CN114306593A - 用于抑制有需要的受试者的纤维化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于抑制有需要的受试者的纤维化的方法。在一个方面，本发明提供用于在患有或有风险发生由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的哺乳动物受试者中治疗、抑制、减轻或预防纤维化的方法。在一个实施方案中，本发明提供治疗患有肾纤维化的受试者的方法。在一个实施方案中，本发明提供减少患有与蛋白尿有关的肾疾病或病况的受试者的蛋白尿的方法。所述方法包括给予有需要的受试者有效抑制MASP‑2‑依赖性补体活化的量的MASP‑2抑制剂的步骤。

Description

用于抑制有需要的受试者的纤维化的方法
本申请是申请日为2017年1月5日的中国专利申请201780005761.8“用于抑制有需要的受试者的纤维化的方法”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月5日提交的临时申请号62/275,025和2016年10月13日提交的临时申请号62/407,979的权益，这二者通过引用以其整体结合到本文中。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸印本提供，并且在此通过引用并入本说明书。包含该序列表的文本文件的名称为MP_1_0250_PCT_Sequence_Listing_20170104_ST25。该文本文件为136 KB；创建于2017年1月4日；并且随着本说明书的提交经由EFS-Web提交。
背景技术
补体系统为在人和其它脊椎动物中启动、增强和协调对微生物感染和其它急性损伤的免疫应答提供了早期的作用机制(M.K. Liszewski和J.P. Atkinson, 1993, inFundamental Immunology, 第三版,W.E. Paul编辑, Raven Press, Ltd., New York)。尽管补体活化提供了重要的针对潜在病原体的第一线防御，但是促进保护性免疫应答的补体活性也可以表现出对宿主的潜在威胁(K.R. Kalli, 等人, Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994)。例如，C3和C5蛋白水解产物募集并活化嗜中性粒细胞。尽管对宿主防御不可缺少，但是活化的中性粒细胞不加选择地释放破坏性酶，可能造成器官损伤。此外，补体活化可能导致溶胞的补体组分沉积在附近的宿主细胞以及微生物靶上，导致宿主细胞裂解。
补体系统也已经被牵连进许多急性和慢性疾病状况的发病机制，所述疾病状况包括：心肌梗死、中风、ARDS、再灌注损伤、败血症性休克、热烧伤之后的毛细血管渗漏、心肺分流术后炎症、移植排斥、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和阿尔茨海默氏病。在几乎所有的这些疾病中，补体都不是病因，而是发病机制所涉及的若干因素之一。尽管如此，补体活化可能是主要的病理机制，并在许多这类疾病状况的临床控制中代表有效点。对各种疾病状况中补体介导的组织损伤的重要性的增加的认识增强了对有效补体抑制药物的需求。迄今为止，依库丽单抗(Solaris®)，针对C5的抗体，是已被批准用于人使用的唯一补体-靶向药物。然而，C5是位于补体系统“下游”的几个效应分子之一，并且C5的阻断不抑制补体系统的活化。因此，补体激活的起始步骤的抑制剂相对于“下游”补体抑制剂具有显著优势。
目前，普遍认为补体系统可通过三种不同的途径被活化：经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径通常是由宿主抗体与外源颗粒(即抗原)相结合构成的复合物触发的，因此需要预先暴露于抗原来产生特异性抗体应答。因为经典途径的活化取决于宿主的先前的适应性免疫应答，所以经典途径是获得性免疫系统的一部分。相反，凝集素途径和替代途径两者不依赖于适应性免疫(adaptive immunity)，是先天性免疫系统的一部分。
补体系统的活化导致了丝氨酸蛋白酶酶原的序贯活化。经典途径活化的第一步是特异性识别分子C1q与结合了抗原的IgG和IgM分子结合。C1q与C1r和C1s丝氨酸蛋白酶酶原结合成称为C1的复合物。当C1q与免疫复合物结合之后，C1r的Arg-Ile位点进行自我蛋白水解裂解，接着是C1r介导的裂解和C1s的活化，从而获得裂解C4和C2的能力。C4裂解成两个片段，称为C4a和C4b，且类似地，C2裂解成C2a和C2b。C4b片段能够与邻近的羟基或氨基形成共价键，且通过与活化C2的C2a片段进行非共价相互作用而产生C3转化酶(C4b2a)。C3转化酶(C4b2a)通过蛋白水解裂解成C3a和C3b亚组分而活化C3，导致生成C5转化酶(C4b2a3b)，所述C5转化酶(C4b2a3b)通过裂解C5而导致形成膜攻击复合物(C5b与C6、C7、C8和C-9组合，也称为“MAC”)，所述膜攻击复合物可以破坏细胞膜，导致细胞裂解。C3和C4的活化形式(C3b和C4b)共价沉积在外源靶表面上，其被多种吞噬细胞上的补体受体所识别。
独立地，补体系统通过凝集素途径活化的第一步也是特异性识别分子的结合，接着是所结合的丝氨酸蛋白酶酶原的活化。然而，凝集素途径中的识别分子包含一组碳水化合物结合蛋白(甘露聚糖结合凝集素(MBL)、H-纤维胶凝蛋白(H-ficolin)、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和C型凝集素CL-11)(统称为凝集素)，而不是通过C1q来结合免疫复合物。参见J. Lu等人，Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov 等人,Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh等人, Immunology 101:225-232(2000))。还参见J. Luet等人, Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov等人, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh等人, Immunology 101:225-232(2000); Hansen等人, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010)。
Ikeda等人首先证明，与C1q类似，MBL在与酵母甘露聚糖包被的红细胞结合之后能够以C4依赖的方式使补体系统活化(Ikeda等人, J. Biol. Chem. 262:7451-7454,(1987))。MBL是胶原凝集素蛋白家族的成员，是钙依赖性凝集素，与具有定位于吡喃糖环赤道面上的3-羟基和4-羟基的碳水化合物结合。因此MBL的重要配体是D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺，而不符合这种空间要求的碳水化合物则对MBL没有可检出的亲和力(Weis等人,Nature 360:127-134, (1992))。MBL和单价糖之间的相互作用是极弱的，解离常数通常在单位数毫摩尔(single-digit millimolar)的范围内。MBL通过亲合力(即通过同时与彼此紧密邻近定位的多个单糖残基相互作用)实现了与聚糖配体的紧密特异性结合(Lee等人,Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992))。MBL识别通常修饰微生物诸如细菌、酵母、寄生虫和某些病毒的碳水化合物模式。相反，MBL不识别D-半乳糖和唾液酸，即倒数第二位的糖和倒数第一位的糖，它们一般修饰哺乳动物血浆和细胞表面糖蛋白上存在的“成熟”复杂糖缀合物。认为这种结合特异性促进“外源”表面的识别且有助于保护免于“自身活化”。然而，MBL确实以高亲和力结合高甘露糖“前体”聚糖簇，这些簇位于被隔离在哺乳动物细胞内质网和高尔基体内的N-连接的糖蛋白和糖脂上(Maynard等人，J. Biol. Chem.257:3788-3794，(1982))。因此，受损细胞是通过MBL结合的凝集素途径活化的潜在目标。
纤维胶凝蛋白(ficolin)具有类型不同于MBL的凝集素结构域，称为血纤蛋白原样结构域。纤维胶凝蛋白以不依赖Ca++的方式来结合糖残基。在人体中，已经鉴定出纤维胶凝蛋白的三种类型(L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白)。L-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白这两种血清纤维胶凝蛋白共同对N-乙酰-D-葡糖胺具有特异性；然而，H-纤维胶凝蛋白还结合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白、CL-11和MBL的糖特异性的差异意味着不同的凝集素可能是互补的，尽管有重叠，但是可能靶向不同的糖缀合物。这个观点得到了最新报道的支持，即在凝集素途径的已知凝集素中，只有L-纤维胶凝蛋白与脂磷壁酸特异性结合，脂磷壁酸是一种存在于所有革兰氏阳性菌上的细胞壁糖缀合物(Lynch等人, J. Immunol. 172:1198-1202, (2004))。胶原凝集素(即MBL)和纤维胶凝蛋白在氨基酸序列上没有显著的相似性。然而，两组蛋白质具有类似的结构域组构，与C1q类似，装配成寡聚结构，这样就使得多位点结合的可能性最大化。
MBL的血清浓度在健康人群中是高度可变的，这在遗传上是由MBL基因的启动子和编码区二者的多态性/突变所控制的。作为急性期蛋白，MBL的表达在炎症期间进一步上调。L-纤维胶凝蛋白在血清中存在的浓度与MBL的浓度类似。因此，凝集素途径的L-纤维胶凝蛋白分支在力量上可能与MBL臂相当。MBL和纤维胶凝蛋白也可能作为调理素起作用，这允许吞噬细胞靶向至MBL和纤维胶凝蛋白装饰的表面(参见Jack等人, J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita和Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002),Aoyagi等人, J Immunol, 174(1):418-25(2005)。这种调理素作用需要这些蛋白质与吞噬细胞受体相互作用(Kuhlman等人, J. Exp. Med. 169:1733, (1989); Matsushita等人,J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996))，其身份还未得到确定。
人MBL通过其胶原样结构域与独特的C1r/C1s样丝氨酸蛋白酶(称为MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases，MASP))形成特异性、高亲和力的相互作用。迄今为止已经描述了三种MASP。首先，鉴定出单一的酶“MASP”，其特征是负责启动补体级联(即裂解C2和C4)的酶(Matsushita等人, J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji等人, J. Immunol. 150:571-578, (1993))。随后确定MASP活性，实际上是两种蛋白酶MASP-1和MASP-2的混合物(Thiel等人，Nature 386:506-510, (1997))。然而，证明了仅MBL-MASP-2复合物就足以使补体活化(Vorup-Jensen等人, J. Immunol.165:2093-2100,(2000))。此外，只有MASP-2快速裂解C2和C4 (Ambrus等人, J. Immunol. 170:1374-1382,(2003))。因此，MASP-2是负责激活C4和C2以产生C3转化酶C4b2a的蛋白酶。这是不同于经典途径的C1复合物的显著差异，C1复合物中两种特异性丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)协同作用导致了补体系统的活化。此外，已经分离出第三种新的蛋白酶MASP-3 (Dahl, M.R.,等人,Immunity 15:127-35, 2001)。MASP-1和MASP-3是同一基因的可变剪接产物。
MASP与C1复合物的酶成分C1r和C1s的那些共享相同的结构域组构(Sim等人，Biochem. Soc. Trans. 28:545，2000)。这些结构域包括N末端C1r/C1s/海胆VEGF/骨形成蛋白(CUB)结构域、表皮生长因子样结构域、第二CUB结构域、补体调控蛋白结构域的串联和丝氨酸蛋白酶结构域。与在C1蛋白酶中一样，MASP-2的活化通过丝氨酸蛋白酶结构域附近的Arg-Ile键裂解而产生，这将酶分成二硫键连接的A链和B链，后者由丝氨酸蛋白酶结构域构成。
MBL还可以与MASP-2的可变切片形式(被称作19 kDa的MBL相关蛋白(MAp19)或小MBL相关蛋白(sMAP)，其缺乏MASP-2的催化活性)结合。(Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi等人, Int. Immunol. 11:859-863, (1999))。MAp19包括MASP-2的前两个结构域，其后接着是4个独特氨基酸的额外序列。MAp19的功能不明确(Degn等人,J Immunol. Methods, 2011)。MASP-1和MASP-2基因分别位于人3号染色体和1号染色体上(Schwaeble等人, Immunobiology 205:455-466, (2002))。
若干证据表明存在不同的MBL-MASP复合物，且血清中MASP的大部分不与MBL复合(Thiel,等人, J. Immunol. 165:878-887, (2000))。H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白都与所有的MASP结合，并且激活凝集素补体途径，同MBL一样(Dahl等人, Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita等人, J. Immunol. 168:3502-3506, (2002))。凝集素途径和经典途径都形成共同的C3转化酶(C4b2a)，这两条途径在这一步会合。
普遍认为在天然宿主中，凝集素途径在宿主抵抗感染的防御中具有重要作用。MBL参与宿主防御的强有力证据来自于对功能性MBL血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick,Biochim. Biophys. Acta1572:401-413, (2002))。这些患者表现出复发性细菌和真菌感染的易感性。这些症状通常在生命早期在易损表观窗期间是明显的，因为从母体获得的抗体效价降低，但处于全部抗体应答发展之前。这种症状经常是由于MBL胶原部分的数个位点突变引起的，其干扰了MBL寡聚体的正确形成。然而，由于MBL可以作为不依赖于补体的调理素起作用，所以还不知道对感染的易感性增加在多大程度上是由于受损的补体活化所致。
认为所有三种途径(即经典、凝集素和替代途径)会合于C5，它被裂解形成具有多种促炎作用的产物。会合后的途径被称为末端补体途径。C5a是最有效的过敏毒素，引起平滑肌和血管紧张度以及血管通透性的改变。它也是嗜中性粒细胞和单核细胞两者的强有力的趋化因子和激活因子。C5a介导的细胞活化能够通过诱导释放多种另外的炎症介质来显著放大炎症反应，另外的炎症介质包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢物和活性氧类别。C5裂解导致了C5b-9的形成，它也被称为膜攻击复合物(MAC)。目前强有力的证据表明，亚裂解的MAC沉积除了起裂解成孔复合物的作用外，还可能还在炎症中发挥重要作用。
除了在免疫防御中的基本作用外，补体系统是造成许多临床疾病的组织损伤的原因。尽管大量证据表明在非感染性人类疾病的发病机制中，经典补体途径和替代补体途径两者都存在，但是对凝集素途径作用的评价才刚刚开始。最新研究提供的证据表明，凝集素途径的活化可能是造成缺血/再灌注损伤中补体活化和相关炎症的原因。Collard等人(2000)报告受到氧化应激的培养的内皮细胞结合MBL，且在暴露于人血清之后显示出C3沉积(Collard等人, Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000))。此外，用阻断性抗MBL单克隆抗体处理人血清抑制了MBL结合和补体活化。将这些发现扩展到心肌缺血-再灌注大鼠模型上，其中比起用对照抗体处理的大鼠，用针对大鼠MBL的阻断性抗体处理的大鼠在冠状动脉闭塞之后显示心肌损伤显著较轻(Jordan等人, Circulation 104:1413-1418,(2001))。尚不清楚氧化应激后MBL与血管内皮结合的分子机制；最近的研究表明，氧化应激后凝集素途径的活化可能是由MBL与血管内皮细胞角蛋白结合而介导的，而不是与糖缀合物结合结合而介导的(Collard等人, Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001))。其它研究已显示出缺血/再灌注损伤发病机制中的经典途径和替代途径以及凝集素途径在这种疾病中的作用仍然存在争议(Riedermann, N.C.,等人, Am. J. Pathol. 162:363-367,2003)。
纤维化是在器官或组织中过度结缔组织形成，通常响应于损害或损伤。纤维化的标志是在局部创伤后产生过度的细胞外基质。对损伤的正常生理反应导致结缔组织沉积，但这种初始有益的修复过程可能持续和变成病态，改变了组织的结构和功能。在细胞水平上，上皮细胞和成纤维细胞增殖和分化成成肌纤维细胞，导致基质收缩、强度增加、微血管压迫和缺氧。炎性细胞(包括巨噬细胞和淋巴细胞)的流入导致细胞因子释放和扩大胶原、纤连蛋白和纤维化的其它分子标志物的沉积。常规治疗方法主要使用皮质类固醇和免疫抑制性药物来靶向纤维化的炎性过程。不幸地是，这些抗炎剂具有很少至没有临床效果。目前对于纤维化没有有效的疗法或治疗剂，但动物研究和实录性的人报告表明，纤维化组织损伤可逆转(Tampe和Zeisberg，Nat Rev Nephrol，Vol 10:226-237，2014)。
肾从损伤恢复的能力有限。各种肾病理导致局部炎症，其引起瘢痕形成和肾组织的纤维化。炎性刺激的永存化驱动小管间质性炎症和纤维化，以及慢性肾疾病的进行性肾功能受损。其进展至晚期肾衰竭与显著的发病率和死亡率有关。因为小管间质性纤维化是多种肾病理的常见终点，其代表了关键的治疗靶标，目的在于预防肾衰竭。不依赖于原发性肾疾病的风险因素(例如，蛋白尿)通过驱动局部炎症来促进肾纤维化的发展和肾排泄功能的损失，其进而增强疾病进展。
鉴于纤维化在许多疾病和病症中的作用，例如，小管间质性纤维化导致慢性肾疾病，对开发用于治疗由纤维化引起或加重的疾病和病况的治疗有效的药剂，存在紧迫需求。进一步鉴于靶向肾疾病中的炎性促纤维化途径的新的和已有治疗的匮乏，对开发治疗、抑制、预防和/或逆转肾纤维化，从而预防进行性慢性肾疾病的治疗有效的药剂，存在需求。
发明内容
提供本概述，从而以简化形式引入概念的选择，其在以下发明详述中进一步描述。本概述既不欲鉴定请求保护的主题的关键特征，也不欲用于协助确定请求保护的主题的范围。
在一个方面，本发明提供用于治疗、抑制、减轻或预防患有或有风险发生由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的哺乳动物受试者的纤维化的方法，包括给予受试者有效抑制纤维化的量的MASP-2抑制剂。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而不显著抑制C1q-依赖性补体活化。在一个实施方案中，受试者患有由以下的至少一项引起或加重的疾病或病症：(i) 与缺血性再灌注损伤有关的纤维化和/或炎症、(ii) 肾纤维化和/或肾炎症(例如，小管间质性纤维化、慢性肾疾病、慢性肾衰竭、肾小球疾病(例如，局灶性节段性肾小球硬化)、免疫复合病症(例如，IgA肾病、膜性肾病)、狼疮性肾炎、肾病综合征、糖尿病肾病、小管间质性损伤和肾小球性肾炎(例如，C3肾小球病)、(iii) 肺纤维化和/或炎症(例如，慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、与硬皮病有关的肺纤维化、支气管扩张和肺动脉高压)、(iv) 肝纤维化和/或炎症(例如，肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(脂肪性肝炎))、继发于酒精滥用的肝脏纤维化、继发于急性或慢性肝炎的肝脏纤维化、胆疾病和毒性肝损伤(例如，由对乙酰氨基酚或其它药物引起的药物诱导的肝损伤导致的肝毒性)、(v) 心脏纤维化和/或炎症(例如，心脏纤维化、心肌梗塞、瓣膜纤维化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、(vi) 血管纤维化(例如，血管疾病、动脉粥样硬化性血管疾病、血管狭窄、再狭窄、血管炎、静脉炎、深部静脉血栓形成和腹主动脉瘤)、(vii)皮肤的纤维化(例如，过度伤口愈合、硬皮病、全身性硬化、瘢痕瘤、结缔组织病、瘢痕形成和肥厚性瘢痕)、(viii) 关节的纤维化(例如，关节纤维化)、(ix) 中枢神经系统的纤维化(例如，中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤)、(x) 消化系统的纤维化(例如，克罗恩病、胰脏纤维化和溃疡性结肠炎)、(xi) 眼纤维化(例如，前囊下白内障、后囊乳浊、黄斑变性和视网膜和玻璃体视网膜病)、(xii) 肌肉骨骼软组织结构的纤维化(例如，粘连性囊炎、杜普伊特伦氏挛缩和骨髓纤维化)、(xiii) 生殖器官的纤维化(例如，子宫内膜异位和佩伦涅氏病)、(xiv)引起纤维化和/或炎症的慢性感染性疾病(例如，α病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、结核病、HIV和流感)、(xv) 引起纤维化和/或炎症的自身免疫性疾病(例如，硬皮病和系统性红斑狼疮(SLE)、(xvi) 与创伤有关的瘢痕形成(例如，其中与创伤有关的瘢痕形成选自手术并发症(例如，手术粘连，其中瘢痕组织可在内脏器官之间形成，导致挛缩、疼痛和可导致不育)、化学治疗药物诱导的纤维化、辐射诱导的纤维化和与烧伤有关的瘢痕形成)、或(xvii) 器官移植、乳房纤维化、肌肉纤维化、腹膜后纤维化、甲状腺纤维化、淋巴结纤维化、膀胱纤维化和胸膜纤维化。
在另一方面，本发明提供用于治疗、抑制、减轻或预防患有或有风险发生由肾纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的哺乳动物受试者的肾纤维化的方法，包括给予受试者有效抑制肾纤维化的量的MASP-2抑制剂。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抗体或其片段以其结合补体系统的不同抗原至少10倍的亲和力特异性结合包含SEQ ID NO:6的多肽。在一个实施方案中，抗体或其片段选自重组抗体、具有减少的效应子功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而不显著抑制C1q-依赖性补体活化。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内或作为吸入剂给予。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂以有效抑制小管间质性纤维化的量给予。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂以有效减少、延迟或消除受试者的透析需要的量给予。在一个实施方案中，受试者患有选自慢性肾疾病、慢性肾衰竭、肾小球疾病(例如，局灶性节段性肾小球硬化)、免疫复合病症(例如，IgA肾病、膜性肾病)、狼疮性肾炎、肾病综合征、糖尿病肾病、小管间质性损伤和肾小球性肾炎(例如，C3肾小球病)的肾疾病或病症。在一个实施方案中，受试者患有蛋白尿和MASP-2抑制剂以有效减少受试者的蛋白尿的量给予。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂以与治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比有效实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少(例如，至少30%减少或至少40%减少或至少50%减少)的量和时间给予。在一个实施方案中，受试者患有与蛋白尿有关的肾疾病或病症，其选自肾病综合征、先兆子痫、子痫、肾的中毒性损害、淀粉样变、胶原血管疾病(例如，系统性红斑狼疮)、脱水、肾小球疾病(例如，膜性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎、C3肾小球病、微小病变疾病、脂性肾病)、大强度运动、应激、良性直立位(体位)蛋白尿、局灶性节段性肾小球硬化、IgA肾病(即，贝格尔氏病)、IgM肾病、膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾病、微小病变疾病、结节病、阿尔波特氏综合征、糖尿病(糖尿病肾病)、药物诱导的毒性(例如，NSAIDS、尼古丁、青霉胺、碳酸锂、金和其它重金属、ACE抑制剂、抗生素(例如，阿霉素)或阿片制剂(例如，海洛英)或其它肾毒素)；法布里氏病、感染(例如，HIV、梅毒、甲、乙或丙型肝炎、链球菌后感染、尿路血吸虫病)；氨基酸尿症、范科尼综合征、高血压肾硬化、间质性肾炎、镰状细胞病、血红蛋白尿、多发性骨髓瘤、肌红蛋白尿、器官排斥(例如，肾移植排斥)、埃博拉出血热、甲髌综合征、家族性地中海热、HELLP综合征、系统性红斑狼疮、韦格纳氏肉芽肿病、类风湿性关节炎、糖原贮积病1型、古德帕斯彻氏综合征、过敏性紫癜、已扩散到肾的尿路感染、斯耶格伦氏综合征和感染后肾小球性肾炎。在一个实施方案中，受试者患有IgA肾病。在一个实施方案中，受试者患有膜性肾病。
在另一方面，本发明提供预防或减少患有与蛋白尿有关的疾病或病况的受试者的肾损伤的方法，包括给予有效减少或预防受试者的蛋白尿的量的MASP-2抑制剂。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而不显著抑制C1q-依赖性补体活化。在一个实施方案中，与蛋白尿有关的疾病或病况选自肾病综合征、先兆子痫、子痫、肾的中毒性损害、淀粉样变、胶原血管疾病(例如，系统性红斑狼疮)、脱水、肾小球疾病(例如，膜性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎、C3肾小球病、微小病变疾病、脂性肾病)、大强度运动、应激、良性直立位(体位)蛋白尿、局灶性节段性肾小球硬化、IgA肾病(即，贝格尔氏病)、IgM肾病、膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾病、微小病变疾病、结节病、阿尔波特氏综合征、糖尿病(糖尿病肾病)、药物诱导的毒性(例如，NSAIDS、尼古丁、青霉胺、碳酸锂、金和其它重金属、ACE抑制剂、抗生素(例如，阿霉素)或阿片制剂(例如，海洛英))；法布里氏病、感染(例如，HIV、梅毒、甲、乙或丙型肝炎、链球菌后感染、尿路血吸虫病)；氨基酸尿症、范科尼综合征、高血压肾硬化、间质性肾炎、镰状细胞病、血红蛋白尿、多发性骨髓瘤、肌红蛋白尿、器官排斥(例如，肾移植排斥)、埃博拉出血热、甲髌综合征、家族性地中海热、HELLP综合征、系统性红斑狼疮、韦格纳氏肉芽肿病、类风湿性关节炎、糖原贮积病1型、古德帕斯彻氏综合征、过敏性紫癜、已扩散到肾的尿路感染、斯耶格伦氏综合征和感染后肾小球性肾炎。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂以与治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比有效实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少(例如，至少30%减少或至少40%减少或至少50%减少)的量和时间给予。
在另一方面，本发明提供抑制慢性肾疾病的进展的方法，包括给予有效减少或预防有需要的受试者的肾纤维化(例如，小管间质性纤维化)的量的MASP-2抑制剂。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而不显著抑制C1q-依赖性补体活化。在一个实施方案中，在给予MASP-2抑制剂之前，有需要的受试者显示蛋白尿，和MASP-2抑制剂的给予降低受试者的蛋白尿。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂以与治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比有效实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少(例如，至少30%减少或至少40%减少或至少50%减少)的量和时间给予。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂以有效减少、延迟或消除受试者的透析需要的量给予。
在另一方面，本发明提供保护受试者的肾免于肾损伤的方法，所述受试者已经历、正在经历或将经历用一种或多种肾毒性剂的治疗，包括给予有效预防或改善药物诱导的肾病的量的MASP-2抑制剂。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的MASP-2单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而不显著抑制C1q-依赖性补体活化。
在另一方面，本发明提供治疗患有免疫球蛋白A肾病(IgAN)的人受试者的方法，包括给予受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中，受试者患有类固醇依赖性IgAN。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，抗体或其片段选自重组抗体、具有减少的效应子功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体不显著抑制经典途径。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体以30 nM或更小的IC50在90%人血清中抑制C3b沉积。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在给予受试者包含有效改进肾功能的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前，鉴定具有类固醇依赖性IgAN的人受试者。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以有效改进肾功能的量给予。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以与治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少的有效量和足够时间给予。在一个实施方案中，组合物以足以在所述受试者中改进肾功能和减少皮质类固醇剂量的量给予。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在另一方面，本发明提供治疗患有膜性肾病(MN)的人受试者的方法，包括给予受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中，受试者患有类固醇依赖性MN。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以有效改进肾功能的量给予。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以与治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少的有效量和足够时间给予。在一个实施方案中，组合物以足够在所述受试者中改进肾功能和减少皮质类固醇剂量的量给予。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
附图说明
通过参考下面的详细描述连同附图，本发明前述的方面以及许多附带的优点将更容易领会，同样也更好理解，其中：
图1是说明人MASP-2基因组结构的图；
图2A是说明人MASP-2蛋白的结构域结构的示意图；
图2B是说明人MAp19蛋白的结构域结构的示意图；
图3是说明鼠MASP-2敲除策略的图；
图4是说明人MASP-2微基因构建体的图；
图5A提供了证明MASP-2缺陷导致凝集素途径介导的C4活化丧失的结果，如通过甘露聚糖上C4b沉积缺陷所测定的，如实施例2所述；
图5B提供了证明MASP-2缺陷导致凝集素途径介导的C4活化丧失的结果，如通过酵母聚糖上C4b沉积缺陷所测定的，如实施例2所述；
图5C提供了证明获自MASP-2 +/-、MASP-2 -/-和野生型品系的血清样品的相对C4活化水平的结果，如通过甘露聚糖和酵母聚糖上的C4b沉积所测定的，如实施例2所述；
图6提供了证明加入鼠重组MASP-2到MASP-2 -/-血清样品中以蛋白浓度依赖的方式恢复了凝集素途径介导的C4活化的结果，如通过甘露聚糖上的C4b沉积所测定的，如实施例2所述；
图7提供了证明MASP-2 -/-品系中经典途径有功能的结果，如实施例8所述；
图8A提供了证明抗MASP-2 Fab2抗体#11抑制C3转化酶形成的结果，如实施例10所述；
图8B提供了证明抗MASP-2 Fab2抗体#11与天然大鼠MASP-2结合的结果，如实施例10所述；
图8C提供了证明抗MASP-2 Fab2抗体#41抑制C4裂解的结果，如实施例10所述；
图9提供了证明经测试抑制C3转化酶形成的所有抗MASP-2 Fab2抗体还被发现抑制C4裂解的结果，如实施例10所述；
图10是说明从用于MASP-2阻断性Fab2抗体表位作图的大鼠MASP-2衍生的重组多肽的示意图，如实施例11所述；
图11提供了证明抗MASP-2 Fab2 #40和#60与大鼠MASP-2多肽结合的结果，如实施例11所述；
图12A图示在凝集素途径特异性测定条件下在存在或不存在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的情况下MAC沉积的水平，证实OMS646以大约1 nM的IC50值抑制凝集素介导的MAC沉积，如实施例12所述；
图12B图示在经典途径特异性测定条件下在存在或不存在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的情况下MAC沉积的水平，证实OMS646不抑制经典途径介导的MAC沉积，如实施例12所述；
图12C图示在替代途径特异性测定条件下在存在或不存在人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的情况下MAC沉积的水平，证实OMS646不抑制替代途径介导的MAC沉积，如实施例12所述；
图13图示在小鼠中人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的药代动力学(PK)特征，显示OMS646浓度(n=3只动物/组的均值)作为在以指定剂量给予后的时间的函数，如实施例12所述；
图14A图示在静脉内给予后在小鼠中人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的药效学(PD)反应，其作为系统凝集素途径活性的下降测量，如实施例12所述；
图14B图示在皮下给予后在小鼠中人MASP-2单克隆抗体(OMS646)的药效学(PD)反应，其作为系统凝集素途径活性的下降测量，如实施例12所述；
图15图示用天狼星红染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，其中组织切片获自单侧输尿管梗阻(UUO) 7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠，和假手术野生型和MASP-2-/-小鼠，如实施例14所述；
图16图示用F4/80巨噬细胞特异性抗体染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，其中组织切片获自单侧输尿管梗阻(UUO) 7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠，和假手术野生型和MASP-2-/-小鼠，如实施例14所述。
图17图示在获自单侧输尿管梗阻(UUO) 7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠和假手术野生型和MASP-2-/-小鼠的肾组织切片中通过定量PCR (qPCR)测量的胶原-4的相对mRNA表达水平，如实施例14所述。
图18图示在获自单侧输尿管梗阻(UUO) 7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠和假手术野生型和MASP-2-/-小鼠的肾组织切片中通过qPCR测量的转化生长因子β-1 (TGFβ-1)的相对mRNA表达水平，如实施例14所述。
图19图示在获自单侧输尿管梗阻(UUO) 7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠和假手术野生型和MASP-2-/-小鼠的肾组织切片中通过qPCR测量的白细胞介素-6 (IL-6)的相对mRNA表达水平，如实施例14所述。
图20图示在获自单侧输尿管梗阻(UUO) 7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠和假手术野生型和MASP-2-/-小鼠的肾组织切片中通过qPCR测量的干扰素-γ的相对mRNA表达水平，如实施例14所述。
图21图示用天狼星红染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，其中组织切片在单侧输尿管梗阻(UUO) 7天后从用MASP-2抑制性抗体和同种型对照抗体处理的野生型小鼠获得，如实施例15所述。
图22图示与在来自获自用IgG4同种型对照处理的野生型小鼠的梗阻肾的组织中羟脯氨酸的水平相比，来自获自用MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠的单侧输尿管梗阻(UUO)后7天收获的肾的羟脯氨酸含量，如实施例15所述。
图23图示在仅接受盐水的野生型对照小鼠(n=2)、接受BSA的野生型小鼠(n=6)和接受BSA的MASP-2-/-小鼠(n=6)中，在蛋白过载研究第15天测量的血清蛋白质的总量(mg/ml)，如实施例16所述。
图24图示在蛋白过载研究第15天经24小时从仅接受盐水的野生型对照小鼠(n=2)、接受BSA的野生型(n=6)和接受BSA的MASP-2-/-小鼠(n=6)收集的尿液中的分泌的蛋白总量(mg)，如实施例16所述。
图25显示在蛋白过载研究第15天来自以下各组小鼠的代表性的苏木精和伊红(H&E)染色的肾组织切片：(图A) 野生型对照小鼠；(图B) MASP-2-/-对照小鼠；(图C) 用BSA处理的野生型小鼠；和(图D) 用牛血清白蛋白(BSA)处理的MASP-2-/-小鼠，如实施例16所述。
图26图示用巨噬细胞特异性抗体F4/80染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，显示巨噬细胞平均染色面积(%)，其中组织切片在蛋白过载研究第15天从野生型对照小鼠(n=2)、用BSA处理的野生型小鼠(n=6)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=5)获得，如实施例16所述。
图27A图示通过在24小时样品的尿液中测量的总分泌蛋白与巨噬细胞浸润(平均染色面积%)作图，在用BSA处理的每只野生型小鼠(n=6)中巨噬细胞-蛋白尿相关性的存在分析，如实施例16所述。
图27B图示通过在24小时样品的尿液中的总分泌蛋白与巨噬细胞浸润(平均染色面积%)作图，在用BSA处理的每只MASP-2-/-小鼠(n=5)中巨噬细胞-蛋白尿相关性的存在分析，如实施例16所述。
图28图示在用BSA处理的野生型小鼠(n=4)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=5)中，用抗-TGFβ抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(作为% TGFβ抗体染色面积测量)，如实施例16所述。
图29图示在用BSA处理的野生型小鼠(n=4)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=5)中，用抗-TNFα抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(作为% TNFα抗体染色面积测量)，如实施例16所述。
图30图示在野生型对照小鼠、MASP-2-/-对照小鼠、用BSA处理的野生型小鼠(n=7)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=7)中，用抗-IL-6抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(作为% IL-6抗体染色面积测量)，如实施例16所述。
图31图示在来自野生型对照小鼠(n=1)、MASP-2-/-对照小鼠(n=1)、用BSA处理的野生型小鼠(n=6)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=7)的肾皮质的组织切片的连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数的TUNEL凋亡细胞的频率，如实施例16所述。
图32显示在用BSA处理后第15天，来自以下各组小鼠的代表性的H&E染色组织切片：(图A) 用盐水处理的野生型对照小鼠、(图B) 同种型抗体处理的对照小鼠和(图C) 用MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠，如实施例17所述。
图33图示在来自用盐水对照和BSA处理的野生型小鼠(n=8)、用同种型对照抗体和BSA处理的野生型小鼠(n=8)和用MASP-2抑制性抗体和BSA处理的野生型小鼠(n=7)的肾皮质的组织切片的连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数的TUNEL凋亡细胞的频率，如实施例17所述。
图34图示在用BSA和盐水处理的野生型小鼠(n=8)、用BSA和同种型对照抗体处理的野生型小鼠(n=7)和用BSA和MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠(n=8)中，用抗-TGFβ抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(作为% TGFβ抗体染色面积测量)，如实施例17所述。
图35图示在用BSA和盐水处理的野生型小鼠(n=8)、BSA和同种型对照抗体(n=7)和用BSA和MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠(n=8)中，用抗-TNFα抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(作为% TNFα抗体染色面积测量)，如实施例17所述。
图36图示在用BSA和盐水处理的野生型小鼠(n=8)、BSA和同种型对照抗体(n=7)和用BSA和MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠(n=8)中，用抗-IL-6抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(作为% IL-6抗体染色面积测量)，如实施例17所述。
图37显示在用阿霉素或仅盐水(对照)处理后第14天，来自以下各组小鼠的代表性的H&E染色组织切片：(图A-1、A-2、A-3) 用仅盐水处理的野生型对照小鼠；(图B-1、B-2、B-3) 用阿霉素处理的野生型小鼠；和(图C-1、C-2、C-3) 用阿霉素处理的MASP-2-/-小鼠，如实施例18所述；
图38图示用巨噬细胞特异性抗体F4/80染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，显示在用阿霉素或仅盐水(野生型对照)处理后第14天来自以下各组小鼠的巨噬细胞平均染色面积(%)：用仅盐水处理的野生型对照小鼠；用阿霉素处理的野生型小鼠；用仅盐水处理的MASP-2-/-小鼠和用阿霉素处理的MASP-2 -/-小鼠，其中**p=0.007，如实施例18所述；
图39图示用天狼星红染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，显示在用阿霉素或仅盐水(野生型对照)处理后第14天来自以下各组小鼠的胶原沉积染色面积(%)：用仅盐水处理的野生型对照小鼠；用阿霉素处理的野生型小鼠；用仅盐水处理的MASP-2-/-小鼠和用阿霉素处理的MASP-2 -/-小鼠，其中**p=0.005，如实施例18所述；和
图40图示在用MASP-2抑制性抗体(OMS646)每周处理的12周研究过程期间，在两个IgA患者中的尿白蛋白/肌酸酐比率(uACR)，如实施例19所述。
序列表描述
SEQ ID NO:1 人MAp19 cDNA
SEQ ID NO:2 人MAp19 蛋白(具有前导序列)
SEQ ID NO:3 人MAp19 蛋白(成熟)
SEQ ID NO:4 人MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 人MASP-2 蛋白(具有前导序列)
SEQ ID NO:6 人MASP-2 蛋白(成熟)
SEQ ID NO:7 人MASP-2 gDNA (外显子1-6)
抗原：(关于MASP-2成熟蛋白)
SEQ ID NO:8 CUBI序列(氨基酸1-121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF序列(氨基酸1-166)
SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII (氨基酸1-293)
SEQ ID NO:11 EGF 区 (氨基酸122-166)
SEQ ID NO:12 丝氨酸蛋白酶结构域 (氨基酸429 – 671)
SEQ ID NO:13 失活的丝氨酸蛋白酶结构域(氨基酸610-625，具有Ser618至Ala的突变)
SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL (CUBI肽)
SEQ ID NO:15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (CUBI肽)
SEQ ID NO:16 TFRSDYSN (MBL结合区核心)
SEQ ID NO:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (MBL结合区)
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG (EGF肽)
SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (丝氨酸蛋白酶结合核心)详述
肽抑制剂：
SEQ ID NO:20 MBL全长cDNA
SEQ ID NO:21 MBL全长蛋白
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP (共有结合)
SEQ ID NO:23 OGKLG
SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G
SEQ ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO
SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG
SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (人h-纤维胶凝蛋白)
SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (人纤维胶凝蛋白p35)
SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (C4裂解位点)
表达抑制剂：
SEQ ID NO:30 CUBI-EGF结构域的cDNA (SEQ ID NO:4的核苷酸22-680)
SEQ ID NO:31
5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'
SEQ ID NO:4的核苷酸12-45，包括MASP-2翻译起始位点(有义链)
SEQ ID NO:32
5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'
编码含有MASP-2 MBL结合位点的区域的SEQ ID NO:4的核苷酸361-396 (有义链)
SEQ ID NO:33
5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'
编码含有CUBII结构域的区域的SEQ ID NO:4的核苷酸610-642
克隆引物：
SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (用于CUB的5' PCR)
SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (用于CUB的3' PCR)
SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (用于CUBIEGF的3' PCR)
SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (用于CUBIEGFCUBII的3' PCR)
SEQ ID NOS:38-47是人源化抗体的克隆引物
SEQ ID NO:48是9个氨基酸的肽键
表达载体：
SEQ ID NO:49是MASP-2小基因插入序列
SEQ ID NO:50是鼠MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:51是鼠MASP-2蛋白(w/前导序列)
SEQ ID NO:52是成熟鼠MASP-2蛋白
SEQ ID NO:53是大鼠MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:54是大鼠MASP-2蛋白(w/前导序列)
SEQ ID NO:55是成熟大鼠MASP-2蛋白
SEQ ID NO:56-59是用于人MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，所述人MASP-2用来产生人MASP-2A
SEQ ID NO:60-63是用于鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，所述鼠MASP-2用来产生鼠MASP-2A
SEQ ID NO:64-65是用于大鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，所述大鼠MASP-2用来产生大鼠MASP-2A
SEQ ID NO: 66 编码17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH) (无信号肽)的DNA
SEQ ID NO: 67 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO: 68 17N16mc重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO: 70 编码17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)轻链可变区(VL)的DNA
SEQ ID NO: 69 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO: 71 17N16_dc17N9轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:72: SGMI-2L(全长)
SEQ ID NO: 73: SGMI-2M (中等截短形式)
SEQ ID NO:74: SGMI-2S (短截短形式)
SEQ ID NO:75: 包含VH-M2ab6-SGMI-2-N和人IgG4恒定区的成熟多肽，具有铰链突变
SEQ ID NO:76: 包含VH-M2ab6-SGMI-2-C和人IgG4恒定区的成熟多肽，具有铰链突变
SEQ ID NO:77: 包含VL-M2ab6-SGMI-2-N和人Ig λ恒定区的成熟多肽
SEQ ID NO:78: 包含VL-M2ab6-SGMI-2-C和人Ig λ恒定区的成熟多肽
SEQ ID NO:79: 肽接头(10aa)
SEQ ID NO:80: 肽接头(6aa)
SEQ ID NO:81: 肽接头(4aa)
SEQ ID NO:82: 编码包含VH-M2ab6-SGMI-2-N和人IgG4恒定区的具有铰链突变的多肽的多核苷酸
SEQ ID NO:83: 编码包含VH-M2ab 6-SGMI-2-C和人IgG4恒定区的具有铰链突变的多肽的多核苷酸
SEQ ID NO:84: 编码包含VL-M2ab6-SGMI-2-N和人Ig λ恒定区的多肽的多核苷酸
SEQ ID NO:85: 编码包含VL-M2ab6-SGMI-2-C和人Ig λ恒定区的多肽的多核苷酸
详细描述
本发明基于本发明人的令人惊讶的发现，即，抑制甘露聚糖结合的凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2 (MASP-2) (补体系统的凝集素途径的关键调节剂)在各种纤维化疾病动物模型(包括肾纤维化的单侧输尿管梗阻(UUO)模型、蛋白过载模型和阿霉素诱导的肾脏病学模型)中显著减轻炎症和纤维化。因此，本发明人已证实，抑制MASP-2介导的凝集素途径活化提供改善、治疗或预防肾纤维化、例如小管间质性炎症和纤维化的有效治疗方法，而不管根本原因如何。如本文进一步描述的，MASP-2抑制性抗体(OMS646)的使用在患有免疫球蛋白A肾病(IgAN)和膜性肾病(MN)的人受试者中有效改进肾功能和减少皮质类固醇需求。
I. 定义
除非本文明确规定，否则本文使用的所有术语都具有如本发明领域的普通技术人员所理解的相同含义。为了明确用于本说明书和所附权利要求书中描述本发明的有关术语，提供下列定义。
本文所用术语“MASP-2依赖性补体活化”包括凝集素途径的MASP-2-依赖性活化，其发生在生理条件下(即，在Ca++存在的情况下)，导致形成凝集素途径C3转化酶C4b2a，和在C3裂解产物C3b聚集后，形成随后的C5转化酶C4b2a(C3b)n，所述C5转化酶C4b2a(C3b)n已经被确定为主要引起调理作用。
本文所用术语“替代途径”是指例如由酵母聚糖触发的补体活化，所述酵母聚糖来自真菌和酵母细胞壁、革兰氏阴性外膜的脂多糖(LPS)和兔红细胞以及来自多种纯的多糖、兔红细胞、病毒、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞，其在传统上一直认为是由来自补体因子C3自发水解产生C3b而引起的。
本文所用术语“凝集素途径”是指通过血清和非血清碳水化合物结合蛋白(包括甘露聚糖结合凝集素(MBL)、CL-11和纤维胶凝蛋白(H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)的特异性结合而发生的补体活化。
本文所用术语“经典途径”是指由抗体与外源颗粒结合而触发的并且需要结合识别分子C1q的补体活化。
本文所用术语“MASP-2抑制剂”是指与MASP-2结合或直接与MASP-2相互作用并有效抑制MASP-2依赖性补体活化的任何试剂，包括抗MASP-2抗体及其MASP-2结合片段、天然和合成肽、小分子、可溶性MASP-2受体、表达抑制剂和分离的天然抑制剂，还包括在凝集素途径中为结合其它识别分子(例如MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)而与MASP-2竞争的肽，但是不包括与这些其它的识别分子结合的抗体。用于本发明方法的MASP-2抑制剂可使MASP-2依赖性补体活化降低大于20%，诸如大于50%，诸如大于90%。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂使MASP-2依赖性补体活化降低大于90%(即导致仅仅10%或更低的MASP-2补体活化)。
本文使用的术语“纤维化”是指在器官或组织中过度结缔组织的形成或存在。纤维化可作为对刺激例如组织损伤或炎症的修复或替换反应而发生。纤维化的标志是过度细胞外基质的产生。对损伤的正常生理反应导致作为愈合过程的一部分的结缔组织沉积，但这种结缔组织沉积可持续和变成病态，改变组织的结构和功能。在细胞水平上，上皮细胞和成纤维细胞增殖和分化成成肌纤维细胞，导致基质收缩、刚性增加、微血管压迫和缺氧。
本文使用的术语"治疗患有或有风险发生由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的哺乳动物受试者的纤维化"是指逆转、减轻、改善或抑制所述哺乳动物受试者的纤维化。
本文使用的术语“蛋白尿”是指存在异常量的尿蛋白，例如在从人受试者收集的24小时尿液中超过0.3g蛋白的量，或在人受试者中超过1g/升的浓度。
本文使用的术语“改善蛋白尿”或“减少蛋白尿”是指与用MASP-2抑制剂治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比，减少患有蛋白尿的受试者的24小时尿蛋白分泌达至少20%、例如至少30%、例如至少40%、例如至少50%或更多。在一个实施方案中，根据本发明的方法用MASP-2抑制剂治疗有效减少人受试者的蛋白尿，例如以实现24小时尿蛋白分泌超过20%减少，或者例如24小时尿蛋白分泌超过30%减少，或者例如24小时尿蛋白分泌超过40%减少，或者例如24小时尿蛋白分泌超过50%减少。
本文所用术语“抗体”包括衍生自产生抗体的任何哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔和包括人在内的灵长类动物)，或衍生自杂交瘤、噬菌体选择、重组表达或转基因动物(或产生抗体或抗体片段的其它方法)并与目标多肽诸如例如MASP-2多肽或其部分特异性结合的抗体及其抗体片段。并不意在关于抗体的来源或其制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物、肽合成等)对术语“抗体”进行限定。示例性的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体；全特异性(pan-specific)、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合的、小鼠−人、小鼠−灵长类、灵长类−人单克隆抗体；和抗独特型抗体，且可以是任何完整的抗体或其片段。本文所用术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(诸如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)，单链(ScFv)，其合成变体，天然存在的变体，包含抗体部分与具有所需特异性的抗原结合片段的融合蛋白，人源化抗体，嵌合抗体，和包含具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰后的构型。
“单克隆抗体”是指均质抗体群体，其中所述单克隆抗体是由参与选择性结合表位的氨基酸(天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸)构成的。单克隆抗体对于目标抗原是高度特异性的。术语“单克隆抗体”不仅包括完整单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且包括其片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)，单链(ScFv)，其变体，包含抗原结合部分的融合蛋白，人源化单克隆抗体，嵌合单克隆抗体，和包含具有所需特异性和与表位结合能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。并不意在关于抗体的来源或其制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)进行限定。该术语包括“抗体”定义之下的上述完整免疫球蛋白以及片段等。
本文所用术语“抗体片段”是指得自或涉及全长抗体，诸如，例如抗MASP-2抗体的一部分，一般包括抗原结合区或其可变区。抗体片段的说明性实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文所用的“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链上。Fv多肽一般还包括VH与VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。
本文所用的“嵌合抗体”是含有得自非人物种(例如啮齿动物)抗体的可变结构域和互补决定区的重组蛋白，而抗体分子的其余部分来源于人抗体。
本文所用的“人源化抗体”是包含符合源自非人免疫球蛋白的特异性互补决定区的最小序列的嵌合抗体，该特异性互补决定区被植入人抗体构架中。人源化抗体通常是其中只有抗体互补决定区是非人来源的重组蛋白。
本文所用术语“甘露聚糖结合凝集素”(“MBL”)等同于甘露聚糖结合蛋白(“MBP”)。
本文所用的“膜攻击复合物”(“MAC”)是指插入并破坏膜的5种末端补体组分(C5b组合C6、C7、C8和C-9)的复合物(也称为C5b-9)。
本文所用的“受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、狗、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿动物。
本文所用的氨基酸残基的缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷胺酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和丙氨酸(Val；V)。
从最广意义上看，天然存在的氨基酸可根据各个氨基酸侧链的化学特性来分组。“疏水”氨基酸是指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro。“亲水”氨基酸是指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。氨基酸的这种分组可进一步细分如下。“不带电荷的亲水”氨基酸是指Ser、Thr、Asn或者Gln。“酸性”氨基酸是指Glu或Asp。“碱性”氨基酸是指Lys、Arg或者His。
本文所用术语“保守的氨基酸取代”通过下面每组中氨基酸之间的取代来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷胺酰胺和天冬酰胺；和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
本文所用术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体。该术语还涵盖由天然存在的核苷酸、糖和核苷间(骨架)共价键以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸所组成的那些寡核碱基。
本文所用的“表位”是指由抗体结合的蛋白(例如，人MASP-2蛋白)上的位点。“重叠表位”包括至少一个(例如，二、三、四、五、或六个)共同的氨基酸残基，包括线性和非线性表位。
本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可以互换使用，并且是指氨基酸的任何肽连接链，无论长度或翻译后修饰。本文所述的MASP-2蛋白可以含有或可以是野生型蛋白，或者可以是具有不超过50个(例如，不超过一、两、三、四、五、六、七、八、九、十、12、15、20、25、30、35、40、或50个)保守氨基酸取代的变体。保守取代通常包括下列组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。
在一些实施方案中，人MASP-2蛋白的氨基酸序列可以与具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的人MASP-2蛋白是或大于70 (例如，71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)％相同。
在一些实施方案中，肽片段可以是至少6个(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500或600或更多个)氨基酸残基长度(例如，SEQ ID NO:5的至少6个连续氨基酸残基)。在一些实施方案中，人MASP-2蛋白的抗原肽片段是少于500个(例如少于450、400、350、325、300、275、250、225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个)氨基酸残基的长度(例如，SEQ ID NOS: 5的任一个中的少于500个连续氨基酸残基)。
百分比(％)氨基酸序列同一性定义为在比对序列和引入缺口之后，候选序列中，如果需要，达到最大百分比序列同一性的与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。用于确定百分比序列同一性的目的的比对可以以本领域技术内的各种方式，例如，使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或Megalign (DNASTAR)软件来实现。用于测量比对的适当参数，包括实现待比较序列全长内的最大比对所需的任何算法可以通过已知方法来确定。
II. 发明综述
如本文所述，本发明人已鉴定了凝集素途径在肾小管病理的起始和疾病进展中的中心作用，从而暗示凝集素途径活化在各种肾疾病，包括IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎(glomerulonephritide)的病理生理学中的关键作用。如本文进一步描述的，本发明人发现抑制甘露聚糖结合的凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2 (MASP-2) (补体系统的凝集素途径的重要调节剂)在各种纤维化疾病动物模型(包括肾纤维化的单侧输尿管梗阻(UUO)模型、蛋白过载模型和阿霉素诱导的肾脏病学模型)中显著减少炎症和纤维化。因此，本发明人已证实，抑制MASP-2介导的凝集素途径活化提供改善、治疗或预防肾纤维化、例如小管间质性纤维化的有效治疗方法，而不管根本原因如何。
凝集素(MBP、M-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白和CL-11)是引发先天性补体系统的特异性识别分子，该系统包括凝集素起始途径和放大末端补体效应分子的凝集素起始的活化的相关末端途径放大环路。C1q是引发获得性补体系统的特异性识别分子，该系统包括经典起始途径和放大末端补体效应分子的C1q起始的活化的相关末端途径放大环路。我们将这两个主要的补体活化系统分别称为凝集素依赖性补体系统和C1q依赖性补体系统。
除了在免疫防御中的基本作用外，补体系统是造成许多临床疾病的组织损伤的原因。因此，迫切需要开发治疗上有效的补体抑制剂以抑制这些副作用。如果认识到其可能抑制凝集素介导的MASP-2途径而使经典途径完整，则就能够理解我们非常需要的是仅仅特异性抑制引起特定病理的补体活化系统而又不完全停止补体的免疫防御能力。例如，在其中补体活化主要由凝集素依赖性补体系统介导的疾病状态中，仅特异性抑制该系统将是有利的。这将保持C1q依赖性补体活化系统的完整性以处理免疫复合物加工以及帮助宿主防御感染。
在特异性抑制凝集素依赖性补体系统的治疗药物的研发中，优选的作为靶标的蛋白成分是MASP-2。在凝集素依赖性补体系统的所有已知的蛋白成分(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白、MASP-2、C2-C9、因子B、因子D和备解素)中，只有MASP-2是凝集素依赖性补体系统所独有并且是这个系统起作用所必需的。凝集素(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和CL-11)也是凝集素依赖性补体系统中独有的成分。然而，这些凝集素成分任一种的丧失并不一定抑制系统活化，这是由于凝集素冗余所致。为了保证抑制凝集素依赖性补体活化系统，抑制所有5种凝集素可能是必要的。此外，由于还已知MBL和纤维胶凝蛋白具有不依赖于补体的调理活性，因此抑制凝集素功能将导致丧失这种有利的抗感染的宿主防御机制。相反，如果MASP-2是抑制靶标的话，这种不依赖于补体的凝集素调理活性会保持完整。MASP-2作为抑制凝集素依赖性补体活化系统的治疗靶的额外好处是，MASP-2的血浆浓度是所有补体蛋白中最低的(约500 ng/ml)；因此，为得到完全抑制可能要足够的相对低浓度的高亲和力MASP-2抑制剂(Moller-Kristensen, M.,等人, J. Immunol Methods 282:159-167, 2003)。
如本文实施例14所述，在纤维化肾疾病的动物模型(单侧输尿管梗阻UUO)中确定了与野生型对照动物相比，没有MASP-2基因(MASP-2-/-)的小鼠显示显著更少的肾疾病，如通过炎性细胞浸润(75%减少)和纤维化的组织学标志物例如胶原沉积(1/3减少)显示的。如实施例15进一步显示的，与用同种型对照抗体治疗的野生型小鼠相比，用选择性地阻断凝集素途径同时保留经典途径完整的抗-MASP-2单克隆抗体全身性治疗的野生型小鼠被保护免于肾纤维化。这些结果证实，凝集素途径是肾疾病的关键贡献因素，并进一步证实阻断凝集素途径的MASP-2抑制剂、例如MASP-2抗体，作为抗纤维化剂是有效的。如实施例16进一步显示的，在蛋白过载模型中用牛血清白蛋白(BSA)处理的野生型小鼠发生蛋白尿肾病，而用相同水平的BSA处理的MASP-2-/-小鼠具有减少的肾损伤。如实施例17所示的，在蛋白过载模型中用选择性地阻断凝集素途径同时保留经典途径完整的抗-MASP-2单克隆抗体全身性治疗的野生型小鼠被保护免于肾损伤。如实施例18所述，与野生型小鼠相比在阿霉素诱导的肾纤维化肾脏病学模型中MASP-2-/-小鼠显示较少的肾炎症和小管间质性损伤。如实施例19所述的，在进行的2期开放标签肾试验中，用抗-MASP-2抗体治疗的具有IgA肾病的患者显示在整个试验中尿液白蛋白:肌酸酐比率(uACR)的临床上有意义的和统计学显著的减少，和24小时尿蛋白水平从基线至治疗结束的减少。如实施例19进一步描述的，在相同的2期肾试验中，用抗-MASP-2抗体治疗的具有膜性肾病的患者也显示在治疗期间uACR减少。
根据前述内容，本发明涉及MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体作为抗纤维化剂的用途，MASP-2抑制剂用于制备治疗纤维化病况的药物的用途，和预防、治疗、减轻或逆转有需要的人受试者的纤维化病况的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的MASP-2抑制剂(例如，抗-MASP-2抗体)。
本发明的方法可用于预防、治疗、减轻或逆转患有由纤维化和/或炎症引起或加重的任何疾病或病症的人受试者的纤维化病况，包括肾(例如，慢性肾疾病、IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎)、肺(例如，特发性肺纤维化、囊性纤维化、支气管扩张)、肝(例如，肝硬化、非酒精性脂肪性肝病)、心脏(例如，心肌梗塞、心房纤维化、瓣膜纤维化、心内膜心肌纤维化)、脑(例如，中风)、皮肤(例如，过度伤口愈合、硬皮病、全身性硬化、瘢痕瘤)、血管(例如，动脉粥样硬化性血管疾病)、肠(例如，克罗恩病)、眼(例如，前囊下白内障、后囊乳浊)、肌肉骨骼的软组织结构(例如，粘连性囊炎、杜普伊特伦氏挛缩、骨髓纤维化)、生殖器官(例如，子宫内膜异位、佩伦涅氏病)的疾病，和一些感染性疾病(例如，α病毒、丙型肝炎和乙型肝炎)。
III.MASP-2在由纤维化引起或加重的疾病和病况中的作用
纤维化是在器官或组织中形成或存在过度结缔组织，通常响应于损伤或损害。纤维化的标志是损伤后产生过度细胞外基质。在肾中，纤维化的特征为在肾实质上进行性有害结缔组织沉积，其不可避免地导致肾功能下降，独立于引起初始肾损伤的原发性肾疾病。所谓的上皮至间质转变(EMT) (细胞特征的一种变化)，其中小管上皮细胞转化为间质成纤维细胞，构成肾纤维化的主要机制。纤维化影响几乎所有组织和器官系统，和可作为对刺激例如组织损伤或炎症的修复或替换反应而发生。对损伤的正常生理反应导致结缔组织的沉积，但如果该反应变成病态，瘢痕形成结缔组织替换高度分化细胞改变组织的结构和功能。在细胞水平上，上皮细胞和成纤维细胞增殖和分化成成肌纤维细胞，导致基质收缩、刚性增加、微血管压迫和缺氧。目前对于纤维化没有有效的疗法或治疗剂，但动物研究和实录性的人报告表明，纤维化组织损伤可逆转(Tampe和Zeisberg，Nat Rev Nephrol，Vol 10:226-237，2014)。
许多疾病导致纤维化，其引起进行性器官衰竭，包括肾(例如，慢性肾疾病、IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎)、肺(例如，特发性肺纤维化、囊性纤维化、支气管扩张)、肝(例如，肝硬化、非酒精性脂肪性肝病)、心脏(例如，心肌梗塞、心房纤维化、瓣膜纤维化、心内膜心肌纤维化)、脑(例如，中风)、皮肤(例如，过度伤口愈合、硬皮病、全身性硬化、瘢痕瘤)、血管(例如，动脉粥样硬化性血管疾病)、肠(例如，克罗恩病)、眼(例如，前囊下白内障、后囊乳浊)、肌肉骨骼的软组织结构(例如，粘连性囊炎、杜普伊特伦氏挛缩、骨髓纤维化)、生殖器官(例如，子宫内膜异位、佩伦涅氏病)的疾病，和一些感染性疾病(例如，α病毒、丙型肝炎、乙型肝炎等)。
当纤维化在许多组织和疾病中发生时，对其病理存在共同的分子和细胞机制。通过成纤维细胞的细胞外基质沉积伴随免疫细胞浸润，主要是单核细胞(参见Wynn T.，Nat Rev Immunol 4(8):583-594，2004，通过引用并入本文)。稳健的炎性反应导致生长因子(TGF-β、VEGF、肝细胞生长因子、结缔组织生长因子)、细胞因子和激素(内皮素、IL-4、IL-6、IL-13、趋化因子)、降解酶(弹性酶、基质金属蛋白酶、组织蛋白酶)和细胞外基质蛋白(胶原、纤连蛋白、整联蛋白)的表达。
此外，补体系统在许多纤维化疾病中被激活。补体组分，包括膜攻击复合物，已在许多纤维化组织样本中鉴定。例如，凝集素途径的组分已在肾疾病(Satomura等人，Nephron. 92(3):702-4 (2002); Sato等人，Lupus 20(13):1378-86 (2011); Liu等人，Clin Exp Immunol，174(1):152-60 (2013))；肝疾病(Rensen等人，Hepatology 50(6):1809-17 (2009))；和肺疾病(Olesen等人，Clin Immunol 121(3):324-31 (2006))的纤维化损伤中发现。
已确定过度(overshooting)补体活化为免疫复合物介导的以及抗体非依赖性肾小球肾炎的关键贡献因素。然而，强的证据线索证实，在非肾小球疾病中不受控制的补体活化原位固有地参与TI纤维化的病理生理学进展(Quigg R.J，J Immunol 171:3319-3324，2003，Naik A.等人，Semin Nephrol 33:575-585，2013，Mathern D.R.等人，Clin J Am Soc Nephrol 10:P1636-1650，2015)。通过局部补体活化触发的强的促炎性信号可通过过滤进入近端小管和随后进入间质间隙的补体组分，或通过小管或其它居留细胞和浸润细胞的补体组分的异常合成，或通过肾细胞上补体调节蛋白的表达改变，或在补体调节组分中功能突变的缺少或损失或获得而启动(Mathern D.R.等人，Clin J Am Soc Nephrol 10:P1636-1650，2015，Sheerin N.S.等人，FASEB J 22: 1065-1072、2008)。例如在小鼠中，补体调节蛋白CR1相关基因/蛋白y (Crry)的缺陷导致小管间质性(TI)补体活化，其中在人TI疾病中见到损伤典型的随后炎症和纤维化(Naik A.等人，Semin Nephrol 33:575-585，2013，BaoL.等人，J Am Soc Nephrol 18:811-822，2007)。小管上皮细胞暴露于过敏毒素C3a导致上皮至间质转变(Tsang Z.等人，J Am Soc Nephrol 20:593-603，2009)。最近表明，通过单独C3a受体阻断C3a信号转导在蛋白尿和非蛋白尿动物中减轻肾TI纤维化(Tsang Z.等人，J Am Soc Nephrol 20:593-603，2009，Bao L.等人，Kidney Int. 80: 524-534，2011)。
如本文所述，本发明人已鉴定了凝集素途径在肾小管病理的启动和疾病进展中的中心作用，从而暗示凝集素途径活化在各种肾疾病包括IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎(Endo M.等人，Nephrol Dialysis Transplant 13: 1984-1990，1998; Hisano S.等人，Am J Kidney Dis 45:295-302，2005; Roos A.等人，J Am Soc Nephrol 17: 1724-1734，2006; Liu L.L.等人，Clin Exp. Immunol 174:152-160，2013; Lhotta K.等人，Nephrol Dialysis Transplant 14:881-886，1999; Pickering等人，Kidney International 84:1079-1089，2013)、糖尿病肾病(Hovind P.等人，Diabetes 54:1523-1527，2005)、缺血再灌注损伤(Asgari E.等人，FASEB J 28:3996-4003，2014)和移植排斥(Berger S.P.等人，Am J Transplant 5:1361-1366，2005)的病理生理学中的关键作用。
如本文进一步描述的，本发明人已证实在小管间质性疾病的小鼠模型中MASP-2抑制减少炎症和纤维化。因此，预期MASP-2抑制剂可用于治疗肾纤维化，包括小管间质性炎症和纤维化、蛋白尿、IgA肾病、C3肾小球病和其它肾小球肾炎和肾缺血再灌注损伤。
肾疾病和病症
根据National Kidney Foundation，2.6千万美国成年人患有慢性肾疾病(CKD)。大多数患者具有导致肾衰竭的进行性疾病，为了存活需要用红细胞生成刺激药物、透析或肾移植治疗。存在若干药物，其可治疗CKD的主要症状高血压，但目前没有解决其根本原因的药物。
研究表明，进行性肾损伤由肾的亚结构(称为肾单位)中的毛细管高血压引起(Whitworth J.A.，Annals Acad of Med，vol 34(1):2005)。因为肾单位(肾的过滤单位)在该过程中受损或被破坏，炎症和组织瘢痕形成发生，用无功能的瘢痕组织替换肾单位。结果是，肾过滤血液的能力随时间下降。这被称为肾纤维化，其是进行性肾疾病的共同途径。不管初始损害的性质如何，认为肾纤维化是肾疾病进展至晚期肾衰竭的共同最终途径。肾纤维化的改善可通过以下一项或多项确定：评估间隙体积、胶原IV沉积和/或结缔组织生长mRNA水平。本文所述的化合物和方法可用于治疗肾纤维化。
肾纤维化和炎症是几乎任何病因的晚期肾疾病的主要特征(参见Boor等人，BoorP.等人，J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515，2007和Chevalier等人，Kidney International 75:1145-1152，2009)。肾衰竭可由一组异源病症引起。进行性肾功能障碍导致蛋白尿和肾机能不全。随着患者健康恶化，透析可仅对防止肾损伤和预防多系统衰竭是必需的。肾衰竭和肾机能不全可随时间进展至晚期肾疾病(ESRD)，其是完全或几乎完全的肾功能永久丧失。根据肾疾病的形式，肾功能可在大约数天或数周内丧失，或可在几十年期间缓慢和逐渐恶化。一旦患者进展至ESRD，需要透析(半透析或腹膜透析)以防止死亡。患者必须保持某一形式的透析方案，或必须获得肾移植。
在肾疾病的纤维化病变中已发现凝集素途径的组分(Satomura等人，Nephron. 92(3):702-4 (2002); Sato等人，Lupus 20(13):1378-86 (2011); Liu等人，Clin Exp Immunol，174(1):152-60 (2013))。在IgA肾病中，与没有MBL沉积的患者相比，具有肾小球MBL沉积的患者具有更严重的蛋白尿，肾功能减少、更低水平的血清白蛋白、更严重的组织学和更大高血压(Liu等人，Clin Exp Immunol. 2013 Oct;174(1):152-60)。具有狼疮性肾炎(Sato等人，Lupus，20(13):1378-86，2011)和慢性肾衰竭(Satomura等人，Nephron 92(3):702-4，2002)的患者还具有增加水平的MBL和凝集素途径活性。
还已证实，在原发性小管间质性损伤的非蛋白尿模型(即单侧输尿管梗阻(UUO))中，C5缺陷导致肾纤维化的主要组分显著改善(Boor P.等人，J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515，2007)。还已报道，在UUO后在野生型小鼠中C3基因表达增加，和与野生型小鼠相比，在UUO后在C3-/-小鼠中胶原沉积显著减少，表明补体活化在肾纤维化中的作用(Fearn等人，Mol Immunol 48:1666-1733，2011: 摘要)。然而，在本文中通过本发明人描述的发现之前，参与肾纤维化的补体组分还未充分确定。如本文实施例14-17所述，本发明人出人意料地确定，MASP-2缺陷或MASP-2被选择性地阻断凝集素途径同时保留经典途径完整的抑制性抗体阻断，在肾疾病的各种动物模型中明确保护小鼠免于肾纤维化。
因此，在某些实施方案中，本公开内容提供抑制患有由纤维化和/或炎症引起或加重的肾疾病或病症的受试者的肾纤维化的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如抗-MASP-2抗体。该方法包括给予患有由纤维化和/或炎症引起或加重的肾疾病或病症的受试者包含有效抑制肾纤维化的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，直接或远端例如通过导管，通过局部施用组合物。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，或对于非肽能药剂可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生决定，直到病况已消退或得到控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，抗-MASP-2抗体)与适合于潜在的肾疾病或病况的一种或多种药剂或治疗方式组合给予。在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，抗-MASP-2抗体)与透析或血浆去除术方案组合给予。在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，抗-MASP-2抗体)用于减少需要透析或血浆去除术的频率。在某些其它实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，抗-MASP-2抗体)与肾移植组合使用。在某些其它实施方案中，在等待肾移植的患者中MASP-2抑制剂(例如，抗-MASP-2抗体)用于控制肾机能不全和预防肾功能进一步下降。
例如，在某些实施方案中，抗-MASP-2抗体用于抑制肾纤维化，从而治疗或改善肾小球疾病例如局灶性节段性肾小球硬化和肾病综合征(包括治疗或改善疾病的症状)。可治疗的示例性的症状包括但不限于高血压、蛋白尿、高脂血症、血尿和高胆固醇血症。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂抑制小管间质性纤维化。在某些实施方案中，治疗包括改善肾功能、降低蛋白尿、改善高血压和/或降低肾纤维化。在某些实施方案中，治疗包括(i) 延迟或预防进展至肾机能不全、肾衰竭或ESRD；(ii) 延迟、降低或预防对透析的需求；或(iii) 延迟或预防对肾移植的需求。
由纤维化和/或炎症引起或加重的某些特定的肾疾病和病症描述于下文。
在某些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的肾疾病是肾小球疾病例如局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)。肾小球疾病损害肾小球，使蛋白和有时红细胞泄露至尿中。有时，肾小球疾病还干扰通过肾的废物清除率，因此它们开始在血液中积累。肾小球疾病的症状包括蛋白尿、血尿、肾小球滤过率减少、低蛋白质血症和水肿。许多不同的疾病可导致肾小球疾病。它可能是感染或对肾有毒的药物的直接结果，或者它可由影响整个身体的疾病导致，例如高血压、糖尿病或狼疮。FSGS是一种特定的肾小球疾病，但甚至这种特征为肾中瘢痕形成的特定病况也可具有许多原因。FSGS患者通常在5-20年内进展至晚期肾疾病，但具有侵袭形式的疾病的患者在2-3年内进展至ESRD。
在某些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的肾疾病是糖尿病肾病(DN)，其是显著未满足的医学需求领域。糖尿病肾病是作为糖尿病的并发症产生的肾疾病或损伤。该病况被高血压、高血糖水平和高胆固醇和脂质水平加重。糖尿病肾病的准确原因是未知的。然而，不受理论的约束，认为不受控制的高血糖导致发生肾损伤、例如组织的纤维化和瘢痕形成。在人中，DN表现为由白蛋白尿、逐渐下降的肾小球滤过率(GFR)和心血管疾病的风险增加构成的临床综合征。糖尿病白蛋白尿与发生特征性组织病理学特征有关，包括肾小球基底膜(GBM)增厚和肾小球系膜膨胀。随着白蛋白尿进展和肾机能不全跟着发生，肾小球硬化症、微动脉透明性变和小管间质性纤维化发生。
因此，在一个实施方案中，本公开内容提供用于治疗糖尿病肾病的方法，包括给予有需要的受试者有效量的MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)。在某些实施方案中，治疗包括减轻糖尿病肾病的一个或多个症状。在某些实施方案中，治疗包括减轻、延迟或消除透析需要。在某些实施方案中，治疗包括减轻、延迟或消除肾移植需要。在某些实施方案中，治疗包括延迟、预防或逆转糖尿病肾病进展至肾衰竭或晚期肾疾病。
在某些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的肾疾病是狼疮性肾炎。如下文更详细描述的，狼疮性肾炎，其是系统性红斑狼疮(SLE)的严重并发症，是可用MASP-2抑制剂(例如，抗-MASP-2抗体)治疗的肾纤维化的另一个实例。
因此，在一个实施方案中，本公开内容提供用于抑制患有由纤维化和/或炎症引起或加重的肾疾病或病症的受试者的肾纤维化的方法，包括给予有效量的MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)。在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症加重的肾疾病或病症选自慢性肾疾病、慢性肾衰竭、肾小球疾病(例如，局灶性节段性肾小球硬化)、免疫复合病症(例如，IgA肾病、膜性肾病)、狼疮性肾炎、肾病综合征、糖尿病肾病、小管间质性损伤和C3肾小球病或其它类型的肾小球性肾炎。
预防或治疗由药物诱导的毒性引起的肾损伤的方法
肾损伤的另一个原因包括药物诱导的毒性。例如，肾毒素可对小管上皮细胞引起直接毒性。如本文所述，本发明人已证实，MASP-2缺陷小鼠受到保护免于阿霉素诱导的肾病。
肾毒素包括但不限于治疗药物(例如，顺铂、庆大霉素、头孢噻啶、环孢菌素、两性霉素、阿霉素)、放射性对比染料、杀虫剂(例如，百草枯)和环境污染物(例如，三氯乙烯和二氯乙炔)。其它实例包括氨基核苷嘌呤霉素(PAN)；氨基葡糖苷例如庆大霉素；头孢菌素例如头孢噻啶；神经钙蛋白抑制剂例如他克莫司或西罗莫司。药物诱导的肾毒性也可由非甾体抗炎药、抗逆转录病毒剂、抗-细胞因子、免疫抑制剂、肿瘤学药物或ACE抑制剂引起。药物诱导的肾毒性可进一步由非诺洛芬滥用、环丙沙星、氯吡格雷、可卡因、cox-2抑制剂、利尿药、膦甲酸、金、异环磷酰胺、免疫球蛋白、中国草药、干扰素、锂、甘露醇、美沙拉秦、丝裂霉素、亚硝基脲、青霉胺、青霉素、喷他脒、奎宁、利福平、链佐星、磺胺、噻氯匹定、氨苯蝶啶、丙戊酸、多柔比星、甘油、西多福韦、妥布霉素、硫酸新霉素、磺粘菌素、万古霉素、阿米卡星、头孢噻肟、顺铂、阿昔洛维、锂、白细胞介素-2、环孢菌素或印地那韦引起。
因此，在一个实施方案中，有风险发生或患有肾损伤的受试者可能接受一种或多种具有肾毒性作用的治疗药物。这些受试者可在所述治疗剂之前或与其同时给予本发明的MASP-2抑制剂。同样，MASP-2抑制剂可在治疗剂之后给予以治疗或减少发生肾毒性的可能性。
与蛋白尿相关的疾病和病况
已确定，蛋白的肾小球过滤受损导致蛋白尿和加速肾单位的进行性损失，其发生在所有慢性肾疾病中(Remuzzi和Bertani，New Eng. J Med vol 339 (20):1448-1456，1998)。例如，在Eddy等人，Am J Pathol 135:719-33，1989中描述的研究中，白蛋白的肾小球过滤之后总是发生间质性损伤和瘢痕形成。如在Eddy等人，1989中进一步描述的，在具有由蛋白-过载引起的肾病的大鼠中观察到补体C3在近端小管的腔表面上沉积，表明被肾小球过滤的补体系统组分可引起间质性损伤。已经证实，补体耗尽或缺乏C6改善蛋白尿动物模型中的小管间质性损伤，例如系膜增殖性肾小球肾炎、阿霉素肾病、5/6肾切除术和氨基核苷嘌呤霉素肾病(Boor等人，J of Am Soc of Nephrology: JASN 18:1508-1515，2007)。人类研究表明，蛋白尿是慢性肾疾病进展的独立预测物和蛋白尿减少是肾保护性的(Ruggenenti P.等人，J Am Soc Nephrol 23:1917-1928，2012)。
因此，在一个实施方案中，本公开内容提供在患有与蛋白尿有关的疾病或病况的受试者中预防或减轻蛋白尿和/或预防或减轻肾损伤的方法，包括给予有效减少或预防受试者的蛋白尿的量的MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)。在一些实施方案中，与蛋白尿有关的疾病或病况选自肾病综合征、先兆子痫、子痫、肾的中毒性损害、淀粉样变、胶原血管疾病(例如，系统性红斑狼疮)、脱水、肾小球疾病(例如，膜性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎、微小病变疾病、脂性肾病)、大强度运动、应激、良性直立位(体位)蛋白尿、局灶性节段性肾小球硬化、IgA肾病(即，贝格尔氏病)、IgM肾病、膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾病、微小病变疾病、结节病、阿尔波特氏综合征、糖尿病(糖尿病肾病)、药物诱导的毒性(例如，NSAIDS、尼古丁、青霉胺、碳酸锂、金和其它重金属、ACE抑制剂、抗生素或阿片制剂(例如，海洛英))；法布里氏病、感染(例如，HIV、梅毒、甲、乙或丙型肝炎、链球菌后感染、尿路血吸虫病)；氨基酸尿症、范科尼综合征、高血压肾硬化、间质性肾炎、镰状细胞病、血红蛋白尿、多发性骨髓瘤、肌红蛋白尿、器官排斥(例如，肾移植排斥)、埃博拉出血热、甲髌综合征、家族性地中海热、HELLP综合征、系统性红斑狼疮、韦格纳氏肉芽肿病、类风湿性关节炎、糖原贮积病1型、古德帕斯彻氏综合征、过敏性紫癜、已扩散到肾的尿路感染、斯耶格伦氏综合征和感染后肾小球性肾炎。
肝脏疾病
肝脏纤维化，亦称为肝纤维化，由瘢痕组织在肝脏中积聚引起，并且是大多数类型的肝脏疾病的特征。健康肝脏组织被瘢痕组织置换损害肝脏正确发挥功能的能力。如果引起瘢痕形成的病况未被治疗，肝脏纤维化可发展为肝硬化和完全肝衰竭，一种威胁生命的病况。肝脏纤维化的主要原因是酒精滥用、慢性丙型肝炎病毒感染、非酒精性脂肪性肝炎和肝毒性(例如，由对乙酰氨基酚或其它药物引起的药物诱导的肝损伤)。
在肝脏疾病的纤维化损伤中已经发现凝集素途径的组分(Rensen等人，Hepatology 50(6): 1809-17 (2009))。例如，在非酒精性脂肪性肝炎(亦称为脂肪肝病)中，存在补体系统蛋白的普遍活化，并且其表达与疾病严重性有关(Rensen等人，Hepatology 50(6): 1809-17 (2009)，其中除了C3和C9沉积之外，还发现MBL积聚，证实了凝集素途径的活化。
因此，在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的肝脏疾病或病症的受试者中抑制肝纤维化的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予患有由纤维化和/或炎症引起或加重的肝脏疾病或病症的受试者包含有效抑制肝纤维化的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，直接或远端(例如通过导管)通过局部施用组合物。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，或对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的肝脏疾病或病况的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的肝脏疾病或病症选自：肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(脂肪性肝炎)、继发于酒精滥用的肝脏纤维化、继发于急性或慢性肝炎的肝脏纤维化、胆疾病和毒性肝损伤(例如，由于对乙酰氨基酚或其它药物引起的药物诱导的肝损伤导致的肝毒性)。
肺疾病
肺纤维化是过度纤维结缔组织在肺中的形成或发展，其中正常的肺组织被纤维化组织置换。这种瘢痕形成导致肺僵硬以及肺结构和功能受损。在人中，肺纤维化被认为由在肺的微小气囊(肺胞)内和之间的重复组织损伤引起。在实验设置下，各种动物模型具有人疾病的重复方面。例如，外来试剂例如博来霉素、异硫氰酸荧光素、二氧化硅或石棉可灌输至动物的气管中(Gharaee-Kermani等人, Animal Models of Pulmonary Fibrosis. Methods Mol. Med., 2005, 117:251-259)。
因此，在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的肺疾病或病症的受试者中抑制肺纤维化的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制肺纤维化、减少肺纤维化和/或改善肺功能的量的MASP-2抑制剂的组合物。肺功能的症状改善包括肺功能和/或肺活量改善、减少疲劳和氧饱和度改善。
在一些实施方案中，本公开内容提供在患有囊性纤维化的受试者中治疗、抑制、预防或改善肺纤维化的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，直接或远端(例如通过导管)通过局部施用组合物。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，或对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的肺疾病或病况的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
由纤维化和/或炎症引起或加重的某些具体的肺疾病和病症在下文描述。
在某些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的肺疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)。COPD是一种其中气道壁以成肌纤维细胞和胶原的积聚而纤维化的疾病，是失能的主要原因，并且在美国它是第四大死亡原因。COPD阻断空气流动和使患者呼吸逐渐困难。COPD由对气道的损伤引起，其最终干扰在肺中氧气和二氧化碳交换。COPD包括慢性阻塞性支气管炎和肺气肿，和通常二者均有。肺已经损伤和肺功能已被损害的COPD患者处于与细菌和病毒感染有关的并发症的增加风险中。
因此，在一个实施方案中，本公开内容提供治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)的方法，包括给予有需要的受试者有效抑制和/或减少肺纤维化的量的MASP-2抑制剂(例如，抗-MASP-2抗体)。在某些实施方案中，治疗包括减少COPD的一种或多种症状。COPD和/或肺纤维化的症状包括但不限于带粘液的咳嗽、轻度活动可变得恶化的呼吸短促(呼吸困难)、疲劳、频繁呼吸道感染、喘鸣、胸部紧迫感、心跳不规律(心律失常)、需要呼吸机和氧气疗法、右侧心力衰竭或肺源性心脏病(由于慢性肺疾病导致的心脏肿胀和心力衰竭)、肺炎、气胸、严重体重减轻和营养不良。症状还包括肺功能降低，如使用一种或多种标准肺功能试验评价的。
在某些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的肺疾病是与硬皮病有关的肺纤维化。如下文更详细描述的，与硬皮病有关的肺纤维化是可用MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)治疗的肺纤维化的另一个实例。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的肺疾病或病症选自：慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、与硬皮病有关的肺纤维化、支气管扩张和肺动脉高压。
心脏和血管疾病
许多不同的心脏和血管病理由共同的纤维化过程引起。纤维化组织在心脏中过度沉积导致心脏病理，其中细胞外基质蛋白的过度产生改变心脏的结构、构造、形状和影响心脏的收缩功能(Khan和Sheppard，Immunology 118: 10-24，2006)。
研究表明纤维化可显著促进在缺血性、膨胀性和肥大性心肌病中的心脏功能障碍。例如，已经证实具有慢性心房颤动的患者发现与对照相比具有更高水平的心肌间质性纤维化(Khan和Sheppard，Immunology 118: 10-24，2006)。作为另一个实例，已经确定在美国，大多数致心律失常性右心室心肌病(ARVC)病例显示脂肪浸润和瘢痕形成(纤维脂肪性ARVC) (Burke等人，Circulation 97:1571-1580，1998)。在检查具有ARVC的人受试者的心室肌的组织病理特征的研究中，已经确定广泛纤维化存在于来自具有ARVC的儿科患者的活检样本中(Nishikawa T.等人，Cardiovascular Pathology vol 8 (4):185-189，1999)。
因此，在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的心脏或血管疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制心脏和/或血管纤维化和/或改善心脏和/或血管功能的量的MASP-2抑制剂的组合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供在患有瓣膜纤维化的受试者中治疗、抑制、预防或改善纤维化的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，直接或远端(例如通过导管)通过局部施用组合物。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的心脏疾病或血管疾病或病况的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的心脏或血管疾病或病症选自：心脏纤维化、心肌梗塞、心房纤维化、心内膜心肌纤维化致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、血管疾病、动脉粥样硬化性血管疾病、血管狭窄、再狭窄、血管炎、静脉炎、深部静脉血栓形成和腹主动脉瘤。
慢性感染性疾病
慢性感染性疾病，例如丙型肝炎和乙型肝炎引起组织炎症和纤维化，并且高凝集素途径活性可能是有害的。在这样的疾病中，MASP-2的抑制剂可能是有益的。例如，发现MBL和MASP-1水平是丙型肝炎病毒(HCV)感染的肝脏纤维化的严重性的重要预测物(Brown等人，Clin Exp Immunol. 147(1):90-8，2007; Saadanay等人，Arab J Gastroenterol. 12(2):68-73，2011; Saeed等人，Clin Exp Immunol. 174(2):265-73，2013)。MASP-1之前已表明是MASP-2和凝集素途径的有效激活剂(Megyeri等人，J Biol Chem. 29: 288(13):8922-34，2013)。甲病毒例如基孔肯雅病毒和罗斯河病毒诱导强的宿主炎性反应，导致关节炎和肌炎，并且该病理由MBL和凝集素途径介导(Gunn等人，PLoS Pathog. 8(3):e1002586，2012)。
因此，在某些实施方案中，本公开内容提供在患有或之前已患有引起炎症和/或纤维化的慢性感染性疾病的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，直接或远端(例如通过导管)通过局部施用组合物。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的慢性感染性疾病的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，引起炎症和/或纤维化的慢性感染性疾病选自：α病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、结核病、HIV和流感。
自身免疫性疾病
硬皮病是特征为纤维化、血管改变和自身抗体的慢性自身免疫性疾病。存在两种主要形式：限制性系统硬皮病和弥散性系统硬皮病。限制性系统硬皮病的皮肤症状影响手、臂和脸。具有此形式的硬皮病的患者通常具有一种或多种以下并发症：钙质沉着症、雷诺现象、食管功能障碍、指硬皮病和毛细管扩张。弥散性系统硬皮病发展快速，和影响大面积的皮肤和一种或多种内脏器官，通常是肾、食管、心脏和/或肺。
硬皮病影响所有器官中称为小动脉的小血管。首先，小动脉的内皮细胞以及平滑肌细胞经凋亡而逐渐减少。这些细胞被胶原和其它纤维材料置换。炎性细胞，特别是CD4+辅助T细胞，浸润小动脉，并引起进一步损伤。
硬皮病的皮肤表现可以是疼痛，可损害受影响区域的使用(例如，手、手指、脚趾、足等的使用)和可损害外貌。皮肤溃疡可发生，并且这样的溃疡可易于感染或甚至坏疽。溃疡的皮肤可能难以治愈或治愈缓慢。治愈皮肤溃疡的困难在具有循环受损的患者(例如具有雷诺现象的那些)中可能特别加重。在某些实施方案中，本公开内容的方法用于治疗硬皮病，例如硬皮病的皮肤症状。在某些实施方案中，治疗硬皮病包括治疗皮肤溃疡，例如手指溃疡。给予MASP-2抑制剂例如抗-MASP-2抗体可用于减少受影响组织和/或器官的硬皮病的纤维化和/或炎性症状。
除了皮肤症状/表现之外，硬皮病还可影响心脏、肾、肺、关节和消化道。在某些实施方案中，治疗硬皮病包括在任何一种或多种这些组织中治疗该疾病的症状，例如通过减少纤维化和/或炎性症状。肺问题是硬皮病的最严重的并发症之一，并且是与该疾病有关的大多数死亡率的原因。与硬皮病有关的两种主要的肺病况是肺纤维化和肺动脉高压。连累肺的患者可具有任一种或两种病况。与硬皮病有关的肺纤维化是可用MASP-2抑制剂治疗的肺纤维化的一个实例。涉及肺的硬皮病导致瘢痕形成(肺纤维化)。这样的肺纤维化在大约70%的硬皮病患者中发生，尽管其进展通常缓慢，和症状在患者中在严重性方面广泛变化。对于的确具有与肺纤维化有关的症状的患者，症状包括干咳、呼吸短促和运动能力减少。约16%的具有一定水平的肺纤维化的患者发生严重肺纤维化。具有严重肺纤维化的患者经历肺功能的明显下降和肺泡炎。
在某些实施方案中，本公开内容的方法用于治疗硬皮病、例如与硬皮病有关的肺纤维化。给予MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体可用于减少肺中的硬皮病的纤维化症状。例如，所述方法可用于改善肺功能和/或减少由于硬皮病导致的死亡风险。
连累肾在硬皮病患者中也是常见的。与硬皮病有关的肾纤维化是可通过给予MASP-2抑制剂、例如抗-MASP-2抗体治疗的肾纤维化的实例。在某些实施方案中，本公开内容的方法用于治疗硬皮病、例如与硬皮病有关的肾纤维化。在一个实施方案中，给予MASP-2抑制性抗体可用于减少肾中的硬皮病的纤维化症状。例如，所述方法可用于改善肾功能，减少尿中的蛋白，减少高血压和/或减少可导致致死性肾衰竭的肾危象的风险。
系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性的炎性自身免疫病症，特征为自发B和T细胞自身反应性和多器官免疫损伤，和可影响皮肤、关节、肾和其它器官。几乎所有具有SLE的人具有关节疼痛，和大多数发生关节炎。经常受影响的关节是手指、手、腕和膝。SLE的一般症状包括：关节炎；疲劳；全身不适、不安或恶感(萎靡不振)；关节痛和肿胀；肌肉痛；恶心和呕吐；和皮疹。另外，症状还可包括：腹痛；尿血；受压或寒冷时手指变色；麻木和刺痛；和皮肤红斑。在一些患者中，SLE具有连累肺或肾。不受理论的约束，肺和肾的炎症和/或纤维化损伤这些器官，和导致与肺和/或肾损伤有关的症状。在一些情况下，具有SLE的患者发生称为狼疮性肾炎的特定肾病况。在某些实施方案中，本公开内容提供治疗SLE的方法，包括给予有效量的MASP-2抑制剂例如抗-MASP-2抗体。给予MASP-2抑制性抗体可用于减少SLE的一种或多种症状。在某些实施方案中，给予抗-MASP-2抗体用于治疗狼疮性肾炎患者的SLE。在这样的情况下，治疗SLE包括治疗狼疮性肾炎，例如通过减少狼疮性肾炎的症状。在某些实施方案中，治疗包括治疗SLE的皮肤症状。在某些实施方案中，治疗包括减少狼疮性肾炎的一种或多种症状。在某些实施方案中，治疗包括减少、延迟或消除透析需要。在某些实施方案中，治疗包括减少、延迟或消除肾移植的需要。在某些实施方案中，治疗包括延迟或预防狼疮性肾炎进展至肾衰竭或晚期肾疾病。
狼疮性肾炎是肾的炎症，并且是系统性红斑狼疮(SLE)的严重并发症。在肾中，狼疮性肾炎可导致功能的弱化损失。狼疮性肾炎患者可最终发展肾衰竭和需要透析或肾移植。也可使用本公开内容的方法治疗的相关并发症包括间质性肾炎和肾病综合征。狼疮性肾炎的症状包括：尿血、尿的泡沫外观、高血压、尿蛋白、液体潴留和水肿。其它症状包括肾纤维化和/或肾衰竭的迹象和症状。如果不治疗，狼疮性肾炎可导致肾衰竭，和甚至晚期肾疾病。
因此，在某些实施方案中，本公开内容提供在患有引起或加重纤维化和/或炎症的自身免疫性疾病的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，直接或远端(例如通过导管)通过局部施用组合物。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的自身免疫性疾病的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，引起或加重纤维化和/或炎症的自身免疫性疾病选自：硬皮病和系统性红斑狼疮(SLE)。
中枢神经系统疾病和病况
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的中枢神经系统的疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如抗-MASP-2抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如在手术或局部注射期间，直接或远端(例如通过导管)通过局部施用组合物。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的中枢神经系统疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的中枢神经系统的疾病或病症选自：中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤。
皮肤疾病和病况
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的皮肤疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如通过局部施用组合物至皮肤，或在手术或局部注射期间直接或远端(例如通过导管)局部施用。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，通过局部给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的皮肤疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的皮肤疾病或病症选自：皮肤纤维化、伤口愈合、硬皮病、全身性硬化、瘢痕瘤、结缔组织病、瘢痕形成和肥厚性瘢痕。
肌肉骨骼的骨和软组织病症和病况
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的骨或软组织疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如通过局部施用组合物至骨或软组织结构，或在手术或局部注射期间直接或远端(例如通过导管)局部施用。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，通过局部给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的骨或软组织疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的骨或软组织疾病或病症选自：与例如囊性纤维化有关的骨质疏松和/或骨质减少、具有骨纤维化增加的骨髓发育不良病况、粘连性囊炎、杜普伊特伦氏挛缩和骨髓纤维化。
关节疾病和病况
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的关节疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如通过局部施用组合物至关节，或在手术或局部注射期间直接或远端(例如通过导管)局部施用。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，通过局部给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的关节疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的关节疾病或病症是关节纤维化。
消化疾病和病况
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的消化疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如通过在手术或局部注射期间直接或远端(例如通过导管)局部施用。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，通过局部给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的消化疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的消化疾病或病症选自：克罗恩病、溃疡性结肠炎和胰脏纤维化。
眼疾病和病况
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的眼疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如通过在手术或局部注射期间直接或远端(例如通过导管)局部施用。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，通过局部给予眼(例如，作为滴眼剂)，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的眼疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的眼疾病或病症选自：前囊下白内障、后囊乳浊、黄斑变性以及视网膜和玻璃体视网膜病。
生殖器官的疾病和病况
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的生殖疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如通过在手术或局部注射期间直接或远端(例如通过导管)局部施用。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，通过局部给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的生殖疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，由纤维化和/或炎症引起或加重的生殖疾病或病症选自：子宫内膜异位和佩伦涅氏病。
与创伤有关的瘢痕形成
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有因与创伤有关的瘢痕形成产生的疾病或病况的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如通过在手术或局部注射期间直接或远端(例如通过导管)局部施用。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，通过局部给予，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在一些实施方案中，与创伤有关的瘢痕形成选自：手术并发症(例如，手术粘连，其中瘢痕组织可在内脏器官之间形成，引起挛缩、疼痛和可引起不育)、化学治疗药物诱导的纤维化、辐射诱导的纤维化和与烧伤有关的瘢痕形成。
由纤维化和/或炎症引起或加重的其它疾病和病症
在某些实施方案中，本公开内容提供在患有由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的受试者中预防、治疗、逆转、抑制和/或减轻纤维化和/或炎症的方法，所述疾病或病症选自器官移植、乳房纤维化、肌肉纤维化、腹膜后纤维化、甲状腺纤维化、淋巴结纤维化、膀胱纤维化和胸膜纤维化，所述方法包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体。该方法包括给予包含有效抑制纤维化和/或炎症的量的MASP-2抑制剂的组合物。
MASP-2抑制性组合物可局部给予纤维化的区域，例如通过在手术或局部注射期间直接或远端(例如通过导管)局部施用。或者，MASP-2抑制剂可全身给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，通过局部给予眼(例如，作为滴眼剂)，或者对于非肽能药物可能通过口服给予。给予可重复进行，由医生确定，直到病况已得到消除或控制。
在某些实施方案中，MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)与适合于潜在的疾病或病症的一种或多种药剂或治疗形式组合给予。
在本文所述的各种方法和药物组合物的任一种的某些实施方案中，MASP-2抑制性抗体选择性地阻断凝集素途径，同时保留经典途径完整。
IV. MASP-2抑制剂
在各个方面，本发明提供抑制纤维化和/或炎症的不良作用的方法，包括给予有需要的受试者MASP-2抑制剂。MASP-2抑制剂以有效抑制有生命的受试者的MASP-2依赖性补体活化的量给予。在本发明这个方面的实施中，代表性的MASP-2抑制剂包括：抑制MASP-2生物活性的分子(诸如小分子抑制剂、抗MASP-2抗体(例如MASP-2抑制性抗体)或者与MASP-2相互作用或干扰蛋白间相互作用的阻断性肽)，以及减少MASP-2表达的分子(诸如MASP-2反义核酸分子、MASP-2特异性RNAi分子和MASP-2核酶)，从而阻止MASP-2激活凝集素补体途径。MASP-2抑制剂可单独使用作为主要疗法，或者与其它治疗药物联用作为辅助疗法以增强其它药物治疗的治疗益处。
MASP-2依赖性补体活化抑制的特征在于补体系统成分的至少一种以下的变化，所述变化是由于根据本发明的方法给予MASP-2抑制剂所致：MASP-2依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9 (MAC)形成或产生的抑制(例如，按实施例2所述测量)，C4裂解和C4b沉积的减少(例如，按实施例2所述测量)，或者C3裂解和C3b沉积的减少(例如，按实施例2所述测量)。
根据本发明，使用有效抑制纤维化和/或炎症，并显示可检测的抗纤维化活性和/或诱导纤维化减少的MASP-2抑制剂。在本发明的背景内，抗-纤维化活性可包含以下至少一项或多项：与缺少MASP-2抑制剂时的纤维化活性相比，(1) 炎症减少，例如通过活化和募集巨噬细胞和内皮细胞；通过分泌许多细胞因子/趋化因子，募集和活化淋巴细胞和/或嗜酸性细胞；释放细胞毒性介质和纤维发生细胞因子评价；(2) 细胞增殖、ECM合成或血管发生减少；和/或(3) 胶原沉积减少。
抗纤维化剂、例如MASP-2抑制剂的评估可使用技术人员已知的任何技术检测。例如，抗纤维化剂的评估可在UUO模型中评估(如本文实施例12和14所述)。如果使用MASP-2抑制剂评估可检测的抗纤维化活性和/或纤维化减少或降低，认为这样的MASP-2抑制剂用作用于预防、治疗、逆转和/或抑制纤维化的药物。
纤维化的评估可定期进行，例如，每周或每个月。纤维化的增加/减少和/或抗纤维化活性的存在可因此定期评估，例如，每周或月。这种评估优选对于给定的受试者以数个时间点进行，或对于给定的受试者和健康对照以一个或数个时间点进行。评估可以规律的时间间隔、例如每周或每个月进行。评估可因此规律地进行，例如每周或每个月。当一项评估导致发现纤维化减少或存在抗纤维化活性时，认为MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体显示可检测的抗纤维化活性和/或诱导纤维化的减少或降低。
用于实施本发明这个方面的MASP-2抑制剂包括例如MASP-2抗体及其片段、MASP-2抑制肽、小分子、MASP-2可溶性受体和表达抑制剂。MASP-2抑制剂可通过阻断MASP-2的生物学功能而抑制MASP-2依赖性补体活化系统。例如，抑制剂可有效阻断MASP-2蛋白间的相互作用，干扰MASP-2二聚化或装配，阻断Ca2+结合，干扰MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点，或者可减少MASP-2蛋白表达。
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂选择性抑制MASP-2补体活化，保持了C1q依赖性补体活化系统功能上的完整性。
在一个实施方案中，用于本发明方法的MASP-2抑制剂是特异性的MASP-2抑制剂，其与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合的亲和力是与补体系统中的其它抗原结合的亲和力的至少10倍。在另一个实施方案中，MASP-2抑制剂与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合的结合亲和力是与补体系统中的其它抗原结合的结合亲和力的至少100倍。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂特异性结合CCP1-CCP2结构域(SEQ ID NO:6的aa 300-431)或MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:6的aa 445-682)的至少一种并抑制MASP-2-依赖性补体活化。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂是特异性结合MASP-2的MASP-2单克隆抗体或其片段。MASP-2抑制剂的结合亲和力可使用合适的结合测定法进行测定。
MASP-2多肽具有类似于C1补体系统的蛋白酶MASP-1、MASP-3以及C1r和C1s的分子结构。SEQ ID NO:4所示的cDNA分子编码MASP-2的代表性实例(由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成)，提供带有前导序列(氨基酸1-15)的人MASP-2多肽，分泌后被裂解，产生成熟形式的人MASP-2 (SEQ ID NO:6)。如图2中所示，人MASP 2基因包括十二个外显子。人MASP-2 cDNA由外显子B、C、D、F、G、H、I、J、K和L编码。可变剪接产生了20 kDa蛋白，称为MBL相关的蛋白19 (“MAp19”，也称“sMAP”) (SEQ ID NO:2)，由图2所示外显子B、C、D和E产生的(SEQID NO:1)编码。SEQ ID NO:50所示的cDNA分子编码鼠MASP-2 (由SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列组成)，提供带有前导序列的鼠MASP-2多肽，分泌后被裂解，产生成熟形式的鼠MASP-2 (SEQ ID NO:52)。SEQ ID NO:53所示的cDNA分子编码大鼠MASP-2 (由SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列组成)，提供带有前导序列的大鼠MASP-2多肽，分泌后被裂解，产生成熟形式的大鼠MASP-2 (SEQ ID NO:55)。
本领域技术人员应理解的是，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53中公开的序列分别代表人、小鼠和大鼠MASP-2的单个等位基因，发生等位基因变异和可变剪接是预料之中的。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53所示核苷酸序列的等位基因变体，包括含有沉默突变的变体以及其中导致氨基酸序列改变的突变的变体，都属本发明的范围。可根据标准方法，通过探测cDNA或基因组文库而从不同个体中克隆MASP-2序列的等位基因变体。
人MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)的结构域见图1和2A，包括N端C1r/C1s/海胆Vegf/骨形成蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO:6的氨基酸1-121)、表皮生长因子样结构域(氨基酸122-166)、第二CUBI结构域(氨基酸167-293)以及串联的补体调控蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。MASP 2基因的可变剪接产生图1中所示的MAp19。MAp19是含有MASP-2的N端CUBI-EGF区的非酶蛋白，具有得自图1所示外显子E的4个额外残基(EQSL)。
一些蛋白质已显示通过蛋白间的相互作用与MASP-2结合或者与MASP-2相互作用。例如，已知MASP-2结合凝集素蛋白MBL、H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白，并与之形成Ca2+依赖性复合物。每种MASP-2/凝集素复合物已显示通过蛋白质C4和C2的MASP-2依赖性裂解来激活补体(Ikeda, K.,等人, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita,M.,等人, J. Exp. Med.176:1497-2284, 2000; Matsushita, M.,等人, J. Immunol. 168:3502-3506, 2002)。研究表明，MASP-2的CUBI-EGF结构域对于MASP-2与MBL的结合是必不可少的(Thielens, N.M.,等人, J. Immunol. 166:5068, 2001)。研究还表明，CUBIEGFCUBII结构域介导MASP-2的二聚化，这是形成活性MBL复合物所需要的(Wallis,R.,等人, J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000)。因此，可对结合已知对MASP-2依赖性补体活化重要的MASP-2靶区或者干扰该区域的MASP-2抑制剂进行鉴定。
抗MASP-2抗体
在本发明这个方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂包括抑制MASP-2依赖性补体活化系统的抗MASP-2抗体。用于本发明这个方面的抗MASP-2抗体包括得自任何产生抗体的哺乳动物的多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体，并且可以是多特异性的、嵌合的、人源化的、抗独特型抗体以及抗体片段。抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv片段、scFv片段和单链抗体，见本文的进一步描述。
使用本文所述的测定法，可筛选MASP-2抗体抑制MASP-2-依赖性补体活化系统的能力和抗纤维化活性和/或抑制与蛋白尿或阿霉素诱导的肾病有关的肾损伤的能力。数种MASP-2抗体已在文献中描述，和一些已经最近产生，其中的一些列于下表1中。例如，如本文实施例10和11所述，已鉴定了阻断MASP-2-依赖性补体活化的抗-MASP-2 Fab2抗体。如实施例12所述，以及在WO2012/151481中所述，其通过引用并入本文，已鉴定了阻断MASP-2-依赖性补体活化的全人MASP-2 scFv抗体(例如，OMS646)。如实施例13所述，以及在WO2014/144542中所述，其通过引用并入本文，具有MASP-2抑制性活性的携带SGMI-2肽的MASP-2抗体和其片段通过融合SGMI-2肽氨基酸序列(SEQ ID NO:72、73或74)至人MASP-2抗体的重链和/或轻链的氨基或羧基端产生(例如，OMS646-SGMI-2)。
因此，在一个实施方案中，用于本发明的方法的MASP-2抑制剂包含人抗体，例如OMS646。因此，在一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法的MASP-2抑制剂包含结合由人MASP-2 (SEQ ID NO:6)组成的多肽的人抗体，其中所述抗体包含：(I) (a) 重链可变区，包含: i) 重链CDR-H1，包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列；和ii) 重链CDR-H2，包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列；和iii) 重链CDR-H3，包含SEQ ID NO:67的95-107的氨基酸序列和b) 轻链可变区，包含: i) 轻链CDR-L1，包含SEQ ID NO:69的24-34的氨基酸序列；和ii) 轻链CDR-L2，包含SEQ ID NO:69的50-56的氨基酸序列；和iii) 轻链CDR-L3，包含SEQ ID NO:69的89-97的氨基酸序列，或(II) 其变体，包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如，与SEQ ID NO:67具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ ID NO:69具有至少90%同一性(例如，具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区，和含有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述方法包括给予受试者包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段特异性识别由参考抗体OMS646识别的人MASP-2上的表位的至少一部分，参考抗体OMS646包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:69所示的轻链可变区。在一个实施方案中，用于本发明的方法的MASP-2抑制剂包含人抗体OMS646。
表1：示例性的MASP-2特异性抗体
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效应子功能降低的抗MASP-2抗体
在本发明这个方面的一些实施方案中，抗MASP-2抗体降低了效应子功能，来减轻可能由经典补体途径活化产生的炎症。IgG分子引发经典补体途径的能力已表明存在于分子的Fc部分(Duncan, A.R.,等人, Nature332:738-740 1988)。其中通过酶裂解除去分子Fc部分的IgG分子缺少这种效应子功能(参见Harlow,Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)。因此，可通过具有使效应子功能减到最低的基因工程改造的Fc序列，或者成为人IgG2或IgG4同种型，由此去掉分子的Fc部分，从而产生效应子功能降低的抗体。
可对IgG重链的Fc部分进行标准分子生物学操作来产生效应子功能降低的抗体，如本文所述，也描述于Jolliffe等人, Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, 1993, 和Rodrigues等人, J. Immunol. 151:6954-6961, 1998。效应子功能降低的抗体还包括激活补体和/或与Fc受体相互作用的能力降低的人IgG2和IgG4同种型(Ravetch, J.V.,等人,Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Isaacs, J.D.,等人, J. Immunol.148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G.,等人, Immunol. Today 14:215-221, 1993)。可通过本领域普通技术人员已知的若干方法之一，来产生由IgG2或IgG4同种型构成的人MASP-2特异性的人源化抗体或完全人抗体，如Vaughan, T.J.,等人, Nature Biotechnical 16:535-539, 1998所述。
抗MASP-2抗体的产生
可使用MASP-2多肽(例如全长MASP-2)或使用带有抗原性MASP-2表位的肽(如MASP-2多肽部分)来产生抗MASP-2抗体。免疫原性肽可以少至五个氨基酸残基。例如，可以使用包括SEQ ID NO:6全部氨基酸序列的MASP-2多肽来诱导用于本发明方法的抗MASP-2多肽。可以将已知参与蛋白间相互作用的特定MASP-2结构域，诸如CUBI和CUBIEGF结构域以及包括丝氨酸蛋白酶活性部位的区域，表达为实施例3中所述的重组多肽并用作抗原。此外，包含MASP-2多肽(SEQ ID NO:6)至少6个氨基酸的部分的肽也可用来诱导MASP-2抗体。下表2中提供了用于诱导MASP-2抗体的MASP-2衍生抗原的其它实例。用于产生抗体的MASP-2肽和多肽可作为天然多肽、或者重组肽或合成肽以及无催化活性的重组多肽(诸如MASP-2A)而被分离出来，如本文进一步描述的。在本发明这个方面的一些实施方案中，使用转基因小鼠品系获得抗MASP-2抗体，如本文描述的。
用于产生抗MASP-2抗体的抗原还包括融合多肽，诸如MASP-2或其部分与免疫球蛋白多肽或者与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是半抗原样的，则最好可将此类部分结合或连接到大分子载体(诸如匙孔
Figure 330330DEST_PATH_IMAGE002
血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)上用于免疫。
表2：MASP-2衍生的抗原
Figure 844487DEST_PATH_IMAGE003
多克隆抗体
可通过使用本领域普通技术人员众所周知的方法，用MASP-2多肽或其免疫原性部分免疫动物来制备抗MASP-2的多克隆抗体。参见，例如，Green等人, "Production ofPolyclonal Antisera," 载于Immunochemical Protocols (Manson主编), 第105页。可通过使用佐剂来增加MASP-2多肽的免疫原性，所述佐剂包括无机凝胶(诸如氢氧化铝)或弗氏佐剂(完全或不完全)、表面活性剂(诸如溶血卵磷脂)、普罗尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、油乳液、匙孔
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血蓝蛋白和二硝基苯酚。多克隆抗体一般由动物诸如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊产生。或者，用于本发明的抗MASP-2抗体也可得自近似人类的灵长类。在狒狒中产生诊断用和治疗用抗体的通用技术可参见例如Goldenberg等人的国际专利公开号WO 91/11465和Losman, M.J.,等人, Int. J. Cancer 46:310, 1990。然后采用本领域众所周知的标准方法，从这些被免疫过的动物的血液中产生含有免疫活性抗体的血清。
单克隆抗体
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是抗MASP-2单克隆抗体。抗MASP-2单克隆抗体是高度特异性的，针对单一MASP-2表位。本文所用的修饰语“单克隆”是指获自基本同质的抗体群的抗体性质，不得理解为需要通过任何特定方法来产生抗体。可采用通过培养物中的连续细胞系以提供抗体分子产生的任何技术来获得单克隆抗体，例如Kohler, G.,等人,Nature 256:495, 1975中所述的杂交瘤方法，或者可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体(参见例如Cabilly的美国专利号4,816,567)。也可以采用Clackson, T.,等人, Nature 352:624-628, 1991, 和Marks, J.D.,等人, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。
例如，可通过将包含MASP-2多肽或其部分的组合物注射给合适的哺乳动物(例如BALB/c小鼠)而获得单克隆抗体。在预定时间期间之后，从小鼠中取出脾细胞，使之悬浮于细胞培养基中。然后将脾细胞与无限增殖细胞系融合形成杂交瘤。将形成的杂交瘤在细胞培养基中培养，对它们产生抗MASP-2单克隆抗体的能力进行筛选。进一步描述抗MASP-2单克隆抗体产生的实例在本文提供(亦参见Current Protocols in Immunology, Vol. 1.,John Wiley & Sons, pages 2.5.1-2.6.7, 1991.)。
可通过使用转基因小鼠来获得人单克隆抗体，所述转基因小鼠已被工程改造以在响应抗原攻击时产生特异性人抗体。在这种技术中，将人免疫球蛋白重链和轻链基因座元件引入得自胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有被定向破坏的内源免疫球蛋白重链和轻链基因座。该转基因小鼠可合成对人抗原(诸如本文所述MASP-2抗原)特异性的人抗体，可使用该小鼠来产生分泌人MASP-2抗体的杂交瘤，其通过采用常规Kohler-Milstein技术，将来自这些动物的B细胞与合适的骨髓瘤细胞系融合，如本文进一步所述。具有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠是市售的(例如购自Abgenix, Inc., Fremont,CA, 和Medarex, Inc., Annandale, N.J.)。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法描述于例如Green, L.L.,等人, Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N.,等人, Nature 368:856, 1994; 和Taylor, L.D.,等人, Int. Immun. 6:579, 1994。
可通过各种已确立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括用A蛋白琼脂糖凝胶亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析(参见例如Coligan，第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页；Baines等人, "Purification of Immunoglobulin G(IgG),"载于Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc.,第10卷，第79-104页，1992)。
多克隆抗体、单克隆抗体或得自噬菌体的抗体一旦产生，首先便要测定其对MASP-2结合的特异性。可以利用本领域技术人员已知的各种测定法来检测特异性结合MASP-2的抗体。示例性的测定法包括通过标准方法进行的Western印迹法或免疫沉淀分析法(描述于例如Ausubel等人)、免疫电泳、酶联免疫吸附测定、斑点印迹法、抑制或竞争测定法以及夹心测定法(描述于Harlow和Land,抗体: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1988)。一旦鉴定出特异性结合MASP-2的抗体，便通过以下几种测定法之一，测定抗MASP-2抗体作为MASP-2抑制剂发挥作用的能力：诸如例如凝集素特异性C4裂解测定法(描述于实施例2)、C3b沉积测定法(描述于实施例2)或者C4b沉积测定法(描述于实施例2)。
本领域普通技术人员可以容易地测定抗MASP-2单克隆抗体的亲和力(参见例如Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949)。在一个实施方案中，用于本发明方法的抗MASP-2单克隆抗体能结合MASP-2，其结合亲和力<100 nM，优选<10 nM，最优选<2nM。
嵌合/人源化抗体
用于本发明方法的单克隆抗体包括嵌合抗体以及这些抗体的片段，其中重链和/或轻链部分与得自特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分与得自另一物种或者属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源(Cabilly的美国专利号4,816,567；和Morrison, S.L.,等人, Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 81:6851-6855, 1984)。
用于本发明的一种嵌合抗体的形式是人源化单克隆抗MASP-2抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合抗体，其含有得自非人免疫球蛋白的最小序列。通过将非人(例如小鼠)互补决定区(CDR)从小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移到人可变区，从而产生人源化单克隆抗体。然后，典型的做法是将人抗体的其余部分代入非人对应部分的构架区。此外，人源化抗体可包括受体抗体或供体抗体中不存在的残基。这些修饰被用来进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一种、通常两种可变结构域，其中所有或基本上所有的超变环都对应于非人免疫球蛋白的超变环，所有或基本上所有的Fv构架区都是人免疫球蛋白序列的Fv构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。更多详情可参见Jones, P.T.,等人,Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L.,等人, Nature 332:323-329, 1988; 和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992。
用于本发明的人源化抗体包括至少含有MASP-2结合CDRH3区的人单克隆抗体。此外，可以替换Fc部分以便产生IgA或IgM以及人IgG抗体。这些人源化抗体将具有特定临床效用，因为它们特异性地识别人MASP-2，但是却不会引起人体对抗体本身的免疫应答。因此它们更适用于人体的体内给药，尤其是必需重复或长期给药的时候。
由鼠抗MASP-2单克隆抗体获得人源化抗MASP-2抗体的实例见本文实施例6。人源化单克隆抗体的生产技术还记载于例如Jones, P.T.,等人, Nature 321:522, 1986;Carter, P.,等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S.,Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I.,等人, J. Immun. 150:2844,1993; Sudhir (主编), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc.,1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibidies,"载于Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland等人 (主编), John Wiley & Sons, Inc., 第399-434页, 1996；以及Queen的美国专利号5,693,762，(1997)。此外，还有从特定鼠抗体区合成人源化抗体的商业实体，诸如Protein Design Labs (Mountain View, CA)。
重组抗体
也可使用重组方法制备抗MASP-2抗体。例如，可使用人免疫球蛋白表达文库(可获自例如Stratagene, Corp., La Jolla, CA)产生人抗体片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或F(ab')2)来制备人抗体。然后使用类似于产生嵌合抗体的技术，将这些片段用以构建完整的人抗体。
抗独特型抗体
一旦鉴定出具有所需抑制活性的抗MASP-2抗体，便可采用本领域众所周知的技术将这些抗体用来产生类似部分MASP-2的抗独特型抗体。参见例如Greenspan, N.S.,等人,FASEB J. 7:437, 1993。例如，结合MASP-2并竞争性抑制补体活化所需的MASP-2蛋白的相互作用的抗体可用来产生类似MASP-2蛋白上的MBL结合位点的抗独特型抗体，从而结合并中和MASP-2的结合配体，诸如，例如MBL。
免疫球蛋白片段
用于本发明方法的MASP-2抑制剂不仅包括完整的免疫球蛋白分子，而且还包括众所周知的片段，这些片段包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
本领域众所周知的是，只有小部分的抗体分子即互补位参与抗体与其表位的结合(参见例如Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology,Wiley & Sons, Inc., NY, 1986)。抗体的pFc'区和Fc区是经典补体途径的效应子，但是不参与抗原结合。其中pFc'区已被酶裂解的抗体，或者所产生的没有pFc'区的抗体被称为F(ab')2片段，它保留了完整抗体的抗原结合部位。分离的F(ab')2片段由于有两个抗原结合部位而被称为二价单克隆片段。类似地，其中Fc区已被酶裂解的抗体，或者所产生的没有Fc区的抗体被称为Fab片段，它保留了完整抗体分子的一个抗原结合部位。
抗体片段可通过蛋白水解而获得，诸如通过常规方法经胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体。例如，可通过用胃蛋白酶进行抗体酶裂解来产生抗体片段，从而提供称为F(ab')2的5S片段。该片段可再使用硫醇还原试剂裂解，得到3.5S Fab'单价片段。任选可使用二硫键裂解产生的巯基的封端基团来进行裂解反应。作为替代方法，使用胃蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法记载于例如Goldenberg的美国专利号4,331,647；Nisonoff, A.,等人, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960;Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman,等人, 载于Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, 1967；以及Coligan的第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
在一些实施方案中，优选使用缺乏Fc区的抗体片段以避免Fc结合Fcγ受体之后激活经典补体途径。有几种方法可产生避免与Fcγ受体相互作用的MoAb。例如，单克隆抗体的Fc区可通过使用蛋白水解酶部分消化(例如无花果蛋白酶消化)，从而用化学法去除，因此产生例如结合抗原的抗体片段，诸如Fab或F(ab)2片段(Mariani, M.,等人, Mol. Immunol. 28:69-71, 1991)。或者，可以在构建本文所述的人源化抗体期间使用不结合Fcγ受体的人γ4 IgG同种型。也可使用本文所述重组技术来工程改造缺少Fc结构域的抗体、单链抗体和结合抗原的结构域。
单链抗体片段
或者，可以制备对MASP-2特异性的单一肽链结合分子，其中重链和轻链Fv区相连接。Fv片段可通过肽接头相连，形成单链抗原结合蛋白(scFv)。通过构建包含编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白，各结构域之间通过寡核苷酸连接。将结构基因插入表达载体中，随后将其引入宿主细胞(诸如大肠杆菌)中。重组宿主细胞合成了由接头肽桥接两个V结构域的单一多肽链。scFv的制备方法记载于例如Whitlow,等人, "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird,等人,Science 242:423, 1988；Ladner的美国专利号4,946,778；Pack, P.,等人, Bio/ Technology 11:1271, 1993。
举例来说，可通过将淋巴细胞体外暴露于MASP-2多肽，并在噬菌体或类似载体中选择抗体展示文库(例如通过使用固定化的或标记的MASP-2蛋白或肽)，获得MASP-2特异性scFv。可通过对噬菌体或细菌(诸如大肠杆菌)上展示的随机肽文库进行筛选而获得编码具有可能的MASP-2多肽结合结构域的多肽的基因。这些随机肽展示文库可用于筛选与MASP-2相互作用的肽。构建和筛选这些随机肽展示文库的技术是本领域众所周知的(Lardner的美国专利号5,223,409；Lardner的美国专利号4,946,778；Lardner的美国专利号5,403,484；Lardner的美国专利号5,571,698；以及Kay等人, Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996)，且随机肽展示文库和用于筛选这些文库的试剂盒是市售的，例如购自CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.)、InvitrogenInc. (San Diego, Calif.)、New England Biolabs, Inc. (Ipswich, Mass.)以及Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.)。
用于本发明这个方面的抗MASP-2抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽，其结合MASP-2抗原的表位并抑制MASP-2依赖性补体活化。可通过构建编码目标抗体CDR的基因而获得CDR肽(“最小识别单元”)。例如可通过使用聚合酶链式反应从抗体生成细胞的RNA合成可变区，从而制备这些基因(参见例如Larrick等人, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies," 载于Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter等人 (主编), 第166页,Cambridge University Press, 1995; 以及Ward等人, "Genetic Manipulation andExpression of Antibodies,"载于Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch等人 (主编), 第137页, Wiley-Liss, Inc., 1995))。
将本文所述MASP-2抗体给予需要其的受试者以抑制MASP-2依赖性补体活化。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是效应子功能降低的高亲和力人或人源化单克隆抗MASP-2抗体。
肽抑制剂
在本发明这个方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂包括分离的MASP-2肽抑制剂，其包括抑制MASP-2依赖性补体活化系统的分离的天然肽抑制剂和合成肽抑制剂。本文所用术语“分离的MASP-2肽抑制剂”是指通过结合MASP-2、与MASP-2竞争以结合凝集素途径中的其它识别分子(例如MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)、和/或直接与MASP-2相互作用以抑制MASP-2依赖性补体活化，从而抑制MASP-2依赖性补体活化的肽，所述肽是基本纯化的，其基本上没有其它与之一起存在于自然界以达到实用和适于其既定用途程度的物质。
已经使用肽抑制剂成功地在体内干扰了蛋白间的相互作用和催化位点。例如，最近，结构上与LFA-1有关的粘着分子的肽抑制剂已获准临床用于凝血病(Ohman, E.M.,等人, European Heart J. 16:50-55, 1995)。研究揭示短的线性肽(<30个氨基酸)防止或干扰整联蛋白依赖性粘附(Murayama, O.,等人, J. Biochem. 120:445-51, 1996)。还使用长度范围为25-200个氨基酸残基的较长肽，成功阻断了整联蛋白依赖性粘附(Zhang, L.,等人, J. Biol. Chem. 271(47):29953-57, 1996)。一般而言，较长的肽抑制剂具有比短肽高的亲和力和/或较慢的解离速度，因此是更有效的抑制剂。研究还表明，环肽抑制剂是有效的整联蛋白体内抑制剂，用于治疗人炎性疾病(Jackson, D.Y.,等人, J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997)。产生环肽的一种方法包括其中肽的末端氨基酸是半胱氨酸的肽的合成，从而使得肽能够通过末端氨基酸之间的二硫键以环状形式存在，已经证实用于治疗造血系统肿瘤时，改善了亲和力和体内半衰期(例如Larson的美国专利号6,649,592)。
合成的MASP-2肽抑制剂
通过模拟对于MASP-2功能是重要的靶区的氨基酸序列，来示例性说明用于本发明这个方面方法中的MASP-2抑制肽。用于实施本发明方法的抑制肽的大小范围为约5个氨基酸至约300个氨基酸。表3提供用于实施本发明这个方面的示例性抑制肽的一览表。可通过几种测定法中的一种对候选MASP-2抑制肽作为MASP-2抑制剂起作用的能力进行测定，这些测定法包括例如凝集素特异性的C4裂解测定法(参见实施例2)以及C3b沉积测定法(参见实施例2)。
在一些实施方案中，MASP-2抑制肽得自MASP-2多肽并选自全长的成熟MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)，或者得自MASP-2蛋白的特定结构域，诸如例如CUBI结构域(SEQ ID NO:8)、CUBIEGF结构域(SEQ ID N O:9)、EGF结构域(SEQ ID NO:11)以及丝氨酸蛋白酶结构域(SEQID NO:12)。如前所述，研究表明CUBEGFCUBII区是二聚化和与MBL结合所需要的(Thielens等人，同上)。特别是在鉴定人体带有Asp105至Gly105纯合突变的研究证实，MASP-2的CUBI结构域中的肽序列TFRSDYN (SEQ ID NO:16)参与结合MBL，所述突变导致从MBL复合物上失去MASP-2 (Stengaard-Pedersen, K.,等人, New England J. Med. 349:554-560,2003)。
在一些实施方案中，MASP-2抑制肽得自结合MASP-2并参与凝集素补体途径的凝集素蛋白。已经鉴定出参与该途径的几种不同的凝集素，包括甘露聚糖结合凝集素(MBL)、L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白(Ikeda, K.,等人, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M.,等人, J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000;Matsushita, M.,等人, J. Immunol. 168:3502-3506, 2002)。这些凝集素作为同源三聚体亚基的寡聚体而存在于血清中，每个亚基都具有带有碳水化合物识别结构域的N端胶原样纤维。已经证实这些不同的凝集素结合MASP-2，凝集素/MASP-2复合物通过裂解蛋白C4和C2而激活补体。H-纤维胶凝蛋白具有24个氨基酸的氨基端区、带有11个Gly-Xaa-Yaa重复的胶原样结构域、12个氨基酸的颈部结构域和207个氨基酸的血纤蛋白原样结构域(Matsushita, M.,等人, J. Immunol. 168:3502-3506, 2002)。H-纤维胶凝蛋白结合GlcNAc，并使被得自鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)、明尼苏达沙门氏菌(S. minnesota)和大肠杆菌的LPS包被的人红细胞凝集。已经证实H-纤维胶凝蛋白结合MASP-2和MAp19并激活凝集素途径，出处同上。L-纤维胶凝蛋白/P35也结合GlcNAc，已被证实与人血清中的MASP-2和MAp19结合，并且证实该复合物激活凝集素途径(Matsushita, M.,等人,J. Immunol. 164:2281, 2000)。因此，用于本发明的MASP-2抑制肽可包括选自MBL蛋白(SEQ ID NO:21)、H-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号NM_173452)、M-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号O00602)以及L-纤维胶凝蛋白(Genbank检索号NM_015838)的至少5个氨基酸的区域。
更具体地，科学家已经鉴定出MBL上的MASP-2结合部位是在12个Gly-X-Y三联体“GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POGNOG PSG SOG PKG QKG DOG KS”(SEQID NO:26)中，该三联体位于MBP胶原样结构域C端部分的铰链和颈之间(Wallis, R.,等人,J. Biol. Chem. 279:14065, 2004)。该MASP-2结合部位区在人H-纤维胶凝蛋白和人L-纤维胶凝蛋白中也是高度保守的。研究指出，所有三种包括氨基酸序列“OGK-X-GP”(SEQ IDNO:22)的凝集素蛋白中存在共有结合部位，该氨基酸序列中字母“O”表示羟脯氨酸，字母“X”表示疏水残基(Wallis等人，2004，同上)。因此，在一些实施方案中，用于本发明这个方面的MASP-2抑制肽长度为至少6个氨基酸并且包含SEQ ID NO:22。已经证实包括氨基酸序列“GLR GLQ GPO GKL GPO G” (SEQ ID NO:24)并得自MBL的肽体外结合MASP-2 (Wallis等人，2004，同上)。为增强与MASP-2的结合，可合成在每端邻接两个GPO三联体的肽(“GPO GPOGLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O” SEQ ID NO:25)，以增强天然MBL蛋白中所发现的三股螺旋的形成(进一步描述见Wallis, R.,等人, J. Biol. Chem. 279:14065, 2004)。
MASP-2抑制肽也可得自人H-纤维胶凝蛋白，其包括来自H-纤维胶凝蛋白的共有MASP-2结合区的序列“GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO” (SEQ ID NO:27)。还包括得自人L-纤维胶凝蛋白的肽，其包括来自L-纤维胶凝蛋白的共有MASP-2结合区的序列“GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO” (SEQ IDNO:28)。
MASP-2抑制肽还可得自C4裂解部位，诸如连接到抗凝血酶III C端部分的C4裂解部位“LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI” (SEQ ID NO:29) (Glover, G.I.,等人, Mol. Immunol. 25:1261 (1988))。
表3：示例性的MASP-2抑制肽
Figure 991752DEST_PATH_IMAGE005
Figure 283056DEST_PATH_IMAGE006
注：字母“O”表示羟脯氨酸。字母“X”为疏水残基。
可对得自C4裂解部位的肽以及抑制MASP-2丝氨酸蛋白酶部位的其它肽进行化学修饰，以使其成为不可逆的蛋白酶抑制剂。例如，合适的修饰可包括但是不必限于C端、Asp或Glu、或者添加到功能侧链上的卤甲基酮(Br、Cl、I、F)；在氨基或其它功能侧链上的卤乙酰(或其它α-卤乙酰)基团；在氨基端或羧基端或者功能侧链上的环氧基或含亚胺的基团；或者在氨基端或羧基端或者其它功能侧链上的亚氨酸酯。这些修饰提供了通过肽的共价结合而永久抑制酶的这一优势。这可能导致有效剂量较低和/或肽抑制剂需要的给药频率较低。
除了上述抑制肽以外，用于本发明方法的MASP-2抑制肽包括含有按本文所述方法获得的抗MASP-2 MoAb的结合MASP-2的CDRH3区的肽。用于合成肽的CDR区的序列可以通过本领域已知方法来测定。重链可变区是通常长度范围为100-150个氨基酸的肽。轻链可变区是通常长度范围为80-130个氨基酸的肽。在重链和轻链可变区内部的CDR序列包括大约仅3-25个氨基酸序列，本领域普通技术人员很容易对其进行测序。
本领域技术人员应理解的是，上述的MASP-2抑制肽的基本同源的变异也可具有MASP-2抑制活性。示例性的变异包括但不必限于在主题肽的羧基端或氨基端部分有插入、缺失、置换和/或添加的氨基酸的肽及其混合物。因此，我们认为这些具有MASP-2抑制活性的同源肽可用于本发明的方法。所述肽还可包括复制基序和具有保守取代的其它修饰。本文其它部分描述了保守变体，包括一种氨基酸与具有同样电荷、大小或疏水性等性质的另一种氨基酸的交换。
可以对MASP-2抑制肽进行修饰以增加溶解度和/或使正或负电荷最大化，以便使之更类似于完整蛋白的区段。衍生物可以具有或没有本文所公开肽的精确的一级氨基酸结构，只要衍生物在功能上仍保留所需要的MASP-2抑制特性。所述修饰可包括氨基酸取代，即被通常已知的20种氨基酸之一或另一种氨基酸取代、被附加有所需特征(诸如酶降解抗性)的衍生化氨基酸或取代氨基酸取代或者被D氨基酸取代，或者被另外的模拟一种或多种氨基酸或肽的天然构象和功能的分子或化合物(诸如碳水化合物)取代；氨基酸缺失；氨基酸插入，即插入通常已知的20种氨基酸之一或另一种氨基酸、插入附加有所需特征(诸如酶降解抗性)的衍生化氨基酸或取代氨基酸或者插入D氨基酸，或者被另外的模拟一种或多种氨基酸或肽的天然构象和功能的分子或化合物(诸如碳水化合物)取代；或者被另外的模拟母体肽的天然构象、电荷分布和功能的分子或化合物(诸如碳水化合物或核酸单体)取代。肽也可通过乙酰化或酰胺化进行修饰。
可根据肽生物合成、碳水化合物生物合成等已知技术合成衍生的抑制肽。开始时，技术人员可根据合适的计算机程序来确定目标肽的构象。一旦知道本文所公开的肽的构象，然后技术人员便能以合理设计方式来确定能够在一个或多个位点进行什么类别的取代，以便形成的衍生物保留了母体肽的基本构象和电荷分布，但却可以拥有母体肽中不存在的特征或者其特征优于母体肽存在的特征。一旦鉴定出候选衍生分子，就可使用本文所述测定法来测定衍生物，以确定它们是否发挥MASP-2抑制剂的作用。
MASP-2抑制肽的筛选
还可使用分子建模和合理分子设计来产生和筛选模拟MASP-2关键结合区的分子结构并抑制MASP-2的补体活性的肽。用于建模的分子结构包括抗MASP-2单克隆抗体的CDR区，以及已知对MASP-2功能十分重要的目标区域，这些区域包括如前所述的二聚化所需要的区域、涉及结合MBL的区域以及丝氨酸蛋白酶活性部位。用于鉴定结合特定靶的肽的方法是本领域众所周知的。例如，分子印记可用于从头构建大分子结构，诸如结合特定分子的肽。参见例如Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties," TRIP 2(5) 1994。
举例来说，制备MASP-2结合肽模拟物的一种方法如下。使已知MASP-2结合肽或具有MASP-2抑制作用的抗MASP-2抗体的结合区的功能性单体(模板)聚合。然后去除模板，接着在模板留下的空隙中使第二类单体聚合，得到具有类似于模板的一种或多种所需性质的新分子。除了以这种方式制备肽外，还可制备作为MASP-2抑制剂的其它MASP-2结合分子，诸如多糖、核苷、药物、核蛋白、脂蛋白、碳水化合物、糖蛋白、类固醇、脂质和其它生物活性材料。该方法适用于设计各种各样比其天然对应物更稳定的生物学模拟物，因为它们通常是通过功能单体的自由基聚合而成的，产生了具有生物不能降解骨架的化合物。
肽合成
可采用本领域众所周知的技术制备MASP-2抑制肽，诸如最初由Merrifield提出的固相合成技术(Merrifield，J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963)。例如，可根据生产商提供的说明书，使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Foster City, Calif.)实现自动合成。其它技术参见例如Bodanszky, M.,等人,肽合成, 第二版, John Wiley &Sons, 1976，以及本领域技术人员已知的其它参考文献。
还可使用本领域技术人员已知的标准遗传工程改造技术来制备肽。例如，可通过酶的方法将编码肽的核酸插入表达载体中，进行DNA表达，在所需要的氨基酸存在下将DNA翻译成肽，从而来制备肽。然后，使用层析技术或电泳技术将肽纯化，或者通过将编码肽的序列与编码载体蛋白的核酸序列同步插入表达载体中的载体蛋白方法来实现，所述载体蛋白可以与肽融合，随后再从肽上切下来。可采用层析技术、电泳技术或免疫学技术(诸如经载体蛋白的抗体而结合到树脂上)分离蛋白－肽融合物。可使用化学方法或酶方法(例如通过水解酶)来裂解肽。
也可按照常规技术，用重组宿主细胞来生产用于本发明方法的MASP-2抑制肽。为了表达MASP-2抑制肽编码序列，必须将编码肽的核酸分子与控制表达载体转录表达的调节序列可操作连接，然后引入宿主细胞中。除了转录调节序列(诸如启动子和增强子)之外，表达载体可包括翻译调节序列和标记基因，标记基因适合于选择携带表达载体的细胞。
可用“基因仪”并用亚磷酰胺法等方法来合成编码MASP-2抑制肽的核酸分子。如果诸如基因或基因片段合成的应用中需要化学合成的双链DNA，则分别制备每条互补链。短基因(60-80个碱基对)的生产在技术上简单易行，可通过合成互补链，然后将它们退火来实现。对于较长基因的生产来说，要由长度为20-100个核苷酸的单链片段按模块形式装配成合成基因(双链)。有关多核苷酸合成的综述参见例如Glick和Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", ASM Press,1994; Itakura, K.等人, Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; 和Climie, S.等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633, 1990。
小分子抑制剂
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是小分子抑制剂，包括具有低分子量的天然和合成物质，诸如例如肽、肽模拟物和非肽抑制剂(包括寡核苷酸和有机化合物)。MASP-2的小分子抑制剂可根据抗MASP-2抗体的可变区的分子结构而产生。
小分子抑制剂也可根据MASP-2的晶体结构采用计算机药物设计来进行设计和产生(Kuntz I.D.,等人, Science 257:1078, 1992)。已经证实大鼠MASP-2的晶体结构(Feinberg, H.,等人, EMBO J. 22:2348-2359, 2003)。应用Kuntz等描述的方法，将MASP-2晶体结构坐标输入计算机程序(诸如DOCK)，计算机将输出一系列预期结合MASP-2的小分子结构。这些计算机程序的使用为本领域技术人员所众所周知。例如，使用HIV-1蛋白酶抑制剂的晶体结构，通过运用程序DOCK，评价从剑桥晶体学数据库(CambridgeCrystallographic database)中查找到的化合物与酶结合部位的匹配性，来鉴定作为HIV-1蛋白酶抑制剂的独特的非肽配体(Kuntz, I.D.,等人, J. Mol. Biol. 161:269-288,1982; DesJarlais, R.L.,等人, PNAS 87:6644-6648, 1990)。
应用诸如实施例10所述的MASP-2结合测定法来筛选用计算机方法鉴定为潜在的MASP-2抑制剂的一系列小分子结构。然后在诸如实施例2所述的功能测定法中对被确定为结合MASP-2的小分子进行分析，以确定它们是否抑制MASP-2依赖性补体活化。
MASP-2可溶性受体
认为其它合适的MASP-2抑制剂包括MASP-2可溶性受体，可以采用本领域普通技术人员已知技术进行生产。
MASP-2的表达抑制剂
在本发明这个方面的另一个实施方案中，MASP-2抑制剂是能够抑制MASP-2依赖性补体活化的MASP-2表达抑制剂。在本发明这个方面的实施中，代表性的MASP-2表达抑制剂包括MASP-2反义核酸分子(诸如反义mRNA、反义DNA或反义寡核苷酸)、MASP-2核酶以及MASP-2 RNAi分子。
反义RNA和反义DNA分子通过与MASP-2 mRNA杂交并阻止MASP-2蛋白的翻译而起到直接阻断MASP-2 mRNA翻译的作用。反义核酸分子能以许多不同的方式来构建，只要它能够干扰MASP-2的表达。例如，可通过使MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)的编码区(或其部分)相对于其正常转录方向进行反转以供其互补序列转录，从而构建反义核酸分子。
反义核酸分子通常与一个或多个靶基因的至少一部分基本相同。然而，核酸并不需要完全相同以抑制表达。较高的同源性一般可用来对较短反义核酸分子的使用予以补偿。最小的百分比同一性通常约65%以上，但是较高的百分比同一性可对内源序列的表达发挥更有效的阻抑作用。通常优选基本为大约80%以上的较大的百分比同一性，尽管通常最优选约95%至完全相同。
反义核酸分子不需要具有与靶基因相同的内含子或外显子模式，靶基因的非编码区段可能在获得靶基因表达的反义抑制方面与编码区段是等效的。至少大约8个左右核苷酸的DNA序列可用作反义核酸分子，尽管优选较长的序列。在本发明中，有用的MASP-2抑制剂的代表性实例是反义MASP-2核酸分子，该分子与由SEQ ID NO:4所示核酸序列组成的MASP-2 cDNA的互补序列有至少90%同一性。SEQ ID NO:4所示核酸序列编码由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的MASP-2蛋白。
反义寡核苷酸靶向结合MASP-2 mRNA是可用于降低MASP-2蛋白合成水平的另一种机制。例如，多聚半乳糖醛酸酶和蝇蕈碱2型乙酰胆碱受体的合成被针对它们相应mRNA序列的反义寡核苷酸所抑制(Cheng的美国专利号5,739,119和Shewmaker的美国专利号5,759,829)。此外，用核蛋白细胞周期蛋白、多药抗药性基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择蛋白、STK-1、纹状体GABAA受体和人EGF证实了反义抑制的实例(参见例如Baracchini的美国专利号5,801,154；Baker的美国专利号5,789,573；Considine的美国专利号5,718,709；以及Reubenstein的美国专利号5,610,288)。
文献记载了使得普通技术人员能够确定哪些寡核苷酸可用于本发明的系统，包括使用RNA酶H裂解作为转录物中序列可及性的标志来探测靶mRNA的合适部位。Scherr, M.,等人, Nucleic Acids Res. 26:5079-5085, 1998; Lloyd,等人, Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001。将与MASP-2转录物某些区域互补的反义寡核苷酸混合物加到表达MASP-2的细胞提取物(诸如肝细胞)中，进行杂交以产生易受RNA酶H攻击的部位。该方法可以与计算机辅助序列选择相结合，所述计算机辅助的序列选择能够根据序列形成二聚体、发夹结构或其它二级结构的相对能力来预测用于反义组成的最佳序列选择，所述结构可降低或抑制对宿主细胞靶mRNA的特异性结合。可使用OLIGO引物分析软件(Rychlik, I.，1997)和BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul, S.F.,等人, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997)来进行这些二级结构分析和靶部位选择考量。针对靶序列的反义化合物的长度优选包括约8个至约50个核苷酸。特别优选包括约9个至约35个左右核苷酸的反义寡核苷酸。本发明人认为，实施本发明基于反义寡核苷酸的方法极优选范围为9个至35个核苷酸(即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个碱基长度左右的核苷酸)的所有寡核苷酸组成。极优选的MASP-2 mRNA靶区域是位于或邻近AUG翻译起始密码子的区域，以及与mRNA的5’区基本互补的序列，例如MASP 2基因核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的-10和+10区域之间的序列。示例性的MASP-2表达抑制剂见表4。
表4：MASP-2的示例性表达抑制剂
Figure 284510DEST_PATH_IMAGE007
如上所述，本文所用术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体。该术语也包括由天然存在的核苷酸、糖和核苷间(骨架)共价键所组成的那些寡核碱基(oligonucleobase)以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸。这些修饰使得能够引入某些无法通过天然存在的寡核苷酸提供的某些所需性质，诸如毒性降低、抗核酸酶降解的稳定性提高以及细胞摄取增强。在示例性实施方案中，本发明的反义化合物由于磷酸二酯骨架的修饰延长了反义寡核苷酸的寿命而不同于天然DNA，其中磷酸取代基被硫代磷酸酯置换。同样地，寡核苷酸的一端或两端可被一个或多个间插在核酸链内相邻碱基对之间的吖啶衍生物取代。
反义方案的另一替代是使用“RNA干扰”(RNAi)。双链RNA (dsRNA)可在哺乳动物体内引起基因沉默。RNAi的天然功能和共抑制似乎保护基因组不受可移动遗传元件(诸如反转录转座子)以及当其活化时在宿主细胞内产生异常RNA或dsRNA的病毒侵袭(参见例如Jensen, J.,等人, Nat. Genet. 21:209-12, 1999)。可通过合成两条能够形成双链RNA分子的RNA链来制备双链RNA分子，每条链的长度约为19-25 (例如19-23)个核苷酸。例如，用于本发明方法的dsRNA分子可包括相当于表4所列序列及其互补序列的RNA。优选至少一条RNA链具有1-5个核苷酸的3’突出端。合成的RNA链是在形成双链分子的条件下进行组合的。RNA序列可包含SEQ ID NO:4的至少8个核苷酸的部分，总长度为25个核苷酸或以下。特定靶的siRNA序列的设计为本领域普通技术人员所掌握。可获得设计siRNA序列并保证表达有至少70%敲减的商业服务(Qiagen, Valencia, Calif)。
dsRNA可作为药物组合物给予并按已知方法进行，其中核酸被引入所需的靶细胞中。通常使用的基因转移方法包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射和病毒方法。这些方法在Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, Inc., 1993中教导。
也可利用核酶来降低MASP-2的量和/或生物活性，诸如靶向MASP-2 mRNA的核酶。核酶是催化性RNA分子，能够裂解具有与核酶序列完全或部分同源的序列的核酸分子。可以设计核酶转基因，该核酶转基因编码与靶RNA特异性配对并在特定位置裂解磷酸二酯骨架的RNA核酶，从而使靶RNA功能性失活。在进行这种裂解时，核酶本身并无改变，因此能够再循环并裂解其它分子。在反义RNA中包括核酶序列赋予了反义RNA裂解RNA的活性，从而增加了反义构建体的活性。
用于实施本发明的核酶通常包括杂交区和催化区，杂交区至少约9个核苷酸，与至少部分靶MASP-2 mRNA的核苷酸序列互补，催化区适于裂解靶MASP-2 mRNA (一般参见EPANo. 0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J.等人, Nature 334:585-591, 1988; Fedor,M.J.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T.R.等人, Ann. Rev. Biochem.55:599-629, 1986)。
核酶可以掺入核酶序列的RNA寡核苷酸的形式直接靶向细胞，或者作为编码所需要的核酶RNA的表达载体而被引入细胞。可与所述用于反义多核苷酸的大致相同的方式使用并应用核酶。
可通过本领域已知的用于DNA和RNA分子合成的任何方法来制备用于本发明方法的反义RNA和DNA、核酶和RNAi分子。这些方法包括本领域众所周知的用于寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的化学合成技术，诸如固相亚磷酰胺化学合成。或者，可通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录来产生RNA分子。这种DNA序列可被掺入各种各样的载体中，载体中插入了合适的RNA聚合酶启动子(诸如T7或SP6聚合酶启动子)。或者，可将取决于所用启动子而组成型或诱导型合成反义RNA的反义cDNA构建体稳定地引入细胞系中。
可引入各种众所周知的DNA分子修饰，从而增加稳定性和半衰期。有用的修饰包括但不限于将核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸侧翼序列加到分子的5’端和/或3’端，或者在寡脱氧核糖核苷酸骨架内使用硫代磷酸酯或2’ O-甲基而不是磷酸二酯键。
V. 药物组合物和递送方法
给药
在另一个方面，本发明提供用于抑制患有本文所述的疾病或病况的受试者中MASP2依赖性补体活化的副作用的组合物，其包括将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学可接受的载体的组合物给予受试者。可以治疗或改善MASP-2依赖性补体活化相关疾病的治疗有效剂量，将MASP-2抑制剂给予需要其的受试者。治疗有效剂量是指MASP-2抑制剂足以导致改善与疾病或病况相关的症状的量。
可通过标准药学方法，使用实验动物模型(诸如实施例1中所述的表达人MASP-2转基因的鼠MASP-2 -/-小鼠模型)，来测定MASP-2抑制剂的毒性和治疗功效。使用这些动物模型，可使用标准方法来确定NOAEL (无观察的副作用水平)和MED (最小有效剂量)。NOAEL/MED效应之间的剂量比是治疗比率，用NOAEL/MED比率表示。最优选的是治疗比率或指数高的MASP-2抑制剂。从细胞培养物分析和动物研究中获得的数据可用来配制用于人体的剂量范围。MASP-2抑制剂的剂量优选在循环浓度的范围之内，包括几乎无毒性或没有毒性的MED。剂量可在这个范围内变化，这取决于所采用的剂型和所使用的给药途径。
在一些实施方案中，MASP-2抑制剂用于治疗、抑制、减轻或预防患有或有风险发生由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的哺乳动物受试者的纤维化的治疗功效通过以下一项或多项确定：肾组织中炎症和瘢痕形成的一种或多种标志物(例如，TGFβ-1、CTFF、IL-6、细胞凋亡、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、EMT、浸润巨噬细胞)的减少；炎症和纤维化肾疾病的可溶性标志物释放至尿液和血浆减少(例如，通过测量肾排泄功能)。
对于任何化合物制剂来说，可使用动物模型来评价治疗有效剂量。例如，可在动物模型中配制达得包括MED在内的循环血浆浓度范围的剂量。也可通过例如高效液相层析法来测定血浆中MASP-2抑制剂的定量水平。
除了毒性研究之外，也可根据有生命的受试者中存在的MASP-2蛋白的量以及MASP-2抑制剂的结合亲和力来估计有效剂量。已经证实正常受试人体血清中存在的MASP-2水平在500 ng/ml低水平范围内，可使用MASP-2定量测定法来测定具体受试者的MASP-2水平(描述于Moller-Kristensen M.,等人, J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003)。
包含MASP-2抑制剂的组合物的给予剂量一般根据受试者年龄、体重、身高、性别、总体医学状况和病史而变化。举例来说，可在大约0.010-10.0 mg/kg、优选0.010-1.0 mg/kg、更优选0.010-0.1 mg/kg受试者体重的剂量范围内给予MASP-2抑制剂，诸如抗MASP-2抗体。在某些实施方案中，所述组合物包含抗MASP-2抗体和MASP-2抑制肽的组合。
可根据本领域技术人员众所周知的补体测定法来测定特定受试者的本发明MASP-2抑制剂组合物和方法的治疗功效以及合适的剂量。补体产生多种特定的产物。在最近的十年间，已经研发出灵敏且特异性的测定法，而且大多数的这类活化产物都是市售的，包括小的活化片段C3a、C4a和C5a和大的活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b-9。大多数的这类测定法都利用了与暴露在片段而不是暴露在其所形成的天然蛋白上的新抗原(new antigen/neoantigen)起反应的单克隆抗体，这使得这些测定法非常简单而特异性。大多数都依赖于ELISA技术，尽管有时放射免疫测定法仍用于C3a和C5a。放射免疫测定法测定未经加工的片段及其“desArg”片段，这些片段是存在于循环中的主要形式。未经加工的片段和C5adesArg通过结合细胞表面受体而被迅速清除掉，因而以极低浓度存在，而C3adesArg则不结合细胞，只在血浆中聚积。测定C3a提供了补体活化灵敏的、不依赖途径的标志。可通过测定Bb片段来评价替代途径活化。检测膜攻击途径活化的液相产物sC5b-9，提供了补体被完全激活的证据。因为凝集素途径和经典途径都产生同样的活化产物C4a和C4d，所以测定这两种片段并不提供有关这两条途径中哪一条途径产生了活化产物的任何信息。
MASP-2依赖性补体活化抑制的特征在于补体系统成分的至少一种以下的变化，所述变化是由于根据本发明的方法给予MASP-2抑制剂所致：MASP-2依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9 (MAC)形成或产生的抑制(例如按实施例2所述测量)、C4裂解和C4b沉积的减少(例如按实施例10所述测量)，或者C3裂解和C3b沉积的减少(例如按实施例10所述测量)。
其它药剂
在某些实施方案中，预防、治疗、逆转和/或抑制纤维化和/或炎症的方法包括给予MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)作为治疗方案的一部分，以及适合于抑制纤维化和/或炎症的一种或多种其它药物、生物制品或治疗干预。在某些实施方案中，其它药物、生物制品或治疗干预适合与由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症有关的特定症状。例如，MASP-2抑制性抗体可作为治疗方案的一部分连同一种或多种免疫抑制剂例如甲氨蝶呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤和霉酚酸酯给予。另外例如，MASP-2抑制性抗体可作为治疗方案的一部分连同经设计增加血流的一种或多种药剂(例如，硝苯地平、氨氯地平、地尔硫卓、非洛地平或尼卡地平)给予。另外例如，MASP-2抑制性抗体可作为治疗方案的一部分连同预期减少纤维化的一种或多种药剂、例如d-青霉胺、秋水仙碱、PUVA、松弛素、环孢霉素、TGFβ阻断剂和/或p38 MAPK阻断剂给予。另外例如，MASP-2抑制性抗体可作为治疗方案的一部分连同类固醇或支气管扩张药给予。
包含MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)的组合物和方法可任选包含一种或多种另外的治疗剂，其可增强MASP-2抑制剂的活性或其以加成或协同方式提供相关的治疗功能。例如，在治疗患有由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的受试者的情况下，一种或多种MASP-2抑制剂可与一种或多种另外的抗纤维化剂和/或一种或多种抗-炎性和/或免疫抑制剂组合给予(包括共-给予)。
MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)可与其它治疗剂例如一般性的免疫抑制性药物例如皮质类固醇、免疫抑制性或细胞毒性剂和/或抗纤维化剂组合使用。
药物载体和递送媒介物
一般而言，本发明的MASP-2抑制剂组合物当与任何其它所选的治疗药物联用时，适合于包含在药学可接受的载体中。载体是无毒的、生物相容的，其选择不得对MASP-2抑制剂(以及与其联用的任何其它治疗药物)的生物活性产生不利的影响。肽的示例性药学可接受的载体描述于Yamada的美国专利号5,211,657。用于本发明的抗MASP-2抗体和抑制肽可以配制成固体、半固体、凝胶、液体或气体形式制剂，诸如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂(depositories)、吸入剂和注射剂，供口服、胃肠外或外科手术给药。本发明还包括通过涂敷医疗装置等局部给予组合物。
用于通过注射、输注或冲洗和局部递送的胃肠外递送的合适载体包括蒸馏水、磷酸缓冲生理盐水、标准林格氏液或乳酸盐林格氏液、葡萄糖溶液、Hank氏溶液或丙二醇。此外，无菌不挥发油可用作溶剂或悬浮介质。对于此目的，可采用任何生物相容性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(诸如油酸)用于注射剂的制备中。可将载体和药物配制成为液体制剂、混悬剂、可聚合或不可聚合的凝胶剂、糊剂或药膏。
载体也可包括递送媒介物以使药物递送持续(即延长、延缓或调节)，或者增强治疗药物的递送、吸收、稳定性或药代动力学特征。这种递送媒介物可包括但不限于以下实例：由蛋白质、脂质体、碳水化合物、合成有机化合物、无机化合物、聚合水凝胶或共聚水凝胶和聚合物胶束组成的微粒、微球、纳米球或纳米粒。合适的水凝胶和胶束递送系统包括WO2004/009664 A2中公开的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物以及美国专利申请公开号2002/0019369 A1中公开的PEO和PEO/环糊精复合物。这些水凝胶可局部注射到期望起效部位，或者皮下或肌内注射以形成缓释贮库。
对于关节内递送，MASP-2抑制剂可被装载于上述可注射的液体或凝胶载体、上述可注射的缓释递送媒介物、或者透明质酸或透明质酸衍生物中。
对于非肽能药物的口服给药，MASP-2抑制剂可装载于惰性填充剂或稀释剂中，诸如蔗糖、玉米淀粉或纤维素中。
对于局部给药，MASP-2抑制剂可装载于软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体制剂或粉剂中或者经由透皮贴剂的凝胶或微胶囊递送系统中。
各种经鼻和经肺的递送系统正在研发中，包括气溶胶、定量吸入器、干粉吸入器和雾化吸入器，可分别合适地适于递送气溶胶、吸入剂或雾化递送媒介物中的本发明药物。
对鞘内(IT)或脑室内(ICV)递送，合适的无菌递送系统(例如液体制剂；凝胶剂、混悬剂等)可用来给予本发明的药物。
本发明的组合物还可包括生物相容性赋形剂，诸如分散剂或润湿剂、悬浮剂、稀释剂、缓冲剂、渗透促进剂、乳化剂、粘合剂、增稠剂、矫味剂(用于口服给药)。
抗体和肽的药物载体
更具体地讲，至于抗MASP-2抗体和抑制肽，可以按注射剂量的所述化合物的溶液剂或混悬剂经胃肠外给予示例性剂型，所述化合物包含在生理上可接受的稀释剂与药物载体内，药物载体可以是无菌液体，诸如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，包含抗MASP-2抗体和抑制肽的组合物中可存在辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的额外组分包括油脂(诸如动物、植物或合成来源的油脂)，例如大豆油和矿物油。一般而言，二元醇诸如丙二醇或聚乙二醇是优选的注射溶液剂的液体载体。
还能以长效注射剂或植入制剂的形式给予抗MASP-2抗体和抑制肽，这些制剂可按允许活性剂缓释或脉冲释放的方式来配制。
表达抑制剂的药学可接受的载体
更具体地讲，至于用于本发明方法的表达抑制剂，提供包含上述表达抑制剂和药学可接受的载体或稀释剂的组合物。组合物还可包含胶体分散体系。
包括表达抑制剂的药物组合物可包括但不限于溶液剂、乳剂和含有脂质体的制剂。这些组合物可由各种组分制备，所述组分包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。这些组合物的制备通常包括将表达抑制剂与一种或多种以下的成分相混合：缓冲剂、抗氧化剂、低分子量多肽、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(诸如EDTA)、谷胱甘肽以及其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或者与非特异性血清白蛋白混合的盐水是合适稀释剂的实例。
在一些实施方案中，组合物可被制备和配制成乳剂，乳剂通常是一种液体以液滴形式分散在另一种液体中的非均相系统(参见Idson,载于Pharmaceutical Dosage Forms,第一卷, Rieger和Banker (主编), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988)。用于乳剂制剂的天然存在的乳化剂的实例包括阿拉伯树胶、蜂蜡、羊毛脂、卵磷脂和磷脂。
在一个实施方案中，包括核酸的组合物可配制成微乳剂。本文所用的微乳剂是指水、油和两亲物的系统，它是单一的光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见Rosoff载于Pharmaceutical Dosage Forms, 第一卷)。本发明的方法也可使用脂质体来将反义寡核苷酸转移和递送到所需要的部位。
用于局部给药的表达抑制剂的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体制剂和粉剂。可以使用常规药物载体以及水性基质、粉末基质或油性基质和增稠剂等等。
给药方式
可以多种方式给予包含MASP-2抑制剂的药物组合物，这取决于是局部还是全身性给药方式最适于待治疗的疾病。此外，本发明的组合物可通过将组合物涂布或掺入可植入的医疗装置上面或里面而递送。
全身性递送
本文所用术语“全身性递送”和“全身性给药”是指包括但不限于口服和胃肠外途径，包括肌内(IM)、皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、口腔、局部、经皮、经鼻、直肠、阴道和其它给药途径，它们将所递送的药物有效地分散到预期治疗作用的一个或多个部位。用于本发明的全身性递送的优选途径包括静脉内、肌内、皮下和吸入。应当理解的是，对于用于本发明具体组合物中所选用的药物，确切的全身性给药途径将部分地考虑药物对与特定给药途径相关的代谢转化途径的敏感性加以确定。例如，肽能药物可能最适于通过口服以外的途径给予。
可通过任何合适的方法将MASP-2抑制抗体和多肽递送到需要其的受试者中。递送MASP-2抗体和多肽的方法包括经口服、肺部、胃肠外(例如肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(诸如经由微细粉制剂)、经皮、经鼻、阴道、直肠或者舌下给药途径而给予，可将其配制成适于各自给药途径的剂型。
举例来说，可以通过将MASP-2抑制抗体和肽应用到能够吸收多肽的身体膜上，例如鼻膜、胃肠膜和直肠膜，而将其引入活体内。通常将多肽和渗透促进剂一起应用到可吸收膜上(参见例如Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee,V.H.L., J. Controlled Release13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G.等人, J. Controlled Release 13:241, 1990)。例如，STDHF是梭链孢酸的合成衍生物，是结构上类似于胆盐的甾类表面活性剂，已被用作经鼻递送的渗透促进剂。(Lee, W.A., Biopharm.22，1990年11/12月)。
可以引入与其它分子(诸如脂质)结合的MASP-2抑制抗体和多肽，以保护多肽不被酶降解。例如，聚合物、尤其是聚乙二醇(PEG)的共价结合已被用来保护某些蛋白质不被体内的酶水解，从而延长半衰期(Fuertges, F.,等人, J. Controlled Release 11:139,1990)。已经报道了许多用于蛋白质递送的聚合物系统(Bae, Y.H.等人, J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R.等人, Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I.等人,J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I.等人, J. Controlled Release 10:195,1989; Asano, M.等人, J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J.等人,J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235,1990; Takakura, Y.等人, J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y.等人, J. Pharm. Sci. 78:219, 1989)。
最近，开发出血清稳定性和循环半衰期得到改进的脂质体(参见例如Webb的美国专利号5,741,516)。而且，对脂质体和脂质体样制备物作为可能的药物载体的各种方法进行了综述(参见例如Szoka的美国专利号5,567,434；Yagi的美国专利号5,552,157；Nakamori的美国专利号5,565,213；Shinkarenko的美国专利号5,738,868以及Gao的美国专利号5,795,587)。
对于经皮应用，可将MASP-2抑制抗体和多肽与其它合适的成分(诸如载体和/或佐剂)组合。对这些其它成分的性质没有限制，除了对于其期望给药来说必须是药学可接受的，并且不能降低组合物中活性成分的活性。合适媒介物的实例包括含或不含纯化胶原的软膏、乳膏、凝胶或混悬液。MASP-2抑制抗体和多肽也可被浸渍到透皮贴剂、膏药和绷带中，优选液体或半液体形式。
可以在为维持治疗效果所需水平而确定的间隔的周期性基础上，全身性给予本发明的组合物。例如，可按每2-4周或者以更低频率的间隔给予组合物(诸如经皮下注射)。剂量方案将由医师考虑可能影响药物联用的作用的各种因素来确定。这些因素可包括待治疗疾病的进展程度、患者年龄、性别和体重和其它临床因素。各独立药物成分的剂量将随组合物中所包含的MASP-2抑制剂以及任何药物递送媒介物(例如缓释递送媒介物)的存在和性质而变化。此外，可在考虑给药频率和所递送药物的药代动力学特征的变化后对剂量进行调整。
局部递送
本文所用术语“局部”包括药物在预定的局限性作用部位上或其周围的应用，可包括例如局部递送到皮肤或其它受累组织；眼递送；鞘内(IT)、脑室内(ICV)、关节内、腔内、颅内或肺泡内给予、安置或冲洗。可优选能够给予低剂量的局部给药以避免全身性副作用，以及更精确地控制递送时机和局部递送部位的活性剂浓度。不论患者之间在新陈代谢、血流等方面的变化，局部给药都在目标部位获得已知浓度。通过直接递送方式还使剂量控制得到改进。
MASP-2抑制剂的局部递送可在用于治疗由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的手术方法的情况下，例如在程序例如手术期间实现。
治疗方案
在预防性应用中，将包含MASP-2抑制剂(例如，MASP-2抑制性抗体)的药物组合物给予对由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症敏感或否则有风险发生由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的受试者，其量足以抑制纤维化和/或炎症，从而消除或减少发生所述病况的症状的风险。在一些实施方案中，药物组合物以治疗有效量给予怀疑或已经患有由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的受试者，该量足以减轻或至少部分地减少所述病况的症状。在预防兼治疗方案中，包含MASP-2抑制剂的组合物可以数次剂量给予，直到在受试者中实现足够的治疗结果。本发明的MASP-2抑制性组合物的给药可通过单次给予组合物，或有限次顺序给予进行，以治疗与纤维化和/或炎症有关的急性病况。或者，组合物可在长期时间内以定期时间间隔给予，以治疗与纤维化和/或炎症有关的慢性病况。
在预防兼治疗方案中，可以以若干剂量给予包含MASP-2抑制剂的组合物，直到在受试者中获得充分的治疗结果。在本发明的一个实施方案中，MASP-2抑制剂包含MASP-2抗体，其可以合适地以以下剂量给予成年患者(例如，70 kg的平均成人体重)：0.1 mg至10,000 mg、更合适地1.0 mg至5,000 mg、更合适地10.0 mg至2,000 mg、更合适地10.0 mg至1,000 mg和仍更合适地50.0 mg至500 mg。对于儿童患者，剂量可以与患者重量按比例调整。可通过组合物的单次给药或有限的连续给药，来施用本发明的MASP-2抑制剂组合物以治疗患有或有风险发生由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的受试者。或者，可在延长的时间期间以定期时间间隔(诸如每天、每周两次、每周、每隔一周、每月或每两月)给予组合物，用于治疗患有或有风险发生由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的受试者。
在预防兼治疗方案中，包含MASP-2抑制剂的组合物可以数次剂量给予，直到在受试者中实现足够的治疗结果。
在一些实施方案中，通过确定受试者具有受损的肾功能的一种或多种症状，受试者经鉴定处于发生由纤维化或炎症引起或加重的疾病或病症的风险中，如例如通过测量血清肌酸酐水平、血清肌酸酐清除率、血尿素氮水平、尿中的蛋白和/或通过测量与肾疾病或损伤有关的一种或多种生物标志物评价。
用于评价肾功能的方法是本领域众所周知的，和包括但不限于测量全身和肾小球毛细血管血压、蛋白尿(例如，白蛋白尿)、微观和肉眼可见的血尿、血清肌酸酐水平(例如，一个用于估计人的肾功能的公式将2.0 mg/dl的肌酸酐水平等同于50%的正常肾功能，和4.0 mg/dl等同于25%)、肾小球滤过率(例如，肌酸酐清除率)的下降和管损伤的程度。例如，肾功能的评估可包括使用生物学和/或生理学参数例如血清肌酸酐水平、肌酸酐清除率、24小时尿蛋白分泌、肾小球滤过率、尿白蛋白肌酸酐比率、白蛋白分泌速率和肾活检(例如，通过测量胶原和/或纤连蛋白的沉积，确定肾纤维化的程度)，评价至少一种肾功能。
具体实施方式
本发明还涉及以下实施方案：
1. 用于在患有或有风险发生由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症的哺乳动物受试者中治疗、抑制、减轻或预防纤维化的方法，包括给予受试者有效抑制纤维化的量的MASP-2抑制剂。
2. 实施方案1的方法，其中MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
3. 实施方案2的方法，其中MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:6的一部分的MASP-2单克隆抗体或其片段。
4. 实施方案2的方法，其中MASP-2抗体或其片段以其结合补体系统中的不同抗原至少10倍的亲和力特异性结合包含SEQ ID NO:6的多肽。
5. 实施方案2的方法，其中抗体或其片段选自重组抗体、具有减少的效应子功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
6. 实施方案1的方法，其中MASP-2抑制剂选择性地抑制凝集素途径补体活化，而不显著抑制C1q-依赖性补体活化。
7. 实施方案1的方法，其中MASP-2抑制剂经皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内或作为吸入剂给予。
8. 实施方案1-7中任一项的方法，其中由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症与缺血性再灌注损伤有关。
9. 实施方案1-7中任一项的方法，其中由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症与缺血性再灌注损伤无关。
10. 实施方案1-7中任一项的方法，其中在给予MASP-2抑制剂之前受试者显示蛋白尿，和MASP-2抑制剂的给予降低受试者的蛋白尿。
11. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由肾纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症。
12. 实施方案11的方法，其中MASP-2抑制剂以有效抑制小管间质性纤维化的量给予。
13. 实施方案11的方法，其中MASP-2抑制剂以有效减少、延迟或消除受试者的透析需要的量给予。
14. 实施方案11的方法，其中所述疾病或病症选自慢性肾疾病、慢性肾衰竭、肾小球疾病(例如，局灶性节段性肾小球硬化)、免疫复合病症(例如，IgA肾病、膜性肾病)、狼疮性肾炎、肾病综合征、糖尿病肾病、小管间质性损伤和肾小球性肾炎(例如，C3肾小球病)。
15. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由肺纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症。
16. 实施方案15的方法，其中所述疾病或病症选自慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、与硬皮病有关的肺纤维化、支气管扩张和肺动脉高压。
17. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由肝纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症。
18. 实施方案17的方法，其中所述疾病或病症选自肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(脂肪性肝炎)、继发于酒精滥用的肝脏纤维化、继发于急性或慢性肝炎的肝脏纤维化、胆疾病和毒性肝损伤(例如，归因于由对乙酰氨基酚或其它药物、例如肾毒素引起的药物诱导的肝损伤的肝毒性)。
19. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由心脏纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症。
20. 实施方案19的方法，其中所述疾病或病况选自心脏纤维化、心肌梗塞、瓣膜纤维化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)。
21. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由血管纤维化引起或加重的疾病或病症。
22. 实施方案21的方法，其中所述疾病或病症选自血管疾病、动脉粥样硬化性血管疾病、血管狭窄、再狭窄、血管炎、静脉炎、深部静脉血栓形成和腹主动脉瘤。
23. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由皮肤的纤维化引起或加重的疾病或病症。
24. 实施方案23的方法，其中所述疾病或病症选自过度伤口愈合、硬皮病、全身性硬化、瘢痕瘤、结缔组织病、瘢痕形成和肥厚性瘢痕。
25. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由关节的纤维化引起或加重的疾病或病症。
26. 实施方案25的方法，其中所述疾病或病症是关节纤维化。
27. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由中枢神经系统的纤维化引起或加重的疾病或病症。
28. 实施方案27的方法，其中所述疾病或病症选自中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤。
29. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由消化系统的纤维化引起或加重的疾病或病症。
30. 实施方案29的方法，其中所述疾病或病症选自克罗恩病、胰脏纤维化和溃疡性结肠炎。
31. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由眼纤维化引起或加重的疾病或病症。
32. 实施方案31的方法，其中所述疾病或病症选自前囊下白内障、后囊乳浊、黄斑变性和视网膜和玻璃体视网膜病。
33. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由肌肉骨骼的骨或软组织结构的纤维化引起或加重的疾病或病症。
34. 实施方案33的方法，其中所述疾病或病症选自与囊性纤维化有关的骨质疏松和/或骨质减少、具有骨纤维化增加的骨髓发育不良病况、粘连性囊炎、杜普伊特伦氏挛缩和骨髓纤维化。
35. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有由生殖器官的纤维化引起或加重的疾病或病症。
36. 实施方案35的方法，其中所述疾病或病症选自子宫内膜异位和佩伦涅氏病。
37. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有引起纤维化和/或炎症的慢性感染性疾病。
38. 实施方案37的方法，其中所述感染性疾病选自α病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、结核病、HIV和流感。
39. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有引起纤维化和/或炎症的自身免疫性疾病。
40. 实施方案39的方法，其中所述自身免疫性疾病选自硬皮病和系统性红斑狼疮(SLE)。
41. 实施方案1-7中任一项的方法，其中受试者患有与创伤有关的瘢痕形成。
42. 实施方案41的方法，其中与创伤有关的瘢痕形成选自手术并发症(例如，手术粘连，其中瘢痕组织可在内脏器官之间形成，导致挛缩、疼痛，并可导致不育)、化学治疗药物诱导的纤维化、辐射诱导的纤维化和与烧伤有关的瘢痕形成。
43. 实施方案1-7中任一项的方法，其中由纤维化和/或炎症引起或加重的疾病或病症选自器官移植、乳房纤维化、肌肉纤维化、腹膜后纤维化、甲状腺纤维化、淋巴结纤维化、膀胱纤维化和胸膜纤维化。
44. 在患有与蛋白尿有关的疾病或病况的受试者中预防或减少肾损伤的方法，包括给予有效减少或预防受试者的蛋白尿的量的MASP-2抑制剂。
45. 实施方案44的方法，其中MASP-2抑制剂是MASP-2抑制性抗体或其片段。
46. 实施方案44或45的方法，其中MASP-2抑制剂以与治疗前的基线24小时尿蛋白分泌相比有效实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少的量和时间给予。
47. 实施方案44-46中任一项的方法，其中与蛋白尿有关的疾病或病况选自肾病综合征、先兆子痫、子痫、肾的中毒性损害、淀粉样变、胶原血管疾病(例如，系统性红斑狼疮)、脱水、肾小球疾病(例如，膜性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎、C3肾小球病、微小病变疾病、脂性肾病)、大强度运动、应激、良性直立位(体位)蛋白尿、局灶性节段性肾小球硬化、IgA肾病(即，贝格尔氏病)、IgM肾病、膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾病、微小病变疾病、结节病、阿尔波特氏综合征、糖尿病(糖尿病肾病)、药物诱导的毒性(例如，NSAIDS、尼古丁、青霉胺、碳酸锂、金和其它重金属、ACE抑制剂、抗生素(例如，阿霉素)或阿片制剂(例如，海洛英)或其它肾毒素)；法布里氏病、感染(例如，HIV、梅毒、甲、乙或丙型肝炎、链球菌后感染、尿路血吸虫病)；氨基酸尿症、范科尼综合征、高血压肾硬化、间质性肾炎、镰状细胞病、血红蛋白尿、多发性骨髓瘤、肌红蛋白尿、器官排斥(例如，肾移植排斥)、埃博拉出血热、甲髌综合征、家族性地中海热、HELLP综合征、系统性红斑狼疮、韦格纳氏肉芽肿病、类风湿性关节炎、糖原贮积病1型、古德帕斯彻氏综合征、过敏性紫癜、已扩散到肾的尿路感染、斯耶格伦氏综合征和感染后肾小球性肾炎。
48. 实施方案44-46中任一项的方法，其中与蛋白尿有关的疾病或病况是IgA肾病(即，贝格尔氏病)。
49. 实施方案44-46中任一项的方法，其中与蛋白尿有关的疾病或病况是膜性肾病。
50. 抑制慢性肾疾病的进展的方法，包括给予有效减少或预防有需要的受试者的小管间质性纤维化的量的MASP-2抑制剂。
51. 实施方案50的方法，其中MASP-2抑制剂是MASP-2抑制性抗体或其片段。
52. 实施方案50的方法，其中有需要的受试者在给予MASP-2抑制剂之前显示蛋白尿，和给予MASP-2抑制剂降低受试者的蛋白尿，使得与治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比，受试者具有24小时尿蛋白分泌至少20%减少。
53. 实施方案50的方法，其中MASP-2抑制剂以有效减少、延迟或消除受试者的透析需要的量给予。
54. 在受试者中保护肾免于肾损伤的方法，所述受试者已经历、正在经历或将经历用一种或多种肾毒性剂治疗，包括给予有效预防或改善药物诱导的肾病的发生率的量的MASP-2抑制剂。
55. 实施方案54的方法，其中MASP-2抑制剂是MASP-2抑制性抗体或其片段。
56. 实施方案54的方法，其中MASP-2抑制剂在所述肾毒性剂之前给予。
57. 实施方案54的方法，其中MASP-2抑制剂与所述肾毒性剂同时共-给予。
58. 实施方案54的方法，其中MASP-2抑制剂在所述肾毒性剂之后给予以治疗肾毒性。
59. 治疗患有免疫球蛋白A肾病(IgAN)的人受试者的方法，包括给予受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。
60. 实施方案59的方法，其中所述受试者患有类固醇依赖性IgAN。
61. 实施方案59或60的方法，其中MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。
62. 实施方案59-61中任一项的方法，其中抗体或其片段选自重组抗体、具有减少的效应子功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
63. 实施方案59-62中任一项的方法，其中MASP-2抑制性抗体不显著抑制经典途径。
64. 实施方案59-63中任一项的方法，其中MASP-2抑制性抗体以30 nM或更小的IC50在90%人血清中抑制C3b沉积。
65. 实施方案59的方法，其中所述方法进一步包括在给予受试者包含有效改进肾功能的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前，鉴定具有类固醇依赖性IgAN的人受试者。
66. 实施方案59-65中任一项的方法，其中MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以有效改进肾功能的量给予。
67. 实施方案66的方法，其中MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以与治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少的有效量和足够时间给予。
68. 实施方案59的方法，其中组合物以足以在所述受试者中改进肾功能和减少皮质类固醇剂量的量给予。
69. 实施方案59-68中任一项的方法，其中MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
70. 治疗患有膜性肾病(MN)的人受试者的方法，包括给予受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物。
71. 实施方案70的方法，其中受试者患有类固醇依赖性MN。
72. 实施方案70或71的方法，其中MASP-2抑制性抗体是特异性结合人MASP-2的单克隆抗体或其片段。
73. 实施方案70-72中任一项的方法，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、具有减少的效应子功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
74. 实施方案70-73中任一项的方法，其中MASP-2抑制性抗体不显著抑制经典途径。
75. 实施方案70-74中任一项的方法，其中MASP-2抑制性抗体以30 nM或更小的IC50在90%人血清中抑制C3b沉积。
76. 实施方案70的方法，其中所述方法进一步包括在给予受试者包含有效改进肾功能的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前，鉴定具有类固醇依赖性MN的人受试者。
77. 实施方案70-76中任一项的方法，其中MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以有效改进肾功能的量给予。
78. 实施方案77的方法，其中MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段以与治疗前受试者的基线24小时尿蛋白分泌相比实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少的有效量和足够时间给予。
79. 实施方案70或71的方法，其中组合物以足以在所述受试者中改进肾功能和减少皮质类固醇剂量的量给予。
80. 实施方案70-79中任一项的方法，其中MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
VI. 实施例
下面的实施例仅举例说明目前预期的用于实施本发明的最佳方式，但是不应解释为限制本发明。本文所引用的所有文献都通过引用并入本文。
实施例1
本实施例描述了缺乏MASP-2 (MASP-2-/-)但MAp19充足(MAp19+/+)的小鼠品系的产生。
材料与方法：设计靶向载体pKO-NTKV 1901来破坏编码鼠MASP-2 C端的三个外显子，包括编码丝氨酸蛋白酶结构域的外显子，见图3。使用PKO-NTKV 1901转染鼠ES细胞系E14.1a (SV129 Ola)。选出新霉素抗性和胸苷激酶敏感的克隆。筛选出600个ES克隆，在其中鉴定出4个不同克隆，通过Southern印迹证实含有预期选择的靶向事件(targetingevent)和重组事件，见图3。通过胚胎转移由这4个阳性克隆产生嵌合体。然后将嵌合体在遗传背景C57/BL6下回交以产生转基因雄性鼠。将转基因雄性鼠与雌性鼠杂交产生F1，50%的后代显示出MASP-2基因被破坏的杂合性。将杂合小鼠互交以产生纯合的MASP-2缺陷型后代，按1:2:1的比例分别产生杂合小鼠和野生型小鼠。
结果和表型：发现所产生的纯合MASP-2-/-缺陷型小鼠是可存活和能育的，通过Southern印迹证实缺乏MASP-2，从而确认了正确的靶向事件，经Northern印迹证实缺乏MASP-2 mRNA，经Western印迹证实缺乏MASP-2蛋白(数据未显示)。使用时间分辨RT-PCR在LightCycler机上进一步证实了存在MAp19 mRNA，缺乏MASP-2 mRNA。MASP-2-/-小鼠确实如预期那样继续表达MAp19、MASP-1和MASP-3 mRNA及蛋白质(数据未显示)。通过LightCycler分析对MASP-2-/-小鼠中备解素、因子B、因子D、C4、C2和C3的mRNA的存在和丰度进行了评价，发现与野生型同窝小鼠对照中的相同(数据未显示)。来自纯合MASP-2-/-小鼠的血浆完全缺乏凝集素途径介导的补体活化，如实施例2进一步描述的。
在纯的C57BL6背景下产生MASP-2-/-品系：将MASP-2-/-小鼠与纯C57BL6品系回交9代后，将MASP-2-/-品系用作实验动物模型。
作为鼠MASP-2-/-、MAp19+/+且表达人MASP-2转基因(鼠MASP-2敲除和人MASP-2敲入)的转基因小鼠品系也生成如下：
材料与方法：构建包括人MASP 2基因启动子区并编码人MASP-2的小基因(SEQ IDNO:49)，称为“mini hMASP-2”，见图4，它包括前3个外显子(外显子1至外显子3)，接着是代表随后8个外显子的编码序列的cDNA序列，从而编码由其内源启动子驱动的全长MASP-2蛋白。将mini hMASP-2构建体注射到MASP-2-/-的受精卵中，以便通过转基因表达人MASP-2来代替缺陷的鼠MASP 2基因。
实施例2
本实施例证实MASP-2是经由凝集素途径进行补体活化所必需的。
方法与材料：
凝集素途径特异性C4裂解测定法：C4裂解测定法记载于Petersen,等人, J. Immunol. Methods 257:107 (2001)，该测定法测定了由来自金黄色葡萄球菌、结合L-纤维胶凝蛋白的脂磷壁酸(LTA)所产生的凝集素途径活化。对Petersen等人, (2001)中所述测定法进行了改进，通过用LPS和甘露聚糖或酵母聚糖包被板后，加入得自MASP-2 -/-小鼠的血清，来测定由MBL引起的凝集素途径活化，如下文所述。还对该测定法进行了改进以消除由经典途径所致的C4裂解的可能性。这通过使用含有1 M NaCl的样品稀释缓冲液来实现，这使得凝集素途径识别组分以高亲和力结合它们的配体，却又阻止了内源C4的活化，从而通过使C1复合物解离而排除了经典途径的参与。简单地说，在改进的测定法中，将血清样品(稀释于高盐(1 M NaCl)缓冲液中)加入到配体包被板上，接着加入缓冲液(具有生理浓度的盐)中的恒量纯C4。含有MASP-2的结合识别复合物裂解C4而引起C4b沉积。
测定方法：
1) 用稀释于包被缓冲液(15 mM Na2CO3，35 mM NaHCO3，pH 9.6)的1 µg/ml甘露聚糖(M7504 Sigma)或任何其它配体(例如诸如下列配体)，来包被Nunc Maxisorb微量滴定板(Maxisorb®，Nunc, 目录号442404，Fisher Scientific)。
下列试剂用于本测定法中：
a.甘露聚糖(1 µg/孔甘露聚糖(M7504 Sigma)，于100 µl包被缓冲液中)；
b.酵母聚糖(1 µg/孔酵母聚糖(Sigma)，于100 µl包被缓冲液中)；
c.LTA (1µg/孔，于100 µl包被缓冲液中，或者2 µg/孔，于20 µl甲醇中)；
d.1 µg H-纤维胶凝蛋白特异性Mab 4H5，于包被缓冲液中；
e.来自浅绿气球菌(Aerococcus viridans)的PSA (2 µg/孔，于100 µl包被缓冲液)；
f.100 µl/孔福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233 (OD550=0.5)，于包被缓冲液中。
2) 将板在4℃下孵育过夜。
3) 过夜孵育后，通过将板与0.1% HSA-TBS封闭缓冲液(0.1% (重量/体积) HSA的10 mM Tris-HCl、140 mM NaCl、1.5 mM NaN3溶液(pH 7.4))孵育1-3小时后，然后用TBS/吐温(tween)/Ca2+(含0.05%吐温20和5 mM CaCl2、1 mM MgCl2的TBS (pH 7.4))洗板3次，从而使剩余蛋白结合位点饱和。
4) 将待测试的血清样品稀释于MBL结合缓冲液(1 M NaCl)中，将稀释的样品加到板上，4℃下孵育过夜。只加缓冲液的孔用作阴性对照。
5) 在4℃下孵育过夜之后，将该板用TBS/吐温/Ca2+洗涤3次。然后将人C4 (100 µl/孔，1 µg/ml稀释于BBS (4 mM巴比妥，145 mM NaCl，2 mM CaCl2，1 mM MgCl2，pH 7.4)中)加到板上，在37℃下孵育90分钟。该板用TBS/吐温/Ca2+再洗涤3次。
6) 用碱性磷酸酶缀合的鸡抗人C4c (以1:1000稀释于TBS/吐温/Ca2+中)来检测C4b沉积，将其加到板上，在室温下孵育90分钟。然后该板用TBS/吐温/Ca2+洗涤3次。
7) 通过加入100 µl磷酸对硝基苯酯底物溶液来检测碱性磷酸酶，在室温下孵育20分钟，在微量滴定板读板仪上读取OD405。
结果：图5A-B显示来自MASP-2+/+ (交叉线)、MASP-2+/- (实心圆)和MASP-2-/-(实心三角)的血清稀释液中在甘露聚糖(图5A)和酵母聚糖(图5B)上C4b沉积的量。图5C显示来自MASP-2-/+小鼠(n=5)和MASP-2-/-小鼠(n=4)的酵母聚糖(白色条形柱)或甘露聚糖(阴影条形柱)包被板上相对于野生型小鼠(n=5)的C4转化酶相对活性，所根据的是测定针对野生型血清均一化的C4b沉积的量。误差条代表标准偏差。如图5A-C所示，来自MASP-2-/-小鼠的血浆在甘露聚糖和酵母聚糖包被板上完全缺乏凝集素途径介导的补体活化。这些结果清楚地表明，MASP-2是凝集素途径的效应子成分。
重组MASP-2重构MASP-2-/-小鼠血清中的凝集素途径依赖性C4活化
为了证实MASP-2缺乏是MASP-2-/-小鼠凝集素途径依赖性C4活化丧失的直接原因，在上述C4裂解测定中测试了将重组MASP-2蛋白加到血清样品中的作用。按照以下实施例3中所述方法，制备了有功能活性的鼠MASP-2和无催化活性的鼠MASP-2A (其中丝氨酸蛋白酶结构域活性部位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代)重组蛋白并进行了纯化。将得自4只MASP-2 -/-小鼠的合并血清与蛋白质浓度递增的重组鼠MASP-2或无活性的重组鼠MASP-2A一起预孵育，按上述方法测定C4转化酶活性。
结果：如图6所示，将有功能活性鼠重组MASP-2蛋白(用空心三角表示)加到获自MASP-2 -/-小鼠的血清中，以蛋白质浓度依赖方式恢复了凝集素途径依赖性C4活化，而无催化活性的鼠MASP-2A蛋白(用星号表示)没有恢复C4活化。将图6所示结果针对用合并的野生型小鼠血清所观察到的C4活化结果均一化(用点线表示)。
实施例3
本实施例描述了重组全长人、大鼠和小鼠MASP-2、MASP-2衍生多肽以及无催化活性的MASP-2突变形式的重组表达和蛋白质生产。
全长人、小鼠和大鼠MASP-2的表达：
将人MASP-2全长cDNA序列(SEQ ID NO:4)同样亚克隆到哺乳动物表达载体pCI-Neo (Promega)中，在CMV增强子/启动子区控制下驱动真核表达(描述于 Kaufman R.J.等人, Nucleic Acids Research19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology,185:537-66 (1991))。将全长小鼠cDNA (SEQ ID NO:50)和大鼠MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:53)分别亚克隆到pED表达载体中。然后应用标准磷酸钙转染方法(描述于Maniatis等人，1989)，将MASP-2表达载体转染到贴壁的中国仓鼠卵巢细胞系DXB1中。用这些构建体转染的细胞生长得非常缓慢，表明所编码的蛋白酶有细胞毒性。
在另一种方法中，将含有由其内源启动子驱动的人MASP-2 cDNA的小基因构建体(SEQ ID NO:49)瞬时转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。人MASP-2蛋白被分泌到培养基中，如下述进行分离。
全长无催化活性的MASP-2的表达：
基本原理：在识别亚成分MBL或纤维胶凝蛋白(L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白或M-纤维胶凝蛋白)结合它们各自的碳水化合物模式之后，MASP-2通过自催化裂解激活。导致MASP-2活化的自催化裂解经常发生在从血清分离MASP-2的过程中，或者在重组表达后的纯化期间。为获得更稳定的蛋白质制备物用作抗原，通过用丙氨酸残基置换蛋白酶结构域催化三联体中存在的丝氨酸残基，产生无催化活性形式的MASP-2，称为MASP-2A，在大鼠中(SEQ ID NO:55 Ser617变成Ala617)；在小鼠中(SEQ ID NO:52 Ser617 变成Ala617)；或在人中(SEQ ID NO:6 Ser618变成Ala618)。
为产生无催化活性的人和鼠MASP-2A蛋白，使用表5所示寡核苷酸进行定点诱变。为了将丝氨酸密码子变成丙氨酸密码子，设计了表5中的寡核苷酸使编码有酶活性丝氨酸的人和鼠cDNA区退火，寡核苷酸含有错配。例如，采用PCR寡核苷酸SEQ ID NO:56-59结合人MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)，以便扩增自起始密码子到有酶活性丝氨酸的区域及自丝氨酸到终止密码子的区域，从而产生完整开放可读形式的含有Ser618到Ala618突变的突变型MASP-2A。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后被纯化，使用标准加尾方法产生单腺苷重叠。然后将加腺苷尾的MASP-2A克隆到pGEM-T easy载体中，再转化到大肠杆菌中。
通过将SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65两种寡核苷酸激酶化(kinasing)，并且通过将这两种寡核苷酸以等摩尔量结合，在100℃下加热2分钟后，缓慢冷却到室温而退火，来产生无催化活性的大鼠MASP-2A蛋白。所得到的退火片段具有Pst1和Xba1相容末端，将该片段插入以替换野生型大鼠MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:53)的Pst1-Xba1片段从而产生大鼠MASP-2A。
5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEQ ID NO:64)
5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (SEQ ID NO:65)
按下述方法，进一步将人、小鼠和大鼠MASP-2A分别亚克隆到哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo并转染到中国仓鼠卵巢细胞系DXB1中。
在另一种方法中，应用Chen等人所述方法构建无催化活性形式的MASP-2 (Chen等人, J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001)。简单来讲，将含有全长人MASP-2cDNA的质粒(描述于Thiel等人, Nature 386:506, 1997)用Xho1和EcoR1消化，将MASP-2cDNA (参见本文的SEQ ID NO:4)克隆到pFastBac1杆状病毒转移载体(LifeTechnologies, NY)相应的限制位点中。然后通过用天然区域氨基酸610-625取代编码肽区域氨基酸610-625 (SEQ ID NO:13)的双链寡核苷酸，将MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点Ser618变成Ala618，从而产生带有无活性蛋白酶结构域的MASP-2全长多肽。
含有得自人Masp-2的多肽区的表达质粒的构建
采用MASP-2信号肽(SEQ ID NO:5的残基1-15)来产生下面的构建体以分泌不同的MASP-2结构域。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:6)残基1-121的区域(相当于N端CUBI结构域)来制备表达人MASP-2 CUBI结构域(SEQ ID NO:8)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:6)残基1-166的区域(相当于N端CUBIEGF结构域)来制备表达人MASP-2CUBIEGF结构域(SEQ ID NO:9)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:6)残基1-293的区域(相当于N端CUBIEGFCUBII结构域)来制备表达人MASP-2 CUBIEGFCUBII结构域(SEQ ID NO:10)的构建体。采用VentR聚合酶，pBS-MASP-2作为模板，根据已确立的PCR方法，经PCR扩增上述结构域。有义引物(5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SEQ ID NO:34)的5’引物序列在PCR产物的5’端引入BamHI限制位点(下划线)。下表5中所示的各MASP-2结构域的反义引物被设计用来在各种PCR产物末端的EcoRI位点(下划线)之前引入终止密码子(粗体)。DNA片段一旦被扩增，便用BamHI和EcoRI消化，并克隆到pFastBac1载体相应的位点中。所得构建体用限制酶切作图表征，并通过dsDNA测序来证实。
表5：MASP-2 PCR引物
Figure 214901DEST_PATH_IMAGE008
MASP-2的重组真核表达与无酶活性的小鼠、大鼠和人MASP-2A的蛋白质生产
应用标准磷酸钙转染方法(Maniatis等人，1989)，将上述MASP-2和MASP-2A表达构建体转染到DXB1细胞中。在无血清培养基中产生MASP-2A，以确保制备物不被其它血清蛋白污染。每隔一天从汇合细胞中收获培养基(共四次)。三个物种中每一种的重组MASP-2A水平平均约为1.5 mg/升培养基。
MASP-2A蛋白纯化：通过亲和层析法在MBP-A琼脂糖柱上使MASP-2A (上述Ser-Ala突变体)纯化。这种策略能够快速纯化而无需使用外部标记。将MASP-2A (100-200 ml培养基用等体积的加样缓冲液(50 mM Tris-Cl，pH 7.5，含有150 mM NaCl和25 mM CaCl2)稀释)加到MBP-琼脂糖亲和柱(4 ml)上，柱用10 ml加样缓冲液预平衡。另用10 ml加样缓冲液洗涤后，在含有1.25 M NaCl和10 mM EDTA的50 mM Tris-Cl (pH 7.5)的1 ml级分中洗脱蛋白质。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来鉴定含有MASP-2A的级分。必要时，MASP-2A通过离子交换层析在MonoQ柱(HR 5/5)上进一步纯化。蛋白质用含有50 mM NaCl的50 mM Tris-Cl(pH 7.5)透析，加到用同一缓冲液平衡的柱上。洗涤后，另用10 ml的0.05-1 M NaCl梯度洗脱出结合的MASP-2A。
结果：从200 ml培养基中获得产量为0.25-0.5 mg的MASP-2A蛋白。由于糖基化作用，所以经MALDI-MS测得77.5 kDa的分子量比未修饰多肽的计算值(73.5 kDa)大。在每个N-糖基化位点连接有聚糖是所测分子量的原因。MASP-2A作为单一条带在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上迁移，证明在生物合成期间没有被蛋白水解加工。通过平衡超速离心法测得的重量平均分子量与糖基化多肽同型二聚体的计算值一致。
重组人MASP-2多肽的生产
生产重组MASP-2和MASP-2A衍生多肽的另一种方法描述于Thielens, N.M.,等人,J. Immunol. 166:5068-5077, 2001。简单来讲，使草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞(获自Novagen, Madison, WI的Ready-Plaque Sf9细胞)在Sf900II无血清培养基(Life Technologies)中生长并维持，该培养基补充了50 IU/ml青霉素和50 mg/ml链霉素(Life Technologies)。使粉纹夜蛾(Trichoplusia ni) (High Five)昆虫细胞(由JadwigaChroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, France提供)在TC100培养基(Life Technologies)中维持，该培养基含有补充了50 IU/ml青霉素和50 mg/ml链霉素的10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, France)。采用Bac-to-Bac系统(LifeTechnologies)来产生重组杆状病毒。杆粒(bacmid) DNA采用Qiagen中量制备纯化系统(Qiagen)纯化，并用来按照生产商所述方案，在cellfectin的Sf900 II SFM培养基(LifeTechnologies)中转染Sf9昆虫细胞。4天后收集重组病毒颗粒，经病毒噬斑测定滴定，按照King和Possee所述方法(King和Possee, 载于The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London，第111-114页，1992)进行扩增。
在Sf900 II SFM培养基中，用含有MASP-2多肽的重组病毒在28℃下感染HighFive细胞(1.75 x 107个细胞/175 cm2组织培养瓶) 96小时，感染复数为2。经离心收集上清液，加入二异丙基氟磷酸至终浓度1 mM。
MASP-2多肽被分泌到培养基中。将培养物上清液对50 mM NaCl、1 mM CaCl2、50mM盐酸三乙醇胺(pH 8.1)透析，以1.5 ml/分钟的速度加到同一缓冲液平衡的Q-琼脂糖凝胶快流速柱(Amersham Pharmacia Biotech) (2.8 x 12 cm)上。在同一缓冲液中，用1.2升的线性梯度(至350 mM NaCl)进行洗脱。通过Western印迹分析法鉴定出含有重组MASP-2多肽的级分，通过加入(NH4)2SO4至60% (重量/体积)进行沉淀，4℃静置过夜。将沉淀重悬浮于145 mM NaCl、1 mM CaCl2、50 mM盐酸三乙醇胺(pH 7.4)中，加到同一缓冲液平衡的TSKG3000 SWG柱(7.5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA)上。然后将已纯化的多肽在Microsep微量浓缩器(截留分子量=10,000) (Filtron, Karlstein, Germany)中通过超滤浓缩至0.3 mg/ml。
实施例4
本实施例描述了抗MASP-2多肽的多克隆抗体的生产方法。
材料与方法：
MASP-2抗原：用以下分离的MASP-2多肽免疫兔，以生产多克隆抗人MASP-2抗血清：分离自血清的人MASP-2 (SEQ ID NO:6)；重组人MASP-2 (SEQ ID NO:6)，含有无活性的蛋白酶结构域(SEQ ID NO:13)的MASP-2A，见实施例3；表达的重组CUBI (SEQ ID NO:8)、CUBEGFI (SEQ ID NO:9)和CUBEGFCUBII (SEQ ID NO:10)，如上文实施例3所述。
多克隆抗体：已用BCG (杆菌卡介苗(bacillus Calmette-Guerin vaccine))免疫的六周龄兔，经注射100 μg MASP-2多肽进行免疫，MASP-2多肽按100 μg/ml溶于无菌盐溶液。每4周进行注射，通过ELISA测定法监测抗体效价，描述于实施例5。收集培养物上清液，用于通过A蛋白亲和层析法进行抗体纯化。
实施例5
本实施例描述了抗大鼠或人MASP-2多肽的鼠单克隆抗体的生产方法。
材料与方法：
将100 μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽(按实施例3中所述制备)皮下注射到8-12周龄的雄性A/J小鼠(Harlan, Houston, Tex.)，所述多肽溶于200 μl磷酸缓冲盐溶液(PBS) (pH 7.4)中的完全弗氏佐剂(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)。在两周的时间间隔下，将50 μg溶于不完全弗氏佐剂的人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽两次皮下注射到小鼠。在第四周，给小鼠注射溶于PBS的50 μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽，4天后进行融合。
对于每次融合，从经过免疫的小鼠脾脏制备单细胞悬液，用于与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。将5x108个Sp2/0和5x108个脾细胞在含有50%聚乙二醇(分子量1450) (Kodak,Rochester, N.Y.)和5%二甲亚砜(Sigma Chemical Co.，St. Louis, Mo.)的培养基中进行融合。然后将细胞调节到每200 μl的Iscove培养基(Gibco, Grand Island, N.Y.)悬液1.5x105脾细胞的浓度，培养基中补充10%胎牛血清、100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.1 mM次黄嘌呤、0.4 μM氨基蝶呤和16 μM胸苷。将200微升细胞悬液加到大约二十个96孔微量培养板的各孔中。大约10天后，取出培养物上清液，用于在ELISA测定法中筛选与纯化因子MASP-2的反应性。
ELISA测定法：通过加入50 μl经纯化的50 ng/ml hMASP-2或大鼠rMASP-2 (或rMASP-2A)在室温下过夜，包被Immulon® 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.)微量试验板的各孔。用于包被的低浓度MASP-2使得能够选择高亲和力抗体。在轻轻拍打培养板除去包被溶液后，将200 μl的BLOTTO (脱脂奶粉)的PBS溶液加到每个孔中达1小时以封闭非特异性位点。一小时之后，然后各孔用缓冲液PBST (含有0.05%吐温20的PBS)洗涤。从各融合孔中收集50微升的培养物上清液，并与50 μl的BLOTTO混合，然后加到微量试验板的各孔中。孵育1小时之后，各孔用PBST洗涤。然后通过与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG (对Fc特异性) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)反应来检测结合的鼠抗体，并以1:2,000稀释于BLOTTO中。将含有0.1% 3,3,5,5-四甲基联苯胺(Sigma, St. Louis, Mo.)和0.0003%过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液加到各孔中，显色30分钟。每孔加入50 μl 2M H2SO4终止反应。用BioTek® ELISA读板仪(BioTek®Instruments, Winooski, Vt.)读取反应混合物在450 nm的光密度(OD)。
MASP-2结合测定：
在上述MASP-2 ELISA测定法中测试为阳性的培养物上清液可在结合测定中进行测定，以测定MASP-2抑制剂对MASP-2的结合亲和力。也可使用类似测定法来确定抑制剂是否结合补体系统中的其它抗原。
通过用MASP-2的磷酸缓冲盐溶液(PBS) (pH 7.4) (20 ng/100 μl/孔，AdvancedResearch Technology, San Diego, CA)在4℃下过夜，来包被聚苯乙烯微量滴定板的各孔(96孔培养基结合板，Corning Costar, Cambridge, MA)。吸出MASP-2溶液后，各孔用含有1%牛血清白蛋白(BSA；Sigma Chemical)的PBS在室温下封闭2小时。无MASP-2包被的孔用作背景对照。将在封闭溶液中不同浓度的杂交瘤上清液或已纯化的抗MASP-2 MoAb等分溶液加到各孔中。在室温下孵育2小时之后，各孔用PBS充分漂洗。通过在封闭溶液中加入过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG (Sigma Chemical)在室温下孵育1小时，来检测结合MASP-2的抗MASP-2 MoAb。该板用PBS再次充分漂洗后，加入100 μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)。加入100 μl的1 M磷酸来猝灭TMB反应，将板在微量板读板仪(SPECTRA MAX 250，Molecular Devices,Sunnyvale, CA)中在450 nm下读数。
然后测定来自阳性孔的培养物上清液在功能测定法(诸如实施例2所述C4裂解测定法)中抑制补体活化的能力。然后经有限稀释克隆阳性孔中的细胞。再在上述ELISA测定法中测定MoAb与hMASP-2的反应性。使选出的杂交瘤在转瓶中生长，收集耗尽培养物的上清液，通过A蛋白亲和层析法纯化抗体。
实施例6
本实施例描述了人源化鼠抗MASP-2抗体和抗体片段的产生和生产。
按照实施例5所述方法，在雄性A/J小鼠中产生鼠抗MASP-2单克隆抗体。然后按照下述方法，将鼠恒定区用其人对应物置换来产生IgG与抗体Fab片段的嵌合体，使鼠抗体人源化以降低它的免疫原性，所述嵌合体用于抑制本发明的人受试者体内的MASP-2依赖性补体活化的副作用。
1. 由鼠杂交瘤细胞克隆抗MASP-2可变区基因
按照生产商的方案(Biotech, Houston, Tex.)，使用RNAzol由分泌抗MASP-2MoAb的杂交瘤细胞(按照实施例7中所述方法获得)中分离出总RNA。采用寡聚dT作为引物，由总RNA合成第一cDNA链。使用免疫球蛋白恒定C区衍生的3’引物和得自前导肽或鼠VH或VK基因的第一构架区的简并引物组作为5’引物对来进行PCR。按Chen和Platsucas所述方法(Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992)进行锚定PCR。对于克隆VK基因，用Not1-MAK1引物(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO:38)来制备双链cDNA。将退火衔接子AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO:39)和AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEQ ID NO:40)连接到双链cDNA的5’端和3’端。经Notl消化除去3’端衔接子。然后将消化产物用作PCR模板，以AD1寡核苷酸作为5’引物，MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEQ ID NO:41)作为3’引物。将大约500 bp的DNA片段克隆到pUC19中。选出若干克隆进行序列分析以证实克隆序列包括预期的鼠免疫球蛋白恒定区。Not1-MAK1和MAK2寡核苷酸得自VK区，分别为Cκ基因第一碱基对下游的182 bp和84bp。选择包括完整VK和前导肽的克隆。
对于克隆VH基因，使用Not1 MAG1引物(5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3'SEQ ID NO:42)来制备双链cDNA。将退火衔接子AD1和AD2连接到双链cDNA的5’端和3’端。经Notl消化除去3’端衔接子。将消化产物用作PCR模板，以AD1寡核苷酸和MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO:43)作为引物。将长度为500-600 bp的DNA片段克隆到pUC19中。Not1-MAG1和MAG2寡核苷酸得自鼠Cγ.7.1区，分别为鼠Cγ.7.1基因第一碱基对下游的180 bp和93 bp。选择包括完整VH和前导肽的克隆。
2. 嵌合MASP-2 IgG与Fab的表达载体的构建
将上述克隆的VH和VK基因用作PCR反应的模板，以便将Kozak共有序列加到5’端，将剪接供体加到核苷酸序列的3’端。对该序列进行分析确定没有PCR误差后，将VH和VK基因分别插入到含有人C.γ1和C.κ的表达载体盒中，得到pSV2neoVH-huCγ1 和 pSV2neoV-huCγ。使用CsCl梯度纯化的重链和轻链载体的质粒DNA通过电穿孔转染COS细胞。48小时后，通过ELISA测定培养物上清液，证实存在大约200 ng/ml的嵌合IgG。收获细胞，制备总RNA。使用寡聚dT作为引物从总RNA合成第一cDNA链。将该cDNA用作PCR模板以产生Fd和κ DNA片段。对于Fd基因，使用5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEQ ID NO:44)作为5’引物以及CH1衍生的3’引物(5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ ID NO:45)进行PCR。证实DNA序列含有完整的人IgG1的VH和CH1结构域。在用合适的酶消化后，将FdDNA片段插入表达载体盒pSV2dhfr-TUS的HindIII和BamHI限制位点，得到pSV2dhfrFd。pSV2质粒是市售的，由不同来源的DNA区段组成：pBR322 DNA (细线)含有pBR322 DNA复制起点(pBR ori)以及内酰胺酶氨苄青霉素抗性基因(Amp)；SV40 DNA，由较粗影线表示并标记，含有SV40 DNA复制起点(SV40 ori)、早期启动子(dhfr和neo基因的5’端)以及聚腺苷酸化信号(dhfr和neo基因的3’端)。SV40衍生的聚腺苷酸化信号(pA)也位于Fd基因的3’端。
对于κ基因，使用5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SEQ ID NO:46)作为5’引物和CK衍生的3’引物(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEQ ID NO:47)进行PCR。验证DNA序列含有完整的VK和人CK区域。在用合适的限制酶消化后，将κ DNA片段插入表达载体盒pSV2neo-TUS的HindIII和BamHI限制位点，得到pSV2neoK。Fd和κ基因的表达均由HCMV衍生的增强子和启动子元件驱动。因为Fd基因不包括涉及到链间二硫键的半胱氨酸氨基酸残基，所以该重组的嵌合Fab就含有非共价连接的重链和轻链。该嵌合Fab被命名为cFab。
为了获得带有重链和轻链间二硫键的重组Fab，可以将上述Fd基因延长以包括来自人IgG1铰链区的额外9个氨基酸(EPKSCDKTH SEQ ID NO:48)的编码序列。编码Fd基因3’端的30个氨基酸的BstEII-BamHI DNA区段可被编码延长的Fd的DNA区段置换，产生pSV2dhfrFd/9aa。
3. 嵌合的抗MASP-2 IgG的表达和纯化
为产生分泌嵌合的抗MASP-2 IgG的细胞系，用经纯化的pSV2neoVH-huC.γ1和pSV2neoV-huC κ的质粒DNA通过电穿孔转染NSO细胞。在0.7 mg/ml G418存在下选出被转染的细胞。将细胞在250 ml转瓶中用含血清的培养基进行培养。
将100 ml旋动培养物的培养物上清液加到10 ml PROSEP-A柱(Bioprocessing,Inc., Princeton, N.J.)上。柱用10个柱床体积的PBS洗涤。结合的抗体用50 mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)洗脱。将等体积的1 M Hepes (pH 8.0)加到含有纯化抗体的级分中，调节pH到7.0。通过Millipore膜超滤(截留分子量：3,000)，用PBS进行缓冲液交换来去除残留的盐。通过BCA方法(Pierce)测得经纯化抗体的蛋白质浓度。
4. 嵌合的抗MASP-2 Fab的表达和纯化
为了产生分泌嵌合的抗MASP-2 Fab的细胞系，用经纯化的pSV2dhfrFd (或pSV2dhfrFd/9aa)和pSV2neoκ的质粒DNA通过电穿孔转染CHO细胞。在G418和甲氨蝶呤存在下选出被转染的细胞。在浓度递增的甲氨蝶呤中对所选细胞系进行扩增。经有限稀释对细胞进行单细胞亚克隆。然后将高产单细胞亚克隆细胞系在100 ml转瓶中用无血清培养基进行培养。
采用抗MASP-2 MoAb的小鼠抗独特型MoAb，通过亲和层析法对嵌合的抗MASP-2Fab进行纯化。可用与匙孔
Figure 618201DEST_PATH_IMAGE009
血蓝蛋白(KLH)缀合的鼠抗MASP-2 MoAb给小鼠免疫，筛选出能够与人MASP-2竞争的特异性MoAb结合，从而来制备抗独特型MASP-2 MoAb。至于纯化，将来自产生cFab或cFab/9aa的旋动培养的CHO细胞的100 ml上清液加到与抗独特型MASP-2MoAb偶联的亲和柱上。然后该柱用PBS充分洗涤后，结合的Fab用50 mM二乙胺(pH 11.5)洗脱出来。按照上述方法通过缓冲液交换除去残留的盐。通过BCA方法(Pierce)测定经纯化的Fab的蛋白质浓度。
可应用实施例2或实施例7中所述的抑制测定法来测定嵌合MASP-2 IgG、cFab和cFAb/9aa抑制MASP-2依赖性补体途径的能力。
实施例7
本实施例描述了用作功能性筛选的体外C4裂解测定法，从而鉴定能够阻断经由L-纤维胶凝蛋白/P35、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或甘露聚糖的MASP-2依赖性补体活化的MASP-2抑制剂。
C4裂解测定法：Petersen, S.V.等人描述了C4裂解测定法(Petersen, S.V.,等人, J. Immunol. Methods 257:107, 2001)，测定了由结合L-纤维胶凝蛋白的金黄色葡萄球菌的脂磷壁酸(LTA)导致的凝集素途径活化。
试剂：福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(DSM20233)如下制备：将细菌在胰胨豆胨血液培养基(tryptic soy blood medium)中于37℃培养过夜，用PBS洗涤三次，然后在室温下于PBS/0.5%福尔马林中固定1小时，再用PBS洗涤三次后，重悬浮于包被缓冲液(15 mMNa2CO3、35 mM NaHCO3，pH 9.6)中。
测定法：Nunc MaxiSorb®微量滴定板(Nalgene Nunc International,Rochester, NY)的各孔用以下的成分包被：100 μl福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233 (OD550 = 0.5)的包被缓冲液与1 μg L-纤维胶凝蛋白的包被缓冲液。孵育过夜之后，各孔用0.1%人血清白蛋白(HSA)的TBS溶液(10 mM Tris-HCl，140 mM NaCl，pH 7.4)封闭，然后用含有0.05%吐温20和5 mM CaCl2的TBS溶液(洗涤缓冲液)洗涤。将人血清样品稀释于20 mM Tris-HCl、1 M NaCl、10 mM CaCl2、0.05% Triton X-100、0.1% HSA (pH 7.4)中，这就防止了内源C4的活化，并使C1复合物(由C1q、C1r和C1s组成)解离。将不同浓度的MASP-2抑制剂(包括抗MASP-2 MoAb和抑制肽)加到血清样品中。将稀释的样品加到板中，在4℃下孵育过夜。24小时后，各板用洗涤缓冲液充分洗涤，然后向每个孔中加入0.1 μg溶于100 μl 4 mM巴比妥、145 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2 (pH 7.4)的经纯化的人C4 (按照Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993所述方法获得)。37℃1.5小时后，各板再次经洗涤，使用碱性磷酸酶缀合的鸡抗人C4c (获自Immunsystem, Uppsala, Sweden)，检测C4b沉积，并使用比色底物磷酸对硝基苯酯进行测定。
关于甘露聚糖的C4测定：修改上述测定法以测定经由MBL的凝集素途径活化，在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，用LSP和甘露聚糖包被测定板。
关于H-纤维胶凝蛋白(Hakata Ag)的C4测定：修改上述测定法以测定经由H-纤维胶凝蛋白的凝集素途径活化，在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，用LSP和H-纤维胶凝蛋白包被测定板。
实施例8
下面的测定法证明了野生型和MASP-2-/-小鼠中存在经典途径活化。
方法：微量滴定板(Maxisorb®，Nunc，目录号442404，Fisher Scientific)用0.1%人血清白蛋白的10 mM Tris、140 mM NaCl (pH 7.4)溶液在室温下包被1小时，然后用按1:1000稀释于TBS/吐温/Ca2+中的绵羊抗全血清的抗血清(Scottish Antibody ProductionUnit, Carluke, Scotland)在4℃下孵育过夜，从而原位产生免疫复合物。从野生型和MASP-2-/-小鼠中获得血清样品，加到包被板中。制备对照样品，其中从野生型和MASP-2-/-血清样品中耗尽C1q。按照供应商的说明书，使用包被了兔抗人C1q IgG (Dako, Glostrup,Denmark)的A蛋白偶联的Dynabead® (Dynal Biotech, Oslo, Norway)来制备C1q耗尽的小鼠血清。将各板在37℃下孵育90分钟。用按1:1000稀释于TBS/吐温/Ca++中的多克隆抗人C3c抗体(Dako A 062)来检测结合的C3b。二抗是山羊抗兔IgG。
结果：图7表示用IgG与野生型血清、MASP-2-/-血清、耗尽C1q的野生型和耗尽C1q的MASP-2-/-血清包被板上C3b的相对沉积水平。这些结果证明，经典途径在MASP-2-/-小鼠品系中是完整的。
实施例9
下面的测定法用来通过在经典途径被免疫复合物启动的情况下分析MASP-2抑制剂的作用，从而检测MASP-2抑制剂是否阻断了经典途径。
方法：为了检测MASP-2抑制剂对其中经典途径被免疫复合物启动的补体活化情况的影响，在37℃下，将含有90% NHS的50 μl样品一式三份在10 μg/ml免疫复合物(IC)或PBS存在下孵育，在37℃孵育的还有含有200 nM抗备解素单克隆抗体的平行样品(+/-IC)一式三份。37℃孵育两小时后，将13 mM EDTA加到所有样品中终止进一步的补体活化，立即将样品冷却到5℃。在按照生产商说明书，使用ELISA试剂盒(Quidel, 目录号A015和A009)进行补体活化产物(C3a和sC5b-9)分析之前，将样品保存于-70℃。
实施例10
本实施例描述了阻断MASP-2活性的高亲和力抗MASP-2 Fab2抗体片段的鉴定。
背景与基本原理：MASP-2是具有许多独立功能结构域的复杂蛋白质，包括：MBL和纤维胶凝蛋白的结合部位、丝氨酸蛋白酶催化部位、蛋白水解底物C2的结合部位、蛋白水解底物C4的结合部位、MASP-2酶原自身活化的MASP-2裂解部位和两个Ca++结合部位。鉴定出以高亲和力结合MASP-2的Fab2抗体片段，在功能测定法中测定所鉴定出的Fab2片段，以确定它们是否能够阻断MASP-2功能活性。
为了阻断MASP-2功能活性，抗体或Fab2抗体片段必须结合并阻碍MASP-2功能活性所需要的MASP-2上的结构表位。因此，许多或所有的高亲和力结合抗MASP-2 Fab2不能抑制MASP-2功能活性，除非它们能结合直接参与MASP-2功能活性的MASP-2的结构表位。
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法被用来评价抗MASP-2 Fab2的“阻断活性”。已知MASP-2在凝集素途径中的主要生理作用是产生凝集素介导的补体途径的下一个功能成分，即凝集素途径C3转化酶。凝集素途径C3转化酶是蛋白水解裂解C3成为C3a和C3b的关键酶复合物(C4bC2a)。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分；然而，需要MASP-2功能活性以产生组成凝集素途径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a)。此外，为了使MASP-2产生凝集素途径C3转化酶，似乎需要所有上述MASP-2的独立功能活性。出于这些原因，认为用于评价抗MASP-2 Fab2的“阻断活性”优选的测定法是测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法。
高亲和力Fab2的产生：应用人可变轻链和重链抗体序列的噬菌体展示文库以及用于鉴定与所选出的目标配体反应的Fab2的自动抗体筛选技术，来产生抗大鼠MASP-2蛋白(SEQ ID NO:55)的高亲和力Fab2。利用已知量的大鼠MASP-2 (~1 mg，纯度>85%)蛋白进行抗体筛选。利用三轮扩增以选出具有最高亲和力的抗体。挑选约250个不同的表达抗体片段的目标(hits)用于ELISA筛选。随后对高亲和力目标进行测序以确定不同抗体的独特性。
将50个独特的抗MASP-2抗体纯化，将250 μg各经纯化的Fab2抗体用于表征MASP-2结合亲和力和补体途径功能测定，详述如下。
用于评价抗MASP-2 Fab2抑制(阻断)活性的测定法
1. 测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的测定法：
背景：凝集素途径C3转化酶是蛋白水解裂解C3成为两个有效促炎片段过敏毒素C3a和调理素C3b的酶复合物(C4bC2a)。C3转化酶的形成似乎是在介导炎症方面的凝集素途径中的关键步骤。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分；因此，抗MASP-2抗体(或Fab2)不会直接抑制之前已存在的C3转化酶的活性。然而，为了产生组成凝集素途径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a)，MASP-2丝氨酸蛋白酶活性是必需的。因此，抑制MASP-2功能活性的抗MASP-2 Fab2 (即阻断性抗MASP-2 Fab2)会抑制凝集素途径C3转化酶从头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当C3转化酶裂解C3时，C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基形成共价键，从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定C3转化酶形成的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下孵育30分钟以激活凝集素途径。然后洗涤各孔，并采用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了凝集素途径C3转化酶的从头形成。在该测定法中测定选定浓度的抗MASP-2Fab2抑制C3转化酶形成和随后C3b产生的能力。
方法：
将96孔Costar培养基结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)的甘露聚糖以1 μg/50 μl/孔在5℃下孵育过夜。过夜孵育后，各孔用200 μl PBS洗涤三次。然后各孔用100 μl/孔的1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭，在室温下轻轻搅动孵育1小时。然后各孔用200 μl PBS洗涤三次。在5℃下，将抗MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM巴比妥，141 mM NaCl，1.0 mM MgCl2，2.0 mM CaCl2，0.1%明胶，pH 7.4)至选定浓度。在5℃下，将0.5%大鼠血清加到上述样品中，将100 μl转移到各孔。将板盖上，在37℃水浴中孵育30分钟以便补体活化。将板从37℃水浴转移至装有冰－水混合物的容器中使反应终止。各孔依次用200 μl PBS-吐温20 (0.05%吐温20的PBS溶液)洗涤5次，用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl/孔按1:10,000稀释的一抗(兔抗人C3c，DAKO A0062)，该抗体溶于含有2.0 mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔按1:10,000稀释的二抗(过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG，AmericanQualex A102PU)，该抗体溶于含有2.0 mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔过氧化物酶底物TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育10分钟。通过加入100 μl/孔1.0 MH3PO4终止过氧化物酶反应，测得OD450。
2. 测定MASP-2依赖性C4裂解抑制的测定法
背景：MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性是高度特异性的，仅鉴定出用于MASP-2的两种蛋白质底物：C2和C4。C4裂解产生C4a和C4b。抗MASP-2 Fab2可结合直接参与C4裂解的MASP-2的结构表位(例如C4的MASP-2结合部位；MASP-2丝氨酸蛋白酶催化部位)，从而抑制MASP-2的C4裂解功能活性。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定MASP-2的C4裂解活性的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下孵育30分钟以激活凝集素途径。因为用于该ELISA测定法中的一抗仅识别人C4，所以稀释的大鼠血清还补充了人C4(1.0 μg/ml)。然后洗涤各孔，采用标准ELISA方法测定固定在孔中的人C4b。在该测定法中，所产生的C4b的量是依赖MASP-2的C4裂解活性的量度。在该测定法中，测定选定浓度的抗MASP-2 Fab2抑制C4裂解的能力。
方法：将96孔Costar培养基结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)的甘露聚糖按1 μg/50 μl/孔在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100 μl/孔1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤3次。在5℃下，将抗MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM巴比妥，141mM NaCl，1.0 mM MgCl2，2.0 mM CaCl2，0.1%明胶，pH 7.4)至选定浓度。1.0 μg/ml人C4(Quidel)也包括在这些样品中。在5℃下，将0.5%大鼠血清加到上述样品中，将100 μl转移到各孔。将板盖上，在37℃水浴中孵育30分钟以便补体活化。将板从37℃水浴转移至装有冰－水混合物的容器中使反应终止。各孔用200 μl PBS-吐温20 (0.05%吐温20的PBS溶液)洗涤5次，然后各孔用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl/孔以1:700稀释的生物素缀合的鸡抗人C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)的PBS溶液(含有2.0 mg/ml牛血清白蛋白(BSA))，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的0.1 μg/ml过氧化物酶缀合的链霉抗生物素(Pierce Chemical #21126)的PBS溶液(含有2.0 mg/ml BSA)，在室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育16分钟。通过加入100 μl/孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，测得OD450。
3. 抗“天然”大鼠MASP-2的抗大鼠MASP-2 Fab2的结合测定法
背景：MASP-2通常作为还包括特异性凝集素分子(甘露糖结合蛋白(MBL)和纤维胶凝蛋白)的MASP-2二聚体复合物存在于血浆中。因此，如果有兴趣研究抗MASP-2 Fab2与生理相关形式的MASP-2结合，则重要的是开发出结合测定法，其中利用的是Fab2与血浆“天然”MASP-2之间，而不是与纯化的重组MASP-2之间的相互作用。在该结合测定法中，先将来自10%大鼠血清的“天然”MASP-2-MBL复合物固定在甘露聚糖包被的孔内。然后采用标准ELISA方法，对各种抗固定化“天然”MASP-2的抗MASP-2 Fab2的结合亲和力进行了研究。
方法：将96孔Costar高结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)的甘露聚糖按1 μg/50 μl/孔在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl PBS洗涤3次。各孔用100 μl/孔的0.5%脱脂奶粉的PBST溶液(PBS与0.05%吐温20)封闭，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200μl TBS/吐温/Ca++洗涤缓冲液(Tris缓冲盐溶液，0.05%吐温20，含有5.0 mM CaCl2，pH 7.4)洗涤3次。在冰上制备10%大鼠血清的高盐结合缓冲液(20 mM Tris，1.0 M NaCl，10 mMCaCl2，0.05% Triton-X100，0.1% (重量/体积)牛血清白蛋白，pH 7.4)。每孔加入100 μl，在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl TBS/吐温/Ca++洗涤缓冲液洗涤3次。然后各孔用200 μlPBS洗涤2次。加入100 μl/孔稀释于含有Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM巴比妥，141 mMNaCl，1.0 mM MgCl2，2.0 mM CaCl2，0.1%明胶，pH 7.4)的选定浓度的抗MASP-2 Fab2，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔按1:5000稀释的溶于2.0 mg/ml牛血清白蛋白/PBS的HRP缀合的山羊抗Fab2 (Biogenesis目录号0500-0099)，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育70分钟。通过加入100 μl/孔的1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，测得OD450。
结果：
挑选了约250个不同的与抗大鼠MASP-2蛋白进行高亲和力反应的Fab2用于ELISA筛选。对这些高亲和力Fab2进行了测序以确定不同抗体的独特性，对50个独特的抗MASP-2抗体进行纯化用于进一步分析。250 μg各经纯化的Fab2抗体用来表征MASP-2结合亲和力及补体途径功能测试。该分析的结果见下表6。
表6：阻断凝集素途径补体活化的抗MASP-2 FAB2
Figure 345986DEST_PATH_IMAGE010
如上表6所示，50个所测的抗MASP-2 Fab2中，17个Fab2被鉴定为MASP-2阻断性Fab2，其有效抑制C3转化酶形成，IC50 ≤ 10 nM Fab2 (34%阳性选中率)。所鉴定出的17个Fab2中，有8个的IC50范围为纳摩尔以下。此外，表6中所示的所有17个MASP-2阻断性Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制了C3转化酶形成。图8A图示说明C3转化酶形成测定法的Fab2抗体#11的结果，在其它所测定的Fab2抗体中具有代表性，其结果见表6。因为甚至当各MASP-2分子被Fab2结合时，“阻断性”Fab2仅可能极微弱地抑制MASP-2功能，这在理论是可能的，因此要慎重考虑。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂，但是在大鼠血清存在的抗甘露聚糖抗体还可能激活经典途径，并且通过经典途径C3转化酶产生C3b，这在理论上是可能的。然而，在本实施例所列的17个阻断性抗MASP-2 Fab2中的每一个都有效地抑制了C3b产生(>95%)，因此证明了该项测定法对于凝集素途径C3转化酶的特异性。
为了计算各个抗体的表观Kd，对阻断性Fab2的所有17个都进行结合测定。6个阻断性Fab2的抗天然大鼠MASP-2的抗大鼠MASP-2 Fab2的结合测定的结果也见表6。图8B通过图示说明了用Fab2抗体#11的结合测定法的结果。对于其它Fab2也进行了类似的结合测定，其结果见表6。一般而言，对于6个Fab2的每一个结合“天然”MASP-2所获得的表观Kd与在C3转化酶功能测定中Fab2的IC50的对应性颇为适当。有证据表明，在激活其蛋白酶活性之后，MASP-2经历了从“无活性”到“活性”形式的构象变化(Feinberg等人, EMBO J 22:2348-59(2003); Gal等人, J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005))。在用于C3转化酶形成测定法的正常大鼠血浆中，MASP-2主要以“无活性”酶原构象存在。相比之下，在结合测定法中，MASP-2作为与MBL一起结合到固定化甘露聚糖的复合物的组成部分存在；因此，MASP-2可能为“活性”构象(Petersen等人, J. Immunol Methods 257:107-16, 2001)。因此，对于这两个功能测定法中所测定的17个阻断性Fab2的每一个，可能不必预期IC50与Kd之间确切的对应性，因为在各个测定法中，Fab2可能结合不同构象形式的MASP-2。尽管如此，除了Fab2 #88以外，两种测定法中所测的其它16个Fab2的每一个，IC50与表观Kd之间似乎有相当密切的对应性(参见表6)。
对用于抑制MASP-2介导的C4裂解的若干个阻断性Fab2进行了评价。图8C通过图示说明了C4裂解测定法的结果，表明用Fab2 #41抑制的IC50=0.81 nM (参见表6)。如图9所示，发现所有测试的Fab2都抑制C4裂解，IC50类似于C3转化酶测定法中所获得的IC50 (参见表6)。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂，但是大鼠血清中抗甘露聚糖抗体的存在也可能激活经典途径，从而通过C1s介导的C4裂解而产生C4b，这在理论上是可能的。然而，已经鉴定出有效抑制C4b产生(>95%)的若干种抗MASP-2 Fab2，因此证明了该测定法对于MASP-2介导的C4裂解的特异性。C4，如同C3一样，含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当通过MASP-2裂解C4之后，C4b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上羟基或氨基形成共价键，因此有利于在ELISA测定法中检测出C4b。
这些研究清楚表明，对于大鼠MASP-2蛋白的高亲和力Fab2的产生，其功能性地阻断C4和C3转化酶活性，从而防止了凝集素途径活化。
实施例11
本实施例描述了对若干按照实施例10所述方法产生的阻断性抗大鼠MASP-2 Fab2抗体进行的表位作图。
方法:
如图10所示，使用pED4载体，在CHO细胞中表达下列都具有N端6个His标记的蛋白质：
大鼠MASP-2A，一种全长MASP-2蛋白，通过活性中心上的丝氨酸改变为丙氨酸(S613A)而失活；
大鼠MASP-2K，经改变降低了自身活化的全长MASP-2蛋白(R424K)；
CUBI-II，一种仅含有CUBI、EGF样和CUBII结构域的大鼠MASP-2的N端片段；和
CUBI/EGF样，一种仅含有CUBI和EGF样结构域的大鼠MASP-2的N端片段。
按照前述方法将这些蛋白质通过镍亲和层析从培养上清液中纯化出来(Chen等人, J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001))。
采用pTrxFus (Invitrogen)，使含有CCPII和大鼠MASP-2丝氨酸蛋白酶结构域的C端多肽(CCPII-SP)，在大肠杆菌中表达成为硫氧还蛋白融合蛋白。用Thiobond亲和树脂将蛋白质从细胞裂解物中纯化出来。硫氧还蛋白融合物配偶体由pTrxFus空载体表达作为阴性对照。
将所有重组蛋白透析到TBS缓冲液中，通过测量OD (280 nm)，测得其浓度。
斑点印迹法分析：
将连续稀释的上述和图10中所示5个重组MASP-2多肽(以及硫氧还蛋白多肽作为CCPII-丝氨酸蛋白酶多肽的阴性对照)点在硝酸纤维素膜上。蛋白质的点样量在5重步骤中的范围为100 ng-6.4 pg。在稍后的实验中，蛋白质的点样量再次在5重步骤中的范围由50ng降至16 pg。该膜用5%脱脂奶粉的TBS溶液(封闭缓冲液)封闭，然后与1.0 μg/ml抗MASP-2Fab2的封闭缓冲液(含有5.0 mM Ca2+)一起孵育。用HRP缀合的抗人Fab (AbD/Serotec；1/10,000稀释)和ECL检测试剂盒(Amersham)检测结合的Fab2。一块膜与作为阳性对照的多克隆兔抗人MASP-2 Ab (参见Stover等人, J Immunol 163:6848-59 (1999))一起孵育。在这种情况下，用HRP缀合的山羊抗兔IgG (Dako；1/2,000稀释)，检测出结合的Ab。
MASP-2结合测定法
ELISA板用1.0 μg/孔的重组MASP-2A或CUBI-II多肽的碳酸盐缓冲液(pH 9.0)在4℃下包被过夜。孔用1% BSA的TBS溶液封闭，然后加入连续稀释的抗MASP-2 Fab2的TBS溶液(含有5.0 mM Ca2+)。将所述板在室温下孵育1小时。用TBS/吐温/Ca2+洗涤3次后，加入按1/10,000稀释于TBS/Ca2+的HRP缀合的抗人Fab (AbD/Serotec)，将所述板再次在室温下孵育1小时。用TMB过氧化物酶底物试剂盒(Biorad)检测出结合的抗体。
结果：
表明了Fab2与各种MASP-2多肽的反应性的斑点印迹法分析的结果提供在下表7中。表7提供的数值表明，提供大约最大信号强度的一半所需要的蛋白质点样量。如所示，所有多肽(仅硫氧还蛋白融合物配偶体例外)均被阳性对照Ab (多克隆抗人MASP-2血清，在兔中产生)识别。
表7：斑点印迹法中与各重组大鼠MASP-2多肽的反应性
Fab2抗体# MASP-2A CUBI-II CUBI/EGF-样 CCPII-SP 硫氧还蛋白
40 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
41 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
11 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
49 0.16 ng NR NR >20 ng NR
52 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
57 0.032 ng NR NR NR NR
58 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
60 0.4 ng 0.4 ng NR NR NR
63 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
66 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
67 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
71 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
81 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
86 0.4 ng NR NR 10 ng NR
87 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
阳性对照 <0.032 ng 0.16 ng 0.16 ng <0.032 ng NR
NR = 无反应。阳性对照抗体是在兔中产生的多克隆抗人MASP-2血清。
所有Fab2均与MASP-2A以及MASP-2K反应(数据未显示)。大多数Fab2识别CCPII-SP多肽但不识别N端片段。Fab2 #60和Fab2 #57是两个例外。Fab2 #60识别MASP-2A和CUBI-II片段，但不识别CUBI/EGF样多肽或CCPII-SP多肽，这提示它能结合CUBII的表位或者跨越CUBII和EGF样结构域。Fab2 #57识别MASP-2A但不识别任何所测试的MASP-2片段，这表明这种Fab2识别CCP1的表位。Fab2 #40和#49仅结合完整的MASP-2A。在图11所示的ELISA结合测定法中，Fab2 #60还结合CUBI-II多肽，虽然只具有略微较低的表观亲和力。
这些观察结果表明对于MASP-2蛋白多个区域的独特阻断性Fab2的鉴定。
实施例12
本实施例描述了使用噬菌体展示鉴定结合MASP-2和抑制凝集素介导的补体活化，同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性)途径组分完整的全人scFv抗体。
概述：
全人高亲和力MASP-2抗体通过筛选噬菌体展示文库鉴定。抗体的可变轻链和重链片段以scFv形式和全长IgG形式分离。人MASP-2抗体可用于抑制与凝集素途径介导的补体途径活化有关的细胞损伤，同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性)途径组分完整。在一些实施方案中，所述MASP-2抑制性抗体具有以下特征：(a) 对人MASP-2的高亲和力(例如，10nM或更小的KD)和(b) 在90%人血清中以30 nM或更小的IC50抑制MASP-2-依赖性补体活性。
方法：
全长无催化活性的MASP-2的表达：
编码人MASP-2多肽与前导序列(SEQ ID NO:5)的人MASP-2的全长cDNA序列(SEQID NO: 4)被亚克隆至哺乳动物表达载体pCI-Neo (Promega)，其在CMV增强子/启动子区的控制下驱动真核表达(描述于Kaufman R.J.等人，Nucleic Acids Research19:4485-90，1991; Kaufman，Methods in Enzymology，185:537-66 (1991))。
为了产生无催化活性的人MASP-2A蛋白，按US2007/0172483所述进行定点诱变，其通过引用并入本文。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后纯化，和使用标准加尾程序产生单腺苷重叠。腺苷加尾的MASP-2A然后被克隆至pGEM-T easy载体和转化至大肠杆菌。人MASP-2A被进一步亚克隆至哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo的任一个中。
上述MASP-2A表达构建体使用标准磷酸钙转染程序(Maniatis等人，1989)被转染至DXB1细胞。MASP-2A在无血清培养基中产生，以确保制备物未被其它血清蛋白质污染。每隔一天从汇合的细胞收获培养基(总共四次)。重组MASP-2A的水平平均为大约1.5 mg/升培养基。MASP-2A (上述Ser-Ala突变体)通过亲和层析在MBP-A-琼脂糖柱上纯化。
对通过淘选/scFv转化和滤器筛选鉴定的ScFv候选克隆的MASP-2A ELISA
对人免疫球蛋白轻链和重链可变区序列的噬菌体展示文库进行抗原淘选，接着自动化抗体筛选和选择以鉴定对人MASP-2蛋白的高亲和力scFv抗体。针对HIS-标签或生物素-标签的MASP-2A进行scFv噬菌体文库的三轮淘选。第三轮淘选首先用MBL洗脱，然后用TEA (碱性)洗脱。为了监测展示针对靶标MASP-2A的scFv片段的噬菌体的特异性富集，针对固定的MASP-2A进行多克隆噬菌体ELISA。将来自淘选第3轮的scFv基因克隆至pHOG表达载体和进行小规模滤器筛选以寻找针对MASP-2A的特异性克隆。
挑出包含编码来自第三轮淘选的scFv片段的质粒的细菌菌落，转印到硝酸纤维素膜上，和在非诱导培养基上生长过夜以产生母板。从第三轮淘选总共18,000个菌落被挑出和分析，一半来自竞争性洗脱和一半来自随后的TEA洗脱。针对MASP-2A淘选scFv噬菌粒文库接着scFv转化和滤器筛选，得到137个阳性克隆。在对于MASP-2结合的ELISA测定中108/137个克隆是阳性的(数据未显示)，其中进一步分析45个克隆在正常人血清中阻断MASP-2活性的能力。
测量抑制凝集素途径C3转化酶的形成的测定法
测量抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法用于评价MASP-2 scFv候选克隆的"阻断活性"。需要MASP-2丝氨酸蛋白酶活性以产生两种蛋白组分(C4b、C2a)，其包含凝集素途径C3转化酶。因此，抑制MASP-2功能活性(即，阻断MASP-2 scFv)的MASP-2 scFv将抑制凝集素途径C3转化酶的重新形成。C3包含不常见的和高度反应性的硫酯基团作为其结构的一部分。在此测定法中在C3被C3转化酶裂解后，C3b上的硫酯基团可与固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基经过酯或酰胺键形成共价键，从而利于在ELISA测定中检测C3b。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测量C3转化酶的形成的以下方法中，用甘露聚糖包被的塑料孔用稀释的人血清孵育，以激活凝集素途径。然后洗涤孔，和使用标准ELISA方法测定固定在孔上的C3b。在此测定中产生的C3b的量是凝集素途径C3转化酶重新形成的直接反映。在此测定中测试选择浓度的MASP-2 scFv克隆抑制C3转化酶形成和因此C3b产生的能力。
方法:
按上述鉴定的45个候选克隆经表达、纯化和稀释至相同的储液浓度，其在含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM巴比妥、141 mM NaCl、1.0 mM MgCl2、2.0 mM CaCl2、0.1%明胶、pH 7.4)中再次稀释以确保所有克隆具有相同量的缓冲液。scFv克隆各自一式三份以2μg/mL的浓度测试。阳性对照是OMS100 Fab2和以0.4 μg/mL测试。在scFv/IgG克隆存在和不存在的情况下监测C3c形成。
在50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3 + 35mM NaHCO3 + 1.5 mM NaN3) pH 9.5中将甘露聚糖稀释至20 μg/mL的浓度(1 μg/孔)和在ELISA板上在4ºC包被过夜。第二天，甘露聚糖-包被的板用200 μl PBS洗涤3次。然后将100 μl的1% HSA封闭溶液加入孔中，和在室温下孵育1小时。用200 μl PBS将板洗涤3次，并在冰上用200 μl PBS贮存，直到加入样品。
在CaMgGVB缓冲液中将正常人血清稀释至0.5%，并将scFv克隆或OMS100 Fab2阳性对照以0.01 μg/mL、1 μg/mL (仅OMS100对照)和10 μg/mL一式三份加入该缓冲液和在冰上预孵育45分钟，然后加入封闭的ELISA板。通过在37ºC孵育1小时开始反应和通过将板转移至冰浴中停止。C3b沉积用兔α-小鼠C3c抗体接着山羊α-兔HRP检测。阴性对照是不含抗体的缓冲液(无抗体= 最大C3b沉积)，并且阳性对照是含EDTA的缓冲液(无C3b沉积)。通过进行相同测定法测定背景，除了该孔不含甘露聚糖之外。将针对不含甘露聚糖的板的背景信号从含甘露聚糖的孔的信号中减去。截止标准设定为无关scFv克隆(VZV)和仅缓冲液的一半活性。
结果：根据截止标准，发现总共13个克隆阻断MASP-2的活性。产生> 50%途径抑制的所有13个克隆被选择和测序，得到10个独特克隆。发现所有10个克隆具有相同的轻链亚类λ3，但三个不同的重链亚类：VH2、VH3和VH6。在功能测定法中，使用0.5%人血清，5/10个候选scFv克隆给出小于25 nM目标标准的IC50 nM值。
为了鉴定具有改进的效力的抗体，对按上文所述鉴定的三个母scFv克隆进行轻链改组。该过程包括产生由每个母克隆的VH与源自6个健康供体的天然人λ轻链(VL)的文库配对组成的组合文库。然后筛选该文库中具有改进的结合亲和力和/或功能性的scFv克隆。
表8：主要子克隆和它们相应的母克隆(全部为scFv形式)的IC50 (nM)的功能效力比较
Figure 834736DEST_PATH_IMAGE011
下文提供了对于上文表8显示的母克隆和子克隆的重链可变区(VH)序列。
Kabat CDRs (31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-107 (H3))用粗体表示；和ChothiaCDRs (26-32 (H1)、52-56 (H2)和95-101 (H3))用下划线表示。
17D20_35VH-21N11VL重链可变区(VH) (SEQ ID NO:67，由SEQ ID NO:66编码)
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSS
d17N9重链可变区(VH) (SEQ ID NO:68)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPFGVPFDIWGQGTMVTVSS
下文提供了对于上文表8显示的母克隆和子克隆的轻链可变区(VL)序列。
Kabat CDRs (24-34 (L1); 50-56 (L2);和89-97 (L3)用粗体表示；和ChothiaCDRs (24-34 (L1); 50-56 (L2)和89-97 (L3)用下划线表示。这些区域是相同的，无论是通过Kabat还是Chothia系统编号。
17D20m_d3521N11轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:69，由SEQ ID NO:70编码)
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL
17N16m_d17N9轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:71)
SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDNLGKKRVHWYQQRPGQAPVLVIYDDSDRPSGIPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQVWDIATDHVVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE
MASP-2抗体OMS100和MoAb_d3521N11VL (包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:69所示的轻链可变区，亦称为“OMS646”和“mAb6”)，均已证实以高亲和力结合人MASP-2和具有阻断功能补体活性的能力，通过斑点印迹关于表位结合分析。结果表明OMS646和OMS100抗体对MASP-2高度特异性，和不结合MASP-1/3。没有抗体结合MAp19，也没有抗体结合不包含MASP-2的CCP1结构域的MASP-2片段，导致得出结论，结合位点包含CCP1。
当与C1s、C1r或MASP-1比较时，测定MASP-2抗体OMS646以>5000倍选择性紧密结合重组MASP-2 (Kd 60-250pM) (参见下表9)：
表9：通过固相ELISA研究评价的OMS646 MASP-2抗体-MASP-2相互作用的亲和力和特异性
抗原 K<sub>D</sub> (pM)
MASP-1 >500,000
MASP-2 62±23*
MASP-3 >500,000
纯化的人C1r >500,000
纯化的人C1s ~500,000
*平均值±SD; n=12
OMS646特异性阻断末端补体组分的凝集素依赖性活化
方法：
使用对于凝集素途径、经典途径和替代途径的途径特异性条件分析OMS646对膜攻击复合物(MAC)沉积的影响。为此，Wieslab Comp300补体筛选试剂盒(Wieslab，Lund，Sweden)按照制造商的说明书使用。
结果：
图12A图示在存在或不存在抗-MASP-2抗体(OMS646)的情况下在凝集素途径特异性测定条件下MAC沉积的水平。图12B图示在存在或不存在抗-MASP-2抗体(OMS646)的情况下在经典途径特异性测定条件下MAC沉积的水平。图12C图示在存在或不存在抗-MASP-2抗体(OMS646)的情况下在替代途径特异性测定条件下MAC沉积的水平。
如图12A所示，OMS646以大约1nM的IC50值阻断MAC沉积的凝集素途径介导的活化。然而，OMS646对从经典途径介导的活化(图12B)或从替代途径介导的活化(图12C)产生的MAC沉积没有影响。
在静脉内(IV)或皮下(SC)给予小鼠后OMS646的药代动力学和药效学
在小鼠的28天单次给药PK/PD研究中评价OMS646的药代动力学(PK)和药效学(PD)。该研究测试了皮下给予(SC) 5mg/kg和15mg/kg的OMS646的剂量水平以及静脉内给予(IV)5mg/kg OMS646的剂量水平。
关于OMS646的PK特征，图13图示给予指定剂量的OMS646后OMS646浓度(n=3只动物/组的平均值)作为时间的函数。如图13所示，以5mg/kg SC给药后大约1-2天，OMS646达到5-6 µg/mL的最大血浆浓度。以5 mg/kg SC，OMS646的生物利用度为大约60%。如图13进一步显示的，以15 mg/kg SC给药后大约1-2天，OMS646达到10-12 µg/mL的最大血浆浓度。对于所有组，OMS646从系统循环缓慢清除，其中终末半衰期为大约8-10天。OMS646的特征是在小鼠中对于人抗体典型的。
OMS646的PD活性在图14A和14B中示出。图14A和14B显示对于5mg/kg IV (图14A)和5mg/kg SC (图14B)组中的各小鼠的PD反应(系统凝集素途径活性下降)。虚线表示测定的基线(最大抑制；试验前体外添加过量OMS646的幼稚小鼠血清)。如图14A所示，在IV给予5mg/kg的OMS646后，系统凝集素途径活性立即下降至几乎不可检测的水平，和经28天观察期，凝集素途径活性仅显示适度恢复。如图14B所示，在给予5mg/kg的OMS646 SC的小鼠中，观察到凝集素途径活性的时间依赖性抑制。凝集素途径活性在药物给予24小时内下降至几乎不可检测的水平和保持低水平至少7天。凝集素途径活性随时间逐渐增加，但在28天观察期内未恢复至给药前水平。在给予15mg/kg SC后观察到的凝集素途径活性对比时间的曲线类似于5 mg/kg SC剂量(数据未显示)，表明PD终点饱和。数据进一步表明，IV或SC给予5mg/kg的OMS646的每周剂量足以在小鼠中实现系统凝集素途径活性的持续抑制。
实施例13
本实施例描述了抑制MASP-2的重组抗体的产生，所述重组抗体包含重链和/或轻链可变区(包含特异性结合MASP-2的一个或多个CDR)和至少一个SGMI核心肽序列(亦称为带有SGMI肽的MASP-2抗体或其抗原结合片段)。
背景/基本原理：
称为SGMI-2的MASP-2的特异性抑制剂的产生描述于Heja等人，J Biol Chem 287:20290 (2012)和Heja等人，PNAS 109:10498 (2012)，其各自通过引用并入本文。SGMI-2是36个氨基酸的肽，其选自沙漠蝗(Schistocerca gregaria)蛋白酶抑制剂2的变体的噬菌体文库，其中蛋白酶结合环的8个位置中的6个被完全随机化。随后体外进化得到单特异性抑制剂，其具有单数位nM KI值(Heja等人，J. Biol. Chem. 287:20290，2012)。结构研究表明，优化的蛋白酶结合环形成限定两种抑制剂的特异性的主要结合位点。延长的次要和内部结合区的氨基酸序列是两种抑制剂共有的，和有助于接触界面(Heja等人，2012. J. Biol. Chem. 287:20290)。在机制上，SGMI-2阻断补体活化的凝集素途径而不影响经典途径(Heja等人，2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498)。
SGMI-2抑制剂的氨基酸序列如下文所示：
SGMI-2-全长：
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:72)
SGMI-2-中等：
TCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:73)
SGMI-2-短：
…………………………………TCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:74)
如本实施例所述，以及在WO2014/144542中所述，带有SGMI-2肽的MASP-2抗体和其片段通过融合SGMI-2肽氨基酸序列(例如，SEQ ID NO: 72、73或74)到人MASP-2抗体的重链和/或轻链的氨基或羧基末端上产生。当使用人血清在C3b或C4b沉积测定法中测量时，与不包含SGMI-2肽序列的裸MASP-2支架抗体相比，带有SGMI-2肽的MASP-2抗体和片段具有提高的抑制性活性，如WO2014/144542中所述，并且当在小鼠体内模型中测量时，与裸MASP-2支架抗体相比也具有提高的抑制性活性。产生带有SGMI-2肽的MASP-2抗体的方法在下文描述。
方法：
产生编码四种示例性的带有SGMI-2肽的MASP-2抗体的表达构建体，其中SGMI-2肽融合至代表性的MASP-2抑制性抗体OMS646 (如实施例12所述产生)的重链或轻链的N-或C-端。
表10：MASP-2抗体/SGMI-2融合物
Figure 306168DEST_PATH_IMAGE012
表10中的缩写：
“H-N”= 重链的氨基末端
“H-C”= 重链的羧基末端
“L-N”= 轻链的氨基末端
“L-C”= 轻链的羧基末端
“M2”=MASP-2 ab支架(代表性OMS646)
对于表10所示的N-末端融合物，肽接头(‘GTGGGSGSSS’ SEQ ID NO: 79)在SGMI-2肽和可变区之间加入。
对于表10所示的C-末端融合物，肽接头(‘AAGGSG’ SEQ ID NO: 80)在恒定区和SGMI-2肽之间加入，和第二肽“GSGA” (SEQ ID NO: 81)在融合多肽的C-末端加入以保护C-末端SGMI-2肽免于降解。
对于以下代表性的MASP-2抗体/SGMI-2融合物，氨基酸序列在下文提供：
H-M2ab6-SGMI-2-N (SEQ ID NO:75，由SEQ ID NO:82编码):
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GTGGGSGSSS QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCT VSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARI RRGGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[491 aa蛋白，aa 1-36=SGMI-2 (下划线)，aa37-46=接头(斜体)，aa47-164=MASP-2 ab#6的重链可变区(下划线)，aa165-491= 具有铰链突变的IgG4恒定区]
H-M2ab6-SGMI-2-C (SEQ ID NO:76，由SEQ ID NO:83编码):
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRL TISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAAGGSG LEV TCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GSGA
[491aa蛋白，aa1-118= MASP-2 ab#6的重链可变区(下划线)，aa 119-445= 具有铰链突变的IgG4恒定区，aa 446-451= 第1接头(斜体)，aa 452-487=SGMI-2，aa488-491=第2接头(斜体)]
L-M2ab6-SGMI-2-N (SEQ ID NO:77，由SEQ ID NO:84编码):
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GTGGGSGSSS QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCS GEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGG TKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[258aa蛋白，aa1-36=SGMI-2 (下划线)，aa37-46=接头(斜体)，aa47-152= MASP-2ab#6的轻链可变区(下划线)，aa153-258=人Ig λ恒定区]
L-M2ab6-SGMI-2-C (SEQ ID NO:78、encoded by SEQ ID NO:85):
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNT ATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSAAGGSG LEVTC EPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GSGA
[258aa蛋白，aa1-106= MASP-2 ab#6的轻链可变区(下划线)，aa 107-212=人Ig λ恒定区，aa 213-218=第1接头，aa219-254=SGMI-2，aa255-258=第2接头]
功能测定法：
四种MASP-2-SGMI-2融合抗体构建体在Expi293F细胞(Invitrogen)中瞬时表达，通过蛋白A亲和层析纯化，并在下文所述的甘露聚糖包被珠测定法中在10%正常人血清中测试C3b沉积的抑制。
在对于C3b沉积的甘露聚糖包被珠测定法中测试MASP-2-SGMI-2融合物
在C3b沉积测定法中在甘露聚糖包被珠上评价MASP-2-SGMI-2融合抗体的凝集素途径抑制。该测定法通过流式细胞术测定活性程度，提供了比Wieslab®测定法更大的分辨率。凝集素途径珠测定法如下进行：在4ºC在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中将甘露聚糖吸附至7 µM直径聚苯乙烯珠(Bangs Laboratories; Fishers，IN，USA)过夜。珠在PBS中洗涤和暴露于10%人血清，或用抗体或抑制剂预孵育的10%血清。将血清-珠混合物在室温下孵育1小时，同时搅拌。血清孵育后，洗涤珠，并通过用抗-C3c兔多克隆抗体(Dako NorthAmerica; Carpinteria，CA，USA)和PE-Cy5缀合的山羊抗-兔二抗(Southern Biotech;Birmingham，AL，USA)检测，测量珠上的C3b沉积。染色程序后，使用FACSCalibur流式细胞仪分析珠。使用前向散射和侧散射将珠门控为均一群体，并且C3b沉积作为FL3-阳性颗粒是明显的(FL-3或“FL-3通道”表示细胞仪上的第3或红色通道)。对于各实验条件，该群体的几何平均荧光强度(MFI)相对于抗体/抑制剂浓度作图，以评价凝集素途径抑制。
IC50值使用GraphPad PRISM软件计算。特别地，IC50值通过应用可变斜率(四参数)、非线性拟合至获自细胞计数测定的log (抗体)与平均荧光强度曲线获得。
结果显示在表11中。
表11：在10%人血清中的C3b沉积(甘露聚糖包被珠测定法)
构建体 IC<sub>50</sub> (nM)
裸N2 ab (mAb#6) ≥ 3.63 nM
H-M2-SGMI-2-N 2.11 nM
L-M2-SGMI-2-C 1.99 nM
H-M2-SGMI-2-N 2.24 nM
L-M2-SGMI-2-N 3.71 nM
结果：
对照，不含SGMI的MASP-2 “裸”支架抗体(mAb#6)，在此测定法中是抑制性的，具有≥ 3.63 nM的IC50值，其与实施例12观察的抑制性结果一致。明显地，如表11所示，测试的所有SGMI-2-MASP-2抗体融合物在该测定法中改进了MASP-2支架抗体的效力，表明价位增加也可能有利于C3b沉积的抑制。
用10%人血清在对于C4b沉积测定的甘露聚糖包被珠测定法中测试MASP-2-SGMI-2 融合物
用10%人血清，使用上述对于C3b沉积测定法相同的测定条件，进行C4b沉积测定法，具有以下修改。在流式细胞术分析之前，通过用抗-C4b小鼠单克隆抗体(1:500，Quidel)染色沉积反应物和用缀合至PE Cy5的山羊抗-小鼠F(ab’)2二抗(1:200，SouthernBiotech)染色，进行C4b检测和流式细胞术分析。
结果：
与MASP-2支架抗体(HL-M2: IC50=0.78nM)相比，带有SGMI-2的MASP-2-N-末端抗体融合物(H-M2-SGMI-2-N: IC50=0.34nM)、L-M2-SGMI-2-N: IC50=0.41 nM))均具有增加的效力。
类似地，与MASP-2支架抗体(HL-M2: IC50=1.2 nM)相比，带有单SGMI-2的C-末端MASP-2抗体融合物(H-M2-SGMI-2-C: IC50=0.45nM和L-M2-SGMI-2C: IC50=0.47 nM)均具有增加的效力。
用10%小鼠血清在对于C3b沉积的甘露聚糖包被珠测定法中测试MASP-2-SGMI-2融 合物
如上所述用10%小鼠血清进行对于C3b沉积的甘露聚糖包被珠测定法。类似于在人血清中观察的结果，确定在小鼠血清中与MASP-2支架抗体相比，带有SGMI-2的MASP-2融合物具有增加的效力。
结果概述：本实施例的结果证实，测试的所有SGMI-2-MASP-2抗体融合物改进了MASP-2支架抗体的效力。
实施例14
本实施例提供使用在MASP-2 -/-缺陷和MASP-2 +/+充足小鼠中肾纤维化的单侧输尿管梗阻(UUO)模型产生的结果，以评价凝集素途径在肾纤维化中的作用。
背景/基本原理：
肾纤维化和炎症是晚期肾疾病的主要特征。肾小管间质性纤维化是进行性过程，涉及持续细胞损伤、异常愈合、驻留和浸润肾细胞的活化、细胞因子释放、炎症和肾细胞表型活化以产生细胞外基质。肾小管间质性(TI)纤维化是多种肾病理的共同终点和代表了目的在于预防慢性肾疾病(CKD)中的进行性肾功能损伤的潜在疗法的关键靶标。肾TI损伤与肾小球疾病中肾功能下降紧密关联(Risdon R.A.等人，Lancet 1: 363-366，1968;Schainuck L.I.等人，Hum Pathol 1: 631-640，1970; Nath K.A.，Am J Kid Dis 20:1-17，1992)，并且是CKD的特征，其中存在成肌纤维细胞的积聚，并且在肾小管和管周围毛细管之间的潜在空间被包含胶原和其它蛋白聚糖的基质占据。TI成肌纤维细胞的来源仍有广泛争论，但纤维化通常在炎症之后，所述炎症初始特征为T淋巴细胞，然后是巨噬细胞的TI积聚(Liu Y.等人，Nat Rev Nephrol 7:684-696，2011; Duffield J.S.，J Clin Invest124:2299-2306、2014)。
UUO的啮齿动物模型产生进行性肾纤维化，一种基本上任何病因的进行性肾疾病的标志(Chevalier等人，Kidney International 75:1145-1152，2009)。已报道，C3基因表达在UUO后的野生型小鼠中增加，和与野生型小鼠相比，胶原沉积在UUO后的C3-/-敲除小鼠中显著减少，表明补体活化在肾纤维化中的作用(Fearn等人，Mol Immunol 48:1666-1733、2011)。还已报道，C5缺陷导致在肾小管间质性损伤的模型中肾纤维化的主要组分显著改善(Boor P.等人，J of Am Soc of Nephrology: 18:1508-1515，2007)。然而，在本发明人进行的本文所述的研究之前，参与肾纤维化的具体补体组分尚不确定。因此，进行下面的研究以评价在单侧输尿管梗阻(UUO)模型中的MASP-2 (-/-)和MASP-2 (+/+)雄性小鼠。
方法：
MASP-2-/-小鼠按实施例1所述产生，和与C57BL/6回交10代。雄性野生型(WT)C57BL/6小鼠和C57BL/6背景的纯合MASP-2缺陷(MASP-2-/-)小鼠保持在12/12日/夜循环的标准条件下，饲喂标准饲料颗粒并且自由获得食物和水。10周龄小鼠，6只/组，用在1.5 L/min氧气中的2.5%异氟烷麻醉。两组10周龄雄性C56/BL6小鼠(野生型和MASP-2-/-)的右输尿管经手术结扎。右肾通过1cm侧切口暴露。在两个点使用6/0 polyglactin缝线将右输尿管完全阻塞。丁丙诺啡止痛在手术前后每12小时提供，至多5个剂量，取决于疼痛评分。局部布比卡因麻醉剂在手术期间给予一次。
手术后7天处死小鼠和收集肾组织，固定和包埋在石蜡块中。在麻醉下通过心脏刺穿从小鼠收集血液，和在肾切除术后通过驱血法淘汰小鼠。使血液在冰上凝固2小时和通过离心分离血清和按等分在-80ºC保持冷冻。
肾组织的免疫组织化学
为了测量通过胶原沉积指示的肾纤维化的程度，5微米石蜡包埋肾切片用苦天狼星红(一种胶原特异性染剂)染色，如Whittaker P.等人，Basic Res Cardiol 89:397-410，1994所述。简言之，将肾切片脱石蜡，再水合和用在500 mL苦味酸饱和水溶液中的苦天狼星红水溶液(0.5 gm天狼星红，Sigma，Dorset UK)将胶原染色1小时。在酸化水(0.5%冰醋酸/蒸馏水)中将玻片洗涤两次，各自5分钟，然后再水合和固定。
为了测量通过巨噬细胞浸润指示的炎症程度，肾切片用巨噬细胞-特异性抗体F4/80如下所述染色。将福尔马林固定、石蜡包埋的5微米肾切片脱石蜡和再水合。在柠檬酸盐缓冲液中在95ºC进行抗原恢复20分钟，接着通过在3% H2O2中孵育10分钟淬灭内源性过氧化物酶活性。将组织切片在封闭缓冲液(10%热灭活的正常山羊血清以及1%牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲盐水(PBS))中在室温下孵育1小时，接着亲和素/生物素封闭。在每一步骤后将组织切片在PBS中洗涤三次，持续5分钟。施加1:100稀释在封闭缓冲液中的F4/80巨噬细胞一抗(Santa Cruz，Dallas，TX，USA)持续1小时。然后施加1:200稀释的生物素化的山羊抗-大鼠二抗，持续30分钟，接着施加辣根过氧化物酶(HRP)缀合酶，持续30分钟。使用二氨基联苯胺(DAB)底物(Vector Labs，Peterborough UK)进行染色显色10分钟和在水中洗涤玻片，再水合和固定，无需复染，以利于基于计算机的分析。
图像分析
肾皮质染色的百分比按Furness P. N.等人，J Clin Pathol 50:118-122，1997所述测定。简言之，24位彩色图像从在肾切片的整个外围周围紧接肾囊下方的肾皮质的连续的不重叠视野捕获。每次图像捕获后，NIH图像用于提取红色通道作为8位单色图像。背景照明的不均匀性使用在适当位置没有切片的明亮显微镜视野的预记录图像减除。使图像经受固定阈值以鉴定对应于染色阳性的图像区域。然后计算黑色像素的百分比，并且在围绕肾的所有图像以此方式已被测量后，记录平均百分比，提供对应于肾切片中染色面积的百分比的值。
基因表达分析
关于小鼠肾中的肾炎症和纤维化的数个基因的表达通过定量PCT (qPCR)如下测量。总RNA从肾皮质使用Trizol® (ThermoFisher Scientific，Paisley，UK)根据制造商的说明书分离。提取的RNA用Turbo DNA-free试剂盒(ThermoFisher Scientific)处理以消除DNA污染，然后使用AMV Reverse Transcription System (Promega，Madison，WI，USA)合成第一链cDNA。cDNA完整性通过使用TaqMan GAPDH Assay (Applied Biosystems，PaisleyUK)的单qPCR反应，接着使用Custom TaqMan Array 96-孔板(Life Technologies，Paisley，UK)的qPCR反应证实。
在此分析中研究了12个基因：
胶原IV型α1 (col4α1; 测定ID: Mm01210125_m1)
转化生长因子β-1 (TGFβ-1; 测定ID: Mm01178820_m1);
钙粘蛋白1 (Cdh1; 测定ID: Mm01247357_m1);
纤连蛋白1 (Fn1; 测定ID:Mm01256744_m1);
白细胞介素6 (IL6; 测定ID Mm00446191_m1);
白细胞介素10 (IL10; 测定ID Mm00439614_m1);
白细胞介素12a (IL12a; 测定ID Mm00434165_m1);
波形蛋白(Vim; 测定ID Mm01333430_m1);
辅肌动蛋白α 1 (Actn1; 测定ID Mm01304398_m1);
肿瘤坏死因子-α (TNF-α; 测定ID Mm00443260_g1)
补体组分3 (C3; 测定ID Mm00437838_m1);
干扰素γ (Ifn-γ; 测定ID Mm01168134)
使用以下持家对照基因：
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH; 测定ID Mm99999915_g1);
葡糖醛酸糖苷酶β (Gusβ; 测定ID Mm00446953_m1);
真核18S rRNA (18S; 测定ID Hs99999901_s1);
次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT; 测定ID Mm00446968_m1)
12 µL反应物使用TaqMan Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems)扩增40个循环。实时PCR扩增数据使用Applied Biosystems 7000 SDS v1.4软件分析。
结果：
在单侧输尿管梗阻(UUO)后，梗阻肾经历炎性细胞、特别是巨噬细胞流入，接着快速发生纤维化，如通过胶原积聚以及近端小管上皮的肾小管扩张和变薄证明的(参见Chevalier R. L.等人，Kidney Int 75:1145-1152，2009)。
图15图示用天狼星红染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，其中组织切片获自输尿管梗阻(UUO)7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠或获自假手术对照小鼠。如图15所示，输尿管梗阻7天后的野生型小鼠的肾切片显示比MASP-2-/-小鼠显著更大的胶原沉积(p值 = 0.0096)。在野生型和MASP-2-/-组中对于UUO手术小鼠的平均值 ± 平均值的标准误差分别是24.79±1.908 (n=6)和16.58±1.3 (n=6)。如图15进一步显示的，来自假手术对照野生型和假手术对照MASP-2-/-小鼠的组织切片显示极低水平的胶原染色，如所期望的。
图16图示用F4/80巨噬细胞特异性抗体染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，其中组织切片获自输尿管梗阻7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠或获自假手术对照小鼠。如图16所示，与野生型小鼠相比，输尿管梗阻7天后，获自MASP-2-/-小鼠的UUO肾的组织显示显著更少的巨噬细胞浸润(%巨噬细胞染色面积为WT:2.23±0.4对比MASP-2-/-:0.53±0.06，p=0.0035)。如图16进一步显示的，来自假手术野生型和假手术MASP-2-/-小鼠的组织切片表明没有可检测的巨噬细胞染色。
与肾炎症和纤维化关联的各种基因的基因表达分析在获自输尿管梗阻7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠以及假手术野生型和MASP-2-/-小鼠的肾组织切片中进行。图17-20中显示的数据是对野生型假手术样品的相对数量的Log10和条棒表示平均值的标准误差。关于纤维化相关基因的基因表达分析的结果，图17图示胶原IV型α 1 (胶原-4)的相对mRNA表达水平，如在获自输尿管梗阻7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠和假手术对照小鼠的肾组织切片中通过qPCR测量的。图18图示转化生长因子β-1 (TGFβ-1)的相对mRNA表达水平，如在获自输尿管梗阻7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠以及假手术对照小鼠的肾组织切片中通过qPCR测量的。如图17和18所示的，与野生型小鼠的假手术肾相比，来自野生型小鼠的梗阻肾证实纤维化相关基因胶原IV型(图17)和TGFβ-1 (图18)的表达显著增加，证实这些纤维化相关基因在野生型小鼠的UUO损伤后被诱导，如所预期的。相比之下，如图17和18进一步显示的，与经过UUO损伤的野生型小鼠比较，来自经过UUO损伤的MASP-2-/-的梗阻肾显示胶原IV型的表达显著减少(图17，p=0.0388)和TGFβ-1的表达显著减少(图18，p=0.0174)。
关于炎症相关基因的基因表达分析的结果，图19图示白细胞介素-6 (IL-6)的相对mRNA表达水平，如在获自输尿管梗阻7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠以及假手术对照小鼠的肾组织切片中通过qPCR测量的。图20图示干扰素-γ的相对mRNA表达水平，如在获自输尿管梗阻7天后的野生型和MASP-2-/-小鼠和假手术对照小鼠的肾组织切片中通过qPCR测量的。如图19和20所示的，与野生型小鼠的假手术肾比较，来自野生型小鼠的梗阻肾证实炎症相关基因白细胞介素-6 (图19)和干扰素-γ (图20)的表达显著增加，证实这些炎症相关基因在野生型小鼠的UUO损伤后被诱导。相比之下，如图19和20进一步显示的，与经过UUO损伤的野生型小鼠相比，来自经过UUO损伤的MASP-2-/-的梗阻肾显示白细胞介素-6 (图19，p=0.0109)和干扰素-γ (图20，p=0.0182)的表达显著减少。
注意，在获自野生型和MASP-2-/-小鼠二者的UUO肾中对于Vim、Actn-1、TNFα、C3和IL-10的基因表达全部发现被显著上调，在野生型和MASP-2-/-小鼠之间这些特定基因的表达水平没有明显差异(数据未显示)。Cdh-1和IL-12a的基因表达水平在来自任何组的动物的梗阻肾中未改变(数据未显示)。
讨论：
公认啮齿动物的UUO模型在梗阻肾中诱导早期、活性和显著的损伤，在梗阻后1-2个周内具有减少的肾血流、间质性炎症和快速纤维化，并已广泛用于理解肾的炎症和纤维化的共同机制和介质(参见例如，Chevalier R.L.，Kidney Int 75:1145-1152，2009; YangH.等人，Drug Discov Today Dis Models 7:13-19，2010)。
本实施例所述的结果证实，相对于野生型(+/+)对照小鼠，在MASP-2(-/-)小鼠的UUO手术肾中存在胶原沉积和巨噬细胞浸润的显著减少。在组织学和基因表达2种水平上显示在MASP-2-/-动物中肾损伤显著减少的该出人意料的结果证实，补体活化的凝集素途径显著促进在梗阻肾中炎症和纤维化的发生。尽管不希望受特定理论的约束，认为凝集素途径通过触发和保持促炎性刺激，决定性地促进纤维化疾病的病理生理学，所述促炎性刺激在细胞损伤驱动炎症时维持恶性循环，其进而引起进一步的细胞损伤、瘢痕形成和组织损失。根据这些结果，预期用抑制剂抑制或阻断MASP-2将具有抑制或预防肾纤维化，以及抑制或预防普遍纤维化(即，不依赖于组织或器官)的预防和/或治疗作用。
实施例15
本实施例描述了单克隆MASP-2抑制性抗体对于在单侧输尿管梗阻(UUO)模型(一种肾纤维化的鼠模型)中的功效的分析。
背景/基本原理：
肾小管间质性纤维化(多种肾病理的共同终点)的改善代表了目的在于预防进行性肾疾病的治疗策略的关键靶标。鉴于缺乏靶向肾疾病的炎性促纤维化途径的新的和已有治疗，对开发新疗法存在紧迫需要。具有蛋白尿肾疾病的许多患者显示肾小管间质性炎症和进行性纤维化，其紧密伴有肾功能下降。蛋白尿本身诱导肾小管间质性炎症和蛋白尿肾病的发生(Brunskill N.J.等人，J Am Soc Nephrol 15:504-505，2004)。不管原发性肾疾病，肾小管间质性炎症和纤维化在具有进行性肾损伤的患者中总是见到，并与排泄功能下降密切相关(Risdon R.A.等人，Lancet 1:363-366，1968; Schainuck L.I.等人，Hum Pathol 1: 631-640，1970)。具有阻断导致纤维化的关键共同细胞途径的潜力的疗法具有肾病症的广泛应用的前景。
如实施例14所述，在非蛋白尿肾纤维化的UUO模型中，确定与野生型对照动物相比，MASP-2-/-小鼠显示显著更少的肾纤维化和炎症，如通过炎性细胞浸润(75%减少)以及纤维化的组织学标志物例如胶原(1/3减少)证明的，从而确立了凝集素途径在肾纤维化中的关键作用。
如实施例13所述的，产生单克隆MASP-2抗体(OMS646-SGMI-2融合物，包含融合至OMS646的重链的C末端的SGMI-2肽)，其特异性阻断人凝集素途径的功能，还已表明在小鼠中阻断凝集素途径。在本实施例中，OMS646-SGMI-2在野生型小鼠的肾纤维化的UUO小鼠模型中分析，以确定MASP-2的特异性抑制剂是否能够抑制肾纤维化。
方法：
本研究评价了与人IgG4同种型对照抗体(10 mg/kg ET904)和溶媒对照相比，MASP-2抑制性抗体(10 mg/kg OMS646-SGMI-2)在雄性WT C57BL/6小鼠中的作用。在UUO手术前第7天、第4天和第1天以及在手术后第2天通过腹膜内(ip)注射将抗体(10mg/kg)给予各组9只小鼠。在抗体给予前和实验结束时获得血液样品以评价凝集素途径功能活性。
UUO手术、组织收集和用天狼星红和巨噬细胞特异性抗体F4/80染色使用实施例14所述的方法进行。
小鼠肾的羟脯氨酸含量使用特定的比色测定检验试剂盒(Sigma)根据制造商的说明书测量。
为了评价MASP-2抑制性mAb在小鼠中的药效学作用，系统凝集素途径活性通过在MASP-2 mAb或对照mAb i.p.给予小鼠后的指定时间收集的最小稀释的血清样品中量化凝集素诱导的C3活化评价。简言之，7 µM直径聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories，FisherIN，USA)通过用在碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)中的30µg/mL甘露聚糖(Sigma)过夜孵育，用甘露聚糖包被，然后洗涤，用1%胎牛血清/PBS封闭和以1x108个珠/mL的终浓度重悬于PBS。补体沉积反应通过加入2.5 µL的甘露聚糖包被珠(~250,000个珠)至50 µL的最小稀释的小鼠血清样品(90%终血清浓度)开始，接着在4ºC孵育40分钟。通过加入250 µL的冰冷的流式细胞术缓冲液(FB: 含0.1%胎牛血清的PBS)终止沉积反应后，通过离心收集珠和用300 µL冰冷FB再洗涤两次。
为了量化凝集素诱导的C3活化，将珠用50 µL的稀释于FB的兔抗-人C3c抗体(Dako，Carpenteria，CA，USA)在4ºC孵育1小时。用FB洗涤两次以除去未结合的物质后，将珠在4ºC用50 µL的稀释于FB的缀合至PE-Cy5的山羊抗-兔抗体(Southern Biotech，Birmingham，AL，USA)孵育30分钟。用FB洗涤两次以除去未结合的物质后，将珠重悬于FB和通过FACS Calibur细胞仪分析。使用正向散射和侧散射将珠门控为均一群体，并且每个样品中的C3b沉积定量为平均荧光强度(MFI)。
结果：
胶原沉积的评估：
图21图示用天狼星红染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，其中在输尿管梗阻7天后，从用MASP-2抑制性抗体或同种型对照抗体处理的野生型小鼠获得组织切片。如图21所示，与获自用IgG4同种型对照处理的野生型小鼠的梗阻肾的组织切片的胶原沉积的量相比，获自用MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠的梗阻(UUO)后7天收获的肾的组织切片显示胶原沉积的显著减少(p=0.0477)。
羟基脯氨酸含量的评估：
羟基脯氨酸作为胶原含量的指示在肾组织中测量。羟基脯氨酸是高度指示在该模型中诱导的疾病的病理生理学进展的参数。
图22图示获自用MASP-2抑制性抗体或同种型对照抗体处理的野生型小鼠的梗阻(UUO)后7天收获的肾的羟脯氨酸含量。如图22所示，与来自用IgG4同种型对照 mAb处理的小鼠的肾相比，来自用MASP-2抑制性抗体处理的小鼠的梗阻肾组织证实显著更少的羟脯氨酸(一种胶原含量的指示) (p=0.0439)。
炎症的评估：
来自野生型、同种型对照抗体处理的动物和用MASP-2抑制性抗体处理的野生型动物的梗阻肾证实巨噬细胞的活跃浸润。仔细量化表明在这两个组之间巨噬细胞百分比染色面积没有显著差异(数据未显示)。然而，尽管等量的浸润巨噬细胞，与来自同种型对照注射的动物的梗阻肾相比，来自MASP-2抑制性抗体注射的动物的梗阻肾显示显著更少的纤维化，如通过天狼星红染色判断的，该结果与来自用MASP-2抑制性抗体处理的小鼠的梗阻肾组织具有比用IgG4同种型对照mAb处理的肾显著更少的羟脯氨酸的结果一致。
讨论
本实施例所述的结果证实，使用MASP-2抑制性抗体提供在UUO模型中针对肾纤维化的保护作用，这与实施例14所述的结果一致，实施例14证实与野生型小鼠相比MASP-2-/-小鼠在UUO模型中具有显著减少的肾纤维化和炎症。本实施例的结果显示在用MASP-2抑制性抗体处理的小鼠中纤维化减少。在减少或阻断MASP-2-依赖性凝集素途径活性的动物的UUO肾中纤维化减少的发现是非常显著的新发现。总之，实施例14和本实施例提供的结果证实MASP-2抑制对肾小管间质性炎症、小管细胞损伤、促纤维化细胞因子释放和瘢痕形成的有益作用。肾纤维化的减轻仍是肾疗法的关键目标。UUO模型是加速肾纤维化的准确模型，并且减少该模型的纤维化的干预，例如使用MASP-2抑制性抗体，可能用于抑制或预防肾纤维化。来自UUO模型的结果可能转移至特征为肾小球和/或蛋白尿小管损伤的肾疾病。
实施例16
本实施例提供在MASP-2-/-和野生型小鼠中使用肾纤维化、炎症和小管间质性损伤的蛋白过载蛋白尿模型产生的结果，以评价凝集素途径在蛋白尿肾病中的作用。
背景/基本原理：
蛋白尿是发生肾纤维化和损失肾排泄功能的风险因素，不管原发肾疾病如何(Tryggvason K.等人，J Intern Med 254:216-224，2003，Williams M.，Am J. Nephrol25:77-94，2005)。蛋白尿肾病的概念描述了作为肾小球选择渗透性受损的结果的过量蛋白进入近端小管的毒性作用(Brunskill N.J.，J Am Soc Nephrol 15:504-505，2004，BainesR.J.，Nature Rev Nephrol 7:177-180，2011)。对于许多肾小球疾病常见的这种现象导致在肾中促炎性瘢痕形成环境，和特征为由于蛋白尿小管流体刺激的信号传导途径失调，近端小管细胞生长、凋亡、基因转录和炎性细胞因子产生改变。蛋白尿肾病公认为各种原发性肾病理共有的进行性肾损伤的关键贡献因素。
慢性肾疾病在美国影响超过15%的成年群体，并且是世界上每年大约750,000例死亡的原因(Lozano R.等人，Lancet vol 380，Issue 9859:2095-2128，2012)。蛋白尿是慢性肾疾病的指示，以及促进疾病进展的因素。具有蛋白尿肾疾病的许多患者显示肾小管间质性炎症和进行性纤维化，其与肾功能下降密切相关。蛋白尿本身诱导肾小管间质性炎症和蛋白尿肾病的发生(Brunskill N.J.等人，J Am Soc Nephrol 15:504-505，2004)。在蛋白尿肾疾病中，过量的白蛋白和其它大分子过滤通过肾小球，和被近端小管上皮细胞重吸收。这导致由补体活化介导的炎性恶性循环，导致细胞因子和白细胞浸润，其引起肾小管间质性损伤和纤维化，从而加重蛋白尿和导致损失肾功能和最终进展为晚期肾衰竭(参见例如，Clark等人，Canadian Medical Association Journal 178:173-175，2008)。调节炎症和蛋白尿的这种有害循环的疗法预期改善慢性肾疾病的结果。
根据MASP-2抑制在肾小管间质性损伤的UUO模型中的有益结果，进行以下实验以确定MASP-2抑制是否会减少蛋白过载模型中的肾损伤。该研究利用蛋白过载诱导蛋白尿肾疾病，如Ishola等人，European Renal Association 21:591-597，2006所述。
方法:
MASP-2-/-小鼠按实施例1所述产生和与BALB/c回交10代。当前研究如下比较了在蛋白过载蛋白尿模型中野生型和MASP-2-/- BALB/c小鼠的结果。
为见到最佳反应，实验前一周，在蛋白过载攻击前将小鼠单侧肾切除。使用的蛋白尿诱导剂是低内毒素牛血清白蛋白(BSA，Sigma)，按以下剂量在正常盐水中i.p.给予WT (n=7)和MASP-2 -/-小鼠(n=7)：各自2mg BSA/gm、4mg BSA/gm、6mg BSA/gm、8mg BSA/gm、10mgBSA/gm和12mg BSA/gm体重的一个剂量和9个剂量的15mg BSA/gm体重，经15天时间总共i.p.给予15个剂量。对照WT (n=4)和MASP-2-/- (n=4)小鼠仅接受i.p给予的盐水。给予最后一个剂量后，动物单独笼养在代谢笼中24小时以收集尿液。通过在麻醉下心脏穿刺收集血液，使血液在冰上凝固2小时和血清通过离心分离。在第15天实验结束时收集血清和尿液样品，贮存和冷冻用于分析。
第15天最后一次BSA给予后24小时处死小鼠，和收集各种组织用于分析。收获肾并经处理以进行H&E和免疫染色。免疫组织化学染色如下进行。来自各小鼠的福尔马林固定、石蜡包埋的5微米肾组织切片经脱石蜡和再水合。抗原恢复在柠檬酸盐缓冲液中在95ºC进行20分钟，接着在3% H2O2中孵育组织10分钟。然后将组织在含10%亲和素溶液的封闭缓冲液(来自二抗产生的物种的10%血清和1% BSA/PBS)中在室温下孵育1小时。在每一步骤后将切片在PBS中洗涤三次，各自5分钟。然后施加在含10%生物素溶液的封闭缓冲液中的一抗1小时，对于抗体F4/80 (Santa Cruz cat# sc-25830)、TGFβ (Santa Cruz cat# sc-7892)、IL-6 (Santa Cruz cat# sc-1265)的浓度为1:100和对于TNFα抗体(Santa Cruz cat# sc-1348)的浓度为1:50。然后施加生物素化二抗30分钟，对于F4/80、TGFβ和IL-6切片浓度为1:200，对于TNFα切片浓度为1:100，接着施加HRP缀合酶另外30分钟。使用二氨基联苯胺(DAB)底物试剂盒(Vector labs)显色10分钟和在水中洗涤玻片，脱水和固定，无需复染以利于基于计算机的图像分析。来自肾皮质的染色组织切片通过数字图像捕获，接着使用自动化图像分析软件量化进行分析。
如下通过用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口端标记(TUNEL)染色在组织切片中评价凋亡。肾切片中的凋亡细胞使用ApopTag®过氧化物酶试剂盒(Millipore)如下染色。将来自各小鼠的石蜡包埋、福尔马林固定的肾切片脱石蜡、再水合，然后使用蛋白酶K (20 µg/mL)蛋白渗透，其在室温下施加至各样本15分钟。在步骤之间样本在PBS中洗涤。内源性过氧化物酶活性通过在3% H2O2中孵育组织10分钟淬灭。然后将组织在平衡缓冲液中孵育，接着用TdT酶在37ºC孵育1小时。在终止/洗涤缓冲液中洗涤10分钟后，抗-洋地黄毒苷缀合物在室温下施加30分钟，接着洗涤。在DAB底物试剂盒中显色4分钟，接着在水中洗涤。将组织在苏木精中复染和在DBX中固定。TUNEL染色的(棕色)凋亡细胞的频率使用Leica DBXM光学显微镜在来自皮质的连续选择的20个高倍视野下手动计数。
结果：
蛋白尿的评估
为证实小鼠中蛋白尿的存在，在第15天分析血清中的总蛋白和在研究第15天经24小时收集的尿液样品中测量尿液中的总分泌蛋白。
图23图示在仅接受盐水的野生型对照小鼠(n=2)、接受BSA的野生型小鼠(n=6)和接受BSA的MASP-2-/-小鼠(n=6)中，第15天测量的血清蛋白质的总量(mg/ml)。如图23所示，在野生型和MASP-2-/-组中，给予BSA增加血清总蛋白水平至超过两倍仅接受盐水的对照组的浓度，且在处理组之间没有显著差异。
图24图示在研究第15天经24小时收集的尿液中分泌的蛋白总量(mg)，来自仅接受盐水的野生型对照小鼠(n=2)、接受BSA的野生型小鼠(n=6)和接受BSA的MASP-2-/-小鼠(n=6)。如图24所示，在本研究的第15天，与仅接受盐水的假处理对照组相比，在BSA处理组中在尿液中总分泌蛋白存在大约6倍增加。图23和24显示的结果证实蛋白尿模型有效，如所期望的。
肾的组织学变化评估
图25显示代表性的H&E染色肾组织切片，其在蛋白过载研究第15天从以下小鼠组收获：(图A)野生型对照小鼠；(图B) MASP-2-/-对照小鼠；(图C)用BSA处理的野生型小鼠；和(图D)用BSA处理的MASP-2-/-小鼠。如图25所示，在相同水平的蛋白过载攻击下，与野生型过载组(图C)相比，在MASP-2-/-过载组(图D)中存在更高程度的组织保存。例如，观察到与野生型对照组(图A)的鲍曼氏囊相比，在用BSA处理的野生型小鼠(过载)中的鲍曼氏囊极大扩大(图C)。相比之下，用相同水平的BSA处理的MASP-2-/-小鼠(过载)的鲍曼氏囊(图D)保持类似于MASP-2-/-对照小鼠(图B)和野生型对照小鼠(图A)的形态学。如图25进一步显示的，大蛋白铸造结构已在野生型肾切片(图C)的近端和远端小管中积聚，其与MASP-2-/-小鼠(图D)相比更大和更丰富。
还注意，来自本研究的肾切片通过发射电子显微镜的分析表明，用BSA处理的小鼠具有对远端和近端小管细胞的纤毛边界的总体损伤，其中细胞内容物和核胀破进入小管腔。相比之下，在用BSA处理的MASP-2-/-小鼠中组织得到保存。
肾中巨噬细胞浸润的评估
为了测量通过巨噬细胞浸润指示的炎症程度，收获的肾的组织切片还用巨噬细胞特异性抗体F4/80使用描述于Boor等人，J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515，2007中的方法染色。
图26图示用巨噬细胞特异性抗体F4/80染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，显示巨噬细胞平均染色面积(%)，其中在蛋白过载研究第15天从野生型对照小鼠(n=2)、用BSA处理的野生型小鼠(n=6)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=5)获得组织切片。如图26所示，用F4/80抗-巨噬细胞抗体染色的肾组织切片显示，尽管与野生型假对照组相比，用BSA处理的两个组显示肾巨噬细胞浸润显著增加(测量为%F4/80抗体染色面积)，但与来自BSA处理的野生型小鼠的组织切片中的巨噬细胞浸润相比，观察到在来自BSA处理的MASP-2-/-小鼠的组织切片中的巨噬细胞浸润显著减少(p值=0.0345)。
图27A图示通过在来自24小时样品的尿液中测量的总分泌蛋白与巨噬细胞浸润(平均染色面积%)作图，分析在用BSA处理的各野生型小鼠(n=6)中巨噬细胞-蛋白尿相关性的存在。如图27A所示，来自野生型肾的大部分样品显示存在的蛋白尿水平和巨噬细胞浸润程度正相关。
图27B图示通过在24小时样品的尿液中的总分泌蛋白与巨噬细胞浸润(平均染色面积%)作图，在用BSA处理的各MASP-2-/-小鼠(n=5)中分析巨噬细胞-蛋白尿相关性的存在。如图27B所示，在MASP-2-/-小鼠中未观察到在野生型小鼠中观察到的在蛋白尿水平和巨噬细胞浸润程度之间的正相关(图27A显示)。尽管不希望受任何特定理论的约束，这些结果可能表明，在MASP-2-/-小鼠中在高水平的蛋白尿下存在炎症清除机制。
细胞因子浸润的评估
白细胞介素6 (IL-6)、转化生长因子β (TGFβ)和肿瘤坏死因子α (TNFα)是促炎性细胞因子，其已知在蛋白尿模型的野生型小鼠的近端小管中被上调(Abbate M.等人，Journal of the American Society of Nephrology: JASN，17: 2974-2984，2006; DavidS.等人，Nephrology，Didalysis，Transplantation，Official Publication of theEuropean Dialysis and Transplant Association- European Renal Association 12:51-56，1997)。肾的组织切片用细胞因子特异性抗体按上文所述染色。
图28图示在用BSA处理的野生型小鼠(n=4)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=5)中用抗-TGFβ抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(测量为% TGFβ抗体染色面积)。如图28所示，观察到与MASP-2-/- BSA处理(过载)组相比，在野生型BSA处理(过载)组中TGFβ染色的显著增加(p=0.026)。
图29图示在用BSA处理的野生型小鼠(n=4)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=5)中用抗-TNFα抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(测量为% TNFα抗体染色面积)。如图29所示，与MASP-2-/- BSA处理(过载)组相比，在野生型BSA处理(过载)组中观察到TNFα染色显著增加(p=0.0303)。
图30图示在野生型对照小鼠、MASP-2-/-对照小鼠、用BSA处理的野生型小鼠(n=7)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=7)中，用抗-IL-6抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(测量为% IL-6抗体染色面积)。如图30所示，与MASP-2-/- BSA处理组相比，在野生型BSA处理组中观察到IL-6染色高度显著增加(p=0.0016)。
凋亡评估
凋亡在组织切片中通过用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口端标记(TUNEL)染色评估，和TUNEL染色凋亡细胞的频率在来自皮质的连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数。
图31图示在来自野生型对照小鼠(n=1)、MASP-2-/-对照小鼠(n=1)、用BSA处理的野生型小鼠(n=6)和用BSA处理的MASP-2-/-小鼠(n=7)的肾皮质的组织切片的连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数的TUNEL凋亡细胞的频率。如图31所示，与获自用BSA处理的MASP-2-/-小鼠的肾相比，在获自用BSA处理的野生型小鼠的肾中观察到在皮质中显著更高的凋亡率(p=0.0001)。
结果和结论总述：
本实施例的结果证实，在蛋白过载模型中MASP-2-/-小鼠具有减少的肾损伤。因此，MASP-2抑制剂，例如MASP-2抑制性抗体，预期抑制或阻止炎症和蛋白尿的有害循环，和改善慢性肾疾病的结果。
实施例17
本实施例描述了在野生型小鼠的小鼠蛋白过载蛋白尿模型中单克隆MASP-2抑制性抗体减轻和/或预防肾炎症和小管间质性损伤的功效的分析。
背景/基本原理：
如实施例16所述，在蛋白尿的蛋白过载模型中，确定MASP-2-/-小鼠显示比野生型小鼠显著更好的结果(例如，较少的小管间质性损伤和较少肾炎症)，暗示凝集素途径在蛋白尿肾疾病中的致病作用。
如实施例13所述，产生单克隆MASP-2抑制性抗体(OMS646-SGMI-2)，其特异性阻断人凝集素途径的功能和还表明在小鼠中阻断凝集素途径。在本实施例中，在小鼠蛋白过载蛋白尿模型中分析MASP-2抑制性抗体OMS646-SGMI-2在野生型小鼠中减轻和/或预防肾炎症和肾小管间质性损伤的功效。
方法：
本研究评价了与人IgG4同种型对照抗体ET904 (10 mg/kg)和盐水对照相比MASP-2抑制性抗体(10 mg/kg OMS646-SGMI-2)的作用。
类似于实施例16所述的研究，本研究利用蛋白过载来诱导蛋白尿肾疾病(Ishola等人，European Renal Association 21:591-597，2006)。蛋白尿在单侧肾切除的Balb/c小鼠中通过每日i.p.注射递增剂量(2 g/kg至15 g/kg)的低内毒素牛血清白蛋白(BSA)诱导，总共15天，如实施例16所述。
抗体治疗通过蛋白尿诱导前7天开始两周一次i.p.注射给予，和持续整个研究。该剂量方案根据证实持续凝集素途径抑制(数据未显示)的之前PK/PD和药理学研究选择。在第15天处死小鼠，收获肾并经处理以进行H&E和免疫染色。来自肾皮质的染色组织切片通过数字图像捕获，接着使用自动化图像分析软件量化进行分析。
免疫组织化学染色和凋亡评估如实施例16所述进行。
结果：
蛋白尿评估
为了证实小鼠中蛋白尿的存在，在第15天(实验结束)经24小时收集的尿液样品中测量尿液中的总分泌蛋白。确定了与未用BSA处理的对照组相比，尿液样品显示在用BSA处理的组中总蛋白水平平均几乎6倍增加(数据未显示)，证实了在用BSA处理的小鼠中蛋白尿的存在。在BSA处理组之间未观察到蛋白水平显著差异。
组织学变化评估
图32显示用BSA处理后第15天，来自以下组的小鼠的代表性的H&E染色组织切片：(图A) 用盐水处理的野生型对照小鼠；(图B) 同种型抗体处理的对照小鼠；和(图C) 用MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠。
如图32所示，在相同水平的蛋白过载攻击下，与用盐水(图A)或同种型对照(图B)处理的野生型组相比，在MASP-2抑制性抗体-处理组(图C)中存在更高程度的组织保存。
凋亡评估
通过用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口端标记(TUNEL)染色在组织切片中评价凋亡，和TUNEL染色凋亡细胞的频率在来自皮质的连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数。图33图示在来自用盐水对照和BSA处理的野生型小鼠(n=8)、用同种型对照抗体和BSA处理的野生型小鼠(n=8)和用MASP-2抑制性抗体和BSA处理的野生型小鼠(n=7)的肾皮质的组织切片的连续选择的20个高倍视野(HPF)中计数的TUNEL凋亡细胞的频率。如图33所示，与盐水和同种型对照处理组相比，在获自MASP-2抑制性抗体处理组的肾中观察到在皮质中凋亡率高度显著减少(对于盐水对照与MASP-2抑制性抗体，p=0.0002；对于同种型对照与MASP-2抑制性抗体，p=0.0052)。
细胞因子浸润的评估
白细胞介素6 (IL-6)、转化生长因子β (TGFβ)和肿瘤坏死因子α (TNFα)，它们是已知在蛋白尿模型的野生型小鼠的近端小管中被上调的促炎性细胞因子，在本研究获得的肾组织切片中进行评价。
图34图示在用BSA和盐水处理的野生型小鼠(n=8)、用BSA和同种型对照抗体处理的野生型小鼠(n=7)和用BSA和MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠(n=8)中，用抗-TGFβ抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(测量为% TGFβ抗体染色面积)。如图34所示，TGFβ染色面积的量化表明，与盐水和同种型对照抗体处理的对照组相比，在MASP-2抑制性抗体处理的小鼠中TGFβ水平显著减少(分别地，p值= 0.0324和0.0349)。
图35图示在用BSA和盐水处理的野生型小鼠(n=8)、用BSA和同种型对照抗体处理的野生型小鼠(n=7)和用BSA和MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠(n=8)中，用抗-TNFα抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(测量为% TNFα抗体染色面积)。如图35所示，染色切片的分析表明，与盐水对照组(p=0.011)以及同种型对照组(p=0.0285)相比，在MASP-2抑制性抗体处理组中TNFα水平显著减少。
图36图示在用BSA和盐水处理的野生型小鼠(n=8)、用BSA和同种型对照抗体处理的野生型小鼠(n=7)和用BSA和MASP-2抑制性抗体处理的野生型小鼠(n=8)中，用抗-IL-6抗体染色的组织切片的基于计算机的图像分析的结果(测量为% IL-6抗体染色面积)。如图36所示，染色切片的分析表明，与盐水对照组(p=0.0269)以及同种型对照组(p=0.0445)相比，在MASP-2抑制性抗体处理组中IL-6水平显著减少。
结果和结论总述：
本实施例的结果证实，使用MASP-2抑制性抗体在蛋白过载模型中提供针对肾损伤的保护作用，这与描述于实施例16的结果一致，实施例16证实在蛋白尿模型中MASP-2-/-小鼠具有减少的肾损伤。
实施例18
本实施例提供在MASP-2-/-和野生型小鼠中使用肾纤维化、炎症和肾小管间质性损伤的阿霉素诱导的肾脏病学模型来评价凝集素途径在阿霉素诱导的肾病中的作用而产生的结果。
背景/基本原理：
阿霉素是用于治疗各种癌症，包括血液恶性肿瘤、软组织肉瘤和许多类型的癌的蒽环抗肿瘤抗生素。阿霉素诱导的肾病在慢性肾疾病的啮齿动物模型中充分确立，其能够更好理解慢性蛋白尿的进展(Lee和Harris，Nephrology，16:30-38，2011)。阿霉素诱导的肾病的结构和功能损伤的类型非常类似于人的慢性蛋白尿肾疾病(Pippin等人，American Journal of Renal Physiology 296:F213-29，2009)。
阿霉素诱导的肾病的特征在于足细胞损伤，接着肾小球硬化症、肾小管间质性炎症和纤维化。在许多研究中已表明阿霉素诱导的肾病通过免疫和非免疫来源的机制调节(Lee和Harris，Nephrology，16:30-38，2011)。阿霉素诱导的肾病作为肾疾病的模型具有若干优点。首先，它是高度可再现和可预测的肾损伤模型。这是因为它的特征为在药物给予几天内诱导肾损伤，由于损伤的时间是一致的这允许容易进行实验设计。它还是其中组织损伤的程度是严重的，但伴有可接受的死亡率(<5%)和发病率(重量减轻)的模型。因此，由于阿霉素诱导的肾病的肾损伤的严重性和时间，它是适合于测试保护免于肾损伤的干预的模型。
如实施例16和17所述，在蛋白尿的蛋白过载模型中确定了MASP-2-/-小鼠和用MASP-2抑制性抗体处理的小鼠显示比野生型小鼠显著更好的结果(例如，更少的肾小管间质性损伤和更少的肾炎症)，暗示凝集素途径在蛋白尿肾疾病中的致病作用。
在本实施例中在阿霉素诱导的肾病模型(AN)中与野生型小鼠比较分析MASP-2-/-小鼠，以确定MASP-2缺陷是否减少和/或预防由阿霉素诱导的肾炎症和肾小管间质性损伤。
方法：
1. 剂量和时间点优化
进行初始实验以确定阿霉素的剂量和BALB/c小鼠发生适合于测试治疗性干预的水平的肾炎症的时间点。
三组野生型BALB/c小鼠(n=8)用IV给予的单剂量的阿霉素(10.5 mg/kg)注射。在三个时间点淘汰小鼠：阿霉素给予后一周、两周和四周。对照小鼠仅用盐水注射。
结果：三个组的所有小鼠显示肾小球硬化症和蛋白尿的迹象，如通过H&E染色确定的，以及逐渐增加程度的组织炎症，如通过在肾中巨噬细胞浸润测量的(数据未显示)。组织损伤的程度在一周组中是轻度的，在两周组中是中等的，和在四周组中是严重的(数据未显示)。两周时间点被选择用于其余的研究。
2. 在野生型和MASP-2-/-小鼠中分析阿霉素诱导的肾病
为了阐明补体的凝集素途径在阿霉素诱导的肾病中的作用，在相同剂量的阿霉素下将一组MASP-2-/-小鼠(BALB/c)与野生型小鼠(BALB/c)比较。MASP-2-/-小鼠与BALB/c小鼠回交10代。
野生型(n=8)和MASP-2-/- (n=8)用阿霉素(10.5 mg/kg) IV注射，和每个品系的三只小鼠被仅给予盐水作为对照。所有小鼠在处理后两周淘汰，和收集组织。组织病理损伤的程度通过H&E染色评价。
结果：
图37显示在用阿霉素或仅盐水(对照)处理后第14天，来自以下组小鼠的代表性的H&E染色组织切片：(图A-1、A-2、A-3)仅用盐水处理的野生型对照小鼠；(图B-1、B-2、B-3)用阿霉素处理的野生型小鼠；和(图C-1、C-2、C-3)用阿霉素处理的MASP-2-/-小鼠。每个图(例如，图A-1、A-2、A-3)代表不同的小鼠。
如图37所示，与用相同剂量的阿霉素处理的野生型组相比，在用阿霉素处理的MASP-2-/-组中存在更高程度的组织保存。
图38图示用巨噬细胞特异性抗体F4/80染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，显示在用阿霉素或仅盐水(野生型对照)处理后第14天，来自以下组小鼠的巨噬细胞平均染色面积(%)：仅用盐水处理的野生型对照小鼠；用阿霉素处理的野生型小鼠；仅用盐水处理的MASP-2-/-小鼠，和用阿霉素处理的MASP-2 -/-小鼠。如图38所示，与用阿霉素处理的野生型小鼠相比，用阿霉素处理的MASP-2-/-小鼠具有减少的巨噬细胞浸润(**p=0.007)。
图39图示用天狼星红染色的肾组织切片的基于计算机的图像分析的结果，显示在用阿霉素或仅盐水(野生型对照)处理后第14天，来自以下组的小鼠的胶原沉积染色面积(%)：仅用盐水处理的野生型对照小鼠；用阿霉素处理的野生型小鼠；仅用盐水处理的MASP-2-/-小鼠，和用阿霉素处理的MASP-2 -/-小鼠。如图39所示，与用阿霉素处理的野生型小鼠相比，用阿霉素处理的MASP-2-/-小鼠具有减少的胶原沉积(**p=0.005)。
总述和结论：
肾小管间质性炎症的改善是治疗肾疾病的关键目标。本文提供的结果表明，补体活化的凝集素途径显著促进肾小管间质性炎症的发生。如本文进一步证实的，MASP-2抑制剂、例如MASP-2抑制性抗体，可用作治疗蛋白尿肾病、阿霉素肾病和改善肾小管间质性炎症的新治疗方法。
实施例19
本实施例描述了评价全人单克隆 MASP-2抑制性抗体在具有类固醇依赖性免疫球蛋白A肾病(IgAN)的成人中和在具有类固醇依赖性膜性肾病(MN)的成人中的安全性和临床功效的正进行的2期临床试验的初始结果。
背景：
慢性肾疾病影响美国超过2千万人(Drawz P.等人，Ann Intern Med 162(11);ITC1-16，2015)。肾小球性肾病(GN)，包括IgAN和MN是其中肾小球损伤和经常导致晚期肾疾病和透析的肾疾病。存在若干类型的原发性GN，最常见的是IgAN。许多这些患者具有持续的肾炎症和进行性损害。通常，这些患者用皮质类固醇或免疫抑制剂治疗，其具有许多严重的长期不良后果。许多患者持续恶化，甚至在这些治疗时。没有治疗被批准用于治疗IgAN或MN。
IgA肾病
免疫球蛋白A肾病(IgAN)是一种自身免疫性肾疾病，导致肾内炎症和肾损伤。IgAN是全世界最常见的原发性肾小球疾病。按照大约2.5/100,000的每年发生率，估计在美国1/1400人将发生IgAN。多达40%的IgAN患者将发生晚期肾疾病(ESRD)。患者通常呈现为显微镜性血尿以及轻度至中度蛋白尿和变化水平的肾机能不全(Wyatt R.J.等人，N Engl J Med368(25):2402-14，2013)。临床标志例如肾功能受损、持续高血压和重蛋白尿(超过1 g/天)与预后差有关(Goto M等人，Nephrol Dial Transplant 24(10):3068-74，2009; BerthouxF.等人，J Am Soc Nephrol 22(4):752-61，2011)。在多个大型观察研究和前瞻性试验中，蛋白尿是最强预后因子，不依赖于其它风险因子(Coppo R.等人，J Nephrol 18(5):503-12，2005; Reich H. N.等人，J Am Soc Nephrol 18(12):3177-83，2007)。如果不治疗，估计在疾病发生10年内15-20%的患者达到ESRD (D’Amico G.，Am J Kidney Dis 36(2):227-37，2000)。
IgAN的诊断标志是在肾小球血管系膜中显著的IgA沉积，单独或伴随IgG、IgM或二者。在IgAN中，肾活检揭示甘露聚糖结合凝集素(MBL)(MASP-2活化的关键识别分子)的肾小球沉积，MASP-2是补体系统的凝集素途径的效应酶。肾小球MBL沉积，通常与IgA共定位和表明补体活化，以及高水平的尿MBL与IgAN的不利预后有关，其中这些患者证实比没有MBL沉积或高水平的尿MBL的患者更严重的组织学变化和系膜增殖(Matsuda M.等人，Nephron 80(4):408-13，1998; Liu LL等人，Clin Exp Immunol 169(2):148-155，2012; Roos A.等人，J Am Soc Nephrol 17(6):1724-34，2006; Liu LL等人，Clin Exp Immunol 174(1):152-60、2013)。具有MBL沉积的患者的缓解率也显著更低(Liu LL等人，Clin Exp Immunol174(1):152-60，2013)。
IgAN的当前疗法包括血压控制以及对于严重疾病(例如，新月形IgAN)，通常为皮质类固醇和/或其它免疫抑制剂，例如环磷酰胺、硫唑嘌呤或霉酚酸酯。改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease Improving Global Outcomes, KDIGO)肾小球肾炎指南(Int. Soc of Nephrol 2(2):139-274，2012)建议皮质类固醇应给予具有蛋白尿大于或等于1 g/天的患者，通常治疗持续时间为6个月。然而，甚至用侵袭性的免疫抑制性疗法，其与严重的长期后遗症有关，一些患者仍具有肾功能的进行性损害。没有批准的IgAN疗法，并且甚至使用血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素受体阻断剂(ARB)来控制血压，蛋白尿在一些患者中持续增加。这些治疗无一表明在有IgAN快速进展的风险的患者中停止或甚至减慢该疾病进展。
膜性肾病
膜性肾病(MN)的每年发生率是大约10-12/1,000,000。具有MN的患者可具有变化的临床过程，但大约25%将发生晚期肾疾病。
膜性肾病是免疫介导的肾小球疾病和成人中肾病综合征的最常见原因之一。该疾病特征为在肾小球基底膜的外面上形成免疫沉积，主要是IgG4，其包含足细胞抗原和对这些抗原特异性的抗体，导致补体活化。MN的初始表现涉及肾病综合征:蛋白尿、血白蛋白减少、高脂血症和水肿。
尽管MN可无需治疗而自发缓解，但多达1/3的患者证实肾功能的进行性损失和以诊断后5年的中位数进展至ESRD。通常，皮质类固醇用于治疗MN和存在开发替代疗法的需要。另外，根据蛋白尿的严重性确定处于中等进展风险的患者用泼尼松结合环磷酰胺或神经钙蛋白(calcinuerin)抑制剂治疗，并且这两种治疗一起通常与严重全身性不良作用有关。
方法：
在健康志愿者中进行的两个1期临床试验已表明，静脉内和皮下给予MASP-2抑制性抗体OMS646导致持续的凝集素途径抑制。
本实施例描述了来自在具有IgAN和MN的受试者中MASP-2抑制性抗体OMS646的正进行的2期无控制多中心研究的临时结果。纳入标准要求该研究中的所有患者不管肾疾病亚型如何，在研究招募前已维持稳定剂量的皮质类固醇至少12周(即，患者是类固醇依赖性的)。研究是单组试验性研究，具有12周治疗和6周随访期。
每种疾病计划招募大约4个受试者。研究经设计以评价OMS646是否可在具有IgAN和MN的受试者中改进肾功能(例如，改进蛋白尿)和减少皮质类固醇需求。迄今为止，具有IgA肾病的2个患者和具有膜性肾病的2个患者已在研究中完成治疗。
在研究进入时，每个受试者必须在尿中具有高水平的蛋白，尽管正用稳定的皮质类固醇剂量进行治疗。这些标准选择在研究期间不可能自发改善的患者。
在筛选时受试者年龄≥ 18和仅在他们诊断以下之一时包括在研究中：肾活检诊断有IgAN或肾活检诊断有原发性MN。招募的患者还必须满足所有以下纳入标准：
(1) 从在筛选期间的2次访问的每次之前连续和每日收集的三个样品，具有平均尿白蛋白/肌酸酐比> 0.6；
(2) 在筛选访问1之前已给予≥ 10 mg的泼尼松或等效剂量至少12周；
(3) 如果给予免疫抑制性疗法(例如，环磷酰胺、霉酚酸酯)，在筛选访问1之前已给予稳定剂量至少2个月，对于研究持续时间未期望剂量改变；
(4) 具有估计的肾小球滤过率(eGFR) ≥ 30 mL/min/1.73m2，通过MDRD公式1计算；
(5) 给予血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和/或血管紧张素受体阻断剂(ARB)的医生指导的稳定优化治疗，和休息时具有收缩血压<150 mmHg和舒张血压<90mmHg；
(6) 在筛选访问1的6个月内未使用belimumab、eculizumab或rituzimab；和
(7) 不具有肾移植历史。
1MDRD公式：eGFR (mL/min/1.73m2) = 175 x (SCr)-1.154 x (Age)-0.203 x (0.742，如果女性) x (1.212，如果非洲裔美国人)。注意：SCr=血清肌酸酐测量应该是mg/dL。
本研究中使用的单克隆抗体OMS646是结合和抑制人MASP-2的全人IgG4单克隆抗体。MASP-2是凝集素途径的效应酶。如实施例12证实的，OMS646紧密结合重组MASP-2 (表观平衡离解常数在100 pM范围内)和相对于同源蛋白C1s、C1r和MASP-1显示大于5,000倍选择性。在功能测定法中OMS646以纳摩尔效力(导致50%抑制[IC50]的浓度为大约3 nM)抑制人凝集素途径，但对经典途径没有显著影响。通过静脉内(IV)或皮下(SC)注射小鼠、非人灵长类动物和人而给予OMS646导致高的血浆浓度，在离体测定法中其与凝集素途径活化的抑制有关。
在本研究中，OMS646药物以100 mg/mL的浓度提供，其被进一步稀释用于IV给予。合适计算体积的OMS646 100 mg/mL注射溶液使用注射器从小瓶抽出，用于剂量制备。输注袋在制备4小时内给予。
研究由筛选(28天)、治疗(12周)和随访(6周)期组成，如下文研究设计流程图中所示。
研究设计流程图
Figure 563974DEST_PATH_IMAGE013
在筛选期内和首次OMS646剂量前，同意的受试者在两个连续3天时间的每一个中提供三个尿样品(每天一次收集)以建立尿白蛋白与肌酸酐比的基线值。筛选期后，合格的受试者接受OMS646 4 mg/kg IV每周一次，持续12周(治疗期)。在最后一个剂量的OMS646后有6周随访期。
在用OMS646治疗的起始4周期间，受试者保持他们稳定的研究前剂量的皮质类固醇。在12周治疗期的起始4周结束时，如果耐受的话，受试者经4周进行皮质类固醇递减(即，皮质类固醇剂量减少)，接着保持得到的皮质类固醇剂量的4周。目标是递减至每天≤ 6 mg泼尼松(或等效剂量)。在此阶段，在具有肾功能损害的受试者中停止递减，如研究者确定的。受试者在皮质类固醇递减期间和在整个12周治疗期间用OMS646治疗。患者然后在最后一次治疗后经过另外6周。皮质类固醇的递减和OMS646治疗允许评估OMS646是否允许维持稳定的肾功能所需的皮质类固醇剂量减少。
本研究中的关键功效测量是从基线至12周，在尿液中白蛋白与肌酸酐比(uACR)和24-小时蛋白水平的变化。尿蛋白或白蛋白的测量常规用于评价肾累及，和持续高水平的尿蛋白与肾疾病进展有关。uACR在临床上用于评价蛋白尿。
功效分析
uACR的分析值定义为对于时间点获得的所有值的平均值。uACR的计划数值在每个预定的时间点是3。uACR的基线值定义为两次筛选访问的分析值的平均值。
结果：
图40图示在用4 mg/kg MASP-2抑制性抗体(OMS646)每周治疗的12周研究过程期间在两个IgAN患者中的uACR。如图40所示，通过非转化分析，在时间点“a” (p=0.003)；时间点“b” (p=0.007)和时间点“c” (p=0.033)，从基线的变化是统计学显著的。表12提供对于用OMS646治疗的两个IgAN患者的24-小时尿蛋白数据。
表12：在OMS646治疗的IgAN患者中24-小时尿蛋白(mg/天)
Figure 462660DEST_PATH_IMAGE014
如图40和表12所示，具有IgAN的患者证实在研究过程中临床和统计学显著的肾功能改善。uACR (见图40)和24小时尿蛋白浓度(见表12)存在统计学显著的减少。如图40的uACR数据所示的，平均基线uACR是1264 mg/g和在治疗结束时达到525 mg/g (p=0.011)，在随访期结束时降低至128 mg/g。如图40进一步显示的，治疗效果在整个随访期中得到保持。24小时尿蛋白分泌的测量追踪uACR，从3156 mg/24小时平均减少至1119 mg/24小时(p=0.017)。在两个患者间治疗效果高度一致。两个患者经历大约2000 mg/天的减少和均达到部分缓解(定义为24小时尿蛋白分泌大于50%减少和/或得到的蛋白分泌少于1000 mg/天；完全缓解定义为蛋白分泌少于300 mg/天)。在两个IgA肾病患者中24-小时蛋白尿减少的幅度与肾存活的显著改善有关。两个IgA肾病患者还能够显著递减他们的类固醇，各自减少每日剂量至≤ 5 mg (60 mg至0 mg；30 mg至5 mg)。
两个MN患者还证实了在用OMS646治疗期间uACR减少。一个MN患者的uACR从1003mg/g减少至69 mg/g和在整个随访期保持该低水平。另一个MN患者的uACR从1323 mg/g减少至673 mg/g，具有变化的治疗后过程。第一个MN患者显示24-小时尿蛋白水平显著减少(基线的10,771 mg/24小时至第85天的325 mg/24小时)，实现部分和几乎完全缓解，而另一个患者保持基本上不变化(基线的4272 mg/24小时至第85天的4502 mg/24)。类固醇在两个MN患者中从30 mg递减至15 mg和从10 mg递减至5 mg。
总之，在用MASP-2抑制性抗体OMS646治疗的IgAN和MN受试者中观察到一致的肾功能改善。在具有IgAN的患者中OMS646治疗的效果是稳健的和一致的，表明强的功效信号。这些效果得到MN患者中的结果的支持。在治疗期间uACR变化的时间过程和幅度在具有IgAN和MN的所有四个患者之间是一致的。未观察到明显的安全性问题。本研究中的患者代表了治疗困难组，并认为这些患者的治疗效果可预测MASP-2抑制性抗体、例如OMS646在IgAN和MN患者、例如患有类固醇依赖性IgAN和MN的患者(即，用MASP-2抑制性抗体治疗前经历用稳定的皮质类固醇剂量治疗的患者)、包括有风险快速进展至晚期肾疾病的那些患者中的功效。
根据前述内容，在一个实施方案中，本发明提供治疗患有IgAN或MN的人受试者的方法，包括给予受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物。在一个实施方案中，方法包括给予患有IgAN或MN的人受试者足以改善肾功能(例如，改善蛋白尿)的量的MASP-2抑制性抗体。在一个实施方案中，受试者患有类固醇依赖性IgAN。在一个实施方案中，受试者患有类固醇依赖性MN。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体以足以在所述受试者中改善肾功能和/或减少皮质类固醇剂量的量给予患有类固醇依赖性IgAN或类固醇依赖性MN的受试者。
在一个实施方案中，方法进一步包括在给予受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物的步骤前，鉴定患有类固醇依赖性IgAN的人受试者。
在一个实施方案中，方法进一步包括在给予受试者包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的量的MASP-2抑制性抗体的组合物的步骤前，鉴定患有类固醇依赖性MN的人受试者。
根据本文公开的任一个实施方案，MASP-2抑制性抗体显示至少一个或多个以下特征：所述抗体以10 nM或更少的KD结合人MASP-2，所述抗体结合MASP-2的CCP1结构域中的表位，所述抗体在体外测定法中在1%人血清中以10 nM或更少的IC50抑制C3b沉积，所述抗体在90%人血清中以30 nM或更少的IC50抑制C3b沉积，其中抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段，其中所述抗体是单链分子，其中所述抗体是IgG2分子，其中所述抗体是IgG1分子，其中所述抗体是IgG4分子，其中IgG4分子包含S228P突变。在一个实施方案中，所述抗体结合MASP-2和选择性抑制凝集素途径和不显著抑制经典途径(即，抑制凝集素途径同时保留经典补体途径完整)。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体以有效改善至少一个或多个与肾功能有关的临床参数的量给予，例如蛋白尿改善(例如，uACR减少和/或24-小时尿蛋白浓度减少，例如24小时尿蛋白分泌大于20%减少，或例如24小时尿蛋白分泌大于30%减少，例如24小时尿蛋白分泌大于40%减少，例如24小时尿蛋白分泌大于50%减少)。
在一些实施方案中，所述方法包括通过导管(例如，静脉内)给予患有IgAN (例如类固醇依赖性IgAN)的受试者MASP-2抑制性抗体，持续第一段时间(例如，至少一天至一周或两周或三周或四周或更久)，接着皮下给予受试者MASP-2抑制性抗体，持续第二段时间(例如，至少两周或更久的慢性阶段)。
在一些实施方案中，方法包括通过导管(例如，静脉内)给予患有MN (例如类固醇依赖性MN)的受试者MASP-2抑制剂，持续第一段时间(例如，至少一天至一周或两周或三周或四周或更久)，接着皮下给予受试者MASP-2抑制性抗体，持续第二段时间(例如，至少两周或更久的慢性阶段)。
在一些实施方案中，方法包括静脉内、肌内或皮下给予患有IgAN (例如类固醇依赖性IgAN)或MN (例如类固醇依赖性MN)的受试者MASP-2抑制性抗体。治疗可以是慢性的，每日至每月给予，但优选地至少每两周或至少一周一次，例如一周两次或一周三次给予。
在一个实施方案中，方法包括治疗患有IgAN (例如类固醇依赖性IgAN)或MN (例如类固醇依赖性MN)的受试者，包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变区和含有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变区。在一些实施方案中，组合物包含MASP-2抑制性抗体，其包含(a) 重链可变区，包含：i) 重链CDR-H1，包含SEQ ID NO:67的31-35的氨基酸序列；和ii) 重链CDR-H2，包含SEQ ID NO:67的50-65的氨基酸序列；和iii) 重链CDR-H3，包含SEQID NO:67的95-107的氨基酸序列，和b) 轻链可变区，包含：i) 轻链CDR-L1，包含SEQ IDNO:69的24-34的氨基酸序列；和ii) 轻链CDR-L2，包含SEQ ID NO:69的50-56的氨基酸序列；和iii) 轻链CDR-L3，包含SEQ ID NO:69的89-97的氨基酸序列，或者(II) 其变体，包含与SEQ ID NO:67具有至少90%同一性(例如，与SEQ ID NO:67至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的重链可变区和与SEQ IDNO:69具有至少90%同一性(例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性)的轻链可变区。
在一些实施方案中，方法包括给予受试者包含一定量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，方法包括给予受试者包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别被包含SEQ ID NO:67所示的重链可变区和SEQ ID NO:69所示的轻链可变区的参考抗体OMS646识别的人MASP-2上的表位的至少一部分。
在一些实施方案中，方法包括给予患有或有风险发生IgAN (例如类固醇依赖性IgAN)或MN (例如类固醇依赖性MN)的受试者包含MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的轻链可变区，其剂量为1 mg/kg-10 mg/kg(即，1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg或10 mg/kg)，一周至少一次(例如一周至少两次或一周至少三次)，持续至少3周、或至少4周、或至少5周、或至少6周、或至少7周、或至少8周、或至少9周、或至少10周、或至少11周、或至少12周的时间。
其它实施方案
本说明书中提及的所有出版物、专利申请和专利通过引用并入本文。
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和组合物的各种修饰和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。尽管本发明已结合特定的所需实施方案进行了描述，但应理解要求保护的本发明不应过度限于这样的特定实施方案。
尽管已说明和描述了示例性的实施方案，但应理解可在其中进行各种变化而不脱离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 奥默罗斯公司
莱斯特大学
N. J. 布伦斯基尔
G. A. 德莫普洛斯
T. 迪勒
H-W. 施维布尔
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<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> CDS
<222> (27)..(584)
<400> 1
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Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu
1 5
ctg tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct 101
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10 15 20 25
gtg ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat 149
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30 35 40
gac cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg 197
Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu
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cgc ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag 245
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tac gac ttc gtc aag ctg agc tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg 293
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tgc ggg cag gag agc aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act 341
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tcc aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag 437
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gac att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac 485
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tag cctcccctgg agctccggcc tgcccagcag gtcagaagcc agagccagcc 634
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atggacccaa taataaacct ggccccaccc c 725
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<211> 185
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<213> 人
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<211> 2460
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<222> (22)..(2082)
<400> 4
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Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys
75 80 85 90
ggg cag gag agc aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act ttc 339
Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe
95 100 105
tac tcg ctg ggc tcc agc ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac tcc 387
Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser
110 115 120
aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag gac 435
Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp
125 130 135
att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac cac 483
Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His
140 145 150
cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gca ggc 531
His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly
155 160 165 170
tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gcc ctg tgc tcc ggc 579
Tyr Val Leu His Arg Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly
175 180 185
cag gtc ttc acc cag agg tct ggg gag ctc agc agc cct gaa tac cca 627
Gln Val Phe Thr Gln Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro
190 195 200
cgg ccg tat ccc aaa ctc tcc agt tgc act tac agc atc agc ctg gag 675
Arg Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu
205 210 215
gag ggg ttc agt gtc att ctg gac ttt gtg gag tcc ttc gat gtg gag 723
Glu Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu
220 225 230
aca cac cct gaa acc ctg tgt ccc tac gac ttt ctc aag att caa aca 771
Thr His Pro Glu Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr
235 240 245 250
gac aga gaa gaa cat ggc cca ttc tgt ggg aag aca ttg ccc cac agg 819
Asp Arg Glu Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg
255 260 265
att gaa aca aaa agc aac acg gtg acc atc acc ttt gtc aca gat gaa 867
Ile Glu Thr Lys Ser Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu
270 275 280
tca gga gac cac aca ggc tgg aag atc cac tac acg agc aca gcg cag 915
Ser Gly Asp His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln
285 290 295
cct tgc cct tat ccg atg gcg cca cct aat ggc cac gtt tca cct gtg 963
Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val
300 305 310
caa gcc aaa tac atc ctg aaa gac agc ttc tcc atc ttt tgc gag act 1011
Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr
315 320 325 330
ggc tat gag ctt ctg caa ggt cac ttg ccc ctg aaa tcc ttt act gca 1059
Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala
335 340 345
gtt tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg cca atg ccc gcg tgc agc 1107
Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser
350 355 360
att gtt gac tgt ggc cct cct gat gat cta ccc agt ggc cga gtg gag 1155
Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu
365 370 375
tac atc aca ggt cct gga gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac 1203
Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr
380 385 390
agc tgt gaa gag acc ttc tac aca atg aaa gtg aat gat ggt aaa tat 1251
Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr
395 400 405 410
gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tca 1299
Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser
415 420 425
ctc cca gtc tgt gag cct gtt tgt gga cta tca gcc cgc aca aca gga 1347
Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly
430 435 440
ggg cgt ata tat gga ggg caa aag gca aaa cct ggt gat ttt cct tgg 1395
Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp
445 450 455
caa gtc ctg ata tta ggt gga acc aca gca gca ggt gca ctt tta tat 1443
Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr
460 465 470
gac aac tgg gtc cta aca gct gct cat gcc gtc tat gag caa aaa cat 1491
Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His
475 480 485 490
gat gca tcc gcc ctg gac att cga atg ggc acc ctg aaa aga cta tca 1539
Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser
495 500 505
cct cat tat aca caa gcc tgg tct gaa gct gtt ttt ata cat gaa ggt 1587
Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly
510 515 520
tat act cat gat gct ggc ttt gac aat gac ata gca ctg att aaa ttg 1635
Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu
525 530 535
aat aac aaa gtt gta atc aat agc aac atc acg cct att tgt ctg cca 1683
Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro
540 545 550
aga aaa gaa gct gaa tcc ttt atg agg aca gat gac att gga act gca 1731
Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala
555 560 565 570
tct gga tgg gga tta acc caa agg ggt ttt ctt gct aga aat cta atg 1779
Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met
575 580 585
tat gtc gac ata ccg att gtt gac cat caa aaa tgt act gct gca tat 1827
Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr
590 595 600
gaa aag cca ccc tat cca agg gga agt gta act gct aac atg ctt tgt 1875
Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys
605 610 615
gct ggc tta gaa agt ggg ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga 1923
Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly
620 625 630
ggg gca ctg gtg ttt cta gat agt gaa aca gag agg tgg ttt gtg gga 1971
Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly
635 640 645 650
gga ata gtg tcc tgg ggt tcc atg aat tgt ggg gaa gca ggt cag tat 2019
Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr
655 660 665
gga gtc tac aca aaa gtt att aac tat att ccc tgg atc gag aac ata 2067
Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile
670 675 680
att agt gat ttt taa cttgcgtgtc tgcagtcaag gattcttcat ttttagaaat 2122
Ile Ser Asp Phe
685
gcctgtgaag accttggcag cgacgtggct cgagaagcat tcatcattac tgtggacatg 2182
gcagttgttg ctccacccaa aaaaacagac tccaggtgag gctgctgtca tttctccact 2242
tgccagttta attccagcct tacccattga ctcaagggga cataaaccac gagagtgaca 2302
gtcatctttg cccacccagt gtaatgtcac tgctcaaatt acatttcatt accttaaaaa 2362
gccagtctct tttcatactg gctgttggca tttctgtaaa ctgcctgtcc atgctctttg 2422
tttttaaact tgttcttatt gaaaaaaaaa aaaaaaaa 2460
<210> 5
<211> 686
<212> PRT
<213> 人
<400> 5
Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr
1 5 10 15
Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser
20 25 30
Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr
35 40 45
Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe
50 55 60
Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser
65 70 75 80
Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp
85 90 95
Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser
100 105 110
Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr
115 120 125
Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val
130 135 140
Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu
145 150 155 160
Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn
165 170 175
Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg
180 185 190
Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile
210 215 220
Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu
225 230 235 240
Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly
245 250 255
Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn
260 265 270
Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly
275 280 285
Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met
290 295 300
Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu
305 310 315 320
Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln
325 330 335
Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly
340 345 350
Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro
355 360 365
Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly
370 375 380
Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe
385 390 395 400
Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly
405 410 415
Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro
420 425 430
Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly
435 440 445
Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly
450 455 460
Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr
465 470 475 480
Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp
485 490 495
Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala
500 505 510
Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly
515 520 525
Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile
530 535 540
Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser
545 550 555 560
Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr
565 570 575
Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile
580 585 590
Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro
595 600 605
Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly
610 615 620
Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu
625 630 635 640
Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly
645 650 655
Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val
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Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe
675 680 685
<210> 6
<211> 671
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala
1 5 10 15
Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp
20 25 30
Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His
35 40 45
Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu
50 55 60
Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser
85 90 95
Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe
100 105 110
Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln
115 120 125
Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His
130 135 140
Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg
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Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys
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Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val
195 200 205
Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr
210 215 220
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Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser
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Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro
275 280 285
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Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp
325 330 335
Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly
340 345 350
Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro
355 360 365
Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr
370 375 380
Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp
385 390 395 400
Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu
405 410 415
Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly
420 425 430
Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu
435 440 445
Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu
450 455 460
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485 490 495
Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala
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Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val
515 520 525
Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu
530 535 540
Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu
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565 570 575
Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr
580 585 590
Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser
595 600 605
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Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys
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Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe
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<211> 4900
<212> DNA
<213> 人
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cctgtcctgc ctgcctggaa ctctgagcag gctggagtca tggagtcgat tcccagaatc 60
ccagagtcag ggaggctggg ggcaggggca ggtcactgga caaacagatc aaaggtgaga 120
ccagcgtagg actgcagacc aggccaggcc agctggacgg gcacaccatg aggtaggtgg 180
gcgccacagc ctccctgcag ggtgtggggt gggagcacag gcctgggcct caccgcccct 240
gccctgccca taggctgctg accctcctgg gccttctgtg tggctcggtg gccaccccct 300
taggcccgaa gtggcctgaa cctgtgttcg ggcgcctggc atcccccggc tttccagggg 360
agtatgccaa tgaccaggag cggcgctgga ccctgactgc accccccggc taccgcctgc 420
gcctctactt cacccacttc gacctggagc tctcccacct ctgcgagtac gacttcgtca 480
aggtgccgtc agacgggagg gctggggttt ctcagggtcg gggggtcccc aaggagtagc 540
cagggttcag ggacacctgg gagcaggggc caggcttggc caggagggag atcaggcctg 600
ggtcttgcct tcactccctg tgacacctga ccccacagct gagctcgggg gccaaggtgc 660
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tctactcgct gggctccagc ctggacatta ccttccgctc cgactactcc aacgagaagc 780
cgttcacggg gttcgaggcc ttctatgcag ccgagggtga gccaagaggg gtcctgcaac 840
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ggatctgagg acagcatcgc ctcaagtgac gcagggactg gccgggcgcg gcagctcacg 1080
cctgtaattc cagcactttg ggaggccgag gctggcttga taatttgagg gtcaggagtt 1140
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atttacaagc tgacaaagtg ggccctgcca gcgggagcgc tgcaggatgt ttgattttca 1440
gatcccagtc cctgcagaga ccaactgtgt gacctctggc aagtggctca atttctctgc 1500
tccttagaag ctgctgcaag ggttcagcgc tgtagccccg ccccctgggt ttgattgact 1560
cccctcatta gctgggtgac ctcggccgga cactgaaact cccactggtt taacagaggt 1620
gatgtttgca tctttctccc agcgctgctg ggagcttgca gcgaccctag gcctgtaagg 1680
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tctgaggtca tggatctcct gggaggagtc caggctggat cccgcctctt tccctcctga 1800
cggcctgcct ggccctgcct ctcccccaga cattgacgag tgccaggtgg ccccgggaga 1860
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cgcaggctac gtcctgcacc gtaacaagcg cacctgctca ggtgagggag gctgcctggg 1980
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ggggtgcgga gggcctgggc ctggacactg ggtgcttcta ggccctgctg cctccagctc 2100
cccttctcag ccctgcttcc cctctcagca gccaggctca tcagtgccac cctgccctag 2160
cactgagact aattctaaca tcccactgtg tacctggttc cacctgggct ctgggaaccc 2220
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accctgctcc cccgactcgg tttctcctct cggggtctct ccttgcctct ctgatctctc 2400
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gggtgggagg gtcgggaggc ggtggggcgc gctcctctct gcctaccctc ctcacagcct 2640
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atgttggggc tcctcacttc ctagaggcct cacaactcaa atgcccccca ctgcagctgg 3000
gggtggggtg gtggtatggg atggggacca agccttcctt gaaggataga gcccagccca 3060
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gggaaagggg gtgatgagag atccttcttc cggatgttcc tccaggaacc agggggctgg 3240
ctggtcttgg ctgggttcgg gtaggagacc catgatgaat aaacttggga atcactgggg 3300
tggctgtaag ggaatttagg ggagctccga aggggccctt aggctcgagg agatgctcct 3360
ctcttttccc gaattcccag ggacccagga gagtgtccct tcttcctctt cctgtgtgtc 3420
catccacccc cgccccccgc cctggcagag ctggtggaac tcagtgctct agcccctacc 3480
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tgtgcgctcc atcccgagtg ctgcctgttt cagctaaagc ctcaaagcaa gagaaacccc 3600
ctctctaagc ggcccctcag ccatcgggtg ggtcgtttgg tttctgggta ggcctcaggg 3660
gctggccacc tgcagggccc agcccaaccc agggatgcag atgtcccagc cacatccctg 3720
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acccagaggt ctggggagct cagcagccct gaatacccac ggccgtatcc caaactctcc 3900
agttgcactt acagcatcag cctggaggag gggttcagtg tcattctgga ctttgtggag 3960
tccttcgatg tggagacaca ccctgaaacc ctgtgtccct acgactttct caaggtctgg 4020
ctcctgggcc cctcatcttg tcccagatcc tcccccttca gcccagctgc accccctact 4080
tcctgcagca tggcccccac cacgttcccg tcaccctcgg tgaccccacc tcttcaggtg 4140
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caccccaatc catggcctgg gttggcctca ttggctgtcc ctgaaatgct gaggaggtgg 4260
gttacttccc tccgcccagg ccagacccag gcagctgctc cccagctttc atgagcttct 4320
ttctcagatt caaacagaca gagaagaaca tggcccattc tgtgggaaga cattgcccca 4380
caggattgaa acaaaaagca acacggtgac catcaccttt gtcacagatg aatcaggaga 4440
ccacacaggc tggaagatcc actacacgag cacagtgagc aagtgggctc agatccttgg 4500
tggaagcgca gagctgcctc tctctggagt gcaaggagct gtagagtgta gggctcttct 4560
gggcaggact aggaagggac accaggttta gtggtgctga ggtctgaggc agcagcttct 4620
aaggggaagc acccgtgccc tcctcagcag cacccagcat cttcaccact cattcttcaa 4680
ccacccattc acccatcact catcttttac ccacccaccc tttgccactc atccttctgt 4740
ccctcatcct tccaaccatt catcaatcac ccacccatcc atcctttgcc acacaaccat 4800
ccacccattc ttctacctac ccatcctatc catccatcct tctatcagca tccttctacc 4860
acccatcctt cgttcggtca tccatcatca tccatccatc 4900
<210> 8
<211> 136
<212> PRT
<213> 人
<400> 8
Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr
1 5 10 15
Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser
20 25 30
Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr
35 40 45
Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe
50 55 60
Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser
65 70 75 80
Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp
85 90 95
Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser
100 105 110
Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr
115 120 125
Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala
130 135
<210> 9
<211> 181
<212> PRT
<213> 人
<400> 9
Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr
1 5 10 15
Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser
20 25 30
Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr
35 40 45
Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe
50 55 60
Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser
65 70 75 80
Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp
85 90 95
Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser
100 105 110
Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr
115 120 125
Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val
130 135 140
Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu
145 150 155 160
Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn
165 170 175
Lys Arg Thr Cys Ser
180
<210> 10
<211> 293
<212> PRT
<213> 人
<400> 10
Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr
1 5 10 15
Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser
20 25 30
Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr
35 40 45
Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe
50 55 60
Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser
65 70 75 80
Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp
85 90 95
Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser
100 105 110
Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr
115 120 125
Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val
130 135 140
Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu
145 150 155 160
Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn
165 170 175
Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg
180 185 190
Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile
210 215 220
Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu
225 230 235 240
Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly
245 250 255
Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn
260 265 270
Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly
275 280 285
Trp Lys Ile His Tyr
290
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 人
<400> 11
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys
1 5 10 15
Asp His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg
20 25 30
Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys
35 40
<210> 12
<211> 242
<212> PRT
<213> 人
<400> 12
Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn
20 25 30
Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala
35 40 45
Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His
50 55 60
Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr
65 70 75 80
His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn
85 90 95
Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys
100 105 110
Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly
115 120 125
Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val
130 135 140
Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys
145 150 155 160
Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly
165 170 175
Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala
180 185 190
Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile
195 200 205
Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val
210 215 220
Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser
225 230 235 240
Asp Phe
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ala Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu
1 5 10 15
<210> 15
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp
1 5 10 15
Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln
35 40
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn
1 5
<210> 17
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr
1 5 10 15
Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe
20 25
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly
1 5
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys
1 5 10 15
Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val
20 25
<210> 20
<211> 960
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> CDS
<222> (51)..(797)
<400> 20
attaactgag attaaccttc cctgagtttt ctcacaccaa ggtgaggacc atg tcc 56
Met Ser
1
ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca gcg tct 104
Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala Ala Ser
5 10 15
tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cct gca 152
Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala
20 25 30
gtg att gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaa gat 200
Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp
35 40 45 50
ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc 248
Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu
55 60 65
aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca 296
Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro
70 75 80
ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga 344
Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly
85 90 95
aaa agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct 392
Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala
100 105 110
ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg 440
Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu
115 120 125 130
ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg 488
Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met
135 140 145
acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg 536
Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val
150 155 160
gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctc atc 584
Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile
165 170 175
aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa ggg cag 632
Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln
180 185 190
ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag 680
Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu
195 200 205 210
ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg 728
Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu
215 220 225
aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc 776
Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala
230 235 240
gtc tgt gag ttc cct atc tga agggtcatat cactcaggcc ctccttgtct 827
Val Cys Glu Phe Pro Ile
245
ttttactgca acccacaggc ccacagtatg cttgaaaaga taaattatat caatttcctc 887
atatccagta ttgttccttt tgtgggcaat cactaaaaat gatcactaac agcaccaaca 947
aagcaataat agt 960
<210> 21
<211> 248
<212> PRT
<213> 人
<400> 21
Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala
1 5 10 15
Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys
20 25 30
Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly
35 40 45
Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly
65 70 75 80
Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp
85 90 95
Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg
100 105 110
Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe
115 120 125
Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu
130 135 140
Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala
145 150 155 160
Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn
165 170 175
Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu
180 185 190
Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp
195 200 205
Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu
210 215 220
Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His
225 230 235 240
Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
245
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 其中X at position 1代表羟脯氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 其中X at position 4代表hydrophobic residue
<400> 22
Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 其中X代表羟脯氨酸
<400> 23
Xaa Gly Lys Leu Gly
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(15)
<223> 其中在位置9和15的X代表羟脯氨酸
<400> 24
Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa Gly
1 5 10 15
<210> 25
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(27)
<223> 其中在位置3, 6, 15, 21, 24, 27的X代表
羟脯氨酸
<400> 25
Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly
1 5 10 15
Lys Leu Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa
20 25
<210> 26
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 26
Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly
1 5 10 15
Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa
20 25 30
Gly Asn Xaa Gly Pro Ser Gly Ser Xaa Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly
35 40 45
Asp Xaa Gly Lys Ser
50
<210> 27
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(33)
<223> 其中在位置3, 6, 12, 18, 21, 30, 33的X代表
羟脯氨酸
<400> 27
Gly Ala Xaa Gly Ser Xaa Gly Glu Lys Gly Ala Xaa Gly Pro Gln Gly
1 5 10 15
Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly Glu Xaa Gly Asp
20 25 30
Xaa
<210> 28
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(45)
<223> 其中在位置3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45的X代表
羟脯氨酸
<400> 28
Gly Cys Xaa Gly Leu Xaa Gly Ala Xaa Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly
1 5 10 15
Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys
20 25 30
Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Asn Gly Ala Xaa Gly Glu Xaa
35 40 45
<210> 29
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Pro Asn Arg Val Thr Ile Lys Ala
1 5 10 15
Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile
20
<210> 30
<211> 559
<212> DNA
<213> 人
<400> 30
atgaggctgc tgaccctcct gggccttctg tgtggctcgg tggccacccc cttgggcccg 60
aagtggcctg aacctgtgtt cgggcgcctg gcatcccccg gctttccagg ggagtatgcc 120
aatgaccagg agcggcgctg gaccctgact gcaccccccg gctaccgcct gcgcctctac 180
ttcacccact tcgacctgga gctctcccac ctctgcgagt acgacttcgt caagctgagc 240
tcgggggcca aggtgctggc cacgctgtgc gggcaggaga gcacagacac ggagcgggcc 300
cctggcaagg acactttcta ctcgctgggc tccagcctgg acattacctt ccgctccgac 360
tactccaacg agaagccgtt cacggggttc gaggccttct atgcagccga ggacattgac 420
gagtgccagg tggccccggg agaggcgccc acctgcgacc accactgcca caaccacctg 480
ggcggtttct actgctcctg ccgcgcaggc tacgtcctgc accgtaacaa gcgcacctgc 540
tcagccctgt gctccggcc 559
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
cgggcacacc atgaggctgc tgaccctcct gggc 34
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
gacattacct tccgctccga ctccaacgag aag 33
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
agcagccctg aatacccacg gccgtatccc aaa 33
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
cgggatccat gaggctgctg accctc 26
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
ggaattccta ggctgcata 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
ggaattccta cagggcgct 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
ggaattccta gtagtggat 19
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
tgcggccgct gtaggtgctg tcttt 25
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
ggaattcact cgttattctc gga 23
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
tccgagaata acgagtg 17
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
cattgaaagc tttggggtag aagttgttc 29
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
cgcggccgca gctgctcaga gtgtaga 27
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
cggtaagctt cactggctca gggaaata 28
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
aagaagcttg ccgccaccat ggattggctg tggaact 37
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
cgggatcctc aaactttctt gtccaccttg g 31
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
aagaaagctt gccgccacca tgttctcact agctct 36
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
cgggatcctt ctccctctaa cactct 26
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
1 5
<210> 49
<211> 4960
<212> DNA
<213> 人
<400> 49
ccggacgtgg tggcgcatgc ctgtaatccc agctactcgg gaggctgagg caggagaatt 60
gctcgaaccc cggaggcaga ggtttggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgcgag 120
gctgaggcag gtgcatcgct ttggctcagg agttcaagac cagcctgggc aacacaggga 180
gacccccatc tctacaaaaa acaaaaacaa atataaaggg gataaaaaaa aaaaaaagac 240
aagacatgaa tccatgagga cagagtgtgg aagaggaagc agcagcctca aagttctgga 300
agctggaaga acagataaac aggtgtgaaa taactgcctg gaaagcaact tctttttttt 360
tttttttttt tttgaggtgg agtctcactc tgtcgtccag gctggagtgc agtggtgcga 420
tctcggatca ctgcaacctc cgcctcccag gctcaagcaa ttctcctgcc tcagcctccc 480
gagtagctgg gattataagt gcgcgctgcc acacctggat gatttttgta tttttagtag 540
agatgggatt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctcaaact cccaacctcg tgatccaccc 600
accttggcct cccaaagtgc tgggattaca ggtataagcc accgagccca gccaaaagcg 660
acttctaagc ctgcaaggga atcgggaatt ggtggcacca ggtccttctg acagggttta 720
agaaattagc cagcctgagg ctgggcacgg tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg 780
gaggctaagg caggtggatc acctgagggc aggagttcaa gaccagcctg accaacatgg 840
agaaacccca tccctaccaa aaataaaaaa ttagccaggt gtggtggtgc tcgcctgtaa 900
tcccagctac ttgggaggct gaggtgggag gattgcttga acacaggaag tagaggctgc 960
agtgagctat gattgcagca ctgcactgaa gccggggcaa cagaacaaga tccaaaaaaa 1020
agggaggggt gaggggcaga gccaggattt gtttccaggc tgttgttacc taggtccgac 1080
tcctggctcc cagagcagcc tgtcctgcct gcctggaact ctgagcaggc tggagtcatg 1140
gagtcgattc ccagaatccc agagtcaggg aggctggggg caggggcagg tcactggaca 1200
aacagatcaa aggtgagacc agcgtagggc tgcagaccag gccaggccag ctggacgggc 1260
acaccatgag gtaggtgggc gcccacagcc tccctgcagg gtgtggggtg ggagcacagg 1320
cctgggccct caccgcccct gccctgccca taggctgctg accctcctgg gccttctgtg 1380
tggctcggtg gccaccccct tgggcccgaa gtggcctgaa cctgtgttcg ggcgcctggc 1440
atcccccggc tttccagggg agtatgccaa tgaccaggag cggcgctgga ccctgactgc 1500
accccccggc taccgcctgc gcctctactt cacccacttc gacctggagc tctcccacct 1560
ctgcgagtac gacttcgtca aggtgccgtc aggacgggag ggctggggtt tctcagggtc 1620
ggggggtccc caaggagtag ccagggttca gggacacctg ggagcagggg ccaggcttgg 1680
ccaggaggga gatcaggcct gggtcttgcc ttcactccct gtgacacctg accccacagc 1740
tgagctcggg ggccaaggtg ctggccacgc tgtgcgggca ggagagcaca gacacggagc 1800
gggcccctgg caaggacact ttctactcgc tgggctccag cctggacatt accttccgct 1860
ccgactactc caacgagaag ccgttcacgg ggttcgaggc cttctatgca gccgagggtg 1920
agccaagagg ggtcctgcaa catctcagtc tgcgcagctg gctgtggggg taactctgtc 1980
ttaggccagg cagccctgcc ttcagtttcc ccacctttcc cagggcaggg gagaggcctc 2040
tggcctgaca tcatccacaa tgcaaagacc aaaacagccg tgacctccat tcacatgggc 2100
tgagtgccaa ctctgagcca gggatctgag gacagcatcg cctcaagtga cgcagggact 2160
ggccgggcgc agcagctcac gcctgtaatt ccagcacttt gggaggccga ggctggctga 2220
tcatttgagg tcaggagttc aaggccagcc agggcaacac ggtgaaactc tatctccact 2280
aaaactacaa aaattagctg ggcgtggtgg tgcgcacctg gaatcccagc tactagggag 2340
gctgaggcag gagaattgct tgaacctgcg aggtggaggc tgcagtgaac agagattgca 2400
ccactacact ccagcctggg cgacagagct agactccgtc tcaaaaaaca aaaaacaaaa 2460
acgacgcagg ggccgagggc cccatttaca gctgacaaag tggggccctg ccagcgggag 2520
cgctgccagg atgtttgatt tcagatccca gtccctgcag agaccaactg tgtgacctct 2580
ggcaagtggc tcaatttctc tgctccttag gaagctgctg caagggttca gcgctgtagc 2640
cccgccccct gggtttgatt gactcccctc attagctggg tgacctcggg ccggacactg 2700
aaactcccac tggtttaaca gaggtgatgt ttgcatcttt ctcccagcgc tgctgggagc 2760
ttgcagcgac cctaggcctg taaggtgatt ggcccggcac cagtcccgca ccctagacag 2820
gacgaggcct cctctgaggt ccactctgag gtcatggatc tcctgggagg agtccaggct 2880
ggatcccgcc tctttccctc ctgacggcct gcctggccct gcctctcccc cagacattga 2940
cgagtgccag gtggccccgg gagaggcgcc cacctgcgac caccactgcc acaaccacct 3000
gggcggtttc tactgctcct gccgcgcagg ctacgtcctg caccgtaaca agcgcacctg 3060
ctcagccctg tgctccggcc aggtcttcac ccagaggtct ggggagctca gcagccctga 3120
atacccacgg ccgtatccca aactctccag ttgcacttac agcatcagcc tggaggaggg 3180
gttcagtgtc attctggact ttgtggagtc cttcgatgtg gagacacacc ctgaaaccct 3240
gtgtccctac gactttctca agattcaaac agacagagaa gaacatggcc cattctgtgg 3300
gaagacattg ccccacagga ttgaaacaaa aagcaacacg gtgaccatca cctttgtcac 3360
agatgaatca ggagaccaca caggctggaa gatccactac acgagcacag cgcacgcttg 3420
cccttatccg atggcgccac ctaatggcca cgtttcacct gtgcaagcca aatacatcct 3480
gaaagacagc ttctccatct tttgcgagac tggctatgag cttctgcaag gtcacttgcc 3540
cctgaaatcc tttactgcag tttgtcagaa agatggatct tgggaccggc caatgcccgc 3600
gtgcagcatt gttgactgtg gccctcctga tgatctaccc agtggccgag tggagtacat 3660
cacaggtcct ggagtgacca cctacaaagc tgtgattcag tacagctgtg aagagacctt 3720
ctacacaatg aaagtgaatg atggtaaata tgtgtgtgag gctgatggat tctggacgag 3780
ctccaaagga gaaaaatcac tcccagtctg tgagcctgtt tgtggactat cagcccgcac 3840
aacaggaggg cgtatatatg gagggcaaaa ggcaaaacct ggtgattttc cttggcaagt 3900
cctgatatta ggtggaacca cagcagcagg tgcactttta tatgacaact gggtcctaac 3960
agctgctcat gccgtctatg agcaaaaaca tgatgcatcc gccctggaca ttcgaatggg 4020
caccctgaaa agactatcac ctcattatac acaagcctgg tctgaagctg tttttataca 4080
tgaaggttat actcatgatg ctggctttga caatgacata gcactgatta aattgaataa 4140
caaagttgta atcaatagca acatcacgcc tatttgtctg ccaagaaaag aagctgaatc 4200
ctttatgagg acagatgaca ttggaactgc atctggatgg ggattaaccc aaaggggttt 4260
tcttgctaga aatctaatgt atgtcgacat accgattgtt gaccatcaaa aatgtactgc 4320
tgcatatgaa aagccaccct atccaagggg aagtgtaact gctaacatgc tttgtgctgg 4380
cttagaaagt gggggcaagg acagctgcag aggtgacagc ggaggggcac tggtgtttct 4440
agatagtgaa acagagaggt ggtttgtggg aggaatagtg tcctggggtt ccatgaattg 4500
tggggaagca ggtcagtatg gagtctacac aaaagttatt aactatattc cctggatcga 4560
gaacataatt agtgattttt aacttgcgtg tctgcagtca aggattcttc atttttagaa 4620
atgcctgtga agaccttggc agcgacgtgg ctcgagaagc attcatcatt actgtggaca 4680
tggcagttgt tgctccaccc aaaaaaacag actccaggtg aggctgctgt catttctcca 4740
cttgccagtt taattccagc cttacccatt gactcaaggg gacataaacc acgagagtga 4800
cagtcatctt tgcccaccca gtgtaatgtc actgctcaaa ttacatttca ttaccttaaa 4860
aagccagtct cttttcatac tggctgttgg catttctgta aactgcctgt ccatgctctt 4920
tgtttttaaa cttgttctta ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa 4960
<210> 50
<211> 2090
<212> DNA
<213> 鼠
<220>
<221> CDS
<222> (33)..(2090)
<400> 50
ggcgctggac tgcagagcta tggtggcaca cc atg agg cta ctc atc ttc ctg 53
Met Arg Leu Leu Ile Phe Leu
1 5
ggt ctg ctg tgg agt ttg gtg gcc aca ctt ctg ggt tca aag tgg cct 101
Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro
10 15 20
gaa cct gta ttc ggg cgc ctg gtg tcc cct ggc ttc cca gag aag tat 149
Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr
25 30 35
gct gac cat caa gat cga tcc tgg aca ctg act gca ccc cct ggc tac 197
Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr
40 45 50 55
cgc ctg cgc ctc tac ttc acc cac ttt gac ctg gaa ctc tct tac cgc 245
Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg
60 65 70
tgc gag tat gac ttt gtc aag ttg agc tca ggg acc aag gtg ctg gcc 293
Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala
75 80 85
aca ctg tgt ggg cag gag agt aca gac act gag cag gca cct ggc aat 341
Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn
90 95 100
gac acc ttc tac tca ctg ggt ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc 389
Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser
105 110 115
gac tac tcc aat gag aag ccg ttc aca ggg ttt gag gcc ttc tat gca 437
Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala
120 125 130 135
gcg gag gat gtg gat gaa tgc aga gtg tct ctg gga gac tca gtc cct 485
Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro
140 145 150
tgt gac cat tat tgc cac aac tac ttg ggc ggc tac tat tgc tcc tgc 533
Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys
155 160 165
aga gcg ggc tac att ctc cac cag aac aag cac acg tgc tca gcc ctt 581
Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu
170 175 180
tgt tca ggc cag gtg ttc aca gga aga tct ggg tat ctc agt agc cct 629
Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro
185 190 195
gag tac ccg cag cca tac ccc aag ctc tcc agc tgc acc tac agc atc 677
Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile
200 205 210 215
cgc ctg gag gac ggc ttc agt gtc atc ctg gac ttc gtg gag tcc ttc 725
Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe
220 225 230
gat gtg gag acg cac cct gaa gcc cag tgc ccc tat gac tcc ctc aag 773
Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys
235 240 245
att caa aca gac aag ggg gaa cac ggc cca ttt tgt ggg aag acg ctg 821
Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu
250 255 260
cct ccc agg att gaa act gac agc cac aag gtg acc atc acc ttt gcc 869
Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser His Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala
265 270 275
act gac gag tcg ggg aac cac aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc 917
Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser
280 285 290 295
aca gca cgg ccc tgc cct gat cca acg gcg cca cct aat ggc agc att 965
Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile
300 305 310
tca cct gtg caa gcc acg tat gtc ctg aag gac agg ttt tct gtc ttc 1013
Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe
315 320 325
tgc aag aca ggc ttc gag ctt ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aaa tca 1061
Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser
330 335 340
ttc act gct gtc tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg ccg atg cca 1109
Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro
345 350 355
gag tgc agc att att gat tgt ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc 1157
Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly
360 365 370 375
cat gtg gac tat atc aca ggc cct caa gtg act acc tac aaa gct gtg 1205
His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Gln Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val
380 385 390
att cag tac agc tgt gaa gag act ttc tac aca atg agc agc aat ggt 1253
Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly
395 400 405
aaa tat gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa 1301
Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu
410 415 420
aaa ctc ccc ccg gtt tgt gag cct gtt tgt ggg ctg tcc aca cac act 1349
Lys Leu Pro Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr
425 430 435
ata gga gga cgc ata gtt gga ggg cag cct gca aag cct ggt gac ttt 1397
Ile Gly Gly Arg Ile Val Gly Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe
440 445 450 455
cct tgg caa gtc ttg ttg ctg ggt caa act aca gca gca gca ggt gca 1445
Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Gln Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala
460 465 470
ctt ata cat gac aat tgg gtc cta aca gcc gct cat gct gta tat gag 1493
Leu Ile His Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu
475 480 485
aaa aga atg gca gcg tcc tcc ctg aac atc cga atg ggc atc ctc aaa 1541
Lys Arg Met Ala Ala Ser Ser Leu Asn Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys
490 495 500
agg ctc tca cct cat tac act caa gcc tgg ccc gag gaa atc ttt ata 1589
Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile
505 510 515
cat gaa ggc tac act cac ggt gct ggt ttt gac aat gat ata gca ttg 1637
His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu
520 525 530 535
att aaa ctc aag aac aaa gtc aca atc aac gga agc atc atg cct gtt 1685
Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn Gly Ser Ile Met Pro Val
540 545 550
tgc cta ccg cga aaa gaa gct gca tcc tta atg aga aca gac ttc act 1733
Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr
555 560 565
gga act gtg gct ggc tgg ggg tta acc cag aag ggg ctt ctt gct aga 1781
Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg
570 575 580
aac cta atg ttt gtg gac ata cca att gct gac cac caa aaa tgt acc 1829
Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Ala Asp His Gln Lys Cys Thr
585 590 595
acc gtg tat gaa aag ctc tat cca gga gta aga gta agc gct aac atg 1877
Thr Val Tyr Glu Lys Leu Tyr Pro Gly Val Arg Val Ser Ala Asn Met
600 605 610 615
ctc tgt gct ggc tta gag act ggt ggc aag gac agc tgc aga ggt gac 1925
Leu Cys Ala Gly Leu Glu Thr Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp
620 625 630
agt ggg ggg gca tta gtg ttt cta gat aat gag aca cag cga tgg ttt 1973
Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe
635 640 645
gtg gga gga ata gtt tcc tgg ggt tcc att aat tgt ggg gcg gca ggc 2021
Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly
650 655 660
cag tat ggg gtc tac aca aaa gtc atc aac tat att ccc tgg aat gag 2069
Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu
665 670 675
aac ata ata agt aat ttc taa 2090
Asn Ile Ile Ser Asn Phe
680 685
<210> 51
<211> 685
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 51
Met Arg Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser
20 25 30
Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr
35 40 45
Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe
50 55 60
Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser
65 70 75 80
Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp
85 90 95
Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser
100 105 110
Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr
115 120 125
Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val
130 135 140
Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn
165 170 175
Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg
180 185 190
Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val Ile
210 215 220
Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala Gln
225 230 235 240
Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His Gly
245 250 255
Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser His
260 265 270
Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly
275 280 285
Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr
290 295 300
Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu
305 310 315 320
Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln
325 330 335
Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly
340 345 350
Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro
355 360 365
Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Gln
370 375 380
Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe
385 390 395 400
Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe
405 410 415
Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Leu Pro Pro Val Cys Glu Pro Val
420 425 430
Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ile Gly Gly Arg Ile Val Gly Gly Gln
435 440 445
Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asn Trp Val Leu Thr
465 470 475 480
Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Lys Arg Met Ala Ala Ser Ser Leu Asn
485 490 495
Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala
500 505 510
Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly
515 520 525
Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile
530 535 540
Asn Gly Ser Ile Met Pro Val Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser
545 550 555 560
Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr
565 570 575
Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile
580 585 590
Ala Asp His Gln Lys Cys Thr Thr Val Tyr Glu Lys Leu Tyr Pro Gly
595 600 605
Val Arg Val Ser Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Thr Gly Gly
610 615 620
Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp
625 630 635 640
Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
645 650 655
Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile
660 665 670
Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu Asn Ile Ile Ser Asn Phe
675 680 685
<210> 52
<211> 670
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 52
Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val
1 5 10 15
Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp
20 25 30
Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His
35 40 45
Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro
85 90 95
Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe
100 105 110
Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg
115 120 125
Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr
130 135 140
Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Ile Leu His Gln
145 150 155 160
Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly
165 170 175
Arg Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys
180 185 190
Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Arg Leu Glu Asp Gly Phe Ser Val
195 200 205
Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Ala
210 215 220
Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Gly Glu His
225 230 235 240
Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser
245 250 255
His Lys Val Thr Ile Thr Phe Ala Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr
260 265 270
Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro
275 280 285
Thr Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val
290 295 300
Leu Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu
305 310 315 320
Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp
325 330 335
Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly
340 345 350
Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro
355 360 365
Gln Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr
370 375 380
Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly
385 390 395 400
Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Leu Pro Pro Val Cys Glu Pro
405 410 415
Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ile Gly Gly Arg Ile Val Gly Gly
420 425 430
Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly
435 440 445
Gln Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asn Trp Val Leu
450 455 460
Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Lys Arg Met Ala Ala Ser Ser Leu
465 470 475 480
Asn Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln
485 490 495
Ala Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala
500 505 510
Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr
515 520 525
Ile Asn Gly Ser Ile Met Pro Val Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala
530 535 540
Ser Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu
545 550 555 560
Thr Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro
565 570 575
Ile Ala Asp His Gln Lys Cys Thr Thr Val Tyr Glu Lys Leu Tyr Pro
580 585 590
Gly Val Arg Val Ser Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Thr Gly
595 600 605
Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu
610 615 620
Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly
625 630 635 640
Ser Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val
645 650 655
Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu Asn Ile Ile Ser Asn Phe
660 665 670
<210> 53
<211> 2091
<212> DNA
<213> 大鼠
<220>
<221> CDS
<222> (10)..(2067)
<400> 53
tggcacaca atg agg cta ctg atc gtc ctg ggt ctg ctt tgg agt ttg gtg 51
Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val
1 5 10
gcc aca ctt ttg ggc tcc aag tgg cct gag cct gta ttc ggg cgc ctg 99
Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu
15 20 25 30
gtg tcc ctg gcc ttc cca gag aag tat ggc aac cat cag gat cga tcc 147
Val Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser
35 40 45
tgg acg ctg act gca ccc cct ggc ttc cgc ctg cgc ctc tac ttc acc 195
Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr
50 55 60
cac ttc aac ctg gaa ctc tct tac cgc tgc gag tat gac ttt gtc aag 243
His Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys
65 70 75
ttg acc tca ggg acc aag gtg cta gcc acg ctg tgt ggg cag gag agt 291
Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser
80 85 90
aca gat act gag cgg gca cct ggc aat gac acc ttc tac tca ctg ggt 339
Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly
95 100 105 110
ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc gac tac tcc aat gag aag cca 387
Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro
115 120 125
ttc aca gga ttt gag gcc ttc tat gca gcg gag gat gtg gat gaa tgc 435
Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys
130 135 140
aga aca tcc ctg gga gac tca gtc cct tgt gac cat tat tgc cac aac 483
Arg Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn
145 150 155
tac ctg ggc ggc tac tac tgc tcc tgc cga gtg ggc tac att ctg cac 531
Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His
160 165 170
cag aac aag cat acc tgc tca gcc ctt tgt tca ggc cag gtg ttc act 579
Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr
175 180 185 190
ggg agg tct ggc ttt ctc agt agc cct gag tac cca cag cca tac ccc 627
Gly Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro
195 200 205
aaa ctc tcc agc tgc gcc tac aac atc cgc ctg gag gaa ggc ttc agt 675
Lys Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser
210 215 220
atc acc ctg gac ttc gtg gag tcc ttt gat gtg gag atg cac cct gaa 723
Ile Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu
225 230 235
gcc cag tgc ccc tac gac tcc ctc aag att caa aca gac aag agg gaa 771
Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu
240 245 250
tac ggc ccg ttt tgt ggg aag acg ctg ccc ccc agg att gaa act gac 819
Tyr Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp
255 260 265 270
agc aac aag gtg acc att acc ttt acc acc gac gag tca ggg aac cac 867
Ser Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His
275 280 285
aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc aca gca cag ccc tgc cct gat 915
Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp
290 295 300
cca acg gcg cca cct aat ggt cac att tca cct gtg caa gcc acg tat 963
Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr
305 310 315
gtc ctg aag gac agc ttt tct gtc ttc tgc aag act ggc ttc gag ctt 1011
Val Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu
320 325 330
ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aag tca ttc act gct gtc tgt cag aaa 1059
Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys
335 340 345 350
gat gga tct tgg gac cgg ccg ata cca gag tgc agc att att gac tgt 1107
Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys
355 360 365
ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc cac gtg gac tat atc aca ggc 1155
Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly
370 375 380
cct gaa gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac agc tgt gaa gag 1203
Pro Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu
385 390 395
act ttc tac aca atg agc agc aat ggt aaa tat gtg tgt gag gct gat 1251
Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp
400 405 410
gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tcc ctc ccg gtt tgc aag 1299
Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys
415 420 425 430
cct gtc tgt gga ctg tcc aca cac act tca gga ggc cgt ata att gga 1347
Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly
435 440 445
gga cag cct gca aag cct ggt gac ttt cct tgg caa gtc ttg tta ctg 1395
Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu
450 455 460
ggt gaa act aca gca gca ggt gct ctt ata cat gac gac tgg gtc cta 1443
Gly Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu
465 470 475
aca gcg gct cat gct gta tat ggg aaa aca gag gcg atg tcc tcc ctg 1491
Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu
480 485 490
gac atc cgc atg ggc atc ctc aaa agg ctc tcc ctc att tac act caa 1539
Asp Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln
495 500 505 510
gcc tgg cca gag gct gtc ttt atc cat gaa ggc tac act cac gga gct 1587
Ala Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala
515 520 525
ggt ttt gac aat gat ata gca ctg att aaa ctc aag aac aaa gtc aca 1635
Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr
530 535 540
atc aac aga aac atc atg ccg att tgt cta cca aga aaa gaa gct gca 1683
Ile Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala
545 550 555
tcc tta atg aaa aca gac ttc gtt gga act gtg gct ggc tgg ggg tta 1731
Ser Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu
560 565 570
acc cag aag ggg ttt ctt gct aga aac cta atg ttt gtg gac ata cca 1779
Thr Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro
575 580 585 590
att gtt gac cac caa aaa tgt gct act gcg tat aca aag cag ccc tac 1827
Ile Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr
595 600 605
cca gga gca aaa gtg act gtt aac atg ctc tgt gct ggc cta gac cgc 1875
Pro Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg
610 615 620
ggt ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga ggg gca tta gtg ttt 1923
Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe
625 630 635
cta gac aat gaa aca cag aga tgg ttt gtg gga gga ata gtt tcc tgg 1971
Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp
640 645 650
ggt tct att aac tgt ggg ggg tca gaa cag tat ggg gtc tac acg aaa 2019
Gly Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys
655 660 665 670
gtc acg aac tat att ccc tgg att gag aac ata ata aat aat ttc taa 2067
Val Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe
675 680 685
tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2091
<210> 54
<211> 685
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 54
Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser
20 25 30
Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp Thr
35 40 45
Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe
50 55 60
Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Thr
65 70 75 80
Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp
85 90 95
Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser
100 105 110
Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr
115 120 125
Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Thr
130 135 140
Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn
165 170 175
Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg
180 185 190
Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile Thr
210 215 220
Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala Gln
225 230 235 240
Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr Gly
245 250 255
Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser Asn
260 265 270
Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly
275 280 285
Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro Thr
290 295 300
Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu
305 310 315 320
Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln
325 330 335
Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly
340 345 350
Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro
355 360 365
Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Glu
370 375 380
Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe
385 390 395 400
Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe
405 410 415
Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro Val
420 425 430
Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gln
435 440 445
Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Glu
450 455 460
Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr Ala
465 470 475 480
Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp Ile
485 490 495
Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala Trp
500 505 510
Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe
515 520 525
Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn
530 535 540
Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu
545 550 555 560
Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln
565 570 575
Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Val
580 585 590
Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro Gly
595 600 605
Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly Gly
610 615 620
Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp
625 630 635 640
Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser
645 650 655
Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr
660 665 670
Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe
675 680 685
<210> 55
<211> 670
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 55
Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val
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Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp
20 25 30
Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His
35 40 45
Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu
50 55 60
Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro
85 90 95
Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe
100 105 110
Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg
115 120 125
Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr
130 135 140
Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His Gln
145 150 155 160
Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly
165 170 175
Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys
180 185 190
Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile
195 200 205
Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala
210 215 220
Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr
225 230 235 240
Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser
245 250 255
Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr
260 265 270
Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro
275 280 285
Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val
290 295 300
Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu
305 310 315 320
Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp
325 330 335
Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly
340 345 350
Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro
355 360 365
Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr
370 375 380
Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly
385 390 395 400
Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro
405 410 415
Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly
420 425 430
Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly
435 440 445
Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr
450 455 460
Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp
465 470 475 480
Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala
485 490 495
Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly
500 505 510
Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile
515 520 525
Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser
530 535 540
Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr
545 550 555 560
Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile
565 570 575
Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro
580 585 590
Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly
595 600 605
Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu
610 615 620
Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly
625 630 635 640
Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val
645 650 655
Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe
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<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人
<400> 56
atgaggctgc tgaccctcct gggccttc 28
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人
<400> 57
gtgcccctcc tgcgtcacct ctg 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人
<400> 58
cagaggtgac gcaggagggg cac 23
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人
<400> 59
ttaaaatcac taattatgtt ctcgatc 27
<210> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠
<400> 60
atgaggctac tcatcttcct gg 22
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠
<400> 61
ctgcagaggt gacgcagggg ggg 23
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠
<400> 62
ccccccctgc gtcacctctg cag 23
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠
<400> 63
ttagaaatta cttattatgt tctcaatcc 29
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠
<400> 64
gaggtgacgc aggaggggca ttagtgttt 29
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<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠
<400> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aggggtaaaa tgggtgtgag ctggatccgt 120
cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgagtga cgaaaaatcc 180
tacaggacat cgctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240
gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300
cgacgtggag gaattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctca 354
<210> 67
<211> 118
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
tcctatgagc tgatacagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaccatt 60
acctgtgcgg gagacaacct tgggaagaaa cgtgtgcact ggtaccagca gaggccaggc 120
caggcccctg tgttggtcat ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgaccga 180
ttctctgcct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcactagggg cgaagccggg 240
gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gacattgcta ctgatcatgt ggtcttcggc 300
ggagggacca agctcaccgt ccta 324
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Gly Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ala Thr Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly
100 105 110
Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
115 120
<210> 72
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Leu Glu Val Thr Cys Glu Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Cys Arg Cys Gly Ser Asp Gly Lys Ser Ala Val Cys Thr Lys Leu
20 25 30
Trp Cys Asn Gln
35
<210> 73
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Thr Cys Glu Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Asn Thr Cys Arg
1 5 10 15
Cys Gly Ser Asp Gly Lys Ser Ala Val Cys Thr Lys Leu Trp Cys Asn
20 25 30
Gln
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Thr Cys Arg Cys Gly Ser Asp Gly Lys Ser Ala Val Cys Thr Lys Leu
1 5 10 15
Trp Cys Asn Gln
20
<210> 75
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Leu Glu Val Thr Cys Glu Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Cys Arg Cys Gly Ser Asp Gly Lys Ser Ala Val Cys Thr Lys Leu
20 25 30
Trp Cys Asn Gln Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gln Val
35 40 45
Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu
50 55 60
Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly Lys Met
65 70 75 80
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
85 90 95
Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser Leu Lys
100 105 110
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
115 120 125
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
130 135 140
Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
165 170 175
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
180 185 190
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
195 200 205
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
210 215 220
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
225 230 235 240
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
245 250 255
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
260 265 270
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
275 280 285
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
290 295 300
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
305 310 315 320
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
325 330 335
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
340 345 350
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
355 360 365
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
370 375 380
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
385 390 395 400
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
405 410 415
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
420 425 430
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
435 440 445
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
450 455 460
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
465 470 475 480
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
485 490
<210> 76
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly
20 25 30
Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala Ala Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Leu Glu Val Thr Cys Glu Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp
450 455 460
Lys Cys Asn Thr Cys Arg Cys Gly Ser Asp Gly Lys Ser Ala Val Cys
465 470 475 480
Thr Lys Leu Trp Cys Asn Gln Gly Ser Gly Ala
485 490
<210> 77
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
Leu Glu Val Thr Cys Glu Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Cys Arg Cys Gly Ser Asp Gly Lys Ser Ala Val Cys Thr Lys Leu
20 25 30
Trp Cys Asn Gln Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gln Pro
35 40 45
Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala
50 55 60
Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Tyr Trp
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr Gln Asp
85 90 95
Lys Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser
100 105 110
Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu
115 120 125
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val Phe Gly
130 135 140
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala
165 170 175
Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val
180 185 190
Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr
195 200 205
Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu
210 215 220
Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln
225 230 235 240
Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu
245 250 255
Cys Ser
<210> 78
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
115 120 125
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
130 135 140
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
180 185 190
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
195 200 205
Thr Glu Cys Ser Ala Ala Gly Gly Ser Gly Leu Glu Val Thr Cys Glu
210 215 220
Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Asn Thr Cys Arg Cys Gly Ser
225 230 235 240
Asp Gly Lys Ser Ala Val Cys Thr Lys Leu Trp Cys Asn Gln Gly Ser
245 250 255
Gly Ala
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser
1 5 10
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Ala Ala Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 81
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
Gly Ser Gly Ala
1
<210> 82
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccttg 60
gaagtgacgt gtgagcccgg aacgacattc aaagacaagt gcaatacttg tcggtgcggt 120
tcagatggga aatcggcggt ctgcacaaag ctctggtgta accagggcac cggtggaggg 180
tcgggatcca gctcacaggt caccttgaag gagtctggtc ctgtgctggt gaaacccaca 240
gagaccctca cgctgacctg caccgtctct gggttctcac tcagcagggg taaaatgggt 300
gtgagctgga tccgtcagcc cccagggaag gccctggagt ggcttgcaca cattttttcg 360
agtgacgaaa aatcctacag gacatcgctg aagagcaggc tcaccatctc caaggacacc 420
tccaaaaacc aggtggtcct tacaatgacc aacatggacc ctgtggacac agccacgtat 480
tactgtgcac ggatacgacg tggaggaatt gactactggg gccagggaac cctggtcact 540
gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcc gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 600
acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 660
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 720
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 780
acgaagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 840
gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccatgcccag cacctgagtt cctgggggga 900
ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 960
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 1020
tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 1080
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 1140
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1200
aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 1260
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1320
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1380
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 1440
caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1500
cagaagagcc tctccctgtc tctcgggaaa tga 1533
<210> 83
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60
gtcaccttga aggagtctgg tcctgtgctg gtgaaaccca cagagaccct cacgctgacc 120
tgcaccgtct ctgggttctc actcagcagg ggtaaaatgg gtgtgagctg gatccgtcag 180
cccccaggga aggccctgga gtggcttgca cacatttttt cgagtgacga aaaatcctac 240
aggacatcgc tgaagagcag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300
cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggatacga 360
cgtggaggaa ttgactactg gggccaggga accctggtca ctgtctcctc agcctccacc 420
aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660
aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720
cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380
tctctcggga aagccgctgg tggtagtggt ttggaagtga cgtgtgagcc cggaacgaca 1440
ttcaaagaca agtgcaatac ttgtcggtgc ggttcagatg ggaaatcggc ggtctgcaca 1500
aagctctggt gtaaccaggg tagtggtgct tga 1533
<210> 84
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccttg 60
gaagtgacgt gtgagcccgg aacgacattc aaagacaagt gcaatacttg tcggtgcggt 120
tcagatggga aatcggcggt ctgcacaaag ctctggtgta accagggcac cggtggaggg 180
tcgggatcca gctcacagcc agtgctgact cagcccccct cactgtccgt gtccccagga 240
cagacagcca gcatcacctg ctctggagag aaattggggg ataaatatgc ttactggtat 300
cagcagaagc caggccagtc ccctgtgttg gtcatgtatc aagataaaca gcggccctca 360
gggatccctg agcgattctc tggctccaac tctgggaaca cagccactct gaccatcagc 420
gggacccagg ctatggatga ggctgactat tactgtcagg cgtgggacag cagcactgcg 480
gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggccagc ctaaggcggc gccctcggtc 540
accctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 600
ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 660
aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 720
agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 780
acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 834
<210> 85
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60
ccagtgctga ctcagccccc ctcactgtcc gtgtccccag gacagacagc cagcatcacc 120
tgctctggag agaaattggg ggataaatat gcttactggt atcagcagaa gccaggccag 180
tcccctgtgt tggtcatgta tcaagataaa cagcggccct cagggatccc tgagcgattc 240
tctggctcca actctgggaa cacagccact ctgaccatca gcgggaccca ggctatggat 300
gaggctgact attactgtca ggcgtgggac agcagcactg cggtattcgg cggagggacc 360
aagctgaccg tcctaggcca gcctaaggcg gcgccctcgg tcaccctgtt cccgccctcc 420
tctgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg 480
ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc 540
accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctatct gagcctgacg 600
cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 660
gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tcagccgctg gtggtagtgg tttggaagtg 720
acgtgtgagc ccggaacgac attcaaagac aagtgcaata cttgtcggtg cggttcagat 780
gggaaatcgg cggtctgcac aaagctctgg tgtaaccagg gtagtggtgc ttag 834

Claims (12)

1.有效减少或预防受试者的蛋白尿的量的MASP-2抑制性单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于在患有与蛋白尿有关的疾病或病况的受试者中预防或减少肾损伤的药物中的用途，所述与蛋白尿有关的疾病或病况选自药物诱导的毒性肾病综合征、镰状细胞病、先兆子痫、子痫、肾的中毒性损害、淀粉样变、系统性红斑狼疮、脱水、膜性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎、C3肾小球病、微小病变疾病、脂性肾病、大强度运动、应激、良性直立位蛋白尿、局灶性节段性肾小球硬化、IgM肾病、膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾病、微小病变疾病、结节病、阿尔波特氏综合征、糖尿病肾病、法布里氏病、感染；氨基酸尿症、范科尼综合征、高血压肾硬化、间质性肾炎、血红蛋白尿、多发性骨髓瘤、肌红蛋白尿、器官排斥、埃博拉出血热、甲髌综合征、家族性地中海热、HELLP综合征、韦格纳氏肉芽肿病、类风湿性关节炎、糖原贮积病1型、古德帕斯彻氏综合征、过敏性紫癜、已扩散到肾的尿路感染、斯耶格伦氏综合征和感染后肾小球性肾炎。
2.权利要求1的用途，其中所述药物适用于以与治疗前的基线24小时尿蛋白分泌相比有效实现24小时尿蛋白分泌至少20%减少的量和时间给予。
3.权利要求1或2的用途，其中所述与蛋白尿有关的疾病或病况是药物诱导的毒性肾病综合征。
4.权利要求1或2的用途，其中所述受试者患有镰状细胞病。
5.权利要求1的用途，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、具有减少的效应子功能的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述MASP-2抑制性抗体不显著抑制经典途径。
7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述MASP-2抑制性抗体以30 nM或更小的IC50在90%人血清中抑制C3b沉积。
8.权利要求1的用途，其中所述药物包含以有效改进肾功能的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求4的用途，其中所述药物适用于以足以在所述受试者中改进肾功能和减少皮质类固醇剂量的量给予。
10.权利要求4的用途，其中所述用途进一步包括在给予受试者包含有效改进肾功能的量的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤之前，鉴定具有类固醇依赖性MN的人受试者。
11.权利要求1-10中任一项的用途，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
12.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述药物适用于经皮下、腹膜内、肌内、动脉内、静脉内或作为吸入剂给予。
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