JP2014515922A - Ｍａｓｐ−２依存性の補体活性化を阻害するための組成物 - Google Patents

Ｍａｓｐ−２依存性の補体活性化を阻害するための組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害する際に使用するための、抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体およびそのような抗体を含む組成物に関する。１つの態様において、本発明は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、その重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ３配列は、さらなる副経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）を形成する際にＢ因子とともに配置されるアミノ酸配列を含む。その副経路Ｃ３コンバターゼは、プロパージンの結合によって安定化される。プロパージンは、副経路Ｃ３コンバターゼの半減期を６〜１０倍延長する。副経路Ｃ３コンバターゼにＣ３ｂが付加することにより、副経路Ｃ５コンバターゼが形成される。

Description

発明の分野
本発明は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害する際に使用するための、抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体およびそのような抗体を含む組成物に関する。
関連出願への相互参照
この出願は、２０１１年５月４日に出願された仮出願第６１／４８２，５６７号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
配列表に関する陳述
本願に付随する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供してあり、本明細書によって本明細書中に参考として援用される。その配列表を含むテキストファイルの名称は、ＭＰ＿１＿０１１５＿ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇａｓＦｉｌｅｄ＿２０１２０５０４＿ＳＴ２５である。このテキストファイルは、１５８ＫＢであり；２０１２年５月４日に作成され；本明細書の出願とともにＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されている。
背景
補体系は、ヒトおよび他の脊椎動物において、微生物感染および他の急性の侵襲に対する免疫応答を開始、増幅および指揮する、初期に作用する機構をもたらす（非特許文献１）。補体活性化は、潜在的な病原体に対する重要な第１線の防御を提供するが、防御免疫応答を促進する補体の活性は、宿主に対する潜在的な脅威でもあり得る（非特許文献２；非特許文献３）。例えば、Ｃ３タンパク分解産物およびＣ５タンパク分解産物は、好中球を動員（ｒｅｃｒｕｉｔ）し、活性化する。活性化された好中球は、宿主防御に不可欠であるが、破壊性酵素の放出において無差別であり、臓器の損傷を引き起こし得る。さらに、補体活性化は、宿主細胞の近傍、ならびに微生物の標的上において溶解性補体成分の沈着を引き起こし得、その結果、宿主細胞が溶解される。
補体系は、心筋梗塞、脳卒中、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、再灌流損傷、敗血症性ショック、熱傷後の毛細血管漏出、心肺バイパス術後の炎症、移植片拒絶、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症およびアルツハイマー病を含む、多くの急性および慢性の疾患状態の病原にも結びつけられている。これらの状態のほとんどすべてにおいて、補体は、原因ではないが、病原に関与するいくつかの因子のうちの１つである。それにもかかわらず、補体活性化は、主要な病理学的機構であり得、これらの疾患状態の多くにおいて、臨床上の管理に関する有効な事項である。
種々の疾患状態における補体媒介性の組織損傷の重要性の認識が高まることにより、有効な補体阻害薬物に対する必要性が強調される。現在までに、Ｃ５に対する抗体であるＥｃｕｌｉｚｕｍａｂ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））が、ヒトでの使用が認可された唯一の補体標的薬物である。けれども、Ｃ５は、補体系の「下流」に位置するいくつかのエフェクター分子の１つであり、Ｃ５の遮断は、補体系の活性化を阻害しない。ゆえに、補体活性化の開始工程のインヒビターが、「下流の」補体インヒビターにまさる有意な利点を有するだろう。
現在、補体系が、３つの別々の経路：古典経路、レクチン経路および副経路を介して活性化され得ることは、広く認知されている。通常、古典経路は、外来性粒子（すなわち、抗原）に結合した宿主抗体から構成される複合体によって誘発され、したがって、特異的な抗体応答を起こすためには抗原への事前の曝露が必要である。古典経路の活性化は、宿主による事前の適応免疫応答に依存するので、古典経路は、獲得免疫系の一部である。対照的に、レクチン経路と副経路の両方は、適応免疫とは無関係であり、先天性免疫系の一部である。
補体系の活性化によって、セリンプロテアーゼチモーゲンの連続的な活性化がもたらされる。古典経路の活性化における第１工程は、特異的な認識分子であるＣ１ｑが、抗原に結合したＩｇＧおよびＩｇＭ複合体に結合することである。Ｃ１ｑは、Ｃ１と呼ばれる複合体として、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓセリンプロテアーゼプロ酵素と会合する。Ｃ１ｑが免疫複合体と結合すると、Ｃ１ｒのＡｒｇ−Ｉｌｅ部位が自己タンパク分解性切断され、その後、Ｃ１ｒの媒介によりＣ１ｓが切断および活性化され、それによって、Ｃ４およびＣ２を切断する能力を獲得する。Ｃ４は、２つのフラグメント（Ｃ４ａおよびＣ４ｂと命名されている）に切断され、同様に、Ｃ２は、Ｃ２ａおよびＣ２ｂに切断される。Ｃ４ｂフラグメントは、隣接するヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができるようになり、活性化Ｃ２のＣ２ａフラグメントとの非共有結合性の相互作用によってＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）を生成することができるようになる。Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）は、Ｃ３ａおよびＣ３ｂ小成分へのタンパク分解性切断によってＣ３を活性化してＣ５コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ３ｂ）を生成させ、それは、Ｃ５を切断することによって、細胞膜を破壊して細胞溶解をもたらすことができる細胞膜傷害複合体（「ＭＡＣ」とも呼ばれる、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９と組み合わされたＣ５ｂ）を形成する。Ｃ３およびＣ４の活性型（Ｃ３ｂおよびＣ４ｂ）は、複数の貧食細胞上の補体レセプターによって認識される外来性の標的表面上に共有結合的に沈着する。
上記とは無関係に、レクチン経路による補体系の活性化における第１段階もまた、特異的な認識分子の結合、それに続く関連するセリンプロテアーゼプロ酵素の活性化である。しかしながら、レクチン経路における認識分子は、Ｃ１ｑによる免疫複合体の結合ではなく、炭水化物結合タンパク質（マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）、Ｈ−フィコリン（ｆｉｃｏｌｉｎ）、Ｍ−フィコリン、Ｌ−フィコリンおよびＣ型レクチンＣＬ−１１）の群（集合的にレクチンと呼ばれる）を含む。非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６を参照のこと。非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；Ｈａｎｓｅｎ Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １８５（１０）：６０９６−６１０４（２０１０）もまた参照のこと。
Ｉｋｅｄａらは、Ｃ１ｑと同様に、ＭＢＬが、酵母マンナン被覆赤血球に結合するとＣ４依存性様式において補体系を活性化することができることを初めて証明した（非特許文献７）。コレクチンタンパク質ファミリーのメンバーであるＭＢＬは、ピラノース環の赤道方向に配向した３−ヒドロキシ基および４−ヒドロキシ基によって炭水化物と結合するカルシウム依存性レクチンである。従って、ＭＢＬに対する卓越したリガンドは、Ｄ−マンノースおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンであるが、この立体的な要件を満たさない炭水化物は、ＭＢＬに対して検出可能な親和性を有しない（非特許文献８）。ＭＢＬと一価の糖との相互作用は、非常に弱く、解離定数は、代表的には一桁のミリモル濃度の範囲である。ＭＢＬは、互いに密接に位置する複数の単糖残基とのアビディティによって、すなわち、同時に相互作用することによってグリカンリガンドに対する堅固で特異的な結合を達成する（非特許文献９）。ＭＢＬは、通常、微生物（例えば、細菌、酵母、寄生生物およびある特定のウイルス）が有する炭水化物パターンを認識する。対照的に、ＭＢＬは、哺乳動物の血漿中の糖タンパク質および細胞表面糖タンパク質の上に存在する「成熟した」複雑な複合糖質が通常有する、末端から２番目の糖ならびに末端の糖であるＤ−ガラクトースおよびシアル酸を認識しない。この結合特異性は、「外来」表面の認識を促進し、自己活性化からの保護を助けていると考えられている。しかしながら、ＭＢＬは、哺乳動物細胞の小胞体およびゴルジ内に隔離されたＮ結合型糖タンパク質および糖脂質の上の高マンノース「前駆体」グリカンの集団と高い親和性で結合する（非特許文献１０）。したがって、損傷した細胞は、ＭＢＬ結合を介してレクチン経路活性化に対する標的となり得る。
フィコリンは、フィブリノゲン様ドメインと呼ばれる、ＭＢＬとは異なるタイプのレクチンドメインを有する。フィコリンは、Ｃａ＋＋非依存性様式で糖残基と結合する。ヒトにおいては、３種類のフィコリン（Ｌ−フィコリン、Ｍ−フィコリンおよびＨ−フィコリン）が同定されている。２つの血清フィコリン、Ｌ−フィコリンおよびＨ−フィコリンが、共通してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに対する特異性を有する；しかしながら、Ｈ−フィコリンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンとも結合する。Ｌ−フィコリンとＨ−フィコリンとＣＬ−１１とＭＢＬとの糖特異性の違いは、様々なレクチンが相補的であり得、異なるが重複する複合糖質を標的化し得ることを意味する。この概念は、Ｌ−フィコリンだけが、すべてのグラム陽性細菌上に見られる細胞壁複合糖質であるリポテイコ酸に特異的に結合するという、レクチン経路における公知のレクチンに関する最近の報告によって支持されている（非特許文献１１）。コレクチン（すなわち、ＭＢＬ）およびフィコリンは、アミノ酸配列に有意な類似性を有しない。しかしながら、この２群のタンパク質は、類似のドメイン組成を有し、そして、Ｃ１ｑと同様に、複数部位での結合の可能性を最大にするオリゴマー構造に構築されている。
ＭＢＬの血清濃度は、健常集団において非常に変動するものであり、これは、ＭＢＬ遺伝子のプロモーターおよびコード領域の両方における多型／変異によって遺伝的に制御されている。急性期タンパク質として、ＭＢＬの発現は、炎症中にさらにアップレギュレートされる。Ｌ−フィコリンは、ＭＢＬと同様の濃度で血清中に存在する。したがって、レクチン経路のＬ−フィコリンブランチ（ｂｒａｎｃｈ）は、潜在的にＭＢＬアームに匹敵する強度である。ＭＢＬおよびフィコリンは、オプソニンとしても機能し得、このオプソニンによって、貧食細胞が、ＭＢＬおよびフィコリンを有する表面を標的化することが可能になる（Ｊａｃｋら、Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．，７７（３）：３２８−３６（２００４）；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ａｎｄ Ｆｕｊｉｔａ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０５（４−５）：４９０−７（２００２）；Ａｏｙａｇｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４（１）：４１８−２５（２００５）を参照のこと）。このオプソニン化には、これらのタンパク質と貧食細胞レセプターとの相互作用が必要である（Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７３３，１９８９；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２４４８−５４，１９９６）が、それらの正体は確立されていない。
ヒトＭＢＬは、そのコラーゲン様ドメインを介して、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）と呼ばれる、固有のＣｌｒ／Ｃｌｓ様セリンプロテアーゼとの特異的かつ高親和性の相互作用を形成する。現在までに、３つのＭＡＳＰが、報告されている。初めに、単一酵素「ＭＡＳＰ」が同定され、補体カスケードの開始（すなわち、Ｃ２およびＣ４の切断）に関与する酵素として特徴付けられた（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｍ ａｎｄ Ｆｕｊｉｔａ Ｔ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７６（６）：１４９７−１５０２（１９９２），Ｊｉ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５７１−５７８，１９９３）。後に、ＭＡＳＰ活性は、実際に、２つのプロテアーゼ：ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２の混合物であることが決定された（Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：５０６−５１０，１９９７）。しかしながら、補体活性化にはＭＢＬ−ＭＡＳＰ−２複合体単独で十分であることが証明された（Ｖｏｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２０９３−２１００，２０００）。さらに、ＭＡＳＰ−２のみが、高い割合でＣ２およびＣ４を切断した（Ａｍｂｒｕｓ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１３７４−１３８２，２００３）。したがって、ＭＡＳＰ−２は、Ｃ３コンバターゼであるＣ４ｂ２ａを生成するＣ４およびＣ２の活性化を担うプロテアーゼである。これは、２つの特異的なセリンプロテアーゼ（Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）の協調作用によって補体系の活性化がもたらされる、古典経路のＣ１複合体とは著しく異なるものである。さらに、第３の新規プロテアーゼであるＭＡＳＰ−３が単離された（Ｄａｈｌ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５：１２７−３５，２００１）。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、同じ遺伝子が選択的にスプライシングされた産物である。
ＭＡＳＰは、Ｃ１複合体の酵素成分であるＣ１ｒおよびＣ１ｓの組成と同一のドメイン組成を共有する（Ｓｉｍ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２０００年，第２８巻，ｐ．５４５）。これらのドメインとしては、Ｎ末端のＣ１ｒ／Ｃ１ｓ／ウニＶＥＧＦ／骨形態形成タンパク質（ＣＵＢ）ドメイン、上皮成長因子様ドメイン、第２ＣＵＢドメイン、タンデム型の補体制御タンパク質ドメインおよびセリンプロテアーゼドメインが挙げられる。Ｃ１プロテアーゼにおけるように、ＭＡＳＰ−２の活性化は、セリンプロテアーゼドメインに隣接したＡｒｇ−Ｉｌｅ結合の切断によって生じ、それにより、その酵素が、ジスルフィド結合したＡ鎖およびＢ鎖（後者は、セリンプロテアーゼドメインからなる）に分離する。最近、ＭＡＳＰ−２の遺伝的欠損が報告された（Ｓｔｅｎｇａａｒｄ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００３年，第３４９巻，ｐ．５５４−５６０）。単一のヌクレオチドの変異により、ＣＵＢ１ドメインにおけるＡｓｐ−Ｇｌｙ交換が生じ、ＭＡＳＰ−２は、ＭＢＬに結合できなくなる。
ＭＢＬは、１９ｋＤａのＭＢＬ関連タンパク質（ＭＡｐ１９）（Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３４８１−９０，１９９９）、またはＭＡＳＰ−２の触媒活性を欠く低分子ＭＢＬ関連タンパク質（ｓＭＡＰ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：８５９−８６３，１９９９）として知られるＭＡＳＰ−２の選択的スプライシングされた形態にも関連し得る。ＭＡｐ１９は、ＭＡＳＰ−２の最初の２つのドメインに続いて独特の４アミノ酸の余分な配列を含む。ＭＡＳＰ１遺伝子およびＭＡＳＰ２遺伝子は、それぞれヒト３番染色体およびヒト１番染色体上に位置する（Ｓｃｈｗａｅｂｌｅ，Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０５：４５５−４６６，２００２）。
いくつかの一連の証拠から、異なるＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体が存在し、血清中のＭＡＳＰのうちの大部分は、ＭＢＬと複合体形成しないことが示唆されている（Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００年，第１６５巻，ｐ．８７８−８８７）。Ｈ−フィコリンおよびＬ−フィコリンの両方が、全てのＭＡＳＰと結合し、そしてＭＢＬと同様に、レクチン補体経路を活性化する（Ｄａｈｌ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１年，第１５巻，ｐ．１２７−３５；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２年，第１６８巻，ｐ．３５０２−３５０６）。レクチン経路および古典経路の両方が、共通のＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）を形成し、この２つの経路は、この段階において合流する。
レクチン経路は、ナイーブな宿主における感染に対する宿主防御において主要な役割を有すると広く考えられている。宿主防御におけるＭＢＬの関与の強力な証拠は、機能的ＭＢＬの血清レベルが低い患者の解析によるものである（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，Ｄ．Ｃ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２年，第１５７２巻，ｐ．４０１−４１３）。そのような患者は、再発性の細菌感染および真菌感染に対して感受性を示す。これらの症状は、通常、母性由来の抗体価が衰退するが、抗体応答の完全なレパートリーが発生する前の、明らかに無防備な時期の間の生後まもなくに明らかになる。この症候群は、ＭＢＬオリゴマーの適正な形成を干渉する、ＭＢＬのコラーゲン性部分におけるいくつかの部位における変異から生じることが多い。しかしながら、ＭＢＬは、補体とは無関係のオプソニンとして機能し得るので、感染症に対する罹患率の上昇が、補体活性化の障害に起因する程度は不明である。
古典経路およびレクチン経路とは対照的に、Ｃ１ｑおよびレクチンが他の２経路において行う認識機能を果たす副経路のイニシエーターは、見出されていない。現在、副経路は、自発的な補体活性化を抑制する適正な分子エレメントを欠く外来性表面または他の異常な表面（細菌、酵母、ウイルスに感染した細胞または損傷組織）上で容易に増幅され得る低レベルの代謝回転の活性化を自発的に起こすことが広く認識されている。副経路の活性化に直接関与する４つの血漿タンパク質が存在する：Ｃ３、Ｂ因子およびＤ因子ならびにプロパージン。非感染性ヒト疾患の病原が、補体古典経路および補体副経路の両方と関係するという広範な証拠が存在するが、レクチン経路の役割は、評価され始めたところである。最近の研究から、レクチン経路の活性化が、虚血／再灌流損傷における補体活性化および関連する炎症に関与し得るという証拠がもたらされた。Ｃｏｌｌａｒｄら（２０００）は、酸化ストレスに供された培養内皮細胞が、ＭＢＬに結合し、ヒト血清に曝露されたときにＣ３の沈着を示すと報告した（Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０００年，第１５６巻，ｐ．１５４９−１５５６）。さらに、遮断抗ＭＢＬモノクローナル抗体によるヒト血清の処理により、ＭＢＬ結合および補体活性化が阻害された。これらの知見は、心筋虚血再灌流のラットモデルにまで拡大され、そのモデルでは、ラットＭＢＬに対して産生された遮断抗体で処置されたラットは、コントロール抗体で処置されたラットよりも冠状動脈の閉塞時における心筋の損傷が有意に小さいことを示した（Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００１年，第１０４巻，ｐ．１４１３−１４１８）。酸化ストレス後の血管内皮へのＭＢＬ結合の分子機構は、不明である；最近の研究では、酸化ストレス後のレクチン経路の活性化は、複合糖質に対してではなく血管内皮サイトケラチンへのＭＢＬ結合によって媒介され得ることが示唆されている（Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００１年，第１５９巻，ｐ．１０４５−１０５４）。他の研究は、古典経路および副経路が虚血／再灌流損傷の病原に関わり、この疾患におけるレクチン経路の役割は、未だ議論の余地があるとしている（Ｒｉｅｄｅｒｍａｎｎ，Ｎ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００３年，第１６２巻，ｐ．３６３−３６７）。
最近の研究では、ＭＡＳＰ−１が（およびおそらくＭＡＳＰ−３も）、副経路活性化酵素であるＤ因子を、そのチモーゲン型からその酵素的に活性な形態に変換するために必要であることが示された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７（１）：２９−３７（２０１０）を参照のこと）。このプロセスの生理学的重要性は、ＭＡＳＰ−１／３欠損マウスの血漿には副経路の機能活性が無いことによって明確にされている。副経路が機能するためには、ネイティブＣ３からのＣ３ｂのタンパク分解性の生成が必要である。副経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）は、必須のサブユニットとしてＣ３ｂを含むので、副経路における最初のＣ３ｂの起源に関する疑問が、不可解な問題をもたらし、相当な研究を刺激している。
Ｃ３は、チオエステル結合として知られている珍しい翻訳後修飾を含むタンパク質のファミリーに属している（Ｃ４およびα−２マクログロブリンとともに）。チオエステル基は、３アミノ酸離れたシステインのスルフヒドリル基と共有結合性のチオエステル結合を形成する末端カルボニル基を有するグルタミンから構成される。この結合は、不安定であり、求電子性のグルタミル−チオエステルは、ヒドロキシルまたはアミノ基などの求核性部分と反応し得るので、他の分子と共有結合を形成し得る。チオエステル結合は、インタクトなＣ３の疎水性ポケット内に隔離されるとき、当然のことながら安定である。しかしながら、Ｃ３からＣ３ａおよびＣ３ｂへのタンパク分解性切断によって、Ｃ３ｂ上の非常に反応性であるチオエステル結合が露出し、ヒドロキシルまたはアミノ基を含む隣接部分による求核攻撃後に、Ｃ３ｂは、標的と共有結合的に結合するようになる。Ｃ３ｂと補体標的との共有結合における十分に実証されている役割に加えて、Ｃ３チオエステルは、副経路を誘発する際の中心的役割を担うとも考えられている。広く認知されている「チックオーバー理論」によれば、副経路は、流体相コンバターゼであるｉＣ３Ｂｂの生成によって開始され、このｉＣ３Ｂｂは、加水分解されたチオエステル（ｉＣ３；Ｃ３（Ｈ２Ｏ））およびＢ因子とともにＣ３から形成される（Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９８４年，第７巻，ｐ．１４３−１６２）。Ｃ３ｂ様Ｃ３（Ｈ２Ｏ）は、タンパク質中の内部チオエステルのゆっくりとした自発的な加水分解によってネイティブＣ３から生成される（Ｐａｎｇｂｕｒｎ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８１年，第１５４巻，ｐ．８５６−８６７）。Ｃ３（Ｈ２Ｏ）Ｂｂコンバターゼの活性によって、Ｃ３ｂ分子が標的表面上に沈着され、それによって副経路が開始する。
副経路活性化のイニシエーターについて知られていることは、非常に少ない。アクチベーターとしては、酵母の細胞壁（ザイモサン）、多くの純粋な多糖類、ウサギ赤血球、ある特定の免疫グロブリン、ウイルス、真菌、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物および損傷細胞が挙げられると考えられている。これらのアクチベーターに共通する唯一の特徴は、炭水化物が存在することであるが、炭水化物構造の複雑さおよび多様性が原因で、認識される共有分子決定基を確立することが困難になっている。副経路の活性化がこの経路の阻害性の制御成分（例えば、Ｈ因子、Ｉ因子、ＤＡＦ、ＣＲ１およびプロパージン（副経路の唯一の正の制御因子である））間の優れたバランスによって制御されていることは広く認知されている。Ｓｃｈｗａｅｂｌｅ Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｒｅｉｄ Ｋ．Ｂ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２０（１）：１７−２１（１９９９））を参照のこと。
上記の見かけ上制御されていない活性化機構に加えて、生成される任意のＣ３ｂが、さらなる副経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）を形成する際にＢ因子に関与し得るので、副経路は、レクチン／古典経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）に対する強力な増幅ループをまたもたらし得る。副経路Ｃ３コンバターゼは、プロパージンと結合することによって安定化する。プロパージンは、副経路Ｃ３コンバターゼの半減期を６〜１０倍延長する。Ｃ３ｂを副経路Ｃ３コンバターゼに付加することによって、副経路Ｃ５コンバターゼが形成される。
３つすべての経路（すなわち、古典経路、レクチン経路および副経路）は、Ｃ５において合流すると考えられており、Ｃ５は、切断されることにより、複数の炎症促進性作用を有する生成物を形成する。合流した経路は、終末補体経路と呼ばれている。Ｃ５ａは、平滑筋の変質および血管緊張ならびに血管透過性を誘導する最も強力なアナフィラトキシンである。Ｃ５ａは、好中球および単球の両方の強力なケモタキシン（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ）およびアクチベーターでもある。Ｃ５ａ媒介性細胞活性化は、サイトカイン、加水分解性酵素、アラキドン酸代謝産物および反応性酸素種を含む、複数のさらなる炎症性メディエーターの放出を誘導することによって、炎症性反応を著しく増幅し得る。Ｃ５切断によって、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）としても知られるＣ５ｂ−９が形成される。現在のところ、半分解性（ｓｕｂｌｙｔｉｃ）のＭＡＣ沈着が、溶解性の孔形成複合体としての役割に加えて、炎症において重要な役割を果たし得るという強力な証拠が存在する。
Ｍ．Ｋ．ＬｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＪ．Ｐ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３年，第３版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｋ．Ｒ．Ｋａｌｌｉら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９９４年，第１５巻、ｐ．４１７−４３１ Ｂ．Ｐ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，１９９４年，第２４巻、ｐ．２１９−２２８ Ｊ．Ｌｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２年，第１５７２巻，ｐ．３８７−４００ Ｈｏｌｍｓｋｏｖら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３年，第２１巻，ｐ．５４７−５７８ Ｔｅｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００年，第１０１巻，ｐ．２２５−２３２ Ｋ．Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７年，第２６２巻，ｐ．７４５１−７４５４ Ｗｅｉｓ，Ｗ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年，第３６０巻，ｐ．１２７−１３４ Ｌｅｅ，Ｒ．Ｔ．ら、Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９２年，第２９９巻，ｐ．１２９−１３６ Ｍａｙｎａｒｄ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８２年，第２５７巻，ｐ．３７８８−３７９４ Ｌｙｎｃｈ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４年，第１７２巻，ｐ．１１９８−１２０２
補体系は、免疫防御におけるその不可欠な役割に加えて、多くの臨床的な状態における組織損傷に関与する。従って、これらの有害作用を予防する治療的に有効な補体インヒビターを開発することが急務である。
要旨
この要旨は、下記の詳細な説明にさらに記載される概念の選択を平易化された形態で紹介するために提供される。この要旨は、特許請求される主題の鍵となる特徴を特定することを目的としていないし、特許請求される主題の範囲を決定する際の助けとして使用されることも目的としていない。
１つの態様において、本発明は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、その重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号３８または配列番号９０として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含み、その軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号５１または配列番号９４として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含み、その単離された抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する。
別の態様において、本発明は、ヒトＭＡＳＰ−２に結合するヒト抗体を提供し、その抗体は、Ｉ）ａ）ｉ）配列番号２１の３１〜３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ１；およびｉｉ）配列番号２１の５０〜６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ２；およびｉｉｉ）配列番号２１の９５〜１０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびにｂ）ｉ）配列番号２５または配列番号２７の２４〜３４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１；およびｉｉ）配列番号２５または配列番号２７の５０〜５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２；およびｉｉｉ）配列番号２５または配列番号２７の８９〜９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域；またはＩＩ）前記重鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１０個までのアミノ酸置換および前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１０個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は前記可変ドメインと同一であるその改変体を含み、その抗体またはその改変体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する。
別の態様において、本発明は、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、その抗体は、Ｉ）ａ）ｉ）配列番号２０の３１〜３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ１；およびｉｉ）配列番号２０の５０〜６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ２；およびｉｉｉ）配列番号１８または配列番号２０の９５〜１０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびにｂ）ｉ）配列番号２２または配列番号２４の２４〜３４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１；およびｉｉ）配列番号２２または配列番号２４の５０〜５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２；およびｉｉｉ）配列番号２２または配列番号２４の８９〜９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域；またはＩＩ）前記重鎖の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１０個までのアミノ酸置換および前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１０個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は前記可変ドメインと同一であるその改変体を含み、その抗体またはその改変体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する。
別の態様において、本発明は、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２１に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む重鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
別の態様において、本発明は、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２７に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ（ａｎ ｏｎｅ）を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列（例えば、表２に示されているもの）をコードする核酸分子を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列（例えば、表２に示されているもの）をコードする核酸分子のうちの少なくとも１つを含む細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、単離されたＭＡＳＰ−２抗体を生成する方法を提供し、この方法は、抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子の発現を可能にする条件下において本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子のうちの少なくとも１つを含む細胞を培養する工程、および前記抗ＭＡＳＰ−２抗体を単離する工程を包含する。
別の態様において、本発明は、表面プラズモン共鳴によって測定されたとき１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＭＡＳＰ−２から解離し、かつ１％血清において、マンナンコーティングされた基材上でＣ４活性化を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識し、ここで、前記参照抗体は、配列番号２０に示されるような重鎖可変領域および配列番号２４に示されるような軽鎖可変領域を含む。
別の態様において、本発明は、本発明の完全ヒトモノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する方法を提供し、この方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を、前記ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するのに十分な量で投与する工程を包含する。
別の態様において、本発明は、ヒト被験体への治療上の投与に適した単位用量の本発明のヒトモノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体を備える製品を提供し、ここで、その単位用量は、１ｍｇから１０００ｍｇまでの範囲である。
本発明の前述の態様および本発明に付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより良好に理解されるとき、それらは、より容易に理解されるだろう。
図１Ａは、ヒトＭＡＳＰ−２のゲノム構造を図示している図である。 図１Ｂは、ヒトＭＡＳＰ−２のタンパク質のドメイン構造を図示している図である。 図２は、実施例２に記載されるように様々なＭＡＳＰ−２抗原に対してパニング（ｐａｎ）されたｓｃＦｃｖファージライブラリーから選択されたポリクローナル集団において行われたＥＬＩＳＡアッセイの結果をグラフで図示している。 図３Ａおよび３Ｂは、実施例３に記載されるような、補体アッセイにおける機能活性についての４５個の候補ｓｃＦｖクローンの試験結果を示している。 図３Ａおよび３Ｂは、実施例３に記載されるような、補体アッセイにおける機能活性についての４５個の候補ｓｃＦｖクローンの試験結果を示している。 図４は、実施例４に記載されるように３種の血清（ヒト、ラットおよびＮＨＰ）におけるＣ３ｃレベルを比較するために行われた実験結果をグラフで図示している。 図５Ａは、実施例４に記載されるようなそれぞれＶＨ２およびＶＨ６遺伝子ファミリーに属する２つの異なる群を明らかにしている、最も活性なクローンの重鎖領域（残基１〜１２０）のアミノ酸配列のアラインメントである。 図５Ｂは、実施例４に記載されるようなｓｃＦｖクローン１７Ｄ２０、１７Ｎ１６、１８Ｌ１６および４Ｄ９のアミノ酸配列のアラインメントである。 図６は、実施例５に記載されるような、９０％ヒト血漿を使用するＣ３ｂ沈着アッセイにおける、ＩｇＧ４に変換された母クローンの調製物の阻害活性をグラフで図示している。 図７Ａは、実施例６に記載されるようにｈｕＭＡＳＰ２Ａに対して力価測定された、１７Ｎ１６母クローン 対 娘クローンにおけるＥＬＩＳＡアッセイの結果をグラフで図示している。 図７Ｂは、実施例６に記載されるようにｈｕＭＡＳＰ２Ａに対して力価測定された、１７Ｄ２０母クローン 対 娘クローンにおけるＥＬＩＳＡアッセイの結果をグラフで図示している。 図８は、実施例６に記載されるように、軽鎖（ＳＹＥで始まる）が、母クローン１７Ｎ１６と１７Ｎ９娘クローンとで異なる１７アミノ酸残基を有することを示している、それら２つのクローンのタンパク質配列のアラインメントである。 図９は、実施例７に記載されるような、１７Ｄ２０母クローンと比較された、突然変異誘発から生じたクローン＃３５、＃５９および＃９０の配列のＣＤＲ−Ｈ３領域のタンパク質配列のアラインメントである。 図１０Ａは、実施例７に記載されるような、１７Ｄ２０母クローンに加えて、鎖シャフリングされたクローン１７Ｄ２０ｍｄ２１Ｎ１１、および１７Ｄ２０ｍｄ２１Ｎ１１のＶＬと組み合わされた図９に示された突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ）クローン＃３５ＣＤＲ−Ｈ３クローン（ＶＨ３５−ＶＬ２１Ｎ１１）のＣＤＲ３領域のタンパク質配列のアラインメントである。図１０Ｂは、実施例７に記載されるような、１７Ｄ２０母クローンおよび娘クローン１７Ｄ２０ｍｄ２１Ｎ１１のＶＬおよびＶＨ領域のタンパク質配列のアラインメントである。 図１１Ａは、実施例８に記載されるような、ヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体母クローン１７Ｎ１６に由来する娘クローンアイソタイプ改変体（ＭｏＡｂ＃１〜３）に対して行われたＣ３ｂ沈着アッセイの結果をグラフで図示している。図１１Ｂは、実施例８に記載されるような、ヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体母クローン１７Ｄ２０に由来する娘クローンアイソタイプ改変体（ＭｏＡｂ＃４〜６）に対して行われたＣ３ｂ沈着アッセイの結果をグラフで図示している。 図１２Ａは、実施例８に記載されるような、９５％血清におけるＣ３ｂ沈着アッセイにおける母クローンおよびＭｏＡｂ＃１〜６の試験をグラフで図示している。 図１２Ｂは、実施例８に記載されるような、９５％血清におけるＣ３ｂ沈着アッセイにおける母クローンおよびＭｏＡｂ＃１〜６の試験をグラフで図示している。 図１３は、実施例８に記載されるような、９５％正常ヒト血清におけるＣ４ｂ沈着の阻害をグラフで図示している。 図１４は、実施例８に記載されるような、９５％アフリカミドリザル血清におけるＣ３ｂ沈着の阻害をグラフで図示している。 図１５は、実施例８に記載されるような、ＭｏＡｂ＃２〜６による、予め組み立てられたＭＢＬ−ＭＡＳＰ２複合体のＣ４切断活性の阻害をグラフで図示している。 図１６は、実施例８に記載されるような、Ｃ１ｓと比較したときのヒトＭＡＳＰ２へのＭｏＡｂ＃６の優先的結合をグラフで図示している。 図１７は、実施例１０に記載されるように、アフリカミドリザルに抗ヒトＭｏＡｂ＃ＯＭＳ６４６を静脈内投与した後にレクチン経路が完全に阻害されたことをグラフで図示している。 図１８Ａは、実施例１１に記載されるような、コントロールマウス、および抗マウスＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＭ１１）または抗ヒトＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＯＭＳ６４６）で処置されたマウスにおける、７．０Ｇｙの放射線への曝露後の経時的な生存パーセントを示しているＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットである。図１８Ｂは、実施例１１に記載されるような、コントロールマウス、および抗マウスＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＭ１１）または抗ヒトＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＯＭＳ６４６）で処置されたマウスにおける、６．５Ｇｙの放射線への曝露後の経時的な生存パーセントを示しているＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットである。 図１８Ｃは、実施例１１に記載されるような、コントロールマウス、および抗ヒトＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＯＭＳ６４６）で処置されたマウスにおける、８．０Ｇｙの放射線への曝露後の経時的な生存パーセントを示しているＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットである。 図１９は、実施例１２に記載されるように、固定化されたＯＭＳ６４６が、約１〜３×１０−４Ｓ−１のＫｏｆｆ速度および約１．６〜３×１０６Ｍ−１Ｓ−１のＫｏｎ速度で組換えＭＡＳＰ−２に結合することを示している、抗ＭＡＳＰ−２抗体ＯＭＳ６４６に対する表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）解析の結果（秒の単位に対する反応単位（結合））をグラフで図示している。 図２０は、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、固定化された組換えヒトＭＡＳＰ−２におよそ１００ｐＭのＫＤで結合することを示している、固定化されたヒトＭＡＳＰ−２に対する抗ＭＡＳＰ−２抗体ＯＭＳ６４６の結合親和性を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果をグラフで図示している。 図２１Ａは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、１％ヒト血清において、マンナンコーティングされた表面上でＣ４活性化をおよそ０．５ｎＭのＩＣ５０で阻害することを証明している、抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下における、マンナンコーティングされた表面上のＣ４活性化のレベルをグラフで図示している。図２１Ｂは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、補体成分Ｃ４の古典経路依存性の活性化を阻害しないことを示している、抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下における、ＩｇＧコーティングされた表面上のＣ４活性化のレベルをグラフで図示している。 図２２Ａは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、レクチン媒介性のＭＡＣ沈着をおよそ１ｎＭのＩＣ５０値で阻害することを証明している、レクチン経路特異的アッセイ条件下の抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下における、ＭＡＣ沈着のレベルをグラフで図示している。図２２Ｂは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、古典経路媒介性のＭＡＣ沈着を阻害しないことを証明している、古典経路特異的アッセイ条件下の抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下における、ＭＡＣ沈着のレベルをグラフで図示している。 図２２Ｃは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、副経路媒介性のＭＡＣ沈着を阻害しないことを証明している、副経路特異的アッセイ条件下の抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下における、ＭＡＣ沈着のレベルをグラフで図示している。 図２３Ａは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、生理学的条件下においてＣ３沈着を阻止することを証明している、レクチン経路特異的条件下の９０％ヒト血清における一連の濃度にわたる抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下における、Ｃ３沈着のレベルをグラフで図示している。図２３Ｂは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、生理学的条件下においてＣ４沈着を阻止することを証明している、レクチン経路特異的条件下の９０％ヒト血清における一連の濃度にわたる抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下における、Ｃ４沈着のレベルをグラフで図示している。 図２４Ａは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｕｇｌｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）血清において用量反応様式でレクチン経路のＣ４沈着を３０〜５０ｎＭの範囲内のＩＣ５０値で阻害することを証明している、レクチン経路特異的条件下の９０％カニクイザル血清における抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下における、Ｃ４沈着のレベルをグラフで図示している。図２４Ｂは、実施例１２に記載されるように、ＯＭＳ６４６が、アフリカミドリザル血清において用量反応様式でレクチン経路のＣ４沈着を１５〜３０ｎＭの範囲内のＩＣ５０値で阻害することを証明している、レクチン経路特異的条件下の９０％アフリカミドリザル血清における抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の非存在下または存在下における、Ｃ４沈着のレベルをグラフで図示している。
配列表の説明
配列番号１ ヒトＭＡＳＰ−２ ｃＤＮＡ
配列番号２ ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（リーダーを含む）
配列番号３ ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（成熟）
配列番号４ ラットＭＡＳＰ−２ ｃＤＮＡ
配列番号５ ラットＭＡＳＰ−２タンパク質（リーダーを含む）
配列番号６ ラットＭＡＳＰ−２タンパク質（成熟） 。
抗原（ヒトＭＡＳＰ−２成熟タンパク質に関して）
配列番号７ ヒトＭＡＳＰ−２のＣＵＢＩドメイン（ａａ１〜１２１）
配列番号８ ヒトＭＡＳＰ−２のＣＵＢＩ／ＥＧＦドメイン（ａａ１〜１６６）
配列番号９ ヒトＭＡＳＰ−２のＣＵＢＩ／ＥＧＦ／ＣＵＢＩＩドメイン（ａａ１〜２７７）
配列番号１０ ヒトＭＡＳＰ−２のＥＧＦドメイン（ａａ１２２〜１６６）
配列番号１１ ヒトＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩ／ＣＣＰＩＩ／ＳＰドメイン（ａａ２７８〜６７１）
配列番号１２ ヒトＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩ／ＣＣＰＩＩドメイン（ａａ２７８〜４２９）
配列番号１３ ヒトＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩドメイン（ａａ２７８〜３４７）
配列番号１４ ヒトＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩＩ／ＳＰドメイン（ａａ３４８〜６７１）
配列番号１５ ヒトＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩＩドメイン（ａａ３４８〜４２９）
配列番号１６ ヒトＭＡＳＰ−２のＳＰドメイン（ａａ４２９〜６７１）
配列番号１７：セリンプロテアーゼ不活性化変異体（変異されたＳｅｒ６１８を含むａａ６１０〜６２５） 。
抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体ＶＨ鎖
配列番号１８ １７Ｄ２０ｍｃ重鎖可変領域（ＶＨ）ポリペプチド
配列番号１９ １７Ｄ２０＿ｄｃ３５ＶＨ２１Ｎ１１ＶＬ（ＯＭＳ６４６）重鎖可変領域（ＶＨ）（シグナルペプチドを含まない）をコードするＤＮＡ
配列番号２０ １７Ｄ２０＿ｄｃ３５ＶＨ２１Ｎ１１ＶＬ（ＯＭＳ６４６）重鎖可変領域（ＶＨ）ポリペプチド
配列番号２１ １７Ｎ１６ｍｃ重鎖可変領域（ＶＨ）ポリペプチド 。
抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体ＶＬ鎖
配列番号２２ １７Ｄ２０ｍｃ軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド
配列番号２３ １７Ｄ２０＿ｄｃ２１Ｎ１１ＶＬ（ＯＭＳ６４４）軽鎖可変領域（ＶＬ）（シグナルペプチドを含まない）をコードするＤＮＡ
配列番号２４ １７Ｄ２０＿ｄｃ２１Ｎ１１ＶＬ（ＯＭＳ６４４）軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド
配列番号２５ １７Ｎ１６ｍｃ軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド
配列番号２６ １７Ｎ１６＿ｄｃ１７Ｎ９（ＯＭＳ６４１）軽鎖可変領域（ＶＬ）（シグナルペプチドを含まない）をコードするＤＮＡ
配列番号２７ １７Ｎ１６＿ｄｃ１７Ｎ９（ＯＭＳ６４１）軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド 。
抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体重鎖ＣＤＲ
配列番号２８〜３１ ＣＤＲ−Ｈ１
配列番号３２〜３５ ＣＤＲ−Ｈ２
配列番号３６〜４０ ＣＤＲ−Ｈ３ 。
抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体軽鎖ＣＤＲ
配列番号４１〜４５ ＣＤＲ−Ｌ１
配列番号４６〜５０ ＣＤＲ−Ｌ２
配列番号５１〜５４ ＣＤＲ−Ｌ３
ＭＡＳＰ−２抗体配列
配列番号５５：ｓｃＦｖ母クローン１７Ｄ２０完全長ポリペプチド
配列番号５６：ｓｃＦｖ母クローン１８Ｌ１６完全長ポリペプチド
配列番号５７：ｓｃＦｖ母クローン４Ｄ９完全長ポリペプチド
配列番号５８：ｓｃＦｖ母クローン１７Ｌ２０完全長ポリペプチド
配列番号５９：ｓｃＦｖ母クローン１７Ｎ１６完全長ポリペプチド
配列番号６０：ｓｃＦｖ母クローン３Ｆ２２完全長ポリペプチド
配列番号６１：ｓｃＦｖ母クローン９Ｐ１３完全長ポリペプチド
配列番号６２：野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域をコードするＤＮＡ
配列番号６３：野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域ポリペプチド
配列番号６４：変異Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４重鎖定常領域をコードするＤＮＡ
配列番号６５：変異Ｓ２２８Ｐポリペプチドを有するＩｇＧ４重鎖定常領域
配列番号６６：ｓｃＦｖ娘クローン１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９完全長ポリペプチド
配列番号６７：ｓｃＦｖ娘クローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ２１Ｎ１１完全長ポリペプチド
配列番号６８：ｓｃＦｖ娘クローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１完全長ポリペプチド
配列番号６９：野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域をコードするＤＮＡ
配列番号７０：野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域ポリペプチド
配列番号７１：１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９軽鎖遺伝子配列（ｎｔ１〜５７によってコードされるシグナルペプチドを含む））
配列番号７２：１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９軽鎖タンパク質配列（シグナルペプチドａａ１〜１９を含む）
配列番号７３：１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９ ＩｇＧ２重鎖遺伝子配列（ｎｔ１〜５７によってコードされるシグナルペプチドを含む）
配列番号７４：１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９ ＩｇＧ２重鎖タンパク質配列（シグナルペプチドａａ１〜１９を含む）
配列番号７５：１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９ ＩｇＧ４重鎖遺伝子配列（ｎｔ１〜５７によってコードされるシグナルペプチドを含む）
配列番号７６：１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９ ＩｇＧ４重鎖タンパク質配列（シグナルペプチドａａ１〜１９を含む）
配列番号７７：１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９ ＩｇＧ４変異重鎖遺伝子配列（ｎｔ１〜５７によってコードされるシグナルペプチドを含む）
配列番号７８：１７Ｎ１７ｍ＿ｄ１７Ｎ９ ＩｇＧ４変異重鎖タンパク質配列（シグナルペプチドａａ１〜１９を含む）
配列番号７９：１７Ｄ２０＿３５２１Ｎ１１軽鎖遺伝子配列（ｎｔ１〜５７によってコードされるシグナルペプチドを含む）
配列番号８０：１７Ｄ２０＿３５２１Ｎ１１軽鎖タンパク質配列（シグナルペプチドａａ１〜１９を含む）
配列番号８１：１７Ｄ２０＿３５２１Ｎ１１ ＩｇＧ２重鎖遺伝子配列（ｎｔ１〜５７によってコードされるシグナルペプチドを含む）
配列番号８２：１７Ｄ２０＿３５２１Ｎ１１ ＩｇＧ２重鎖タンパク質配列（シグナルペプチドａａ１〜１９を含む）
配列番号８３：１７Ｄ２０＿３５２１Ｎ１１ ＩｇＧ４重鎖遺伝子配列（ｎｔ１〜５７によってコードされるシグナルペプチドを含む）
配列番号８４：１７Ｄ２０＿３５２１Ｎ１１ ＩｇＧ４重鎖タンパク質配列（シグナルペプチドａａ１〜１９を含む）
配列番号８５：１７Ｄ２０＿３５２１Ｎ１１ ＩｇＧ４変異重鎖遺伝子配列（ｎｔ１〜５７によってコードされるシグナルペプチドを含む）
配列番号８６：１７Ｄ２０＿３５２１Ｎ１１ ＩｇＧ４変異重鎖タンパク質配列（シグナルペプチドａａ１〜１９を含む）
配列番号８７：完全長ポリペプチド（シグナルペプチドを含まない）をコードするｓｃＦｖ娘クローン１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９ ＤＮＡ
配列番号８８：完全長ポリペプチド（シグナルペプチドを含まない）をコードするｓｃＦｖ娘クローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ２１Ｎ１１ ＤＮＡ
配列番号８９：完全長ポリペプチド（シグナルペプチドを含まない）をコードするｓｃＦｖ娘クローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１ ＤＮＡ
配列番号９０：１７Ｄ２０ｍおよびｄ３５２１Ｎ１１のコンセンサス重鎖ＣＤＲ−Ｈ３
配列番号９１：１７Ｄ２０ｍおよびｄ３５２１Ｎ１１のコンセンサス軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１
配列番号９２：１７Ｎ１６ｍおよびｄ１７Ｎ９のコンセンサス軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１
配列番号９３：１７Ｄ２０ｍ、ｄ３５２１Ｎ１１、１７Ｎ１６ｍおよびｄ１７Ｎ９のコンセンサス軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２
配列番号９４：１７Ｎ１６ｍおよびｄ１７Ｎ９のコンセンサス軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３ 。
詳細な説明
本発明は、ヒトＭＡＳＰ−２に結合し、かつ免疫系の古典（Ｃ１ｑ依存性）経路の成分を損なわないままでレクチン媒介性の補体活性化を阻害する、完全ヒト抗体を提供する。そのヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体は、実施例２〜９に記載されるようにファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。実施例１０〜１２に記載されるように、インビトロアッセイとインビボの両方において証明されるように、レクチン媒介性の補体活性化を阻害する能力を有する高親和性抗ＭＡＳＰ−２抗体が同定された。上記抗体の可変軽鎖フラグメントおよび可変重鎖フラグメントは、ｓｃＦｖ型と完全長ＩｇＧ型の両方として単離された。上記ヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体は、免疫系の古典（Ｃ１ｑ依存性）経路の成分を損なわないままで、レクチン媒介性の補体経路の活性化に伴う細胞の損傷を阻害するために有用である。
（Ｉ．定義）
本明細書中で特に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての用語は、本発明の分野における当業者が理解する意味と同じ意味を有する。以下の定義は、本発明を説明する明細書および特許請求の範囲において使用される用語に関して明確にするために提供される。
本明細書中で使用されるとき、用語「ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化」は、レクチン経路のＭＡＳＰ−２依存性の活性化を含み、それは、生理学的条件下において（すなわち、Ｃａ＋＋の存在下において）生じ、レクチン経路Ｃ３コンバターゼのＣ４ｂ２ａを形成させ、Ｃ３切断産物のＣ３ｂが蓄積すると、続いてＣ５コンバターゼのＣ４ｂ２ａ（Ｃ３ｂ）ｎがもたらされる。
本明細書中で使用されるとき、用語「副経路」とは、例えば、真菌および酵母の細胞壁由来のザイモサン、グラム陰性外膜由来のリポ多糖（ＬＰＳ）およびウサギ赤血球によって、ならびに、多くの純粋な多糖類、ウサギ赤血球、ウイルス、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物および損傷細胞から引き起こされる補体活性化、および、従来、補体因子Ｃ３からの自発的なタンパク分解性の生成によるＣ３ｂから生じると考えられている、補体活性化のことをいう。
本明細書中で使用されるとき、用語「レクチン経路」とは、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）、ＣＬ−１１およびフィコリン（Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリンまたはＬ−フィコリン）を含む、血清および非血清の炭水化物結合タンパク質の特異的な結合を介して生じる補体活性化のことをいう。
本明細書中で使用されるとき、用語「古典経路」とは、外来性粒子に結合した抗体によって引き起こされ、認識分子Ｃ１ｑの結合を必要とする補体活性化のことをいう。
本明細書中で使用されるとき、用語「ＭＡＳＰ−２阻害抗体」とは、ＭＡＳＰ−２に結合するか、またはＭＡＳＰ−２と直接相互作用し、そして、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を効果的に阻害する、任意の抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのＭＡＳＰ−２結合フラグメントのことをいう。本発明の方法において有用なＭＡＳＰ−２阻害抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を２０％よりも大きく（例えば、３０％よりも大きく、または４０％よりも大きく、または５０％よりも大きく、または６０％よりも大きく、または７０％よりも大きく、または８０％よりも大きく、または９０％よりも大きく、または９５％よりも大きく）低下させ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ＭＡＳＰ−２遮断抗体」とは、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を９０％よりも大きく（例えば、９５％よりも大きく、または９８％よりも大きく）低下させる（すなわち、わずか１０％（例えば、わずか９％、またはわずか８％、またはわずか７％、またはわずか６％、例えば、わずか５％以下、またはわずか４％、またはわずか４％、またはわずか３％、またはわずか２％、またはわずか１％）のＭＡＳＰ−２補体活性化しかもたらさない）、ＭＡＳＰ−２阻害抗体のことをいう。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、当業者に十分理解されており、抗原に特異的に結合する１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質のことをいう。抗体の１つの形態が、抗体の構造の基本単位を構成する。この形態は、四量体であり、２つの同一対の抗体鎖からなり、各対が、１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。各対において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、一緒に抗原への結合に関与し、定常領域は、抗体のエフェクター機能に関与する。
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体」は、任意の抗体産生哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギおよび霊長類（ヒトを含む））またはハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現もしくはトランスジェニック動物（または抗体もしくは抗体フラグメントを生成する他の方法）由来の、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその一部に特異的に結合する抗体およびその抗体フラグメントを包含する。用語「抗体」は、抗体の起源、またはそれが生成される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物、ペプチド合成など）に関して限定されると意図されていない。例示的な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および組換え抗体；多重特異性抗体（例えば、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体）；ヒト化抗体；マウス抗体；キメラモノクローナル抗体、マウス−ヒトモノクローナル抗体、マウス−霊長類モノクローナル抗体、霊長類−ヒトモノクローナル抗体；および抗イディオタイプ抗体が挙げられ、それらは、任意のインタクトな分子またはそのフラグメントであり得る。本明細書中で使用されるとき、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、それらのフラグメント（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの合成改変体、天然に存在する改変体、必要とされる特異性を有する抗原結合フラグメントを含む抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗原結合部位または必要とされる特異性を有するフラグメント（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された配置も包含する。
本明細書中で使用されるとき、用語「抗原結合フラグメント」とは、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチドフラグメントのことをいう。この点において、本明細書中に記載される抗体の抗原結合フラグメントは、ＭＡＳＰ−２に結合する抗体由来の本明細書中に示されるＶＨおよびＶＬ配列の１、２、３、４、５つのまたは６つすべてのＣＤＲを含み得る。本明細書中に記載されるＭＡＳＰ−２特異的抗体の抗原結合フラグメントは、ＭＡＳＰ−２に結合することができる。ある特定の実施形態において、抗原結合フラグメント、または抗原結合フラグメントを含む抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の阻害を媒介する。
本明細書中で使用されるとき、用語「抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体」とは、同種の抗体集団のことをいい、ここで、そのモノクローナル抗体は、ＭＡＳＰ−２上のエピトープの選択結合に関与するアミノ酸を含む。抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体は、ＭＡＳＰ−２標的抗原に非常に特異的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体だけでなく、それらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの改変体、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性およびエピトープに結合する能力を有する抗原結合フラグメント（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された配置も包含する。
本明細書中で使用されるとき、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体の特性のことを示し、抗体の起源、またはそれが生成される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物など）に関して限定されると意図されない。その用語には、免疫グロブリン全体、ならびに上記の「抗体」の定義に記載されたフラグメントなどが含まれる。モノクローナル抗体は、継続的に培養中の細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の手法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５，１９７５に記載されているハイブリドーマ法）を使用して得ることができるか、または組換えＤＮＡ法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙに対する米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８，１９９１およびＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１に記載されている手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスであり得る。
認識される免疫グロブリンポリペプチドは、カッパーおよびラムダ軽鎖、ならびにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミュー重鎖または他の種における等価物を含む。完全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端に約１１０アミノ酸の可変領域、およびＣＯＯＨ末端にカッパーまたはラムダ定常領域を含む。完全長免疫グロブリンの「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸）も同様に、可変領域（約１１６アミノ酸）および上述の重鎖定常領域のうちの１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸）を含む。
基本的な４鎖抗体単位は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドに加えて、５つのその基本的なヘテロ四量体単位からなり、ゆえに、１０個の抗原結合部位を含む。分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖とともに２〜５つの基本的な４鎖単位を含む多価の集合体を形成し得る。各Ｌ鎖は、１つの共有結合性のジスルフィド結合によってＨ鎖に結合し、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって１つ以上によって互いに結合する。Ｈ鎖およびＬ鎖の各々は、規則的に間隔が空いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。ＶＨとＶＬがともに対形成することによって、単一の抗原結合部位が形成される。
各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、αおよびγ鎖の各々の場合は３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμおよびεアイソタイプの場合は４つのＣＨドメイン（ＣＨ）を有する。
各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、続いて、その他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨと整列し、ＣＬは、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいて、カッパー（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、種々のクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と命名されている重鎖を有する５つのクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。γおよびαクラスは、ＣＨ配列中のわずかな相違および機能に基づいてさらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
抗体の種々のクラスの構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ）；Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ ７１およびＣｈａｐｔｅｒ ６を参照のこと。
用語「可変」とは、Ｖドメインのある特定のセグメントが、抗体の間で配列が広く異なる事実のことをいう。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸長にわたって均等に分布しているわけではない。それどころか、Ｖ領域は、「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性であるより短い領域（各々９〜１２アミノ酸長である）によって分断されている、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる１５〜３０アミノ酸の比較的変化しない範囲からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、３つの超可変領域（ｎ−シート構造を接続するループを形成し、場合によってはｎ−シート構造の一部を形成する）によって接続された大部分はベータシート配置をとる４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲと接近して他の鎖由来の超可変領域とともに保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与）を示す。
本明細書中で使用されるとき、用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）に記載されているようなＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングするとき、軽鎖可変ドメインにおけるおよそ残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおけるおよそ約３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３））；および／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）に記載されているようなＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムに従ってナンバリングするとき、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）および９５〜１０１（Ｈ３））；および／または「超可変ループ」／ＣＤＲ由来の残基（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：２０９−２１２；Ｒｕｉｚ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：２１９−２２１（２０００）に記載されているようなＩＭＧＴナンバリングシステムに従ってナンバリングするとき、ＶＬにおける残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）および１０５〜１２０（Ｌ３）ならびにＶＨにおける２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）および１０５〜１２０（Ｈ３））を含む。
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体フラグメント」とは、完全長抗ＭＡＳＰ−２抗体（一般に、抗原結合領域またはその可変領域を含む）から得られた部分またはそれらに関連する部分のことをいう。抗体フラグメントの実例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、鎖状抗体、一本鎖抗体分子、抗体フラグメントから形成される二重特異性および多重特異性抗体が挙げられる。
二重特異性抗体が使用される場合、これらは、種々の方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６−４４９（１９９３））で製造され得る、例えば、化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製され得る、従来の二重特異性抗体であり得るか、または上で述べた任意の二重特異性抗体フラグメントであり得る。
本明細書中で使用されるとき、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、このポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが、抗原に結合するのに望ましい構造を形成することができる。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、堅固な非共有結合性の会合での、１つの重鎖可変領域ドメインおよび１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みによって、抗原結合のためのアミノ酸残基をもたらし、抗体に抗原結合特異性を付与する、６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖から各々３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識し、結合する能力（結合部位全体よりも低い親和性であるが）を有する。
本明細書中で使用されるとき、用語「特異的結合」とは、抗体が、種々の検体の均一な混合物中に存在する特定の検体に優先的に結合できることをいう。ある特定の実施形態において、特異的結合の相互作用は、サンプル中の望ましい検体と望ましくない検体を、いくつかの実施形態では約１０〜１００倍以上より大きく（例えば、約１０００または１０，０００倍より大きく）、識別する。ある特定の実施形態において、捕捉剤と検体との間の親和性は、それらが捕捉剤／検体複合体に特異的に結合しているとき、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満、または約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満、または約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＫＤ（解離定数）を特徴とする。
本明細書中で使用されるとき、用語「改変体」抗ＭＡＳＰ−２抗体とは、親抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により「親」または参照抗体アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる分子のことをいう。１つの実施形態において、改変体抗ＭＡＳＰ−２抗体とは、重鎖可変領域のＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換、および／または軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までのアミノ酸置換を除けば親可変ドメインと同一の可変領域を含む分子のことをいう。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的な配列改変である。
本明細書中で使用されるとき、用語「親抗体」とは、改変体を調製するために使用されるアミノ酸配列によってコードされる抗体のことをいう。好ましくは、その親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、存在するなら、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、その親抗体は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であり得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「単離された抗体」とは、その天然の環境の成分から、同定され、かつ分離されかつ／または回収された抗体のことを指す。その天然の環境の夾雑物の成分は、その抗体に対する診断的または治療的な使用を干渉し得る材料であり、それらとしては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、その抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって測定されるとき、９５重量％超、最も好ましくは、９９重量％超の抗体にまで；（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度にまで；または（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて、還元条件下または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一にまで、精製される。単離された抗体は、その抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内の原位置における抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
本明細書中で使用されるとき、用語「エピトープ」とは、モノクローナル抗体が特異的に結合する抗原の一部のことをいう。エピトープの決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面群（例えば、アミノ酸または糖側鎖）からなり、通常、特異的な３次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。より詳細には、用語「ＭＡＳＰ−２エピトープ」は、本明細書中で使用されるとき、当該分野で周知の任意の方法、例えば、イムノアッセイによって測定されたとき、抗体が免疫特異的に結合する対応するポリペプチドの一部のことをいう。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。そのようなエピトープは、本質的に直鎖状であり得るか、または不連続なエピトープであり得る。したがって、本明細書中で使用されるとき、用語「立体配座エピトープ」とは、連続した一続きのアミノ酸以外の抗原のアミノ酸間の空間的関係によって形成される不連続なエピトープのことをいう。
本明細書中で使用されるとき、用語「マンナン結合レクチン」（「ＭＢＬ」）は、マンナン結合タンパク質（「ＭＢＰ」）と等価である。
本明細書中で使用されるとき、「細胞膜傷害複合体」（「ＭＡＣ」）とは、膜に挿入し、膜を破壊する、最後の５つの補体成分（Ｃ５−Ｃ９）の複合体のことをいう。Ｃ５ｂ−９とも呼ばれる。
本明細書中で使用されるとき、「被験体」には、すべての哺乳動物（ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタおよびげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない）が含まれる。
本明細書中で使用されるとき、アミノ酸残基は、以下のとおり省略して記載される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
最も広い意味において、天然に存在するアミノ酸は、各アミノ酸の側鎖の化学的特性に基づいて群に分けることができる。「疎水性」アミノ酸とは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＰｒｏのいずれかを意味する。「親水性」アミノ酸とは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓのいずれかを意味する。この群のアミノ酸は、さらに以下のとおり分類され得る。「電荷を有しない親水性」アミノ酸とは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎのいずれかを意味する。「酸性」アミノ酸とは、ＧｌｕまたはＡｓｐのいずれかを意味する。「塩基性」アミノ酸とは、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓのいずれかを意味する。
本明細書中で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の各群内におけるアミノ酸間の置換と説明される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギンならびに（６）リシン、アルギニンおよびヒスチジン。
本明細書中で使用されるとき、「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された、成長因子をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種の染色体の完全なＤＮＡ分子より小さい。
本明細書中で使用されるとき、「核酸分子構築物」は、天然に存在しない配置で組み合され並べられた核酸のセグメントを含むようにヒトの介入によって改変された一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
本明細書中で使用されるとき、「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。代表的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下にあり、そのような遺伝子は、そのプロモーター「に作動可能に連結される」と言われる。同様に、調節エレメントが、コアプロモーターの活性を調節する場合、その調節エレメントとそのコアプロモーターは、作動可能に連結されている。
本明細書中で使用されるとき、数値に関する用語「およそ」または「約」は、別段述べられていないかまたは別段文脈から明らかでない限り、通常、その数値のいずれかの向きの（それより大きいまたは小さい）５％の範囲内に入る数値を含むと見なされる（そのような数値が、可能性のある値の１００％を超え得る場合を除く）。範囲が述べられる場合、別段述べられていないかまたは別段文脈から明らかでない限り、終点はその範囲内に含められる。
本明細書中で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の態様を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」へ言及は、単一の細胞ならびに２つ以上の細胞を含み；「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」へ言及は、１つの薬剤ならびに２つ以上の薬剤を含み；「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」へ言及は、複数のそのような抗体を含み、「フレームワーク領域（ａ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）」へ言及は、１つ以上のフレームワーク領域および当業者に公知のそれらの等価物への言及を含むなど。
本明細書における各実施形態は、別段明確に述べられない限り、必要な変更を加えて、他のすべての実施形態に適用される。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために標準的な手法が使用され得る。酵素反応および精製の手法は、製造者の仕様書に従って、または当該分野において通常遂行されるようにもしくは本明細書中に記載されるように、行われ得る。これらのおよび関連する手法および手順は、当該分野で周知の従来の方法に従って、本明細書全体で引用され、述べられる、様々な一般的な参考文献およびより具体的な参考文献に記載されているように、通常、行われ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）；または他の関連したＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ刊行物および他の同様の参考文献を参照のこと。特定の定義が提供されていない限り、本明細書中に記載される分子生物学、分析化学、有機合成化学ならびに薬学および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの研究室手順および手法は、当該分野において周知であり、通常使用されるものである。組換え技術、分子生物学的合成、微生物学的合成、化学的合成、化学解析、医薬品、製剤化および送達ならびに患者の処置のために、標準的な手法が使用され得る。
本明細書で述べられる任意の実施形態が、本発明の任意の方法、キット、試薬または組成物に関して満たされ得ることが企図され、逆もまた同じである。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用され得る。
ＩＩ．概要
レクチン（ＭＢＬ、Ｍ−フィコリン、Ｈ−フィコリン、Ｌ−フィコリンおよびＣＬ−１１）は、先天性の補体系を引き起こす特異的な認識分子であり、この系は、レクチン開始経路、およびレクチンによって開始される、末端の補体エフェクター分子の活性化を増幅する関連する末端経路増幅ループを含む。Ｃ１ｑは、後天性の補体系を引き起こす特異的な認識分子であり、この系は、古典開始経路、およびＣ１ｑによって開始される、末端の補体エフェクター分子の活性化を増幅する関連する末端経路増幅ループを含む。本発明者らは、これらの２つの主要な補体活性化の系を、それぞれレクチン依存性補体系およびＣ１ｑ依存性補体系と呼ぶ。
補体系は、免疫防御におけるその不可欠な役割に加えて、多くの臨床的な状態における組織損傷に関与する。従って、これらの有害作用を予防する治療的に有効な補体インヒビターを開発することが急務である。
米国特許第７，９１９，０９４号、同時係属中の米国特許出願番号１２／９０５，９７２（ＵＳ２０１１／００９１４５０として公開）および同時係属中の米国特許出願番号１３／０８３，４４１（ＵＳ２０１１／０３１１５４９として公開）（これらの各々は、本願の譲受人であるＯｍｅｒｏｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに帰属しており、これらの各々は、本明細書によって参考として援用される）に記載されているように、古典経路を損なわないままで、レクチン媒介性のＭＡＳＰ−２経路を阻害できることが、ＭＡＳＰ−２−／−マウスモデルの使用によって判明した。古典経路を損なわないままで、レクチン媒介性のＭＡＳＰ−２経路を阻害できるという認識とともに、補体の免疫防御能力を完全に停止することなく、特定の病態を引き起こす補体活性化の系だけを特異的に阻害することが、非常に望ましいと理解される。例えば、補体活性化がレクチン依存性の補体系によって主に媒介される疾患状態では、この系だけを特異的に阻害することが有益であり得る。このことは、Ｃ１ｑ依存性補体活性化の系を損なわずに、免疫複合体のプロセシングを取り扱い、そして感染症に対する宿主防御に役立ち得る。
レクチン依存性の補体系を特異的に阻害する治療薬の開発の際に標的化するのに好ましいタンパク質成分は、ＭＡＳＰ−２である。レクチン依存性の補体系のすべての公知のタンパク質（ＭＢＬ、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、Ｌ−フィコリン、ＭＡＳＰ−２、Ｃ２−Ｃ９、Ｂ因子、Ｄ因子およびプロパージン）のうち、ＭＡＳＰ−２だけが、レクチン依存性の補体系に固有であり、かつ、その系が機能するために必要である。レクチン（ＭＢＬ、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、Ｌ−フィコリンおよびＣＬ−１１）もまた、レクチン依存性の補体系における固有の成分である。しかしながら、レクチン成分のいずれか１つが喪失することによっては、レクチン重複性に起因して、必ずしもその系の活性化を阻害しない。レクチン依存性の補体活性化の系の阻害を保証するためには、５種すべてのレクチンを阻害する必要がある。さらに、ＭＢＬおよびフィコリンは、補体とは無関係のオプソニン活性を有することが知られているので、レクチン機能の阻害によって、感染に対するこの有益な宿主防御機構の喪失がもたらされ得る。対照的に、この補体非依存性レクチンオプソニン活性は、ＭＡＳＰ−２が阻害性標的であったとしても、損なわれないままであり得る。レクチン依存性の補体活性化の系を阻害する治療的な標的としてのＭＡＳＰ−２に加えられる利点は、ＭＡＳＰ−２の血漿濃度が、任意の補体タンパク質のうち最も低い（約５００ｎｇ／ｍｌ）ことである；したがって、このことに対応して、本明細書の実施例で実証されるように、低濃度のＭＡＳＰ−２の高親和性インヒビターは、完全な阻害をもたらすのに十分である。
前述のことに一致して、本明細書中に記載されるように、本発明は、高親和性でヒトＭＡＳＰ−２に結合し、かつレクチン媒介性の補体経路の活性化を阻害することができる、モノクローナル完全ヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体を提供する。
ＩＩＩ．ＭＡＳＰ−２阻害抗体
１つの態様において、本発明は、ヒトＭＡＳＰ−２に特異的に結合し、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するかまたは遮断する、モノクローナル完全ヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、ＭＡＳＰ−２の生物学的機能を阻害するかまたは遮断することによって、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系を効果的に阻害し得るか、または効果的に遮断し得る。例えば、阻害抗体は、ＭＡＳＰ−２のタンパク質間の相互作用を効果的に阻害し得るかもしくは遮断し得るか、ＭＡＳＰ−２の二量体化または組み立てを干渉し得るか、Ｃａ２＋結合を遮断し得るか、またはＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ活性部位を干渉し得る。
ＭＡＳＰ−２エピトープ
本発明は、ヒトＭＡＳＰ−２に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。ＭＡＳＰ−２ポリペプチドは、ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−３ならびにＣ１補体系のプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓに類似の分子構造を示す。配列番号４に示されるｃＤＮＡ分子は、ＭＡＳＰ−２の代表例（配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる）をコードし、そして分泌後に切断されてヒトＭＡＳＰ−２の成熟型（配列番号３）がもたらされる、リーダー配列を有するヒトＭＡＳＰ−２ポリペプチド（ａａ１−１５）を提供する。図１Ａに示される通りに、ヒトＭＡＳＰ２遺伝子は、１２個のエキソンを包含する。ヒトＭＡＳＰ−２ ｃＤＮＡは、エキソンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬによってコードされる。配列番号４に示されるｃＤＮＡ分子は、ラットＭＡＳＰ−２（配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる）をコードし、分泌後に切断されて、ラットＭＡＳＰ−２の成熟型（配列番号６）をもたらす、リーダー配列を含むラットＭＡＳＰ−２ポリペプチドを提供する。
当業者は、配列番号１および配列番号４に開示される配列が、それぞれヒトおよびラットのＭＡＳＰ−２の単一の対立遺伝子であること、ならびに、対立遺伝子バリエーションおよび選択的スプライシングが生じると予想されることを認識するだろう。サイレント変異を含む配列および変異によってアミノ酸配列が変化する配列を含む、配列番号１および配列番号４に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内である。ＭＡＳＰ−２配列の対立遺伝子改変体は、標準的な手順に従って、様々な個体由来のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーを探索することによってクローニングされ得る。
ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質のドメイン（配列番号３）を、図１Ｂおよび下記の表１に示し、そのドメインとしては、Ｎ末端のＣ１ｒ／Ｃ１ｓ／ウニＶＥＧＦ／骨形態形成タンパク質（ＣＵＢＩ）ドメイン、上皮成長因子様ドメイン、第２のＣＵＢドメイン（ＣＵＢＩＩ）ならびにタンデム型の補体制御タンパク質ドメインＣＣＰ１およびＣＣＰ２およびセリンプロテアーゼドメインが挙げられる。ＭＡＳＰ−２遺伝子の選択的スプライシングによって、ＭＡｐ１９がもたらされる。ＭＡｐ１９は、４つのさらなる残基（ＥＱＳＬ）を有するＭＡＳＰ−２のＮ末端のＣＵＢ１−ＥＧＦ領域を含む非酵素的なタンパク質である。
いくつかのタンパク質は、ＭＡＳＰ−２に結合するか、またはタンパク質とタンパク質との相互作用によってＭＡＳＰ−２を干渉することが示されている。例えば、ＭＡＳＰ−２は、レクチンタンパク質であるＭＢＬ、Ｈ−フィコリンおよびＬ−フィコリンに結合し、そしてそれらとＣａ２＋依存性複合体を形成することが知られている。各ＭＡＳＰ−２／レクチン複合体は、タンパク質Ｃ４およびＣ２のＭＡＳＰ−２依存性切断によって補体を活性化することが示されている（Ｉｋｅｄａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７４５１−７４５４，１９８７；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１４９７−２２８４，２０００；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：３５０２−３５０６，２００２）。研究によって、ＭＡＳＰ−２のＣＵＢ１−ＥＧＦドメインは、ＭＡＳＰ−２とＭＢＬとの会合に不可欠であることが示されている（Ｔｈｉｅｌｅｎｓ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５０６８，２００１）。ＣＵＢ１ＥＧＦＣＵＢＩＩドメインが、活性なＭＢＬ複合体の形成に必要なＭＡＳＰ−２の二量体化を媒介することも示されている（Ｗａｌｌｉｓ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３０９６２−３０９６９，２０００）。したがって、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化にとって重要であることが知られているＭＡＳＰ−２標的領域に結合するか、または、それを干渉するＭＡＳＰ−２阻害抗体が、同定され得る。
１つの実施形態において、本発明の抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、完全長ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（配列番号３）の一部（例えば、ＭＡＳＰ−２のＣＵＢＩ、ＥＧＦ、ＣＵＢＩＩ、ＣＣＰＩ、ＣＣＰＩＩまたはＳＰドメイン）に結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、ＣＣＰ１ドメイン（配列番号１３（配列番号３のａａ２７８〜３４７））内のエピトープに結合する。例えば、実施例９に記載されるように、ＣＣＰ１ドメインを含むＭＡＳＰ−２フラグメントにのみ結合し、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する、抗ＭＡＳＰ−２抗体（例えば、ＯＭＳ６４６）が同定された。
ＭＡＳＰ−２阻害抗体の結合親和性
抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、補体系における他の抗原よりも少なくとも１０倍高い親和性でヒトＭＡＳＰ−２（配列番号３として示されるもの、配列番号１によってコードされる）に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、補体系における他の抗原よりも少なくとも１００倍高い結合親和性でヒトＭＡＳＰ−２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満、または約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満、または約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下のＫＤ（解離定数）でヒトＭＡＳＰ−２に特異的に結合する。ＭＡＳＰ−２阻害抗体の結合親和性は、本明細書中の実施例３〜５に記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイなどの当該分野で公知の適当な結合アッセイを使用して測定され得る。
ＭＡＳＰ−２阻害抗体の効力
１つの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、１％血清において測定されたとき、≦３０ｎＭ、好ましくは、２０ｎＭ未満もしくは約２０ｎＭ、または約１０ｎＭ未満、または約５ｎＭ未満、または約３ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下のＩＣ５０でＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するのに十分強力である。
１つの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、９０％血清において測定されたとき、≦３０ｎＭ、好ましくは、２０ｎＭ未満もしくは約２０ｎＭ、または約１０ｎＭ未満、または約５ｎＭ未満、または約３ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下のＩＣ５０でＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するのに十分強力である。
ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の阻害は、ＭＡＳＰ−２阻害抗体の投与の結果として生じる、補体系の成分の以下の変化のうちの少なくとも１つを特徴とする：ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系の産物Ｃ４ａ、Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂ−９（ＭＡＣ）（例えば、米国特許第７，９１９，０９４号の実施例２に記載されるように測定される）ならびにそれらの異化分解産物（例えば、Ｃ３ｄｅｓＡｒｇ）の産生または生成の阻害、Ｃ４切断およびＣ４ｂ沈着（例えば、実施例５に記載されるように測定される）ならびにその後の異化分解産物（例えば、Ｃ４ｂｃまたはＣ４ｄ）の減少、またはＣ３切断およびＣ３ｂ沈着（例えば、実施例５に記載されるように測定される）またはその後の異化分解産物（例えば、Ｃ３ｂｃ、Ｃ３ｄなど）の減少。
いくつかの実施形態において、本発明のＭＡＳＰ−２阻害抗体は、すべて血清（ｆｕｌｌ ｓｅｒｕｍ）においてＣ３沈着を、コントロールＣ３沈着の８０％未満、例えば、７０％未満、例えば、６０％未満、例えば、５０％未満、例えば、４０％未満、例えば、３０％未満、例えば、２０％未満、例えば、１５％未満、例えば、１０％未満に阻害することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のＭＡＳＰ−２阻害抗体は、すべて血清においてＣ４沈着を、コントロールＣ４沈着の８０％未満、例えば、７０％未満、例えば、６０％未満、例えば、５０％未満、例えば、４０％未満、例えば、３０％未満、例えば、２０％未満、例えば、１５％未満、例えば、１０％未満に阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、Ｃ１ｑ依存性の補体活性化の系を機能的に損なわないままで（すなわち、古典経路の活性の少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９８％または１００％が保持される）、ＭＡＳＰ−２補体活性化を選択的に阻害する（すなわち、Ｃ１ｒまたはＣ１ｓよりも少なくとも１００倍以上の親和性でＭＡＳＰ−２に結合する）。
いくつかの実施形態において、主題の抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、以下の特徴を有する：（ａ）ヒトＭＡＳＰ−２に対する高親和性（例えば、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは、１ｎＭ以下のＫＤ）および（ｂ）９０％ヒト血清においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性を３０ｎＭ以下のＩＣ５０、好ましくは、１０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する。
実施例２〜１２に記載されるように、高親和性でＭＡＳＰ−２に結合し、かつ免疫系の古典（Ｃ１ｑ依存性）経路の成分を損なわないままでレクチン媒介性の補体活性化を阻害する、完全ヒト抗体が同定された。その抗体の可変軽鎖フラグメントおよび可変重鎖フラグメントは、ｓｃＦｖ型と完全長ＩｇＧ型の両方として、配列決定され、単離され、解析された。図５Ａは、ＭＡＳＰ−２に対する高結合親和性、およびＭＡＳＰ−２依存性活性を阻害する能力を有すると同定された７つのｓｃＦｖ抗ＭＡＳＰ−２クローンのアミノ酸配列のアラインメントである。図５Ｂは、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域を示している、ｓｃＦｖ母クローン１７Ｄ２０、１７Ｎ１６、１８Ｌ１６および４Ｄ９の４つのアミノ酸配列のアラインメントである。実施例６および７に記載されるように、ｓｃＦｖ母クローン１７Ｄ２０および１７Ｎ１６を親和性成熟に供したところ、それらの母クローンと比べて、より高い親和性および増強された効力を有する娘クローンが生成された。図５Ａおよび５Ｂに示されるｓｃＦｖクローンならびに得られた娘クローンの重鎖可変領域（ＶＨ）（ａａ１〜１２０）および軽鎖可変領域（ＶＬ）（ａａ１４８〜２５０）のアミノ酸配列を下記の表２に提供する。
上で述べた抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をアラインメントし、どのアミノ酸がそれらの抗体のどの位置に存在するかを決定することによって、ヒト抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体の置換可能な位置、ならびに（ａｓ ｗｅｌｌ）それらの位置に置換され得るアミノ酸の選択が明らかにされる。１つの代表的な実施形態において、図５Ａおよび５Ｂの重鎖および軽鎖アミノ酸配列をアラインメントし、代表的な抗体の各位置におけるアミノ酸の同一性を決定した。図５Ａおよび５Ｂ（代表的なＭＡＳＰ−２阻害抗体の重鎖および軽鎖の各位置に存在するアミノ酸を図示している）に図示されるように、いくつかの置換可能な位置、ならびにそれらの位置に置換され得るアミノ酸残基は、容易に特定される。別の代表的な実施形態において、置換可能な位置、ならびにこれらの位置に置換され得るアミノ酸残基を決定するために、母および娘クローンの軽鎖アミノ酸配列がアラインメントされ、代表的な抗体の各位置におけるアミノ酸の同一性が決定される。
ある特定の実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、表２に示される重鎖可変ドメイン配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の重鎖可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号１８として示される１７Ｄ２０（ＶＨ）と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の重鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、その主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号１８を含むかまたは配列番号１８からなる重鎖可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２０として示される１７Ｄ２０＿ｃｄ３５ＶＨ２Ｎ１１（ＶＨ）と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の重鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、その主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２０を含むかまたは配列番号２０からなる重鎖可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２１として示される１７Ｎ１６（ＶＨ）と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の重鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、その主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２１を含むかまたは配列番号２１からなる重鎖可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、表２に示される軽鎖可変ドメイン配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の軽鎖可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２２として示される１７Ｄ２０（ＶＬ）と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、その主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２２を含むかまたは配列番号２２からなる軽鎖を有する。
いくつかの実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２４として示される１７Ｄ２０＿３５ＶＨ−２１Ｎ１１ＶＬ（ＶＬ）と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、その主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２４を含むかまたは配列番号２４からなる軽鎖を有する。
いくつかの実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２５として示される１７Ｎ１６（ＶＬ）と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、その主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２５を含むかまたは配列番号２５からなる軽鎖を有する。
いくつかの実施形態において、主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２７として示される１７Ｎ１６＿１７Ｎ９（ＶＬ）と実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）の軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、その主題のヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル阻害抗体は、配列番号２７を含むかまたは配列番号２７からなる軽鎖を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体は、表２に示されるような重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる重鎖または軽鎖を含む。高ストリンジェンシー条件は、５０℃以上における０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ食塩水／０．１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中でのインキュベーションを含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、図５Ａもしくは５Ｂに示されるかまたは下記の表３Ａ〜Ｆおよび表４に記載される任意の重鎖可変配列のＣＤＲのアミノ酸配列と比べて、実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）であるか、または同一配列を含むかもしくは同一配列からなる、１つ以上のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、図５Ａもしくは５Ｂに示されるかまたは下記の表４Ａ〜Ｆおよび表５に記載される任意の軽鎖可変配列のＣＤＲのアミノ酸配列と比べて、実質的に同一（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一、または少なくとも９９％同一）であるか、または同一配列を含むかもしくは同一配列からなる、１つ以上のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を有する。
重鎖可変領域
上の表２および表３Ａ〜Ｆに列挙された母クローンおよび娘クローンに対する重鎖可変領域（ＶＨ）配列を下記に示す。
Ｋａｂａｔ ＣＤＲ（３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３））は太字にしてあり；Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ（２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）および９５〜１０１（Ｈ３））には下線を引いている。
軽鎖可変領域
上の表２および表５Ａ〜Ｆに列挙された母クローンおよび娘クローンに対する軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を下記に示す。
Ｋａｂａｔ ＣＤＲ（２４〜３４（Ｌ１）；５０〜５６（Ｌ２）；および８９〜９７（Ｌ３）は太字にしてあり；Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ（２４〜３４（Ｌ１）；５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）には下線を引いている。これらの領域は、Ｋａｂａｔシステムによってナンバリングされていようと、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによってナンバリングされていようと、同じである。
１つの態様において、本発明は、以下を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する：
（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号３８または配列番号９０として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号５１または配列番号９４として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含み、単離された抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する）。
１つの実施形態において、上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２配列は、配列番号３２または３３として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含む。１つの実施形態において、上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１配列は、配列番号２８または配列番号２９として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む。１つの実施形態において、上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２配列は、配列番号９３として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む。１つの実施形態において、上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１配列は、配列番号９１または配列番号９２として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む。１つの実施形態において、上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号２８を含む。
１つの実施形態において、上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号３２を含む。１つの実施形態において、上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号９０（表４に示されるような）を含む。１つの実施形態において、配列番号９０に示されるアミノ酸配列は、８位にＲ（Ａｒｇ）を含む。
１つの実施形態において、上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号９１（表６に示されるような）を含む。１つの実施形態において、配列番号９１に示されるアミノ酸は、２位にＥ（Ｇｌｕ）を含む。１つの実施形態において、配列番号９１に示されるアミノ酸配列は、８位にＹ（Ｔｙｒ）を含む。
１つの実施形態において、上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号９３（表６に示されるような）を含み、ここで、配列番号９３に示されるアミノ酸配列は、２位にＫ（Ｌｙｓ）を含む。１つの実施形態において、配列番号９３に示されるアミノ酸配列は、３位にＱ（Ｇｌｎ）を含む。
１つの実施形態において、上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号５１を含む。
１つの実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＭＡＳＰ−２に結合する。１つの実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、１％ヒト血清におけるインビトロアッセイにおいて１０ｎＭ以下のＩＣ５０でＣ４活性化を阻害する。１つの実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、９０％ヒト血清において３０ｎＭ以下のＩＣ５０でＣ４活性化を阻害する。１つの実施形態において、その保存的な配列改変は、重鎖可変領域のＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５、６、７、８ ９もしくは１０個のアミノ酸置換、および／または軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までのアミノ酸置換を除けば列挙された可変ドメインと同一の可変領域を含む分子を含むかまたはその分子からなる。
別の態様において、本発明は、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、その抗体は：Ｉ）ａ）ｉ）配列番号２１の３１〜３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ１；およびｉｉ）配列番号２１の５０〜６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ２；およびｉｉｉ）配列番号２１の９５〜１０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびにｂ）ｉ）配列番号２５または配列番号２７の２４〜３４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１；およびｉｉ）配列番号２５または配列番号２７の５０〜５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２；およびｉｉｉ）配列番号２５または配列番号２７の８９〜９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域；またはＩＩ）前記重鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個までのアミノ酸置換および前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は前記可変ドメインと同一であるその改変体を含み、ここで、その抗体またはその改変体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する。１つの実施形態において、前記改変体は、前記重鎖可変領域の３１、３２、３３、３４、３５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１０２位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む。１つの実施形態において、前記改変体は、前記軽鎖可変領域の２５、２６、２７、２９、３１、３２、３３、５１、５２、８９、９２、９３、９５、９６または９７位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む。１つの実施形態において、前記抗体の重鎖は、配列番号２１を含む。１つの実施形態において、前記抗体の軽鎖は、配列番号２５を含む。１つの実施形態において、前記抗体の軽鎖は、配列番号２７を含む。
別の態様において、本発明は、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体を提供し、ここで、その抗体は：Ｉ）ａ）ｉ）配列番号２０の３１〜３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ１；およびｉｉ）配列番号２０の５０〜６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ−２；およびｉｉｉ）配列番号１８または配列番号２０の９５〜１０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびにｂ）ｉ）配列番号２２または配列番号２４の２４〜３４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１；およびｉｉ）配列番号２２または配列番号２４の５０〜５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２；およびｉｉｉ）配列番号２２または配列番号２４の８９〜９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域；またはＩＩ）前記重鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個までのアミノ酸置換および前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は前記可変ドメインと同一であるその改変体を含み、ここで、その抗体またはその改変体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する。１つの実施形態において、前記改変体は、前記重鎖可変領域の３１、３２、３３、３４、３５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１０２位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む。１つの実施形態において、前記改変体は、前記軽鎖可変領域の２５、２６、２７、２９、３１、３２、３３、５１、５２、８９、９２、９３、９５、９６または９７位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む。１つの実施形態において、前記抗体の重鎖は、配列番号２０、または配列番号２０に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、配列番号２０に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性）を含むその改変体を含む。１つの実施形態において、前記抗体の重鎖は、配列番号１８、または配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、配列番号１８に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性）を含むその改変体を含む。１つの実施形態において、前記抗体の軽鎖は、配列番号２２、または配列番号２２に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、配列番号２２に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性）を含むその改変体を含む。１つの実施形態において、前記抗体の軽鎖は、配列番号２４、または配列番号２４に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、配列番号２４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性）を含むその改変体を含む。
１つの実施形態において、前記抗体は、ＭＡＳＰ−２のＣＣＰ１ドメインにおけるエピトープに結合する。
１つの実施形態において、前記抗体は、１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＭＡＳＰ−２に結合する。１つの実施形態において、前記抗体は、１％ヒト血清におけるインビトロアッセイにおいて１０ｎＭ以下のＩＣ５０でＣ３ｂ沈着を阻害する。１つの実施形態において、前記抗体は、９０％ヒト血清において３０ｎＭ以下のＩＣ５０でＣ３ｂ沈着を阻害する。
１つの実施形態において、前記抗体は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択される抗体フラグメントである。１つの実施形態において、前記抗体は、一本鎖分子である。１つの実施形態において、前記抗体は、ＩｇＧ２分子である。１つの実施形態において、前記抗体は、ＩｇＧ１分子である。１つの実施形態において、前記抗体は、ＩｇＧ４分子である。１つの実施形態において、前記ＩｇＧ４分子は、Ｓ２２８Ｐ変異を含む。
１つの実施形態において、前記抗体は、古典経路を実質的に阻害しない（すなわち、古典経路の活性は、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９５％損なわれない）。
別の態様において、本発明は、表面プラズモン共鳴によって測定されたとき１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＭＡＳＰ−２から解離し、かつ１％血清において、マンナンコーティングされた基材上でＣ４活性化を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２０に示されるような重鎖可変領域および配列番号２４に示されるような軽鎖可変領域を含む参照抗体（例えば、参照抗体ＯＭＳ６４６（表２２を参照のこと））によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する。上記にしたがって、本願のある特定の好ましい実施形態に係る抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ｉ）ヒトＭＡＳＰ−２に特異的に結合し、かつ（ｉｉ）本明細書中に開示されるＶＨおよび／もしくはＶＬドメインを含むかまたは本明細書中に開示されるＣＤＲ−Ｈ３もしくはこれらの任意の改変体を含む、本明細書中に記載される任意の抗体と、その抗原への結合について競合するものであり得る。結合メンバー間の競合は、インビトロにおいて、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、および／または同じエピトープもしくは重複するエピトープに結合する特異的な結合メンバーの識別を可能にするタグ付けしていない他の結合メンバーの存在下において検出され得る特定のレポーター分子を一方の結合メンバーにタグ付けすることによって、容易にアッセイされ得る。したがって、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する本明細書中に記載される抗体（例えば、表２４に示されるようなＯＭＳ６４１〜ＯＭＳ６４６のいずれか１つ）とヒトＭＡＳＰ−２への結合について競合するヒト抗体の抗原結合部位を含む特定の抗体またはその抗原結合フラグメントがここで提供される。
改変体ＭＡＳＰ−２阻害抗体
上に記載されたヒトモノクローナル抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する改変体抗体を提供するように改変され得る。その改変体抗体は、上に記載されたヒトモノクローナル抗体の少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加または欠失によって作製され得る。通常、これらの改変体抗体は、上に記載されたヒト抗体の一般的な特徴を有し、上に記載されたヒト抗体の少なくともＣＤＲ、またはある特定の実施形態では、上に記載されたヒト抗体のＣＤＲによく似たＣＤＲを含む。
好ましい実施形態において、上記改変体は、親抗体の１つ以上の超可変領域に１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、その改変体は、少なくとも１つ、例えば、約１〜約１０個、例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の置換、および好ましくは、約２〜約６個の置換を、親抗体の１つ以上のＣＤＲ領域に含み得る。１つの実施形態において、前記改変体は、前記重鎖可変領域の３１、３２、３３、３４、３５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１０２位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む。１つの実施形態において、前記改変体は、前記軽鎖可変領域の２５、２６、２７、２９、３１、３２、３３、５１、５２、８９、９２、９３、９５、９６または９７位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、上記改変体抗体は、前記重鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５もしくは６個までのアミノ酸置換および／または前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５もしくは６個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は表２に示される主題の抗体の可変ドメインと同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、その抗体またはその改変体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する。
通常、上記改変体は、親抗体の重鎖または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。この配列に関する同一性または相同性は、配列をアラインメントし、必要であれば最大パーセント配列同一性を達成するようにギャップを導入した後に親抗体の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中で定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失または挿入（例えば、シグナルペプチド配列、リンカー配列、またはＨＩＳタグなどのタグ）は、配列の同一性または相同性に影響すると解釈されないものとする。上記改変体は、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する能力を保持し、好ましくは、親抗体よりも優れた特性を有する。例えば、上記改変体は、より強い結合親和性および／またはＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するかもしくは遮断する増強された能力を有し得る。
本明細書中に開示される生物学的活性アッセイにおいて抗ＭＡＳＰ−２抗体の型がその活性に影響すると見出されているので、そのような特性を解析するために、例えば、Ｆａｂ型の改変体とＦａｂ型の親抗体または完全長型の改変体と完全長型の親抗体とを比較すべきである。本明細書中の特定の目的の改変体抗体は、親抗体と比べたとき、少なくとも約１０倍、好ましくは、少なくとも約２０倍、最も好ましくは、少なくとも約５０倍の生物学的活性の増強を示すものである。
本発明の抗体は、望ましい特性を増強するように改変され得る（例えば、抗体の血清半減期を制御することが望ましい場合）。通常、完全な抗体分子は、非常に長い血清残留性を有するのに対し、フラグメント（＜６０〜８０ｋＤａ）は、非常にすばやく腎臓で濾過される。ゆえに、ＭＡＳＰ−２抗体の長期間作用が望ましい場合、そのＭＡＳＰ−２抗体は、好ましくは、完全な完全長ＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）であるのに対し、ＭＡＳＰ−２抗体のより短い作用が望ましい場合、抗体フラグメントが好ましいことがある。実施例５に記載されるように、ＩｇＧ４のヒンジ領域内のＳ２２８Ｐ置換が血清安定性を増大させると確認された。したがって、いくつかの実施形態において、主題のＭＡＳＰ−２抗体は、Ｓ２２８Ｐ置換を含む完全長ＩｇＧ４抗体である。
一本鎖抗体
本発明の１つの実施形態において、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、遺伝的に融合された一本鎖分子として、適当なポリペプチドリンカーによって結合された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作された分子として定義される一本鎖抗体である。そのような一本鎖抗体は、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントとも呼ばれる。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを含む。ＭＡＳＰ−２に結合するｓｃＦｖ抗体は、可変軽鎖領域を可変重鎖領域に対してアミノ末端またはそれに対してカルボキシル末端に方向づけられ得る。本発明の代表的なｓｃＦｖ抗体は、配列番号５５〜６１および配列番号６６〜６８として本明細書中に示される。
抗体を生成するための方法
多くの実施形態において、主題のモノクローナル抗体をコードする核酸が、宿主細胞に直接導入され、その細胞が、コードされる抗体の発現を誘導するのに十分な条件下でインキュベートされる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメント（例えば、表２に示される抗体またはそのフラグメント）をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２６、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号９７、配列番号８８および配列番号８９からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子を含む細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子を含む発現カセットを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、抗ＭＡＳＰ−２抗体を生成する方法を提供し、この方法は、本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子を含む細胞を培養する工程を包含する。
ある特定の関連する実施形態によると、本明細書中に記載されるような１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞；任意の抗体、ＣＤＲ、ＶＨもしくはＶＬドメインまたはその抗原結合フラグメントをコードする核酸；およびコードされる生成物を生成する方法（この方法は、そのためのコード核酸からの発現を包含する）が提供される。発現は、上記核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって都合よく達成され得る。発現による生成の後、抗体またはその抗原結合フラグメントは、任意の好適な手法を用いて単離および／または精製され得、次いで、所望のとおり使用され得る。
例えば、宿主細胞として発現カセットの発現に適した任意の細胞、例えば、酵母、昆虫、植物などの細胞が、使用され得る。多くの実施形態において、通常は抗体を産生しない哺乳動物宿主細胞株が使用され、それらの例は、以下のとおりである：サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ−２９３、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４２１６，（１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ３８３：４４−６８（１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）；およびマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１）。さらなる細胞株が当業者には明らかになるだろう。多種多様の細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９から入手可能である。
核酸を細胞に導入する方法は、当該分野で周知である。適当な方法としては、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞のタイプおよび形質転換を行う状況（すなわち、インビトロ、エキソビボまたはインビボ）に依存する。これらの方法の全般的な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５に見られる。いくつかの実施形態において、リポフェクトアミンおよびカルシウムによって媒介される遺伝子導入技術が使用される。
主題の核酸が、細胞に導入された後、その細胞は、代表的には、通常３７℃において、時折、選択下において、抗体を発現させるのに適当な時間にわたって、インキュベートされる。ほとんどの実施形態において、抗体は、代表的には、細胞が増殖している培地の上清に分泌される。
哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスベースの発現系が、主題の抗体を発現させるために利用され得る。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入によって、生存可能であり、かつ感染した宿主において抗体分子を発現することができる、組換えウイルスが生じ得る（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増大し得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
組換え抗体の長期間にわたる高収率産生のために、安定した発現が使用され得る。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が操作され得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、免疫グロブリン発現カセットおよび選択可能なマーカーで宿主細胞を形質転換し得る。その外来ＤＮＡの導入の後、操作された細胞は、富化培地中で１〜２日間増殖され得、次いで、選択培地に切り替えられる。その組換えプラスミド内の選択可能なマーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞がそのプラスミドを染色体に安定的に組み込むこと、および増殖してフォーカス（ｆｏｃｉ）を形成し、その後それをクローン化して細胞株に増殖させることを可能にする。そのような操作された細胞株は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
一旦、本発明の抗体分子が生成されると、その抗体分子は、免疫グロブリン分子を精製するための当該分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ（特に、プロテインＡの後の、特定の抗原に対する親和性によるもの）、およびサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質を精製するための他の任意の標準的な手法によって精製され得る。多くの実施形態において、抗体は、細胞から培養培地に分泌され、その培養培地から回収される。例えば、配列番号７２のアミノ酸１〜１９に提供されるようなシグナルペプチドをコードする配列番号７１のヌクレオチド１〜５７に提供されるように、例えば、シグナルペプチドをコードする核酸配列が、抗体またはフラグメントのコード領域に隣接して含められ得る。そのようなシグナルペプチドは、主題の抗体の生成を促進するために、主題の抗体に対して本明細書中に示されるアミノ酸配列の５’末端に隣接して組み込まれ得る。
薬学的キャリアおよび送達ビヒクル
別の態様において、本発明は、治療有効量のヒト抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体および薬学的に許容可能なキャリアを含む、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の有害作用を阻害するための組成物を提供する。
通常、他の任意の選択された治療薬と併用する本発明のヒトＭＡＳＰ−２阻害抗体組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に適当に含まれる。そのキャリアは、無毒性で、生体適合性であり、ＭＡＳＰ−２阻害抗体（およびそれと併用される他の任意の治療薬）の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択される。ポリペプチドに対する代表的な薬学的に許容可能なキャリアは、Ｙａｍａｄａに対する米国特許第５，２１１，６５７号に記載されている。抗ＭＡＳＰ−２抗体は、固体、半固体、ゲル、液体またはガス状の形態（例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、溶液、堆積物（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）、吸入剤および経口、非経口または外科的投与用の注射）の調製物に製剤化され得る。本発明はまた、医療デバイスなどをコーティングすることによる本組成物の局所投与も企図する。
注射可能物質を介する非経口送達、注射または注入および局所的送達に適したキャリアとしては、蒸留水、生理学的リン酸緩衝化食塩水、通常のリンガー溶液もしくは乳酸加リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液またはプロパンジオールが挙げられる。さらに、無菌不揮発性油が溶媒または懸濁媒質として使用され得る。この目的で、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む任意の生体適合性の油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射可能物質の調製における用途が見出される。上記のキャリアおよび薬剤は、液体、懸濁液、重合可能ゲルもしくは非重合可能ゲル、ペーストまたは軟膏として調合され得る。
上記キャリアはまた、上記薬剤の送達を保持する（すなわち、延長するか、遅延させるか、または制御する）ためか、またはその治療薬の送達、取り込み、安定性または薬物動態を向上させるために、送達ビヒクルを含み得る。そのような送達ビヒクルとしては、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成の有機化合物、無機化合物、重合体のヒドロゲルまたは共重合体のヒドロゲルおよび重合体のミセルから構成される、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェアまたはナノ粒子が挙げられ得るが、これらに限定されない。適当なヒドロゲル送達系およびミセル送達系としては、ＷＯ２００４／００９６６４Ａ２に開示されている、ＰＥＯ：ＰＨＢ：ＰＥＯ共重合体および共重合体／シクロデキストリン複合体ならびに米国特許出願公開第２００２／００１９３６９号に開示されているＰＥＯおよびＰＥＯ／シクロデキストリン複合体が挙げられる。そのようなヒドロゲルを、意図される作用部位に局所的に、または皮下にもしくは筋肉内に注射することにより、徐放デポーが形成され得る。
関節内送達については、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、注射可能な上記の液体もしくはゲルキャリア、注射可能な上記の徐放送達ビヒクル、または、ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体中に保持され得る。
くも膜下腔内（ＩＴ）送達または脳室内（ＩＣＶ）送達については、適切に滅菌された送達系（例えば、液体；ゲル、懸濁液など）を使用して、本発明を投与することができる。
本発明の組成物は、生体適合性の賦形剤（例えば、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、希釈剤、緩衝液、浸透促進剤、乳化剤、結合剤、増粘剤、着香料（経口投与用））も含み得る。
局所送達用の高濃度の抗ＭＡＳＰ−２抗体を達成するために、その抗体は、その後の注射（例えば、デポーの筋肉内注射）用の溶液における粒子または結晶の懸濁液として製剤化され得る。
抗ＭＡＳＰ−２抗体に関してより詳細には、代表的な製剤は、滅菌液体（例えば、水、油、食塩水、グリセロールまたはエタノール）であり得る薬学的キャリアを含む生理的に許容可能な希釈剤中の本化合物の溶液または懸濁液の注射可能な投与量として非経口的に投与され得る。さらに、補助剤（例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性物質、ｐＨ緩衝物質など）が、抗ＭＡＳＰ−２抗体を含む組成物中に存在し得る。薬学的組成物のさらなる成分としては、石油（例えば、動物起源、植物起源または合成起源のもの）、例えば、ダイズ油および鉱油が挙げられる。通常、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）は、注射可能な溶液にとって好ましい液体キャリアである。
抗ＭＡＳＰ−２抗体はまた、活性な薬剤の持続性放出または拍動性放出を可能にするように、そのような様式で製剤化され得る、蓄積注射または埋込調製物の形態で投与され得る。
ＭＡＳＰ−２阻害抗体を含む薬学的組成物は、局所的または全身性の投与様式が、処置される状態に最も適しているか否かに応じて、多くの方法で投与され得る。また、体外再灌流手技に関して、本明細書の上で記載した通りに、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、再循環血液または血漿への本発明の組成物の導入を介して投与され得る。さらに、本発明の組成物は、埋込可能な医療デバイス上または医療デバイス中に本組成物をコーティングまたは組み込むことによって送達され得る。
全身性送達
本明細書中で使用されるとき、用語「全身性送達」および「全身性投与」は、治療的効果が意図される単一の部位または複数の部位に送達される抗体の分散を効率的にもたらす、筋肉内（ＩＭ）、皮下、静脈内（ＩＶ）、動脈内、吸入、舌下、頬側、局所的、経皮的、経鼻、直腸、膣および他の投与経路を含む、経口経路および非経口経路を含むがこれらに限定されないことを意図する。本組成物に対する全身性送達の好ましい経路としては、静脈内、筋肉内、皮下および吸入が挙げられる。本発明の特定の組成物において利用される選択された薬剤にとって的確な全身性投与経路は、所与の投与経路に関連する代謝変換経路に対するその薬剤の感受性を明らかにするために部分的に決定されることが理解されるだろう。
ＭＡＳＰ−２阻害抗体およびＭＡＳＰ−２阻害ポリペプチドは、任意の適当な手段によって、そのような阻害の必要がある被験体に送達され得る。ＭＡＳＰ−２抗体およびポリペプチドの送達方法としては、経口、肺、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、吸入（例えば、微粉製剤を介する吸入）、経皮的、経鼻、膣、直腸または舌下の投与経路による投与が挙げられ、各投与経路に適した剤形に製剤化され得る。
例示目的で、ＭＡＳＰ−２阻害抗体およびＭＡＳＰ−２阻害ペプチドは、そのポリペプチドを吸収することができる身体の膜（ｂｏｄｉｌｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、例えば、鼻、消化管および直腸の膜への適用によって生存中の身体に導入され得る。そのポリペプチドは、代表的には、透過促進剤と組み合わせて吸収性の膜に適用される（例えば、Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．Ｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．５：６９，１９８８；Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３：２１３，１９９０；Ｌｅｅ，Ｖ．Ｈ．Ｌ．，Ｅｄ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；ＤｅＢｏｅｒ，Ａ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１３：２４１，１９９０を参照のこと）。例えば、ＳＴＤＨＦは、胆汁酸塩の構造に類似しているステロイド性の界面活性物質であるフシジン酸の合成誘導体であり、経鼻送達のための透過促進剤として使用されている（Ｌｅｅ，Ｗ．Ａ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２２，Ｎｏｖ．／Ｄｅｃ．１９９０）。
ＭＡＳＰ−２阻害抗体およびＭＡＳＰ−２阻害ポリペプチドは、酵素的分解からそのポリペプチドを保護する脂質などの別の分子と併せて導入され得る。例えば、共有結合のポリマー（特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ））は、身体における酵素的加水分解からある特定のタンパク質を保護し、それにより半減期を延長するために使用されている（Ｆｕｅｒｔｇｅｓ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１：１３９，１９９０）。多くのポリマー系が、タンパク質送達のために報告されている（Ｂａｅ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ９：２７１，１９８９；Ｈｏｒｉ，Ｒ．ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６：８１３，１９８９；Ｙａｍａｋａｗａ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７９：５０５，１９９０；Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０：１９５，１９８９；Ａｓａｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ９：１１１，１９８９；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ９：１９５，１９８９；Ｍａｋｉｎｏ，Ｋ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２：２３５，１９９０；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７８：１１７，１９８９；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７８：２１９，１９８９）。
近年、血清中の安定性および循環中の半減時間が改善されたリポソームが開発されている（例えば、Ｗｅｂｂに対する米国特許第５，７４１，５１６号を参照のこと）。さらに、潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様の調製物の様々な方法が、概説されている（例えば、Ｓｚｏｋａに対する米国特許第５，５６７，４３４号；Ｙａｇｉに対する米国特許第５，５５２，１５７号；Ｎａｋａｍｏｒｉに対する米国特許第５，５６５，２１３号；Ｓｈｉｎｋａｒｅｎｋｏに対する米国特許第５，７３８，８６８号；およびＧａｏに対する米国特許第５，７９５，５８７号を参照のこと）。
経皮的適用については、ＭＡＳＰ−２阻害抗体およびＭＡＳＰ−２阻害ポリペプチドは、他の適当な成分（例えば、キャリアおよび／または補助剤）と併用され得る。意図される投与に対して薬学的に許容可能でなければならないこと、および組成物の活性成分の活性を低下させ得ないことを除いては、そのような他の成分の性質に関して制限はない。適当なビヒクルの例としては、精製コラーゲンを含むかまたは含まない、軟膏剤、クリーム、ゲルまたは懸濁液が挙げられる。ＭＡＳＰ−２阻害抗体およびＭＡＳＰ−２阻害ポリペプチドはまた、好ましくは、液体または半液体の形態で、経皮的パッチ、硬膏剤および包帯に浸透され得る。
本発明の組成物は、所望のレベルの治療的効果を維持するように決定された間隔で周期的に全身性に投与され得る。例えば、組成物は、例えば、２〜４週間ごとまたはそれよりも少ない間隔で皮下注射によって投与され得る。その投与レジメンは、併用する薬剤の作用に影響を及ぼし得る様々な因子を考慮して医師が決定する。これらの因子としては、処置される状態の進行の程度、患者の年齢、性別および体重ならびにその他の臨床上の因子が挙げられる。個別の薬剤についての投与量は、組成物中に含まれるＭＡＳＰ−２阻害抗体ならびに任意の薬物送達ビヒクル（例えば、徐放送達ビヒクル）の存在および性質の関数として変動し得る。さらに、投与量は、送達される薬剤の投与の頻度および薬物動態学的な挙動における変動を埋め合わせるように調整され得る。
局所送達
本明細書中で使用されるとき、用語「局所」は、意図される局在化作用の部位におけるかまたはその部位周辺における薬物の適用を包含し、例えば、皮膚または他の罹患組織への局所的送達、眼への送達、くも膜下腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）、関節内、腔内、頭蓋内もしくは小嚢内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒ）への投与、留置または灌注が挙げられ得る。局所投与は、低用量の投与によって、全身性副作用を回避することを可能にするために、ならびに、局所送達の部位における活性薬剤の送達のタイミングおよび濃度をより正確に管理するために、好ましい場合がある。局所投与によって、代謝、血流などにおける患者間変動にかかわらず、標的部位において既知の濃度がもたらされる。直接的な送達様式によって、投与量管理の改善もまた、もたらされる。
ＭＡＳＰ−２阻害抗体の局所送達は、疾患または状態を処置するための外科的方法という状況（例えば、手技（例えば、動脈のバイパス手術、アテレクトミー、レーザー手技、超音波手技、バルーン血管形成術およびステント留置）中）において達成され得る。例えば、ＭＡＳＰ−２インヒビターは、バルーン血管形成術手技と組み合わせて被験体に投与され得る。バルーン血管形成術手技は、収縮したバルーンを有するカテーテルの動脈への挿入を含む。その収縮したバルーンは、動脈硬化巣の近位に置かれ、そしてプラークが血管壁に対して圧縮されるようにそのバルーンを膨らませる。結果として、そのバルーンの表面は、血管の表面上で血管内皮細胞層と接触する。ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、動脈硬化巣の部位においてその薬剤を放出できる様式でバルーン血管形成術カテーテルに付着され得る。その薬剤は、当該分野で公知の標準的な手順に従って、バルーンカテーテルに付着され得る。例えば、その薬剤が局所的な環境に放出される位置においてそのバルーンを膨らませるまで、その薬剤は、バルーンカテーテルのコンパートメント内に保存され得る。あるいは、バルーンを膨らませるときに、その薬剤が動脈壁の細胞に接触するように、その薬剤をバルーン表面上に含浸させてもよい。その薬剤はまた、Ｆｌｕｇｅｌｍａｎ，Ｍ．Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８５：１１１０−１１１７，１９９２に開示されているような穴のあるバルーンカテーテルにおいて送達され得る。治療的タンパク質をバルーン血管形成術用カテーテルに付着させるための代表的な手順については、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９５／２３１６１も参照のこと。同様に、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、ステントに塗布されるゲルまたは重合体コーティング中に含められてもよいし、ステントが血管に留置された後にＭＡＳＰ−２阻害抗体を溶出するようにステントの材料中に組み込まれてもよい。
処置レジメン
関節炎および他の筋骨格障害の処置において使用されるＭＡＳＰ−２阻害抗体組成物は、関節内注射によって局所的に送達され得る。そのような組成物は、徐放送達ビヒクルを適当に含み得る。局所送達が望まれ得る場合のさらなる例として、尿生殖器状態の処置において使用されるＭＡＳＰ−２阻害抗体組成物は、膀胱内または別の泌尿生殖器の構造内に適当に点滴注入され得る。
予防的な適用では、上記薬学的組成物は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化に関連する状態に感受性であるかまたは別途その状態の危険性のある被験体に、その状態の症状を排除するかまたはその症状の発症の危険性を低下させるのに十分な量で投与される。治療的な適用では、上記薬学的組成物は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化に関連する状態の疑いがあるか、またはその状態にすでに罹患している被験体に、その状態の症状を軽減するかまたは少なくとも部分的に減少させるのに十分な治療有効量で投与される。予防的レジメンと治療的レジメンの両方において、ＭＡＳＰ−２阻害抗体を含む組成物は、その被験体において十分な治療結果が達成されるまでいくつかの投与量で投与され得る。本発明のＭＡＳＰ−２阻害抗体組成物の適用は、急性状態、例えば、再灌流損傷または他の外傷性の損傷を処置するために、その組成物の単回投与または限られた一連の投与によって行われ得る。あるいは、その組成物は、慢性状態、例えば、関節炎または乾癬を処置するために、長期間にわたって周期的な間隔で投与され得る。
本発明において使用されるＭＡＳＰ−２阻害組成物は、レクチン経路の活性化をもたらす急性の事象の直後またはその後間もなく（例えば、虚血事象および虚血組織の再灌流の後）送達され得る。例としては、心筋虚血再灌流、腎虚血再灌流、脳虚血再灌流、臓器移植および指／四肢再付着が挙げられる。他の急性の例としては、敗血症が挙げられる。本発明のＭＡＳＰ−２阻害組成物は、レクチン経路を活性化する急性の事象の後できる限り速やかに、好ましくは、引き金となる事象の１２時間以内、より好ましくは、２〜３時間以内に、例えば、ＭＡＳＰ−２阻害組成物の全身性送達によって、投与され得る。
本発明の方法および組成物は、代表的には診断的および治療的な医学的手技および外科的手技からもたらされる炎症および関連プロセスを阻害するために使用され得る。そのようなプロセスを阻害するために、本発明のＭＡＳＰ−２阻害組成物は、手技付近で（ｐｅｒｉｐｒｏｃｅｄｕｒａｌｌｙ）適用され得る。本明細書中で使用されるとき、「手技付近で」とは、手技前および／または手技中および／または手技後に、すなわち、手技前、手技前および手技中、手技前および手技後、手技前、手技中および手技後、手技中、手技中および手技後、または手技後に、阻害組成物を投与することをいう。手技付近での適用は、外科的部位または手技的部位にその組成物の局所投与によって（例えば、その部位の注射またはその部位の連続的もしくは間欠的な灌注によって、あるいは全身性投与によって）行われ得る。ＭＡＳＰ−２阻害抗体溶液の局所的な周術期の送達に適した方法は、Ｄｅｍｏｐｕｌｏｓに対する米国特許第６，４２０，４３２号およびＤｅｍｏｐｕｌｏｓに対する同第６，６４５，１６８号に開示されている。ＭＡＳＰ−２阻害抗体を含む軟骨保護性組成物の局所送達に適した方法は、国際ＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／０７０６７Ａ２に開示されている。ＭＡＳＰ−２阻害抗体を含む軟骨保護性組成物の標的化全身性送達に適した方法および組成物は、国際ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／０６３７９９Ａ２に開示されている。
投与量
ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化と関連する状態を処置するかまたは回復させるのに治療的に有効な用量で、そのような阻害の必要がある被験体に投与され得る。治療的に有効な用量とは、その状態の症状の回復をもたらすのに十分なＭＡＳＰ−２阻害抗体の量のことをいう。
ＭＡＳＰ−２阻害抗体の毒性および治療的有効性は、実験動物モデル（例えば、本明細書中に記載されるようなアフリカミドリザル）を使用して、標準的な薬学的手順によって測定され得る。そのような動物モデルを使用し、標準的な方法を用いて、ＮＯＡＥＬ（無毒性量）およびＭＥＤ（最小有効用量）が測定され得る。ＮＯＡＥＬ効果とＭＥＤ効果との用量比は、比ＮＯＡＥＬ／ＭＥＤとして表される治癒比である。大きな治癒比または指標を示すＭＡＳＰ−２阻害抗体が、最も好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための一連の投与量を製剤化する際に使用することができる。ＭＡＳＰ−２阻害抗体の投与量は、好ましくは、少し毒性があるかまたは毒性がないＭＥＤを含む一連の循環濃度内に設定する。その投与量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
任意の化合物の製剤化のために、動物モデルを使用して、治療的に有効な用量を推定することができる。例えば、用量は、ＭＥＤを含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて製剤化され得る。ＭＡＳＰ−２阻害抗体の血漿中の定量的レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定してもよい。
毒性研究に加えて、有効な投与量もまた、生存被験体中に存在するＭＡＳＰ−２タンパク質の量およびＭＡＳＰ−２阻害抗体の結合親和性に基づいて推定され得る。正常なヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２レベルが、５００ｎｇ／ｍｌの範囲の低レベルで血清中に存在すること、および、特定の被験体におけるＭＡＳＰ−２レベルが、Ｍｏｌｌｅｒ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８２：１５９−１６７，２００３（本明細書によって参考として援用される）に記載されているＭＡＳＰ−２に対する定量的アッセイを用いて測定され得ることが示されている。
一般に、ＭＡＳＰ−２阻害抗体を含む投与組成物の投与量は、被験体の年齢、体重、身長、性別、全般的な病状およびそれまでの病歴などの因子に応じて変動する。実例として、ＭＡＳＰ−２阻害抗体は、約０．０１０〜１０．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１０〜１．０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１０〜０．１ｍｇ／ｋｇ被験体体重の範囲の投与量で投与され得る。
所与の被験体における本発明のＭＡＳＰ−２阻害組成物およびＭＡＳＰ−２阻害方法の治療的有効性ならびに適切な投与量は、当業者に周知の補体アッセイに従って決定され得る。補体は、数多くの特異的な産物を生成する。最近１０年間で、感度が高く、かつ特異的なアッセイが開発され、また、小さな活性化フラグメントＣ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａならびに大きな活性化フラグメントｉＣ３ｂ、Ｃ４ｄ、ＢｂおよびｓＣ５ｂ−９を含む、これらの活性化産物のほとんどに対して市販されている。これらのアッセイのほとんどは、新しい抗原（新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ））を形成するネイティブタンパク質上には露出していないが上記フラグメント上に露出しているその新抗原と反応する抗体を利用するものであり、それにより、これらのアッセイが非常に単純かつ特異的になる。これらのほとんどが、ＥＬＩＳＡ技術に依存しているが、なおも時折Ｃ３ａおよびＣ５ａに対してラジオイムノアッセイが使用される。これらの後者のアッセイは、プロセシングされていないフラグメントと循環中に見られる主要な形態であるそれらの「ｄｅｓＡｒｇ」フラグメントの両方を測定する。プロセシングされていないフラグメントおよびＣ５ａｄｅｓＡｒｇは、細胞表面レセプターに結合することによって迅速に除去され、それゆえ非常に低濃度で存在するのに対し、Ｃ３ａｄｅｓＡｒｇは、細胞に結合せず、血漿中に蓄積する。Ｃ３ａの測定は、感度が高く経路に依存しない、補体活性化の指標をもたらす。副経路の活性化は、Ｂｂフラグメントを測定することによって評価され得る。膜攻撃経路の活性化の流体相産物ｓＣ５ｂ−９の検出は、補体活性化が完了している証拠をもたらす。レクチン経路および古典経路の両方が、Ｃ４ａおよびＣ４ｄという同じ活性化産物を生成するので、これらの２つのフラグメントを測定しても、これらの２つの経路のうちのどちらがその活性化産物を生成したのかについて何の情報ももたらさない。
ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の阻害は、本発明に従って抗ＭＡＳＰ−２抗体が投与された結果として生じる補体系の成分の以下の変化のうちの少なくとも１つを特徴とする：ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化の系の産物であるＣ４ｂ、Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよび／もしくはＣ５ｂ−９（ＭＡＣ）の生成または産生の阻害、Ｃ４切断およびＣ４ｂ沈着の減少あるいはＣ３切断およびＣ３ｂ沈着の減少。
製品
別の態様において、本発明は、ヒト被験体への治療上の投与に適した単位剤形（例えば、１ｍｇ〜５０００ｍｇ、例えば、１ｍｇ〜２０００ｍｇ、例えば、１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲、例えば、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇまたは１０００ｍｇの単位投与量）の、本明細書中に記載されるようなヒトＭＡＳＰ−２阻害抗体またはその抗原結合フラグメントを備える製品を提供する。いくつかの実施形態において、その製品は、容器、およびその容器上のまたはその容器に付随したラベルまたは添付文書を備える。適当な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが挙げられる。それらの容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。その容器は、上記状態を処置するために有効な組成物を保持し、滅菌されたアクセスポートを有し得る（例えば、その容器は、皮下注射用針によって貫通可能な栓を有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。その組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤は、本発明のＭＡＳＰ−２阻害抗体またはその抗原結合フラグメントである。上記ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の状態の処置のために使用されることを示している。上記ラベルまたは添付文書は、患者に抗体組成物を投与するための指示をさらに含み得る。本明細書中に記載される組み合わせの治療薬を備える製品およびキットもまた企図される。
抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体の治療的な使用
別の態様において、本発明は、ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する方法を提供し、この方法は、本発明のヒトモノクローナル抗ＭＡＳＰ−２阻害抗体を、前記ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するのに十分な量で投与する工程を包含する。
本発明のこの態様によると、実施例１０に記載されるように、本発明のＭＡＳＰ−２阻害抗体は、静脈内投与後のアフリカミドリザルにおいてレクチン経路を阻害することができる。表２４、実施例８に示されるように、この研究において使用される抗体ＯＭＳ６４６は、ヒト血清中でより強力であることが見出された。当業者に公知であるように、非ヒト霊長類は、抗体治療を評価するためにモデルとして使用されることが多い。
米国特許第７，９１９，０９４号、同時係属中の米国特許出願番号１３／０８３，４４１および同時係属中の米国特許出願番号１２／９０５，９７２（これらの各々は、本願の譲受人であるＯｍｅｒｏｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに帰属している）（これらの各々は、本明細書によって参考として援用される）に記載されているように、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体媒介性の血管の状態、虚血再灌流損傷、アテローム性動脈硬化症、炎症性胃腸障害、肺の状態、体外再灌流手技、筋骨格の状態、腎臓の状態、皮膚の状態、臓器もしくは組織移植、神経系の障害もしくは損傷、血液障害、泌尿生殖器の状態、糖尿病、化学療法もしくは放射線治療、悪性疾患、内分泌障害、凝固障害または眼科学的状態を含む、多くの急性および慢性の疾患状態の病原に関与するものとして意味づけられている。したがって、本発明のＭＡＳＰ−２阻害抗体は、上で言及された疾患および状態を処置するために使用され得る。
さらに実施例１１に記載されるように、本発明のＭＡＳＰ−２阻害抗体は、急性放射線症候群の有害な作用のリスクがあるかまたはそれに罹患している哺乳動物被験体を処置する際に有効であり、それにより、インビボにおける治療的有効性が証明される。
以下の実施例は、本発明を実施するためにここで企図されている最良の形態を単に例示するものであり、本発明を限定すると解釈されるべきでない。
実施例１
この実施例では、組換え完全長ヒト、ラットおよびマウスＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−２由来ポリペプチド、ならびに触媒的に不活性化された変異型のＭＡＳＰ−２の組換え発現およびタンパク質産生を説明する。
完全長ヒトおよびラットＭＡＳＰ−２の発現：
リーダー配列を含むヒトＭＡＳＰ−２ポリペプチド（配列番号２）をコードするヒトＭＡＳＰ−２の完全長ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域の制御下で真核生物発現を駆動する哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にサブクローニングした（Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：４４８５−９０，１９９１；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５３７−６６（１９９１）に記載）。リーダー配列を含むラットＭＡＳＰ−２ポリペプチド（配列番号５）をコードする完全長ラットＭＡＳＰ−２ ｃＤＮＡ（配列番号４）をｐＥＤ発現ベクター内にサブクローニングした。次いで、それらのＭＡＳＰ−２発現ベクターを、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９に記載されている標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順を使用して、付着性チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＸＢ１にトランスフェクトした。これらの構築物でトランスフェクトした細胞は、非常にゆっくりと増殖したことから、コードされたプロテアーゼが細胞傷害性であることが意味される。成熟型のヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（配列番号３）および成熟型のラットＭＡＳＰ−２タンパク質（配列番号６）を、下に記載するように培養培地中に分泌させ、単離した。
触媒的に不活性な完全長ＭＡＳＰ−２の発現：
論理的根拠：
認識小成分のＭＢＬ、Ｃ型レクチンＣＬ−１１またはフィコリン（Ｌ−フィコリン、Ｈ−フィコリンまたはＭ−フィコリンのいずれか）（集合的にレクチンと呼ばれる）が各々の炭水化物パターンに結合した後、ＭＡＳＰ−２は、自己触媒的切断によって活性化される。ＭＡＳＰ−２の活性化をもたらす自己触媒的切断は、血清からのＭＡＳＰ−２の単離手順中または組換え発現後の精製中に起きることが多い。抗原として使用するために、より安定なタンパク質調製物を得るために、プロテアーゼドメインの触媒的な三つ組中に存在するセリン残基を、成熟ラットＭＡＳＰ−２タンパク質（配列番号６ Ｓｅｒ６１７をＡｌａ６１７に置換）；または成熟ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（配列番号３ Ｓｅｒ６１８をＡｌａ６１８に置換）においてアラニン残基で置換することによって、ＭＡＳＰ−２Ａと称される触媒的に不活性な形態のＭＡＳＰ−２を作製した。
触媒的に不活性なヒトおよびラットＭＡＳＰ−２Ａタンパク質を作製するために、本明細書によって参考として援用されるＵＳ２００７／０１７２４８３に記載されているように部位特異的突然変異誘発を行った。アガロースゲル電気泳動およびバンド調製後に、そのＰＣＲ産物を精製し、そして標準的なテイリング（ｔａｉｌｉｎｇ）手順を使用して単一のアデノシンオーバーラップを作製した。次いで、アデノシンテイル化ＭＡＳＰ−２ＡをｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換した。ヒトおよびラットＭＡＳＰ−２Ａの各々をさらに、下に記載するように、哺乳動物発現ベクターｐＥＤまたはｐＣＩ−Ｎｅｏのいずれかにサブクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＸＢ１にトランスフェクトした。
ヒトＭａｓｐ−２由来のポリペプチド領域を含む発現プラスミドの構築
ＭＡＳＰ−２の様々なドメインを分泌させるＭＡＳＰ−２シグナルペプチド（配列番号２の残基１〜１５）を使用して、以下の構築物を作製した。ヒトＭＡＳＰ−２ ＣＵＢＩドメイン（配列番号７）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）の残基１〜１２１（Ｎ末端のＣＵＢ１ドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ヒトＭＡＳＰ−２ ＣＵＢＩ／ＥＧＦドメイン（配列番号８）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）の残基１〜１６６（Ｎ末端のＣＵＢ１／ＥＧＦドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ヒトＭＡＳＰ−２ ＣＵＢＩ／ＥＧＦ／ＣＵＢＩＩドメイン（配列番号９）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）のａａ残基１〜２７７（Ｎ末端のＣＵＢＩ ＥＧＦ ＣＵＢＩＩドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ヒトＭＡＳＰ−２ ＥＧＦドメイン（配列番号１０）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）のａａ残基１２２〜１６６（ＥＧＦドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ヒトＭＡＳＰ−２ ＣＣＰＩ／ＣＣＰＩＩ／ＳＰドメイン（配列番号１１）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）のａａ残基２７８〜６７１（ＣＣＰＩ／ＣＣＰＩＩ／ＳＰドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ヒトＭＡＳＰ−２ ＣＣＰＩ／ＣＣＰＩＩドメイン（配列番号１２）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）のａａ残基２７８〜４２９（ＣＣＰＩ／ＣＣＰＩＩドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩドメイン（配列番号１３）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）のａａ残基２７８〜３４７（ＣＣＰＩドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩＩ／ＳＰドメイン（配列番号１４）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）のａａ残基３４８〜６７１（ＣＣＰＩＩ／ＳＰドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ＭＡＳＰ−２のＣＣＰＩＩドメイン（配列番号１５）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）のａａ残基３４８〜４２９（ＣＣＰＩＩドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。ＭＡＳＰ−２のＳＰドメイン（配列番号１６）を発現する構築物を、ＭＡＳＰ−２（配列番号３）のａａ残基４２９〜６７１（ＳＰドメインに対応する）をコードする領域を増幅するＰＣＲによって作製した。
上で述べたＭＡＳＰ−２ドメインを、ＶｅｎｔＲポリメラーゼおよび鋳型としてｐＢＳ−ＭＡＳＰ−２を使用して、確立されたＰＣＲ方法に従ってＰＣＲによって増幅した。センスプライマーの５’プライマー配列によって、ＰＣＲ産物の５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素認識部位（下線部）を導入した。ＭＡＳＰ−２ドメインの各々に対するアンチセンスプライマーを、各ＰＣＲ産物の末端において終止コドンの後ろにＥｃｏＲＩ部位を導入するように設計した。一旦増幅されたら、そのＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターの対応する部位にクローニングした。得られた構築物を、制限マッピングによって特徴づけ、ｄｓＤＮＡ配列決定によって確かめた。
ＭＡＳＰ−２の組換え真核生物発現ならびに酵素的に不活性なラットおよびヒトのＭＡＳＰ−２Ａのタンパク質生成。
上に記載したＭＡＳＰ−２発現構築物およびＭＡＳＰ−２Ａ発現構築物を、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）を使用して、ＤＸＢ１細胞にトランスフェクトした。調製物中に他の血清タンパク質が混入しないことを確実にするために、ＭＡＳＰ−２Ａを、無血清培地中で生成した。２日毎に培地をコンフルエントな細胞から回収した（合計４回）。２つの種の各々についての組換えＭＡＳＰ−２Ａのレベルは、培養培地１リットルあたり平均約１．５ｍｇであった。
ＭＡＳＰ−２Ａタンパク質の精製：ＭＡＳＰ−２Ａ（上に記載したＳｅｒ−Ａｌａ変異体）を、ＭＢＰ−Ａ−アガロースカラム上でのアフィニティークロマトグラフィによって精製した。このストラテジーによって、外来性のタグを使用することなく迅速な精製が可能になった。ＭＡＳＰ−２Ａ（等体積の充填緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５）で希釈した１００〜２００ｍｌの培地）を、１０ｍｌの充填緩衝液で予め平衡化しておいたＭＢＰ−アガロースアフィニティーカラム（４ｍｌ）上に充填した。さらに１０ｍｌの充填緩衝液で洗浄した後、タンパク質を、１．２５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５を用いて１ｍｌずつの画分に溶出した。ＭＡＳＰ−２Ａを含む画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定した。必要であれば、ＭＡＳＰ−２Ａを、ＭｏｎｏＱカラム（ＨＲ５／５）におけるイオン交換クロマトグラフィによってさらに精製した。タンパク質を、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５で透析し、そして同じ緩衝液で平衡化したカラムに充填した。洗浄後、０．０５〜１ＭのＮａＣｌ勾配を用いて１０ｍｌにわたって、結合したＭＡＳＰ−２Ａを溶出した。
結果：２００ｍｌの培地から０．２５〜０．５ｍｇのＭＡＳＰ−２Ａタンパク質の収量が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって測定された７７．５ｋＤａという分子量は、グリコシル化に起因して、無修飾ポリペプチドの計算値（７３．５ｋＤａ）よりも大きい。Ｎ−グリコシル化部位の各々におけるグリカンの結合によって、観察された質量が説明される。ＭＡＳＰ−２Ａは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上を単一のバンドとして移動することから、生合成中にタンパク分解性にプロセシングされないことが示される。平衡超遠心分離によって測定される重量平均分子量は、グリコシル化されたポリペプチドのホモ二量体に対する計算値と一致する。
実施例２
この実施例では、親和性成熟に進めるための、ＭＡＳＰ−２の機能活性を阻止する高親和性完全ヒト抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖ抗体候補を同定するために使用されるスクリーニング方法を説明する。
背景および論理的根拠：
ＭＡＳＰ−２は、多くの別個の機能的ドメインを有する複合体タンパク質であり、その機能的ドメインとしては、ＭＢＬおよびフィコリンに対する結合部位、セリンプロテアーゼ触媒性部位、タンパク分解性基質Ｃ２に対する結合部位、タンパク分解性基質Ｃ４に対する結合部位、ＭＡＳＰ−２チモーゲンの自己活性化に対するＭＡＳＰ−２切断部位および２つのＣａ＋＋結合部位が挙げられる。高親和性でＭＡＳＰ−２に結合するｓｃＦｖ抗体フラグメントを同定し、それらがＭＡＳＰ−２機能活性を遮断することができるか否かを決定するためにその同定されたＦａｂ２フラグメントを機能的アッセイにおいて試験した。
ＭＡＳＰ−２機能活性を遮断するために、抗体またはｓｃＦｖ抗体フラグメントまたはＦａｂ２抗体フラグメントは、ＭＡＳＰ−２機能活性に必要なＭＡＳＰ−２上の構造的エピトープに結合しなければならず、かつその構造的エピトープを干渉しなければならない。したがって、高親和性で結合する抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖまたはＦａｂ２の多くまたはすべてが、ＭＡＳＰ−２機能活性に直接関与するＭＡＳＰ−２上の構造的エピトープに結合しない限り、それらは、ＭＡＳＰ−２機能活性を阻害しないかもしれない。
レクチン経路Ｃ３コンバターゼ形成の阻害を測定する機能的アッセイを使用して、抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖの「遮断活性」を評価した。レクチン経路におけるＭＡＳＰ−２の主要な生理学的役割は、レクチン媒介性補体経路の次なる機能的成分、すなわち、レクチン経路Ｃ３コンバターゼを生成することが公知である。レクチン経路Ｃ３コンバターゼは、Ｃ３をタンパク分解性にＣ３ａおよびＣ３ｂに切断する重要な酵素的複合体（Ｃ４ｂＣ２ａ）である。ＭＡＳＰ−２は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂＣ２ａ）の構造的成分ではない；しかしながら、ＭＡＳＰ−２機能活性は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼを含む２つのタンパク質成分（Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ）を生成するために必要とされる。さらに、上に列挙したＭＡＳＰ−２の別個の機能活性のすべては、ＭＡＳＰ−２がレクチン経路Ｃ３コンバターゼを生成するために必要とされるようである。これらの理由のために、抗ＭＡＳＰ−２ Ｆａｂ２およびｓｃＦｖ抗体フラグメントの「遮断活性」を評価する際に使用するのに好ましいアッセイは、レクチン経路Ｃ３コンバターゼ形成の阻害を測定する機能的アッセイであると考えられる。
ヒトに１ｍｇ／ｋｇを投与した後にインビボにおいて＞９０％のレクチン経路切断をもたらすと予測される治療的な抗ＭＡＳＰ−２抗体に対する標的プロファイルは、９０％血漿においてＩＣ５０＜５ｎＭである。これらのアッセイ形式でのインビトロにおける薬理学的活性とインビボにおける薬力学との関係性を、抗げっ歯類ＭＡＳＰ−２抗体を用いて実験的に確証した。
治療的に使用するための第１世代ＭＡＳＰ−２遮断抗体の選択基準は、以下のとおりだった：ＭＡＳＰ−２に対する高親和性および約２５ｎＭまでの機能的なＩＣ５０値。さらに、非ヒト霊長類血清およびラット血清との交差反応性について候補をスクリーニングした。
方法：
ＭＡＳＰ−２抗原に対するｓｃＦｖファージミドライブラリーのスクリーニング
抗原：
Ｎ末端の５×Ｈｉｓタグを有するヒトＭＡＳＰ−２ＡおよびＮ末端の６×Ｈｉｓタグを有するラットＭＡＳＰ−２Ａを、実施例１に記載した試薬を用いて作製し、先に記載されたように（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５８９４−０２（２００１））ニッケルアフィニティークロマトグラフによって培養上清から精製した。
Ｆａｂ２型のヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体であるＯＭＳ１００を、ＭＡＳＰ−２への結合に対するポジティブコントロールとして使用した。
ファージミドライブラリーの説明：
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域配列のファージディスプレイライブラリーを、抗原パニングに続いて、自動化された抗体のスクリーニングおよび選択に供することにより、ラットＭＡＳＰ−２タンパク質およびヒトＭＡＳＰ−２タンパク質に対する高親和性ｓｃＦｖ抗体を同定した。
パニング法：
概要：２つのパニングストラテジーを使用して、合計３回のパニングで、ＭＡＳＰ−２に結合したファージをファージミドライブラリーから単離した。両方のストラテジーが、溶液におけるパニングおよびＭＡＳＰ−２に結合したファージの釣り上げを含んだ。ＭＡＳＰ−２を、標的上のＨｉｓ−タグ（ＮｉＮＴＡビーズを使用する）またはビオチン（ストレプトアビジンビーズを使用する）のいずれかを介して磁気ビーズ上に固定化した。
最初の２回のパニングは、アルカリ溶出（ＴＥＡ）を含み、３回目のパニングは、まずＭＢＬと競合的に溶出した後、従来のアルカリ（ＴＥＡ）溶出工程を行った。２および３回目の前にネガティブ選択を行い、これは、古典補体経路の機能的アナログ、Ｃ１ｓおよびＣ１ｒに対するものだった。パニングの後、ＭＡＳＰ−２Ａに対するｓｃＦｖフラグメントによるファージの特異的濃縮をモニターしたところ、そのパニングストラテジーが成功したことが決定された（データ示さず）。
３回目のパニングからのｓｃＦｖ遺伝子を、下でさらに記載するように、ｐＨＯＧ発現ベクターにクローニングし、ＭＡＳＰ−２Ａに対する特定のクローンを探索する小規模フィルタースクリーニングを行った。
パニング試薬：
ヒトＭＡＳＰ−２Ａ
ＯＭＳ１００抗体（ポジティブコントロール）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３１４１２）
ＮｉＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ ＃ＬＢ１３２６７）
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン，１０ｍｇ／ｍｌ（ＬＢ１２３２１）
正常ヒト血清（ＬＢ１３２９４）
ポリクローナルウサギ抗ヒトＣ３ｃ（ＬＢ１３１３７）
ヤギ抗ウサギＩｇＧ，ＨＲＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ ＃Ａ１０２ＰＵ）
タグ付きＭＡＳＰ−２Ａ抗原を試験するために、ビオチンタグ付きＭＡＳＰ−２ＡまたはＨＩＳタグ付きＭＡＳＰ−２Ａ抗原（１０μｇ）とともにプレインキュベートされたポジティブコントロールＯＭＳ１００抗体（２００ｎｇ／ｍｌ）を、それぞれ４％乳ＰＢＳ中の５０μｌのＮｉＮＴＡビーズまたは２００μｌのストレプトアビジンビーズを用いて捕捉する実験を行った。結合したＭＡＳＰ−２Ａ−ＯＭＳ１００抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ（１：５０００）およびＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質を用いて検出した。
ＮｉＮＴＡビーズＥＬＩＳＡアッセイ
５０μｌのＮｉＮＴＡビーズを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１ｍｌの４％乳でブロッキングし、ローテーターホイール（ｒｏｔａｔｏｒ ｗｈｅｅｌ）上において室温で１時間インキュベートした。並行して、１０μｇのＭＡＳＰ−２ＡおよびＯＭＳ１００抗体（４％乳−ＰＢＳ中に２００ｎｇ／ｍｌに希釈されたもの）を１時間プレインキュベートした。次いで、各工程の間に磁石を使用して、そのビーズを１ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＯＭＳ１００抗体とともにプレインキュベートされたＭＡＳＰ−２Ａを、洗浄されたビーズに加えた。その混合物をローテーターホイール上においてＲＴで１時間インキュベートし、次いで、上に記載したように磁石を使用して１ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。そのチューブを、ＰＢＳ中４％乳において１：５０００希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰとともにＲＴで１時間インキュベートした。ネガティブコントロールの場合は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ（１：５０００）を、別個のチューブ内の洗浄され、ブロッキングされた、Ｎｉ−ＮＴＡビーズに加えた。
上記サンプルを、ローテーターホイール上において室温で１時間インキュベートし、次いで、上に記載したように磁石を使用して１ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回、および１×ＰＢＳで１回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質を加え、室温で３分間インキュベートした。そのチューブを、磁気ラックに２分間置いてビーズを濃縮し、次いで、ＴＭＢ溶液をマイクロタイタープレートに移し、１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにおいて読み出した。
ストレプトアビジンビーズＥＬＩＳＡアッセイ
このアッセイは、代わりにサンプル１つあたり２００μｌのストレプトアビジンビーズおよび非ビオチン化抗原を使用したこと以外は、ＮｉＮＴＡビーズＥＬＩＳＡアッセイについて上に記載したように行った。
結果：ポジティブコントロールＯＭＳ１００抗体とともにプレインキュベートしたＨｉｓタグ付きおよびビオチンタグ付きＭＡＳＰ−２Ａ抗原の各々は、それぞれＮｉＮＴＡビーズまたはストレプトアビジンビーズを用いて首尾よく捕捉された。
パニング
ＨＩＳタグ付きまたはビオチンタグ付きＭＡＳＰ−２Ａに対するｓｃＦｖファージライブラリーの３回のパニングを、それぞれ表７または表８に示されるように行った。３回目のパニングを、まずＭＢＬで溶出し、次いでＴＥＡ（アルカリ）で溶出した。標的のＭＡＳＰ−２Ａに対するｓｃＦｖフラグメントをディスプレイしているファージの特異的濃縮をモニターするために、固定化されたＭＡＳＰ−２Ａに対するポリクローナルファージＥＬＩＳＡを、下に記載するように行った。
パニング後に濃縮されたポリクローナルファージに対するＭＡＳＰ−２Ａ ＥＬＩＳＡ
上に記載したようなヒトＭＡＳＰ−２に対するｓｃＦｖファージライブラリーの３回のパニングの後、下に記載するように、固定化されたＭＡＳＰ−２Ａに対するパニングによって作製された濃縮されたポリクローナルファージ集団においてＥＬＩＳＡアッセイを行うことによって、標的ＭＡＳＰ−２Ａに対するｓｃＦｖフラグメントを用いたファージの特異的濃縮をモニターした。
方法：
５ｎｇ／ｍｌのＭＡＳＰ−２Ａを、４℃で一晩、ＰＢＳにおいてｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート上に固定化した。３回のすべてのパニングからのパッケージングされたファージを、４％乳−ＰＢＳにおいて１：３希釈し、３倍希釈で力価測定した。ネガティブコントロールは、Ｍ１３ヘルパーファージだった。
ブロッキングは、ＰＢＳ中４％乳だった。上記プレートを、すべての工程の間に２００μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％（ｖ／ｖ）中で３回洗浄した。１次抗体は、４％乳−ＰＢＳ（ｗ／ｖ）中の１：５０００のウサギα−ｆｄ（Ｍ１３コートタンパク質）だった。結合体は、４％乳−ＰＢＳ（ｗ／ｖ）中の１：１０．０００のウサギα−ヤギ−ＨＲＰだった。基質は、ＡＢＴＳだった。洗浄およびブロッキングを除くすべての体積は、１００μｌ／ウェルだった。すべてのインキュベーションは、室温での振盪しながらの１時間だった。
結果：
ファージＥＬＩＳＡの結果は、両方のパニングストラテジーについてＭＡＳＰ−２Ａに対するｓｃＦｖの特異的濃縮を示した。図２を参照のこと。図２に示されるように、ＮｉＮＴＡ磁気ビーズによる捕捉を含むストラテジーは、２回のパニングの後、ＭＡＳＰ−２Ａに対するファージ上でのｓｃＦｖの濃縮をもたらしたのに対し、両方のストラテジーが、３回目のパニングの後、競合的な溶出とＴＥＡ溶出の両方において良好な濃縮を有した。ネガティブコントロールファージは、Ｍ１３ヘルパーファージだったが、それは、その最低希釈においてＭＡＳＰ−２Ａに対して交差反応を示さなかった。これらの結果から、観察されたシグナルが、ＭＡＳＰ−２Ａに特異的に結合するｓｃＦｖに起因することが証明される。
フィルタースクリーニング：
３回目のパニングからのｓｃＦｖフラグメントをコードするプラスミドを含む細菌コロニーを拾い、ニトロセルロース膜上に格子状に並べ（ｇｒｉｄｄｅｄ）、非誘導培地上で一晩増殖させることにより、マスタープレートを作製した。３回目のパニングから合計１８，０００個のコロニーを拾い、半数を競合溶出から、および半数をその後のＴＥＡ溶出から解析した。
上記の細菌コロニーを含むニトロセルロース膜を、ＩＰＴＧを用いて誘導することにより、可溶性ｓｃＦｖタンパク質を発現および分泌させ、ＰＢＳ中４％乳（ブロッキング溶液）でコーティングされた対応する膜とともに、ＭＡＳＰ−２Ａ抗原でコーティングされた第２のニトロセルロース膜と接触させた。
ＭＡＳＰ−２Ａに結合したＳｃＦｖを、それらのｃ−Ｍｙｃタグを介して、マウスα−ｃＭｙｃ ｍＡｂおよびウサギα−マウスＨＲＰを用いて検出した。ＭＡＳＰ−２Ａに対して陽性かつ乳−ＰＢＳに対して陰性のｓｃＦｖクローンに対応するヒットを、さらなる発現およびその後のＥＬＩＳＡ解析のために選択した。
結果：ＭＡＳＰ−２Ａに対するｓｃＦｖファージミドライブラリーのパニングの後のｓｃＦｖ変換およびフィルタースクリーニングによって、１３７個の陽性クローンが得られた。それらの陽性クローンの大部分は、ＮｉＮＴＡストラテジーとストレプトアビジンストラテジーの両方を使用したときのＭＢＬとの競合溶出に由来した。すべての陽性クローンが、微小発現（２００μｌスケール）およびその後の抽出に進んだ。細菌懸濁液をスクロース溶解緩衝液およびリゾチームと１時間インキュベートし、その後、その上清を遠心分離工程によって単離することによって細菌のペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａ）からＳｃＦｖを単離した。ペリプラズムの内容物とともに、培地中に分泌されたｓｃＦｖを含む上清を、２つのアッセイ：下記に詳細に記載されるような、物理的に吸着されたＭＡＳＰ−２Ａを使用するＥＬＩＳＡ、およびＣＭ５チップにアミンカップリングされたＭＡＳＰ−２ＡをＢｉｏｃｏｒｅにおいて使用する結合解析によって解析した。
パニング／ｓｃＦｖ変換およびフィルタースクリーニングによって同定されたＳｃＦｖ候補クローンに対するＭＡＳＰ−２Ａ ＥＬＩＳＡ
方法：
４μｇ／ｍｌのＭＡＳＰ−２Ａを、４℃で一晩、ＰＢＳにおいてｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上に固定化した。翌日、そのプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で３回洗浄することによってブロッキングした。１３７個のｓｃＦｖ候補（上に記載したように作製された）の各々からの粗製ｓｃＦｖ材料（１００μｌの培地−ペリプラズム抽出物）をプレートの１ウェルごとに加えた。次に、抗ｃＭｙｃを加え、最後の工程では、ＨＲＰ結合体化ウサギ抗マウスを適用することにより、結合したｓｃＦｖを検出した。ペルオキシダーゼ基質１ステップＡＢＴＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）において反応を発色させた。ポジティブコントロールは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％中に１０μｇ／ｍｌに希釈されたＯＭＳ１００（Ｆａｂ２型の抗ＭＡＳＰ−２抗体）だった。ネガティブコントロールは、プラスミドを含まないＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の培地−ペリプラズムだった。
３×２００μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％（ｖ／ｖ）の洗浄を、すべての工程の間に行った。
１次抗体は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％（ｗ／ｖ）中のマウスα−ｃＭｙｃ，１：５０００だった。
結合体は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％（ｗ／ｖ）中１：５０００のウサギα−ヤギ−ＨＲＰまたはヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ，Ｐｉｅｒｃｅ ３１４１２）だった。基質は、室温での１５分間のインキュベーションによるＡＢＴＳだった。洗浄およびブロッキングを除くすべての体積は、１００μｌ／ウェルだった。すべてのインキュベーションは、室温での振盪しながらの１時間だった。
結果：１０８／１３７個のクローンが、このＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性であり（データ示さず）、このうちの４５個のクローンを、下に記載するようにさらに解析した。ポジティブコントロールは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１０μｇ／ｍｌに希釈されたＯＭＳ１００ Ｆａｂ２であり、このクローンは、陽性だった。ネガティブコントロールは、プラスミドを含まないＸＬ１−Ｂｌｕｅからの培地−ペリプラズムであり、これは、陰性だった。
実施例３
この実施例では、正常ヒト血清においてＭＡＳＰ−２活性を阻止する能力について高親和性完全ヒト抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖ抗体候補を解析するために使用されたＭＡＳＰ−２機能的スクリーニング方法を説明する。
論理的根拠／背景
レクチン経路Ｃ３コンバターゼ形成の阻害を測定するアッセイ：
レクチン経路Ｃ３コンバターゼ形成の阻害を測定する機能的アッセイを使用して、抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖ候補クローンの「遮断活性」を評価した。レクチン経路Ｃ３コンバターゼは、Ｃ３を２つの強力な炎症促進性フラグメント（アナフィラトキシンＣ３ａおよびオプソニンのＣ３ｂ）へとタンパク分解性に切断する酵素的複合体（Ｃ４ｂＣ２ａ）である。Ｃ３コンバターゼの形成は、炎症の媒介に関してレクチン経路における重要な工程であるらしい。ＭＡＳＰ−２は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂＣ２ａ）の構造的成分ではない；したがって、抗ＭＡＳＰ−２抗体（またはＦａｂ２）は、既存のＣ３コンバターゼの活性を直接阻害しない。しかしながら、ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ活性は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼを含む２つのタンパク質成分（Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ）を生成するために必要とされる。したがって、ＭＡＳＰ−２機能活性を阻害する抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖ（すなわち、遮断抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖ）は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼのデノボ形成を阻害する。Ｃ３は、その構造の一部として、反応性の高い独特のチオエステル基を含む。このアッセイにおいてＣ３コンバターゼがＣ３を切断する際に、Ｃ３ｂ上のチオエステル基は、プラスチックウェルの底面上に固定化された高分子上のヒドロキシル基またはアミノ基とエステル結合またはアミド結合を介して共有結合を形成することができ、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＣ３ｂの検出を容易にし得る。
酵母マンナンは、レクチン経路の公知のアクチベーターである。Ｃ３コンバターゼの形成を測定する以下の方法において、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを、希釈ヒト血清と一緒にインキュベートしてレクチン経路を活性化した。次いで、そのウェルを洗浄し、ウェル上に固定化されたＣ３ｂについて標準的なＥＬＩＳＡ法を使用してアッセイする。このアッセイにおいて生成されたＣ３ｂの量は、レクチン経路Ｃ３コンバターゼのデノボ形成を直接反映するものである。選択された濃度における抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖを、Ｃ３コンバターゼ形成およびそれに続くＣ３ｂ生成を阻害する能力についてこのアッセイにおいて試験した。
方法：
実施例２に記載したように同定された４５個の候補クローンを発現させ、精製し、同じストック濃度に希釈し、それを再度、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有ＧＶＢ緩衝液（４．０ｍＭバルビタール、１４１ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ゼラチン，ｐＨ７．４）に希釈することにより、すべてのクローンが同じ量の緩衝液を有することを確実にした。それらのｓｃＦｖクローンを各々、２μｇ／ｍｌの濃度において三連で試験した。ポジティブコントロールは、ＯＭＳ１００ Ｆａｂ２であり、０．４μｇ／ｍｌにおいて試験した。ｓｃＦｖ／ＩｇＧクローンの存在下および非存在下においてＣ３ｃの形成をモニターした。
マンナンを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３＋３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋１．５ｍＭ ＮａＮ３），ｐＨ９．５において２０μｇ／ｍｌ（１μｇ／ウェル）の濃度に希釈し、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。翌日、マンナンコーティングされたプレートを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１００μｌの１％ＨＳＡブロッキング溶液をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。そのプレートを、２００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、サンプルを加えるまで、２００μｌのＰＢＳとともに氷上で保存した。
正常ヒト血清をＣａＭｇＧＶＢ緩衝液中に０．５％に希釈し、ｓｃＦｖクローンまたはＯＭＳ１００ Ｆａｂ２ポジティブコントロールを、この緩衝液に０．０１μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ（ＯＭＳ１００コントロールのみ）および１０μｇ／ｍｌにおいて三連で加え、氷上で４５分間プレインキュベートした後、ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに加えた。反応を、３７℃で１時間インキュベーションすることによって開始し、そのプレートを氷浴に移すことによって停止させた。ウサギα−マウスＣ３ｃ抗体に続いてヤギα−ウサギＨＲＰを用いて、Ｃ３ｂ沈着を検出した。ネガティブコントロールは、抗体を含まない緩衝液であり（ＯＭＳ１００なし＝最大Ｃ３ｂ沈着）、ポジティブコントロールは、ＥＤＴＡを含む緩衝液だった（Ｃ３ｂ沈着なし）。マンナン陰性のウェルであること以外は同じアッセイを行うことによって、バックグラウンドを測定した。マンナンを含まないプレートに対するバックグラウンドシグナルを、マンナン陽性のシグナルから引き算した。カットオフ判定基準を、無関係のｓｃＦｖクローン（ＶＺＶ）および緩衝液のみの活性の半分に設定した。
結果：カットオフ基準に基づいて、合計１３個のクローンが、図３Ａおよび３Ｂに示されるようにＭＡＳＰ−２の活性を阻止すると見出された。＞５０％経路抑制をもたらす１３個すべてのクローンを選択し、配列決定したところ、下記の表９に示されるように、１０個の特有なクローンが得られた。その表９に示される１０個の異なるクローンは、補体アッセイにおいて許容可能な機能活性をもたらすと見出された。１０個すべてのクローンが、同じ軽鎖サブクラスλ３を有するが３つの異なる重鎖サブクラスＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ６を有すると見出された。生殖細胞系列配列とのそれらのクローンの配列同一性もまた、表９に示す。
上の表９に示されたように、許容可能な機能活性および特有な配列を有する１０個の異なるクローンをさらなる解析のために選択した。表９で述べられているように、それらのクローンのいくつかは、同一配列に基づいて２または３回検出された（クローン名を含む表９の１列目を参照のこと）。
１０個のｓｖＦｃ候補クローンの発現および精製
表９に示された１０個の候補クローンを１リットルスケールで発現させ、ニッケルクロマトグラフィにおけるイオン交換により精製した。その後、各クローンのサンプルをサイズ排除クロマトグラフィカラムに流して、モノマーおよびダイマーの含有量を評価した。下記の表１０に示されるように、ほとんどすべてのｓｃＦｖクローンがモノマー型で存在し、このモノマー画分を、さらなる試験および順位付けのために単離した。
結合および機能活性についてのモノマー画分の試験
表１０に示されたクローンを、１Ｌスケールで発現させ、金属クロマトグラフィおよびイオン交換において精製し、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によりモノマー画分に分離し、機能的アッセイを繰り返すことにより、ＩＣ５０値および交差反応性を測定した。
モノマー画分における機能的アッセイ：
表１０に示される上位１０個のクローンのモノマー画分を精製し、希釈系列（その各々には、同じ濃度の、カルシウムおよびマグネシウムを含むＧＶＢ緩衝液ならびにヒト血清が与えられている）において機能的なＩＣ５０ｎＭについて試験した。それらのｓｃＦｖクローンを、１２の希釈において三連で試験した。ポジティブコントロールは、ＯＭＳ１００ Ｆａｂ２だった。Ｃ３ｂ沈着を抗体の存在下および非存在下においてモニターした。結果を下記の表１１に示す。
結合アッセイ：
２つの異なる方法において、１０個の候補ｓｃＦｖクローンの精製モノマー画分に対して結合親和性ＫＤを測定した。ＭＡＳＰ−２Ａを、ＣＭ５チップへのアミンカップリングによって固定化するか、またはまず、一定濃度のｓｃＦｖ（５０ｎＭ）をアミンカップリングされた高親和性α−ｃＭｙｃ抗体で捕捉し、次に、溶液中の一連の濃度のＭＡＳＰ−２Ａをそのチップの上を通過させた。結果を下記の表１１に示す。
結果：
結果の考察：
表１１に示されたように、機能的アッセイにおいて、１０個の候補ｓｃＦｖクローンのうち５個が、０．５％ヒト血清を使用したとき、２５ｎＭの標的基準未満のＩＣ５０ｎＭ値をもたらした。下に記載するように、これらのクローンを、他の種における機能活性を測定するために非ヒト霊長類血清およびラット血清の存在下においてさらに試験した。溶液における結合親和性に関しては、すべての結合親和性が、低ｎＭまたはそれより良好な範囲であったのに対し、固定化されたＭＡＳＰ−２を用いた従来のアッセイでは、２つのクローン（４Ｄ９および１７Ｄ２０）だけしか、低ｎＭ範囲の親和性を有しなかった。溶液ベースのアッセイにおけるより高い親和性の観察結果は、おそらく、抗原が溶液中では多量体化するという事実の結果である。また、標的がチップ上に固定化されたとき（方向付けられたカップリングによって）、エピトープがマスクされることにより、固定化されたアッセイでは、観察される親和性が低下し得る。
実施例４
この実施例では、１０個の候補ヒト抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖクローンをラットＭＡＳＰ−２に対する交差反応性について試験した結果、ならびにヒト血清、非ヒト霊長類血清およびラット血清においてＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する能力を測定する機能的アッセイにおいてこれらのｓｃＦｖクローンのＩＣ５０値を測定した結果を説明する。
方法：
ラットＭＡＳＰ−２に対する交差反応性
実施例３の表９に示された１０個の候補ｓｃＦｖクローンを、吸着されたラットＭＡＳＰ−２Ａに対する従来のＥＬＩＳＡアッセイにおいてラットＭＡＳＰ−２Ａに対する交差反応性について試験した。ラットＭＡＳＰ−２Ａを、ＰＢＳにおいて４μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上にコーティングした。翌日、そのプレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）において３回洗浄することによってブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにおいて２０μｇ／ｍｌに希釈されたＳｃＦｖクローン（１００μｌ）をそのプレートに加え、さらに４倍希釈物で３回力価測定した。ＭＡＳＰ−２Ａ特異的ｓｖＦｃクローン（結合したｓｃＦｖを含むウェル）を、抗ｃＭｙｃおよびウサギ抗マウスＨＲＰ二次抗体で検出した。その反応をペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）において発色させた。ポジティブコントロールは、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにおいて１０μｇ／ｍｌに希釈されたＯＭＳ１００ Ｆａｂ２だった。試験されたすべてのクローンが、ラットＭＡＳＰ−２Ａに対して交差反応を示したが、２回目のパニングにおいてラットＭＡＳＰ−２を用いたので、これは予想されたものだった（データ示さず）。
ヒト血清、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血清およびラット血清における１０個の候補ｓｃＦｖクローンの機能的特徴付け
種々の血清におけるベースラインＣ３ｃレベルの測定
まず、以下のとおり、上記３種の血清（ヒト、ラットおよびＮＨＰ）においてベースラインＣ３ｂレベルを比較する実験を行った。
マンナンを２０μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。翌日、ウェルを１％ＨＳＡでブロッキングした。正常ヒト、ラットおよびアフリカミドリザル血清（非ヒト霊長類「ＮＨＰ」）血清を、２％から開始して２倍希釈でＣａＭｇＧＶＢ緩衝液に希釈した。反応を、３７℃で１時間インキュベーションすることによって開始し、プレートを氷浴に移すことによって停止させた。ウサギ抗マウスＣ３ｃ抗体に続いてヤギ抗ウサギＨＲＰを用いて、Ｃ３ｂ沈着を検出した。ネガティブコントロールは、抗体を含まない緩衝液であり（ＯＭＳ１００なしは、最大Ｃ３ｂ沈着をもたらす）、阻害に対するポジティブコントロールは、ＥＤＴＡを含む緩衝液だった（Ｃ３ｂ沈着なし）。
図４は、３種の血清（ヒト、ラットおよびＮＨＰ）におけるベースラインＣ３ｃレベルをグラフで図示している。図４に示されるように、それらのＣ３ｃレベルは、試験された種々の血清において非常に異なっていた。それらのＣ３ｃレベルを比較すると、１％ヒト血清は、０．２％ＮＨＰおよび０．３７５％ラット血清と等しいレベルをもたらすとみられた。これらの結果に基づいて、ｓｃＦｖの結果が３種の異なるタイプの血清において直接比較できるように、血清の濃度を正規化した。
種々の血清におけるＳｃＦｖクローンの機能的アッセイ
次いで、上記１０個の候補ｓｃＦｖクローンの精製モノマー画分を、ヒト血清、ラット血清およびアフリカミドリザル血清（非ヒト霊長類「ＮＨＰ」）における機能的ＩＣ５０ｎＭについて試験した。このアッセイは、１０００ｎＭ ｓｃＦｖ精製タンパク質、およびＣａＭｇＧＶＢ緩衝液において０．９％に希釈された正常ヒト血清；ＣａＭｇＧＶＢ緩衝液において０．２％に希釈されたアフリカミドリザル血清；またはＣａＭｇＧＶＢ緩衝液において０．３７５％に希釈されたラット血清を使用して、実施例３に記載されたように行った。１０個すべてのｓｃＦｖクローンを、同じ濃度の、カルシウムおよびマグネシウムを含むＧＶＢ緩衝液ならびに血清が与えられた希釈系列において試験した。それらのｓｃＦｖクローンを、１２の希釈において三連で試験した。ポジティブコントロールは、１００ｎｇ／ｍｌのＯＭＳ１００ Ｆａｂ２またはその反応物へのＥＤＴＡの添加だった。ネガティブコントロールは、無関係のｓｃＦｖコントロールまたはｓｃＦｖを含まないＰＢＳだった。Ｃ３ｂ沈着をｓｃＦｖまたはＦａｂ２抗体の存在下および非存在下においてモニターした。１００ｎｇ／ｍｌのＯＭＳ１００のバックグラウンドシグナルをすべてのシグナルから引き算した。表１２は、３種すべての血清における機能的アッセイの結果を要約している。
種々の血清におけるｓｃＦｖ候補クローンにおける機能活性についての結果の要旨：
上記血清をＣ３ｂ沈着レベルに関して正規化した後、上記ｓｃＦｖクローンの１０個すべてがヒト血清と非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血清の両方において機能を示した。ヒト血清において最も活性な６つのクローンは、最良から最悪に順位付けすると：９Ｐ１３＞１７Ｎ１６＞１７Ｄ２０＞４Ｄ９＞３Ｆ２２＞１８Ｌ１６だった。ＮＨＰ血清では、それらのクローンは、順位付けされた（最良から最悪の順で）：１７Ｌ２０＞１７Ｎ１６＞１７Ｄ２０＞９Ｐ１３＞１８Ｌ１６＞３Ｆ２２。１７Ｎ１６と１７Ｄ２０の両方が、ヒト血清とＮＨＰ血清の両方に対して上位３つに順位付けされた。１７Ｄ２０は、ラット血清においてもいくらかの活性を示した。
これらの結果に基づいて、上位３つのｓｃＦｖクローンは、１８Ｌ１６、１７Ｄ２０および１７Ｎ１６であると決定された。これらの３つのクローンを、下記の表１３に示されるように希薄なヒト血清（１％血清）においてさらに解析した。
図５Ａは、完全長ｓｃＦｖクローン１７Ｄ２０、１８Ｌ１６、４Ｄ９、１７Ｌ２０、１７Ｎ１６、３Ｆ２２および９Ｐ１３のアミノ酸配列のアラインメントである。これらのｓｃＦｖクローンは、重鎖可変領域（ａａ１〜１２０）、リンカー領域（ａａ１２１〜１４５）および軽鎖可変領域（ａａ１４６〜２５０）を含む。図５Ａに示されるように、最も活性なクローンの重鎖領域（残基１〜１２０）のアラインメントは、それぞれＶＨ２およびＶＨ６遺伝子ファミリーに属する２つの異なる群を明らかにする。図５Ａに示されるように、ＶＨ２クラスのクローン：１７Ｄ２０、１８Ｌ１６および４Ｄ９に関するＶＨ領域は、合計１２０アミノ酸領域中、２０個のａａ位置において可変性を有した（すなわち、８３％の同一性）。
さらに図５Ａに示されるように、ＶＨ６クラスのクローン：１７Ｌ２０、１７Ｎ１６、３Ｆ２２および９Ｐ１３に関するＶＨ領域は、合計１２０アミノ酸領域中、１８個のａａ位置において可変性を有する（すなわち、８５％の同一性）。
図５Ｂは、ｓｃＦｖクローン１７Ｄ２０、１７Ｎ１６、１８Ｌ１６および４Ｄ９の配列のアラインメントである。
順位付けの優先順位は、（１）ヒト血清機能的効力および完全遮断；（２）ＮＨＰ交差反応性および（３）配列多様性だった。各遺伝子ファミリーの最良の代表として１７Ｄ２０および１７Ｎ１６を選択した。かなりのＣＤＲ３配列多様性を有する第３の候補として１８Ｌ１６を選択した。
ヒトに対する最良の機能的効力；サルに対するかなりの交差反応性、および異なるＶＨ遺伝子ファミリーに加えて、完全な機能遮断に起因して、１７Ｎ１６および１７Ｄ２０が、上位２つの選択だった。１７Ｎ１６とほぼ同一のＶＨ配列に起因して、３Ｆ２２および９Ｐ１３を除外した。中程度の力価に起因して、１８Ｐ１５、４Ｊ９および２１Ｂ１７を除外した。１７Ｌ２０は、部分的にしか遮断しなかったので、追跡しなかった。
１８Ｌ１６および４Ｄ９は、１７Ｄ２０と比べて、類似の活性およびかなりの多様性を有した。４Ｄ９よりも霊長類における交差反応性が高いという理由から、１８Ｌ１６を選択した。
したがって、これらの基準に基づいて：以下の３つの母クローン：１７Ｄ２０、１７Ｎ１６および１８Ｌ１６を、下でさらに記載されるような親和性成熟へ進めた。
実施例５
この実施例では、３つの母クローン１７Ｄ２０、１７Ｎ１６および１８Ｌ１６（実施例２〜４に記載したように同定された）の野生型ＩｇＧ４型へのクローニング、ならびに完全長ＩｇＧとしての３つの母クローンの機能性の評価を説明する。
論理的根拠：
中程度の機能的効力を有する完全ヒト抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖ抗体を、実施例２〜４に記載したようにファージディスプレイを用いて同定した。そのような３つの母クローン１７Ｄ２０、１７Ｎ１６および１８Ｌ１６を親和性成熟のために選択した。完全長ＩｇＧとしてのこれらの母クローンの機能性を評価するために、これらの抗体のＩｇＧ４野生型およびＳ２２８Ｐヒンジ領域ＩｇＧ４変異型を作製した。血清安定性を高めるためにＳ２２８Ｐヒンジ領域変異を含めた（Ｌａｂｒｉｊｎ Ａ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７：７６７（２００９）を参照のこと）。
ＩｇＧ４野生型のアミノ酸配列は、配列番号６２によってコードされる配列番号６３として示されている。
ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐのアミノ酸配列は、配列番号６４によってコードされる配列番号６５として示されている。
上記母クローンを、Ｆ（ａｂ）２分子であるＯＭＳ１００コントロール抗体と直接比較するために、上記のＩｇＧ４分子を、ペプシン消化によってＦ（ａｂ’）２型に切断し、サイズ排除クロマトグラフィによって分画した。
方法：
完全長型のクローンの作製
上記３つの母クローンを野生型ＩｇＧ４型およびＩｇＧ４変異Ｓ２２８Ｐ型に変換した。これは、所望の抗体を生成するために、先述の母クローンから適切なＶＨおよびＶＬ領域をＰＣＲ単離し、それらを、適切な重鎖定常領域を有するｐｃＤＮＡ３発現ベクターにクローニングして、インフレーム融合物を作製することによって達成された。次いで、変異ＩｇＧ４型の３つの母クローンをペプシンで切断することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成し、サイズ排除クロマトグラフィカラムにおける分画によって後者を精製した。
結合アッセイ
ＩｇＧ４型に変換された候補母クローンを、ＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトし、その一過性のトランスフェクションからの上清をＥＬＩＳＡアッセイにおいて力価測定した。それらのクローンは、物理的に吸着されたヒトＭＡＳＰ−２Ａと優れた反応性を示し、以下の順序で順位付けされた：１７Ｎ１６＞１７Ｄ２０＞１８Ｌ１６（データ示さず）。
次いで、上記クローンを精製し、以下のとおり、ＥＬＩＳＡおよび活性アッセイにおいて再度試験した。ヒトＭＡＳＰ−２Ａを、ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌにおいてｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングし、ＩｇＧ（４５μｇ／ｍｌ）およびＦａｂ’２（３０μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにおいて３００ｎＭという出発濃度に希釈し、さらに３倍希釈で希釈した。ＩｇＧをＨＲＰ結合体化ヤギα−ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出し、Ｆ（ａｂ’）２を、ＨＲＰ−結合体化ヤギα−ヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Ｐｉｅｒｃｅ ３１４１２）で検出した。その反応をＴＭＢ基質で発色させ、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。結果を下記の表１５に示す。
機能的アッセイ
実施例４に記載したように１％正常ヒト血清（ＮＨＳ）を使用するＣ３コンバターゼアッセイを用いて、１％ＮＨＳにおける母ｓｃＦｖクローンおよび完全長ＩｇＧ４対応物の機能活性を比較した。マンナンを２０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。翌日、ウェルを１％ヒト血清でブロッキングした。ヒト血清をＣａＭｇＧＶＢ緩衝液において１％に希釈し、精製された抗体；ｓｃＦｖ（９００ｎＭ）、Ｆ（ａｂ’）２（３００ｎＭ）、ＩｇＧ（３００ｎＭ）を、一連の種々の希釈において同じ量の緩衝液に二連で加え、氷上で４５分間プレインキュベートした後、ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに加えた。反応を、３７℃で１時間インキュベーションすることによって開始し、そのプレートを氷上に置くことによって停止させた。ウサギα−マウスＣ３ｃ抗体に続いてヤギα−ウサギＨＲＰを用いて、Ｃ３ｂ沈着を決定した。マンナン陽性プレート上の５０ｎＭのＯＭＳ１００のバックグラウンドを、その曲線から引き算した。この解析の結果の要旨を下記の表１６に示す。
ＩｇＧ４母クローンの機能的効力も、各クローンについてＩｇＧ４ヒンジ変異（Ｓ２２８Ｐ）型と比較した。１％ＮＨＳを使用したＣ３ｂ沈着アッセイに対するＩＣ５０の数値を下記の表１７に示す。
上の表１７に示されたように、場合によっては、拮抗性のｓｃＦｖ由来のＩｇＧについて予想外のアゴニスト薬理学が顕著だった。この観察結果に対する機構的な根拠は理解されていない。
１％ＮＨＳにおいて阻害機能を有するＩｇＧ４に変換された母クローンの活性を、生理学的条件をより模倣するよりストリンジェントなアッセイ条件下においてさらに評価した。生理学的条件下の抗体活性を推定するために、最小限で希釈された（９０％）ヒト血漿を使用するストリンジェントなアッセイ条件下において、マンナンコーティングされたプレート上へのレクチン経路（ＬＰ）依存性Ｃ３ｂ沈着を阻害する能力についての母クローンＩｇＧ４調製物の試験を行った。
９０％ヒト血漿におけるＣ３ｂ沈着アッセイの結果を図６に示す。ＭＡＳＰ−２およびその基質が、１％正常ヒト血清を使用した希薄な血清アッセイよりもおよそ１００倍高い濃度でアッセイ混合物中に存在するので、通常、アンタゴニスト用量反応曲線の右側シフトが予想される。図６に示されるように、予想どおり、より低い見かけの効力への右側シフトが、ＯＭＳ１００および試験されたすべてのＭＡＳＰ−２抗体について観察された。しかしながら、驚いたことに、１７Ｄ２０のヒンジ領域変異体（Ｓ２２８Ｐ）については、見かけの効力の低下は観察されず、この形式における効力は、１％血漿において測定された効力に匹敵した（表１７を参照のこと）。９０％ＮＨＳアッセイ形式では、１７Ｄ２０ ＩｇＧ４（Ｓ２２８）の機能的効力は、１％ＮＨＳにおけるアッセイ結果とは対照的に、ＯＭＳ１００ Ｆａｂ２よりも中程度に低いと見出された（ここで、ＯＭＳ１００は、１７Ｄ２０ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐよりも５０〜１００倍強力だった（データ示さず））。図６に示されるように、野生型ＩｇＧ４型の１７Ｎ１６も、９０％ＮＨＳにおいて完全阻害を示したが、このアッセイ形式では幾分強力ではなく（約１５ｎＭのＩＣ５０）、野生型ＩｇＧ４型の１８Ｌ１６は、より強力ではなく、単に部分的に阻害性だった。
これらの知見に基づいて、ストリンジェントなアッセイ条件下（９０％ＮＨＳ）においてＣ４ｂ沈着を調べることによって、ＩｇＧ４に変換された母クローンの活性をさらに評価した。このアッセイ形式は、ＭＡＳＰ−２によって触媒される酵素反応に対する抗体活性の直接的な尺度を提供する。
ＭＡＳＰ−２依存性Ｃ４切断の阻害を測定するアッセイ
背景：ＭＡＳＰ−２のセリンプロテアーゼ活性は、非常に特異的であり、ＭＡＳＰ−２に対する２つのタンパク質基質；Ｃ２およびＣ４だけが同定されている。Ｃ４の切断は、Ｃ４ａおよびＣ４ｂを生成する。抗ＭＡＳＰ−２ Ｆａｂ２は、Ｃ４切断に直接関与するＭＡＳＰ−２上の構造的エピトープ（例えば、Ｃ４に対するＭＡＳＰ−２結合部位；ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼ触媒部位）に結合し得、したがってＭＡＳＰ−２のＣ４切断機能活性を阻害する。
酵母マンナンは、レクチン経路の公知のアクチベーターである。ＭＡＳＰ−２のＣ４切断活性を測定する以下の方法において、レクチン経路を活性化するために、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを９０％ヒト血清と一緒に４℃で９０分間インキュベートした。次いで、そのウェルを洗浄し、ウェル上に固定化されたヒトＣ４ｂについて標準的なＥＬＩＳＡ法を使用してアッセイした。このアッセイにおいて生成されるＣ４ｂの量は、ＭＡＳＰ−２依存性Ｃ４切断活性の尺度である。このアッセイでは、選択された濃度における抗ＭＡＳＰ−２抗体を、それがＣ４切断を阻害する能力について試験した。
方法：９６ウェルＣｏｓｔａｒ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇプレートを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に希釈されたマンナンと１．０μｇ／５０μｌ／ウェルで５℃にて一晩インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、そのウェルを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングし、そして穏やかに混合しながら室温にて１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。５℃において、抗ＭＡＳＰ−２抗体サンプルを、Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋とを含むＧＶＢ緩衝液（４．０ｍＭバルビタール、１４１ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ゼラチン，ｐＨ７．４）中に選択された濃度まで希釈した。５℃において、９０％ヒト血清を上のサンプルに加え、そして１００μｌを各ウェルに移した。プレートに蓋をして、氷水浴において９０分間インキュベートして補体を活性化させた。ＥＤＴＡを反応混合物に添加することによって、反応を停止させた。各ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）２００μｌで５回洗浄し、次いで、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。２．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中のビオチン結合体化ニワトリ抗ヒトＣ４ｃ（Ｉｍｍｕｎｓｙｓｔｅｍ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の１：７００希釈物を、１００μｌ／ウェルで加え、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。２．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳ中の０．１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＃２１１２６）を、１００μｌ／ウェルで加え、振盪機上で穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１６分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１．０Ｍ Ｈ３ＰＯ４を加えることによってペルオキシダーゼ反応を停止させ、そしてＯＤ４５０を測定した。
結果：
この形式では、両方のＩｇＧ４型の１７Ｄ２０が、レクチン経路によって駆動されるＣ４ｂ沈着を阻害したが、ＩＣ５０値は、Ｃ３ｂ沈着アッセイと比べて約３倍高かった。興味深いことに、１７Ｎ１６のＩｇＧ４野生型は、このアッセイにおいて、Ｃ３ｂ沈着アッセイに匹敵するＩＣ５０値および用量反応プロファイルで良好な活性を示した。１８Ｌ１６は、相当に強力ではなく、この形式では完全な阻害を達成しなかった（データ示さず）。
考察：
実施例２〜５に記載したように、機能遮断活性を有する完全ヒト抗ＭＡＳＰ−２ ｓｃＦｖ抗体を、ファージディスプレイを用いて同定した。そのような３つのクローン１７Ｎ１６、１７Ｄ２０および１８Ｌ１６を親和性成熟およびさらなる試験のために選択した。完全長ＩｇＧとしてのこれらの母クローンの機能性を評価するために、ＩｇＧ４野生型およびＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐヒンジ領域変異型のこれらの抗体を作製した。この実施例に記載したように、完全長ＩｇＧの大部分は、１％ヒト血漿を用いる標準的な機能的アッセイ形式において試験されたとき、それらのｓｃＦｖ対応物と比べて改善された機能活性を有した。生理学的条件下の抗体活性を推定するために、９０％ヒト血漿を使用するストリンジェントなアッセイ条件下において母クローンＩｇＧ４調製物の試験を行った。これらの条件下において、いくつかの抗体は、標準的な（１％）血漿機能的アッセイにおけるそれらの成績に基づく予想より実質的に良い機能的な効力を明らかにした。
実施例６
この実施例では、母クローン１７Ｄ２０、１７Ｎ１６および１８Ｌ１６の鎖シャフリングおよび親和性成熟、ならびに得られた娘クローンの解析を説明する。
方法：
改善された効力を有する抗体を同定するために、実施例２〜５に記載したように同定された３つの母ｓｃＦｖクローン１７Ｄ２０、１７Ｎ１６および１８Ｌ１６を軽鎖シャフリングに供した。このプロセスは、６人の健常ドナー由来のナイーブヒトラムダ軽鎖（ＶＬ）のライブラリーと対形成された各母クローンのＶＨからなるコンビナトリアルライブラリーの作製を含んだ。次いで、このライブラリーを、改善された結合親和性および／または機能性を有するｓｃＦｖクローンについてスクリーニングした。
母クローン１つあたり９，０００個の軽鎖シャフリングされた娘クローン、合計２７，０００個のクローンを解析した。各娘クローンを、可溶性ｓｃＦｖを発現し、分泌するように誘導し、ヒトＭＡＳＰ−２Ａに結合する能力についてスクリーニングした。ヒトＭＡＳＰ−２Ａに結合したＳｃＦｖを、それらのｃ−Ｍｙｃタグを介して検出した。この最初のスクリーニングによって、合計１１９個のクローン（これには、１７Ｎ１６ライブラリーからの１０７個の娘クローン、１７Ｄ２０ライブラリーからの８個の娘クローン、および１８Ｌ１６ライブラリーからの４個の娘クローンが含まれる）が選択された。
その１１９個のクローンを、小規模で発現させ、ＮｉＮＴＡカラムにおいて精製し、物理的に吸着されたヒトＭＡＳＰ−２Ａに対するＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合親和性について試験した。
結果：
上記１１９個の娘クローンの代表的なサブセットに対するＥＬＩＳＡアッセイの結果を図７ＡおよびＢに示す。図７Ａは、ｈｕＭＡＳＰ−２Ａに対して力価測定された、１７Ｎ１６母クローン 対 娘クローンのＥＬＩＳＡアッセイの結果をグラフで図示している。図７Ｂは、ｈｕＭＡＳＰ−２Ａに対して力価測定された、１７Ｄ２０母クローン 対 娘クローンのＥＬＩＳＡアッセイの結果をグラフで図示している。
図７Ａに示されるように、１７Ｎ１６母クローンに由来する娘クローン１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１６Ｅ１２および１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９は、母クローンよりも高い親和性を有した。また、図７Ｂに示されるように、１７Ｄ２０母クローンに由来する１つのクローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ１８Ｍ２４は、母クローンよりも高い親和性を有した。これらの３つのクローン、ならびにさらなる３つのクローン：１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１３Ｌ１２、１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１６Ｋ５、１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１Ｇ５および低い発現レベルを有する１７Ｄ２０ｍ＿ｄ１８２４を０．５Ｌスケールで発現させ、サイズ排除クロマトグラフィによってモノマー画分中に精製し、ＥＬＩＳＡおよび機能的アッセイにおいて再度試験した。１８Ｌ１６ライブラリーは、所望の結合親和性を有する娘クローンをまったく生成しなかった。
精製後、上記６つの娘クローンを補体アッセイにおいて阻害活性について試験した。結果を表１８に示す。
上の表１８に示されたように、ただ１つのクローン１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９だけが、母クローンと同じ範囲の親和性および活性を有した。
図８は、軽鎖（ＳＹＥから始まる）が、完全長ｓｃＦｖ母クローン１７Ｎ１６（配列番号５９）と１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９娘クローン（配列番号６６）とで異なる１７個のアミノ酸残基を有することを示している、これらの２つのクローンのアミノ酸配列のアラインメントである。
１７Ｎ１６ラムダライブラリーを再度スクリーニングすることによって、いくつかのさらなる候補娘クローンが得られ、そのうちの１７Ｎ１６ｍ＿ｄ２７Ｅ１３を、ＥＬＩＳＡおよび補体アッセイにおいて同定し、さらなる解析のための候補娘クローンセットに含めた。
種々の血清における娘クローンのアッセイ
上記の候補娘クローンを、以下のとおり種々の血清において解析した。マンナンを２０μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。翌日、ウェルを１％ＨＳＡでブロッキングした。ＣａＭｇＧＶＢ緩衝液において、アフリカミドリザル血清を０．２％に希釈し、ラット血清を０．３７５％に希釈し、ヒト血清を１％に希釈した。各候補娘クローンからの精製されたｓｃＦｖを、一連の種々の濃度において２つ組で同じ量の緩衝液に加え、氷上で４５分間プレインキュベートした後、ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに加えた。反応を、３７℃で１時間インキュベーションすることによって開始し、プレートを氷浴に移すことによって停止させた。ウサギα−マウスＣ３ｃ抗体に続いてヤギα−ウサギＨＲＰを用いて、Ｃ３ｃ放出を検出した。マンナン陰性プレート上での０．１μｇ／ｍｌのＯＭＳ１００のバックグラウンドを、これらの曲線から引き算した。結果を下記の表１９に要約する。
結果の考察：
表１９に示されたように、娘クローン１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９は、母クローンより高い機能活性を有する。母クローンと比べて軽鎖における１７アミノ酸の配列差異に加えてラット血清における改善された機能によって、このクローンが陽性候補になる。このデータに基づいて、娘クローン１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９をさらなる解析のために選択した。
実施例７
この実施例では、母クローン１７Ｄ２０に由来する娘クローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１の作製および解析を説明する。
背景／論理的根拠：
母クローン候補１７Ｄ２０ｍｃの親和性を改善するために、さらなる「ルックスルー突然変異誘発（ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ−ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」を、重鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｈ３）中の最初の３アミノ酸に対して行った。これは、１７Ｄ２０ｍｃの通常の軽鎖シャフリングと並行した突然変異誘発キャンペーンだった。したがって、縮重コドンを使用して１、２および３位のアミノ酸を可能性のある２０種すべてのアミノ酸のセットに対してランダム化するＰＣＲによって３つの異なるｓｃＦｖライブラリーを構築した。ライブラリーをクローニングした後、マイクロスケール発現を行い、ＭＡＳＰ−２ＡでコーティングされたＣＭ５チップ上のｓｃＦｖ結合をモニターした（示さず）。マイクロスケール発現のＢＩＡｃｏｒｅ解析を、１、２または３位においてランダム化されたＭＡＳＰ−２Ａでコーティングされたチップ上で３つの異なるライブラリーにおいて行い、潜在的に興味深い娘クローンを同定した。
ＣＤＲ−Ｈ３の１および２位のアミノ酸について、母候補クローン１７Ｄ２０ｍと比較して改善された解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有するクローンは見出されないことが観察された。しかしながら、ＣＤＲ−Ｈ３内の３位のアミノ酸に変異を有するいくつかの候補が、母クローン１７Ｄ２０ｍと比較して改善された解離速度を示した。これらのクローン（＃３５、＃５９および＃９０）を配列決定することにより、その変異を特定した。２つの「ルックスルー突然変異誘発」由来クローンの配列を１７Ｄ２０ｍｃ（元の配列）と比較する。興味深いことに、１つ（＃９０）を除くすべての配列決定されたクローンが、母候補と比較してＡｌａ−Ａｒｇ置換を有した。
図９は、ｓｃＦｖ母クローン１７Ｄ２０ｍの重鎖領域のアミノ酸配列（配列番号１８のａａ６１〜１１９）およびＣＤＲ−Ｈ３に変異を含むｓｃＦｖクローンであるクローン＃３５のＣＲＤ−Ｈ３領域のアミノ酸配列（配列番号１８の１０２位にＲによるＡの置換を有する、配列番号２０のａａ６１〜１１９）、クローン＃５９（クローン＃３５と同じ配列）およびクローン＃９０（配列番号１８の１０２位におけるＰによるＡの置換）の配列比較である。
変異クローン＃３５および＃５９の解析
変異クローン＃３５および＃５９を小規模で発現させ、固定化されたＭＡＳＰ−２Ａ（１０μｇ／ｍｌ）に対する力価測定−ＥＬＩＳＡにおいて母候補クローン１７Ｄ２０と比較してさらに試験した。それらのｓｃＦｖを、２０μｇ／ｍｌから開始して５倍段階希釈し、抗Ｍｙｃ（マウス）／抗マウスＨＲＰを使用して結合を検出した。母候補クローン１７Ｄ２０と比較して候補クローン＃３５および＃５９に対するＥＬＩＳＡアッセイにおいてわずかに改善された結合が観察された（データ示さず）。
改善されたクローン＃３５を、軽鎖シャフリングされた最良のクローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ２１Ｎ１１と組み合わせた。候補１７Ｄ２０ｍｄ３５のＶＨにおける変異（Ａｌａ−Ａｒｇ）を、候補１７Ｄ２０ｍ＿ｄ２１Ｎ１１の軽鎖と組み合わせたところ、ＶＨ３５−ＶＬ２１Ｎ１１と呼ばれ、別途３５２１Ｎ１１と呼ばれるクローンが生じた。
図１０Ａは、母クローン１７Ｄ２０のＣＤＲ３領域の配列（配列番号１８のａａ６１〜１１９）、同じ配列を有する娘クローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ２１Ｎ１１の同じ領域、および「３５２１Ｎ１１」と呼ばれる１７Ｄ２０ｍ＿ｄ２１Ｎ１１のＶＬと組み合わされた突然変異誘発クローン＃３５の同じ領域（配列番号２０のａａ６１〜１１９）のアミノ酸配列のアラインメントである。強調されているＶＨ配列領域は、ＣＤＲＨ３を含み、変異された標的残基領域には下線が引かれている。
図１０Ｂは、１７Ｄ２０母クローン（配列番号５５）および娘クローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ２１Ｎ１１（配列番号６７）のＶＬおよびＶＨ領域を含む完全長ｓｃＦｖのタンパク質配列のアラインメントである。ｓｃＦｖ娘クローン１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１は、配列番号６８として示されている。注：図１０Ｂ中の２２０位のＸ残基は、配列番号６８に示されるように「Ｅ」であると決定された。
図１０に示されるｓｃＦｖセットの力価測定ＥＬＩＳＡアッセイをＭＡＳＰ−２（１０μｇ／ｍｌ）に対して行った。結果を表２０に示す。
１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１娘クローンを、下記の実施例８に記載されるように機能活性についてさらに解析した。
実施例８
この実施例では、候補娘クローン１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９および１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１からＩｇＧ４、ＩｇＧ４／Ｓ２２８ＰおよびＩｇＧ２型への変換および解析を説明する。
論理的根拠／背景
実施例２〜７に記載した抗体スクリーニング方法によって、適当な機能性を有する２つの母クローン１７Ｎ１６および１７Ｄ２０が同定された。これらの母クローンの親和性成熟によって、ｓｃＦｖレベルでの代理の機能的アッセイにおいてそれらの母クローンと比べておよそ２倍の効力の改善を示す娘クローンが得られた。最良の活性を有する娘クローンは、１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９および１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１である。実施例６に記載したように、１７Ｎ１６母クローンと軽鎖シャフリングされた娘クローンとの機能活性の比較において（ｓｃＦｖ型，１％ＮＨＳアッセイ）、１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９が、母クローンよりもわずかに強力であり、このアッセイにおいて試験されたすべての娘クローンのうち最良の機能的効力を有すると測定された。
方法：
候補ｓｃＦｖクローンの機能的効力の比較を、実施例５に記載したように行われたＣ３変換アッセイ（１％ヒト血清および９０％ヒト血清）およびＣ４変換アッセイ（９０％ヒト血清）において行った。
結果を下記の表２１に示す。
上の表２１に示されたように、１７Ｎ１６ｍ＿ｄ１７Ｎ９は、Ｃ３アッセイにおいて９０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）中でアッセイされたとき、良好な活性を有し、この型の他の娘クローンよりも強力である。
候補クローンのＩｇＧ４、ＩｇＧ４／Ｓ２２８ＰおよびＩｇＧ２型への変換
これらの候補クローンのすべてを、さらなる解析のためにＩｇＧ４、ＩｇＧ４／Ｓ２２８ＰおよびＩｇＧ２型に変換した。
配列番号６２：野生型ＩｇＧ４をコードするｃＤＮＡ
配列番号６３：野生型ＩｇＧ４ポリペプチド
配列番号６４ ＩｇＧ４変異Ｓ２２８ＰをコードするｃＤＮＡ
配列番号６５：ＩｇＧ４変異Ｓ２２８Ｐポリペプチド
配列番号６９：野生型ＩｇＧ２をコードするｃＤＮＡ
配列番号７０：野生型ＩｇＧ２ポリペプチド
ヒトに対する予測となり得る動物モデルにおける毒性について試験するためにモノクローナル抗体＃１〜６が使用され得るかを決定するＣ３アッセイにおいて非ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（アフリカミドリ（ＡＧ）ザル）と交差反応する能力について、これらの抗体を試験した。モノクローナル抗体＃１〜６を、９０％ヒト血清中でのＣ３ｂ沈着アッセイおよびＣ４アッセイにおいて試験した。結果を下記の表２３に示す。
図１１Ａは、ヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体母クローン１７Ｎ１６に由来する娘クローンアイソタイプ改変体（ＭｏＡｂ＃１〜３）に対して行われたＣ３ｂ沈着アッセイの結果をグラフで図示している。
図１１Ｂは、ヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体母クローン１７Ｄ２０に由来する娘クローンアイソタイプ改変体（ＭｏＡｂ＃４〜６）に対して行われたＣ３ｂ沈着アッセイの結果をグラフで図示している。
表２３ならびに図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、ヒト抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ＃１〜６）は、高親和性でＭＡＳＰ−２に結合し、９０％ヒト血清においてＣ３およびＣ４活性の機能を阻害する。ヒト抗ＭＡＳＰ−２ ＭｏＡｂが、ヒトに対する予測となり得る毒性研究のための動物モデルを提供する非ヒトＭＡＳＰ−２タンパク質（アフリカミドリザル）と交差反応することにも留意されたい。
ＭｏＡｂ＃１〜６を、９５％ヒト血清、９５％アフリカミドリザル血清においてさらに解析した。結果を下記の表２４に要約する。
図１２Ａおよび１２Ｂは、９５％正常ヒト血清におけるＣ３ｂ沈着アッセイにおける母クローンおよびＭｏＡｂ＃１〜６の試験をグラフで図示している。
図１３は、９５％正常ヒト血清におけるＣ４ｂ沈着の阻害をグラフで図示している。
図１４は、９５％アフリカミドリザル血清におけるＣ３ｂ沈着の阻害をグラフで図示している。
ラットＣ３ｂの阻害、予め組み立てられたＭＢＬ−ＭＡＳＰ−２複合体の阻害；古典経路の阻害およびＣ１ｓに対する選択性についてアッセイすることによって、レクチン経路を選択的に阻害する能力についてＭｏＡｂ＃１〜６をさらに試験した。結果を表２５に要約する。
図１５は、ＭｏＡｂ＃２、３、５および６による、予め組み立てられたＭＢＬ−ＭＡＳＰ−２複合体のＣ４切断活性の阻害をグラフで図示している。
図１６は、Ｃ１ｓと比べたときの、ヒトＭＡＳＰ−２へのＭｏＡｂ＃６の優先的結合をグラフで図示している。
実施例９
この実施例では、遮断ヒト抗ＭＡＳＰ−２ＭｏＡｂのうちのいくつかに対して行われたエピトープマッピングを説明する。
方法：
以下の組換えタンパク質を、実施例１に記載したように作製した：
ヒトＭＡｐ１９
ヒトＭＡＳＰ２Ａ
ヒトＭＡＳＰ−２ ＳＰ
ヒトＭＡＳＰ−２ ＣＣＰ２−ＳＰ
ヒトＭＡＳＰ−２ ＣＣＰ１−ＣＣＰ２−ＳＰ
ヒトＭＡＳＰ−１／３ ＣＵＢ１−ＥＧＦ−ＣＵＢ２
ヒトＭＡＳＰ−１ ＣＣＰ１−ＣＣＰ２−ＳＰ
抗ＭＡＳＰ−２抗体ＯＭＳ１００およびＭｏＡｂ＃６（３５ＶＨ−２１Ｎ１１ＶＬ）（この両方ともが、高親和性でヒトＭＡＳＰ−２に結合し、機能的補体活性を阻止する能力を有すると証明された（実施例６〜８を参照のこと））を、ドットブロット解析によってエピトープ結合に関して解析した。
ドットブロット解析
上に記載される組換えＭＡＳＰ−２ポリペプチドの段階希釈物をニトロセルロース膜上にスポットした。スポットしたタンパク質の量は、１０倍の段階で５０ｎｇ〜５ｐｇの範囲であった。後の実験では、スポットしたタンパク質の量は、５０ｎｇに低下させた量から再度５倍の段階で１６ｐｇまでの範囲であった。膜をＴＢＳ中の５％スキムミルク粉末（ブロッキング緩衝液）でブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液（５．０ｍＭ Ｃａ２＋を含む）中１．０μｇ／ｍｌ抗ＭＡＳＰ−２ Ｆａｂ２とともにインキュベートした。ＨＲＰ結合体化抗ヒトＦａｂ（ＡｂＤ／Ｓｅｒｏｔｅｃ；１／１０，０００希釈）およびＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、結合しているＦａｂ２を検出した。１枚の膜を、ポジティブコントロールとしてポリクローナルウサギ抗ヒトＭＡＳＰ−２Ａｂ（Ｓｔｏｖｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：６８４８−５９（１９９９）に記載されているもの）とインキュベートした。この場合、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ；１／２，０００希釈）を使用して、結合しているＡｂを検出した。
結果：
結果を表２７に要約する。
上記の結果は、ＭｏＡｂ＃６およびＯＭＳ１００抗体が、ＭＡＳＰ−２に非常に特異的であり、ＭＡＳＰ−１またはＭＡＳＰ−３に結合しないことを示している。いずれの抗体も、Ｍａｐ１９、およびＭＡＳＰ−２のＣＣＰ１ドメインを含まないＭＡＳＰ−２フラグメントに結合しなかったことから、それらの結合部位がＣＣＰ１ドメインを含むという結論が導かれる。
実施例１０
この実施例では、ヒト抗ＭＡＳＰ−２ＭｏＡｂ＃６が、静脈内投与後のアフリカミドリザルにおいてレクチン経路を阻害することが証明される。
方法：
ＭｏＡｂ＃６を、第１群の３頭のアフリカミドリザルに１ｍｇ／ｋｇの投与量で、および第２群の３頭のアフリカミドリザルに３ｍｇ／ｋｇの投与量で、静脈内投与した。血液サンプルを、投与の２、４、８、１０、２４、４８、７２および９８時間後に得て、レクチン経路活性の存在について試験した。
図１７に示されるように、レクチン経路は、抗ヒトＭｏＡｂ＃６の静脈内投与後に完全に阻害された。
実施例１１
この実施例では、抗ＭＡＳＰ−２抗体などのＭＡＳＰ−２インヒビターが、放射線曝露の処置および／または急性放射線症候群の処置、回復もしくは予防に有効であることが証明される。
論理的根拠：
高線量の電離放射線への曝露は、２つの主要な機構：骨髄に対する毒性および胃腸症候群によって死亡を引き起こす。骨髄毒性により、すべての血液学的（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ）細胞が減少し、その生物が感染および出血によって死亡しやすくなる。胃腸症候群は、より重篤であり、腸上皮層の崩壊に起因する腸管の関門機能の喪失および腸管の内分泌機能の喪失によって駆動される。これによって、死に至り得る、敗血症および関連する全身性炎症反応症候群がもたらされる。
補体のレクチン経路は、組織損傷および外来性の表面（すなわち、細菌）への曝露に応答して炎症を開始する先天性免疫機構である。虚血性の腸管組織損傷または敗血症性ショックのマウスモデルでは、この経路の遮断によって、より良好な結果がもたらされる。レクチン経路が、照射によって誘導される組織損傷に応答して過度のおよび有害な炎症を引き起こし得ると仮定される。したがって、レクチン経路の遮断は、二次損傷を減少させ得、急性の放射線曝露後の生存を増大させ得る。
この実施例に記載されるように行われる研究の目的は、抗マウスＭＡＳＰ−２抗体を投与することによって照射損傷のマウスモデルにおける生存に対するレクチン経路遮断の効果を評価することだった。
研究＃１
方法および材料：
材料。本研究において使用された被験物質は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞において産生されるレクチン補体経路のＭＡＳＰ−２タンパク質成分を遮断する、（ｉ）高親和性抗マウスＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＭ１１）および（ｉｉ）高親和性抗ヒトＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＯＭＳ６４６）だった。投薬濃度は、抗マウスＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＭ１１）の１ｍｇ／ｋｇ、抗ヒトＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＯＭＳ６４６）の５ｍｇ／ｋｇまたは滅菌食塩水だった。各投薬セッションについて、適切な体積の新鮮な投薬溶液が調製された。
動物。若い成体雄Ｓｗｉｓｓ−ＷｅｂｓｔｅｒマウスをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した。動物を、Ａｌｐｈａ−Ｄｒｉ寝床を備えた底が頑丈なケージに収容し、保証されたＰＭＩ５００２ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ（Ａｎｉｍａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｂｂａｒｄ ＯＲ）および水を自由に提供した。温度をモニターし、動物を収容している部屋を、１２時間明期／１２時間暗期の光サイクルで操作した。
照射。上記施設における２週間の順化の後、３２０ｋＶ高安定Ｘ線発生装置、金属セラミックＸ線管、可変Ｘ線ビームコリメーターおよびフィルターを備えたＴｈｅｒａｐａｘ Ｘ−ＲＡＤ ３２０システム（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｘ−ｒａｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｅａｓｔ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を使用して０．７８Ｇｙ／分の線量率で１０個の群において、６．５、７．０および８．０Ｇｙを全身照射によってマウスに照射した。
薬物の製剤化および投与。プロトコルに従って、適切な体積の濃縮原液を、氷冷食塩水で希釈することにより、０．２ｍｇ／ｍｌの抗マウスＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＭ１１）または０．５ｍｇ／ｍｌの抗ヒトＭＡＳＰ−２抗体（ｍＡｂＯＭＳ６４６）の投薬溶液を調製した。抗ＭＡＳＰ−２抗体ｍＡｂＭ１１およびｍＡｂＯＭＳ６４６の投与は、動物の体重に基づいて（ｂａｓｅ ｏｎ）、２５ゲージ針を使用して１ｍｇ／ｋｇのｍＡｂＭ１１、５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂＯＭＳ６４６または食塩水ビヒクルを送達するＩＰ注射を介するものだった。
研究デザイン。マウスを、表２８に記載されるような群にランダムに割り当てた。体重および体温を毎日測定し、記録した。群７、１１および１３のマウスを照射後７日目に屠殺し、深麻酔下での心臓穿刺によって血液を回収した。照射後３０日目に生存していた動物を同じ様式で屠殺し、血液を回収した。プロトコルに従って、回収された血液サンプルから血漿を調製し、解析のためにＳｐｏｎｓｏｒに戻した。
統計解析。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を作成し、それを使用し、ログランク法およびウィルコクソン法を用いて処置群間の平均生存時間を比較した。標準偏差を含む平均または平均値の標準誤差を含む平均値を報告する。対応のない両側ｔ検定を用いて、コントロールの照射動物と個別の処置群との間の統計的比較を行った。
研究＃１の結果
６．５、７．０および８．０Ｇｙ曝露群に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットを、それぞれ図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃに提供し、下記の表２９に要約する。全般的に見れば、照射前の抗マウスＭＡＳＰ−２ａｂ（ｍＡｂＭ１１）による処置は、６．５Ｇｙ曝露レベル（２０％増大）と７．０Ｇｙ曝露レベル（３０％増大）の両方において、ビヒクルで処置された照射コントロール動物と比べて、照射されたマウスの生存を増大させた。６．５Ｇｙの曝露レベルでは、抗マウスＭＡＳＰ−２ａｂによる照射後の処置によって、ビヒクルコントロール照射動物と比べて、生存の中程度の増大（１５％）をもたらした。
比較すると、７．０Ｇｙおよび８．０Ｇｙの曝露レベルでの処置されたすべての動物は、ビヒクルで処置された照射コントロール動物と比べて、生存の増大を示した。ｍＡｂＯＭＳ６４６を投与された動物において、最も大きな生存の変化が生じ、７．０Ｇｙの曝露レベルでは、コントロール動物と比べて生存において４５％の増大、および８．０Ｇｙの曝露レベルでは生存において１２％の増大だった。さらに、７．０Ｇｙの曝露レベルにおいて、ｍＡｂＯＭＳ６４６処置群における死亡は、ビヒクルで処置された照射コントロール動物に対する照射後８日目に対して、照射後１５日目に初めて生じ、コントロール動物よりも７日遅かった。ｍＡｂＯＭＳ６４６を投与されたマウスに対する死亡までの平均時間（２７．３±１．３日）は、７．０Ｇｙの曝露レベルにおいて、コントロール動物（２０．７±２．０日）と比べて有意に増大した（ｐ＝０．００８７）。
照射前の日（−１日目）と比較したときの体重の変化率をこの研究全体にわたって記録した。一過性の体重減少が、照射されたすべての動物において生じたが、コントロールと比べてｍＡｂＭ１１またはｍＡｂＯＭＳ６４６処置に起因する変化の差異の証拠はなかった（データ示さず）。研究終了時、すべての生存動物は、開始時（−１日目）の体重からの体重の増大を示した。
考察
急性放射線症候群は、３つの明確な亜症候群（ｓｕｂｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）からなる：造血、胃腸および脳血管。観察される症候群は、放射線量に依存し、造血への作用は、１Ｇｙを超える有意な部分的または全身放射線曝露を受けたヒトにおいて観察される。造血症候群は、免疫系への損傷と同時に起きる血球数、赤血球および白血球ならびに血小板の変化を伴う汎血球減少症に至る、骨髄機能の極度の低下を特徴とする。末梢血中に好中球および血小板がほとんど存在しない底（ｎａｄｉｒ）が生じると、好中球減少症、発熱、敗血症の合併症および制御できない出血によって死に至る。
本研究では、ｍＡｂＨ６の投与は、７．０Ｇｙで照射されたＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ雄マウスにおいて全身Ｘ線照射からの生存性を高めると見出された。特に、７．０Ｇｙの曝露レベルでは、ｍＡｂＯＭＳ６４６を投与された動物の８０％が、ビヒクルで処置されたコントロール照射動物の３５％と比べて、３０日まで生存した。重要なことには、この処置群における最初の死亡日は、照射後１５日目まで現れず、ビヒクルで処置されたコントロール照射動物において観察されたものに対して７日の延長だった。奇妙なことに、より低いＸ線曝露（６．５Ｇｙ）では、ｍＡｂＯＭＳ６４６の投与は、ビヒクルで処置されたコントロール照射動物と比べて、生存性または死亡の遅延に影響しないとみられた。この曝露レベル間の応答の差異については、複数の理由が存在し得るが、いずれの仮説の検証にも、微生物培養および血液学的パラメータのための中間サンプルの回収を含むさらなる研究が必要であり得る。１つの解釈は単純に、群に割り当てられた動物の数が、処置に関連する任意の微妙な差異の理解を妨げていた可能性があるというものであり得る。例えば、ｎ＝２０という群のサイズを用いたとき、６５％（６．５Ｇｙ曝露におけるｍＡｂＯＭＳ６４６）と８０％（７．０Ｇｙ曝露におけるｍＡｂＨ６）との間の生存の差は、３匹である。他方で、３５％（７．０Ｇｙ曝露におけるビヒクルコントロール）と８０％（７．０Ｇｙ曝露におけるｍＡｂＯＭＳ６４６）との間の差は、９匹であり、処置に関連する差異の信頼できる証拠を提供する。
これらの結果から、抗ＭＡＳＰ−２抗体が、急性放射線症候群の有害な作用のリスクがあるかまたはそれに罹患している哺乳動物被験体を処置する際に有効であることが証明される。
研究＃２
Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５０）を電離放射線（８．０Ｇｙ）に曝露した。放射線曝露の１８時間前および２時間後ならびにその後毎週投与された抗ＭＡＳＰ−２抗体による治療（ＯＭＳ６４６ ５ｍｇ／ｋｇ）の死亡に対する効果を評価した。
研究＃２の結果
抗ＭＡＳＰ−２抗体ＯＭＳ６４６の投与によって、８．０Ｇｙに曝露されたマウスの生存率がビヒクルコントロールを投与されたマウスと比べて増大し（調整されたメジアン生存率 ４日〜６日）、ビヒクルコントロールを投与されたマウスと比べて死亡率が１２％減少した（ログランク検定，ｐ＝０．０４０）と測定された。
研究＃３
Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝５０）を、以下の群において電離放射線（８．０Ｇｙ）に曝露した：（Ｉ：ビヒクル）食塩水コントロール；（ＩＩ：低）照射の１８時間前および照射の２時間後に抗ＭＡＳＰ−２抗体ＯＭＳ６４６（５ｍｇ／ｋｇ）を投与、（ＩＩＩ：高）照射の１８時間前および照射の２時間後にＯＭＳ６４６を投与（１０ｍｇ／ｋｇ）；および（ＩＶ：高後）照射の２時間後のみＯＭＳ６４６（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与。
研究＃３の結果
照射の前および後の抗ＭＡＳＰ−２抗体の投与によって、ビヒクルコントロールを投与された動物と比較して、平均生存時間が４日から５日に調整されると決定された。抗ＭＡＳＰ−２抗体で処置されたマウスの死亡率は、ビヒクルコントロールマウスと比較して６〜１２％低下した。処置の有意な有害作用が観察されなかったことにさらに留意されたい。
要約すれば、この実施例における結果は、本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体が、急性放射線症候群の有害な作用のリスクがあるかまたはそれに罹患している哺乳動物被験体を処置する際に有効であることを証明する。
実施例１２
この実施例では、ヒンジ領域に変異を有する完全ヒト抗ヒトＭＡＳＰ−２ ＩｇＧ４抗体であるＯＭＳ６４６抗体（１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１）のさらなる特徴付けを説明する。
方法：
ヒンジ領域に変異を有する完全ヒト抗ヒトＭＡＳＰ−２ ＩｇＧ４抗体であるＯＭＳ６４６（１７Ｄ２０ｍ＿ｄ３５２１Ｎ１１）を上記の実施例２〜８に記載したように作製した。ＯＭＳ６４６抗体を、ＯＭＳ６４６の重鎖および軽鎖をコードする発現構築物で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ発現細胞株の培養上清から精製した。細胞をＰＦ−ＣＨＯ培地中で１６〜２０日間増殖させ、細胞生存率が５０％未満に低下したら、細胞非含有上清を回収した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフに続いて、イオン交換、濃縮およびＰＢＳへの緩衝液交換によってＯＭＳ６４６を精製した。
１．ＯＭＳ６４６は高親和性でヒトＭＡＳＰ−２に結合する
固定化されたＯＭＳ６４６と組換えヒトＭＡＳＰ−２との結合の表面プラズモン共鳴（Ｂｉｏｃｏｒｅ）解析
方法：
ＣＭ５チップへのアミンカップリングによって様々な密度でＯＭＳ６４６を固定化し、９ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭまたは０．３ｎＭで溶解された組換えヒトＭＡＳＰ−２の会合および解離を経時的に記録することにより、会合速度定数（Ｋｏｎ）および解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を測定した。実験上のＫｏｎおよびＫｏｆｆ値に基づいて平衡結合定数（ＫＤ）を計算した。
結果：
図１９は、固定化されたＯＭＳ６４６が、約１〜３×１０−４Ｓ−１のＫｏｆｆ速度および約１．６〜３×１０６Ｍ−１Ｓ−１のＫｏｎ速度で組換えＭＡＳＰ−２に結合することを示しており、これらの実験条件下における親和性（約９２ｐＭのＫＤ）を意味する、ＯＭＳ６４６に対する表面プラズモン共鳴（Ｂｉｏｃｏｒｅ）解析の結果をグラフで図示している。固定化されたＯＭＳ６４６の密度および溶液中のＭＡＳＰ−２の濃度に応じて、５０〜２５０ｐＭの範囲内の実験上のＫＤ値が決定された。
固定化された組換えヒトＭＡＳＰ−２へのＯＭＳ６４６結合のＥＬＩＳＡアッセイ
方法：ＥＬＩＳＡアッセイを行うことにより、固定化された組換えＭＡＳＰ−２へのＯＭＳ６４６の結合の用量反応を評価した。組換えヒトＭＡＳＰ−２（５０ｎｇ／ウェル）を、４℃で一晩、ＰＢＳ中においてｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上に固定化した。翌日、そのプレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で３回洗浄することによってブロッキングした。次いで、ブロッキング緩衝液中の段階希釈系列のＯＭＳ６４６（０．００１〜１０ｎＭの濃度範囲）を、ＭＡＳＰ−２でコーティングされたウェルに加えた。１時間インキュベーションして、固定化された抗原にＯＭＳ６４６を結合させた後、ウェルを洗浄することにより、未結合のＯＭＳ６４６を除去した。結合したＯＭＳ６４６を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｑｕａｌｅｘ；ブロッキング緩衝液において１：５０００希釈されたもの）を使用して検出した後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させた。１００μｌ／ウェルの１．０Ｍ Ｈ３ＰＯ４を加えることによってペルオキシダーゼ反応を停止させ、基質の変換を、９６ウェルプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を使用して４５０ｎＭにおいて測光法で定量した。単一結合部位カーブフィッティングアルゴリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して、ＫＤ値を計算した。
結果：
図２０は、固定化されたヒトＭＡＳＰ−２に対するＯＭＳ６４６の結合親和性を決定するＥＬＩＳＡアッセイの結果をグラフで図示している。図２０に示されるように、ＯＭＳ６４６は、固定化された組換えヒトＭＡＳＰ−２に８５±５ｐＭのＫＤで結合すると測定され、これは、図１９に示されたようなＢｉｏｃｏｒｅ解析において得られた結果と一致する。これらの結果から、ＯＭＳ６４６が、ヒトＭＡＳＰ−２に対しておよそ１００ｐＭのＫＤという高親和性を有することが証明される。
２．ＯＭＳ６４６は、マンナンコーティングされた表面上においてＣ４活性化を阻害するが、免疫複合体でコーティングされた表面上では阻害しない
方法：
それぞれ以下のとおり図２１Ａおよび２１Ｂに示される濃度範囲にわたるＯＭＳ６４６の存在下または非存在下で、マンナンコーティングされた表面上または免疫複合体でコーティングされた表面上において、Ｃ４活性化を測定した。
ＭＡＳＰ−２のＣ４切断活性を測定する以下の方法において、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを、３７℃において６０分間、１％ヒト血清とともにインキュベートすることにより、レクチン経路を活性化させた。次いで、そのウェルを洗浄し、標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて、ウェル上に固定化されたヒトＣ４ｂについてアッセイした。このアッセイにおいて生成されたＣ４ｂの量は、ＭＡＳＰ−２依存性のＣ４切断活性の尺度である。このアッセイでは、選択された濃度の抗ＭＡＳＰ−２抗体を、Ｃ４切断を阻害する能力について試験した。
方法：
マンナンコーティングされた表面上におけるＣ４活性化：
レクチン経路に対するＯＭＳ６４６の作用を測定するために、９６ウェルＣｏｓｔａｒ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇプレートを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液，ｐＨ９．５中に希釈された５０μＬの４０μｇ／ｍＬのマンナン溶液とともに５℃で一晩インキュベーションすることによって、マンナンでコーティングした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ウェルを、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。別個の９６ウェルプレートにおいて、ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の段階希釈物を、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有ＧＶＢ緩衝液（４．０ｍＭバルビタール、１４１ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ゼラチン，ｐＨ７．４）中の１％ヒト血清とともに５℃で１時間プレインキュベートした。続いて、これらの抗体血清プレインキュベーション混合物を、上記のマンナンコーティングされたアッセイプレートの対応するウェルに移した。そのアッセイプレートを３７℃の水浴に移すことによって、補体活性化を惹起した。６０分間のインキュベーションの後、その反応混合物にＥＤＴＡを加えることによって、反応を停止させた。各ウェルを２００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、次いで、各ウェルを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬ／ウェルのビオチン結合体化ニワトリ抗ヒトＣ４ｃ（Ｉｍｍｕｎｓｙｓｔｅｍ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の１：１００希釈物を、２．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳにおいて加え、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄した。１００μＬ／ウェルの０．１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＃２１１２６）を、２．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳにおいて加え、振盪機上で穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄した。１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１．０Ｍ Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、ペルオキシダーゼ反応を停止させ、ＯＤ４５０を測定した。
免疫複合体でコーティングされた表面上におけるＣ４活性化
古典経路に対するＯＭＳ６４６の作用を測定するために、上に記載したアッセイを、免疫複合体でコーティングされたプレートを使用するように改変した。古典経路を介してＣ４活性化を刺激するために使用される精製ヒツジＩｇＧでウェルをコーティングしたという差異を加えて、上記のレクチン経路に対して詳述されたとおりアッセイを行った。
結果：
図２１Ａは、ＯＭＳ６４６の存在下または非存在下における、マンナンコーティングされた表面上のＣ４活性化のレベルをグラフで図示している。図２１Ｂは、ＯＭＳ６４６の存在下または非存在下における、ＩｇＧコーティングされた表面上のＣ４活性化のレベルをグラフで図示している。図２１Ａに示されるように、ＯＭＳ６４６は、マンナンコーティングされた表面上においてＣ４活性化を１％ヒト血清中においておよそ０．５ｎＭのＩＣ５０で阻害する。１０個の独立した実験において得られたＩＣ５０値は、０．５２±０．２８ｎＭ（平均±ＳＤ）だった。対照的に、図２１Ｂに示されるように、ＯＭＳ６４６は、ＩｇＧコーティングされた表面上においてＣ４活性化を阻害しなかった。これらの結果から、ＯＭＳ６４６は、補体成分Ｃ４のレクチン依存性の活性化を遮断するが、古典経路依存性の活性化を阻害しないことが証明される。
３．ＯＭＳ６４６は、末端補体成分のレクチン依存性の活性化を特異的に遮断する
方法：
細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）の沈着に対するＯＭＳ６４６の作用を、レクチン経路、古典経路および副経路に対する経路特異的条件を使用して解析した。この目的で、Ｗｉｅｓｌａｂ Ｃｏｍｐ３００補体スクリーニングキット（Ｗｉｅｓｌａｂ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）を製造者の指示書に従って使用した。
結果：
図２２Ａは、レクチン経路特異的アッセイ条件下の抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下におけるＭＡＣ沈着のレベルをグラフで図示している。図２２Ｂは、古典経路特異的アッセイ条件下の抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下におけるＭＡＣ沈着のレベルをグラフで図示している。図２２Ｃは、副経路特異的アッセイ条件下の抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下におけるＭＡＣ沈着のレベルをグラフで図示している。
図２２Ａに示されるように、ＯＭＳ６４６は、ＭＡＣ沈着のレクチン経路媒介性の活性化をおよそ１ｎＭのＩＣ５０値で遮断する。しかしながら、ＯＭＳ６４６は、古典経路媒介性の活性化（図２２Ｂ）または副経路媒介性の活性化（図２２Ｃ）からもたらされるＭＡＣ沈着に影響しなかった。
４．ＯＭＳ６４６は、生理条件下においてレクチン経路の活性化を効果的に阻害する
方法：
レクチン依存性のＣ３およびＣ４活性化を、以下のとおり、様々な濃度のＯＭＳ６４６の非存在下および存在下において９０％ヒト血清において評価した：
Ｃ４活性化アッセイ
レクチン依存性のＣ４活性化に対するＯＭＳ６４６の作用を評価するために、９６ウェルＣｏｓｔａｒ ｍｅｄｉｕｍ結合プレートを、５℃において一晩、２μｇのマンナン（５０ｍＭ炭酸塩緩衝液，ｐＨ９．５中の５０μｌの４０μｇ／ｍＬ溶液）でコーティングした。次いで、プレートを、２００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、穏やかに混合しながら室温で１時間、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。別個のプレインキュベーションプレートにおいて、選択された濃度のＯＭＳ６４６を９０％ヒト血清と混合し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、これらの抗体血清プレインキュベーション混合物を、氷上のアッセイプレートのマンナンコーティングされたウェルに移した。次いで、そのアッセイプレートを氷水浴において９０分間インキュベートすることにより、補体を活性化させた。その反応混合物にＥＤＴＡを加えることによって、反応を停止させた。各ウェルを２００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、次いで、各ウェルを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬ／ウェルのビオチン結合体化ニワトリ抗ヒトＣ４ｃ（Ｉｍｍｕｎｓｙｓｔｅｍ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の１：１０００希釈物を、２．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳにおいて加え、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄した。１００μＬ／ウェルの０．１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＃２１１２６）を、２．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳにおいて加え、振盪機上で穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄した。１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｋｉｒｄｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１６分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１．０Ｍ Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、ペルオキシダーゼ反応を停止させ、ＯＤ４５０を測定した。
Ｃ３活性化アッセイ
レクチン依存性のＣ３活性化に対するＯＭＳ６４６の作用を評価するために、終点においてＣ３沈着を評価した点を除いては、上に記載したＣ４活性化アッセイと同一の様式でアッセイを行った。Ｃ３沈着を、以下のとおり定量した。補体沈着反応の終わりに、プレートを上に記載したように洗浄し、続いて、１００μＬ／ウェルの、２．０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中のウサギ抗ヒトＣ３ｃ抗体（Ｄａｋｏ）の１：５０００希釈物とともに１時間インキュベートした。各プレートを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄し、次いで、１００μＬ／ウェルの、２．０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳ中のＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄し、次いで、１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１．０Ｍ Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、ペルオキシダーゼ反応を停止させ、ＯＤ４５０を測定した。シグモイド用量反応カーブフィッティングアルゴリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ）を実験データセットに適用することによって、ＩＣ５０値を得た。
結果：
図２３Ａは、レクチン経路特異的条件下の９０％ヒト血清における一連の濃度にわたる抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下におけるＣ３沈着のレベルをグラフで図示している。図２３Ｂは、レクチン経路特異的条件下の９０％ヒト血清における一連の濃度にわたる抗ＭＡＳＰ−２抗体（ＯＭＳ６４６）の存在下または非存在下におけるＣ４沈着のレベルをグラフで図示している。図２３Ａに示されるように、ＯＭＳ６４６は、９０％ヒト血清においてＣ３沈着をＩＣ５０＝３±１．５ｎＭ（ｎ＝６）で遮断した。図２３Ｂに示されるように、ＯＭＳ６４６は、Ｃ４沈着をＩＣ５０＝２．８±１．３ｎＭ（ｎ＝６）で遮断した。
これらの結果から、ＯＭＳ６４６が、生理学的条件下においてレクチン経路活性化の強力かつ有効な遮断を提供することが証明され、それにより、低治療用量のＯＭＳ６４６の使用に対する支持が提供される。これらのデータに基づいて、ＯＭＳ６４６が、２０ｎＭ（３μｇ／ｍＬ）以下の血漿濃度の患者循環においてレクチン経路の＞９０％を遮断し得ると予想される。代表的なヒトの血漿体積がおよそ３Ｌであること、および投与される抗体材料の大部分が血漿中に保持されるという知識（Ｌｉｎ Ｙ．Ｓ．ら、ＪＰＥＴ ２８８：３７１（１９９９））に基づくと、静脈内に投与される１０ｍｇもの低い用量のＯＭＳ６４６が、短期間（すなわち、１〜３日間などの一過性の期間）におけるレクチン経路の遮断において有効であり得ると予想される。慢性疾病の状況では、処置の最大の利益を達成するために、長期間にわたってレクチン経路を遮断することが有益であり得る。したがって、そのような慢性状態については、１００ｍｇというＯＭＳ６４６の用量が好ましい場合があり、これは、成人のヒト被験体におけるレクチン経路の少なくとも１週間以上にわたる遮断において有効であると予想される。ヒトの抗体について通常観察される緩徐なクリアランスおよび長い半減期を考慮に入れると、１００ｍｇの用量のＯＭＳ６４６が、１週間より長く（例えば、２週間または４週間も）有効であり得ることが可能である。より高用量の抗体（すなわち、１００ｍｇ超、例えば、２００ｍｇ、５００ｍｇまたはそれ以上、例えば、７００ｍｇまたは１０００ｍｇ）が、より長い作用時間（例えば、２週間超）を有すると予想される。
５．ＯＭＳ６４６は、サルにおいてレクチン経路の活性化を遮断する
上記の実施例１０に記載し、図１７に示されたように、ＯＭＳ６４６が、ＯＭＳ６４６（３ｍｇ／ｋｇ）をアフリカミドリザルに静脈内投与した後の約７２時間にわたって全身のレクチン経路活性を切断した後、レクチン経路の活性が回復すると測定された。この実施例では、以下のとおり、レクチン依存性のＣ４活性化を、ＯＭＳ６４６の一連の濃度にわたって、およびＯＭＳ６４６の非存在下において、９０％アフリカミドリザル血清または９０％カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｇｌｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）血清において評価した追跡研究を説明する：
種々の非ヒト霊長類種におけるレクチン依存性のＣ４活性化に対するＯＭＳ６４６の作用を測定するために、９６ウェルＣｏｓｔａｒ ｍｅｄｉｕｍ結合プレートを、５℃において一晩、２μｇのマンナン（５０ｍＭ炭酸塩緩衝液，ｐＨ９．５中の５０μｌの４０μｇ／ｍＬ溶液）でコーティングした。次いで、プレートを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄し、穏やかに混合しながら室温で１時間、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。別個のプレインキュベーションプレートにおいて、選択された濃度のＯＭＳ６４６を、アフリカミドリザルまたはカニクイザルから回収された９０％血清と混合し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、これらの抗体血清プレインキュベーション混合物を、氷上のアッセイプレートのマンナンコーティングされたウェルに移した。次いで、そのアッセイプレートを氷水浴において９０分間インキュベートすることにより、補体を活性化させた。その反応混合物にＥＤＴＡを加えることによって、反応を停止させた。各ウェルを２００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、次いで、各ウェルを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬ／ウェルのビオチン結合体化ニワトリ抗ヒトＣ４ｃ（Ｉｍｍｕｎｏｓｙｓｔｅｍ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の１：１０００希釈物を、２．０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳにおいて加え、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄した。１００μＬ／ウェルの０．１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＃２１１２６）を、２．０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳにおいて加え、振盪機上で穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳで５回洗浄した。１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（Ｋｉｒｄｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１．０Ｍ Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、ペルオキシダーゼ反応を停止させ、ＯＤ４５０を測定した。シグモイド用量反応カーブフィッティングアルゴリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ）を実験データセットに適用することによって、ＩＣ５０値を得た。
結果：
９０％カニクイザル血清（図２４Ａ）および９０％アフリカミドリザル血清（図２４Ｂ）におけるレクチン経路阻害の用量反応が、それぞれ３０ｎＭ〜５０ｎＭおよび１５ｎＭ〜３０ｎＭの範囲内のＩＣ５０値で観察された。
要約すれば、完全ヒト抗ヒトＭＡＳＰ−２ ＩｇＧ４抗体（ヒンジ領域に変異を有する）であるＯＭＳ６４６は、以下の有益な特性を有すると観察された：ヒトＭＡＳＰ−２に対する高親和性の結合性（５０〜２５０ｐＭの範囲内のＫＤ、１〜３×１０−４Ｓ−１の範囲内のＫｏｆｆ速度および１．６〜３×１０６Ｍ−１Ｓ−１の範囲内のＫｏｎ速度）；ヒト血清における機能的効力（１％ヒト血清における０．５２±０．２８ｎＭ（ｎ＝１０）のＩＣ５０；および９０％血清における３±１．５ｎＭのＩＣ５０でのＣ４沈着の阻害）；および１５〜５０ｎＭの範囲内のＩＣ５０でのＣ４沈着の阻害（９０％サル血清）を示すサルにおける交差反応性。
上に記載したように、１０ｍｇもの低い用量のＯＭＳ６４６（平均的なヒトに対する０．１５ｍｇ／ｋｇに対応する）は、ヒト循環中のレクチン経路の急性の遮断（例えば、少なくとも１〜３日間）において有効であると予想されるが、１００ｍｇの用量のＯＭＳ６４６（平均的なヒトに対する１．５ｍｇ／ｋｇに対応する）は、患者の循環中のレクチン経路を少なくとも１週間以上にわたって遮断すると予想される。より高用量のＯＭＳ６４６（例えば、１００ｍｇより多い用量、例えば、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇまたはそれ以上）、および好ましくは、皮下（ｓｃ）または筋肉内（ｉｍ）投与経路を用いることにより、有効なレクチン経路の切断の時間枠が２週間、好ましくは４週間までさらに延長され得る。
例えば、本明細書中の実験データに示されるように、霊長類において、１ｍｇ／ｋｇの用量のＯＭＳ６４６は、レクチン経路を１日間阻害し、３ｍｇ／ｋｇの用量のＯＭＳ６４６は、レクチン経路を約３日間（７２時間）阻害した。したがって、７〜１０ｍｇ／ｋｇというより多い投与量が、レクチン経路を約７日間にわたって阻害するのに有効であり得ると推定される。本明細書中に示されるように、ＯＭＳ６４６は、サルＭＡＳＰ−２と比べて、ヒトＭＡＳＰ−２に対して５〜１０倍高い効力を有する。同等の薬物動態と仮定して、ヒトにおいて有効なレクチン経路の切断を達成すると予想される投与量の範囲を、下記の表３０に示す。
本発明の好ましい実施形態を、図示および説明してきたが、様々な変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書中でなされ得ることが理解されるだろう。
排他的な特性または特権を主張する本発明の実施形態が、以下のとおり定義される。
本発明の前述の態様および本発明に付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより良好に理解されるとき、それらは、より容易に理解されるだろう。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号３８または配列番号９０として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含み、上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号５１または配列番号９４として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含み、上記単離された抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２）
上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２配列が、配列番号３２または３３として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含む、項目１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
（項目３）
上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１配列が、配列番号２８または配列番号２９として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む、項目２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
（項目４）
上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２配列が、配列番号９３として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む、項目３に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
（項目５）
上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１配列が、配列番号９１または配列番号９２として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む、項目４に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
（項目６）
上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号２８を含む、項目３に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
（項目７）
上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号３２を含む、項目２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
（項目８）
上記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号９０を含む、項目１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
（項目９）
配列番号９０に示されるアミノ酸配列が、８位にＲを含む、項目８に記載の単離された抗体。
（項目１０）
上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号９１を含む、項目５に記載の単離された抗体。
（項目１１）
配列番号９１に示されるアミノ酸配列が、２位にＥを含む、項目１０に記載の単離された抗体。
（項目１２）
配列番号９１に示されるアミノ酸配列が、８位にＹを含む、項目１０に記載の単離された抗体。
（項目１３）
上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号９３を含み、配列番号９３に示されるアミノ酸配列が、２位にＫを含む、項目４に記載の単離された抗体。
（項目１４）
上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号９３を含み、配列番号９３に示されるアミノ酸配列が、３位にＱを含む、項目４に記載の単離された抗体。
（項目１５）
上記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号５１を含む、項目１に記載の単離された抗体。
（項目１６）
上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび抗体全体からなる群より選択される、項目１に記載の単離された抗体。
（項目１７）
上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、一本鎖抗体、ＳｃＦｖ、およびヒンジ領域を欠く一価抗体からなる群より選択される、項目１に記載の単離された抗体。
（項目１８）
上記抗体が、１０ｎＭ以下のＫ Ｄ でヒトＭＡＳＰ−２に結合する、項目１に記載の単離された抗体。
（項目１９）
上記抗体が、１％ヒト血清におけるインビトロアッセイにおいてＣ４活性化を１０ｎＭ以下のＩＣ ５０ で阻害する、項目１に記載の抗体。
（項目２０）
上記抗体が、９０％ヒト血清においてＣ４活性化を３０ｎＭ以下のＩＣ ５０ で阻害する、項目１に記載の抗体。
（項目２１）
ヒトＭＡＳＰ−２に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、上記抗体は、
Ｉ）ａ）
ｉ）配列番号２０の３１〜３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ１；および
ｉｉ）配列番号２０の５０〜６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ２；および
ｉｉｉ）配列番号１８または配列番号２０の９５〜１０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域；ならびに
ｂ）
ｉ）配列番号２２または配列番号２４の２４〜３４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１；および
ｉｉ）配列番号２２または配列番号２４の５０〜５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２；および
ｉｉｉ）配列番号２２または配列番号２４の８９〜９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変領域；または
ＩＩ）上記重鎖の上記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１０個までのアミノ酸置換および上記軽鎖可変領域の上記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１０個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は上記可変ドメインと同一であるその改変体
を含み、上記抗体またはその改変体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２２）
上記抗体が、１０ｎＭ以下のＫ Ｄ でヒトＭＡＳＰ−２に結合する、項目２１に記載の抗体。
（項目２３）
上記抗体が、ＭＡＳＰ−２のＣＣＰ１ドメインにおけるエピトープに結合する、項目２１に記載の抗体。
（項目２４）
上記抗体が、１％ヒト血清におけるインビトロアッセイにおいてＣ３ｂ沈着を１０ｎＭ以下のＩＣ ５０ で阻害する、項目２１に記載の抗体。
（項目２５）
上記抗体が、９０％ヒト血清においてＣ３ｂ沈着を３０ｎＭ以下のＩＣ ５０ で阻害する、項目２１に記載の抗体。
（項目２６）
上記抗体が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ） ２ およびＦ（ａｂ’） ２ からなる群より選択される抗体フラグメントである、項目２１に記載の抗体。
（項目２７）
上記抗体が、一本鎖分子である、項目２１に記載の抗体。
（項目２８）
上記抗体が、ＩｇＧ２分子である、項目２１に記載の抗体。
（項目２９）
上記抗体が、ＩｇＧ１分子である、項目２１に記載の抗体。
（項目３０）
上記抗体が、ＩｇＧ４分子である、項目２１に記載の抗体。
（項目３１）
上記ＩｇＧ４分子が、Ｓ２２８Ｐ変異を含む、項目３０に記載の抗体。
（項目３２）
上記抗体が、古典経路を実質的に阻害しない、項目２１に記載の抗体。
（項目３３）
上記重鎖可変領域が、配列番号２０、または配列番号２０に対して少なくとも８０％の同一性を含むその改変体を含む、項目２１に記載の抗体。
（項目３４）
上記重鎖可変領域が、配列番号１８、または配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を含むその改変体を含む、項目２１に記載の抗体。
（項目３５）
上記軽鎖可変領域が、配列番号２４、または配列番号２４に対して少なくとも８０％の同一性を含むその改変体を含む、項目２１に記載の抗体。
（項目３６）
上記軽鎖可変領域が、配列番号２２、または配列番号２２に対して少なくとも８０％の同一性を含むその改変体を含む、項目２１に記載の抗体。
（項目３７）
上記改変体が、上記重鎖可変領域の上記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５または６個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は上記重鎖可変領域と同一である、項目２１に記載の抗体。
（項目３８）
上記改変体が、上記重鎖可変領域の３１、３２、３３、３４、３５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１０２位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む、項目２１に記載の抗体。
（項目３９）
上記改変体が、上記軽鎖可変領域の上記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５または６個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は上記軽鎖可変領域と同一である、項目２１に記載の抗体。
（項目４０）
上記改変体が、上記軽鎖可変領域の２５、２６、２７、２９、３１、３２、３３、５１、５２、８９、９２、９３、９５、９６または９７位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む、項目２１に記載の抗体。
（項目４１）
配列番号１８、配列番号２０または配列番号２１に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む重鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目４２）
配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、項目４１に記載の単離された抗体。
（項目４３）
配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２７に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目４４）
配列番号１８、配列番号２０または配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、項目４３に記載の単離された抗体。
（項目４５）
項目１、２１、４１または４３に示されたような抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列をコードする核酸分子。
（項目４６）
項目４５に記載の本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子を含む発現カセット。
（項目４７）
項目４５または項目４６に記載の本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子のうちの少なくとも１つを含む細胞。
（項目４８）
単離された抗ＭＡＳＰ−２抗体を生成する方法であって、上記抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子の発現を可能にする条件下において項目４７に記載の細胞を培養する工程、および上記抗ＭＡＳＰ−２抗体を単離する工程を包含する、方法。
（項目４９）
表面プラズモン共鳴によって測定されたとき１０ｎＭ以下のＫ Ｄ でヒトＭＡＳＰ−２から解離し、かつ１％血清において、マンナンコーティングされた基材上でＣ４活性化を１０ｎＭ以下のＩＣ ５０ で阻害する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目５０）
上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２０に示されるような重鎖可変領域および配列番号２４に示されるような軽鎖可変領域を含む参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、項目４９に記載の単離されたヒト抗体。
（項目５１）
項目１、２１、４１、４３または４９に記載の完全ヒトモノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
（項目５２）
上記組成物が、全身性送達のために製剤化される、項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
上記組成物が、動脈内、静脈内、頭蓋内、筋肉内、吸入、経鼻または皮下投与のために製剤化される、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）
上記組成物が、皮下投与のために製剤化される、項目５２に記載の組成物。
（項目５５）
ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する方法であって、項目１、２１、４１、４３または４９に記載のヒトモノクローナル抗体を、上記ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するのに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
（項目５６）
ヒト被験体への治療上の投与に適した単位用量のヒトモノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体を備える製品であって、上記単位用量は、１ｍｇから１０００ｍｇまでの範囲である、製品。

Claims (56)

  1. （ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域；ならびに
    （ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ３配列は、配列番号３８または配列番号９０として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含み、前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ３配列は、配列番号５１または配列番号９４として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含み、前記単離された抗体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 前記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２配列が、配列番号３２または３３として示されるアミノ酸配列およびその保存的な配列改変を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  3. 前記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１配列が、配列番号２８または配列番号２９として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む、請求項２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  4. 前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２配列が、配列番号９３として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む、請求項３に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  5. 前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１配列が、配列番号９１または配列番号９２として示されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む、請求項４に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  6. 前記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号２８を含む、請求項３に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  7. 前記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号３２を含む、請求項２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  8. 前記重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号９０を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  9. 配列番号９０に示されるアミノ酸配列が、８位にＲを含む、請求項８に記載の単離された抗体。
  10. 前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号９１を含む、請求項５に記載の単離された抗体。
  11. 配列番号９１に示されるアミノ酸配列が、２位にＥを含む、請求項１０に記載の単離された抗体。
  12. 配列番号９１に示されるアミノ酸配列が、８位にＹを含む、請求項１０に記載の単離された抗体。
  13. 前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号９３を含み、配列番号９３に示されるアミノ酸配列が、２位にＫを含む、請求項４に記載の単離された抗体。
  14. 前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号９３を含み、配列番号９３に示されるアミノ酸配列が、３位にＱを含む、請求項４に記載の単離された抗体。
  15. 前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号５１を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
  16. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび抗体全体からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された抗体。
  17. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、一本鎖抗体、ＳｃＦｖ、およびヒンジ領域を欠く一価抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された抗体。
  18. 前記抗体が、１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＭＡＳＰ−２に結合する、請求項１に記載の単離された抗体。
  19. 前記抗体が、１％ヒト血清におけるインビトロアッセイにおいてＣ４活性化を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項１に記載の抗体。
  20. 前記抗体が、９０％ヒト血清においてＣ４活性化を３０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項１に記載の抗体。
  21. ヒトＭＡＳＰ−２に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、
    Ｉ）ａ）
    ｉ）配列番号２０の３１〜３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ１；および
    ｉｉ）配列番号２０の５０〜６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ２；および
    ｉｉｉ）配列番号１８または配列番号２０の９５〜１０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ−Ｈ３
    を含む重鎖可変領域；ならびに
    ｂ）
    ｉ）配列番号２２または配列番号２４の２４〜３４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１；および
    ｉｉ）配列番号２２または配列番号２４の５０〜５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２；および
    ｉｉｉ）配列番号２２または配列番号２４の８９〜９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３
    を含む軽鎖可変領域；または
    ＩＩ）前記重鎖の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１０個までのアミノ酸置換および前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１０個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は前記可変ドメインと同一であるその改変体
    を含み、前記抗体またはその改変体は、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  22. 前記抗体が、１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＭＡＳＰ−２に結合する、請求項２１に記載の抗体。
  23. 前記抗体が、ＭＡＳＰ−２のＣＣＰ１ドメインにおけるエピトープに結合する、請求項２１に記載の抗体。
  24. 前記抗体が、１％ヒト血清におけるインビトロアッセイにおいてＣ３ｂ沈着を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項２１に記載の抗体。
  25. 前記抗体が、９０％ヒト血清においてＣ３ｂ沈着を３０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、請求項２１に記載の抗体。
  26. 前記抗体が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択される抗体フラグメントである、請求項２１に記載の抗体。
  27. 前記抗体が、一本鎖分子である、請求項２１に記載の抗体。
  28. 前記抗体が、ＩｇＧ２分子である、請求項２１に記載の抗体。
  29. 前記抗体が、ＩｇＧ１分子である、請求項２１に記載の抗体。
  30. 前記抗体が、ＩｇＧ４分子である、請求項２１に記載の抗体。
  31. 前記ＩｇＧ４分子が、Ｓ２２８Ｐ変異を含む、請求項３０に記載の抗体。
  32. 前記抗体が、古典経路を実質的に阻害しない、請求項２１に記載の抗体。
  33. 前記重鎖可変領域が、配列番号２０、または配列番号２０に対して少なくとも８０％の同一性を含むその改変体を含む、請求項２１に記載の抗体。
  34. 前記重鎖可変領域が、配列番号１８、または配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を含むその改変体を含む、請求項２１に記載の抗体。
  35. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２４、または配列番号２４に対して少なくとも８０％の同一性を含むその改変体を含む、請求項２１に記載の抗体。
  36. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２２、または配列番号２２に対して少なくとも８０％の同一性を含むその改変体を含む、請求項２１に記載の抗体。
  37. 前記改変体が、前記重鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５または６個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は前記重鎖可変領域と同一である、請求項２１に記載の抗体。
  38. 前記改変体が、前記重鎖可変領域の３１、３２、３３、３４、３５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１０２位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項２１に記載の抗体。
  39. 前記改変体が、前記軽鎖可変領域の前記ＣＤＲ領域内における合わせて合計１、２、３、４、５または６個までのアミノ酸置換を除けばその他の部分は前記軽鎖可変領域と同一である、請求項２１に記載の抗体。
  40. 前記改変体が、前記軽鎖可変領域の２５、２６、２７、２９、３１、３２、３３、５１、５２、８９、９２、９３、９５、９６または９７位からなる群より選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項２１に記載の抗体。
  41. 配列番号１８、配列番号２０または配列番号２１に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む重鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  42. 配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項４１に記載の単離された抗体。
  43. 配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２７に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＭＡＳＰ−２に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  44. 配列番号１８、配列番号２０または配列番号２１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、請求項４３に記載の単離された抗体。
  45. 請求項１、２１、４１または４３に示されたような抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列をコードする核酸分子。
  46. 請求項４５に記載の本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子を含む発現カセット。
  47. 請求項４５または請求項４６に記載の本発明の抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子のうちの少なくとも１つを含む細胞。
  48. 単離された抗ＭＡＳＰ−２抗体を生成する方法であって、前記抗ＭＡＳＰ−２抗体をコードする核酸分子の発現を可能にする条件下において請求項４７に記載の細胞を培養する工程、および前記抗ＭＡＳＰ−２抗体を単離する工程を包含する、方法。
  49. 表面プラズモン共鳴によって測定されたとき１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＭＡＳＰ−２から解離し、かつ１％血清において、マンナンコーティングされた基材上でＣ４活性化を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
  50. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２０に示されるような重鎖可変領域および配列番号２４に示されるような軽鎖可変領域を含む参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、請求項４９に記載の単離されたヒト抗体。
  51. 請求項１、２１、４１、４３または４９に記載の完全ヒトモノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
  52. 前記組成物が、全身性送達のために製剤化される、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記組成物が、動脈内、静脈内、頭蓋内、筋肉内、吸入、経鼻または皮下投与のために製剤化される、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記組成物が、皮下投与のために製剤化される、請求項５２に記載の組成物。
  55. ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害する方法であって、請求項１、２１、４１、４３または４９に記載のヒトモノクローナル抗体を、前記ヒト被験体におけるＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を阻害するのに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
  56. ヒト被験体への治療上の投与に適した単位用量のヒトモノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体を備える製品であって、前記単位用量は、１ｍｇから１０００ｍｇまでの範囲である、製品。
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