)与同种型对照相比，不降低凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；(d)与同种型对照相比，不增加从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；(e)与同种型对照相比，不降低由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；(f)允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；(g)与同种型对照相比，保持凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；(h)与同种型对照相比，保持从测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；(i)与同种型对照相比，保留由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；(j)在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；(k)不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；(l)不与人FVIIa竞争结合至人TF；(m)抑制FVIIa依赖性TF信号传导；(n)结合至食蟹猴TF；(o)结合至小鼠TF；(p)结合至兔TF；(q)结合至猪TF；(r)减少猪脉络膜新生血管(CNV)模型中的病变大小；(s)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变K149N的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(t)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变K68N的变体TF胞外结构域之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(u)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQID NO:810所示序列的突变N171H和T197K的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(v)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ IDNO:810所示序列的氨基酸残基1至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基1至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(w)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基39至77被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基38至76取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(x)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基94至107被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基99至112取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(y)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基146至158被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基151至163取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(z)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至219被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至224取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(aa)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至189被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至194取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(bb)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基159至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基164至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；(cc)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与人TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基167至174被SEQ ID NO:838所示序列的大鼠TF胞外结构域氨基酸残基172至179取代)之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且(dd)如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与大鼠TF胞外结构域(其中SEQ ID NO:838所示序列的氨基酸残基141至194被SEQ ID NO:810所示序列的人TF胞外结构域氨基酸残基136至189取代)之间的结合大于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变N171H和T197K的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变N171H和T197K的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变K149N的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变N171H和T197K的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变K149N的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变N171H和T197K的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；结合至食蟹猴TF；如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；结合至食蟹猴TF；如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变K149N的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变N171H和T197K的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基171和197处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
在一些实施方案中，本文提供的抗体表现出以下中列出的特征的组合：在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；结合至食蟹猴TF；如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变K149N的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％；并且如通过在活细胞染色测定中抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的突变N171H和T197K的变体TF胞外结构域之间的结合小于抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
2.3.TF抗体的亲和力和其他特征
2.3.1.TF抗体的亲和力
在一些实施方案中，如由KD所指示，本文提供的抗体对TF的亲和力小于约10-5M、小于约10-6M、小于约10-7M、小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M或小于约10-12M。在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-7M和10-12M之间。在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-7M和10-11M之间。在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-7M和10-10M之间。在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-7M和10-9M之间。在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-7M和10-8M之间在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-8M和10-12M。在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-8M和10-11M之间。在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-9M和10-11M之间。在一些实施方案中，抗体的亲和力在约10-10M和10-11M之间。
在一些实施方案中，本文提供的抗体对cTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的15倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对cTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的10倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对cTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的8倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对cTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的5倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对cTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的3倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对cTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的2倍。
在一些实施方案中，本文提供的抗体对mTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的20倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对mTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的15倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对mTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的10倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对mTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的5倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对mTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的2倍。
在一些实施方案中，如5中所阐述的，如由Biacore测量的KD所指示，本文提供的抗体对hTF的亲和力选自约0.31nM、约6.20nM、约0.36nM、约0.08nM、约23.0nM、约0.94nM、约13.3nM、约0.47nM、约0.09nM、约1.75nM、约0.07nM、约0.14nM、约2.09nM、约0.06nM、约0.15nM、约1.46nM、约1.60nM和约0.42nM。在一些实施方案中，由KD所指示的此种亲和力在约23.0nM至约0.06nM的范围内。在一些实施方案中，此种为约23.0nM或更小。
在一些实施方案中，如表5中所阐述的，如由ForteBio测量的KD所指示，本文提供的抗体对hTF的亲和力选自约1.28nM、约2.20nM、约8.45nM、约1.67nM、约0.64nM、约21.9nM、约3.97nM、约35.8nM、约3.30nM、约2.32nM、约0.83nM、约2.40nM、约0.96nM、约0.86nM、约3.84nM、约1.02nM、约1.61nM、约2.52nM、约2.28nM和约1.59nM。在一些实施方案中，由KD所指示的此种亲和力在约35.8nM至约0.64nM的范围内。在一些实施方案中，此种KD为约35.8nM或更小。
在一些实施方案中，如表5中所阐述的，如由Biacore测量的KD所指示，本文提供的抗体对cTF的亲和力选自约0.26nM、约5.42nM、约0.21nM、约0.04nM、约18.0nM、约0.78nM、约16.4nM、约5.06nM、约0.08nM、约5.64nM、约0.12nM、约0.24nM、约5.66nM、约0.39nM、约5.69nM、约6.42nM和约1.83nM。在一些实施方案中，由KD所指示的此种亲和力在约18.0nM至约0.04nM的范围内。在一些实施方案中，此种KD为约18.0nM或更小。
在一些实施方案中，如表5中所阐述的，如由ForteBio测量的KD所指示，本文提供的抗体对cTF的亲和力选自约1.43nM、约2.70nM、约7.65nM、约1.36nM、约0.76nM、约17.5nM、约4.99nM、约42.9nM、约12.0nM、约15.0nM、约0.57nM、约3.40nM、约1.05nM、约0.94nM、约4.12nM、约1.11nM、约1.96nM、约4.07nM、约2.71nM和约4.16nM。在一些实施方案中，由KD所指示的此种亲和力在约42.9nM至约0.57nM的范围内。在一些实施方案中，此种KD为约42.9nM或更小。
在一些实施方案中，如表5中所阐述的，如由Biacore测量的KD所指示，本文提供的抗体对mTF的亲和力选自约5.4nM、约2.9nM、约21nM和约2.4nM。在一些实施方案中，由KD所指示的此种亲和力在约21nM至约2.4nM的范围内。在一些实施方案中，此种KD为约21nM或更小。
在一些实施方案中，如表5中所阐述的，如由ForteBio测量的KD所指示，本文提供的抗体对mTF的亲和力选自约263nM、约131nM、约188nM、约114nM、约34.2nM、约9.16nM、约161nM、约72.1nM、约360nM、约281nM、约41.4nM、约6.12nM、约121nM和约140nM。在一些实施方案中，由KD所指示的此种亲和力在约360nM至约6.12nM的范围内。在一些实施方案中，此种KD为约360nM或更小。
在一些实施方案中，如由用人TF阳性HCT-116细胞测量的EC50所指示，本文提供的抗体对hTF的亲和力(如国际PCT申请PCT/US2019/012427和US实用申请号16/959,652中所阐述的，所述申请以引用的方式整体并入本文)选自约50pM、约58pM、约169pM、约77pM、约88pM、约134pM、约85pM、约237pM、约152pM、约39pM、约559pM、约280pM、约255pM、约147pM、约94pM、约117pM、约687pM、约532pM和约239pM。在一些实施方案中，此种亲和力在约687pM至约39pM的范围内。在一些实施方案中，此种EC50为约687pM或更小。
在一些实施方案中，如由用小鼠TF阳性CHO细胞测量的EC50所指示，本文提供的抗体对mTF的亲和力(如国际PCT申请PCT/US2019/012427和US实用申请号16/959,652中所阐述的，所述申请以引用的方式整体并入本文)选自约455nM、约87nM、约11nM、约3.9nM、约3.0nM、约3.4nM、约255nM、约2.9nM、约3.6nM和约4.0nM。在一些实施方案中，此种亲和力在约455nM至约2.9nM的范围内。在一些实施方案中，此种EC50为约455pM或更小。
在一些实施方案中，本文提供的抗体对pTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的20倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对pTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的15倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对pTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的10倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对pTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的5倍。在一些实施方案中，本文提供的抗体对pTF的KD值不大于针对hTF的抗体的KD值的2倍。
在一些实施方案中，如表40中所阐述的，如由Biacore测量的KD所指示，本文提供的抗体对pTF的亲和力为约3.31nM或12.9nM。
2.3.2.TF抗体存在下的凝血酶生成
在一些实施方案中，本文提供的TF抗体不抑制由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。在某些实施方案中，本文提供的TF抗体允许由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，凝血酶生成的峰值百分比(峰值IIa％)为至少40％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少50％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少60％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少95％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少99％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少40％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少50％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少60％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少95％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少99％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少60％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少95％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％为至少99％。
在一些实施方案中，如表6和表37中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在100nM TF抗体的存在下，如通过无需抗体预孵育的凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％选自约99％、约100％、约103％、约64％、约52％、约87％、约96％、约98％和约53％。在一些实施方案中，此种峰值IIa％在约52％至约103％的范围内。在一些实施方案中，此种峰值IIa％为约52％或更高。
在一些实施方案中，如表6和表37中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在50nM TF抗体的存在下，如通过无需抗体预孵育的凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％选自约99％、约100％、约103％、约67％、约58％、约89％、约96％、约98％、约68％、约62％和约88％。在一些实施方案中，此种峰值IIa％在约58％至约103％的范围内。在一些实施方案中，此种峰值IIa％为约58％或更高。
在一些实施方案中，如表6和表37中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在10nM TF抗体的存在下，如通过无需抗体预孵育的凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％选自约100％、约99％、约103％、约87％、约83％、约95％、约98％、约86％和约96％。在一些实施方案中，此种峰值IIa％在约83％至约103％的范围内。在一些实施方案中，此种峰值IIa％为约83％或更高。
在一些实施方案中，如表7和表38中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在100nM TF抗体的存在下，如通过在10分钟抗体预孵育下的凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％选自约108％、约105％、约111％、约58％、约47％、约91％、约103％、约109％、约107％和约45％。在一些实施方案中，此种峰值IIa％在约45％至约111％的范围内。在一些实施方案中，此种峰值IIa％为约45％或更高。
在一些实施方案中，如表7和表38中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在50nM TF抗体的存在下，如通过在10分钟抗体预孵育下的凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％选自约107％、约104％、约114％、约62％、约49％、约87％、约105％、约109％、约55％和约92％。在一些实施方案中，此种峰值IIa％在约49％至约114％的范围内。在一些实施方案中，此种峰值IIa％为约49％或更高。
在一些实施方案中，如表7和表38中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在10nM TF抗体的存在下，如通过在10分钟抗体预孵育下的凝血酶生成测定(TGA)确定的，峰值IIa％选自约105％、约114％、约76％、约68％、约94％、约108％、约104％、约74％和约93％。在一些实施方案中，此种峰值IIa％在约68％至约114％的范围内。在一些实施方案中，此种峰值IIa％为约68％或更高。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，内源性凝血酶潜能百分比(ETP％)为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少95％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少99％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少95％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少99％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少95％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于10nM TF抗体的存在下，如通过凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％为至少99％。
在一些实施方案中，如表6和表37中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在100nM TF抗体的存在下，如通过无需抗体预孵育的凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％选自约108％、约103％、约109％、约100％、约96％、约102％、约105％和约92％。在一些实施方案中，此种ETP％在约92％至约109％的范围内。在一些实施方案中，此种ETP％为约92％或更高。
在一些实施方案中，如表6和表37中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在50nM TF抗体的存在下，如通过无需抗体预孵育的凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％选自约108％、约103％、约111％、约101％、约97％、约104％、约106％、约93％、约96％和约105％。在一些实施方案中，此种ETP％在约93％至约111％的范围内。在一些实施方案中，此种ETP％为约93％或更高。
在一些实施方案中，如表6和表37中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在10nM TF抗体的存在下，如通过无需抗体预孵育的凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％选自约106％、约109％、约105％、约104％、约107％、约99％、约101％和约102％。在一些实施方案中，此种ETP％在约99％至约109％的范围内。在一些实施方案中，此种ETP％为约99％或更高。
在一些实施方案中，如表7和表38中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在100nM TF抗体的存在下，如通过在10分钟抗体预孵育下的凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％选自约110％、约104％、约106％、约98％、约95％、约108％、约107％、约96％、约92％和约103％。在一些实施方案中，此种ETP％在约92％至约110％的范围内。在一些实施方案中，此种ETP％为约92％或更高。
在一些实施方案中，如表7和表38中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在50nM TF抗体的存在下，如通过在10分钟抗体预孵育下的凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％选自约110％、约106％、约108％、约103％、约96％、约109％、约102％、约104％、约94％和约98％。在一些实施方案中，此种ETP％在约94％至约110％的范围内。在一些实施方案中，此种ETP％为约94％或更高。
在一些实施方案中，如表7和表38中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在10nM TF抗体的存在下，如通过在10分钟抗体预孵育下的凝血酶生成测定(TGA)确定的，ETP％选自约107％、约106％、约110％、约103％、约100％、约105％、约102％和约101％。在一些实施方案中，此种ETP％在约100％至约110％的范围内。在一些实施方案中，此种ETP％为约100％或更高。
2.3.3.TF抗体存在下的FXa转化
在一些实施方案中，本文提供的抗体在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。在某些实施方案中，本文提供的抗体不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，FXa转化的百分比(FXa％)为至少75％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，FXa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，FXa％为至少85％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，FXa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，FXa％为至少95％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，FXa％为至少75％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，FXa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，FXa％为至少85％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，FXa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于50nM TF抗体的存在下，FXa％为至少95％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于25nM TF抗体的存在下，FXa％为至少75％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于25nM TF抗体的存在下，FXa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于25nM TF抗体的存在下，FXa％为至少85％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于25nM TF抗体的存在下，FXa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于25nM TF抗体的存在下，FXa％为至少95％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于12.5nM TF抗体的存在下，FXa％为至少75％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于12.5nMTF抗体的存在下，FXa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于12.5nM TF抗体的存在下，FXa％为至少85％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于12.5nM TF抗体的存在下，FXa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于12.5nM TF抗体的存在下，FXa％为至少95％。
在一些实施方案中，如表8中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在100nM TF抗体的存在下，FXa％选自约89％、约96％、约116％、约108％、约117％、约105％、约112％、约106％、约103％、约111％、约98％和约101％。在一些实施方案中，此种FXa％在约89％至约117％的范围内。在一些实施方案中，此种FXa％为约89％或更高。
在一些实施方案中，如表8中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在50nM TF抗体的存在下，FXa％选自约94％、约93％、约78％、约102％、约99％、约104％、约105％、约108％、约107％、约97％和约106％。在一些实施方案中，此种FXa％在约78％至约108％的范围内。在一些实施方案中，此种FXa％为约78％或更高。
在一些实施方案中，如表8中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在25nM TF抗体的存在下，FXa％选自约81％、约89％、约85％、约109％、约96％、约97％、约108％、约104％、约103％、约112％和约89％。在一些实施方案中，此种FXa％在约81％至约112％的范围内。在一些实施方案中，此种FXa％为约81％或更高。
在一些实施方案中，如表8中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在12.5nM TF抗体的存在下，FXa％选自约87％、约89％、约82％、约99％、约101％、约98％、约113％、约106％、约115％、约110％、约120％、约85％和约108％。在一些实施方案中，此种FXa％在约82％至约120％的范围内。在一些实施方案中，此种FXa％为约82％或更高。
2.3.4.TF抗体存在下的FVIIa结合
在一些实施方案中，本文提供的抗体在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。在某些实施方案中，本文提供的抗体不与人FVIIa竞争结合至人TF。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于250nM TF抗体的存在下，FVIIa结合的百分比(FVIIa％)为至少75％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于250nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于250nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少85％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于250nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于250nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少95％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于83nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少75％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于83nMTF抗体的存在下，FVIIa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于83nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少85％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于83nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于83nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少95％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于28nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少75％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于28nMTF抗体的存在下，FVIIa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于28nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少85％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于28nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于28nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少95％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于9.25nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少75％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于9.25nMTF抗体的存在下，FVIIa％为至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于9.25nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少85％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于9.25nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少90％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于9.25nM TF抗体的存在下，FVIIa％为至少95％。
在一些实施方案中，如表9中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在250nM TF抗体的存在下，FVIIa％选自约98％、约87％、约80％、约92％、约95％、约89％、约91％、约97％、约94％、约101％和约96％。在一些实施方案中，此种FVIIa％在约80％至约101％的范围内。在一些实施方案中，此种FVIIa％为约80％或更高。
在一些实施方案中，如表9中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在83nM TF抗体的存在下，FVIIa％选自约97％、约88％、约77％、约93％、约94％、约91％、约98％、约100％和约92％。在一些实施方案中，此种FVIIa％在约77％至约100％的范围内。在一些实施方案中，此种FVIIa％为约77％或更高。
在一些实施方案中，如表9中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在28nM TF抗体的存在下，FVIIa％选自约101％、约87％、约79％、约96％、约93％、约95％、约98％、约100％、约102％、约99％、约92％和约91％。在一些实施方案中，此种FVIIa％在约79％至约102％的范围内。在一些实施方案中，此种FVIIa％为约79％或更高。
在一些实施方案中，如表9中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在9.25nM TF抗体的存在下，FVIIa％选自约100％、约90％、约76％、约97％、约93％、约99％、约98％、约102％、约101％和约95％。在一些实施方案中，此种FVIIa％在约76％至约102％的范围内。在一些实施方案中，此种FVIIa％为约76％或更高。
2.3.5.TF抗体存在下的FVIIa依赖性TF信号传导
在一些实施方案中，本文提供的抗体抑制FVIIa依赖性TF信号传导。在一些实施方案中，通过减少IL8来测量对FVIIa依赖性TF信号传导的抑制。在一些实施方案中，通过减少GM-CSF来测量对FVIIa依赖性TF信号传导的抑制。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，白细胞介素8浓度(IL8浓度)为至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少90％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于40nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于40nMTF抗体的存在下，IL8浓度降低至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于40nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少90％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于16nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少60％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于16nMTF抗体的存在下，IL8浓度降低至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于16nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于16nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少90％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少50％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少60％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，IL8浓度降低至少90％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子浓度(GM-CSF浓度)降低至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于100nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少90％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于40nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于40nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于40nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少90％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于16nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少60％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于16nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于16nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于16nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少90％。
在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少50％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少60％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少70％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少80％。在一些实施方案中，与不含抗体的对照条件相比，在不小于6.4nM TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低至少90％。
在一些实施方案中，如表10中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在100nM TF抗体的存在下，白细胞介素8的百分比(IL8％)选自约2％、约9％、约8％、约6％、约13％、约1％、约3％、约4％和约5％。在一些实施方案中，此种IL8％在约1％至约13％的范围内。在一些实施方案中，此种IL8％为约13％或更少。
在一些实施方案中，如表10中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在40nM TF抗体的存在下，IL8％选自约2％、约8％、约7％、约10％、约14％、约4％、约5％和约6％。在一些实施方案中，此种IL8％在约2％至约14％的范围内。在一些实施方案中，此种IL8％为约14％或更少。
在一些实施方案中，如表10中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在16nM TF抗体的存在下，IL8％选自约2％、约3％、约10％、约8％、约7％、约16％、约9％、约15％、约5％和约6％。在一些实施方案中，此种IL8％在约2％至约16％的范围内。在一些实施方案中，此种IL8％为约16％或更少。
在一些实施方案中，如表10中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在6.4nM TF抗体的存在下，IL8％选自约3％、约4％、约11％、约9％、约14％、约22％、约12％、约6％、约5％、约15％、约21％和约8％。在一些实施方案中，此种IL8％在约3％至约22％的范围内。在一些实施方案中，此种IL8％为约22％或更少。
在一些实施方案中，如表11中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在100nM TF抗体的存在下，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的百分比(GM-CSF％)选自约6％、约7％、约22％、约20％、约12％、约19％、约17％、约25％、约5％、约14％、约11％和约10％。在一些实施方案中，此种GM-CSF％在约5％至约25％的范围内。在一些实施方案中，此种GM-CSF％为约25％或更少。
在一些实施方案中，如表11中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在40nM TF抗体的存在下，GM-CSF％选自约6％、约7％、约19％、约15％、约18％、约16％、约26％、约5％、约13％、约11％和约10％。在一些实施方案中，此种GM-CSF％在约5％至约26％的范围内。在一些实施方案中，此种GM-CSF％为约26％或更少。
在一些实施方案中，如表11中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在16nM TF抗体的存在下，GM-CSF％选自约6％、约7％、约22％、约19％、约14％、约32％、约17％、约26％、约5％、约12％、约13％、约9％、约11％和约15％。在一些实施方案中，此种GM-CSF％在约5％至约32％的范围内。在一些实施方案中，此种GM-CSF％为约32％或更少。
在一些实施方案中，如表11中所阐述的，与不含抗体的对照条件相比，在6.4nM TF抗体的存在下，GM-CSF％选自约8％、约9％、约24％、约20％、约18％、约39％、约34％、约15％、约21％、约16％、约17％和约10％。在一些实施方案中，此种GM-CSF％在约8％至约39％的范围内。在一些实施方案中，此种GM-CSF％为约39％或更少。
2.3.6.猪脉络膜新生血管(CNV)模型中的病变减少
在一些实施方案中，本文提供的抗体减少猪脉络膜新生血管(CNV)模型中的病变大小。在一些实施方案中，通过荧光素血管造影术(FA)测量病变大小的减小。
在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体7天后减小至少5％。在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体7天后减小至少10％。在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体7天后减小至少20％。在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体7天后减小至少40％。在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体7天后减小至少60％。
在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体21天后减小至少10％。在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体21天后减小至少20％。在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体21天后减小至少40％。在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体21天后减小至少60％。在一些实施方案中，猪CNV模型中的病变大小在施用抗TF抗体21天后减小至少80％。
2.4.种系
本文提供的抗体可包含任何适合VH和VL种系序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH3种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH1种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH4种系。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH3-23种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH1-18种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH3-30种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH1-69种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH4-31种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH4-34种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VH区来自VH1-46种系。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的VL区来自VK1种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VL区来自VK4种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VL区来自VK3种系。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的VL区来自VK1-05种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VL区来自VK4-01种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VL区来自VK3-15种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VL区来自VK3-20种系。在一些实施方案中，本文提供的抗体的VL区来自VK1-33种系。
2.5.单特异性和多特异性TF抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体为单特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体为多特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合多于一个抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合两个抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合三个抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合四个抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合五个抗原。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合TF抗原上的多于一个表位。在一些实施方案中，多特异性抗体结合TF抗原上的两个抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体结合TF抗原上的三个抗原。
许多特异性抗体构建体在本领域中是已知的，并且本文提供的抗体可以任何适合多特异性适合构建体的形式提供。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含至少两个不同的重链可变区，所述重链可变区各自与共有轻链可变区(即，“共有轻链抗体”)配对。共有轻链可变区与两个不同的重链可变区中的每个形成不同的抗原结合结构域。参见Merchant等,Nature Biotechnol.,1998,16:677-681，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含连接于此种免疫球蛋白的重链或轻链的N端或C端中的一个或多个的抗体或其片段。参见Coloma和Morrison,Nature Biotechnol.,1997,15:159-163，其以引用的方式整体并入。在一些方面，此种抗体包含四价双特异性抗体。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含杂交免疫球蛋白，所述杂交免疫球蛋白包含至少两个不同的重链可变区和至少两个不同的轻链可变区。参见Milstein和Cuello,Nature,1983,305:537-540；以及Staerz和Bevan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:1453-1457；其各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含免疫球蛋白链，其具有改变以减少不具有多特异性的副产物的形成。在一些方面，抗体包含一种或多种“杵臼”修饰，如描述于美国专利号5,731,168中，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含具有一种或多种静电修饰以促进Fc异源多聚体组装的免疫球蛋白链。参见WO 2009/089004，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含双特异性单链分子。参见Traunecker等,EMBO J.,1991,10:3655-3659；和Gruber等,J.Immunol.,1994,152:5368-5374；其各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含通过多肽接头连接的重链可变结构域和轻链可变结构域，其中选择接头的长度以促进具有所需多特异性的多特异性抗体的组装。例如，当重链可变结构域和轻链可变结构域通过具有超过12个氨基酸残基的多肽接头连接时，通常形成单特异性scFv。参见美国专利号4,946,778和5,132,405，其各自以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，将多肽接头的长度减少到少于12个氨基酸残基防止同一多肽链上的重链和轻链可变结构域的配对，从而使来自一条链的重链和轻链可变结构域与另一条链上的互补结构域配对。因此，所得的抗体具有多特异性，其中每个结合位点的特异性由多于一个多肽链贡献。包含由3到12个氨基酸残基之间的接头连接的重链和轻链可变结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。具有0到2个氨基酸残基之间的接头，三聚体(称为三抗体)和四聚体(称为四抗体)是有利的。然而，寡聚的确切类型似乎取决于氨基酸残基组合物和每个多肽链中可变结构域的顺序(例如，VH-接头-VL比VL-接头-VH)，除了接头的长度。技术人员可基于所需多特异性选择适当的接头长度。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含双抗体。参见Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:6444-6448，其以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，多特异性抗体包含三抗体。参见Todorovska等,J.Immunol.Methods,2001,248:47-66，其以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，多特异性抗体包含四抗体。参见同上，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含三特异性F(ab’)3衍生物。参见Tutt等J.Immunol.,1991,147:60-69，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含交联抗体。参见美国专利号4,676,980；Brennan等,Science,1985,229:81-83；Staerz,等Nature,1985,314:628-631；和EP0453082；其各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含由亮氨酸拉链组装的抗原结合结构域。参见Kostelny等,J.Immunol.,1992,148:1547-1553，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含互补蛋白结构域。在一些方面，互补蛋白质结构域包含锚定结构域(AD)以及二聚化和对接结构域(DDD)。在一些实施方案中，AD和DDD彼此结合，并从而能够通过“对接和锁定”(DNL)方法组装多特异性抗体结构。可组装具有许多特异性的抗体，包括双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体、五特异性抗体和六特异性抗体。包含互补蛋白结构域的多特异性抗体描述于例如美国专利号7,521,056；7,550,143；7,534,866和7,527,787中；其各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含双重作用Fab(DAF)抗体，如描述于美国专利公布号2008/0069820中，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含通过还原两个亲本分子之后混合两个亲本分子并再氧化以组装杂化结构而形成的抗体。参见Carlring等,PLoS One,2011,6:e22533，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含DVD-IgTM。DVD-IgTM是可结合两种或更多种抗原的双重可变结构域免疫球蛋白。DVD-IgsTM描述于美国专利号7,612,181中，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含DARTTM。DARTsTM描述于Moore等,Blood,2011,117:454-451中，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含
Figure BDA0004110303870001051
描述于Labrijn等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,110:5145-5150；Gramer等,mAbs,2013,5:962-972；和Labrijn等,Nature Protocols,2014,9:2450-2463中；其各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含连接于另一抗体或片段的抗体片段。连接可为共价或非共价的。当连接为共价时，其可呈融合蛋白的形式或通过化学接头。包含连接于其他抗体的抗体片段的多特异性抗体的说明性实例包括四价双特异性抗体，其中scFv从IgG与CH3的C端融合。参见Coloma和Morrison,Nature Biotechnol.,1997,15:159-163。其他实例包括抗体，其中Fab分子连接于免疫球蛋白的恒定区。参见Miler等,J.Immunol.,2003,170:4854-4861，其以引用的方式整体并入。可使用任何适合片段，包括本文所述或本领域已知的任何片段。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含CovX-Body。CovX-Bodies描述于例如Doppalapudi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2010,107:22611-22616中，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含Fcab抗体，其中一个或多个抗原结合结构域被引入Fc区。Fcab抗体描述于Wozniak-Knopp等,Protein Eng.Des.Sel.,2010,23:289-297中，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含
Figure BDA0004110303870001061
抗体。/>
Figure BDA0004110303870001062
抗体描述于Kipriyanov等,J.Mol.Biol.,1999,293:41-56和Zhukovsky等,Blood,2013,122:5116中，其各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含串联Fab。串联Fab描述于WO 2015/103072中，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含ZybodyTM。ZybodiesTM描述于LaFleur等,mAbs,2013,5:208-218中，其以引用的方式整体并入。
2.6.糖基化变体
在某些实施方案中，可改变本文提供的抗体以提高、降低或消除其糖基化的程度。多肽的糖基化通常为“N-连接的”或“O-连接的”。
“N-连接的”糖基化是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在创建潜在的糖基化位点。
“O-连接的”糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最常见的为丝氨酸或苏氨酸)的连接，虽然也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
可通过改变氨基酸序列以使得创建或除去上述三肽序列中的一个或多个来实现对本文提供的抗体或来自本文提供的抗体的N-连接的糖基化位点的添加或缺失。可通过在抗体序列中或到(视情况而定)一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加、缺失或取代来实现O-连接的糖基化位点的添加或缺失。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含不同于天然存在的抗体的糖基化基序。可在本文提供的抗体中修饰任何适合天然存在的糖基化基序。例如，免疫球蛋白的结构和糖基化性质在本领域中已知，并且总结于例如Schroeder和Cavacini,J.AllergyClin.Immunol.,2010,125:S41-5中，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含对连接于天冬酰胺297(Asn 297)的寡糖进行修饰的IgG1 Fc区。由哺乳动物细胞产生的天然存在的IgG1抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N键连接于Fc区的CH2结构域的Asn 297。参见Wright等,TIBTECH,1997,15:26-32，其以引用的方式整体并入。连接于Asn 297的寡糖可包括各种碳水化合物，诸如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。
在一些实施方案中，修饰连接于Asn 297的寡糖以创建具有改变的ADCC的抗体。在一些实施方案中，改变寡糖以改进ADCC。在一些实施方案中，改变寡糖以减少ADCC。
在一些方面，本文提供的抗体包含相较于天然存在的IgG1结构域，在位置Asn 297处具有降低的海藻糖含量的IgG1结构域。已知所述Fc结构域具有改进的ADCC。参见Shields等,J.Biol.Chem.,2002,277:26733-26740，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，此类抗体在位置Asn 297处不包含任何海藻糖。海藻糖的量可使用任何适合方法测定，例如如以引用的方式整体并入本文的WO 2008/077546中所述。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含二等分寡糖，诸如连接于抗体的Fc区的由GlcNAc二等分的双触角寡糖。此类抗体变体可具有降低的海藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体变体的实例例如描述于WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；以及美国专利公布号2005/0123546中；所述专利中的每一者以引用的方式整体并入。
可并入本文提供的抗体中的其他说明性糖基化变体例如描述于美国专利公布号2003/0157108、2004/0093621、2003/0157108、2003/0115614、2002/0164328、2004/0093621、2004/0132140、2004/0110704、2004/0110282、2004/0109865；国际专利公布号2000/61739、2001/29246、2003/085119、2003/084570、2005/035586、2005/035778；2005/053742、2002/031140；Okazaki等,J.Mol.Biol.,2004,336:1239-1249；以及Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622中，所述专利和文献中的每一者以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的Fc区。此类抗体变体可具有改进的CDC功能。所述抗体变体的实例例如描述于WO1997/30087；WO 1998/58964；以及WO 1999/22764中；所述专利中的每一者以引用的方式整体并入。
能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括Lec13 CHO细胞，所述Lec13 CHO细胞是蛋白质岩藻糖基化缺陷的(参见Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.,1986,249:533-545；美国专利公布号2003/0157108；WO 2004/056312；所述文献和专利中的每一者以引用的方式整体并入)，以及剔除细胞系诸如α-1,6-海藻糖基转移酶基因或FUT8剔除CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622；Kanda等,Biotechnol.Bioeng.,2006,94:680-688；以及WO 2003/085107；所述文献和专利中的每一者以引用的方式整体并入)。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是糖基化抗体。可使用本领域已知或本文所述的任何方法来产生无糖基化的抗体。在一些方面，通过修饰抗体以去除所有糖基化位点来产生无糖基化抗体。在一些方面，仅从抗体的Fc区去除糖基化位点。在一些方面，通过在不能够糖基化的生物体诸如大肠埃希氏菌中表达抗体或通过在无细胞反应混合物中表达抗体来产生无糖基化抗体。
在一些实施方案中，与天然IgG1抗体相比，本文提供的抗体具有恒定区，所述恒定区具有降低的效应子功能。在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区的恒定区对Fc受体的亲和力小于天然IgG1恒定区对此种Fc受体的亲和力。
2.7.Fc区氨基酸序列变体
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含与天然存在的Fc区相比具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的Fc区。在一些方面，此类取代、插入或缺失产生具有改变的稳定性、糖基化或其他特征的抗体。在一些方面，此类取代、插入或缺失产生糖基化抗体。
在一些方面，对本文提供的抗体的Fc区进行修饰以产生对Fc受体具有改变的亲和力的抗体、或更具免疫惰性的抗体。在一些实施方案中，本文提供的抗体变体具有一些但不是所有的效应子功能。例如，当抗体的半衰期在体内很重要，但是当某些效应子功能(例如，补体激活和ADCC)不必要或有害时，此类抗体可为有用的。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区是包含铰链稳定突变S228P和L235E中的一个或多个的人IgG4 Fc区。参见Aalberse等,Immunology,2002,105:9-19，其以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含以下突变中的一个或多个：E233P、F234V和L235A。参见Armour等,Mol.Immunol.,2003,40:585-593，其以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含位置G236处的缺失。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区是包含一个或多个突变以降低Fc受体结合的人IgG1 Fc区。在一些方面，一个或多个突变在选自S228(例如，S228A)、L234(例如，L234A)、L235(例如，L235A)、D265(例如，D265A)和N297(例如，N297A)的残基中。在一些方面，抗体包含PVA236突变。PVA236意指来自IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(SEQ ID NO:928)或IgG4的EFLG(SEQ ID NO:929)被PVA取代。参见美国专利号9,150,641，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，对本文提供的抗体的Fc区进行修饰，如描述于Armour等,Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；WO 1999/058572；和/或英国专利申请号98099518中；其各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区是包含突变A330S和P331S中的一个或多个的人IgG2 Fc区。
在一些实施方案中，本文提供的抗体的Fc区在选自238、265、269、270、297、327和329的一个或多个位置具有氨基酸取代。参见美国专利号6,737,056，其以引用的方式整体并入。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括用丙氨酸取代残基265和297的所谓的“DANA”Fc突变体。参见美国专利号7,332,581，其以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，抗体包含氨基酸位置265处的丙氨酸。在一些实施方案中，抗体包含氨基酸位置297处的丙氨酸。
在某些实施方案中，本文提供的抗体包含具有一个或多个使ADCC改进的氨基酸取代的Fc区，所述氨基酸取代诸如是在Fc区的位置298、333和334中的一者或多者处的取代。在一些实施方案中，本文提供的抗体包含具有在位置239、332和330处的导致增强的效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc区，如以引用的方式整体并入本文的Lazar等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2006,103:4005-4010中所述。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含一个或多个使C1q结合和/或CDC改进或减弱的改变。参见美国专利号6,194,551；WO 99/51642；以及Idusogie等,J.Immunol.,2000,164:4178-4184；所述专利和文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含一个或多个增加半衰期的改变。具有增加的半衰期和改进的与新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体描述于例如Hinton等,J.Immunol.,2006,176:346-356；和美国专利公布号2005/0014934中，其各自以引用的方式整体并入。此类Fc变体包括在IgG的Fc区残基238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428和434中的一处或多处具有取代的那些变体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含一种或多种Fc区变体，如描述于美国专利号7,371,826、5,648,260和5,624,821；Duncan和Winter,Nature,1988,322:738-740；和WO 94/29351中；其各自以引用的方式整体并入。
2.8.焦谷氨酸
如本领域中已知的，重组蛋白N端处的谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)在体外和体内可自发地环化以形成焦谷氨酸(pE)。参见Liu等,J.Biol.Chem.,2011,286:11211-11217，其以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供了包含在N端位置具有pE残基的多肽序列的抗体。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽序列的抗体，其中N端残基已从Q转化为pE。在一些实施方案中，本文提供了包含多肽序列的抗体，其中N端残基已从E转化为pE。
2.9.经半胱氨酸工程改造的抗体变
在某些实施方案中，本文提供了经半胱氨酸工程改造的抗体，也称为“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基取代。在具体的实施方案中，取代的残基存在于抗体的溶剂可接近位点。通过用半胱氨酸取代此类残基，反应性硫醇基团被引入抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)偶联，以例如创建免疫偶联物。
在某些实施方案中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任一个或多个：轻链的V205；重链Fc区的A118；和重链Fc区的S400。可生成经半胱氨酸工程改造的抗体，如描述于例如美国专利号7,521,541中，其以引用的方式整体并入。
3.抗TF抗体-药物缀合物
本文提供了抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含与TF和细胞毒性剂特异性结合的抗体。在一些实施方案中，细胞毒性剂直接连接到抗TF抗体。在一些实施方案中，细胞毒性剂间接连接到抗TF抗体。
在一些实施方案中，ADC还包含接头。在一些实施方案中，接头将抗TF抗体连接到细胞毒性剂。
在一些实施方案中，本文提供的ADC具有的药物-抗体比率(DAR)为1。在一些实施方案中，本文提供的ADC具有的DAR为2。在一些实施方案中，本文提供的ADC具有的DAR为3。在一些实施方案中，本文提供的ADC具有的DAR为4。在一些实施方案中，本文提供的ADC具有的DAR为5。在一些实施方案中，本文提供的ADC具有的DAR为1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4、3至5、4至5、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，本文提供的ADC具有的DAR大于5。在一些实施方案中，通过UV/vis光谱、疏水相互作用色谱(HIC)和/或具有飞行时间检测和质量表征的反相液相色谱分离(RP-UPLC/质谱)来测量DAR。
4.用于制备TF抗体的方法
4.1.TF抗原制备
用于分离本文提供的抗体的TF抗原可为完整TF或TF的片段。TF抗原可为例如经分离蛋白质或在细胞表面上表达的蛋白质的形式。
在一些实施方案中，TF抗原为TF的非天然存在的变体，诸如具有自然界中不存在的氨基酸序列或翻译后修饰的TF蛋白。
在一些实施方案中，通过去除例如细胞内或跨膜序列或信号序列来截短TF抗原。在一些实施方案中，TF抗原在其C端融合至人IgG1Fc结构域或聚组氨酸标签。
4.2.单克隆抗体的制备方
单克隆抗体可例如使用Kohler等,Nature,1975,256:495-497(以引用的方式整体并入)首先描述的杂交瘤方法获得，和/或通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567，其以引用的方式整体并入)。单克隆抗体也可例如使用噬菌体展示文库(参见例如，美国专利号8,258,082，其以引用的方式整体并入)，或另选地，使用基于酵母的文库(参见例如，美国专利号8,691,730，其以引用的方式整体并入)。
在杂交瘤方法中，对小鼠或其他适当的宿主动物进行免疫以引发产生或能够产生将与用于免疫的蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。另选地，可在体外免疫淋巴细胞。然后使用适合融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。参见Goding J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice第3版(1986)AcademicPress,San Diego,CA，其以引用的方式整体并入。
将杂交瘤细胞接种于适合培养基中并在其中生长，所述培养基含有抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
有用的骨髓瘤细胞是有效融合、支持由所选抗体产生细胞稳定地高水平产生抗体、并且具有敏感培养基条件(诸如存在或不存在HAT培养基)的那些骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤细胞系，诸如来源于MOP-21和MC-11小鼠肿瘤(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,CA)以及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection,Rockville,MD)的那些。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。参见例如，Kozbor,J.Immunol.,1984,133:3001，其以引用的方式整体并入。
在鉴定出产生所需特异性、亲和力和/或生物学活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过限制稀释程序来对所选克隆进行亚克隆，并通过标准方法生长。参见Goding，同上。用于此目的的适合培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水肿瘤在体内生长。
编码单克隆抗体的DNA可被容易地分离并使用常规工序(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行测序。因此，杂交瘤细胞可充当编码具有所需特性的抗体的DNA的有用来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，诸如细菌(例如，大肠埃希氏菌(E.coli))、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces)或毕赤酵母(Pichia sp.))、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或本身不产生抗体的骨髓瘤细胞中，以产生单克隆抗体。
4.3.嵌合抗体的制备方法
制备嵌合抗体的说明性方法描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81:6851-6855；其各自以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，通过使用重组技术将非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类诸如猴的可变区)与人恒定区组合来制备嵌合抗体。
4.4.人源化抗体的制备方
可通过用相应的人抗体序列取代非人单克隆抗体的大部分或所有结构部分来生成人源化抗体。因此，生成了杂交分子，其中仅抗原特异性变量或CDR由非人序列组成。获得人源化抗体的方法包括描述于例如以下中的那些：Winter和Milstein,Nature,1991,349:293-299；Rader等,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:8910-8915；Steinberger等,J.Biol.Chem.,2000,275:36073-36078；Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1989,86:10029-10033；以及美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370；其各自以引用的方式整体并入。
4.5.人抗体的制备方
人抗体可通过本领域已知的多种技术生成，例如通过使用转基因动物(例如，人源化小鼠)。参见，例如，Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90:2551；Jakobovits等,Nature,1993,362:255-258；Bruggermann等,Year in Immuno.,1993,7:33；以及美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807；其各自以引用的方式整体并入。人抗体还可源自噬菌体展示文库(参见例如，Hoogenboom等,J.Mol.Biol.,1991,227:381-388；Marks等,J.Mol.Biol.,1991,222:581-597；以及美国专利号5,565,332和5,573,905；其各自以引用的方式整体并入)。还可由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，其各自以引用的方式整体并入)。人抗体还可源自基于酵母的文库(参见例如，美国专利号No.8,691,730，其以引用的方式整体并入)。
4.6.抗体片段的制备方法
本文提供的抗体片段可通过任何适合方法制备，包括本文所述的说明性方法或本领域已知的那些方法。适合方法包括重组技术和整个抗体的蛋白水解消化。制备抗体片段的说明性方法描述于例如Hudson等,Nat.Med.,2003,9:129-134中，其以引用的方式整体并入。制备scFv抗体的方法描述于例如Plückthun中，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458中；其各自以引用的方式整体并入。
4.7.替代性骨架的制备方法
本文提供的替代性骨架可通过任何适合方法制备，包括本文所述的说明性方法或本领域已知的那些方法。例如，AdnectinsTM的制备方法描述于Emanuel等,mAbs,2011,3:38-48中，其以引用的方式整体并入。iMab的制备方法描述于美国专利公布号2003/0215914中，其以引用的方式整体并入。
Figure BDA0004110303870001161
的制备方法描述于Vogt和Skerra,Chem.Biochem.,2004,5:191-199中，其以引用的方式整体并入。Kunitz结构域的制备方法描述于Wagner等,Biochem.&Biophys.Res.Comm.,1992,186:118-1145中，其以引用的方式整体并入。硫氧还蛋白肽适体的制备方法提供于Geyer和Brent,Meth.Enzymol.,2000,328:171-208中，其以引用的方式整体并入。亲和体的制备方法提供于Fernandez,Curr.Opinion in Biotech.,2004,15:364-373中，其以引用的方式整体并入。DARPins的制备方法提供于Zahnd等,J.Mol.Biol.,2007,369:1015-1028中，其以引用的方式整体并入。人泛素的制备方法提供于Ebersbach等,J.Mol.Biol.,2007,372:172-185中，其以引用的方式整体并入。四连接素的制备方法提供于Graversen等,J.Biol.Chem.,2000,275:37390-37396中，其以引用的方式整体并入。高亲和性多聚体的制备方法提供于Silverman等,Nature Biotech.,2005,23:1556-1561中，其以引用的方式整体并入。Fynomers的制备方法提供于Silacci等,J.Biol.Chem.,2014,289:14392-14398中，其以引用的方式整体并入。
关于替代性骨架的其他信息提供于Binz等,Nat.Biotechnol.,200523:1257-1268；和Skerra,Current Opin.in Biotech.,2007 18:295-304中，其各自以引用的方式整体并入。
4.8.多特异性抗体的制备方
本文提供的多特异性抗体可通过任何适合方法制备，包括本文所述的说明性方法或本领域已知的那些方法。常见轻链抗体的制备方法描述于Merchant等,NatureBiotechnol.,1998,16:677-681中，其以引用的方式整体并入。四价双特异性抗体的制备方法描述于Coloma和Morrison,Nature Biotechnol.,1997,15:159-163中，其以引用的方式整体并入。杂化免疫球蛋白的制备方法描述于Milstein和Cuello,Nature,1983,305:537-540；以及Staerz和Bevan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:1453-1457中；其各自以引用的方式整体并入。具有杵臼修饰的免疫球蛋白的制备方法描述于美国专利号5,731,168中，其以引用的方式整体并入。具有静电修饰的免疫球蛋白的制备方法提供于WO 2009/089004中，其以引用的方式整体并入。双特异性单链抗体的制备方法描述于Traunecker等,EMBOJ.,1991,10:3655-3659；和Gruber等,J.Immunol.,1994,152:5368-5374中；其各自以引用的方式整体并入。接头长度可变化的单链抗体的制备方法描述于美国专利号4,946,778和5,132,405中，其各自以引用的方式整体并入。双抗体的制备方法描述于Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:6444-6448中，其以引用的方式整体并入。三抗体和四抗体的制备方法描述于Todorovska等,J.Immunol.Methods,2001,248:47-66中，其以引用的方式整体并入。三特异性F(ab')3衍生物的制备方法描述于Tutt等J.Immunol.,1991,147:60-69中，其以引用的方式整体并入。交联抗体的制备方法描述于美国专利号4,676,980；Brennan等,Science,1985,229:81-83；Staerz,等Nature,1985,314:628-631；和EP0453082中；其各自以引用的方式整体并入。由亮氨酸拉链组装的抗原结合结构域的制备方法描述于Kostelny等,J.Immunol.,1992,148:1547-1553中，其以引用的方式整体并入。通过DNL方法制备抗体的方法描述于美国专利号7,521,056；7,550,143；7,534,866和7,527,787中；其各自以引用的方式整体并入。抗体和非抗体分子的杂化物的制备方法描述于WO 93/08829中，其以引用的方式整体并入，以用于此种抗体的实例。DAF抗体的制备方法描述于美国专利公布号2008/0069820中，其以引用的方式整体并入。通过还原和氧化制备抗体的方法描述于Carlring等,PLoS One,2011,6:e22533中，其以引用的方式整体并入。DVD-IgsTM的制备方法描述于美国专利号7,612,181中，其以引用的方式整体并入。DARTsTM的制备方法描述于Moore等,Blood,2011,117:454-451中，其以引用的方式整体并入。
Figure BDA0004110303870001181
的制备方法描述于Labrijn等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,110:5145-5150；Gramer等,mAbs,2013,5:962-972；和Labrijn等,Nature Protocols,2014,9:2450-2463中；其各自以引用的方式整体并入。包含从IgG融合到CH3的C端的scFv的抗体的制备方法描述于Coloma和Morrison,Nature Biotechnol.,1997,15:159-163中，其以引用的方式整体并入。Fab分子连接到免疫球蛋白的恒定区的抗体的制备方法描述于Miler等,J.Immunol.,2003,170:4854-4861中，其以引用的方式整体并入。CovX-Bodies的制备方法描述于Doppalapudi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2010,107:22611-22616中，其以引用的方式整体并入。Fcab抗体的制备方法描述于Wozniak-Knopp等,Protein Eng.Des.Sel.,2010,23:289-297中，其以引用的方式整体并入。/>
Figure BDA0004110303870001182
抗体的制备方法描述于Kipriyanov等,J.Mol.Biol.,1999,293:41-56和Zhukovsky等,Blood,2013,122:5116中，其各自以引用的方式整体并入。串联Fab的制备方法描述于WO 2015/103072中，其以引用的方式整体并入。ZybodiesTM的制备方法描述于LaFleur等,mAbs,2013,5:208-218中，其以引用的方式整体并入。
4.9.制备变体的方
在一些实施方案中，本文提供的抗体是亲本抗体的亲和力成熟的变体，其可例如使用基于噬菌体文库的亲和力成熟技术来生成。简而言之，可对一个或多个CDR残基进行突变，并且将变体抗体或其部分在噬菌体上展示并筛选亲和力。可在CDR“热点”或由密码子编码的残基中进行此类改变，所述残基在体细胞成熟过程期间经历高频突变(参见Chowdhury,Methods Mol.Biol.,2008,207:179-196，其以引用的方式整体并入)和/或与抗原接触的残基。
可使用任何适合方法将可变性引入编码抗体的一个或多个多核苷酸序列中，包括易错PCR、链改组和寡核苷酸定向诱变，诸如三核苷酸定向诱变(TRIM)。在一些方面，数个CDR残基(例如，一次4至6个残基)是随机的。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定涉及抗原结合的CDR残基。特别是CDR-H3和CDR-L3通常是突变的靶。
将多样性引入可变区和/或CDR中可用于产生次级文库。然后，筛选次级文库以鉴定具有改进的亲和力的抗体变体。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经描述于例如Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology,2001,178:1-37中，其以引用的方式整体并入。
4.10.载体、宿主细胞和重组方法
还提供了编码TF抗体的经分离核酸、包含核酸的载体以及包含载体和核酸的宿主细胞、以及用于产生抗体的重组技术。
为了重组制备抗体，可将编码其的一个或多个核酸分离并插入可复制载体中以便进一步克隆(即DNA扩增)或进行表达。在一些方面，可通过同源重组产生核酸，例如，如描述于美国专利号5,204,244中，其以引用的方式整体并入。
许多不同的载体在本领域中是已知的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如如描述于美国专利号5,534,615中，其以引用的方式整体并入。
下面提供了适合宿主细胞的说明性实例。这些宿主细胞并不意味着是限制性的，并且任何适合宿主细胞可用于产生本文提供的抗体。
适合宿主细胞包括任何原核(例如，细菌)、低等真核(例如，酵母)或高等真核(例如，哺乳动物)细胞。适合原核细胞包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科诸如埃希氏菌属(Escherichia)(大肠埃希氏菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))沙雷氏菌属(Serratia)(粘质沙雷氏菌(S.marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacilli)(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))、假单胞菌菌(Pseudomonas)(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))，和链霉菌属(Streptomyces)。一种有用的大肠埃希氏菌克隆宿主是大肠埃希氏菌294，但其他菌株诸如大肠埃希氏菌B、大肠埃希氏菌X1776和大肠埃希氏菌W3110也是适合。
除原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌(filamentous fungi)或酵母也是TF抗体编码载体的适合克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母(common baker's yeast)是低等真核宿主微生物中常用的。然而，许多其他属、种和菌株是可获得并且有用的，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主(Kluyveromyces)(乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)、威肯克鲁维酵母(K.wickeramii)、克鲁雄酵母(K.waltii)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus))；耶氏酵母属(Yarrowia)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、假丝酵母属(Candida)(白假丝酵母(C.albicans))、瑞氏木霉(Trichoderma reesia)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、许旺酵母属(Schwanniomyces)(西方许旺酵母(S.occidentalis))；和丝状真菌诸如例如青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)(构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。
有用的哺乳动物宿主细胞包括COS-7细胞、HEK293细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)、小鼠睾丸支持细胞、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)等。
用于产生本发明的TF抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基，诸如例如Ham's F10、最小必需培养基(Minimal Essential Medium)(MEM)、RPMI-1640以及杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)，适于培养宿主细胞。此外，可使用描述于Ham等,Meth.Enz.,1979,58:44；Barnes等,Anal.Biochem.,1980,102:255；以及美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655和5,122,469；或WO 90/03430和WO 87/00195中的任何培养基。上述参考文献各自以引用的方式整体并入。
这些培养基中的任何一种可根据需要用激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷)、抗生素、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等量的能量源进行补充。也可以本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其他必需补充剂。
培养条件，诸如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可在细胞内、周质空间中产生、或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。例如，Carter等(Bio/Technology,1992,10:163-167，其以引用的方式整体并入)描述了分离分泌至大肠埃希氏菌的周质空间的抗体的程序。简而言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻细胞体约30分钟。可通过离心去除细胞碎片。
在一些实施方案中，抗体在无细胞体系中产生。在一些方面，无细胞体系是体外的转录和翻译系统，如描述于Yin等,mAbs,2012,4:217-225中，其以引用的方式整体并入。在一些方面，无细胞体系利用来自真核细胞或原核细胞的无细胞提取物。在一些方面，原核细胞为大肠埃希氏菌。抗体的无细胞表达可为有用的，例如，在抗体以不溶性聚集体形式在细胞中积累或周质表达的收率较低的情况下。
在将抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如，
Figure BDA0004110303870001221
或/>
Figure BDA0004110303870001222
超滤单元)浓缩来自此类表达体系的上清液。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可包括在上述任何步骤中以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止不定污染物的生长。
可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和色谱是特别有用的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化包含人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.,1983,62:1-13，其以引用的方式整体并入)。蛋白G可用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等,EMBO J.,1986,5:1567-1575，其以引用的方式整体并入)。
亲和配体所连接的基质最通常是琼脂糖，但也可使用其他基质。机械稳定的基质(诸如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)可实现比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，BakerBond
Figure BDA0004110303870001223
树脂可用于纯化。
用于蛋白质纯化的其他技术，诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、肝素
Figure BDA0004110303870001224
色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的，并且可由本领域技术人员应用。
在任何初步纯化步骤之后，可使用pH在约2.5至约4.5之间的洗脱缓冲液对包含受关注的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱法，通常在低盐浓度下(例如，约0至约0.25M盐)进行。
5.细胞毒性剂
在一些实施方案中，本文提供的ADC包含细胞毒性剂。对于患有炎性疾病(例如，自身免疫性病症)的患者，可考虑细胞毒性剂。本文提供的细胞毒性剂包括本领域已知的各种免疫抑制剂、抗肿瘤剂或抗癌剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂引起癌细胞或免疫细胞的破坏。
适合细胞毒性剂包括抗血管生成剂、促凋亡剂、抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷化剂、激素、激素激动剂、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶、抗代谢药、抗生素、生物碱和放射性同位素。
在一些实施方案中，细胞毒性剂包含以下中的至少一种：刺孢霉素、喜树碱、卡铂、伊立替康、SN-38、卡铂、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、多柔比星、依托泊苷、伊达比星、拓扑替康、长春花生物碱、美登木素生物碱、美登木素生物碱类似物、吡咯并苯二氮杂
Figure BDA0004110303870001231
紫杉烷类、多米卡星、多拉司他汀、奥里斯他汀及其衍生物。在某些实施方案中，细胞毒性剂为单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
在一些实施方案中，细胞毒性剂为诊断剂，诸如放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
在一些实施方案中，细胞毒性剂为经改进的安全性简档的细胞毒性有效载荷，例如XMT-1267和描述于Trail等,Pharmacol Ther,2018,181:126-142中的其他细胞毒性有效载荷。
6.接头
在一些实施方案中，本文提供的ADC包含接头。在一些实施方案中，未结合的接头包含两个反应性末端：抗体缀合反应性末端和细胞毒性剂缀合反应性末端。接头的抗体缀合反应性末端可通过抗体上的半胱氨酸硫醇或赖氨酸胺基团与抗体缀合，通常是硫醇反应性基团(诸如双键)、离去基团(诸如氯、溴或碘)、R-硫烷基或磺酰基、或胺反应性基团(诸如羧基)。接头的细胞毒性剂缀合反应性末端可通过与细胞毒素上的碱性胺或羧基(通常为羧基或碱性胺基)形成酰胺键而与细胞毒性剂缀合。
在一些实施方案中，接头为不可裂解的接头。在一些实施方案中，接头为可裂解的接头。在一些实施方案中，细胞毒性剂从细胞中的ADC释放。
ADC的适合接头包括不稳定的接头、酸不稳定的接头(例如，腙接头)、光不稳定的接头、带电荷的接头、含二硫键的接头、肽酶敏感的接头(例如，包含氨基酸(例如缬氨酸和/或瓜氨酸诸如瓜氨酸-缬氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸)的肽接头)、β-葡糖醛酸苷接头(参见例如，Graaf等,Curr Pharm Des,2002,8:1391-1403)、二甲基接头(参见例如，Chari等,Cancer Research,1992,52:127-131；美国专利号5,208,020)、硫醚接头或亲水接头(参见例如，Kovtun等,Cancer Res.,2010,70:2528-2537)。在某些实施方案中，使用缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头将细胞毒性剂缀合到抗体。
7.抗体-药物缀合物的制备方法
可使用多种双功能蛋白偶联剂(诸如BMP、EMC、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基EMCS、磺基GMBS、磺基KMUS、磺基MBS、磺基SIAB、磺基SMCC和磺基SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)制备本文提供的抗体-药物缀合物(ADC)。例如，可如Vitetta等,Science,1987,238:1098中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。此外，可使用本领域中公开的任何适合方法来制备ADC，例如，BioconjugateTechniques,第2版,G.T.Hermanson,编,Elsevier,San Francisco,2008中。
在一些实施方案中，ADC是用位点特异性缀合技术制备的，导致均匀的药物负载并避免具有改变的抗原结合或药代动力学的ADC亚群。在一些实施方案中，对重链和轻链上的位置处包含半胱氨酸取代的“硫单抗”进行工程化改造以提供不破坏免疫球蛋白折叠和组装或改变抗原结合的反应性硫醇基(Junutula等,J.Immunol.Meth.,2008,332:41-52；Junutula等,Nat.Biotechnol.,2008,26:925-932,)。在一些实施方案中，通过重新编码从终端到硒代半胱氨酸插入的终止密码子UGA，将硒代半胱氨酸共翻译插入到抗体序列中，从而允许在其他天然氨基酸的存在下，在硒代半胱氨酸的亲核硒醇基团处进行位点特异性共价缀合(参见例如，Hofer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105:12451-12456；Hofer等,Biochemistry,2009,48(50):12047-12057)。在某些实施方案中，如Behrens等,Mol Pharm,2015,12:3986-98中所述合成ADC。
8.测定
本领域已知的各种测定可用于鉴定和表征本文提供的抗TF抗体和抗TF ADC。
8.1.结合、竞争和表位作图测定
如本公开别处所述，可通过任何适合方法来评估本文提供的抗体的特异性抗原结合活性，所述方法包括使用SPR、BLI、RIA和MSD-SET。此外，可通过ELISA测定和蛋白质印迹测定评估抗原结合活性。
用于测量两种抗体或一种抗体与另一种分子(例如，TF的一个或多个配体)之间的竞争的测定描述于本公开的别处，例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual第14章,1988,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y中，其以引用的方式整体并入。
用于对本文提供的抗体所结合的表位作图的测定描述于，例如，Morris“EpitopeMapping Protocols,”在Methods in Molecular Biology第66卷,1996,Humana Press,Totowa,N.J.中，其以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，通过肽竞争确定表位。在一些实施方案中，通过质谱分析确定表位。在一些实施方案中，通过晶体学确定表位。
8.2.凝血酶生成、FXa转化和TF信号传导测定
如本公开别处所述，可通过凝血酶生成测定(TGA)来确定在本文提供的抗体存在下的凝血酶生成。
本公开别处描述了用于在本文提供的抗体存在下测量FXa转化的测定。
可通过测量由TF信号传导调节的细胞因子(诸如IL8和GM-CSF)的产生来确定TF信号传导的抑制。用于确定IL8和/或GM-CSF水平的测定提供于本公开别处，并且例如，Hjortoe等,Blood,2004,103:3029-3037中。
8.3.用于效应子功能的测定
可使用本领域已知的多种体外和体内测定评估用本文提供的抗体治疗后的效应子功能，所述测定包括描述于以下中的那些：Ravetc h和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,1991,9:457-492；美国专利号5,500,362、5,821,337；Hellstrom等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1986,83:7059-7063；Hellstrom等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1985,82:1499-1502；Bruggemann等,J.Exp.Med.,1987,166:1351-1361；Clynes等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1998,95:652-656；WO 2006/029879；WO 2005/100402；Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods,1996,202:163-171；Cragg等,Blood,2003,101:1045-1052；Cragg等Blood,2004,103:2738-2743；和Petkova等,Int’l.Immunol.,2006,18:1759-1769；其各自以引用的方式整体并入。
8.4.细胞毒性测定和体内研究
本公开别处描述了用于评估本文提供的抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性的测定。
本公开别处描述了对免疫受损的小鼠的异种移植研究以用于评估本文提供的ADC的体内功效。
本公开包括对免疫活性小鼠的同基因研究以用于评估ADC的体内功效。
8.5.免疫组织化学(IHC)测定
本公开别处描述了用于评估患者样品中TF表达的免疫组织化学(IHC)测定。
8.6.嵌合构建体作图和表位鉴定测定
如本公开别处所述，可通过嵌合TF构建体作图实验和表位结合测定来确定本文提供的抗人TF抗体之间的表位鉴定差异。
9.药物组合物
可将本文提供的抗体配制成任何适当的药物组合物，并且通过任何适合的施用途径来施用。药物组合物的施用途径可根据已知方法，例如口服、通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内途径、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方式注射、通过持续释放系统或通过植入装置施用。在需要时，组合物可通过推注或连续输注或通过植入装置施用。在某些实施方案中，适合的施用途径包括但不限于动脉内、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、经鼻、肠胃外、局部、经肺和皮下途径。
药物组合物可包含一种或多种药物赋形剂。可使用任何适合药物赋形剂，并且本领域普通技术人员能够选择适合药物赋形剂。因此，以下提供的药物赋形剂旨在说明而非限制。另外的药物赋形剂包括例如描述于以下中的那些：Handbook of PharmaceuticalExcipients,Rowe等(编)第6版(2009)，其以引用的方式整体并入。
9.1.肠胃外剂型
在某些实施方案中，本文提供的抗体被配制为肠胃外剂型。肠胃外剂型可通过各种途径施用于受试者，所述途径包括但不限于皮下、静脉内(包括输注和推注)、肌内和动脉内。因为它们的施用通常绕过受试者对污染物的天然防御，所以肠胃外剂型通常是无菌的或能够在施用给受试者之前被灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备溶解或悬浮于药学上可接受的注射用媒介物中的干燥(例如，冻干)产品、准备注射的悬浮液以及乳剂。
10.剂量和单位剂量形式
在人类疗法中，医生将根据预防性或治疗性治疗并且根据年龄、体重、状况和要治疗对象的其他特定因素来确定他认为最适当的剂量。
在某些实施方案中，本文提供的组合物为药物组合物或单一单位剂型。本文提供的药物组合物和单一单位剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防性或治疗性抗体或ADC。
将在预防或治疗病症或其一种或多种症状中有效的抗体/ADC的量可随疾病或疾患的性质和严重程度以及施用抗体/ADC的途径而变化。频率和剂量也可根据每个受试者的特定因素而变化，其取决于所施用的特定疗法(例如，治疗剂或预防剂)、病症、疾病或疾患的严重程度、施用途径以及受试者的年龄、体重、响应和既往病史。可由来源于体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线来外推有效剂量。
如本领域普通技术人员容易知道的，不同的治疗有效量可适用于不同的疾病和疾患。类似地，本文提供的剂量的量和剂量频率方案也包括足以预防、控制、治疗或改善此类病症，但不足以引起或足以减轻与本文提供的抗体或ADC相关的不利影响的量。此外，当给受试者施用多个剂量的本文提供的组合物时，并非所有剂量都需要相同。例如，可增加施用于受试者的剂量以改善组合物的预防或治疗效果，或可降低其以减少特定受试者正在经历的一种或多种副作用。
如本公开别处更详细地讨论的，本文提供的抗体或ADC可任选地与一种或多种用于预防或治疗疾病或病症的其他药剂一起施用。此类其他药剂的有效量可取决于存在于制剂中的ADC的量、病症或治疗的类型和本领域已知或本文所述的其他因素。
11.治疗应用
对于治疗应用，将本发明的抗体以药学上可接受的剂型(诸如本领域已知的那些和上面讨论的那些)施用于受试者，通常为哺乳动物，通常为人。例如，可将本发明的抗体作为丸剂静脉内施用于受试者或通过在一段时间内通过玻璃体内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、肿瘤内或局部途径连续输注施用于受试者。在某些实施方案中，施用是通过静脉内、肌内、肿瘤内、皮下、滑膜内、眼内、斑块内或皮内注射抗体或具有编码所述抗体的cDNA的表达载体。载体可以是携带编码抗体的cDNA的复制缺陷型腺病毒载体、逆转录病毒载体或其他病毒载体。
在一些实施方案中，用有效量的携带编码抗体的cDNA的一种或多种复制缺陷型腺病毒载体或一种或多种腺相关载体治疗患者。
本文提供的抗体可用于治疗涉及TF的炎性疾病。如所使用，术语“炎性疾病”在广义上是指以炎症(局部或全身性，急性或慢性)为特征的任何疾病、病症、损伤或疾患。如所使用，“炎性疾病”还涵盖自身免疫性疾病。此外，如所使用，术语“炎性疾病”还涵盖炎症的症状。
炎症的症状的实例包括但不限于炎性细胞因子和趋化因子(局部或全身)的浓度或表达增加、肿胀、疼痛、纤维化、红细胞沉降率(ESR)增加、单个核细胞和/或粒细胞在患病或损伤部位(例如，肺间质液、肺泡、急性损伤部位等)的浸润、脾肿大、体重减轻、如使用脉搏血氧仪测定的低氧血症(指示影响呼吸系统的炎性疾病)、肺泡液体清除率降低、粪便稠度改变(例如，受试者粪便的软化)、腹泻(例如，慢性腹泻)、便血、潜血、炎症或损伤部位潮红(发红)、炎症或损伤部位发热(热增加)、炎症或损伤部位或患病器官的机能丧失(功能丧失)、皮疹、头痛、发热、恶心或局部组织或细胞损伤。
使用本公开的方法治疗炎性疾病导致减轻或改善炎性疾病的一种或多种不良症状或与炎性疾病的感染或进展相关的其他效应。
在一些情况下，总白细胞计数的增加是炎性疾病(例如，结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸道合胞病毒(RSV))的症状。在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC使总白细胞计数相对于基线水平和/或另一种抗炎剂降低例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。用于测量总白细胞计数的方法是本领域已知的。在某些实施方案中，使用光学显微术测定总白细胞计数。
在一些情况下，总粒细胞计数(例如总嗜中性粒细胞计数、总嗜酸性粒细胞计数、总嗜碱性粒细胞计数)的增加是炎性疾病(例如，结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸道合胞病毒(RSV))的症状。在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC使总粒细胞计数相对于基线水平和/或另一种抗炎剂降低例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。用于测量总粒细胞计数的方法是本领域已知的。在某些实施方案中，使用组织样品或血清样品上的免疫组织化学(IHC)分析测定总粒细胞计数。在某些实施方案中，使用支气管肺泡灌洗(BAL)液分类细胞计数测定总粒细胞计数。用于进行BAL液分类细胞计数和分析的方法是本领域已知的(参见例如Choi SH,等人PLoSOne.2014；9(5):e97346，其以引用的方式整体并入)。
在一些情况下，总单核细胞计数(例如总巨噬细胞计数、总淋巴细胞计数)的增加是炎性疾病(例如，结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸道合胞病毒(RSV))的症状。在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC使总单个核细胞计数相对于基线水平和/或另一种抗炎剂降低例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。用于测量总单个核细胞计数的方法是本领域已知的。在某些实施方案中，使用组织样品或血清样品上的免疫组织化学(IHC)分析测定总单个核细胞计数。在某些实施方案中，使用支气管肺泡灌洗(BAL)液分类细胞计数测定总单个核细胞计数。用于进行BAL液分类细胞计数和分析的方法是本领域已知的(参见例如Choi SH,等人PLoSOne.2014；9(5):e97346，其以引用的方式整体并入)。
在某些实施方案中，用本公开的抗体或ADC治疗导致M1巨噬细胞减少和/或M2巨噬细胞减少。在某些实施方案中，用本公开的抗体或ADC治疗导致M1巨噬细胞减少和/或M2巨噬细胞增加。在某些炎性疾病中，升高的M2巨噬细胞与疾病的无症状状态或疾病消退相关。(参见Hu,Kebin,等人,Journal of Immunology Research,2018，其以引用的方式整体并入本文)。
在一些情况下，脾肿大(脾肿大)是炎性疾病的症状。在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC相对于基线水平或相对于不同的抗炎剂降低脾的重量、减小脾的大小或消除/逆转脾肿大。在临床环境中，测量脾的重量可能不实用。在此类情况下，脾肿大的进展(或逆转)可使用本领域已知的方法(例如，触诊、叩诊、超声、计算机断层摄影术(CT)扫描或磁共振成像(MRI))测量。超声、计算机断层摄影术(CT)扫描和磁共振成像(MRI)允许脾的可视化。超声或计算机断层摄影术(CT)扫描有助于确定你的脾的大小，并确定其是否与其他器官拥挤。磁共振成像(MRI)允许临床医生追踪通过脾的血流。
在一些情况下，纤维化(例如，肺组织的纤维化或炎症部位的纤维化)是炎性疾病的症状。纤维化通常是慢性炎症的特征。在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC相对于基线水平或相对于不同的抗炎剂减少纤维化(例如肺、皮肤或肝中的纤维化)。可使用组织的IHC分析或通过定量高分辨率计算机断层摄影术(qHRCT)测量纤维化的变化。
在一些情况下，红细胞沉降率(ESR)增加是炎性疾病的指标。ESR是抗凝全血中的红细胞在标准化试管中在一小时时间段内下降的速率。其是常见的血液学检验，并且是炎症的非特异性量度。在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC使ESR相对于基线水平和/或另一种抗炎剂降低例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些情况下，粪便稠度的变化、粪便软化和/或腹泻是炎性疾病(例如，结肠炎、炎性肠病(IBD))的症状。例如，患有炎性疾病的受试者可表现出在布里斯托粪便图表上分类为大于4、5或6的稀便。布里斯托粪便形状量表(BSFS)或布里斯托粪便图表被开发作为评估成人肠道通过时间的方法(参见Lewis S J等人,Scand J Gastrotrnterol,32:920-924(1997)，其以引用的方式整体并入)。它是一种纸质图表量表，由以垂直方式排序的各种粪便类型的二维表示组成，其中每种粪便类型与每种粪便类型的文本描述相关联地描绘。BSFS在临床护理中广泛用于患有功能性胃肠病症(FGID)的患者。用于测量粪便稠度的方法和装置的实例以引用的方式整体并入的美国申请号13/592,906中提供。在患有炎性疾病(例如结肠炎、IBD)的受试者表现为稀便的情况下，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC导致粪便相对于基线水平和/或不同的抗炎剂硬化。在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC导致在BSFS上分类为3的粪便稠度。可通过用本文提供的抗体或ADC治疗而改善的其他终点或症状包括便血、大便次数、大便急迫性和严重性以及腹痛。
在一些情况下，便血和/或潜血是炎性疾病(例如，结肠炎或IBD)的症状。便血是从肛门排出血液(通常在粪便中或与粪便一起)。便血可通过粪便的肉眼检查来确定。相比之下，潜血是粪便中不明显的血液，并且也可指示炎性疾病。用于测定粪便中的血量(特别是潜血)变化的更准确的方法是通过使用潜血测试、粪便潜血测试或免疫化学血凝测试。用于进行隐血测试的方法是本领域已知的(例如，可使用潜血载玻片试剂盒，SmithKlineDiagnostics,Inc.和制造商说明书)。用于进行免疫化学血凝测试的方法也是本领域已知的，并且利用对人血红蛋白具有特异性的抗体进行检测。
在一些情况下，净肺泡液体清除率(AFC)的降低或AFC损伤是炎性疾病(例如，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和急性肺损伤)的症状。在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC相对于基线水平或不同的抗炎剂增加AFC。AFC可使用本领域已知的方法，例如连续水肿液蛋白质浓度的测量进行测量。使用连续水肿液蛋白质浓度的测量来确定AFC变化的方法提供于例如Ware,L.B.和Michael,M.A.,American journal ofrespiratory and critical care medicine,163.6(2001):1376-1383中，其以引用的方式整体并入。
炎症可直接或间接地导致对多种细胞、组织或器官或对单一细胞类型、组织类型或器官的细胞、组织或器官损伤。可显示损伤的示例性组织和器官取决于炎性疾病并且包括上皮或粘膜组织、胃肠道、肠、胰腺、胸腺、肝、肾、脾、皮肤或骨关节(例如，膝、踝、髋、肩、腕、手指、脚趾或肘)。根据本公开的治疗可导致组织损伤的减少或抑制，或者可导致受损器官或组织(例如，皮肤、粘膜、肝、肺等)的再生。
图1提供人类中ALI和ARDS的特征/症状的实例。(参见Matute-Bello2008American Journal of Physiology，其以引用的方式整体并入)。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗体或ADC来延迟所述受试者的炎性疾病的发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗体或ADC来预防所述受试者的炎性疾病的发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗体或ADC来延长所述受试者的总体存活期、中值存活期或无进展存活期的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于通过向已对护理治疗标准产生抗性的受试者施用有效量的本文提供的抗体或ADC来治疗所述受试者的方法。
在一些实施方案中，可受益于用抗TF抗体治疗的疾病或疾患是涉及炎症的疾病或疾患。在某些实施方案中，炎性疾病是结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施方案中，可受益于用抗TF抗体治疗的疾病或疾患是涉及血管炎症的疾病或疾患。
在一些实施方案中，提供本文提供的抗TF抗体或ADC以用作用于治疗涉及炎症的疾病或疾患的药物。在一些实施方案中，提供本文提供的抗TF抗体以用于制造或制备用于治疗癌症的药物。在某些实施方案中，炎性疾病是结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施方案中，提供本文提供的抗TF抗体或ADC以用作用于治疗涉及血管炎症的疾病或疾患的药物。在一些实施方案中，提供本文提供的抗TF抗体以用于制造或制备用于治疗涉及血管炎症的疾病或疾患的药物。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗TF抗体来治疗所述受试者的炎性疾病的方法。在某些实施方案中，炎性疾病是结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗TF抗体或ADC来治疗所述受试者的涉及血管炎症的疾病或疾患的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗体来延迟所述受试者的炎性疾病的发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗体来预防所述受试者的炎性疾病的发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗体来延迟所述受试者的涉及血管炎症的疾病或疾患的发作的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过向有需要的受试者施用有效量的本文提供的抗体来阻止所述受试者的涉及血管炎症的疾病或疾患的发作的方法。
12.炎症和炎性疾病
炎症可分类为急性或慢性炎症。急性炎症是身体对有害刺激的初始反应，并且通过血浆和白血细胞(例如，白细胞，例如，单核细胞和粒细胞)从血液至受损组织的移动增加而实现。这起始一系列生化事件，导致成熟炎性响应，包括局部脉管系统、免疫系统和受损组织中的各种细胞。相比之下，慢性炎症导致炎症部位存在的细胞类型的进行性转变并且特征在于炎症过程引起组织同时发生破坏和愈合。慢性炎症还可导致宿主疾病，包括但不限于花粉热、牙周炎、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和癌症，从而突出了身体对身体密切调控的需要。
在本公开的方法中考虑的炎性疾病的实例包括：结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸道合胞病毒(RSV)。
炎性疾病的非限制性实例包括但不限于寻常痤疮、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、自身免疫性疾病(例如，急性播散性脑脊髓炎(ADEM))、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩性侧索硬化、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性变态反应、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛同心性硬化、白塞氏病、伯格氏病、比克斯塔夫脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、卡斯尔曼氏病、乳糜泻、查加斯病、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、慢性阻塞性肺病、丘-施综合征、瘢痕性类天疱疮、科根综合征、结肠炎、冷凝集素病、补体组分2缺乏症、接触性皮炎、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩氏病、库欣氏综合征、皮肤白细胞破碎性血管炎、德戈斯病、德尔肯氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、德雷斯勒综合征、药物诱导的狼疮、盘状红斑狼疮、湿疹、子宫内膜异位、起止点炎相关的关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、胎儿成红细胞增多症、原发性混合性冷球蛋白血症、埃文氏综合征、进行性骨化性纤维发育不良、纤维化性肺泡炎、胃炎、胃肠类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、亨-舍二氏紫癜、妊娠疱疹、化脓性汗腺炎、霍夫-斯陶文综合征(Hughes-Stovin syndrome)、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘疾病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、包涵体肌炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎、川崎病、莱伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线状IgA病、红斑狼疮、马吉德综合征(Majeed syndrome)、美尼尔氏病、显微镜下多血管炎、混合性结缔组织病、硬斑病、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮、眼阵挛性肌阵挛综合征、奥德氏甲状腺炎、复发性风湿病、PANDAS、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、帕里龙贝格综合征(Parry Romberg syndrome)、Parsonage-Turner综合征、睫状体扁平部炎、寻常天疱疮、恶性贫血、静脉周围脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性神经病、银屑病性关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen'sencephalitis)、雷诺现象、复发性多软骨炎、莱特尔氏综合征、呼吸道合胞病毒(RSV)、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、血清病、舍格伦氏综合征、脊柱关节病、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、Susac综合征、斯威特氏综合征、交感性眼炎、高安氏动脉炎、颞动脉炎、血小板减少症、托-享综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化型结缔组织病、未分化性脊柱关节病、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病)、乳糜泻、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠病、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、血管炎、间质性膀胱炎和骨关节炎。
在一些实施方案中，术语“炎性疾病”包括病毒感染。在一些实施方案中，炎性疾病包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在一些实施方案中，本文所述的抗TF抗体用于治疗致病性病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒、腺病毒、SARS-CoV-2和A型流感病毒。在一些实施方案中，所述致病性病毒选自：疱疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科和弹状病毒科。在一个实施方案中，所述病毒选自由以下组成的组：1型单纯疱疹、2型单纯疱疹、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒、天花、乙型肝炎病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、TBE病毒、寨卡病毒、风疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、拉沙病毒、克里米亚-刚果、出血热病毒、汉坦病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒和丁型肝炎病毒(HDV)。
几种自身免疫性疾病被认为是炎性疾病和/或通过多种机制引起炎症。使用本文提供的抗体或ADC治疗自身免疫性疾病也在本公开中考虑。炎性疾病的非限制性实例包括：自身免疫性疾病或病症的实例包括关节炎，如类风湿性关节炎、急性关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、骨关节炎、II型胶原诱发的关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、斯蒂尔氏病、脊柱关节炎、幼发型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、骨关节炎、慢性原发性多发性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎；炎性过度增生性皮肤病；银屑病如寻常型银屑病、点滴型银屑病、脓疱型银屑病、指甲型银屑病；特应性(例如，特应性疾病，例如，花粉热和乔布氏综合征(Job syndrome))；皮炎(例如，接触性皮炎、慢性接触性皮炎、红皮病、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹性皮炎、货币性皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎)；x连锁高IgM综合征；过敏性眼内炎性疾病；荨麻疹，例如慢性过敏性荨麻疹、慢性特发性荨麻疹和慢性自身免疫性荨麻疹；肌炎；多发性肌炎/皮肌炎；幼年型皮肌炎；中毒性表皮坏死；硬皮病，例如系统性硬皮病；硬化症，例如全身硬化症、多发性硬化症(MS)、脊柱光学MS、原发性进行性MS(PPMS)、复发缓解型MS(RRMS)、进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化症和共济失调性硬化性视神经脊髓炎(NMO)；炎性肠病(IBD)，例如克罗恩氏病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、显微镜下结肠炎、胶原形成性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎、全层结肠炎和自身免疫炎性肠病；肠炎；坏疽性硬皮病；结节性红斑；原发性硬化性胆管炎呼吸困难综合征，例如成人或急性呼吸困难综合征(ARDS)；脑膜炎；葡萄膜全部或部分炎症；虹膜炎；脉络膜炎；自身免疫性血液病；风湿性脊柱炎；滑膜炎；遗传性血管性水肿；脑神经病症如脑膜炎；妊娠期疱疹；妊娠期类天疱疮；阴囊瘙痒；自身免疫性卵巢功能障碍；自身免疫性症状；由于IgE介导的疾病如过敏性脑炎(例如，ramssen脑病和边缘性和/或脑干脑炎)引起的突发性听力丧失；葡萄膜炎，例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎；伴有或不伴有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，例如慢性或急性球型肾炎、原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性或膜性增生性GN(MPGN)，例如I型和II型，以及快速进行性GN；增生性肾炎；自身免疫性多发性内分泌功能不全；龟头炎，例如浆细胞局限性龟头炎、龟头包皮炎；传出性环状红斑；多形性红斑；环肉芽肿；光泽苔藓；萎缩性苔藓；比德尔苔藓；多刺苔藓；扁平苔藓；板层状鱼鳞病；表皮剥脱性角化病；癌前角化病；坏疽性硬皮病；过敏症状和反应；反应；湿疹，如过敏性和特应性湿疹、皮脂缺乏性湿疹、水疱性湿疹和水疱性掌跖湿疹；哮喘，如支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘；T细胞润湿和症状，包括慢性炎性响应；怀孕期间对外来抗原如胎儿ABO血型的免疫响应；慢性肺部炎性疾病；自身免疫性心肌炎；白细胞粘附缺陷；狼疮如狼疮肾炎；狼疮性脑炎、儿童狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮SLE、皮肤性SLE、亚急性皮肤性SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性狼疮、红斑狼疮(播散性红斑狼疮)；幼年发病型(I型)糖尿病，例如小儿胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成年发病型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病和糖尿病性主动脉疾病；由细胞因子和T淋巴细胞介导的与急性和迟发型超敏反应相关的免疫响应；结核病；结节病；肉芽肿病，例如淋巴瘤样肉芽肿病；韦格纳氏肉芽肿病；粒细胞缺乏症；血管炎病，例如血管炎、大血管炎、类风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎、中度血管性血管炎、川崎病、结节性多动脉炎/结节性动脉周炎、显微镜下多血管炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、过敏性血管炎、坏死性血管炎、全身性坏死性血管炎、ANCA相关血管炎、齐格-斯特劳斯血管炎或综合征(CSS)和ANCA相关小血管炎；颞动脉炎；再生障碍性贫血；自身免疫性再生障碍性贫血；库姆斯阳性贫血；先天性再生障碍性贫血(Diamond Blackfan anemia)；溶血性贫血或免疫性溶血性贫血(例如，自身免疫性溶血性贫血(AIHA))、恶性贫血(恶性贫血)；阿狄森病；真性红细胞贫血或红细胞再生障碍性贫血(PRCA)；因子VIII缺乏症；A型血友病、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症；全血细胞减少症；白细胞减少症；包括白细胞渗漏的疾病；CNS炎性疾病；多器官损伤综合征，例如继发于败血症、创伤或出血；抗原-抗体复合物介导的疾病；肾小球基底膜抗体疾病；抗磷脂抗体综合征；过敏性白塞氏病/综合征；卡斯曼综合征；古德帕斯丘综合征；雷诺综合征；舍格伦综合征；史蒂文斯-约翰逊综合征；大疱性类天疱疮和皮肤性类天疱疮、天疱疮、寻常天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜性类天疱疮和红斑型天疱疮；自身免疫性多内分泌内分泌病莱特尔氏病或综合征；热损伤；先兆子痫；免疫复合物病症如免疫复合物肾炎和抗体介导的肾炎；多发性神经病；慢性肾病如IgM多发性神经病和IgM介导的神经官能症；血小板减少症(例如，在患有心肌梗死的患者中)，例如血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱导的血小板减少症、自身免疫性或免疫介导的血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)和慢性或急性ITP；巩膜炎，例如特发性角膜巩膜炎和表层巩膜炎；睾丸和卵巢自身免疫性疾病如自身免疫性睾丸炎；原发性甲状腺功能减退症；甲状旁腺功能减退症；自身免疫性内分泌疾病如甲状腺炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯病、多腺体综合征、自身免疫性多腺体综合征和多腺体内分泌紊乱综合征；副肿瘤综合征，如神经副肿瘤综合征；兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征；僵人综合征或全身僵硬生殖器综合征；脑脊髓炎，例如变应性表现脊髓炎、脑脊髓炎过敏和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)；重症肌无力，例如与胸腺瘤小脑变性相关的重症肌无力；神经肌肉张力；眼阵挛或眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)；感觉神经病；多灶性运动神经病；席汉综合征；肝炎如自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮性肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎和自身免疫性慢性活动性肝炎；淋巴样间质性肺炎(LIP)；阻塞性细支气管炎(非移植)vs NSIP；格林-巴利综合征；伯杰氏病(IgA肾病)；特发性IgA肾病；线性IgA皮肤病；急性嗜中性皮肤病；角下脓疱性皮肤病；例如原发性胆汁性肝硬化和肺纤维化；自身免疫性肠病综合征；乳糜泻或腹腔疾病；脂便(麸质肠病)；难治性口炎性腹泻；特发性口炎性腹泻；球蛋白血症；肌萎缩性侧索硬化(ALS；卢伽雷氏病)；环动脉疾病；自身免疫性耳病如自身免疫性内耳病(AIED)；自身免疫性听力损失；软骨炎，例如难治性或复发性或复发性多软骨炎；细胞蛋白质沉积症；科根综合征/非梅毒性间质性角膜炎；贝尔麻痹；斯威特病/综合征；自身免疫性酒渣鼻自身免疫；与带状疱疹相关的疼痛；淀粉样变性；非癌性淋巴细胞增多症；原发性淋巴水肿，例如单克隆B细胞淋巴细胞肥大(例如，良性单克隆免疫球蛋白和意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)；周围神经病；通道病，例如癫痫、偏头痛、心律失常、肌无力、痔疮、失明、周期性麻痹和CNS通道病；孤独症；炎性肌病；局灶性或节段性肾小球硬化(FSGS)；内分泌眼病；自身免疫性肝病；纤维肌痛；多发性内分泌功能不全；施密特综合征；肾上腺炎；胃萎缩；早老性痴呆；脱髓鞘疾病如自身免疫性脱髓鞘性和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病；德雷斯勒综合征；斑秃；完全脱发；CREST综合征(钙化、雷诺现象、食管下蠕动、菌核病和毛细血管扩张)；男性和女性自身免疫性不育(例如，抗精子抗体)；混合性结缔组织病；查加斯病；风湿热；反复流产；农民肺；红斑性红斑；心脏切开术后综合征；库欣综合征；禽病；过敏性肉芽肿性血管炎；良性皮肤淋巴细胞性血管炎；奥尔波特综合征；肺泡炎，例如过敏性肺泡炎和纤维性肺泡炎间质性肺炎；输血反应；麻风病；疟疾；萨姆特综合征；卡普兰综合征；心内膜炎；心内膜心肌纤维化；弥漫性间质性肺纤维化；间质性肺纤维化；肺纤维化；特发性肺纤维化；囊性纤维化；眼内炎；持续性红斑升高；胎儿成红细胞增多症；嗜酸性粒细胞筋膜炎；舒尔曼综合征费尔蒂综合征；flaresis；睫状体炎症，甚至慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch睫状体炎；亨-舍二氏紫癜；败血症；内毒素血症；胰腺炎；甲状腺毒症；埃文综合征；自身免疫性腺体功能障碍；西登哈姆舞蹈病；链球菌感染后肾炎；阻塞性血栓性血管炎；甲状腺中毒；背侧动脉)；巨细胞性多肌痛；慢性过敏性肺炎；干性角膜结膜炎；流行性角膜结膜炎；特发性肾病综合征；微小病变性肾病；良性家族性和缺血性灌注病症；灌注；视网膜自身免疫；关节炎症；支气管炎；慢性阻塞性气道/肺病；矽肺；口疮；口疮性口炎；动脉硬化性疾病；无精子症；自身免疫性溶血)、Croglob Nchisho；Dupuis Trang(杜普伊特伦)挛缩；晶状体过敏性眼内炎(晶状体蛋白过敏性眼内炎)；过敏性小肠结肠炎；麻风结节性红斑；特发性面神经麻痹；风湿热；哈-里二氏病；感觉神经性听力损失；阵发性血红蛋白尿(血色素尿症发作)；性腺功能障碍；局灶性回肠炎；白细胞减少症；传染性单核细胞增多症；原发性特发性粘液水肿；肾病；症状性眼炎；肉芽肿性睾丸炎；胰腺炎；急性多发性神经病；坏疽性脓皮病；奎尔万甲状腺炎；获得性脾萎缩；非恶性胸腺瘤；白癜风；中毒性休克综合征；食物中毒；包括T细胞浸润的症状；白细胞粘附缺陷症；与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫响应；包括白细胞渗漏的症状；多器官损伤综合征；由抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜抗体病；过敏性神经炎；自身免疫性多腺性内分泌功能不全；原发性粘液水肿；自身免疫性萎缩性胃炎；互换性眼炎；肾病综合征；胰岛炎；多腺性内分泌缺乏；I型多腺性自身免疫综合征(成人发作型特发性甲状旁腺功能减退症：AOIH)；心肌病如扩张型心肌病；获得性大疱性表皮松解症(EBA)；血色素沉着症；心肌炎；肾病综合征；原发性硬化性胆管炎；化脓性或非化脓性鼻窦炎；鼻窦炎；筛窦炎、额窦炎、上颌窦炎或蝶窦炎；与嗜酸性粒细胞有关的疾病，如嗜酸性粒细胞增多症、肺湿性嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性粒细胞增多肌痛综合征、吕弗勒综合征、慢性嗜酸性粒细胞肺炎局限性肺嗜酸性粒细胞增多症、支气管肺曲霉病、曲霉瘤或包括嗜酸性粒细胞的肉芽肿；过敏反应；血清阴性脊柱关节病；多腺体内分泌自身免疫性疾病；硬化症慢性粘膜皮肤腺体病；布鲁顿综合征；婴儿期暂时性低丙种球蛋白血症；维斯科特-奥尔德里奇综合征；共济失调性外周血管舒张综合征；血管舒张；与胶原病相关的自身免疫性疾病、风湿病、神经疾病、淋巴结炎、血压反应降低、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血和血管生成相关疾病；过敏性超敏反应疾病；肾小球性肾炎；再灌注损伤；缺血性再灌注障碍；心肌或其他组织再灌注损伤、淋巴瘤支气管炎；炎性皮肤病；由于急性炎性组分引起的皮肤病；多器官衰竭；大疱病；肾皮质坏死；急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性疾病；眼部和眼眶炎性疾病；粒细胞输注相关综合征；细胞因子诱导的毒性；嗜睡症；急性重度炎症；慢性难治性炎症；肾盂肾炎；动脉增生；消化性溃疡；瓣膜炎；和子宫内膜异位症。
在一些实施方案中，本文提供的抗体可用于治疗与蛋白酶激活受体2(PAR-2)的上调相关的疾病或损伤。在一些实施方案中，本文提供的抗体可用于治疗与PAR-2的上调相关的心血管疾病或损伤。在一些实施方案中，心血管疾病或损伤是心肌梗死。在一些实施方案中，心血管疾病或损伤是动脉粥样硬化。与PAR2的上调相关的疾病的实例提供于例如Heuberger,Dorothea M.和Reto A.Schuepbach.Thrombosis journal 17.1(2019):1-24以及Kagota,Satomi等人BioMed research international vol.2016(2016):3130496中，其各自的相关公开内容以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，本文提供的抗体可用于治疗与炎症相关的癌症。例如，可施用本文提供的抗体用于治疗Car-T疗法后的CRS(细胞因子释放酶综合征)。例如，许多与慢性炎症相关的癌症包括结肠直肠癌、肺癌、间皮瘤、肝癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、卵巢癌/子宫癌、前列腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、唾液腺癌、口腔癌(鳞状)和皮肤癌、何杰金氏病/非何杰金氏淋巴瘤和MALT(粘膜相关淋巴组织)。炎症相关癌症的另外实例提供于CoussensLM和Werb Z.Nature.2002；420(6917):860-867中，其以引用的方式整体并入。
13.炎症和凝血病
炎症引发凝血，降低天然抗凝机制的活性并损害纤维蛋白溶解系统。炎性细胞因子是参与凝血激活的主要介质。急性炎症已显示导致凝血的全身激活。全身性炎症导致凝血激活，这是由于TF介导的凝血酶生成。抗凝级联中的介质(例如血栓调节蛋白)降低对炎症介质的细胞反应性，并促进一些炎症介质的中和。炎症与凝血之间的相互作用详述于Esmon,C.T.British journal of haematology 131.4(2005):417-430中，其以引用的方式整体并入。
凝血病是身体形成凝块的能力受损的疾患。在患者中，它表现为难以控制出血、慢性出血和/或过度出血，尤其是在诸如损伤、手术或分娩的激发后。凝血病是由凝血因子的肝脏合成减少和弥散性血管内凝血病(DIC)的存在引起的，其是凝血因子和血小板的加速消耗过程。在DIC中，存在凝血酶的不受调控的和过度的生成以及由此导致的凝血因子(例如，纤维蛋白原和因子VIII)的消耗。研究表明，炎症激活与微血管血栓形成共同导致患有严重感染和DIC的患者的多器官功能衰竭。(参见Levi,M.等人,Cardiovascular research60.1(2003):26-39中，其以引用的方式整体并入)。
如本文所用，术语“凝血病”是指出血倾向增加，其可归因于正常凝血级联的任何促凝血组分的任何定性或定量缺乏，或纤维蛋白溶解的任何上调。凝血病可分类为获得性、先天性或医源性。凝血病可通过使用凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(PTT)的测量来诊断和跟踪。在某些实施方案中，本文提供的抗体可用于治疗凝血病(例如，获得性凝血病、先天性凝血病)。可使用本文提供的抗体或ADC治疗的凝血病的实例包括但不限于弥散性血管内凝血病(DIC；消耗性凝血病)、A型血友病、B型血友病、冯维勒布兰德病、特发性血小板减少症、一种或多种接触因子如因子XI、因子XII、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMMK)缺乏症、一种或多种与显著临床出血相关的因子如因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II(低凝血酶原血症)和冯维勒布兰德因子缺乏症、维生素K缺乏症、与纤维蛋白原相关的病症(包括无纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症和高纤维蛋白原血症)、α2-抗纤溶酶缺乏症和大出血，如由肝病、肾病、血小板减少症、血小板功能障碍、血肿、血肿、血肿、血肿创伤、体温过低、月经和妊娠期间的出血引起的出血。在一些实施方案中，NASP用于治疗先天性出血病症，包括A型血友病、B型血友病和冯维勒布兰德病。获得性凝血病症的实例包括因子VIII缺乏症、冯维勒布兰德因子、因子IX、因子V、因子XI、因子XII和因子XIII缺乏，特别是由针对凝血因子的抑制剂或自身免疫响应引起的病症，或由导致凝血因子合成减少的疾病或疾患引起的止血障碍。凝血病和用于评估凝血病的变化(例如由于用抗体治疗)的方法的另外实例提供于美国申请号13/721,802中，其以引用的方式整体并入。
在某些实施方案中，受试者患有凝血病，并且用本文提供的抗体或ADC治疗减轻或改善凝血病的一种或多种症状。
14.炎性细胞因子和趋化因子
在某些实施方案中，在适用于受试者后，本文提供的抗体或ADC降低炎性细胞因子或趋化因子的浓度。炎性细胞因子或促炎细胞因子是从免疫细胞(例如，辅助T细胞(Th)、巨噬细胞)分泌并促进炎症的信号传导分子(细胞因子)类型。炎性趋化因子是小的细胞因子或信号传导蛋白，其主要作为白细胞的化学引诱物，从血液中募集单核细胞、嗜中性粒细胞和其他效应细胞到感染或组织损伤的部位。它们可分类为四个主要亚家族：CXC、CC、CX3C和XC，它们全部都通过选择性结合至位于靶细胞表面的趋化因子受体而具有生物活性。
在某些实施方案中，在施用本文提供的抗体或ADC后，所述抗体或ADC导致炎性细胞因子和趋化因子相对于基线水平或不同的抗炎剂减少，其中炎性细胞因子和趋化因子是以下中的一种或多种：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、GM-CSF、TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL19、CCL20、CCL25、CXCL1、CXCL2和CXCL10。
IL-1α(白细胞介素1α)是白细胞介素1细胞因子家族的成员。它是参与多种免疫响应、炎症过程和造血的多效细胞因子。IL-1α由单核细胞和巨噬细胞作为原蛋白产生，其经蛋白水解加工并响应于细胞损伤而释放，并且因此诱导细胞凋亡。
IL-1β(白细胞介素1β)是白细胞介素1细胞因子家族的成员，并且由激活的巨噬细胞作为原蛋白产生，其通过半胱天冬酶1(CASP1/ICE)蛋白水解加工为其活性形式。IL-1β是炎性响应的重要介质，并且参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。发现中枢神经系统(CNS)中这种细胞因子对环氧合酶-2(PTGS2/COX2)的诱导促成炎性疼痛超敏反应。
IL-2(白细胞介素2)是对T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖重要的细胞因子。IL-2是对微生物感染的免疫响应的一部分，并且区分外来(“非自身”)和“自身”。在T细胞成熟的胸腺中，它通过促进某些未成熟T细胞分化为调控性T细胞来防止T细胞对健康细胞的破坏而预防自身免疫性疾病。在小鼠中靶向破坏类似基因导致溃疡性结肠炎样疾病，这表明此基因在对抗原刺激的免疫响应中发挥重要作用。
IL-4(白细胞介素4)是由激活的T细胞产生的多效细胞因子。所述细胞因子的作用之一是刺激激活的B细胞和T细胞增殖，以及B细胞分化为浆细胞。血管外组织中IL-4的存在促进巨噬细胞至M2细胞中的替代激活并抑制巨噬细胞至M1细胞中的经典激活。
IL-5(白细胞介素5)是充当B细胞和嗜酸性粒细胞两者的生长和分化因子的细胞因子，并且其在调控嗜酸性粒细胞形成、成熟、募集和存活中起主要作用。IL-5升高与嗜酸性粒细胞依赖性炎性疾病的发病机制相关。(参见Takatsu K.,Proc Jpn Acad Ser B PhysBiol Sci.2011；87(8):463-485，其以引用的方式整体并入)。
IL-6(白细胞介素6)是在炎症和B细胞成熟中起重要作用的细胞因子。它是能够诱导患有自身免疫性疾病或感染的患者的发热的内源性热原。所述蛋白质主要在急性和慢性炎症部位产生，在所述部位中其分泌到血清中并通过白细胞介素6受体α诱导转录炎性响应。
IL-8(白细胞介素8、CXCL8或C-X-C基序趋化因子配体8)是趋化因子-CXC趋化因子家族的成员-并且是炎性响应的主要介质和有效的血管生成因子。其主要由嗜中性粒细胞分泌，其中其通过将嗜中性粒细胞引导至感染部位而充当趋化因子。
IL-10(白细胞介素10)是主要由单核细胞产生的细胞因子。其在免疫调控和炎症中具有多效性作用。其下调巨噬细胞上Th1细胞因子、MHC II类Ag和共刺激分子的表达。它还增强B细胞存活、增殖和抗体产生。它也阻断NF-κB活性，并且参与JAK-STAT信号传导途径的调控。小鼠的基因敲除研究表明，这种细胞因子在肠道中作为必需免疫调控剂的功能。(参见Schreiber,S.等人,Gastroenterology108.5(1995):1434-1444中，其以引用的方式整体并入)。
IFNγ(干扰素γ)是作为II型干扰素类的成员的可溶性细胞因子。它是与触发对病毒和微生物感染的细胞反应的干扰素γ受体结合的同二聚体。编码IFNγ的基因中的突变与对致病性感染和几种自身免疫性疾病的易感性增加相关。
GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的细胞因子。它是刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞的单体糖蛋白。它还能增强嗜中性粒细胞迁移。它被认为是当被阻断或抑制时减轻炎症的靶标。
TNFα(肿瘤坏死因子)是多功能促炎性细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族。它可结合至其受体TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSF1B/TNFBR并且因此通过所述受体发挥作用。TNFα参与多种生物学过程的调控，包括细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢和凝血。
CCL2(C-C基序趋化因子配体2)是特征在于两个相邻的半胱氨酸残基的CC趋化因子家族的成员。CCL2对单核细胞和嗜碱性粒细胞显示趋化活性，但对嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞不显示趋化活性。牵涉于以单核细胞浸润物为特征的疾病的发病机制种，如银屑病、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化。
CCL3(C-C基序趋化因子配体3或巨噬细胞炎性蛋白1-α)是CC趋化因子家族的成员。它通过与受体CCR1、CCR4和CCR5结合在炎性响应中发挥作用。它是巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的化学引诱物。
CCL4(C-C基序趋化因子配体4)是由嗜中性粒细胞、单核细胞、B细胞、T细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞分泌的丝裂原诱导型单核因子，并且是由CD8+T细胞产生的主要HIV抑制因子之一。所编码的蛋白质是分泌性的，并且具有化学增活和炎症功能。
CCL5(C-C基序趋化因子配体5)是特征在于两个相邻的半胱氨酸残基的CC趋化因子家族的成员。这种趋化因子充当血液单核细胞、记忆性T辅助细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱物。它引起从嗜碱性粒细胞释放组胺并激活嗜酸性粒细胞。这种细胞因子是CD8+细胞产生的主要HIV抑制因子之一。
CCL19(C-C基序趋化因子配体19)是特征在于两个相邻的半胱氨酸残基的CC趋化因子家族的成员。它在正常淋巴细胞再循环和归巢中起作用。它还在胸腺中T细胞的运输以及T细胞和B细胞迁移至次级淋巴器官中发挥重要作用。
CCL20(C-C基序趋化因子配体20)是特征在于两个相邻的半胱氨酸残基的CC趋化因子家族的成员。它显示对淋巴细胞的趋化活性并且能够抑制骨髓祖细胞的增殖。
CCL25(C-C基序趋化因子配体25)是对树突细胞、胸腺细胞和激活的巨噬细胞显示趋化活性、但对外周血淋巴细胞和嗜中性粒细胞无活性的细胞因子。
CXCL1(C-X-C基序趋化因子配体1)是通过G蛋白偶联受体CXC受体2传递信号的趋化因子CXC亚家族的成员。CXCL1由巨噬细胞、嗜中性粒细胞和上皮细胞表达，并且具有嗜中性粒细胞趋化活性。这种蛋白质的异常表达与某些肿瘤的生长和进展相关。
CXCL2(C-X-C基序趋化因子配体2或巨噬细胞炎性蛋白2-α)是在炎症部位表达的CXC亚家族中的趋化因子。它由单核细胞和巨噬细胞分泌并对多形核白细胞和造血干细胞具有趋化性。
CXCL10(C-X-C基序趋化因子配体10)是CXC亚家族中的趋化因子。它是受体CXCR3的配体。这种蛋白质与CXCR3的结合导致多效性效应，包括单核细胞的刺激、自然杀伤细胞和T细胞迁移以及粘附分子表达的调节。
炎性细胞因子和趋化因子的非限制性实例提供于Turner,M.D.等人Biochimicaet Biophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research1843.11(2014):2563-2582中，其以引用的方式整体并入。
本文所述的炎性细胞因子和趋化因子可例如使用免疫组织化学、ELISA、MSD-ECLA、Olink板(例如定制Olink板；Olink Proteomics,Uppsala,Sweden)或Luminex多重测定。或者，可使用RT-PCR测量血液样品中炎性细胞因子的表达水平。
15.用于治疗炎性疾病的比较疗法
本公开的抗体和ADC可用于治疗炎性疾病。在某些实施方案中，与比较疗法、其他抗炎治疗剂(也称为抗炎剂)相比，本文提供的抗体和ADC更大程度地减轻或减少炎性疾病的症状或指标。这些抗炎剂是已知的或被指示用于治疗本文所考虑的炎性疾病的替代疗法。例如，在某些实施方案中，比较抗炎剂选自以下中的任一种：非类固醇抗炎药物(NSAID)、类固醇抗炎药物、β-激动剂、抗胆碱能剂、抗组胺药和甲基黄嘌呤。在某些实施方案中，比较抗炎剂是IL-6抑制剂(可溶性IL-6和IL-6R)、GM-CSF抑制剂、TNFα抑制剂、抗IL-1α、地塞米松、趋化因子和趋化因子受体拮抗剂或JAK抑制剂。在某些实施方案中，比较抗炎剂是环孢菌素。
由于IL-6在炎症和自身免疫性疾病中的作用(上文所论述)，所以IL-6被认为是自身免疫性疾病的可行靶标。IL-6抑制剂的非限制性实例包括：抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6变体、IL-6受体变体、IL-6或IL-6受体的可溶性肽和部分肽以及显示类似活性的低分子量化合物和质子(例如，C326 Avimer(Nature Biotechnology(2005)23:1556-61，其以引用的方式整体并入))。在患有类风湿性关节炎(RA)的患者的滑膜和血清中存在高水平的IL-6。最近的研究显示用IL-6抑制剂治疗RA具有显著疗效。(参见HenniganS.,and Kavanaugh A.Ther Clin Risk Manag.2008；4(4):767-775，其以引用的方式整体并入)。可用的IL-6抑制剂药物的实例包括托珠单抗(RoActemra，Roche)和萨瑞鲁单抗(Kevzara，Sanofi)。
托珠单抗是具有以下轻链和重链序列的重组人源化单克隆抗体IL-6受体抑制剂：
托珠单抗轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:930)
托珠单抗重链：
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:931)
萨瑞鲁单抗是可与膜结合型和可溶性白细胞介素6(IL-6)受体结合的完全人抗IL-6R单克隆IgG1抗体。其具有以下轻链和重链序列：
萨瑞鲁单抗轻链：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQANSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:932)
萨瑞鲁单抗重链：
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASRFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAENSLFLQMNGLRAEDTALYYCAKGRDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:933)
由于GM-CSF的促炎性功能，已经开发了靶向并抑制细胞因子的疗法。靶向GM-CSF的抗体、抗体片段和其他GM-CSF拮抗剂的非限制性实例提供于美国申请号16/442,779和11/944,162中，其各自以引用的方式整体并入。
TNFα抑制剂是干扰TNFα活性的剂(如上所述)。它们包括但不限于本文所述的每种抗TNFα人抗体和抗体部分以及美国专利号6,090,382；6,258,562；6,509,015和美国专利申请号09/801,185(现在美国专利号7,223,394)和10/302,356中描述的那些，其各自以引用的方式整体并入。在一个实施方案中，用于本发明的TNFα抑制剂是抗TNFα抗体或其片段，包括英夫利昔单抗(
Figure BDA0004110303870001531
Johnson and Johnson；描述于以引用的方式并入本文的美国专利号5,656,272中)、CDP571(人源化单克隆抗TNF-αIgG4抗体)、CDP 870(人源化单克隆抗TNF-α抗体片段)、抗TNF dAb(Peptech)、CNTO 148(戈利木单抗或Simponi；Medarex andCentocor，参见以引用的方式整体并入的国际申请号PCT/US2001/024785中)和阿达木单抗(/>
Figure BDA0004110303870001532
Abbott Laboratories，人抗-TNF mAb，在以引用的方式整体并入的美国专利号6,090,382中描述为D2E7)。可用于本发明中的另外TNF抗体描述于美国专利号6,593,458；6,498,237；6,451,983；和6,448,380中，其各自以引用的方式整体并入。在另一个实施方案中，TNFα抑制剂是TNF融合蛋白，例如，依那西普(/>
Figure BDA0004110303870001533
Amgen；描述于以引用的方式整体并入的国际申请号PCT/US1990/004001中)。在另一个实施方案中，TNFα抑制剂是重组TNF结合蛋白(r-TBP-I)(Serono)。TNFα抑制剂的另一个实例是培戈-塞妥珠单抗(Cimzia)。
培戈-塞妥珠单抗是针对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的聚乙二醇化单克隆抗体。重链和轻链的示例性序列在下文提供：
培戈-塞妥珠单抗轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASFLYSGVPYRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:934)
培戈-塞妥珠单抗重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYVFTDYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYIGEPIYADSVKGRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYRSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCAA(SEQ ID NO:935)
IL-1α抑制剂干扰IL-1α的活性(如上所述)。IL-1α抑制剂的非限制性实例包括贝迈奇单抗(MABp1或Xilonix)和利那西普。
贝迈奇单抗(MABp1或Xilonix)是靶向白细胞介素1α的IgG1k同种型的人单克隆抗体。贝迈奇单抗重链和轻链的示例性序列在下文提供：
贝迈奇单抗重链：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFTFSMFGVHWVRQAPGKGLEWVAAVSYDGSNKYYAESVKGRFTISRDNSKNILFLQMDSLRLEDTAVYYCARGRPKVVIPAPLAHWGQGTLVTFSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:936)
贝迈奇单抗轻链：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASNLETGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSSFLLSFGGGTKVEHKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:937)
利那西普是充当白细胞介素1抑制剂的二聚体融合蛋白并且用于治疗CAPS，也称为冷吡啉相关周期性综合征，包括家族冷自主炎症综合征(FCAS)和穆-韦二氏综合征(MWS)。IL-1α是其靶标之一。利那西普的示例性序列在下文提供：
SERCDDWGLDTMRQIQVFEDEPARIKCPLFEHFLKFNYSTAHSAGLTLIWYWTRQDRDLEEPINFRLPENRISKEKDVLWFRPTLLNDTGNYTCMLRNTTYCSKVAFPLEVVQKDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVVGSPKNAVPPVIHSPNDHVVYEKEPGEELLIPCTVYFSFLMDSRNEVWWTIDGKKPDDITIDVTINESISHSRTEDETRTQILSIKKVTSEDLKRSYVCHARSAKGEVAKAAKVKQKVPAPRYTVEKCKEREEKIILVSSANEIDVRPCPLNPNEHKGTITWYKDDSKTPVSTEQASRIHQHKEKLWFVPAKVEDSGHYYCVVRNSSYCLRIKISAKFVENEPNLCYNAQAIFKQKLPVAGDGGLVCPYMEFFKNENNELPKLQWYKDCKPLLLDNIHFSGVKDRLIVMNVAEKHRGNYTCHASYTYLGKQYPITRVIEFITLEENKPTRPVIVSPANETMEVDLGSQIQLICNVTGQLSDIAYWKWNGSVIDEDDPVLGEDYYSVENPANKRRSTLITVLNISEIESRFYKHPFTCFAKNTHGIDAAYIQLIYPVTNSGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:938)
地塞米松或MK-125是在位置9氟化的皮质类固醇，用于治疗内分泌、风湿、胶原、皮肤、过敏、眼科、胃肠、呼吸、血液、肿瘤、水肿和其他疾患。地塞米松的示例性结构在下文提供：
Figure BDA0004110303870001561
如本文所用，术语“趋化因子拮抗剂”和“趋化因子受体拮抗剂”是指抑制、减少、消除或阻断趋化因子与一种或多种其同源受体结合的药物或分子。趋化因子拮抗剂和趋化因子受体拮抗剂的非限制性实例提供于美国申请号15/759,886和10/996,353中所述，其各自以引用的方式整体并入。
JAK抑制剂通过抑制一种或多种Janus激酶家族的酶(JAK1、JAK2、JAK3、TYK2)的活性、从而干扰JAK-STAT信号传导途径而起作用。Janus激酶(JAK)家族在参与免疫响应的细胞的增殖和作用的细胞因子依赖性调控中起重要作用。JAK抑制剂的非限制性实例提供于美国申请号12/401,348和国际申请号PCT/US2017/025117中，其各自以引用的方式整体并入。
AZD1480是JAK2激酶的强效三磷酸腺苷竞争性小分子抑制剂。它已用于研究实体恶性肿瘤、真性红细胞增多症后、原发性骨髓纤维化(PMF)和原发性血小板增多症骨髓纤维化的治疗的测试中。它已显示抑制人多发性骨髓瘤细胞的生长、存活以及FGFR3和STAT3信号传导和下游靶标(包括细胞周期蛋白D2)。(参见Scuto,Anna等人Leukemia 25.3(2011):538-550中，其以引用的方式整体并入)。AZD1480的示例性结构在下文提供：
Figure BDA0004110303870001571
环孢菌素(CsA)是因其预防器官移植排斥和治疗各种炎性和自身免疫性疾患的免疫调节性质而闻名的钙调磷酸酶抑制剂。环孢菌素的示例性结构在下文提供：
Figure BDA0004110303870001572
抗炎剂的非限制性实例包括非类固醇抗炎药物(NSAID)、类固醇抗炎药物、β-激动剂、抗胆碱能剂、抗组胺药(例如，乙醇胺、乙二胺、哌嗪和吩噻嗪)和甲基黄嘌呤。NSAID的实例包括但不限于阿司匹林、布洛芬、水杨酸盐、对乙酰氨基酚、塞来昔布、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、吲哚美辛、酮咯酸、奥沙普秦、纳布孟酮(nabumentone)、舒林酸、托美丁、罗非考昔、萘普生、酮洛芬和萘丁美酮。此类NSAID通过抑制环氧合酶(例如，COX-1和/或COX-2)而起作用。类固醇抗炎药的实例包括但不限于糖皮质激素、地塞米松、可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、去炎松、柳氮磺胺吡啶和类花生酸如前列腺素、血栓烷和白三烯。
16.组合疗法
在一些实施方案中，本文提供的抗体或ADC与至少一种额外治疗剂一起施用。任何适合的额外治疗剂都可与本文提供的抗体或ADC一起施用。在一些方面，额外治疗剂选自放射、细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞生长抑制剂、抗激素剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、抗炎剂、抗血管生成剂以及它们的组合。
额外治疗剂可通过任何合适的方式施用。在一些实施方案中，本文提供的抗体或ADC和额外治疗剂包含在同一药物组合物中。在一些实施方案中，本文提供的抗体或ADC和额外治疗剂包含在不同药物组合物中。
在本文提供的抗体或ADC和额外治疗剂包含在不同药物组合物中的实施方案中，所述抗体或ADC的施用可发生在所述额外治疗剂的施用之前、同时和/或之后。
17.诊断方法
还提供了用于检测来自受试者的细胞上TF的存在的方法。此类方法可用于例如预测和评估对用本文提供的抗体或ADC治疗的反应性。
在一些实施方案中，所述方法可用于检测患有或疑似患有炎性疾病的受试者中的TF。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)接收来自受试者的样品；以及(b)通过使所述样品与本文提供的抗体接触来检测样品中TF的存在或水平。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向受试者施用本文提供的抗体；以及(b)检测所述受试者中TF的存在或水平。在一些实施方案中，炎性疾病是结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸道合胞病毒(RSV)中的任一种。在一些实施方案中，炎性疾病涉及血管炎症。
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向受试者施用本文提供的ADC；以及(b)检测所述受试者中TF的存在或水平。在一些实施方案中，炎性疾病是结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸道合胞病毒(RSV)中的任一种。
在一些实施方案中，本文提供的抗体与荧光标记缀合。在一些实施方案中，本文提供的抗体与放射性标记缀合。在一些实施方案中，本文提供的抗体与酶标记缀合。
在一些实施方案中，本文提供的ADC包含荧光标记。在一些实施方案中，本文提供的ADC包含放射性标记。在一些实施方案中，本文提供的ADC包含酶标记。
在一些实施方案中，确定由此类细胞表达的TF的相对量。表达TF的细胞的比例和由此类细胞表达的TF的相对量可通过任何适合方法来确定。在一些实施方案中，使用流式细胞术进行此类测量。在一些实施方案中，使用荧光辅助细胞分选(FACS)进行此种测量。
18.药盒
还提供了包含本文提供的抗体或ADC的药盒。药盒可用于如本文所述治疗、预防和/或诊断疾病或病症。
在一些实施方案中，药盒包括容器和在所述容器上或与所述容器相关联的标记或包装说明书。适合容器包括例如瓶、小瓶、注射器和IV溶液袋。容器可由诸如玻璃或塑料的各种材料形成。容器容纳本身有效或与其他组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断疾病或病症的组合物。容器可具有无菌进入口。例如，如果容器是静脉输液袋或小瓶，则其可能具有可被针头刺穿的端口。组合物中的至少一种活性剂为本文提供的抗体或ADC。标记或包装说明书指示所述组合物用于治疗所选疾患。
在一些实施方案中，药盒包括(a)其中含有第一组合物的第一容器，其中所述第一组合物包含本文提供的抗体或ADC；以及(b)其中含有第二组合物的第二容器，其中所述第二组合物包含另外的治疗剂。本发明的此实施方案中的药盒还可包括包装说明书，其指示所述组合物可用于治疗特定疾患。
替代地或另外地，药盒还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的赋形剂。在一些方面，赋形剂为缓冲液。药盒还可包括在商业和使用者看来所需的其他材料，包括过滤器、针和注射器。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，考虑到本文的一般性描述，可实施各种其他实施方案。
以下是用于进行本发明的特定实施方案的实施例。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如数量、温度等)的准确性，但当然应虑及一些实验误差和偏差。
除非另外指示，否则本发明的实施将采用属于本领域的技能的常规蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。此类技术充分说明于文献中。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,本期新增)；Sambrook,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A和B卷(1992)。
实施例1：TF抗体的生成
将人、食蟹猴和小鼠TF胞外结构域(ECD)片段表达为C端His或Fcγ片段融合体。按照制造商的建议，用编码人、食蟹猴或小鼠TF ECD–His6(TF-His；分别为SEQ ID NO:811、815和819)的pcDNA3.1V5-HisA(ThermoFisher Scientific)或编码人、食蟹猴或小鼠TFECD–Fc(TF-Fc；分别为SEQ ID NO:812、816和820)的pFUSE-hIgG1-Fc(Invivogen,SanDiego,CA,USA)瞬时转染Expi293细胞(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)。对于His标记的蛋白，用330mM氯化钠和13.3mM咪唑对通过离心从细胞中清除的细胞培养上清液进行预处理。使用推荐的程序，分别通过用HisTrap HP和MabSelect SuRe柱(GEHealthcare Bio-Sciences,Marlborough,MA,USA)的亲和色谱法纯化TF-His6和TF-Fc蛋白。通过用MabSelect SuRe柱的亲和色谱法，之后进行尺寸排阻色谱法来对Expi293中表达的FVII-Fc进行纯化。按照建议用15倍摩尔过量的Sulfo-NHS-SS-生物素对TF-His6和TF-Fc蛋白进行生物素化(ThermoFisher Scientific)。通过使用Superdex 200Increase 10/300柱的尺寸排阻色谱法进一步纯化非标记和生物素化的蛋白(GE Healthcare Bio-Sciences)。
如下所述，通过使用生物素化的重组TF蛋白作为筛选抗原的基于AdimabTM酵母的抗体呈递生成针对人TF的人抗体。评估所有针对人TF的抗体与食蟹猴和小鼠TF的交叉反应性。抗体与人、食蟹猴和小鼠TF的结合活性示于表5。
I.用于分离抗TF抗体的文库询问和选择方法
初始文库选择
如前所述，设计、生成和繁殖八个初始人合成酵母文库，每个所述初始人合成酵母文库具有的多样性为约109(参见，例如，WO2009036379；WO2010105256；WO2012009568；Xu等,Protein Eng Des Sel.,2013,26(10):663-70)。使用用于单体人TF选择的八个初始文库进行八次平行选择。
对于前两轮的选择，基本如所述进行利用Miltenyi MACS系统的磁珠分选技术(Siegel等,J Immunol Methods,2004,286(1-2):141-53)。简而言之，将酵母细胞(约1010个细胞/文库)与10nM生物素化的人TF Fc融合抗原在室温下于含0.1％ BSA的FACS洗涤缓冲液PBS中孵育15分钟。用50mL冰冷的洗涤缓冲液洗涤一次后，将细胞沉淀重悬于40mL洗涤缓冲液中，并且将500μl Streptavidin MicroBeads(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany；目录号130-048-101)添加到酵母中，并在4℃下孵育15分钟。接下来，将酵母沉淀，重悬于5mL洗涤缓冲液中，并加载到MACS LS色谱柱(Miltenyi Biotec,BergischGladbach,Germany；目录号130-042-401)上。加载5mL后，用3mL FACS洗涤缓冲液洗涤柱3次。然后将柱从磁场中移出，并用5mL生长培养基洗脱酵母，然后使其生长过夜。
在两轮MACS之后，使用流式细胞术(FACS)进行以下四轮分选。对于第一轮FACS，沉淀约5×107个酵母，用洗涤缓冲液洗涤3次，并且每次在室温下与10nM的每种小鼠和/或食蟹猴TF抗原的生物素化Fc融合蛋白一起孵育10至15min。然后洗涤酵母两次，并且用1:100稀释的LC-FITC(Southern Biotech,Birmingham,Alabama；Cat#2062-02)以及1:500稀释的SA-633(Life Technologies,Grand Island,NY；目录号S21375)或1:50稀释的EA-PE(Sigma-Aldrich,St Louis；目录号E4011)二次试剂在4℃下染色15分钟。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤两次后，将细胞沉淀重悬于0.4mL洗涤缓冲液中，并转移至滤网盖的分选管。使用FACS ARIA分选仪(BD Biosciences)进行分选，并且确定分选门以选择TF结合。来自第一轮FACS的小鼠和食蟹猴选择的群体生长出，并且通过在选择性培养基中进行亚培养扩增。FACS的第二轮、第三轮和第四轮涉及正向分类以丰富TF结合物和/或阴性分类以使用来自CHO细胞的可溶性膜蛋白减少非特异性结合物的数量(参见，例如，WO2014179363和Xu等,PEDS,2013,26(10):663-70)。在分选的最后一轮之后，将酵母涂铺并测序。
初始选择中鉴定出的克隆的亲和力成熟
使用来自初始输出的重链(如上所述)制备轻链多样化文库，然后将其用于其他选择轮次。特别地，从第四次初始选择轮次输出中提取重链可变区，并且将其转化为具有的多样性为1x 106的轻链文库。
选择轮次的第一轮利用Miltenyi MACS珠和10nM生物素化的人TF Fc融合蛋白作为抗原。在选择MACS珠之后，如上所述，使用以10nM的食蟹猴和小鼠Fc融合TF、或人、小鼠或食蟹猴TF的生物素化的Fc融合TF抗原或生物素化的单体HIS形式进行三轮FACS分选。对来自每个FACS选择轮次的单个菌落进行测序。
从初始或轻链多元化选择中识别出的先导物优化
利用三种成熟策略进行先导克隆的优化：CDR-H1和CDR-H2的多样化；CDR-H1和CDR-H2多样性库优化之后的CDR-H3多样化；在选定的CDR-L1和CDR-L2多样性库中的CDR-L3多样化。
CDR-H1和CDR-H2选择：将来自选自初始或轻链多样化程序的克隆中的CDR-H3重新组合到预制文库中，所述文库具有多样性为1x 108的CDR-H1和CDR-H2变体，并且使用生物素化的Fc融合食蟹猴TF抗原、生物素化的食蟹猴HIS-TF抗原和/或生物素化的人HIS-TF进行选择。通过在室温下在平衡条件下使用浓度降低的生物素化HIS-TF抗原(低至1nM)来施加亲和力压力。
CDR-H3/CDR-H1/CDR-H2选择：寡聚物从IDT订购，所述寡聚物包含CDR-H3以及CDR-H3任一侧上的同源侧翼区。CDR-H3中的氨基酸位置通过整个CDR-H3中每个寡聚物的两个位置处的NNK多样性进行变异。使用退火至CDR-H3的侧翼区的引物将CDR-H3寡聚物双链化。重链可变区的剩余FR1至FR3从具有改进的亲和力的抗体池中扩增，所述抗体池是从上面选择的CDR-H1和CDR-H2多样性中分离的。然后，通过将双链CDR-H3寡聚物、FR1至FR3合并的片段以及重链表达载体转化至已经含有亲本轻链的酵母中来创建文库。如在先前的周期中一样，使用FACS分选进行选择。FACS轮次评估了非特异性结合、物种交叉反应性和亲和力压力，并且进行分选以获得具有所需特征的群体。如上关于CDR-H1和CDR-H2选择所述，进行这些选择的亲和力压力。
CDR-L3/CDR-L1/CDR-L2选择：寡聚物从IDT订购，所述寡核苷酸包含CDR-L3以及CDR-L3任一侧上的同源侧翼区。CDR-L3中的氨基酸位置通过整个CDR-L3中每个寡聚物的一个位置处的NNK多样性进行变异。使用退火至CDR-L3的侧翼区的引物将CDR-L3寡聚物双链化。轻链可变区的剩余FR1至FR3从具有改进的亲和力的抗体池中扩增，所述抗体池是从上面选择的CDR-L1和CDR-L2多样性中分离的。然后，通过将双链CDR-L3寡聚物、FR1至FR3合并的片段以及轻链表达载体转化至已经含有亲本重链的酵母中来创建文库。如在先前的循环中一样，使用FACS分选进行选择。FACS轮次评估了非特异性结合、物种交叉反应性和亲和力压力，并且进行分选以获得具有所需特征的群体。亲和力压力包括滴定以及将亲本Fab掺入到抗原预复合中。
II.IgG和Fab的生产和纯化
为了产生足够量的所选抗体以进行进一步表征，使酵母克隆生长到饱和，然后在30℃下振荡诱导48h。诱导后，将酵母细胞沉淀，并且收集上清液以用于纯化。使用ProteinA柱纯化IgG，并且用pH 2.0的乙酸洗脱。通过木瓜蛋白酶消化生成Fab片段，并且通过CaptureSelect IgG-CH1亲和基质(LifeTechnologies,目录号1943200250)进行纯化。
实施例2:DSS结肠炎模型中抗TF抗体的影响
进行了体内研究以确定抗TF抗体(例如，43D8)对结肠炎模型中的炎症终点的影响。43D8克隆在本实施例和以下实施例中用作本文所述的其他抗TF抗体的替代物，因为它与小鼠TF交叉反应并以高亲和力结合至小鼠TF。参见例如，表5。
在结肠炎模型中，葡聚糖硫酸钠(DSS)的施用由于对结肠上皮细胞的毒性而引起结肠炎样病理，其导致粘膜功能受损和嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的浸润。它导致上皮屏障功能丧失、促炎性细胞因子和趋化因子分泌以及具有细胞毒性潜力的细胞(诸如嗜中性粒细胞和炎性巨噬细胞)流入。它在本领域中不被认为是T细胞介导的过程。
在研究的第0天，8-12周龄雄性C57BL/6小鼠随意接受无菌水(第1组，n＝5)或随意接受溶解于无菌水中的2.5％(w/v)DSS(第2-5组，n＝10只小鼠/组)。在第0天和第4天，来自第2、4和5组的小鼠接受了以下剂量(静脉内途径)：
●第2组：媒介物(PBS)
●第4组：3mg/kg的测试品
●第5组：10mg/kg的测试品
测试品是抗TF抗体43D8。
同样从第0天开始至第10天，每日一次通过口服管饲80mg/kg(Neoral)的阳性对照环孢菌素(CsA)治疗第3组中的小鼠。在第8天，所有动物在实验的剩余时间接受无菌水，并在第10天安乐死。
在整个研究期间，每天进行临床观察一次。每天测量并记录体重(从第0天至第10天)。还使用图2中所示的评分系统每天目视评价身体状况。定性测定粪便稠度，并使用潜血粪便出血测试每天测量粪便中的血液。表50、60和61说明用于评估粪便稠度、便血(潜血)和体重相对于基线水平(第0天)的变化的评分系统。将粪便稠度评分、便血评分和体重评分组合以提供每名受试者在测量时的疾病活动指数。表62显示确定疾病活动指数的复合评分系统。
表50：粪便稠度评分
评分 0 1 2 3
观察结果 正常 潮湿/粘性粪便 软便 腹泻
表60：便血评分
Figure BDA0004110303870001661
表61：体重评分
Figure BDA0004110303870001662
表62：疾病活动指数(DAI)评分，其是粪便稠度评分+便血评分+体重评分的组合。
评分 粪便稠度评分 便血评分 体重减轻
0 正常 阴性隐血测试，无血液 0％
1 潮湿/粘性粪便 在＞30秒内阳性隐血测试 1％-5％
2 软便 在＜30秒内阳性隐血测试 6％-10％体重减轻
3 腹泻 载片上可观察到肉眼血 11％-15％体重减轻
4 N/A N/A 16％或更高
安乐死后，对动物进行测量(测定长度)和称重。计算每只动物的体重/长度比。对动物进行解剖并测定其脾的重量。对于每只动物，将结肠“瑞士卷化”，并置于10％中性缓冲福尔马林(NBF)中持续24小时，然后置于70％乙醇中。将固定的结肠样品在内部加工。将样品包埋在石蜡中，切成5微米的切片，并且用苏木精和伊红(H&E)对切片进行染色用于组织学分析。
结果显示对于用CsA治疗的第3组动物，到第4天的显著和早期体重减轻(相对于基线的约20％体重减轻)。对于前5天，对于媒介物对照组(第2组)以及第4组和第5组，体重减轻相当。然后，在第5天与第10天之间，与第4组和第5组的动物相比，媒介物对照动物的体重减轻更显著。结果表明，与比较药物相比，用抗TF抗体43D8治疗导致相对于基线水平更少的体重减轻。它们还表明，用抗TF抗体治疗导致的体重减轻少于在不存在治疗的情况下将经历的体重减轻(图3)。
还使用上述指标分析了疾病活动性。第5组(接受10mg/kg的43D8)中的动物具有与媒介物对照中的动物相比更低(更接近正常)的疾病活动性评分(图4)。在媒介物对照组或接受3mg/kg的43D8的组中未观察到对疾病活动性的影响。总的来说，这些结果表明，与在不存在治疗的情况下相比，用抗TF抗体治疗导致更正常的粪便稠度、更少的可检测血液和更少的体重减轻。
体况的结果揭示直到第7天研究中小鼠的身体状况没有变化，此后第2组CsA小鼠经历最显著的身体状况恶化。在整个研究期间，仅初始组的身体状况维持在3(正常，健康状态良好)。第5组经历了最低的身体状况评分降低，其次是第4组(图5)。结果表明，相对于比较治疗和相对于不治疗将导致的身体状况，用抗TF抗体治疗改善身体状况。
来自测量脾重量的结果显示相对于媒介物对照，43D8治疗组中的脾重量的剂量依赖性降低(图6)。那些结果表明，用抗TF抗体治疗可逆转或减轻炎性疾病中常见的脾肿大。所述结果还表明抗TF抗体的全身抗炎作用。
实施例3：DSS结肠炎模型中抗TF抗体的影响
进行了另一项体内研究以确定抗TF抗体(例如，43D8)对结肠炎模型中的炎症终点的影响。研究方法与实施例2中概述的那些相同，然而，改变了用于诱导结肠炎的DSS的浓度以及研究和对照的终日期。
简言之，在研究第0天，8-12周龄雄性C57BL/6小鼠随意接受无菌水(第1组，n＝5)或随意接受溶解于无菌水中的3％ DSS(第2-5组，n＝10只小鼠/组)。在第0天和第4天，来自第4、5和6组的小鼠接受两剂同种型43D8 mAb或抗小鼠Il-6mAb。同样从第0天开始至第10天，每日一次通过口服管饲80mg/kg(Neoral，n＝10)的媒介物或阳性对照环孢菌素(CsA)治疗第2组和第3组中的小鼠。第8天，对所有动物实施安乐死。实验设计显示在表67中，并且时间点和时间表显示在图13中。研究终点是体重、DAI评分、结肠密度(宽度/长度)、脾重量和组织病理学。
表67：用于DSS模型的实验设计
Figure BDA0004110303870001681
*IP＝腹膜内；PO＝口服施用
体重测量值、DAI评分、结肠密度(结肠重量/长度的比率)和脾重量测量值的结果分别在图14、15、16和17中示出。
结果显示，相对于媒介物和同种型对照以及抗IL-6mAb小鼠，第5组小鼠(用43D8mAb治疗)的体重减轻延迟到第5天和随后时间。到第6天，体重减轻的延迟相对于媒介物对照小鼠是高度显著的(图14)。
结果显示，到第3天，DAI评分相对于媒介物对照小鼠的显著改善。到第4天，相对于第6组小鼠(抗IL-6mAB)，第5组小鼠的DAI评分也较低(图15)。
结果显示第5组小鼠的结肠密度相对于媒介物对照小鼠的显著改善。到研究结束时，第5组小鼠也表现出比第6组小鼠更低的结肠密度(图16)。
在研究结束时，未观察到组之间脾重量的显著差异(图17)。
实施例4：TNBS-结肠炎模型中抗TF抗体的影响
进行了体内研究以确定抗TF抗体(例如，43D8)对TNBS-结肠炎模型中的炎症终点的影响。
在此结肠炎模型中，施用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)引起结肠炎样病理。一般而言，TNBS模型的特征在于结肠中比DSS结肠炎模型更多的局灶性损伤。其导致主要由TH1介导的免疫响应驱动并以固有层浸润
Figure BDA0004110303870001691
T细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞为特征的透壁性结肠炎。抗IFNg、抗IL-12p40抗体在TNBS模型中显示治疗作用。
用于制备TNBS诱导的结肠炎模型的方法是本领域普通技术人员已知的。参见例如，Antoniou,Efstathios等人Annals of medicine and surgery 11(2016):9-15，其相关公开内容以引用的方式并入本文。
在TNBS结肠炎模型中评价抗TF的作用，其中动物接受2％TNBS结肠内注射以诱导结肠炎(n＝10只小鼠/组)。每天进行临床观察、体重和DAI评分。将动物用抗TF抗体(例如，43D8)、媒介物对照或同种型对照进行治疗。另一组接受美沙拉明作为阳性对照。施用抗TF抗体(例如，43D8)显示相对于对照无影响。在TNBS模型中施用抗TF抗体可能不导致任何作用，因为TNBS模型是T细胞主导的模型。本领域已知TF在激活的骨髓细胞上表达，但不在T细胞上表达。
实施例5：抗TF抗体在急性肺损伤模型中的影响
进行了体内研究以评价抗TF抗体(例如，43D8)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤模型中的炎症终点的影响。急性肺损伤(ALI)及其最严重的表现即急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种由急性低氧性呼吸衰竭、与水肿一致的双侧肺浸润物和正常心脏充盈压力定义的临床综合征。
对于此研究，将48只雄性BALB/c小鼠随机且前瞻性地分配至五个组：一组6只(n＝6)、一组12只(n＝12)和三组10只(n＝10只/组)动物。在第0天，在LPS施用前60分钟根据表63对第2-5组动物中的动物进行给药。在第1天(LPS后24小时)再次向第3组动物施用地塞米松(3mg/kg)(阳性对照)。使用异氟烷麻醉所有动物，并且一旦每只动物对捏脚趾无响应，则通过鼻内施用10μg的25μl中的鼻内LPS(IN)(仅第2-5组)或盐水作为对照(第1组)来激发动物。然后将动物释放至恢复笼中，直至它们醒来。
表63：用于ALI研究的实验设计。TA表示测试品(43D8抗体)
Figure BDA0004110303870001701
每天对所有动物进行称重并评价呼吸窘迫(定义为呼吸速率增加和/或明显的呼吸努力)。在观察的2小时内，对患有严重呼吸窘迫的动物或体重减轻超过其起始总体重20％的动物实施安乐死。
LPS激发后48小时，将所有动物用过剂量甲苯噻嗪处死，并且仅对右肺进行支气管肺泡灌洗(BAL)(通过结扎左肺)，以进行总细胞计数和分类细胞计数以及通过Luminex进行总蛋白质定量和细胞因子定量。然后称重肺(总肺重量和右肺重量)。将右肺冷冻在液氮中并储存在-80℃下。用10％NBF吹入肺的左叶，在10％NBF中固定24小时，然后转换至PBS，并且随后加工以用于组织学。将福尔马林固定的肺包埋在石蜡中，切成5微米的切片，并且用苏木精和伊红(H&E)对载片进行染色。所有载片均由委员会认证的兽医病理学家评价，所述病理学家使用评分系统来评价肺损伤和炎症的程度。表64和表65显示用于白细胞浸润的评分系统。
表64：ALI模型中间质或肺泡嗜中性粒细胞浸润的组织病理学评分
评分 间质或肺泡嗜中性粒细胞浸润
0 不存在
1 极少(＜10％的样品受影响)
2 轻度(10％-25％的样品受影响)
3 中度(26％-50％的样品受影响)
4 显著(51％-75％的样品受影响)
5 重度(＞75％的样品受影响)
表65：血管周围/细支气管周围区域中单个核细胞浸润/聚集体形成的组织病理学评分
评分 间质或肺泡嗜中性粒细胞浸润
0 不存在
1 极少(局灶性浸润物或分散浸润细胞)
2 轻度(多灶性浸润物或小聚集体形成)
3 中度(多灶性聚集体形成)
4 显著(大多数血管/细支气管被聚集体包围)
5 重度(所有血管/细支气管被大的且聚结的聚集物包围)
体重结果显示接受1mg/kg 43D8的组中体重减轻最高。到研究结束时，媒介物对照组和第4组(1mg/kg 43D8)具有相当的体重减轻百分比(相对于基线体重减轻约6％)。相比之下，阳性对照组(地塞米松)在研究结束时仅显示出相对于基线约2％的体重减轻。第5组(接受10mg/kg)表现出比媒介物对照更少的体重减轻，但比阳性对照更多的体重减轻(图7)。结果表明，在ALI受试者中，用抗TF抗体(43D8)治疗可导致与在不存在治疗的情况下将经历的更少的体重减轻(对体重减轻的保护作用)。结果还表明抗TF抗体以剂量依赖性方式对抗体重减轻。
来自BAL分类细胞计数的结果揭示，与阳性对照和媒介物对照相比，用抗TF抗体(43D8)处理导致较低总白细胞计数。第4组(1mg/kg 43D8)中的总巨噬细胞计数不显著低于媒介物对照，然而，第5组(10mg/kg 43D8)的总巨噬细胞计数低于媒介物对照(以及阳性对照)。第4组和第5组的总淋巴细胞计数和总嗜中性粒细胞计数低于其各自的媒介物对照，并且其计数的降低是剂量依赖性的。相比之下，第4组和第5组的总嗜酸性粒细胞计数显著高于媒介物对照。总体而言，结果揭示用43D8治疗的组中BAL液中的淋巴细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润物减少，并且所述减少与阳性对照(地塞米松)相当或更好(图8A和8B)。
对于组织病理学分析，第5组(10mg/kg的43D8)表现出相对于媒介物对照，嗜中性粒细胞浸润至间质、肺泡和细支气管中以及单个核细胞浸润至血管周围/细支气管周围组织的轻微减少。第4组(1mg/kg的43D8)与媒介物对照之间在嗜中性粒细胞浸润至间质、肺泡和细支气管中的差异不显著。在减少嗜中性粒细胞浸润至间质、肺泡和细支气管以及单核细胞浸润至血管周围/细支气管周围组织中方面，没有一个测试品组与阳性对照(地塞米松)一样有效(图9)。
炎性细胞因子的结果显示在图10A和10B中。10mg/kg的43D8组表现出相对于媒介物对照，细胞因子浓度的显著降低。在所有情况下，除IL-6和TNFα外，10mg/kg 43D8组表现出相对于阳性对照(地塞米松)，炎性细胞因子水平显著降低。这些结果也表明作为用抗TF抗体治疗的结果，局部炎症减少。
实施例6：RSV模型中抗TF抗体的影响
进行了体内研究以评价抗TF抗体(例如，43D8)对呼吸道合胞病毒(RSV)模型中BAL分类细胞计数的影响。
向在研究开始时约6-8周龄的雌性BALB/c小鼠施用50μL的8.5×105滴度RSV-A2储液，所述储液最初通过鼻内接种从ATCC(VR-1540)获得。第1组接受Hep-2上清液作为模拟对照。所有接种均在动物处于吸入麻醉影响下进行。
在RSV-A2感染后2小时，经由静脉内(IV)或经口(PO)途径以被配制为递送表66中的量的体积施用分子(n＝10/组)。AZD1480(JAK抑制剂充当阳性对照)。在感染后5天，从每只动物收获肺并称重。然后将肺用汉克氏缓冲液和支气管肺泡灌洗液(BALF)冲洗，从每只动物收获，并对总BAL白细胞进行计数。将BALF分成3个等分部分并储存在-80℃下。将右肺和左肺二等分、称重、单独速冻并储存在-80℃下。储存右肺用于病毒定量。
表66：用于RSV模型研究的实验设计
Figure BDA0004110303870001731
将载片从剩余BAL白细胞制备，固定并用May Geimsa染色剂染色，并手动记录分类计数。使用来自Meso Scale Discovery(MSD,Rockville,Maryland)的小鼠细胞因子组评价等分BAL液。
结果显示相对于媒介物对照并且相对于阳性对照(AZD1480)，第4组(10mg/kg的43D8)的平均白细胞计数的显著降低(图11)。如图12所示，第4组表现出平均巨噬细胞BAL计数、平均嗜中性粒细胞BAL计数和平均淋巴细胞BAL计数的显著降低。结果还揭示对用抗TF抗体治疗的剂量依赖性响应。未观察到单核细胞和嗜酸性粒细胞计数的变化(数据未显示)。总之，这些结果与TF介导的趋化性一致。
实施例7：聚I:C模型中抗TF抗体的影响
进行了体内研究以评价抗TF抗体(例如，43D8)对聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I:C))模型中的炎症终点的影响。聚I:C模型模拟肺对病毒感染的体内响应。在所述模型中，向小鼠施用聚I:C，其是双链(ds)RNA的合成类似物并且是TL3配体。其在体内经常用于研究宿主细胞先天免疫系统对病毒的识别以及随后的细胞因子风暴和炎症。
简言之，在第1、2和3天，通过异氟烷吸入将所有小鼠麻醉。将小鼠保持直立，并且使用移液器将50μL于PBS中的聚(I:C)施用到动物的鼻孔中。在第2天，在第二次鼻内激发后3小时时，将来自选定组的10只小鼠终末麻醉，并进行血液收集和三次连续支气管肺泡灌洗(BAL)收集。在第4天，在最后一次鼻内激发后24小时时，将剩余小鼠终末麻醉，并进行血液采集和连续三次支气管肺泡灌洗(BAL)采集。通过多重电化学发光MSD测定来评估BAL测量值。
用测试品给药：媒介物、同种型对照和抗体(例如，43D8)在第1天在聚:IC注射前2小时腹膜内(IP)注射。
剂量和组提供于表68和69中。
表68：用于第1-4组的研究设计实施例
Figure BDA0004110303870001741
Figure BDA0004110303870001751
表69：43D8的剂量(mg抗体/kg)
组 治疗和测试品 剂量(mg/kg) 收获时间
1 媒介物(初始小鼠) NA 第3天
2 媒介物+聚I：C NA 第2天
3 43D8+聚I：C 10mg/kg 第2天
5 媒介物+聚I：C NA 第3天
6 同种型+聚I：C 10mg/kg 第3天
7 43D8+聚I：C 10mg/kg 第3天
图18A显示从研究第3天起的促炎性细胞因子水平。结果显示，相对于第5组(媒介物+聚I：C对照)和第7组(同种型+聚I：C对照)，在第3天第7组(43D8+聚I：C治疗组)中的GMCSF、VEGF、ILl7F、IL-1β、IL-6、IFNγ和KC促炎标志物的水平的显著降低。
图18B显示了从研究第3天抗炎标志物IL-10和IL28p28的水平。相对于第5组(媒介物+聚I：C对照)和第7组(同种型+聚I：C对照)，在第3天第7组(43D8+聚I：C治疗组)中两种标志物显著增加。
相比之下，第2天的响应幅度较小。
实施例8：COVID模型中抗TF抗体的影响
进行了体内研究以评价抗TF抗体(例如，43D8)在COVID模型中的影响。该模型用于评价抗TF mAb 43D8在SARS-CoV-2鼻内激发后在4-8周龄表达人ACE2的B6.Cg-Tg(K18-ACE2)小鼠(The Jackson Laboratory)的血浆中和肺上的治疗效果。
简言之，根据表70，在研究第1天，通过鼻内接种用SARS-CoV-2的净储液激发第1组至第4组小鼠。在激发前大约2小时(±15分钟)，第1组至第4组中的小鼠接受单剂量的测试品或对照品。在研究第4天，对第1组和第2组中的小鼠实施安乐死以进行样品收集。对研究第8天存活的第3组和第4组中的小鼠实施安乐死以进行样品收集。观察小鼠并记录观察结果，在研究期的持续时间每天至少两次，间隔至少6小时，人道处死当天除外，该天仅进行一次观察。研究前和研究期间每天收集体重。
表70：抗TF-COVID模型研究的实验详情
Figure BDA0004110303870001761
F＝雌性IN＝鼻内IP＝腹膜内M＝雄性
1 12.5μL将被滴入右侧和左侧鼻孔，总体积为25μL。2将以10mL/kg的目标体积递送治疗。
图19显示了研究过程中的体重测量的结果。表71显示了盐水和43D8治疗组的临床观察的结果。
表71：COVID模型中的临床观察结果
盐水 盐水的临床观察结果 43D8 43D8的临床观察结果
2254 弓背，粗糙皮毛 2268 正常至研究结束
2255 在第7天死亡 2269 正常至研究结束
2266 正常至研究结束 2271 正常至研究结束
2267 弓背、嗜睡、呼吸困难 2274 正常至研究结束
2270 在第8天死亡 2275 正常至研究结束
2281 正常至研究结束 2277 嗜睡、呼吸困难
2286 正常至研究结束 2279 正常至研究结束
2288 弓背、呼吸困难 2280 正常至研究结束
2297 正常至研究结束 2283 正常至研究结束
2298 弓背、嗜睡、呼吸减少 2300 正常至研究结束
总体而言，结果显示43D8治疗组的体重减轻延迟。在43D8治疗组中未观察到死亡，而对照组中有2只动物在研究期间死亡。对照组中的大多数动物具有显著临床观察结果，而43D8治疗组中仅1只动物显示疾病体征。
肺组织病理学
为了评价抗TF抗体(例如，43D8)对肺组织病理学的影响，在研究结束时将动物安乐死。在安乐死后，将来自肺的组织样品置于10％中性缓冲福尔马林(NBF)中≥48小时，然后转移至70％乙醇中≥72小时。将样品包埋在石蜡中，切片并用苏木精和伊红(H&E)染色用于组织病理学分析。
病毒滴度测量
为了评价抗TF抗体(例如，43D8)对SARS-CoV-2病毒滴度水平的影响，简言之，在安乐死后从右肺无菌收集约4-5mm3样品并随后保存在RNA中。使用定量实时PCR(qRT-PCR)测定来测量样品中的病毒载量。在研究过程中，还使用qRT-PCR定期分析鼻、咽和直肠样品。用于测量和分析病毒滴度数据的方法是本领域普通技术人员已知的。参见例如，Roberts,Anjeanette等人PLoS pathogens 3.1(2007):e5，其相关公开内容以引用的方式并入本文。
BAL细胞因子/趋化因子测量
为了评价抗TF抗体(例如，43D8)对细胞因子和趋化因子水平的影响，在研究期间终末麻醉的小鼠进行血液收集和支气管肺泡灌洗(BAL)收集。测量促炎性细胞因子(例如，GMCSF、VEGF、IL17F、IL-1β、IL-6、IFNγ、TNF和KC)。抗炎细胞因子(例如，测量IL-10和IL27p28)。
D-二聚体测量
为了评价抗TF抗体(例如，43D8)对D-二聚体水平的影响，收集血液以获得来自治疗组(43D8)和对照(盐水)组的血浆和血清样品。使用ELISA分析血浆和血清样品的D-二聚体。用于测量和分析小鼠模型中d-二聚体水平的方法的实例提供于例如Weiler,Hartmut等人"Characterization of a mouse model for thrombomodulin deficiency."Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology 21.9(2001):1531-1537，其相关公开内容以引用的方式并入本文。
实施例9：抗TF抗体对心肌梗死(MI)恢复的影响
由巨噬细胞表达的PAR2以及TF细胞质结构域对小鼠中心肌梗死(MI)的缺血后恢复具有不利影响。进行了体内研究以评价抗TF抗体(例如，43D8)和TF信号传导阻断对心肌梗死(MI)恢复的影响。用于制备和测试在MI模型中测试终点的方法是本领域普通技术人员已知的。参见例如，Molitor,Michael等人Cardiovascular research 117.1(2021):162-177，其相关公开内容以引用的方式并入本文。
简言之，为了诱导MI，小鼠经历了冠状动脉左前降支的永久结扎。通过高频超声活体内成像监测心脏功能。在诱导MI后，小鼠(8只小鼠/组)在脊柱中接受10mg的43D8抗体/kg或同种型对照。在MI后第1天和第4天施用抗体和对照，并且在第7天通过高频超声活体内成像进行心脏功能评价。使用高频超声活体内成像来测定室壁运动评分指数(梗死面积)、左室射血分数和左心室舒张末期容积。在第7天将小鼠安乐死，并评价梗死心肌中缺血心脏组织的炎性细胞募集。使用荧光激活细胞分选术(FACS)分析梗死心肌组织中的炎性细胞募集。
结果显示在图20-23中。结果揭示，相对于同种型对照，用抗TF抗体治疗的组中梗死面积减小(图20)。MI降低了左心室射血分数，并且结果表明，与同种型对照相比，用抗TF抗体治疗更多地恢复了左心室射血分数。MI显著增加左心室舒张末期容积，并且结果揭示，与同种型对照相比，用抗TF抗体治疗更大地减少左心室舒张末期容积(图21)。结果还显示梗死心肌中炎性细胞浸润的减少(图22和23)。
细胞因子表达和PAR2信号传导
上述结果可以是抗TF抗体中断TF-Par2信号传导的指示。为了评价抗TF抗体对TF-Par2信号传导的影响，使用RT-PCR测量炎性细胞因子表达，并使用ERK1/2磷酸化作为PAR2信号传导的标志物。在第7天和第28天测量炎症终点。
实施例10：胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型中抗TF抗体的影响
进行了体内研究以评价抗TF抗体(例如，43D8)对CAIA模型中的炎症终点的影响。在CAIA模型中，使用针对II型胶原的单克隆抗体诱导关节炎。
简言之，将在研究开始时约21日龄的相同性别的小鼠随机且前瞻性地分配至五个组(n＝10/组)：
·第1组：初始
·第2组：媒介物对照(PBS)
·第3组：测试品(10mg/kg的43D8)
·第4组：阳性对照(地塞米松)
·第5组：抗TNFα
在第0天，通过施用抗II型胶原抗体混合物在第2-5组中诱导疾病。在同一天，第2-5组中的动物接受媒介物、阳性对照或测试品。在第3天，向动物腹膜内(IP)施用LPS。此后，每天检查动物以评估将指示关节炎的活动性变化、体重测量值和身体状况评分，如(图2)所示。
在研究结束时(第12天)对动物实施安乐死。安乐死后，对动物进行测量(测定长度)和称重。计算每只动物的体重/长度比。对动物进行解剖并测定脾的重量。收集滑液样品并使用IHC检查单个核细胞浸润。将来自诱导关节炎部位的组织样品置于10％中性缓冲福尔马林(NBF)中24小时，然后置于70％乙醇中。将样品包埋在石蜡中，切片并用苏木精和伊红(H&E)染色用于组织病理学分析。还观察到诱导关节炎部位的骨的骨侵蚀。在动物中测量的其他终点包括临床关节炎评分、爪垫厚度(例如，其中在爪中诱导关节炎)和一般临床观察结果。(参见例如，MacKenzie JD等人Radiology.2011；259(2):414-420和Jung,EG.等人BMC complementary and alternative medicine 15.1(2015):1-11.中，其各自以引用的方式整体并入)。结果显示相对于对照，针对抗TF抗体(10mg/kg的43D8)的一个或多个测量指标的显著改善。
实施例11：结合亲和力测定
抗TF抗体的动力学测量在Octet QK384(Pall ForteBio,Fremont,CA,USA)或Biacore(GE Healthcare Bio-Sciences)上进行。
大体上如先前所述，进行ForteBio亲和力测量(Estep等,MAbs.2013年3月至4月；5(2):270-8)。简而言之，通过将IgG在线加载到AHC传感器上以进行ForteBio亲和力测量。传感器在测定缓冲液中离线平衡30分钟，然后在线监测60秒以建立基线。将带有负载IgG的传感器暴露于100nM抗原(人、食蟹猴或小鼠TF)3分钟，然后将其转移至测定缓冲液3分钟以进行解离速率测量。另选地，通过将生物素化的TF单体加载到SA传感器上，之后将其暴露于溶液中的100nM抗体Fab来获得结合测量值。使用1:1Langmuir结合模型对动力学数据进行分析和拟合，并且通过将koff除以kon来计算KD。通过基于Octet的实验测量的TF抗体的KD值示于表5。
对于基于Biacore的测量，使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare Bio-Sciences)将抗体共价偶联至CM5或C1芯片。测量抗TF抗体与从25至500nM开始的五点三倍滴定的TF-His之间的缔合300秒。随后，测量抗TF抗体与TF-His之间的解离长达1800秒。使用1:1结合模型对动力学数据进行整体分析和拟合。通过基于Biacore的实验测量的TF抗体的KD值示于表5。
如表5所示，抗体对hTF的亲和力，如KD所指示，在10-7M和10-11M之间。所有抗hTF抗体都与cTF交叉反应。此外，来自第25组和第43组的所有抗hTF抗体均表现出与mTF的结合活性。抗hTF抗体25G、25G1、25G9和43D8与mTF交叉反应。不存在表现出与小鼠TF的结合活性和交叉反应性的其他已知的人或人源化抗hTF单克隆抗体，这指示来自第25组和第43组的抗体与新型TF表位结合。
表5：抗体动力学
Figure BDA0004110303870001811
/>
Figure BDA0004110303870001821
无结合*：无结合至弱结合，无可报告的KD
nd*：未确定
实施例12:基于细胞的结合测定
从美国组织培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)获得具有内源性人TF表达的HCT116细胞，并按建议进行维护。通过用按建议的编码具有C端FLAG标记的全长小鼠TF的pcDNA5/FRT载体(ThermoFisher Scientific)转染Flp-In-CHO细胞来生成表达小鼠TF的Flp-In-CHO细胞。通过在经组织培养处理的96孔板中进行有限稀释来分离小鼠TF阳性CHO克隆。
评估基于细胞的抗体结合，如先前描述于Liao-Chan等,PLoS One,2015,10:e0124708中，其以引用的方式整体并入。将用Cellstripper(Mediatech,Manassas,VA,USA)收集的1.2x105个细胞用十二点1:3稀释滴定的抗人TF IgG1或Fab抗体(在250nM或100nM处开始)在冰上孵育2小时。洗涤2次后，将标记有IgG1或Fab的细胞分别与150nM山羊藻红蛋白(PE)F(ab’)2片段山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)或FITC标记的F(ab’)2片段山羊抗人κ(SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA)在冰上孵育30min。洗涤2次后，用TO-PRO-3碘化物(ThermoFisher Scientific)标记死细胞，并且在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)或Novocyte流式细胞仪(ACEA Biosciences,San Diego,CA,USA)上分析样品。绘制每个稀释度处的中值荧光强度(MFI)，并且使用Prism(GraphPad,La Jolla,CA,USA)中的4参数结合模型得出细胞EC50。抗TF抗体与人TF阳性HCT-116细胞的结合的结果显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。抗TF抗体与表达小鼠TF的CHO细胞的结合的结果显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
所有抗hTF抗体显示在国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中，对人TF阳性HCT-116细胞表现出高亲和力，其中EC50在约687pM至约39pM的范围内。来自第25组和第43组的抗体表现出与表达小鼠TF的CHO细胞的结合，其中EC50在约455nM至约2.9nM的范围内，显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。与小鼠TF的结合活性是(例如，来自第25组和第43组的)抗hTF抗体的独特性质。这对于用小鼠模型进行这些抗体的临床前研究是有利的。在某些实施方案中，对小鼠TF的结合亲和力是用于选择针对炎性疾病、炎症和纤维化的抗体的重要性质。
实施例13:凝血酶生成测定(TGA)
使用由STAGO制造和分配的校准自动血栓图(CAT)仪器进行TGA测定。测试方法设计等效于标准CAT测定的测量，不同之处在于血浆来源为柠檬酸盐/CTI中的NPP。将抗TF抗体在0、10、50和100nM处进行滴定，并且与在补充有100微克/mL玉米胰蛋白酶抑制剂(柠檬酸盐/CTI)的11mM柠檬酸盐中收集的正常混合血浆(NPP)混合。将重新脂化的TF添加到96孔测定板，之后添加抗体/NPP混合物。孵育10分钟后或直接将重新脂化的TF与抗体/NPP合并后，通过添加钙和凝血酶底物来引发凝血酶的生成。使用STAGO软件报告以下参数：峰值IIa(生成的最高凝血酶浓度[nM])；滞后时间(生成IIa的时间)[min])；ETP(内源性凝血酶潜能，曲线下面积)[nM x min])；和ttPeak(到达峰值IIa的时间[min])。还报告了在同一板上，相对于无抗体血浆对照，每种抗体存在下凝血酶生成的峰值百分比(峰值IIa％)和内源性凝血酶潜能百分比(ETP％)。
表6示出选自1F、25A、25A3、25G1、29E、39A、43B1、43D7、43Ea和54E的每种抗体存在下的IIa峰、滞后时间、ETP、ttPeak、IIa峰％和ETP％，其中在添加钙和凝血酶底物之前不进行抗体孵育。表7示出选自1F、25A、25A3、25G1、29E、39A、43B1、43D7、43Ea和54E的每种抗体存在下的峰值IIa、滞后时间、ETP、ttPeak、峰值IIa％和ETP％，其中在添加钙和凝血酶底物之前进行10分钟抗体孵育。在添加钙和凝血酶底物之前不进行抗体孵育情况下抗TF抗体滴定存在下的IIa峰％显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。10分钟在添加钙和凝血酶底物之前进行10分钟抗体孵育情况下抗TF抗体滴定存在下的IIa峰％显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
在来自第25组的抗体(包括25A、25A3和25G1)存在下，峰值IIa％大于90％。在来自第25组的抗体(包括25A、25A3和25G1)存在下，ETP％大于100％。在来自第43组的抗体(包括43B1、43D7和43Ea)存在下，峰值IIa％大于40％。在来自第43组的抗体(包括43B1、43D7和43Ea)存在下，ETP％大于90％。
该数据指示来自第25组和第43组的抗体允许正常凝血酶生成，并因此不是凝血酶生成的抑制剂。
表6：不进行抗体预孵育的凝血酶生成测定
Figure BDA0004110303870001851
*当软件无法计算ETP时，组具有“未发现尾(No Tail Found)”的错误。
表7：进行10分钟抗体预孵育的凝血酶生成测定
Figure BDA0004110303870001861
*当软件无法计算ETP时，组具有“未发现尾(No Tail Found)”的错误。
实施例14：FXa转化测定
为了评价TF:FVIIa在抗TF人抗体的存在下将FX转化为FXa的能力，将5x104个MDA-MB-231细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)涂铺到经组织培养处理的黑色96孔板(Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA)中。在去除细胞培养基并且在含1.5mM CaCl2的HEPES缓冲液中添加最终浓度为200nM的FX后，在37℃下用滴定抗体孵育细胞15min。在复溶具有最终浓度为20nMFVIIa的二元TF:FVIIa复合物后，将细胞在37℃下孵育5min。在猝灭与乙二胺四乙酸(EDTA)的反应后，用50μM SN-7 6-氨基-1-萘磺酰胺基生荧光底物(Haematologic Technologies,Essex Junction,VT,USA)在配备有Umbelliferone 355激发滤光片、Umbelliferone 460发射滤光片和LANCE/DELFIA顶镜的Envision读板仪(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上测量生成的FXa。相对于无抗体对照，抗TF抗体滴定存在下的FXa转化百分比(FXa％)总结于表8中并且在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中对其进行绘图。
在不同浓度的来自第25组和第43组的抗体(包括25A、25A3、25G、25G1、25G5、25G9、43B、43B1、43B7、43D，43D7、43D8、43E和43Ea)存在下，FXa转化百分比在约78％至约120％的范围内。
该数据指示来自第25组和第43组的抗TF抗体不抑制TF:FVIIa介导的FXa从FX转化。该数据还表明来自第25组和第43组的抗TF抗体具有与由FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点。
表8：FXa转化％
Figure BDA0004110303870001871
Figure BDA0004110303870001881
实施例15：FVIIa竞争测定
使用Alexa Fluor 488 5-磺基二氯苯酚酯(ThermoFisher Scientific)生成FVII-Fc缀合物。通过凝胶过滤(ThermoFisher Scientific)从缀合物制剂中去除过量的Alexa Fluor染料。
为了评价FVIIa与抗TF人抗体之间的竞争，首先将TF阳性MDA-MB-231细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在冰上孵育1小时，其中滴定抗TF人抗体。随后，将最终浓度为20nM的与Alexa488缀合的FVII-Fc添加到抗体细胞混合物中。在冰上再孵育1小时后，洗涤细胞，用活性染料进行染色，并通过流式细胞术进行分析。使用中值荧光强度总结了来自活细胞的Alexa488荧光数据。FVII-Fc结合总结为FVII-Fc结合％＝[MFI抗体标记的细胞–MFI未染色的细胞]/[MFIIgG1对照标记的细胞–MFI未染色细胞]。相对于无抗体对照，抗TF抗体滴定存在下的FVIIa结合百分比(FVIIa％)总结于表9中并且显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
在不同浓度的来自第25组和第43组的抗体(包括25A、25A3、25G、25G1、25G5、25G9、43B、43B1、43B7、43D、43D7、43D8、43E和43Ea)存在下，FVIIa结合百分比在约76％至约102％的范围内。
该数据表明来自第25组和第43组的抗TF抗体不与FVIIa竞争结合至人TF。该数据还表明来自第25组和第43组的抗TF抗体具有与由FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点。
表9：抗TF抗体与FVIIa的竞争
Figure BDA0004110303870001891
实施例16：TF信号传导测定
对IL-8和GM-CSF蛋白水平进行测量，如先前描述于Hjortoe等,Blood,2004,103:3029-3037中。将用Leibovitz的L-15培养基进行2小时血清饥饿的TF阳性MDA-MB-231细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)用从100nM抗TF抗体开始的8点1:2.5滴定进行孵育。在37℃下30分钟后，将FVIIa(NovoSeven RT,Novo Nordisk,Bagsvaerd,Denmark)以20nM的最终浓度添加到细胞中。5小时后，收集细胞培养上清液，并按建议通过ELISA分析IL8或GM-CSF(R&DBiosystems,Minneapolis,MN,USA)。在Prism中使用用重组IL8或GM-CSF(R&DBiosystems,Minneapolis,MN,USA)的标准曲线，以计算细胞培养上清液中的细胞因子浓度。相对于无抗体对照，计算报告抗体浓度下的IL8和GM-CSF百分比(IL8％和GM-CSF％)。用抗TF抗体滴定的IL8浓度显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中，并且不同抗体浓度下的IL8％示于表10中。用抗TF抗体滴定的GM-CSF浓度显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中，并且不同抗体浓度下的IL8％示于表11中。
在浓度大于或等于6.4nM的抗TF抗体的存在下，IL8浓度降低大于75％。在浓度大于或等于6.4nM的抗TF抗体的存在下，GM-CSF浓度降低大于60％。
该数据表明所有测试的抗TF抗体抑制FVIIa依赖性TF信号传导。
表10：IL8的抑制
Figure BDA0004110303870001901
Figure BDA0004110303870001911
表11：GM-CSF的抑制
Figure BDA0004110303870001912
实施例17：抗体竞争测定
使用Alexa Fluor 488 5-磺基二氯苯酚酯(ThermoFisher Scientific)生成Alexa Fluor抗体。通过凝胶过滤(ThermoFisher Scientific)从抗体染料缀合物制剂中去除过量的Alexa Fluor染料。
为了评价第一抗TF人抗体与25A之间的竞争，首先将TF阳性A431细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在冰上孵育1小时，其中滴定第一抗TF人抗体。随后，将最终浓度为20nM的与Alexa488缀合的25A添加到抗体细胞混合物中。在冰上再孵育1小时后，洗涤细胞，用活性染料进行染色，并通过流式细胞术进行分析。使用中值荧光强度总结了来自活细胞的Alexa488荧光数据。25A结合总结为25A结合％＝[MFI抗体标记的细胞–MFI未染色的细胞]/[MFIIgG1对照标记的细胞–MFI未染色的细胞]。
为了评价第一抗TF人抗体与43Ea之间的竞争，首先将TF阳性A431细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在冰上孵育1小时，其中滴定第一抗TF人抗体。随后，将最终浓度为20nM的与Alexa488缀合的43Ea添加到抗体细胞混合物中。在冰上再孵育1小时后，洗涤细胞，用活性染料进行染色，并通过流式细胞术进行分析。使用中值荧光强度总结了来自活细胞的Alexa488荧光数据。43Ea结合总结为43Ea结合％＝[MFI抗体标记的细胞–MFI未染色的细胞]/[MFIIgG1对照标记的细胞–MFI未染色的细胞]。
25A结合％和43Ea结合％示于表12。来自第25组和第43组的抗体降低25A结合％和43Ea结合％至小于10％。
该数据指示第25组的抗体和第43组的抗体彼此竞争结合至人TF，并且可结合与人TF相同或重叠的表位。
表12：抗TF抗体与抗体克隆25A或43Ea的竞争
Figure BDA0004110303870001921
Figure BDA0004110303870001931
实施例18:细胞存活力测定
为了评价抗TF抗体的内化，进行细胞毒性测定。简而言之，将细胞以每孔4x103个细胞涂铺于384孔板(Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA)内的40μl培养基中。与微管蛋白抑制剂单甲基澳瑞他汀F(MMAF)(Moradec,San Diego,CA,USA)缀合的抗体和二级抗人Fc抗体分别从5nM和30nM处开始进行连续稀释。孵育板3天，之后在CellTiter-Glo(CTG)测定试剂(Promega,Madison,WI,USA)中裂解。在Envision读板仪上测量CTG发光，并且在Prism中绘制4次重复实验的平均值和标准偏差。对于每种抗TF抗体，使用4参数结合模型在Prism中计算IC50及其相关的95％置信区间。
如由发光水平和计算的IC50指示的细胞存活力显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
该数据表明，从第1组、第25组、第29组、第39组、第43组和第54组测试的所有抗TF抗体有效降低了TF阳性A431细胞的活力。
实施例19:凝血酶生成测定(TGA)
使用由STAGO制造和分配的校准自动血栓图(CAT)仪器进行TGA测定。测试方法的设计等效于标准CAT测定的测量，不同之处在于血浆来源为补充有玉米胰蛋白酶抑制剂的柠檬酸盐(柠檬酸盐/CTI)中的正常混合血浆(NPP)。将抗TF抗体分别在0、10、50和100nM处进行滴定，并且与在补充有100微克/mL玉米胰蛋白酶抑制剂(柠檬酸盐/CTI)的11mM柠檬酸盐中收集的正常混合血浆(NPP)混合。将重新脂化的TF添加到96孔测定板中，之后添加抗体/NPP混合物。孵育10分钟后或直接将重新脂化的TF与抗体/NPP合并后，通过添加钙和凝血酶底物来引发凝血酶的生成。使用STAGO软件报告以下参数：峰值IIa(生成的最高凝血酶浓度[nM])；滞后时间(生成IIa的时间)[min])；ETP(内源性凝血酶潜能，曲线下面积)[nM xmin])；和ttPeak(到达峰值IIa的时间[min])。还报告了在同一板上，相对于无抗体血浆对照，每种抗体存在下凝血酶生成的峰值百分比(峰值IIa％)和内源性凝血酶潜能百分比(ETP％)。
表37示出选自25A、25A3、25A5、39A、43B1、43D7、43Ea和M1593的每种抗体存在下的峰值IIa、滞后时间、ETP、ttPeak、峰值IIa％和ETP％，其中在添加钙和凝血酶底物之前不进行抗体孵育。表38示出选自25A、25A3、25A5、39A、43B1、43D7、43Ea和M1593的每种抗体存在下的峰值IIa、滞后时间、ETP、ttPeak、峰值IIa％和ETP％，其中在添加钙和凝血酶底物之前进行10分钟抗体孵育。在添加钙和凝血酶底物之前不进行抗体孵育情况下抗TF抗体滴定存在下的IIa峰％显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。10分钟在添加钙和凝血酶底物之前进行10分钟抗体孵育情况下抗TF抗体滴定存在下的IIa峰％显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。M1593抗体具有SEQ ID NO:821的VH序列和SEQ ID ID NO:822的VL序列。
在不进行抗体预孵育的来自第25组的抗体(包括25A、25A3和25A5)存在下，峰值IIa％为95％或更高。在进行10分钟抗体预孵育的来自第25组的抗体(包括25A、25A3和25A5)存在下，峰值IIa％为100％或更高。在来自第25组的测试抗体的存在下，ETP％为99％或更高。
在不进行抗体预孵育的来自第43组的抗体(包括43B1、43D7和43Ea)和抗TF抗体M1593的存在下，峰值IIa％大于50％但等于或小于96％。在进行10分钟抗体预孵育的来自第43组的抗体(包括43B1、43D7和43Ea)和抗TF抗体M1593的存在下，峰值IIa％大于40％但等于或小于93％。在来自第43组的测试抗体和M1593抗体的存在下，ETP％为92％或更高。
该数据指示来自第25组和第43组的抗体允许正常凝血酶生成，并因此不是凝血酶生成的抑制剂。与第43组的抗体和M1593抗体相比，凝血酶生成的峰值百分比(峰值IIa％)在第25组的抗体的存在下更大。
表37：不进行抗体预孵育的凝血酶生成测定
Figure BDA0004110303870001951
Figure BDA0004110303870001961
*当软件无法计算ETP时，组具有“未发现尾(No Tail Found)”的错误。
表38：进行10分钟抗体预孵育的凝血酶生成测定
Figure BDA0004110303870001962
Figure BDA0004110303870001971
*当软件无法计算ETP时，组具有“未发现尾(No Tail Found)”的错误。
实施例20:抗体-药物缀合物(ADC)的合成
合成抗体-药物缀合物(ADC)，如描述于Behrens等,Mol Pharm,2015,12:3986-98中。用2.5摩尔当量的三(2-羧基乙基)膦将pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中5mg/mL的抗体还原。在37℃下2小时后，将部分还原的抗体冷却至室温，并且缀合1小时至3至5摩尔当量的MC-vc-PAB-MMAE(马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧基羰基-单甲基澳瑞他汀E)。将反应物缓冲液交换到PBS中以去除小分子量试剂。所得ADC的药物-抗体比率(DAR)为3至4。用以下公式确定DAR：吸光度(248nm)/吸光度(280nm)＝(n x ExPAB[248nm]+Ex抗体[248nm])/(n x ExPAB[280nm]+Ex抗体[280nm])，其中n为DAR的变量，并且Ex为PAB和抗体的消光系数。疏水相互作用色谱法和尺寸排阻色谱法分别用于证实基于吸光度的DAR估计值和用于确保ADC制剂为至少95％单体。
实施例21:抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性测定
为了评价ADC的细胞毒性，将TF阳性A431和HPAF-II细胞以每孔4x103个细胞涂铺于384孔板(Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA)中的40μL培养基内。将缀合至MC-vc-PAB-MMAE的抗TF抗体从5nM开始进行连续稀释。孵育板3至4天，之后在CellTiter-Glo(CTG)测定试剂(Promega,Madison,WI,USA)中裂解。在Envision读板仪上测量CTG发光，并且在Prism中绘制4次重复实验的平均值和标准偏差。对于每个ADC，使用4参数结合模型在Prism中计算IC50及其相关的95％置信区间。
在TF阳性A431和HPAF-II细胞中如由CTG发光和计算的IC50指示的细胞存活力显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。包含缀合至MC-vc-PAB-MMAE的来自第25组、第43组和第39组的抗TF抗体的ADC在TF阳性A431和HPAF-II细胞中产生细胞毒性。
该数据指示抗TF抗体-药物缀合物降低了TF阳性细胞的体外活力。
实放例22:对猪TF的结合亲和力测定
测试了某些抗体与猪TF结合的能力。对于猪TFBiacore-基测量，给定抗TF抗体被共价偶联至CM5芯片(GE Healthcare Bio-Sciences)的抗人IgG抗体捕获。测量抗TF抗体与从100nM开始的五点三倍滴定的猪TF-His之间的缔合180至240秒。随后，测量抗TF抗体与TF-His之间的解离1800秒。使用1:1结合模型对动力学数据进行整体分析和拟合。通过Biacore基实验测量的指示的TF抗体的KD值示于表40。
如表40所示，来自第25组和第43组、25G9和43D8的抗hTF抗体表现出与猪TF的结合活性和交叉反应性。
表40：猪TF的抗体动力学
Ab KD(nM)[]
1G 无结合*
29D 无结合*
25G9 3.31[0.08]
43D8 12.9[0.03]
无结合*：无结合至弱结合，无可报告的KD
实施例23:基于细胞的结合测定
人TF阳性肿瘤细胞系A431和MDA-MB-231以及普通猕猴TF阳性细胞系RF/6A获自美国组织培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)，并按建议进行维护。
评估基于细胞的抗体结合，如先前描述于Liao-Chan等,PLoS One,2015,10:e0124708中，其以引用的方式整体并入。将用Cellstripper(Mediatech,Manassas,VA,USA)收集的1.2x105个细胞用十二点1:3稀释滴定的抗人TF IgG1抗体(在250nM或100nM处开始)在冰上孵育2小时。洗涤2次后，将标记有IgG1抗体的细胞分别与150nM山羊藻红蛋白(PE)F(ab’)2片段山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)或FITC标记的F(ab’)2片段山羊抗人kappa(SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA)在冰上孵育30min。洗涤2次后，用TO-PRO-3碘化物(ThermoFisher Scientific)标记死细胞，并且在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)或Novocyte流式细胞仪(ACEA Biosciences,San Diego,CA,USA)上分析样品。绘制每个稀释度处的中值荧光强度(MFI)，并且使用Prism(GraphPad,La Jolla,CA,USA)中的4参数结合模型得出细胞EC50。基本上不影响FX转化的抗体(即25A、25A3、25G1、43B1、43D7和43Ea)和抑制FX转化超过50％的抗体(即1F、29E、39A和54E)包括在测定中。抗TF抗体与人TF阳性A431细胞的结合的结果显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。抗TF抗体与人TF阳性MDA-MB-231细胞的结合的结果显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652的图12A中的所有测试的抗hTF抗体对人TF阳性A431细胞表现出高亲和力，其中EC50在约1.50nM至约0.34nM的范围内。IgG1同种型对照不结合A431细胞(不结合，nb)。国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652的图12B中的所有测试的抗hTF抗体对人TF阳性MDA-MB-231细胞表现出高亲和力，其中EC50在约1.50nM至约0.06nM的范围内。IgG1同种型对照不结合MDA-MB-231细胞(不结合，nb)。
如实施例11所述和表5所示，评价了抗hTF抗体对来自食蟹猴(食蟹猕猴)的TF的结合亲和力。食蟹猕猴TF和普通猕猴TF的蛋白质序列是相同的。使用如表42所示的普通猕猴RF/6A细胞系证实TF特异性抗体与食蟹猴的结合。所有测试的抗hTF抗体对TF阳性普通猕猴RF/6A细胞表现出高亲和力，其中EC50在约1.28nM至约0.17nM的范围内。抗TF抗体结合至食蟹猴的能力对于用非人灵长类动物模型对这些抗体进行毒理学研究是有利的。
表42：抗TF抗体与普通猕猴RF/6A细胞的结合
Ab RF/6A EC50(nM) RF/6A 95％CI
1F 0.17 0.14至0.21
25A 0.43 0.37至0.50
25A3 0.27 0.24至0.30
25G1 0.27 0.23至0.32
29E 0.53 0.46至0.61
39A 0.27 0.23至0.32
43B1 0.47 0.40至0.55
43D7 0.41 0.35至0.49
43Ea 0.92 0.83至1.01
54E 1.28 1.16至1.41
实施例24:对大肠埃希氏菌来源的TF的结合测定
大场埃希氏菌来源的TF被表达为OmpA信号序列与TFECD-His6之间的融合体，并且通过亲和和阴离子交换色谱进行纯化。通过蛋白ELISA研究确定抗TF抗体1F、25A，25A3、25G1、29E、39A、43B1、43D7、43Ea和54E与Expi293或大场埃希氏菌来源的TF的结合。将用Expi293或大场埃希氏菌来源的TF-His包被的板与浓度递增的抗体一起孵育。在用HRP缀合的二级抗体(JacksonImmunoresearch)孵育后，获得发光数据，并用于使用Prism计算EC50与95％置信区间。表43中列出了抗体的EC50和95％置信区间。
表43：抗TF抗体与Expi293或大肠埃希氏菌来源的TF的结合
Figure BDA0004110303870002011
所有测试的抗hTF抗体均对大肠埃希氏菌来源的TF表现出高亲和力，其中EC50在约0.68nM至约0.31nM的范围内，这可与抗体与Expi293来源的TF的结合亲和力(约0.98nM至0.41nM)相比。这些结果指示，尽管从人细胞系中选择了针对糖基化TF的抗TF抗体，但是当通过蛋白ELISA测量时，抗体可以相似的亲和力结合至大肠埃希氏菌来源的TF。
实施例25：凝血酶生成测定(TGA)
使用由STAGO制造和分配的校准自动血栓图(CAT)仪器(Diagnostica Stago SAS,Asnières sur Seine,France)进行TGA测定。参见Samama等,Thromb Res,2012,129:e77-82，其以引用的方式整体并入。测试方法的设计等效于标准CAT测定的测量，不同之处在于血浆来源为补充有100μg/mL玉米胰蛋白酶抑制剂的11mM柠檬酸盐(柠檬酸盐/CTI)中收集的正常混合血浆(NPP)。将抗TF抗体以0、10、50和100nM滴定，并与柠檬酸盐/CTI中的NPP混合。将重新脂化的TF添加到96孔测定板中，之后添加抗体/NPP混合物。孵育10分钟后或直接将重新脂化的TF与抗体/NPP合并后，通过添加钙和凝血酶底物来引发凝血酶的生成。使用STAGO软件报告以下参数：峰值IIa(凝血酶生成曲线上生成的最高凝血酶浓度[nM])；滞后时间(从测定开始到形成10nM凝血酶时刻的时间)[min])；ETP(内源性凝血酶潜能，曲线下面积)[nM x min])；和ttPeak(从测定开始到峰值IIa的时间[min])。还报告了在同一板上，相对于无抗体血浆对照，每种抗体存在下凝血酶生成的峰值百分比(峰值IIa％)、内源性凝血酶潜能百分比(ETP％)和ttPeak百分比(ttPeak％)。如本文所用，术语“凝血酶生成测定”(TGA)是指在此实施例中使用的TGA。
表44示出选自1F、25A、25A3、25G1、29E、39A、43B1、43D7、43Ea、54E、TF-011、5G9和10H10的每种抗体存在下的峰值IIa、滞后时间、ETP、ttPeak、峰值IIa％、ETP％和ttPeak％，其中在添加钙和凝血酶底物之前不进行抗体孵育。表45示出选自1F、25A、25A3、25G1、29E、39A、43B1、43D7、43Ea、54E、TF-011、5G9和10H10的每种抗体存在下的峰值IIa、滞后时间、ETP、ttPeak、峰值IIa％、ETP％和ttPeak％，其中在添加钙和凝血酶底物之前进行10分钟抗体孵育。未进行抗体预孵育的100nM抗TF抗体存在下的凝血酶生成曲线显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。未进行抗体预孵育的抗TF抗体滴定存在下的峰值凝血酶浓度显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
如国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652(以引用的方式整体并入本文)中所示，在未进行抗体预孵育的条件下，在100nM抗体浓度下，1F、29E、39A、54E分别将峰值IIa浓度降低了92％、76％、91％和70％。类似地，100nM的5G9和TF-011分别抑制峰值IIa浓度92％和91％。在两种最高浓度的1F、39A、5G9和TF-011的存在下，凝血酶生成大大降低，这阻碍了内源性凝血酶生成(ETP)计算，并且分别将在50nM和100nM下达到峰值IIa/凝血酶生成(ttPeak)的时间增加了至少284％和353％。相比之下，来自第25组的抗体对峰值IIa浓度或ttPeak的影响不超过9％。第43组抗体和10H10对峰值IIa浓度表现出轻微的干扰：100nM的43B1、43D7、43Ea和10H10分别将峰值IIa浓度降低了33％、44％、13％和34％。此外，100nM的43B1、43D7和10H10示出ttPeak增加了至少29％。但是，对于第43组抗体和10H10，观察到的峰值IIa浓度下降和ttPeak延迟不导致ETP下降超过10％。
在进行10分钟抗体预孵育的条件下，类似的结果在表45中示出。在100nM抗体浓度下，1F、29E、39A、54E分别将峰值IIa浓度降低了93％、72％、93％和87％。类似地，100nM的5G9和TF-011分别抑制峰值IIa浓度92％和91％。在两种最高浓度的1F、39A、54E和TF-011以及所有测试浓度的5G9的存在下，凝血酶生成大大降低，这阻碍了内源性凝血酶生成(ETP)计算，并且分别将在50nM和100nM下达到峰值IIa/凝血酶生成(ttPeak)的时间增加了至少303％和371％。相比之下，来自第25组的抗体并不降低峰值IIa浓度或增加ttPeak。第43组抗体和10H10对峰值IIa浓度表现出轻微的干扰：100nM的43B1、43D7、43Ea和10H10分别将峰值IIa浓度降低了41％、56％、13％和48％。此外，100nM的43B1、43D7和10H10示出ttPeak增加了至少33％。但是，对于第43组抗体和10H10，观察到的峰值IIa浓度下降和ttPeak延迟不导致ETP下降超过11％。
总体而言，这些结果指示，当考虑到所有三个TGA参数(ETP、峰值IIa浓度和ttPeak)时，第25组抗体在凝血级联的倒数第二步中是完全惰性的。
表44：不进行抗体预孵育的凝血酶生成测定
Figure BDA0004110303870002031
/>
Figure BDA0004110303870002041
/>
Figure BDA0004110303870002051
*当软件无法计算ETP时，组具有“未发现尾(No Tail Found)”的错误。
表45：进行10分钟抗体预孵育的凝血酶生成测定
Figure BDA0004110303870002052
/>
Figure BDA0004110303870002061
*当软件无法计算ETP时，组具有“未发现尾(No Tail Found)”的错误。
实施例26：对先前描述的抗TF抗体的FXa转化测定和FVIIa竞争测定
在FXa转化测定和FVIIa竞争测定中测试先前描述的TF特异性抗体TF-011、5G9和10H10(Breij等，Cancer Res，2014，74：1214-1226；Versteeg等，Blood，2008，111：190-199；其各自以引用的方式整体并入)。
为了评价在抗TF的人抗体存在下TF：FVIIa将FX转化为FXa的能力，进行基于细胞的FX转化测定，如描述于Larsen等,J Biol Chem,2010,285:19959-19966中，其以引用的方式整体并入。简而言之，将5x104个MDA-MB-231细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)涂铺到经组织培养物处理的黑色96孔板(Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA)中并培养过夜。在去除细胞培养基并且在含1.5mM CaCl2的HEPES缓冲液中添加最终浓度为200nM的FX后，在37℃下用滴定抗体孵育细胞15min。在复溶具有最终浓度为20nM FVIIa的二元TF:FVIIa复合物后，将细胞在37℃下孵育5min。在猝灭黑色94孔板中与乙二胺四乙酸(EDTA)的反应后，用50μMSN-7 6-氨基-1-萘磺酰胺基荧光底物(Haematologic Technologies,Essex Junction,VT,USA)在配备有Umbelliferone 355激发滤光片、Umbelliferone 460发射滤光片和LANCE/DELFIA顶镜的Envision读板仪(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上测量生成的FXa。相对于无抗体对照，抗TF抗体滴定存在下的FXa转化百分比(FXa％)显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
为了评价FVIIa与抗TF人抗体之间的竞争，首先将TF阳性MDA-MB-231细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在冰上孵育1小时，其中滴定抗TF人抗体或同种型对照。随后，将缀合到Alexa488的FVII-Fc以20nM的最终浓度添加到抗体细胞混合物。在冰上再孵育1小时后，洗涤细胞，用活性染料进行染色，并通过流式细胞术进行分析。使用中值荧光强度(MFI)总结了来自活细胞的Alexa488荧光数据。FVII-Fc结合总结为FVII-Fc结合％＝[MFI抗体标记的细胞–MFI未染色的细胞]/[MFIIgG1对照标记的细胞–MFI未染色细胞]。相对于同种型对照，抗TF抗体滴定存在下的FVIIa结合百分比(FVIIa％)显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
如国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652(以引用的方式整体并入本文)中所示，TF-011和5G9在25nM、50nM和100nM的浓度下抑制FX转化57％-59％和67％-70％。10H10在这三种浓度下不显著抑制FX转化。
如国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652(以引用的方式整体并入本文)中所示，TF-011与FVII有效竞争，而5G9和10H10分别示出在最高抗体浓度下低于25％和10％的竞争。
这些结果指示，5G9主要与底物FX结合竞争，从而导致观察到FX转化和凝血酶生成的抑制。TF-011通过与FVIIa竞争结合至TF来抑制凝血酶生成。然而，10H10抑制TF-FVIIa介导的信号传导，而基本上不影响FVIIa与TF的结合。这些发现与以下中描述的先前观察结果一致：Huang等,J Mol Biol,1998,275:873-894；Ruf等,Biochem J,1991,278:729-733；和Teplyakov等,Cell Signal,2017,36:139-144；其各自以引用的方式整体并入。
实施例27:抗体竞争测定
根据制造商的方案使用Alexa Fluor 4885-磺基二氯苯酚酯(ThermoFisherScientific)生成Alexa Fluor抗体。通过凝胶过滤(ThermoFisher Scientific)从抗体染料缀合物制剂中去除过量的Alexa Fluor染料。
为了评估第一抗TF人抗体与25A3之间的竞争，首先将TF阳性MDA-MB-231细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在冰上孵育1小时，其中滴定第一抗TF人抗体。随后，将最终浓度为20nM的与Alexa488缀合的25A3添加到抗体细胞混合物中。在冰上再孵育1小时后，洗涤细胞，用活性染料进行染色，并通过流式细胞术进行分析。使用中值荧光强度总结了来自活细胞的Alexa488荧光数据。25A3结合总结为25A3结合％＝[MFI抗体标记的细胞–MFI未染色的细胞]/[MFIIgG1对照标记的细胞–MFI未染色的细胞]。
为了评价第一抗TF人抗体与43D7之间的竞争，首先将TF阳性MDA-MB-231细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在冰上孵育1小时，其中滴定第一抗TF人抗体。随后，将最终浓度为20nM的与Alexa488缀合的43D7添加到抗体细胞混合物中。在冰上再孵育1小时后，洗涤细胞，用活性染料进行染色，并通过流式细胞术进行分析。使用中值荧光强度总结了来自活细胞的Alexa488荧光数据。43D7结合总结为43D7结合％＝[MFI抗体标记的细胞–MFI未染色的细胞]/[MFIIgG1对照标记的细胞–MFI未染色的细胞]。
为了评价第一抗TF人抗体与39A之间的竞争，首先将TF阳性MDA-MB-231细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在冰上孵育1小时，其中滴定第一抗TF人抗体。随后，将最终浓度为20nM的与Alexa488缀合的39A添加到抗体细胞混合物中。在冰上再孵育1小时后，洗涤细胞，用活性染料进行染色，并通过流式细胞术进行分析。使用中值荧光强度总结了来自活细胞的Alexa488荧光数据。39A结合总结为39A结合％＝[MFI抗体标记的细胞–MFI未染色的细胞]/[MFIIgG1对照标记的细胞–MFI未染色的细胞]。
25A3结合％、43D7结合％和39A结合％显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。来自第25组和第43组的抗体、5G9和10H10降低25A3结合％和43D7结合％并且不降低39A结合％。来自第1组、第29组、第39组和第54组的抗体以及TF-011降低39A结合％并且不降低25A3结合％和43D7结合％。
虽然抗体竞争测定结果指示，第25组和第43组抗体、5G9和10H10可与人TF的相同或重叠表位结合，或可通过变构机制影响彼此的TF结合，但是如本公开别处所述的嵌合TF构建体作图实验证明第25组抗体、第43组抗体、5G9和10H10结合不同的表位。此外，虽然抗体竞争测定结果指示，第1组、第29组、第39组和第54组的抗体和TF-011可与人TF的相同或重叠表位结合，或可通过变构机制影响彼此的TF结合，但是如本公开别处所述的嵌合TF构建体作图实验证明第29组、第39组和第54组的抗体结合与TF-011不同的表位。
实施例28:抗TF抗体内化
为了评价抗TF抗体的内化作用，进行细胞毒性测定，如描述于Liao-Chan等,PLoSOne,2015,10:e012470中，其以引用的方式整体并入。简而言之，将细胞以每孔4x103个细胞涂铺于384孔板(Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA)中的40μl培养基内。与微管蛋白抑制剂单甲基澳瑞他汀F(MMAF)(Moradec,San Diego,CA,USA)缀合的抗体和抗人Fc Fab分别从5nM和30nM处开始进行连续稀释。与MMAF缀合的抗人Fc Fab由对人IgG的Fc区具有特异性的多克隆抗体组成，其中DAR为1.2至1.5。孵育板3天，之后在CellTiter-Glo(CTG)测定试剂(Promega,Madison,WI,USA)中裂解。在Envision读板仪上测量CTG发光，并且在Prism(GraphPad,La Jolla,CA,USA)中绘制4个重复实验的平均值和标准偏差。对于每种抗TF抗体，使用4参数结合模型在Prism中计算IC50及其相关的95％置信区间。用抗TF抗体和抗TF抗体Fab:MMAF复合物孵育后的细胞存活力结果显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。IC50值的95％置信区间在表46中示出。
还通过基于内化荧光和猝灭的表面荧光的定量测定来评价抗TF抗体的内化。如Liao-Chan等,PLoS One,2015,10:e0124708中所述评估细胞表面荧光猝灭。简而言之，将1.2x105个MDA-MB-231细胞与100nM的A488缀合的抗体在培养基中于冰上预孵育2小时。洗涤2次后，将细胞重悬于冷培养基中，并且在37℃下脉冲长达4小时。将细胞快速冷却，并且在有或没有300nM抗A488抗体(克隆19A)的情况下在冰上孵育30min。洗涤2次后，用DAPI标记死细胞，并且在Novocyte流式细胞仪(ACEA Biosciences)上分析样品。相对于同种型对照，对每个抗A488 mAb浓度处的中值荧光强度(MFI)进行标准化，以获得归一化的MFI百分比。通过校正不完全表面猝灭，从猝灭和非猝灭的样品数据中计算出内化荧光：1–(N1–Q1)/(N1–(N1Q0/N0))其中N1＝每个时间点(t1)的未猝灭的MFI；Q1＝t1的猝灭的MFI；Q0＝保持在冰上的样品(t0)的猝灭的MFI；N0＝t0的未猝灭的MFI。与A488缀合的抗TF抗体的内化百分比显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
因为Fab:MMAF结合TF特异性抗体的Fc区，所以这些复合物的细胞摄取可触发细胞死亡。虽然单独的TF特异性抗体在TF阳性A431细胞的三天培养中对细胞存活力没有影响，但是Fab:MMAF复合物中的TF特异性抗体示出剂量依赖性细胞杀伤，其中IC50值在0.07nM和0.14nM的范围内。(参见国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652，其以引用的方式整体并入本文中)。
细胞摄取被荧光标记的TF特异性抗体证实。在基于内化荧光和猝灭表面荧光的定量分析中，TF特异性抗体在4小时孵育后示出28％和37％之间的内化。(参见国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652，其以引用的方式整体并入本文中)。
这些结果指示，所测试的抗TF抗体可治疗内化和毒素递送到TF阳性细胞中。
Figure BDA0004110303870002121
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Figure BDA0004110303870002131
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Figure BDA0004110303870002141
实施例29:抗体-药物缀合物(ADC)的基于细胞的结合测定
为了评价ADC的细胞结合特性，评估了抗TF抗体和抗TF ADC与表达HCT116细胞的内源性人TF结合，如先前描述于Liao-Chan等,PLoS One,2015,10:e0124708中，其以引用的方式整体并入。简而言之，将用Cellstripper(Mediatech,Manassas,VA,USA)收集的1.2x105个细胞在冰上用十二点1:3稀释滴定的在100nM开始的抗人TF抗体或ADC孵育2小时。洗涤2次后，将标记有抗体或ADC的细胞分别与150nM山羊藻红蛋白(PE)F(ab’)2片段山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)或FITC标记的F(ab’)2片段山羊抗人κ(SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA)在冰上孵育30min。洗涤2次后，用TO-PRO-3碘化物(ThermoFisher Scientific)标记死细胞，并且在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)或Novocyte流式细胞仪(ACEA Biosciences,SanDiego,CA,USA)上分析样品。绘制每个稀释度处的中值荧光强度(MFI)，并且使用Prism(GraphPad,La Jolla,CA,USA)中的4参数结合模型得出细胞EC50。抗TF抗体和抗TF ADC的结合曲线显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。可报告细胞EC50及其抗TF抗体和ADC的95％置信区间显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
如以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中所示，TF特异性ADC的细胞结合特性与TF特异性抗体的细胞结合特性相当，这指示ADC的缀合过程不改变ADC的TF特异性抗体的细胞结合特性。
实施例30：抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性测定
为了评价ADC的细胞毒性，将A431细胞涂铺于384孔板(Greiner Bio-One)中。如所示将缀合至MC-vc-PAB-MMAE的抗TF抗体进行连续稀释。将TF特异性ADC加入A431细胞中，72小时孵育或4小时孵育，之后去除过量的ADC，并且再孵育68小时。处理后，A431细胞在CTG测定试剂中裂解。测量CTG发光，并且在Prism中绘制4次重复实验的平均值和标准偏差。对于每个ADC，使用4参数结合模型在Prism中计算IC50及其相关的95％置信区间。
在滴定连续72小时孵育的抗TF ADC后的细胞存活力显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。滴定孵育4小时的抗TF ADC，之后去除过量的ADC并再培养68小时后的细胞存活力显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。在连续处理和脉冲处理下的ADC的可报告IC50值显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。表46和表47分别列出了连续处理和脉冲处理的IC50的95％置信区间。
两种处理均导致有效的细胞杀伤，其中与72小时孵育相比，当在4小时孵育后从培养物中去除过量的ADC时，IC50升高2.4至4.7倍。去除过量的25A3和39A ADC对IC50的影响最小，分别从0.07和0.05nM增加了2.7和2.4倍。
这些结果指示，与TF特异性抗体相似，TF特异性ADC经历了实质性的细胞内化。
实施例31:FVIIa存在下的细胞毒性测定
为了了解FVIIa是否干扰TF特异性ADC的活性，我们在不存在或存在FVIIa的情况下，用TF特异性ADC(与MC-vc-PAB-MMAE缀合的抗TF抗体)处理A431细胞4小时并在68小时后测量细胞存活力。在添加抗TF ADC滴定之前，将A431细胞在没有或有50nM FVIIa的情况下预孵育30分钟。通过CTG测定确定细胞存活力。在Prism中绘制4次重复实验的平均值和标准偏差。对于每个ADC，使用4参数结合模型在Prism中计算IC50。
在不存在或存在FVIIa的情况下滴定抗TF ADC后的细胞存活力显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。在不存在或存在FVIIa的情况下，ADC的可报告IC50值显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
虽然与FVIIa(29E、39A、54E和TF-011)竞争的ADC受到FVIIa存在的负面影响至少2.3倍，但是在不存在或不存在FVIIa的情况下，未与FVIIa竞争的ADC(第25组和第43组抗体)同样有效。
这些结果指示FVIIa不干扰第25组和第43组的抗TF ADC的活性。
实施例32:抗体-药物缀合物(ADC)存在下的细胞内微管网络
进行了细胞内微管网络的免疫荧光实验，以说明ADC的作用机制。参见Theunissen等,Methods Enzymol,2006,409:251-284。简而言之，将A431或HPAF-II细胞接种于8孔经聚D-赖氨酸处理的载玻片(Corning Inc,Corning,NY,USA)上。一天后，将培养基替换为含有5nM ADC的培养基。ADC暴露20小时后，在室温下用4％多聚甲醛(ThermoFisherScientific)固定细胞15min。用PBS洗涤三次后，用含有0.3％ Triton X-100和5％正常山羊血清的PBS使细胞渗透1小时。接下来，将微管网络在含有1％ BSA和0.3％ Triton X-100的PBS中用抗微管蛋白(11H10)兔mAb(Alexa Fluor 488缀合物)(Cell SignalingTechnology,Danvers,MA,USA)染色3小时。洗涤三次后，将带有DAPI的ProLong GoldAntifade试剂(ThermoFisher Scientific)添加到细胞中，并且使用0.17mm盖玻片将载玻片固定以用于显微术。在配备有sCMOS相机的DMi8荧光显微术(Leica Microsystems,Buffalo Grove,IL,USA)上进行图像采集。使用Leica LAS X软件获取系统优化的6至7微米的Z堆栈。用扩展景深(EDF)图像特征自动创建此Z堆栈中的清晰二维图像。A431或HPAF-II细胞的微管蛋白染色的代表性图像显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
虽然同种型对照ADC不影响微管网络，但是25A3 ADC在A431和HPAF-II细胞中均有效破坏微管网络。
这些结果指示，基于MMAE的抗TF ADC通过破坏细胞内微管网络来诱导TF阳性癌细胞的细胞毒性。
实施例33:细胞毒性测定和HUVEC中的G2/M阻滞
为了评价人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞表面上的TF拷贝数，收集1.2x105个HUVEC，并与小鼠IgG2a主链上的133nM抗人TF抗体5G9一起在冰上孵育2小时。洗涤2次后，将QIFIKIT珠(Agilent)和标记有抗TF抗体的细胞与150nM的山羊藻红蛋白(PE)F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(Fc-γ片段特异性)(Jackson ImmunoResearch)在冰上孵育30分钟。洗涤2次后，用TO-PRO-3碘化物(ThermoFisher Scientific)标记死细胞，并且在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)上分析样品。门控单个活细胞后，使用FlowJo(Flowjo,Ashland,OR,USA)确定MFI。使用5参数结合模型在Prism中生成使用QIFIKIT珠的标准曲线，以确定拷贝数。定量的下限为1.9x103个抗体结合位点(也称为拷贝数)，并且定量的上限为8.0x105个抗体结合位点。
对损伤、炎性和血管生成因子的响应短暂增加血管系统中表面TF的表达。参见Holy等,Adv Pharmacol,2010,59:259-592，其以引用的方式整体并入。通过用炎性细胞因子(5ng/mL IL1-β、25ng/mL TNF-α和50ng/mL VEGF)联合治疗HUVEC来模仿细胞培养物中TF的瞬时上调。如国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652(以引用的方式整体并入本文)中所示，在细胞因子治疗6小时后，不存在炎性细胞因子的表面TF水平从2.4x103个拷贝增加至1.2x104个拷贝。相对于6小时的细胞因子治疗，20小时治疗后表面TF降低约3倍，这指示细胞因子诱导的TF上调是短暂的。
对于ADC细胞毒性测定，将HUVEC培养物接种于半面积96孔板上。第二天，将炎性细胞因子和滴定ADC的组合添加到培养物中。四天后，通过在CellTiter-Glo(CTG)测定试剂中裂解来评估培养物的活力。如国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652(以引用的方式整体并入本文)中所示，抗TF ADC、25A-vc-MMAE和43Ea-vc-MMAE不影响经炎性细胞因子处理的HUVEC培养物的细胞存活力。结果指示，经炎性细胞因子处理的内皮细胞对抗TF ADC具有抗性。
为了进一步了解内皮细胞对抗TF ADC的抗性，在添加细胞因子和TF特异性ADC后24小时评价了细胞周期进程。如Theunissen等,Methods Enzymol,2006,409:251-284中所述分析了细胞周期的G2/M期的阻滞。简而言之，低传代HUVEC(Lifeline CellTechnologies,Frederick,MD,USA)在VascuLife VEGF-Mv内皮培养基(Lifeline CellTechnologies)中繁殖，并且将HCT-116细胞接种于12孔板上。第二天，去除培养基，并且用新鲜培养基(无细胞因子)或含有5ng/mL IL1-β、25ng/mL TNF-α和50ng/mL VEGF(含细胞因子)的培养基替换。将滴定的MMAE连接的ADC或游离MMAE添加到细胞中。处理24小时后，将细胞固定在冰冷的70％乙醇中。随后，用流式细胞术缓冲液(PBS,1％ FBS,0.1％ Triton)洗涤细胞，并且用磷酸组蛋白H3(Ser10)的1:100稀释液(D2C8 PE Conjugate,CellSignaling Technology)染色1小时。洗涤2次后，用100μg/mL PureLink RNAse A(ThermoFisher Scientific)处理细胞20min，之后添加活性染料TO-PRO-3碘化物(ThermoFisher Scientific)。在Novocyte流式细胞仪上收集40000个事件。在Flowjo数据分析软件中，排除了细胞双倍体和非整倍体细胞。根据DNA含量对pH3信号进行作图，以确定pH3阳性细胞的百分比。
在不存在或存在炎性细胞因子的情况下，用HUVEC上的抗TF ADC滴定的pH3阳性细胞的百分比(pH3％)显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。用HCT-116细胞上的抗TF ADC滴定的pH3阳性细胞的百分比(pH3％)显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
虽然TF特异性ADC诱导HCT-116细胞中细胞周期的G2/M期处的阻滞，但是ADC不影响经或不经炎性细胞因子处理的HUVEC的细胞周期进程。如以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中，与同种型vc-MMAE的处理相比，pH3阳性HCT-116细胞的百分比在25A-vc-MMAE处理后增加了5倍。
如以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中所示，未缀合的MMAE在HCT-116细胞和HUVEC中均以类似的程度增加组蛋白H3的磷酸化，这指示内皮细胞中的抗性对基于MMAE的ADC具有特异性。
综上所述，这些结果指示，在不存在或存在炎症细胞因子的情况下，抗TF ADC不影响HUVEC的活力。
实施例34:Erk磷酸化测定
为了评估Erk磷酸化，将A431细胞涂铺于培养基中的6孔板(Corning)过夜。第二天，将细胞洗涤一次，并且在无血清培养基中进行血清饥饿。饥饿后，在37℃下将细胞与100nM抗TF抗体预孵育30分钟。将FVIIa以50nM加标至孔中，并且在37℃下孵育20min以诱导p-ERK。诱导后，用RIPA裂解液裂解细胞，并且用HaltTM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(ThermoFisher Scientific)裂解提取缓冲液。使用Phospho-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)和p44/42MAPK(Erk1/2)(137F5)(Cell Signaling Technology)作为一抗以及过氧化物酶AffiniPure驴抗兔IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)作为二抗用20μg细胞裂解液进行蛋白质印迹。在Amersham AI600(GE Healthcare)上测量pErk和Erk的非饱和谱带强度。将每个pErk强度根据其各自的Erk强度和无抗体无FVIIa样品强度进行归一化。
pErk和Erk的蛋白质印迹结果显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。在不进行抗TF抗体预处理的情况下，用FVIIa处理诱导细胞培养物中的Erk磷酸化为5.2倍。Erk磷酸化的诱导通过用1F、39A和54E预处理(诱导倍数在0.8和1.2之间)进行消融，并且被29E以及第25组和第43组的成员减弱(诱导倍数在2.0和3.4之间)。
该数据指示，在评估Erk磷酸化时，抗TF抗体抑制FVIIa依赖性TF信号传导。
实施例35:抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)测定
为了评价ADCC活性，根据制造商的方案使用ADCC报告生物测定核心试剂盒(Promega)。简而言之，将A431细胞涂铺于微量滴定板(Corning)上。第二天，用在50nM开始的十点1:3稀释滴定的抗TF抗体或ADC孵育细胞。将ADCC效应子与靶细胞比率为8:1添加到每个孔中，并且在37℃下孵育6小时。将Bio-GloTM萤光素酶测定试剂添加到每个孔中，以在Envision读板仪(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)上测量发光。在Prism中绘制4次重复实验的平均值和标准偏差。对于每个抗体和ADC，使用4参数结合模型在Prism中计算EC50及其相关的95％置信区间。
在代表滴定的抗TF抗体或抗TF ADC的情况下，用报告子Jurkat细胞系孵育后ADCC的报告子发光显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。每种抗TF抗体或ADC的ADCC报告子发光EC50值显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
所有测试的TF特异性抗体和ADC均诱导荧光素酶依赖性发光，其中EC50值范围在0.18nM与0.43nM之间。
这些数据指示，TF特异性抗体和ADC均可通过抗体的IgG1 Fc结构域诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
实施例36:对猪TF和兔TF的结合亲和力测定
测试了某些抗体与猪TF结合的能力。对于猪TFBiacore-基测量，给定抗TF抗体被共价偶联至CM5芯片(GE Healthcare Bio-Sciences)的抗人IgG抗体捕获。测量抗TF抗体与从100nM开始的五点三倍滴定的猪TF-His之间的缔合180至240秒。随后，测量抗TF抗体与TF-His之间的解离1800秒。使用1:1结合模型对动力学数据进行整体分析和拟合。通过基于Biacore的实验测量的指示的TF抗体的KD值示于表48。
测试了某些抗体与兔TF结合的能力。对于兔TFBiacore-基测量，给定抗TF抗体被共价偶联至CM5芯片(GE Healthcare Bio-Sciences)的抗人IgG抗体捕获。测量抗TF抗体与从100nM开始的五点三倍滴定的兔TF-His之间的缔合180至240秒。随后，测量抗TF抗体与TF-His之间的解离1800秒。使用1:1结合模型对动力学数据进行整体分析和拟合。通过基于Biacore的实验测量的指示的TF抗体的KD值示于表48。
如表48所示，来自第25组和第43组的抗hTF抗体表现出与猪TF和兔TF的结合活性和交叉反应性。相比之下，来自第1组和第29组的抗体未示出与猪TF或兔TF的结合活性。
表48：猪和兔TF的抗体动力学
抗体 KD,nM KD,nM
1G 无结合 无结合
25A 18.7 50.5
25A3 5.5 12.4
25A5 5.2 5.4
25A5-T 4.5 5.4
25G 26.0 75.5
25G1 2.6 3.6
25G9 3.3 4.2
29D 无结合 无结合
43D7 8.8 6.8
43D8 19.2 7.7
无结合*：无结合至弱结合，无可报告的KD
实施例37:抗TF抗体的表位鉴定
为了建立抗人TF抗体之间的表位结合差异，进行了嵌合TF构建体作图实验。该作图技术能够区分抗体表位。
因为评价的所有抗人TF抗体均不结合大鼠TF，所以将大鼠TF序列用于构建嵌合人-大鼠TF构建体。嵌合人-大鼠构建体设计由TF胞外结构域的N和C末端结构域(分别为胞外结构域的氨基酸1-107和108-219)指导，其中比对显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。基于使用来自国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652的图36的构建体进行的嵌合作图结果，大鼠氨基酸片段141至194被人序列(hTF胞外结构域的氨基酸136-189)替代，其中比对显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。设计三个具有1或2个人-大鼠取代的人TF构建体(hTF_K68N、hTF_K149N和hTF_N171H_T197K)是基于报告的10H10抗体的接触残基K68、K149、及N171和T197(Teplyakov等,Cell Signal.,2017,36:139-144)，其中比对显示在以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中。
为了建立抗人TF抗体与各种TF构建体的结合，用共表达TF构建体的DNA质粒和绿色荧光蛋白标记物转染HEK293细胞。对于抗体的子集，在选定的TF构建体上评价抗体滴定(250nM处开始的12点1:3稀释系列)(参见以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中)。这些抗体滴定表明，表51和表52中使用的15μg/ml(100nM)的抗体浓度适于建立“相对于hTF的抗体与TF构建体的结合百分比”。转染两天后，将细胞从组织培养板中收集，用15μg/ml指示的抗TF抗体进行染色，洗涤，用抗人IgG-Fc Alexa Fluor 647多克隆抗体染色，洗涤，并且用活力染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐染色。在流式细胞仪上获得80000个活事件后，分析用荧光标记物标记的活细胞的抗TF抗体染色的程度。每个TF表达构建体的相对于同种型对照的中值荧光强度值除以hTF表达构建体的相对于同种型对照的中值荧光强度值，并且所得百分数列为“相对于hTF的与TF构建体结合的抗体百分比”于表51和表52中。如本文所用，术语“活细胞染色测定”是指在此实施例中使用的抗体结合测定。
抗体集合中至少一种抗人TF抗体的所有TF构建体均满足所有嵌合TF构建体在细胞表面上表达的水平在hTF对照构建体的50％和150％之间的假设，除了h1-107_r构建体(人氨基酸片段1-107被大鼠序列取代)之外。预期抗人TF抗体与细胞表面表达的大鼠TF缺乏结合。当表51和表52中的“相对于hTF与TF构建体的抗体结合百分比”小于50％时，表53和表54中的抗体被认为是非结合物(0)。当表51和表52中的“相对于hTF与TF构建体的抗体结合百分比”在50％和150％之间时，5354中的抗体被认为是结合物(1)。
基于来自表53的未结合构建体的组合，将每种抗体分配给表55中的表位仓。来自谱系25的抗体(25A、25A3、25A5-T、25G1和25G9)结合独特的表位，在表55中称为表位仓6。来自谱系43的抗体(43B1、43D7、43D8和43Ea)还结合独特的表位，在表55中称为表位仓7。来自谱系29的抗体(29E)结合独特的表位，在表55中称为表位仓2。来自谱系39和54的抗体(39A和54E)结合独特的表位，在表55中称为表位仓3。
谱系25和43抗体是抗体组中唯一结合嵌合构建体r141-194_h的抗体，所述构建体中大鼠氨基酸141至194被人序列替代(表54)。此外，虽然M1593不能结合hTF_K68N，但是抗体组中所有其他抗体结合hTF_K68N(表54)。仅谱系25和43抗体不能结合hTF_K149N(表54)。仅谱系25抗体不能结合hTF_N171H_T197K(表54)。(参见以引用的方式整体并入本文的国际PCT申请PCT/US2019/012427和美国实用申请号16/959,652中)。
总之，这些结果指示，与所有其他测试的抗体相比，谱系25抗体结合人TF上的独特表位。与所有其他测试的抗体相比，谱系43抗体结合人TF上的独特表位。谱系25和谱系43抗体结合来自M1593的人TF上不同的表位。
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尽管本发明已参考优选实施方案和各种替代性实施方案加以特定显示和描述，但相关领域技术人员将了解可在不脱离本发明的精神和范围下在其中进行各种形式和细节变化。
在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请都据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
序列
表13:可变区序列
Figure BDA0004110303870002311
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Figure BDA0004110303870002321
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Figure BDA0004110303870002331
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Figure BDA0004110303870002341
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Figure BDA0004110303870002351
表14：共有可变区序列
Figure BDA0004110303870002352
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Figure BDA0004110303870002361
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Figure BDA0004110303870002371
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Figure BDA0004110303870002381
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Figure BDA0004110303870002391
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Figure BDA0004110303870002401
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Figure BDA0004110303870002411
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Figure BDA0004110303870002421
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Figure BDA0004110303870002431
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Figure BDA0004110303870002441
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Figure BDA0004110303870002451
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Figure BDA0004110303870002461
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Figure BDA0004110303870002471
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Figure BDA0004110303870002481
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Figure BDA0004110303870002491
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Figure BDA0004110303870002501
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Figure BDA0004110303870002511
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Figure BDA0004110303870002521
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Figure BDA0004110303870002531
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Figure BDA0004110303870002541
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Figure BDA0004110303870002551
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Figure BDA0004110303870002561
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Figure BDA0004110303870002571
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Figure BDA0004110303870002581
表36：人、食蟹猴和小鼠TF序列
Figure BDA0004110303870002591
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Figure BDA0004110303870002601
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Figure BDA0004110303870002611
表39：抗TF抗体的序列
Figure BDA0004110303870002612
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Figure BDA0004110303870002621
表41：猪TF序列
Figure BDA0004110303870002622
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Figure BDA0004110303870002631
表49：兔TF序列
Figure BDA0004110303870002632
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Figure BDA0004110303870002641
表56：大鼠TF ECD和嵌合构建体ECD序列
Figure BDA0004110303870002642
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Figure BDA0004110303870002651
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Figure BDA0004110303870002661
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Figure BDA0004110303870002671
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Figure BDA0004110303870002681
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Figure BDA0004110303870002691
表57：可变区序列共有
Figure BDA0004110303870002692
表58：共有CDR
Figure BDA0004110303870002701
*示例性CDR序列涵盖了由Kabat加Chothia确定的氨基酸
表59：TF抗体的抗体序列
可变区呈粗体；参与药物缀合的半胱氨酸加下划线。表13中的克隆具有相同的重链恒定区。表13中的克隆具有相同的轻链恒定区。
Figure BDA0004110303870002702
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Figure BDA0004110303870002711
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Figure BDA0004110303870002721
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Figure BDA0004110303870002731
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Figure BDA0004110303870002741
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Figure BDA0004110303870002751
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Claims (144)

1.一种治疗有需要的受试者的炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用经分离的抗体，其中所述抗体结合至人组织因子(TF)的胞外结构域，其中所述抗体在与由人FVIIa结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒感染是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述炎性疾病选自：结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和呼吸道合胞病毒(RSV)。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述炎性疾病是结肠炎。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述炎性疾病是炎性肠病(IBD)。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述炎性疾病是关节炎。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述炎性疾病是急性肺损伤。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述炎性疾病是ARDS。
9.如权利要求3所述的方法，其中所述炎性疾病是RSV。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述炎性疾病是心血管疾病或损伤。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述心血管疾病或损伤是心肌梗死。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述炎性疾病是与蛋白酶激活受体2(PAR-2)的上调相关的心血管疾病。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述抗体不抑制如由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中与包含SEQ IDNO:821的VH序列和SEQ IDNO:822的VL序列的参考抗体相比，所述经分离的人抗体不抑制或在较低程度上抑制如由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成。
15.如权利要求14所述的方法，其中如通过在活细胞染色测定中所述经分离的抗体相对于同种型对照的中值荧光强度值所确定的，所述经分离的抗体与包含SEQ ID NO:810所示序列的氨基酸残基149处的突变的变体TF胞外结构域之间的结合小于所述经分离的抗体与SEQ ID NO:810所示序列的TF的胞外结构域之间的结合的50％。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述抗体包含来自表35中的抗体组的所有三个重链互补决定区(CDR)和所有三个轻链CDR，其中所述所有三个重链CDR和所述所有三个轻链CDR来自同一抗体组。
17.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述抗体包含来自表15-34中任一个中的抗体的所有三个重链互补决定区(CDR)和所有三个轻链CDR，其中所述所有三个重链CDR和所述所有三个轻链CDR来自同一抗体。
18.如权利要求17所述的方法，其包含来自以下抗体的所有三个CDR和所有三个轻链CDR：定名为25A的抗体、定名为25A5的抗体、定名为25A5-T的抗体、定名为25G的抗体、定名为25G1的抗体、定名为25G9的抗体、定名为43B的抗体、定名为43B1的抗体、定名为43B7的抗体、定名为43D的抗体、定名为43D7的抗体、定名为43D8的抗体、定名为43E的抗体或定名为43Ea的抗体。
19.如权利要求18所述的方法，其包含来自以下抗体的所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR：所述定名为43B的抗体、所述定名为43B1的抗体、所述定名为43B7的抗体、所述定名为43D的抗体、所述定名为43D7的抗体、所述定名为43D8的抗体、所述定名为43E的抗体或所述定名为43Ea的抗体。
20.如权利要求18所述的方法，其包含来自以下抗体的所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR：所述定名为25A的抗体、所述定名为25A5的抗体、所述定名为25A5-T的抗体、所述定名为25G的抗体、所述定名为25G1的抗体或所述定名为25G9的抗体。
21.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述抗体包含来自表14的VH结构域序列和VL结构域序列，其中所述VH结构域序列和所述VL结构域序列来自表14中的同一组。
22.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述抗体包含来自表13的VH结构域序列和VL结构域序列，其中所述VH结构域序列和所述VL结构域序列来自表13中的同一克隆。
23.如权利要求1或13所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:797中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:798中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:799中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:800中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:801中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:802中列出的序列的VL-CDR3。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:571中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:572中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:573中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:574中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:575中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:576中列出的序列的VL-CDR3。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:609中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:610中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:611中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:612中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:613中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:614中列出的序列的VL-CDR3。
26.如权利要求1至13和权利要求23中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQID NO:769中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:770中列出的序列的VL序列。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:569中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:570中列出的序列的VL序列。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:607中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:608中列出的序列的VL序列。
29.如权利要求24或28所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:924中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO:925中列出的序列的轻链。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:645中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:646中列出的序列的VL序列。
31.如权利要求25或30所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:926中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO:927中列出的序列的轻链。
32.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:779中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:780中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:781中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:782中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:783中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:784中列出的序列的VL-CDR3。
33.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:872中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:873中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:874中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:875中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:876中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:877中列出的序列的VL-CDR3。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:884中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:885中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:886中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:887中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:888中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:889中列出的序列的VL-CDR3。
35.如权利要求1至16和33中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:868中列出的序列的VH序列和包含SEQ IDNO:869中列出的序列的VL序列。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:189中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:190中列出的序列的VL序列。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:836中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:837中列出的序列的VL序列。
38.如权利要求34或37所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:920中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO:921中列出的序列的轻链。
39.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:878中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:879中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:880中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:881中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:882中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:883中列出的序列的VL-CDR3。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:267中列出的序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO:268中列出的序列的VH-CDR2；包含SEQ ID NO:269中列出的序列的VH-CDR3；包含SEQ ID NO:270中列出的序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO:271中列出的序列的VL-CDR2；以及包含SEQ ID NO:272中列出的序列的VL-CDR3。
41.如权利要求1至16和39中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:870中列出的序列的VH序列和包含SEQ IDNO:871中列出的序列的VL序列。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ IDNO:303中列出的序列的VH序列和包含SEQ ID NO:304中列出的序列的VL序列。
43.如权利要求40或42所述的方法，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:922中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO:923中列出的序列的轻链。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体与以下抗体竞争结合至人TF：所述定名为25A的抗体、所述定名为25A5的抗体、所述定名为25A5-T的抗体、所述定名为25G的抗体、所述定名为25G1的抗体、所述定名为25G9的抗体、所述定名为43B的抗体、所述定名为43B1的抗体、所述定名为43B7的抗体、所述定名为43D的抗体、所述定名为43D7的抗体、所述定名为43D8的抗体、所述定名为43E的抗体或所述定名为43Ea的抗体。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述抗体与以下抗体竞争结合至人TF：所述定名为43B的抗体、所述定名为43B1的抗体、所述定名为43B7的抗体、所述定名为43D的抗体、所述定名为43D7的抗体、所述定名为43D8的抗体、所述定名为43E的抗体或所述定名为43Ea的抗体。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述抗体与以下抗体竞争结合至人TF：所述定名为25A的抗体、所述定名为25A5的抗体、所述定名为25A5-T的抗体、所述定名为25G的抗体、所述定名为25G1的抗体或所述定名为25G9的抗体。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体与由以下抗体结合的同一人TF表位结合：所述定名为25A的抗体、所述定名为25A5的抗体、所述定名为25A5-T的抗体、所述定名为25G的抗体、所述定名为25G1的抗体、所述定名为25G9的抗体、所述定名为43B的抗体、所述定名为43B1的抗体、所述定名为43B7的抗体、所述定名为43D的抗体、所述定名为43D7的抗体、所述定名为43D8的抗体、所述定名为43E的抗体或所述定名为43Ea的抗体。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述抗体与由以下抗体结合的同一人TF表位结合：所述定名为43B的抗体、所述定名为43B1的抗体、所述定名为43B7的抗体、所述定名为43D的抗体、所述定名为43D7的抗体、所述定名为43D8的抗体、所述定名为43E的抗体或所述定名为43Ea的抗体。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述抗体与由以下抗体结合的同一人TF表位结合：所述定名为25A的抗体、所述定名为25A5的抗体、所述定名为25A5-T的抗体、所述定名为25G的抗体、所述定名为25G1的抗体或所述定名为25G9的抗体。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体不抑制如由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；与同种型对照相比，不降低凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；与同种型对照相比，不增加从所述测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；与同种型对照相比，不降低如由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；允许如由凝血酶生成测定(TGA)确定的人凝血酶生成；与同种型对照相比，保持凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值(峰值IIa)；与同种型对照相比，保持从所述测定开始到凝血酶生成曲线上的凝血酶峰值的时间(ttPeak)；与同种型对照相比，保留如由凝血酶生成曲线下面积确定的内源性凝血酶潜能(ETP)；在与由人FX结合的人TF结合位点不同的人TF结合位点处结合人TF；不干扰TF:FVIIa将FX转化为FXa的能力；并且不与FVIIa竞争结合至人TF。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用示例性、Kabat、Chothia、AbM、Contact或IMGT编号来确定所述三个重链CDR和所述三个轻链CDR。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体特异性地结合至食蟹猴TF。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体特异性地结合至小鼠TF。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体特异性地结合至兔TF。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体特异性地结合至猪TF。
56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疾病涉及血管炎症。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疾病涉及局部炎症。
58.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疾病涉及全身炎症。
59.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疾病涉及单个核细胞和/或粒细胞的浸润。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述单个核细胞包括巨噬细胞和/或淋巴细胞。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述粒细胞包括嗜中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞。
62.如权利要求1和13-61中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：结肠炎、炎性肠病、关节炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、呼吸道合胞病毒(RSV)、心肌梗死和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
63.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体减少总白细胞计数。
64.如权利要求63所述的方法，其中通过光学显微术测定总白细胞计数。
65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体减少粒细胞的总数。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述粒细胞包括嗜中性粒细胞。
67.如权利要求65或66所述的方法，其中所述粒细胞包括嗜酸性粒细胞。
68.如权利要求65至67中任一项所述的方法，其中通过免疫组织化学(IHC)分析或支气管肺泡灌洗(BAL)液分类细胞计数测定粒细胞的总数。
69.如权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述粒细胞在肺泡中。
70.如权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述粒细胞在间质液中。
71.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体减少单个核细胞的总数。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述单个核细胞包括巨噬细胞。
73.如权利要求71或72所述的方法，其中所述巨噬细胞包括M1巨噬细胞。
74.如权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述单个核细胞包括淋巴细胞。
75.如权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述单个核细胞包括单核细胞。
76.如权利要求71至74中任一项所述的方法，其中通过免疫组织化学(IHC)分析或支气管肺泡灌洗(BAL)液分类细胞计数测定单个核细胞的总数。
77.如权利要求71至76中任一项所述的方法，其中所述单个核细胞在肺泡中。
78.如权利要求71至76中任一项所述的方法，其中所述单个核细胞在间质液中。
79.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述受试者相对于基线水平维持或增加体重。
80.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂维持或增加体重。
81.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减小脾大小或逆转脾肿大。
82.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减小所述脾大小或逆转所述脾肿大。
83.如权利要求81或82所述的方法，其中使用触诊、叩诊、超声、计算机断层摄影术(CT)扫描或磁共振成像(MRI)来测定所述脾大小或脾肿大。
84.如权利要求1和13-83中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是急性肺损伤。
85.如权利要求1和13-83中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
86.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平增加净肺泡液清除率。
87.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂增加净肺泡液清除率。
88.如权利要求86或87所述的方法，其中通过测量连续水肿液蛋白质浓度来测定净肺泡液清除率。
89.如权利要求88所述的方法，其中用ELISA测量所述连续水肿液蛋白质浓度。
90.如权利要求1和13-83中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是SARS-Cov-2。
91.如权利要求90所述的方法，其中在施用于受试者后，所述受试者相对于基线水平维持或增加体重。
92.如权利要求90或91所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂维持或增加体重。
93.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。
94.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。
95.如权利要求93或94所述的方法，其中所述炎性细胞因子和趋化因子在支气管肺泡灌洗(BAL)样品中。
96.如权利要求93至95中任一项所述的方法，其中所述炎性细胞因子和趋化因子在肺匀浆样品中。
97.如权利要求93至96中任一项所述的方法，其中所述炎性细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、GM-CSF、TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL19、CCL20、CCL25、CXCL1、CXCL2和CXCL10。
98.如权利要求93至96中任一项所述的方法，其中所述炎性细胞因子和趋化因子包括VEGF。
99.如权利要求93至96中任一项所述的方法，其中所述炎性细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：GM-CSF、VEGF、IL17F、IL-1β、IL-6、IFNγ、IL-8和KC。
100.如权利要求93至98中任一项所述的方法，其中使用ELISA测量所述炎性细胞因子和趋化因子。
101.如权利要求93至98中任一项所述的方法，其中使用Luminex多重测定测量所述炎性细胞因子和趋化因子。
102.如权利要求1和13-83中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是病毒感染。
103.如权利要求102所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平增加抗炎细胞因子和趋化因子。
104.如权利要求102或103所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂增加抗炎细胞因子和趋化因子。
105.如权利要求102-104中任一项所述的方法，其中所述抗炎细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：IL-10和IL27p28。
106.如权利要求102-105中任一项所述的方法，其中所述抗炎细胞因子和趋化因子在支气管肺泡灌洗(BAL)样品中。
107.如权利要求102-106中任一项所述的方法，其中使用多重电化学发光MSD测定来测量所述炎性细胞因子和趋化因子。
108.如权利要求102-106中任一项所述的方法，其中使用Luminex多重测定测量所述炎性细胞因子和趋化因子。
109.如权利要求1至83和86至101中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是RSV。
110.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减少肺中的纤维化。
111.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减少肺中的纤维化。
112.如权利要求110或111所述的方法，其中通过IHC分析测定所述纤维化。
113.如权利要求110或111所述的方法，其中通过定量高分辨率计算机断层摄影术(qHRCT)测定所述纤维化。
114.如权利要求1和13-83中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是关节炎。
115.如114所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。
116.如114或115所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。
117.如权利要求115或116所述的方法，其中所述炎性细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、GM-CSF、TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5 CCL19、CCL20、CCL25、CXCL1、CXCL2和CXCL10。
118.如权利要求1和13-83中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是结肠炎。
119.如权利要求1和13-83中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是炎性肠病。
120.如权利要求118或119所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体导致正常粪便稠度或使受试者的粪便稠度相对于基线水平变硬。
121.如权利要求118至120中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂导致正常粪便稠度或使受试者的粪便稠度变硬。
122.如权利要求120或121所述的方法，其中使用布里斯托粪便量表测定所述粪便稠度。
123.如权利要求118至122中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减少所述受试者粪便中的血液或使得所述受试者粪便中没有血液。
124.如权利要求118至123中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减少所述受试者粪便中的血液或使得所述受试者粪便中没有血液。
125.如权利要求123或124所述的方法，其中使用隐血测试测量所述受试者粪便中的血液。
126.如权利要求118至125中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。
127.如118或126所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂降低炎性细胞因子和趋化因子的浓度。
128.如权利要求126或127所述的方法，其中所述炎性细胞因子和趋化因子包括以下中的一种或多种：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、GM-CSF、TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL19、CCL20、CCL25、CXCL1、CXCL2和CXCL10。
129.如权利要求1和13-83中任一项所述的方法，其中所述炎性疾病是心肌梗死。
130.如权利要求129所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减小梗死面积。
131.如权利要求129或130所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减小梗死面积。
132.如权利要求129-131所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平增加左心室射血分数。
133.如权利要求129-132所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂增加左心室射血分数。
134.如权利要求129-133所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平降低左心室舒张末期容积。
135.如权利要求129-134所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂降低左心室舒张末期容积。
136.如权利要求129-135所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于基线水平减少梗死心肌中的炎性细胞募集。
137.如权利要求129-136所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体相对于不同的抗炎治疗剂减少梗死心肌中的炎性细胞募集。
138.如权利要求136或137所述的方法，其中所述炎性细胞选自CD45+、CD11b+、Ly6Chi、CD45+/CD90.2-/NK1.1-/CD11b+、CD45+/CD90.2-/NK1.1-/CD11b+/Ly6Chi和CD45+/CD90.2-/NK1.1-/CD11b+/Ly6Clo。
139.如权利要求136-138中任一项所述的方法，其中使用流式细胞术测量所述炎性细胞募集。
140.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用于受试者后，所述抗体导致对全身性类固醇的需求减少。
141.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同的抗炎治疗剂包括以下中的一种或多种：非类固醇抗炎药物(NSAID)、类固醇抗炎药物、β-激动剂、抗胆碱能剂、抗组胺药和甲基黄嘌呤。
142.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同的抗炎治疗剂包括以下中的任一种：IL-6抑制剂、抗GM-CSF、抗TNFa、抗IL-1a、地塞米松、趋化因子和趋化因子受体拮抗剂以及JAK抑制剂。
143.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每两周一次施用所述抗体。
144.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每周一次施用所述抗体。
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