DK175956B1 - Ribozymer - Google Patents

Description

Den foreliggende opfindelse angår en klasse syntetiske RNA-molekyler og derivater heraf, der i det følgende omtales som ribozymer, og som udviser meget specifik endoribonukleaseaktivitet.

DK 175956 B1 5 En række naturligt forekommende RNA-molekyler, såsom "avocado sun-blotch viroid" (ASBV), satell it-RNA'er fra tobaks ringpletvirus (sTobRV) og "lucerne-transient streak-virus" (sLTSV), undergår selvkatalyseret spaltning. En sådan spaltning viser sig at være en væsentlig og enestående del af disse og andre RNA'ers livscyklus.

10

Selvkatalyserede RNA-spaltningsreaktioner har et fælles krav til divalente metalioner og neutralt eller højere pH og resulterer i fremstilling af RNA med termini, der udviser 5'-hydroxyl- og 2',3'-cykliske phosphatgrupper (Prody et al., Science 231:1577-1580 (1986) 15 og Buzayan et al., Virology 151:186-199 (1986)). Spaltningsreaktionerne katalyseres af RNA'erne i sig selv, formodentlig som et resultat af konformation, som bringer de reaktive grupper i tæt nærhed. Stederne med selvkatalyseret spaltning i naturligt forekommende RNA'er er lokaliseret inden for meget konserverede områder 20 i den sekundære RNA-struktur (Buzayan et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 83:8859-8862 (1986) og Forster, A.C. og Symons, R.H., Cell 50:9-16 (1987)).

Forsøg, som opfinderne af den foreliggende opfindelse har udført, på 25 satellit-RNA'er fra tobaks ringpletvirus (sTobRV) har ført til udformning af hidtil ukendte endoribonukleaser (i det følgende omtalt som "ribozymer"), som er enzymer omfattende RNA, der katalyserer specifik spaltning af RNA-målmolekyler.

30 Udtrykket "ribozym", som det anvendes i beskrivelsen, refererer til molekyler, der helt udgøres af RNA eller derivater deraf.

Ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse er forskellige fra den RNA-endoribonuklease, der forekommer naturligt i Tetrahymena 35 Thermophila (kendt som IVS eller L-19 I VS RNA), og som er blevet udførligt beskrevet af Thomas Cech og medarbejdere (Zaug, A.J. et al., Science (1984) 224:574-578; Zaug, A.J. og Cech, T.R., Science (1986) 231:470-475; Zaug, A.J. et al., Nature (1986) 324:429-433; publiceret international patentansøgning nr. W0 88/04300 til 2 DK 175956 B1

University Patents Inc.)· Cechs endoribonuklease har et aktivt sted i med otte basepar, hvilket sted hybridiserer med en mål-RNA-sekvens, hvorefter der sker spaltning af mål-RNA'et med et krav om frit guanosin eller guanosinderivater. De ved spaltningen fremkomne 5 fragmenter indeholder terminale 5'-phosphat- og 3'-hydroxylgrupper.

Det begrænsede antal nukleotider, som er tilgængelige for hybridise-ring til et RNA-substrat, begrænser effektiviteten eller virkningsgraden af Cechs endoribonuklease, idet oligonukleotider omfattende mindre end 12 nukleotider almindeligvis hybridiserer dårligt ‘‘med 10 mål sekvenser. Det viser sig også, at det kan være nødvendigt, at en række nukleotider i det aktive sted i Cech-endoribonukleasen bevares med henblik på effektiv endonukleaseaktivitet. Dette begrænser antallet af permutationer af sekvenserne for det aktive sted, hvilke kan konstrueres for at bevirke hybridisering vmed mål sekvenser, 15 hvorved rækken af RNA-målsekvenser, der kan spaltes med Cech-endoribonukleasen, begrænses. Cech-Endoribonukleasen modificerer også RNA ved at tilføje et frit guanosinnukleotid til 5'enden af det spaltede RNA.

20 I modsætning hertil hybridiserer ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse effektivt til en lang række mål-RNA-sekvenser og modificerer ikke det spaltede mål-RNA.

Ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter et hybridi-25 serende område, hvis nukleotidsekvens er komplementær med i det mindste en del af mål-RNA'et, og et katalytisk område, som er tilpasset til at spalte mål-RNA'et. Det hybridi serende område indeholder 9 eller flere nukleotider.

30 I et foretrukket aspekt har ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse et hybridiserende område omfattende én eller flere arme, der er dannet af enkeltstrenget RNA og har en sekvens, som er komplementær med i det mindste en del af mål-RNA'et, hvorhos én eller flere arme er forbundet med et katalytisk område, som kan 35 spalte mål-RNA'et, hvorhos det hybridiserende område omfatter en enkelt arm af RNA, hvilken arm indeholder mindst 9 nukleotider, og hvorhos det hybridi serende område omfatter 2 eller flere RNA-arme, hvor summen af nukleotider i disse arme er over 9 nukleotider.

3 DK 175956 B1 I en udførelsesform for opfindelsen tilvejebringes der et ribozym med formlen 1: 3' 5· 5 <*>nX X(X)n- (I) A C (I)

A U

G 1A G (Π) (1)

C * G G A

10 I I X

X* X" 5 ’ 3 ' hvor X betegner et hvilket som helst ribonukleotid, og X-enhederne 15 kan være ens eller forskellige; summen af n og n' er større end 6, og n og n' kan være ens eller forskellige; en (*) betegner et basepar mellem komplementære ribonukleoti-der; 20 X' og X" betegner oligoribonukleotider med komplementær sekvens langs i det mindste en del af deres længde for at tillade baseparring mellem oligoribonukleotiderne, eller X' og X" tilsammen danner en enkelt RNA-sekvens, hvorhos i det mindste en del af sekvensen omfatter en stilk dannet ved baseparring 25 mellem komplementære nukleotider; og hvor et yderligere nukleotid udvalgt blandt A, G, C eller U eventuelt kan være indføjet efter *A i formlen (1).

Område (I) i formlen (1) repræsenterer armene eller de flankerende 30 sekvenser af et ribozym, som hybridiserer til de respektive dele af en mål-RNA-sekvens. Armene kan hybridisere langs den fulde længde af mål-RNA'et eller en del deraf. Et katalytisk RNA-område er afbildet ved område (II) i formel (1). Det katalytiske område kan indeholde ét eller flere yderligere nukleotider, som ikke påvirker den kataly-35 tiske aktivitet i uheldig retning. Sådanne tilføjelser kan let testes for ribozymaktivitet uden unødige forsøg ifølge beskrivelsen af den foreliggende opfindelse. Det katalytiske område kan også udgøre en del af det hybridiserende område.

DK 175956 B1 4 01 igoribonukleotiderne X' og X" kan omfatte op til 5000 eller flere nukleotider.

Ifølge en yderligere specifik udførelsesform for den foreliggende 5 opfindelse tilvejebringes der et ribozym med formlen (2): 3* 5· (X>rA X(X)n.

A C

AU

10 G *A G

C * G G A (2)

X * X X

X * x 15 <X)m * <X)m· X x

B

hvor X betegner et hvilket som helst ribonukleotid, og X-enhederne kan være ens eller forskellige; 20 en (*) betegner et basepar mellem komplementære ribonukleoti- der; n og n' er som tidligere defineret; m og m' er 1 eller derover og kan være ens eller forskellige; B betegner en binding, et basepar, et ribonukleotid eller et 25 oligoribonukleotid indeholdende mindst 2 ribonukleotider; og hvor .

et yderligere nukleotid udvalgt blandt A, G, C eller U eventuelt kan være indføjet efter *A i formlen (2).

30 Ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles ved fremgangsmåder, der i sig selv er kendte inden for fagområdet med syntese af RNA-molekyler. (F.eks. i overensstemmelse med de anbefalede protokoller fra Promega, Madison, WI, USA). Ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse kan navnlig fremstilles ud fra en 35 tilsvarende DNA-sekvens (DNA, som ved transkription giver et rizo-zym, og som kan syntetiseres ifølge fremgangsmåder, der i sig selv er kendte inden for fagområdet med DNA-syntese), som er operabelt forbundet til en RNA-polymerasepromoter, såsom en promoter for T7-RNA~polymerase eller SP6-RAN-polymerase. En DNA-sekvens svarende DK 175956 B1 5 til et ribozym ifølge den foreliggende opfindelse kan ligeres til en DNA-transfer-vektor, såsom et plasmid eller bakteriofag DNA. Når transfer-vektoren indeholder en RNA-polymerasepromoter, der opera-belt er forbundet til DNA svarende til et ribozym, kan ribozymet 5 passende produceres efter inkubation med en RNA-polymerase. Ribozy-mer kan derfor fremstilles in vitro ved inkubation af RNA-polymerase sammen med en RNA-polymerasepromoter, der operabelt er forbundet til DNA svarende til et ribozym i nærvær af ribonukleotider. In vivo kan prokaryote eller eukatyote celler (herunder pattedyrsceller og 10 planteceller) transficeres med en passende transfer-vektor indeholdende genetisk materiale, som svarer til et ribozym, i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, og operabelt forbundet til en RNA-polymerasepromoter, således at ribozymet transcriberes i værtscellen. Transfer-vektorer kan være bakterielle plasmider eller 15 viralt RNA eller DNA. Nukleotidsekvenser svarende til ribozymer anbringes almindeligvis under styring af kraftige promotere, såsom f.eks. lac-, den sene SV40-, tidlige SV40-, metallothionin- eller λ-promotere. Ribozymer kan transcriberes direkte in vivo fra en transfer-vektor eller kan alternativt transcriberes som en del af et 20 større RNA-molekyle. F.eks. kan DNA svarende til ribozymsekvenser ligeres til 3'-enden af et bærergen, f.eks. efter et translationsstopsignal. Større RNA-molekyler kan hjælpe til at stabilisere ribozymmolekylerne mod nukleasefordøjelse i cellerne. Efter translation kan bærergenet give anledning til et protein, hvis tilstede-25 værelse kan påvises direkte, f.eks. ved enzymatisk reaktion. Bærergenet kan f.eks. kode for et enzym.

I et yderligere aspekt af opfindelsen tilvejebringes der en DNA-transfer-vektor, som indeholder en DNA-sekvens svarende til et 30 ribozym, hvilken DNA-sekvens er operativt forbundet med en promoter for at tilvejebringe transcription af ribozymet.

Ved en foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af et ribozym fremstilles to syntetiske oligonukleotider med komplementær sekvens 35 ved standardprocedurer (f.eks. under anvendelse af et Applied Biosystems Model 380A DNA-synteseapparat (Applied Biosystems Inc.,

Foster City, California 94404, USA)) og hybridiseres sammen. Den ene af oligonukleotiderne koder for et ønsket ribozym. De respektive ender af de hybridiserede oligonukleotider svarer til forskellige DK 175956 B1 6 restriktionsenzymsteder, f.eks. EcoRl ved den ene ende og Pstl ved den anden ende. Efter spaltning med passende restriktionsenzymer (EcoRl og Pstl i ovennævnte eksempel) kan det dobbeltstrengede DNA-fragment klones i en transfer-vektor. Når plasmidvektoren S indeholder en RNA-polymerasepromoter opstrøms for den DNA-sekvens, som svarer til et ribozym ifølge den foreliggende opfindelse, kan RNA-transcripter svarende til ribozymet passende fremstilles enten in vitro eller in vivo. Når ribozymet udgøres af to halvdele, som holdes sammen ved baseparring mellem komplementære nukleotider, kan 10 hver halvdel af ribozymet fremstilles ved ovennævnte fremgangsmåder, og halvdelene kan inkuberes sammen til dannelse af ribozymet.

De foretrukne ribozymer ifølge den foreliggende opfindelse spalter mål-RNA, som indeholder sekvensen X°UY, hvor X° betegner ethvert 15 ribonukleotid, U betegner uracil, og Y betegner adenin, cytosin eller uracil. X°U udgør en del af et flankerende baseparområde, og Y er ikke baseparret. X° er fortrinsvis men på ingen måde udelukkende guanidin, og X°UY er GUC eller GUA. Ethvert RNA-molekyle, som indeholder disse sekvenser, kan spaltes med ribozymerne ifølge den 20 foreliggende opfindelse. Når sekvensen af et RNA-transcript, som indeholder sekvensen X°UY er blevet bestemt, kan armene af ribozym- sekvensen syntetiseres til at være komplementære med og således hybridiserbare til RNA-et på mål sekvensen, der flankerer X°UY-sekvensen. Efter hybridisering af ribozymets arme til mål-RNA-25 sekvensen, som flankerer X°UY-sekvensen, spalter ribozymets katalytiske område mål-RNA'et inden for X°UY-sekvensen. RNA-Spaltning lettes i nærvær af magnesium eller en anden di valent kation ved en pH på ca. 8,0.

30 De foretrukne ribozymer ifølge den foreliggende opfindelse kan følgelig konstrueres til at spalte ethvert RNA, hvis sekvens er kendt. Den høje hyppighed af enhederne, som spaltes af ribozymerne i RNA (1:64 for GUC i et RNA med tilfældig eller lige frekvens af basefordeling), betyder, at en række potentielle steder for 35 ribozymspaltning på sikker måde kan forudsiges i ethvert givet mål-RNA.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til inaktivering af en mål-RNA-sekvens, hvilken DK 175956 B1 7 fremgangsmåde omfatter omsætning af mål-RNA-sekvensen med et ribozym ifølge den foreliggende opfindelse.

In vivo, dvs. inden i cellen eller cellerne i en organisme, kan en 5 transfer-fektor, såsom et bakterielt plasmid eller viralt RNA eller DNA, som koder for ét eller flere ribozymer, transfi ceres til celler (f.eks. Llewellyn et al., J. Mol. Biol. (1987) 195:115-123; Hanahan et al., J. Mol. Biol. (1983) 166).

10 Når transfer-vektoren er kommet ind i cellen, kan den replikere og transcriberes ved hjælp af cellepolymeraser til frembringelse af ribozym-RNA'er, som derpå inaktiverer et ønsket mål-RNA. Alternativt kan en transfer-vektor, som indeholder én eller flere ribozymsekven-ser, transficeres til celler eller indføres i celler ved hjælp af 15 mikromanipuleringsmetoder, såsom mi kroindsprøjtning, således at transfer-vektoren eller en del heraf bliver integreret i værtscellens genom. Transcription af det integrerede genetiske materiale giver anledning til ribozymer, som virker ved at inaktivere et ønsket mål-RNA.

20

Ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse har omfattende terapeutiske og biologiske anvendelser. F.eks. kan sygdomsfremkal-dende vira hos menneske og dyr i naktiveres ved at indgive et ribozym ifølge den foreliggende opfindelse, som er tilpasset til at hybridi-25 sere med og spalte RNA-transcripter af virusen til et individ, som er inficeret med en virus. Sådanne ribozymer kan indgives parente-ralt eller ad andre indgivelsesveje. Alternativt kan et individ, der er inficeret med en sygdomsfremkaldende virus, indgives en ikke-virulent virus, såsom vaccinia eller adenovirus, som er blevet 30 genetisk konstrueret til at indeholde DNA svarende til et ribozym, som operabelt er forbundet med en RNA-promoter, således at ribozymet transcriberes i værtsdyrets celler, som er transficeret med den konstruerede virus, for at bevirke spaltning og/eller inaktivering af mål-RNA-transcriptet af det sygdomsfremkaldende virus. Ribozy-35 merne ifølge den foreliggende opfindelse har navnlig anvendelighed til virale sygdomme forårsaget af f.eks. Herpes simplex-virus (HSV) eller AIDS-virus (HIV).

Ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse har også særlig DK 175956 B1 8 anvendelighed til inaktivering af RNA-transcripter i bakterier eller andre prokaryote celler, planter og dyr. I bakterier kan RNA-transcripter af f.eks. bakteriofag, som forårsager bakteriecelledød, inaktiveres ved at transficere en celle med en DNA-transfer-vektor, 5 som kan producere et ribozym ifølge den foreliggende opfindelse, hvilket inaktiverer fag-DNA'et. Alternativt kan ribozymet selv sættes til og optages i bakteriecellen for at bevirke spaltning af fag-RNA'et.

10 RNA-Transcripter i planter kan inaktiveres ved at anvende ribozymer, der kodes af en transfer-vektor, såsom Ti-plasmidet af Aorobacterium tumefaciens. Når sådanne vektorer overføres til en plantecelle, produceres ribozymerne under indvirkning af RNA-polymerase og kan bevirke spaltning af en specifik mål-RNA-sekvens. Følgelig kan 15 plantevira, hvis RNA-sekvens er kendt, eller RNA-transcripter af plantegener, inaktiveres under anvendelse af ribozymer.

Endogene gentranscripter i planter, dyr eller andre celletyper kan inaktiveres under anvendelse af ribozymerne ifølge den foreliggende 20 opfindelse. Følgelig kan uønskede fænotyper eller karakteristika moduleres. Det kan f.eks. være muligt at anvende ribozymerne ifølge den foreliggende opfindelse til at fjerne sten fra frugt eller behandle nedarvede sygdomme hos mennesker, som er forårsaget af produktion af et skadeligt protein eller overproduktion af et 25 bestemt protein.

Den foreliggende opfindelse vil i det følgende kun blive illustreret som ikke-begrænsende eksempel under henvisning til nedenstående ikke-begrænsende eksempler og figurer.

30 På tegningen:

Figur 1 viser RNA-selvspaltningssteder af vild type og muterede RNA'er og en elektroforetisk profil, som viser selvkatalyserede 35 RNA-spaltningsprodukter.

(a) Gengiver de bevarede strukturer, som er forbundet med naturligt forekommende RNA-spaltningssteder i ASBV, sal amander-satel lit-DNA-transcripter og satellit-RNA'er fra sTobRV, LTSV, "velvet tobacco DK 175956 B1 9 mottle virus", "solanum nodiflorum mottle virus" og "subterranean clover, mottle virus". Nukleotidsekvenser, som er bevaret mellem disse strukturer, er vist, medens andre er repræsenteret ved X. Baseparring er repræsenteret ved og stedet for RNA-spaltning er 5 vist med en pil.

(b) Viser de bevarede nukleotidsekvenser forbundet med spaltningen af (+)-strengen af sTobRV-RNA. Spaltningsstedet er vist med en pil.

10 (c) En in vitro-mutant af sTobRV indeholdende en indføjelse på otte nukleotider (vist med en firkant) sammen med en flankerende dublet af tre nukleotider (UGU-enhederne 7-9) er vist.

(d) Subklonede Hael 11-fragmenter af vild type sTobRV og D-51 in 15 vi tro-mutanten blev hver især transcriberet i både (+)- og (-)-ret-ninger, og radioaktivt mærkede transcripter blev fraktioneret ved polyacrylamidgelelektroforese. Positionerne af de uspaltede 159- og 170-basetranscripter fra vild type (WT)- og mutant (D-51)-sekvenser er vist med pile, og størrelsen af de spaltede produkter er vist.

20

Figur 2 viser nukleotidsekvensen af et ribozym og produkterne fra ribozymspaltning adskilt ved gelelektroforese.

(a) De indføjede nukleotider i D-5]-mutanten (fi g. lc) indeholder et 25 BamHI-restriktionsendonukleasested. BamHI blev anvendt til at dele mutant-DNA, og de to sekvenser blev subklonet og transcriberet separat in vitro. RNA-Transcripterne er vist skematisk, hvor potentielle baseparringer mellem RNA'erne er anført med Fragmentet indeholdende det med pil viste spaltningssted er omtalt som S-RNA, 30 og fragmentet indeholdende ribozymet er benævnt Rz-RNA.

(b) [^P]-Rz-RNA (101 baser) blev inkuberet alene (bane 1) og med umærket S-RNA (bane 2). [^^P]-S-RNA blev inkuberet alene (bane 3) og 32 med umærket og P-mærket Rz-RNA'er (henholdsvis bane 4 og bane 5).

35

Figur 3 viser en skematisk model af et ribozym ifølge en udførelsesform af den foreliggende opfindelse. Område A repræsenterer spaltningssekvensen inden for mål-RNA'et. Område B repræsenterer et katalytisk område, og områderne C repræsenterer armene af ribozymet.

10 DK 175956 B1

I Figur 4 viser udformningen af ribozymer mål mærket over for CAT

(chloramphenicol acetyl transferase)-gentranscriptet. Ribozymer benævnt RzCAT-1, -2 og -3, blev mål mærket over for tre steder inden for et in vitro-transcript af CAT-genet på 835 baser. De relative 5 placeringer af spaltningsstederne på transcriptet er vist skematisk med nummerering af de flankerende baser (a). De tre ribozymsekvenser er vist ((b) - (d)) med deres målsekvenser. Arainosyresekvenser af CAT-genet er nummereret, og de forudsagte steder for RNA-spaltning er vist med pil. RzCAT-1 og -3 indeholder 24 basesekvenser afledt 10 fra (+)-strengen sTobRV (område B, figur 3), medens RzCAT-2 indeholder en enkelt U-A-ændring i dette område.

Figur 5 viser resultaterne fra CAT-RNA-spaltning med ribozymerne RzCAT-1 til -3.

15 op (a) [ P]-CAT-RNA'er blev gel fraktioneret efter inkubation alene (-) eller med et af de tre ribozymer, RzCAT-1 til -3 (banerne 1, 2 henholdsvis 3). Placeringen af transcriptet med fuld længde er vist med pil.

20 (b) 5'-Terminalbaseanalyse. 3'-Fragmenter produceret ved ribozym- 32 spaltning af CAT-mRNA blev [5'- P]-kinasebehandlet, geloprenset og underkastet fuldstændig nukleasefordøjelse, og de frigjorte terminale enheder blev fraktioneret ved pH 3,5 polyacrylamidgel elektro-25 forese. De 5'-terminale nukleotider bestemt ved reference til markørerne (bane M) var A, U og G for fragmenterne produceret af RzCAT-1 til -3 (banerne 1, 2 henholdsvis 3).

Figur 6 viser et tidsforløb for ribozym (RzCAT-1)-katalytisk 30 aktivitet over for CAT-RNA. Mængderne af spaltningsproduktet på 139 nukleotider blev kvantificeret og afbildet. Indføjelsen viser akkumuleringen af fragmentet på 139 baser som funktion af tiden efter polyacrylamidgelelektroforese.

35 Figur 7 viser de forholdsvise spaltningsomfang for CAT-RNA under forskellige temperaturbetingelser. Substrat-RNA er vist med en(hel) linie. I hvert tilfælde er spaltningsproduktet anført med en stiplet linie.

11 DK 175956 B1

Figur 8 viser tre ribozymer (svarende til RzCAT-2) med arme eller flankerende sekvenser med varierende længde.

Figur 9 viser skemaet for fremstilling af et ribozym omfattende 5 katalytisk anti-sense-RNA indeholdende hvert af spaltningsdomænerne RzCAT-1 til -3.

Figur 10 viser ribozymer hybridi serende til målsekvenser indeholdende GUA- (10a) og GUU- (10b) motiver i CAT-mRNA.

10

Figur 11 viser steder for selvkatalyseret RNA-spaltning i citrus-exocortis vi rois (CEV)-RNA og dets komplement.

Figur 12 viser ribozymet RzCEV25x(+) hybridiseret til mål-CEV-RNA 15 (a) og en gelelektroforetisk profil af (+)-CEV-RNA og komplementært (-)-CEV-RNA inkuberet med RzCEV25x(+) (b, bane 1 henholdsvis 2. Spaltningsproduktet er vist med pil).

Figur 13 viser ribozymet RzCAT-2 hybridiserende til sin målsekvens 20 (a) og ribozym RzSCMoV (b). Det katalytiske domæne af hvert ribozym er vist med en firkant. Forskellene i det katalytiske område af RzSCMoV i sammenligning med RzCAT-2 er markeret.

Figur 14 viser rizobymet RzCEV-2 hybridiserende til en målsekvens i 25 citrus exocortis viroid (CEV)-RNA. Spaltningsstedet svarer til nukleotid-336 i CEV-RNA-sekvensen. Ændringen i nukleotidsekvens i det katalytiske domæne i sammenligning med det katalytiske domæne af sTobRV er vist med en cirkel (a). Figur 14(b) viser en elektroforetisk profil af en kontrol-[(-)-streng af CEV]-RNA, bane 7, og 30 (+)-strengen af CEV-RNA, bane 8, efter inkubation med RzCEV-2.

Figur 15 viser ribozymet RzCAT-2 (a) i sammenligning med ribozymet RzCAT-2B (b). Katalytiske domæner er vist med en firkant. Ændringerne i det katalytiske domæne af RzCAT-2B i sammenligning med RzCAT-2 35 er også vist med en firkant.

Figur 16 viser et kort over plasmid pJ35SN.

Figur 17 er en grafisk fremstilling af gennemsnittet af fire forsøg 12 DK 175956 B1 med hæmning af CAT-ekspression i planter (tobaksprotoplaster).

Nedenstående eksempler er kun anført for at illustrere den foreliggende opfindelse og har ikke til hensigt at begrænse denne.

5

Reaktioner og manipulationer involverende DNA, såsom ligationer, restriktionsenzymfordøjelser, bakteriel transformation, DNA-sekven-sering osv., blev ud ifølge standardmetoder, såsom de, der er ' beskrevet af Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Har-10 bour, 1982). Manipulationer involverende RNA blev også udført ifølge standardmetoder, såsom de, der er beskrevet af Uhlenbeck (Nature 328, 596-600 (1987)) og Haseloff og Gerlach (Nature 334, 585-591 (1988)). ! 15 Eksempel 1 }

Selvkatalvseret soaltnino af muteret sTobRV-RNA

En koncensus af domænerne forbundet med naturligt forekommende 20 RNA-spaltningssteder i ASBV, sal amander-satel 1it-DNA-transcripter og satellit-RNA'er af sTobRV, LYSV, "velvet tobacco mottle virus" (VMOV), "solanum nodiflorum mottle virus" (SNMN) og "subterranean clover mottle virus" (SCMoV) som vist i figur la. Der er vist nukleotidsekvenser, som er bevaret mellem disse strukturer, medens 25 ikke-bevarede sekvenser er vist ved X. Et ekstra U er anbragt efter enhed ^A i LTSV(+)-strengen.

Det domæne, som er forbundet med den selvkatalyserede spaltning af (+)-strengen af sTobRV blev undersøgt for at fastlægge den enzyma-30 tiske substrataktivitet inden for dette domæne. Først blev klonet sTobRV-cDNA'er mutageniseret under anvendelse af en oligonukleotid-linker (BamHl)-indføjelsesprotokol.

Konstruktion af en vektor til in vitro-ekspression af sTobRV 35

Et 160 bp-Taq 1-fragment af sTobRV cDNA blev isoleret fra pSP653 (Gerlach et al. 1985, Virology 151:172-185) og ligeret til Acc 1-Spe 1-skåret, phosphatasebehandlet pGEM 4 for at omdanne Acc 1-stedet.

En resulterende klon blev lineariseret med Acc 1 og DK 175956 B1 13 phosphatasebehandlet, og et 359 bp-Taq 1-fragment af sTobRV-cDNA blev indføjet. De resulterende kloner blev screenet for tilstedeværelse af en cirkulært permuteret 520 bp-sTobRV-cDNA-sekvens indeholdende de terminalt overflødige enheder 5 277-81 (pTTS). sTobRV-Sekvensen er flankeret af promotere for T7- og SP6-RNA-polymeraser, og in vitro-transcription gav anledning til RNA'er med (+)- eller (-)-orientering indeholdende to steder for selvspaltning.

10 In vitro-mutaoenese

Plasmid pTTS (50 μ$) blev lineariseret med BamHl, behandlet med

Sl-nuklease og religeret for at fjerne et enestående BamHl-sted. Den -4 resulterende konstruktion pTTS-B blev behandlet med 2 x 10 enheder 15 DNase 1 i 20 mM Tris-HCl med pH 7,0, 15 mM MnClg i 10 minutter ved 37’C. De resulterende lineære DNA'er blev trimmet og/eller fyldt ud ved enderne under anvendelse af T4-DNA-polymerase og oprenset ved 0,7¾ LGT-agarosegelelektroforese og ekstraktion. Kinasebehandlede BamHl-1inkersekvenser (CGGATCCG) blev ligeret til det lineariserede 20 plasmid natten over ved stuetemperatur i nærvær af 5% polyethylen-glycol. Derefter blev reaktionsblandingerne BamHl fordøjet, og de lineære plasmid-DNA'er blev genoprenset ved 0,7% LGT-agarosegelelektroforese (dette var nødvendigt for at fjerne de sidste spor af cirkulært plasmid sammen med ikke-1igerede linkere). Plasmider blev 25 recirkulari seret ved anvendelse af T4-DNA-1igase og transformeret til E. coli-DH-1. Kolonier (større end 1000) blev skrabet af agarplader og dyrket i væskekultur til mæthed, og der blev fremstillet en blandet population af plasmid-DNA'er. De blandede sTobRV-cDNA-indføjelser blev udskåret ved restriktionsenzymfordøjelse ved 30 flankerende EcoRl- og Pstl-steder, oprenset ved 1% LGT-agarosegelelektroforese og subklonet i EcoRl-Pstl-skåret, phosphatasebehandlet pGEM 4. De resulterende transformanter blev igen sammenhældt og dyrket i væskekultur, og der blev fremstillet plasmid-DNA. Plasmid-DNA'er blev behandlet med BamHl for kun at spalte de plasmider 35 indeholdende en BamHl-linkersekvens, og de lineære former blev igen oprenset ved to runder af 0,7% LGT-agarosegelelektroforese, recir-kulariseret med T4-DNA-1igase og transformeret i E. coli-DH-1. Individuelle transformanter blev screenet for den omtrentlige stilling af den indføjede BamHl-1inker i sTobRV-sekvensen ved DK 175956 B1 14 ! restriktionsenzyrofordøjelse, subklonet i M13-mpl9 og sekvenseret via dideoxynukleotidkædetermineringsmetoden.

Der blev opnået et bibliotek af sTobRV-mutanter, og nukleotidse-5 kvensanalyse viste, at hver mutant indeholdt en indføjet BamHl-1inkersekvens (CGGATCCG) sammen med flankerende duplikerede eller deleterede sTobRV-sekvenser. Mutanterne blev transcriberet in vitro og RNA'erne blev analyseret for deres evne til at undergå spaltning.

Ud fra disse forsøg blev en 52-nukleotidsekvens identificeret som 10 indeholdende både substratet og spaltningsdelene af sTobRV-RNA.

Denne 52-nukleotidsekvens, som er vist i figur lb, indeholdt domænet med den bevarede sekvens, som er nødvendig for selvspaltning af andre RNA'er (figur la). En mutant benævnt D-51 indeholdt en BamHl-1inkersekvens på otte nukleotider indføjet mellem tre duplikerede 15 sTobRV-nukleotider nummereret 7-9. Denne mutant undergik selvkatalyseret RNA-spaltning.

HaelIl-Fragmenter på 97 og 108 basepar indeholdende 52-nukleotid-spaltningssekvensen af vildtypen og D-51 RNA'er (som vist i figur lb 20 og lc) blev udskåret fra sekvenserede plasmidkloner. Fragmenterne blev ligeret til Smal-stedet af pGEMA og screenet til opnåelse af begge orienteringer af indføjelsen. Plasmiderne blev lineariseret under anvendelse af EcoRl, og (+)- og (-)-RNA-strenge med længder på 159 og 170 baser blev transcri beret under anvendelse af 200 enhe-25 der/ml T7-RNA-polymerase i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 6 mM MgCl,, 2 mM spermidin, 100 enheder/ml RNasin, 500 pM ATP, CTP og GTP med 200 μΜ [a PJUTP. RNA'er blev fraktioneret ved elektroforese på en 10% polyacrylamid, 7 molær urinstof og 25% formamidgel og auto-radiograferet.

30

Som vist i figur ld blev der ikke observeret spaltning af RNA-tran-scripterne af (-)-strengen. Dette var forventet, idet (-)-strengen ikke indeholdt et selvkatalyseret spaltningssted. For (+)-strengene for både vildtype- og D-51-sekvenser forekom der spaltning, og 35 spaltningen af D-51-RNA var noget mindre effektiv end den af vildtypen (figur ld). Dette forsøg antyder, at det enkeltstrengede loop-område i højre side af 52-nukleotidsekvensen, som er involveret i den selvkatalyserede spaltning af RNA, ikke er væsentlig.

DK 175956 B1 15

Adskillelse af enzymatisk aktivitet og substrataktivitet

Under anvendelse af BamHl-restriktionsendonukleasestedet indføjet i D-51 blev de flankerende HaellI-BamHl- og BamHl-Haelll-fragmenter 5 opnået, og hver blev subklonet i et E. coli-plasmid, der er egnet til in vitro-transcription. Dette førte til eliminerig af det muterede enkel tstrengede loop fra selvspaltningsdomænet opdelende området i to RNA-segmenter (figur 2a). Det mindste Haelll-BamHl- fragment indeholdt nukleotider 321-9, herunder det aktuelle sted for 10 spaltning og blev benævnt S-fragmentet. BamHl-Haelll-Fragmentet indeholdende sTobRV-nukleotider 7-48 blev benævnt ribozym- eller Rz-fragmentet. E. coli-PIasmiderne anvendt til in vitro-transcription var pGEM3 og pGEM4 (Promega, Madison, WI, USA). Disse ekspressionspi asmider indeholder: 15 (a) et replikationsorigin, (b) et selekterbart lægemiddel resi stensgen (Ampr), (c) et multipelt kloningssted flankeret af RNA-polymerasepromotere, som kan anvendes til in vitro-produktion af transcripter.

20 T7-DNA-Polymerasebehandlet, Kpnl-fordøjet Rz-pGEM3 og Xbal-fordøjet S-pGEM4 blev transcriberet under anvendelse af SP6-RNA-polymerase under de samme betingelser som anført ovenfor.

25 Som vist i figur 2 udviste både S- og Rz-RNA'erne ingen væsentlig nedbrydning ved inkubation alene (figur 2b, bane 1 og 3) under betingelser, der er egnede til meget effektiv selvspaltning (50*C, 20 mM MgC^, pH 8,0). Det mærkede Rz-RNA fremkom også uændret efter inkubation med S-RNA (Figur 2b, bane 2 og 5). Når S-RNA imidlertid 30 blev blandet med Rz-RNA, forekom der effektiv spaltning af S-RNA (figur 2b, bane 4 og 5) under produktion af to fragmenter. Produktstørrelserne svarede til spaltning af S-RNA (84 baser) ved det normale sted mellem nukleotid nr. 359 og nr. 1 til opnåelse af 5'-og 3'-proximale fragmenter på henholdsvis 67 og 17 nukleotider.

35 Dette viser, at S-RNA virkede som et substrat for ribonukleolytisk spaltning med Rz-RNA, som virkede på katalytisk måde.

En model af et ribozym baseret på det katalytiske område af sTobRV-RNA er vist i figur 3. Ribozymet har to arme eller DK 175956 B1 16 flankerende sekvenser med enkeltstrenget RNA vist ved C hybridiserende til komplementære sekvenser på et substrat-RNA, dvs.

RNA, som skal spaltes. Hver flankerende sekvens vist ved C indeholder 8 ribonukleotider. Antallet af nukleotlder indeholdt i 5 område C er ikke kritisk. Der skal imidlertid være tilstrækkeligt mange nukleotider til stede til, at ribozymet kan hybridisere til et mål-RNA. Fire nukleotider i hvert område C synes at være det minimale antal for hybridisering.

10 Det katalytiske område B indeholder sekvenser, som er meget bevaret i naturligt forekommende spaltningsområder (jfr. figur la). Ud fra en sammenligning med spaltningsområder i de kendte sekvenser er længden af baseparstænglen II uinteressant ligesom tilstedeværelsen af det forbundne loop ved den ene ende heraf.

15

Spaltningsstedet inden for mål-RNA'et er vist ved A (figur 3) som 6UC. Baseret på opfindernes forsøg (ikke vist) og andre forsøg foretaget af Koizumi (FEBS LETT 288, 228-230 (1988) og FEBS LETT 239, 285-288 (1988)) med spaltningssteder i naturligt forekommende 20 RNA'er, virker sekvenserne GUA, GUC, CUC, AUC og UUC også som spaltningssteder i RNA.

Eksempel 2 25 Demonstration af udformningen, syntesen og aktiviteten af ribozvmer med hidtil ukendt og meget specifik endoribonukleaseaktivitet

Som illustration af nærværende opfindelse er der blevet udformet tre ribozymer, som er målrettet over for transcriptet af et almindeligt 30 anvendt indikatorgen hidrørende fra bakterier, Tn9-chloramphenicol-acetyltransferase (CAT), som kan tilvejebringe antibiotikaresistens i bakterier, planter og dyr, og som let kan analyseres. Disse ribozymer, der benævnes RzCAT-1 til -3, svarer til potentielle GUC-spaltningssteder i CAT-RNA i positionerne 139-140, 494-495 35 henholdsvis 662-663. Sekvenserne af disse ribozymer er vist i figur 4. I hvert tilfælde er de flankerende sekvenser af ribozymet, som hybridiserer til mål-CAT-RNA'et, 8 nukleotider i længden. Det katalytiske område blev valgt til at svare til det af sTobRV-RNA, som er vist i figur 3.

DK 175956 B1 17 CAT-Genet blev opnået fra pCM4 og subklonet som et BamHl-fragment i pGEM-32 (fra Promega, Madison, WI, USA). Dette plasmid blev lineari-seret med HindiII, og CAT-gentranscripter blev opnået under anven-del se af T7-RNA-polymerase med 220 μm [a- P]UTP. Ribozymsekvenser 5 blev syntetiseret som oligodeoxynukleotiderne Rz-CAT-1, -2 henholds* vis -3. De blev kinasebehandlet, ligeret med phosphatasebehandlet EcoRl-Pstl-skåret pGEM4 og inkuberet med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase 1 før bakteriel transformation. EcoRl-Lineariserede plasmider blev transcriberet med T7-RNA-polymerase til frembringelse 10 af ribozym-RNA'er. Ribozymer blev inkuberet med CAT-transcript i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM MgCl2 ved 50°C i 60 minutter, og produkterne blev fraktioneret ved 5% polyacrylamid, 7M urinstof, 25% formamidgelelektroforese før autoradiografi.

15 Når 840-nukleotid-CAT-transcriptet blev inkuberet med en hvilken som helst af de tre ribozymer, skete der effektiv og meget sekvensspecifik spaltning (figur 5) producerende 2 RNA-fragmenter ved hver reaktion. Fragmentstørrelserne var i overensstemmelse med de forud-sagte spaltningssteder (dvs. 139 og 696, 494 og 341, 662 og 173 20 basefragmenter var 5'- og 3'-produkterne fra RzCAT-1- til -3-kataly-seret spaltning). De betingelser, der krævedes for disse ribozym-katalyserede spaltninger, svarede til dem, der observeres for naturligt forekommende spaltningsreaktioner (Foster, A.C. og Symons, R.H., Cell 49:211-220 (1987) og Foster, A.C. og Symons, R.H. Cell 25 50:9-16 (1987)), hvor mere effektiv spaltning forekommer ved forhø jet pH, temperatur og di val ente kationkoncentrationer (resultater ikke vist). Når de tre ribozymer var til stede i molært overskud, katalyserede de næsten fuldstændigt spaltning af CAT-RNA-substratet efter 60 minutter i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM MgC^ ved 50°C.

30 Under tilsvarende betingelser med 0,1 μΜ substrat og 3 μΜ ribozymer var Tj^2 for CAT-mRNA-substrat 3,5, 3,5 og 2,5 minutter i nærvær af RzCAT-1 til -3. Ribozymsekvenserne var inaktive over for substrat-RNA'ets komplement (dvs. (+)-strengen)) og i form af oligodeoxyribo-nukleotider (resultater ikke vist). De 3'-terminae spaltningsfrag-35 menter fra hver ribozymkatalyserede reaktion blev. isoleret og 5'-32P-kinasebhandlet (50 mM Tris-HCl, pH 9, 10 mM MgCl^, 10 mM DTT med 50 μΟΐ γ-32Ρ-ΑΤΡ og 5 enheder T4-polynukleotidkinase i 30 minutter ved 37*C. Effektiv kinasebehandling af fragmenterne antydede, at de besad 5'-terminale hydroxygrupper svarende til dem, der DK 175956 B1 18 produceres ved naturligt forekommende spaltningsreaktioner.

Det terminale nukleotid af fragmenterne produceret ved spaltning af CAT-sekvenserne med RzCAT-1 til -3 blev bestemt. Kort fortalt blev 5 radioaktivt mærkede fragmenter oprenset på en 5% polyacrylamidgel og fordøjet med et tilsvarende volumen 500 enheder/ml RNase-Tl, 25 enheder/ml RNase-T2 og 0,125 mg/πιΊ RNaseA i 50 mM ammoniumacetat, pH

4,5, i 120 minutter ved 37eC. Produkterne blev fraktioneret på en 20% polyacrylamidgel indeholdende 25 mM natriumcitrat, pH 3,5, og 7 10 molær urinstof. Figur 5b viser, at spaltning af CAT-sekvenserne med RzCAT-1 til -3 forekommer nøjagtigt før nukleotiderne A, U henholdsvis G.

Den terminale sekvens af CAT-genfragmenterne blev bestemt direkte 15 under anvendelse af den partielle enzymatiske fordøjelsesmetode (Donis-Keller et al. Nucleic Acids Res. 4:2527-2538 (1980)) under anvendelse af basespecifik partiel ribonukleolytisk spaltning. Fragmenternes sekvens bekræftede, at spaltning forekom ved de forventede steder inden for CAT-RNA (ikke vist).

20

Enzymatisk katalyse

For at vise, at ribozymerne forårsager spaltning af CAT-mRNA-sub-stratet på katalytisk måde, blev hver inkuberet med et molært 25 overskud af substrat under betingelser, som skulle favorisere både effektiv spaltning og produktdissociering. Figur 6 viser resultaterne fra et forsøg, hvor efter 75 minutter ved 50*C, pH 8,0, i 20 mM MgCl^, 10 pmol RzCAT-1 havde katalyseret specifik spaltning af 163 pmol af et trunkeret CAT-mRNA (173 baser)-substrat til opnåelse 30 af 5'- og 3'-fragmenter på 139 henholdsvis 34 baser. I gennemsnit havde hvert ribozym deltaget i mere end ti spaltningsbegivenheder.

Efter 75 minutter ved 50*C blev der bemærket en vis ikke-specifik spaltning af RNA på grund de ekstreme betingelser, men 70% af de resterende intakte RNA'er (163 pmol) havde akkumuleret sig som 35 139-basefragmentet. Tilsvarende resultater blev opnået for RzCAT-2 og -3 (resultater ikke vist), og hver virker således som et RNA-enzym.

Eksempel 3 19 DK 175956 B1

Temperaturens virkning på ribozvmaktivitet 5 Reaktionstemperaturens virkning på in vi tro-omfanget af ribozymakti-vitet blev undersøgt.

Der blev udført et tidsforløb af reaktioner for ribozymerne RzCAT-1 til -3 på CAT-RNA-substrat ved 37’C og 50*C.

10 I dette forsøg blev reaktionerne for hvert ribozym udført dobbelt under de i eksempel 2 anførte reaktionsbetingelser for ribozymspalt-ning. Den ene reaktion blev inkuberet ved 37"C og den anden ved 50*C. Prøver blev udtaget på tidspunkter op til 90 minutter, og 15 reaktionsomfanget blev analyseret ved denaturerende polyacrylamid-gelelektroforese. Figur 7 viser tidsforløbet af reaktionen for hver af ribozymerne RzCAT-1 til -3 ved 37“C og 50*0. Reaktionsomfanget for hvert ribozym øgedes med stigende reaktionstemperatur.

20 Tidsrummet for 50% (tj^) spaltning af CAT-RNA er anført i tabel 1.

Tabel 1

RzCAT-1 RzCAT-2 RzCAT-3 25 tj^2 (minutter) 50*C 3,5 3,5 2,5 37*C 55,0 70,0 65,0 30

Som det fremgår af tabel 1, er ribozymernes reaktionshastighed ved 37*C ca. 20 gange langsommere end reaktionshastigheden ved 50'C.

35

Eksempel 4 20 DK 175956 B1

Virkningerne af forskellige armlænoder af ribozvmer (eller flankerende sekvenser! på ribozvmkatalvtisk aktivitet 5

Armene eller de flankerende sekvenser af et ribozym (område (I) i formel 1) hybridiserer ribozymet til. et mål-RNA, hvorefter der forekommer spaltning af RNA'et. I dette forsøg blev virkningen af spaltningsomfanget på en mål sekvens ved at ændre omfanget af komple-10 mentaritet og følgelig længde af ribozymarmenes baseparring til mål sekvensen undersøgt.

Der blev fremstillet ribozymer med 4, 8 og 12 baser komplementære med mål sekvensen RzCAT-2 på hver arm (figur 8a). Ribozymerne blev 15 fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåderne ifølge eksempel 2. Ribozymaktivitet blev bestemt ved at inkubere ribozym-RNA med CAT-RNA som beskrevet tidligere.

Ribozymet med en komplementaritet på 4 baser på hver arm spaltede 20 ikke substrat-RNA'et. Ribozymet med 8 basers komplementaritet på hver arm spaltede CAT-substratet ligesom ribozymet med 12 basers komplementaritet. Ribozymer med 12 basers komplementaritet spaltede mål-RNA'et mere effektivt vurderet ved reaktionsomfang in vitro end ribozymer med et mindre antal basekomplementariteter. Selv om det 25 synes åt være nødvendigt at have mere end 4 basers komplementaritet, øger stigende længde af hybridiseringsområdet af ribozymerne deres reaktionsomfang.

I et andet forsøg blev reaktionsvirkningen af et ribozym med (a) 30 komplementaritet til hele længden af CAT-transcript-mål-RNA'et og (b) multiple katalytiske domæner undersøgt.

Der blev valgt fire GUC-målsteder i CAT-RNA-sekvenser. Ribozymkata-lytiske domæner over for disse steder blev indføjet i en fuldstændig 35 anti-sense-(-)-sekvens for CAT-transcriptet, og den katalytiske aktivitet blev afprøvet.

De fire valgte steder var de tre tidligere beskrevne specificeret af RzCAT-1 til -3 og et yderiigre sted, som kan repræsenteres som i 21 DK 175956 B1 ; følger:

Nyt CAT-sted 5 Nr. 192

His His Ala Val Cys Asp Gly 5' CAU CAU GCC GUC UGU GAU GGC 3 hvor "192" refererer til aminosyre 192 i CAT-polypeptidet, og en 10 refererer til spaltningsstedet.

i 01igodeoxyribonukleotider indeholdende ribozymkatalytiske domæner og spændende over hvert af disse spaltningssteder blev anvendt til M13-mutageneseforsøg til fremstilling af en sekvens indeholdende 15 hele komplementet af CAT-sekvensen men med de fire ribozymkatalytiske områder indføjet i den. M13-Mutagenese blev udført ved at binde oligonukleotider indeholdende ribozymindføjelser til enkeltstrengede M13-DNA'er indeholdende uracil fulgt af syntese af komplementære DNA'er indeholdende indføjelsen. De komplementære DNA'er 20 blev indvundet efter kloning i en passende Escherichia coli-stamme {T.A. Kunkel 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. §2:488-492). Det resulterende dobbeltstrengede cDNA blev klonet i en in vi tro ekspressionsvektor til produktion af ribozym-RNA under anvendelse af T7-polymerasetranscriptionssystemet. Ribozymaktivitet blev bestemt 25 ved at inkubere ribozym-RNA med CAT-transcript fulgt af gelelektro-forese af reaktionsblandingen efter glyoxalbehandling for at denaturere nukleinsyrer.

Der skete autolytisk spaltning på alle de forventede steder på 30 CAT-transcriptet. Følgelig kan de flankerende sekvenser af arme eller ét ribozym strække sig langs hele længden af RNA-transcriptet, som skal spaltes.

Figur 9 viser skematisk fremstilling af katalytisk anti-sense-RNA 35 indeholdende hver af de fire ribozymer. Det katalytiske anti-sense-RNA indeholder ca. 900 baser.

Under ovennævnte reaktionsbetingelser danner ribozymet og mål sekvenser komplekser med høj molekylvægt formodentlig ved omfattende ! DK 175956 B1 22 baseparring. En kraftig denaturerende behandling, såsom glyoxal-behandling er påkrævet for at genopløse reaktionsprodukterne under elektroforese.

5 Eksempel 5 Mål sekvenser for ribozvmsoaltninq GUA-Motivet i mRNA blev afprøvet for at undersøge, hvorvidt et 10 ribozym ville bevirke RNA-spaltning ved denne sekvens.

Et specifikt sted i CAT-mRNA omfattende GUA-motivet (figur 10a) blev udvalgt, og en passende ribozymsekvens blev fremstillet og afprøvet for aktivitet. Ribozymet indeholdt arme med 8 ribonukleotider.

15

Syntetiske oligonukleotider svarende til ribozymet på figur 10 blev fremstillet i overensstemmelse med eksempel 2, og dobbeltstrenget cDNA blev klonet i en in vitro-ekspressionsvektor (pGEM 4, se ovenfor) i E. coli for at producere ribozym-RNA under anvendelse af 20 T7-polymerasetranscriptionssystemet. Ribozymaktivitet blev bestemt ved at inkubere ribozym-RNA med CAT-mRNA fulgt af gelelektroforese af reaktionsblandingen som tidligere beskrevet.

Ribozymet bevirkede spaltning ved GUA-målstedet (ikke vist). Følge-25 lig er GUA-motivet i RNA et substrat for ribozymer ifølge den foreliggende opfindelse. Dette var ikke helt uventet, idet et naturligt forekommende spaltningssted i satellit-RNA af "lucerne transient streak virus" kræver genkendelse af et GUA-sted.

30 På tilsvarende måde blev et GUU-motiv i CAT-RNA:målsekvensen afprøvet med et passende ribozym (jfr. figur 10b), og spaltning blev bevirket.

Eksempel 6 35

RibozymspaUninq af viralt RNA

Viroidt RNA i form af "citrus exocortis vi roid RNA" blev spaltet under anvendelse af et ribozym ifølge den foreliggende opfindelse.

DK 175956 B1 23

Der blev valgt to GUC-målsteder i "citrus exocortis viroid (CEV) RNA". Der blev også valgt ét sted i den komplementære strengsekvens.

Der blev fremstillet ribozymer mod alle disse steder, og de blev afprøvet for aktivitet. Ribozymerne blev benævnt CEV9x(+), CEV9x(-) 5 og CEV25x{+). Figur 11 viser de tre spaltningssteder i CEV-RNA for hvert af disse ribozymer.

Der blev fremstillet ribozymer i overensstemmelse med tidligere fremgangsmåder. Ribozym RzCEV25x(+) er vist i figur 12. Dette 10 ribozym spalter GUC-motivet ved nukleotid 116 af CEV-RNA.

Figur 12(b) viser spaltning af CEV-RNA med ribozym RzCEV9x(+). Der blev ikke observeret spaltning med ribozym RzCEV9x(-).

15 Dette forsøg antyder, at ribozymer er aktive over for mål-RNA-sekveniser fra forskellige kilder. Dette forventes, idet alle RNA'er er dannet ud fra de basale ribonukleotidbyggesten af adenin, guanin, cytosin og uracil uafhængigt af deres animalske, vegetabilske eller mikrobielle oprindelse.

20

Eksempel 7

Eksempler på ribozymer med variable katalytiske domæner 25 Et ribozym målrettet over for et CAT-2-sted blev fremstillet under anvendelse af den katalytiske domænesekvens fra satellit-RNA fra "subterranean clover mottle virus" (SCMoV). Tolv basers komplementaritet af den flankerende ribozymarmsekvens blev inkorporeret i udformningen af ribozymet RzSCMoV. Ribozymerne RzCAT-2 og RzSCMoV er 30 vist på figur 13a henholdsvis 13b. Loopområdet af RzSCMoV indeholder 5 nukleotider med sekvensen AAAUC. Dette skal ses i modsætning til loop-området af RzCAT-2, som indeholder 4 nukleotider med sekvensen AGAG. Derudover indeholder RzSCMoV et C i det katalytiske område i stedet for U* i RzCAT-2. De forskellige sekvenser i RzSCMoV i 35 sammenligning med RzCAT-2 er markeret.

RzSCMoV blev produceret ifølge eksempel 2. RzSCMoV var aktivt og gav to spaltningsprodukter som forventet.

DK 175956 B1 24 I et andet forsøg blev "citrus exocortis viroid" (CEV) målstedet ved nukleotidet -336 i dets komplementære RNA spaltet under anvendelse af et ribozym (RzCEV2) med den i figur 14a anførte sekvens. Loopområdet mærket med bogstavet "L" i figur 14 omfatter seks nukleotider 5 med sekvensen 3'-CCTATA-5'. Dette er forskelligt fra loopområdet i sTobRV, som omfatter fire nukleotider med sekvensen 3'-AGAG-5'.

Dette ribozym spalter komplementært mål-CEV-RNA i position -336 som vist på den elektroforetiske profil i figur 14b.

10 Dette forsøg antyder, at antallet af nukleotider og nukleotidse-kvensen i loopområdet er uden betydning for ribozymaktiviteten. I disse forsøg blev ribozymet fremstillet ifølge de i nærværende beskrivelse tidligere beskrevne fremgangsmåder, 15 I et andet forsøg blev virkningen af baseparring i det katalytiske område (stængelområdet) på ribozymaktiviteten bestemt.

Et modificeret ribozym svarende til RzCAT-2 men indeholdende fire ekstra basepar blev fremstillet og afprøvet. I figur 15a er sekven-20 sen af ribozymet RzCAT-2 vist hybridiseret med mål-CAT-RNA. Testri bozymet er vist i figur 15b med de yderligere basepar anført i en firkant. Testribozymet havde en aktivitet, der var sammenlignelig med aktiviteten af RzCAT-2. Dette antyder, at de baseparrede område i det ribozymkatalytiske område kan være af varierende længde uden 25 at påvirke den katalytiske aktivitet.

Det er blevet observeret (resultater ikke vist), at den stabile in vivo-form af sTobRV-RNA-transcripter udtrykt i transgene planter hovedsageligt er cirkulær, formodentlig på grund af ligation af 5'-30 og 3'-termini. Derfor fører anvendelse af to autolytiske spaltningssteder flankerende en sekvens af interesse i et in vivo-RNA-tran-script sandsynligvis til et cirkul ari seret produkt, som kan 'have større stabilitet end lineære transcripter. Denne egenskab viser sig at tilvejebringe en hidtil ukendt fremgangsmåde til in vivo-stabi-35 lisering af ribozymsekvenser. Dette er betegnet cirkularisering.

Eksempel 8 25 DK 175956 B1

In vivo-aktivitet af ribozvmer 5 I dette eksempel undersøges in vivo-aktiviteten af ribozymer i planteceller.

Forsøgsprotokol 10 PI asmider indeholdende anti-CAT (CAT = chloramphenicolacetyltrans-ferase) eller kombinerede anti-CAT/ribozymgenkonstruktioner (se nedenfor) blev indført i tobaksprotoplaster i samme mængde og forhold til hinanden sammen med et andet plasmid, som indeholdt en funktionel CAT-genkonstruktion. CAT-Aktiviteterne blev bestemt og 15 sammenlignet med basisniveauet for genaktivitet.

Materialer og metoder a) Elektroporationer og CAT-analyser j i 20

Disse blev udført som beskrevet af Llewellyn et al., J. Mol. Biol.

1987) 195:115-123. Kort fortalt blev protoplaster af Nicotiana plumbaoinifolia linje T5 fremstillet ud fra en suspension to dage efter subkultur, suspenderet i 10 mM HEPES, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,2 25 M mannitol og justeret til en densitet på 3 x 10®/ml. Der blev udført elektroporation under anvendelse af en enkelt 50 ms impuls ved 250V. Protoplaster blev fortyndet 10 gange og dyrket i 20 timer ved 26*C i mørke. De blev ødelagt ved ultralydbehandling, og der blev opnået ekstrakter. Ekstrakterne blev normaliseret for protein- 30 indhold og analyseret for CAT-aktivitet in vitro under anvendelse af ^C-chloramphenicol og acetyl CoA. Reaktionsprodukter blev fraskilt ved tyndtlagskromatografi og visualiseret ved autoradiografi.

Reaktionernes omfang blev beregnet ud fra produktionen af radio- 14 aktive produktderivater fra C-chloramphenicol-tempiaten.

35 (b) Genkonstruktioner

Genkonstruktioner blev indført i 0,1 ml protoplassuspensioner som plasmid-DNA'er, som var renset for bakterier ved ekstraktion og to DK 175956 B1 26 cykluser med CsCl-ligevægtsdensitetsgradientcentrifugering. De blev resuspenderet i 10 mM Tris/1 mM EDTA/pH = 7,5 med henblik på anvendelse.

5 Den aktive CAT-genkonstruktion blev båret på pi asmidet benævnt pCAT7+. Det blev opnået ved fusion af en CAT-gensekvens (fra plasmid pCM4, jfr. T.J. Close og R. Rodriguez, 1982, Gene 20:305-316) i plasmidet pJ35SN (afledt fra p35SN, W.L. Gerlach et al., 1987,

Nature 328:802-805), således at den aktive genkonstruktion var 10 5'___3' ->

35S CAT NOS

15 __ 35S refererer til 35S CaMV (blomkåls-"mosiac"-virus)-promoter, NOS til nopalinsyntetasepolyadenyleringssignal, T/C til transcription.

20 Sammen med 0,2 pg pCAT7+ blev der tilsat forskellige genkonstruktioner i overskud som beskrevet nedenfor. Genkonstruktionerne var indeholdt i pi asmider med følgende betegnelser: 25 pJ35SN - Dette vektorpi asmid, hvoraf et kort er vist på figur 16, indeholder en 35S-CaMV-promoter og plantenopalinsyntase-3'-polyadenyleringssignal, hvilket kan afbildes som følger: 30 5'__ 3'

35S NOS

35 pCAT7- - Dette indeholder CAT-gensekvensen indføjet i pJ35SN, således at transcript!onen vil resultere i produktion af anti-sense-CAT-RNA, hvilket kan afbildes som følger: 5' _3' 27 DK 175956 B1 <--

. 35S CAT NOS

5 __ pCAT19- - Dette indeholder CAT-genet indbefattende fire katalytiske ribozymområder (jfr. eksempel 4 og figur 9) indføjet i pJ35SN, således at transcriptionen vil resultere i produk-10 tion af anti-sense-CAT-RNA indeholdende fire katalytiske ribozymområder, hvilket kan afbi Ides som følger: 5'___ 3'

<—......... -^1 I

15 i 35S CAT NOS i katalytiske domæneindføjelser 20

Resultater

Nedenstående tabel viser de relative CAT-aktiviteter i celler 20 timer efter elektroporation. Aktiviteten udtrykkes som procent 25 omdannelse af chloramphenicolsubstrat ved 1 times analyse.

jig Plasmid elektroporeret

Behandling pCAT7+ pJ35SN pCAT7- pCAT19- % omdannelse 30 1A 0 IB 0 2A 0,2 18 21 2B 0,2 18 46 35 3A 0,2 9 9 28 3B 0,2 9 9 32 4A 0,2 18 26 4B 0,2 18 19 28 DK 175956 B1 5A 0,2 9 9 19 5B 0,2 9 22 5 6A 0,2 18 14 6B 0,2 18 16 (for hver behandling er "A" og "B" dubletter) 10

Ud fra disse resultater kan der drages følgende konklusion: (a) Indføring af CAT-genkonstruktionen resulterer i væsentlig CAT-aktivitet - sammenlign 2A,B med 1A,B. Der er variation 15 mellem dubletter. Ud fra tendenserne i de andre prøver (jfr.

"b" og "c" nedenfor) er det sandsynligt, at 2A viser unormalt lav aktivitet.

(b) Samtidig indføring af en anti-sense-genkonstruktion resulterer 20 i et fald i aktivitetsniveauet - sammenlign 3A,B og 4A,B med 2B. Faldets omfang er direkte forbundet med omfanget af tilsat anti-sense-gen som plasmid - sammenlign 3A,B og 4A,B.

(c) Samtidig indføring af den kombinerede anti-sense/ribozymgenkon-

25 struktion resulterer i et genaktivitetsfald - sammenlign 5A,B

og 6A,8 med 2B. Endvidere er faldet mere markant end for de tilsvarende omfang af anti-sense-genkonstruktioner - sammenlign 5A,B med 3A,B og 6A,8 med 4A,B.

30 Gennemsnitsresultaterne fra fire in vivo-forsøg er vist i figur 17.

I denne figur repræsenterer "kontrol" behandling 2. "Antisense" repræsenterer behandling 4. "Katalytisk" repræsenterer behandling 6, og "Baggrund" repræsenterer behandling 1.

35 Det katalytiske ribozym hæmmer CAT-aktivitet med i gennemsnit 47% i sammenligning med et gennemsnit på 34% for et anti-sense-ribozym.

Indføringen af ribozymbærende gener i planteceller hæmmer aktiviteten af de gener, mod hvilke de er målrettet. Endvidere er hæmningen DK 175956 B1 29 større end for tilsvarende anti-sense-RNA-molekyler.

Disse resultater viser, at ribozymer vil være aktive i animalske, vegetabilske eller mikrobielle celler mod en række mål-RNA-moleky-5 le·".

Ribozymernes virkningsmekanismer i dette eksempel er ikke klare.

F.eks. kan anti-sense-ribozymet irreversibelt hybridisere til et 1 mål-RNA og katalysere phosphodiesterbindingsspaltning ved ét eller 10 flere udvalgte målsteder langs mål-RNA'et. Alternativt kan cellulære enzymer "vikle” anti-sense-RNA'et fra dets målsekvens, således at mål-RNA'et spaltes i to eller flere fragmenter.

Eksempel 9 15

In vivo-aktivitet af ribozvmer i dyreceller I dette eksempel vises ribozymernes aktivitet med henblik på at inaktivere et mål-RNA i pattedyrceller.

20

Materialer og metoder

De aktive genkonstruktioner, der koder for ribozymer, blev transfi-ceret til den meget udbredte abenyrecellelinie C0S1 ved elektropora-25 tion. Ved denne fremgangsmåde blev 3 x 10^ COSl-celler/ml suspenderet i en pufret saltopløsning med 10% FCS (føtalt kalveserum) bragt i forbindelse med forskellige genkonstruktioner, og en elektrisk ladning blev påført for at bevirke elektroporation af DNA ind i cellerne. De transficerede celler blev inkuberet ved 37‘C i 48 timer 30 i dyrkningsmedium før analyse for CAT- og luciferaseaktivitet.

CAT-Genkonstruktioner blev båret på plasmid betegnet pTK-CAT (Miksi-cek et al., Cell 46:283-290, 1986). Dette plasmid blev afledt ved at indføre en CAT-gensekvens i plasmidet pSV2, således at det kom under 35 styring af thymidinkinasepromoteren fra Herpes simplex-virus.

Genkonstruktioner kodende for ribozymer blev båret på plasmidet pSV232A (De Wet et al., Molecular and Cellular Biology 7:725-737, 1987) indeholdende luciferasegenet sammensmeltet med den tidlige DK 175956 B1 30 SV40-promoter. DNA-Kodende ribozymer blev ligeret til Xbal-stedet ved 3'-enden af luciferasegenet i overensstemmelse med standardmetoderne ifølge Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, 1982).

5

Der blev fremstillet nedenstående konstruktioner under anvendelse af standardmetoderne ifølge Maniatis et al. (se ovenfor).

pFC58 - Denne plasmidvektor indeholder DNA kodende for ribozym 10 RzCAT-1 sammen smeltet til 3'-enden af luciferasegenet i en ikke-funktionel orientering.

Dette kan afbi Ides som følger: 15 __ SV40 _ ribozym lille

232A tidlig-* luciferase*· RzCAT-1 T Po1y+ 232A

20 hvor 232A refererer til pSV232A-sekvenser, SV40 tidlig refererer til den tidlige promoter af SV40, og lille T er DNA kodende for den lille T-intervenerende sekvens af SV40. Denne konstruktion resulterer i produktion af et RNA-molekyle kodende for luciferase og ribozymet RzCAT-1, hvor sidstnævnte er i en sådan orientering, at 25 den ikke forventes at være katalytisk.

pFC4 - Dette plasmid er det samme som pFC58 med undtagelse af, at RzCAT-1 er erstattet med RzCAT-3.

30 pFCl-6 - Dette plasmid er det samme som pFC58 med undtagelse af, at

RzCAT-1 er erstattet med RzCAT-3 i sense-retningen (5'-3').

pFC20 - Dette plasmid er det samme som pFCl-6 med undtagelse af, 35 at RzCAT-3 er erstattet med RzCAT-2 med flankerende sekvenser på otte nukleotider.

pFCl2 - Dette plasmid er det samme som pFC20 med undtagelse af, at ribozymet RzCAT-2 indeholder flankerende sekvenser med DK 175956 B1 31 tolv nukleotider.

pFC50 - Dette plasmid indeholder CAT-genet omfattende fire katalytiske ribozymdomæner (jfr. eksempel 4 og figur 9) i 5 sense-retningen (5'-3'), som ved transcription giver anledning til et inaktivt ribozym. Dette plasmid kan angives som følger: -1-1----- 10 SV40 CAT-gen indeholdende Poly sen ribozymdomæner A+ ->

ikke-katalytisk RNA

15 pFC54 - Dette plasmid er det samme som pFC50 med undtagelse af, at CAT-genet og ribozymdomænerne er i den aktive anti-sense (3'-5')-retning.

20 pFC64 - Dette plasmid deler SV40-promotor og polyadenyleringssig- naler med pFC50 og indeholder vildtype CAT-genet uden indføjede ribozymdomæner. Dette gen er i anti-sense-ret-ning og producerer således ikke CAT-protein.

25 pFC65 - Dette plasmid er det samme som pFC64 med undtagelse af, at vildtype CAT-genet er i sense (5'-3')-retningen og således kan producere CAT-protein.

Analvser 30

Luciferaseaktivitet blev analyseret i overensstemmelse med fremgangsmåderne ifølge De Wet et al. (se ovenfor). Kort fortalt blev COS-celler lyseret 48 timer efter transfektion, og cellelysatet blev inkuberet med luciferin, der er substratet af luciferase, og lumi-35 nescensen blev påvist under anvendelse af et scinti11ationstælleapparat.

CAT-Aktiviteten blev også bestemt under anvendelse af COS-celle-lysater (cellelysater blev delt i to, og hver del blev analyseret DK 175956 B1 32 enten for luciferase eller CAT-aktivitet) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Sleigh, M.J., Anal. Biochem. 156:251-256 (1986).

5 Ved in vivo-analyserne bevirkede pFC58 og pFC4 ikke CAT-aktivitet i transficerede celler. Oenne aktivitet blev benævnt 100% CAT-aktivitet og 0% CAT-suppression. CAT-Aktivitet i celler transficeret med andre pi asmider blev bestemt i forhold til pFC58. Procenten af CAT-suppression blev bestemt som 10 f CATPrøve \ 100 - - x 100 y CATkontrol / 15 normaliseret til luciferaseproduktion. CATprøve = CAT-analyseresul-tat for prøvekonstruktioner. CAT^ ^ -j = CAT-analyse for kontrol -konstruktioner (pFC4 og pFC58).

Luciferaseproduktion er en intern kontrol for elektroporation og 20 giver et mål for ribozymproduktion inden for hver individuelt elektroporeret vævskulturplade.

Resultater 25 Forsøg (il

pg plasmid elektroporeret/1,5 x 105 celler Behand- pTKCAT pFC58 pFC20 pFCl-6 pFC12 % CAT

ling suppression 30 -- 1 5 2 56 2 5 11 53 3 5 2 49 4 5 2 0 35 -

Alle behandlinger blev udført dobbelt, og der er anført en gennemsnitsværdi .

33 DK 175956 B1

Forsøg fin /tg plasmid elektroporeret/1,5 x 10® celler Behand- pTKCAT pFCl-6 pFC20 pFC12 pFC4 % CAT 5 Ung suppression 5 5 2 75 6 5 2 75 7 5 4 62 10 8 5 1 1 70 9 5 4 51 10 5 2 0 ! jj. Behandlingerne 5-10 blev udført dobbelt, og der er anført en gennem snitsværdi .

Forsøg Hi i)

/ig plasmid elektroporeret/1,5 x 10® celler Behandling pTKCAT pFCl-6 pFC4 % CAT

suppression 11 5 2 66 25 2_[_2 °_

Behandlingerne blev udført femdobbelt, og der er anført en gennemsnitsværdi .

30 35 0 DK 175956 B1 34

Forsøg fiv) /jg plasmid elektroporeret

Behand- pTKCAT pFC50 pFC54 pFC64 pFC65 % CAT 5 ling suppression 13 5 2 0 14 5 2 26 15 5 2 2

10 16 0 2 NA

Hver af behandlingerne 13-16 blev udført firdobbelt.

lc Sense-CAT-konstruktionen (behandling 16) kunne producere høje omfang 10 af CAT-aktivitet i sig selv. Derfor er % suppression ikke anvendelig (NA) ("not applicant").

Der blev også udført en række forsøg, hvor TK-promoteren af pTKCAT 2Q var erstattet med human metallothioneinpromoter. Når denne CAT-kon-struktion blev co-transficeret til COSl-celler med plasmider kodende for ét eller flere ribozymer, blev der observeret et markant fald i CAT-aktivitet.

Ovennævnte resultater viser tydeligt ribozymernes in vivo-inaktive-25 ringsaktivitet i dyreceller.

Medens effektiviteten af ribozymerne in vivo menes at være forårsaget af ét eller flere katalytiske områder, som kan spalte mål-RNA, vil tilstedeværelse af sådanne områder i ribozymer af "anti-sense"-30 RNA-type ikke nødvendigvis føre til spaltning in vivo, hvis ikke hele RNA/anti-sense-RNA-molekylet falder fra hinanden. På trods af, hvorvidt molekylet falder fra hinanden eller ej, viser ovenstående eksempler ribozymets effektivitet til at inaktivere mål-RNA. Opfin-delsen er således anvendelig til alle ribozymer med et katalytisk område, som kan forårsage spaltning, og et hybridiserende område, uanset om der faktisk sker spaltning i mål-RNA'et. Det vil sige, at det hybridiserende område kan være så stort, at det får det kombinerede RNA/ribozym til at blive sammen og forhindrer mål-RNA'et i at blive spaltet i særskilte komponenter, selv om det katalytiske 35 DK 175956 B1 område i sig selv er i stand til at forårsage spaltning.

5 10 15 20 25 30 35

Claims (24)

1, Forbindelse med formlen: _ 3' (Χ),τ-Α X-(X)n. 5’ 5 \ \ A C I \ A U \ G \

2. Forbindelse med formlen: 15 3' (X)— CA X—(X)a. 5' \ \ A C I \ A U

3. Forbindelse med formlen: l 3 * (X)— CA Xj-(X>„· 5’

4. Forbindelse ifølge ethvert af kravene 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, 15 at summen af n + n’ er større end eller lig med 14.

5. Forbindelse ifølge ethvert af kravene 1, 2, 3 eller 4, kendetegnet ved, at hvert n og n’ er større end 6.

5. C i \ I \ G AG l /\ \ C * G G. A

6. Forbindelse med formlen; 3'-*· Q (Y) - hvor Q betegner en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1, 2, 3, 4 eller 25 5; - hvor hvert Y betegner et ribonukleotid som kan være ens eller forskellige; - hvor hvert r og s betegner et helt tal som kan være større end eller lig med 0; og 30. hvor z betegner et helt tal som er større end eller lig med 1. DK 175956 B1

7. Forbindelse ifølge ethvert af kravene 1,2, 3, 4, 5 eller 6, kendetegne t ved, at mål-RNA sekvensen som skal spaltes er en viral RNA sekvens.

8. Forbindelse som omfatter en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1,2,3, 5 4, 5, 6 eller 7 sammen med en farmaceutisk, veterinært eller landbrugsmæs- sigt acceptabel bærer.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1,2,3, 4, 5, 6 eller 7, som omfatter trinnene at: 10 (a) en nukleotidsekvens svarende til forbindelsen ligeres i en transfer vektor omfattende DNA, RNA eller en kombination heraf; (b) nukleotidsekvensen fra trin (a) transcriberes med RNA-polymerase; og (c) forbindelsen oprenses.

10. Transfer-vektor, kendetegnet ved, at den omfatter RNA eller DNA eller en kombination heraf indeholdende en nukleotidsekvens som ved transcription giver anledning til forbindelsen ifølge ethvert af kravene 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7.

10 X * £ xx x * X (X). * Φ»· X X \ Νχ>^ 15 - hvor hvert X betegner et ribonukleotid som kan være ens eller forskellige; - hvor hvert (X)n.i og (X)n- betegner et oligoribonukleotid som (a) er i 20 stand til at hybridisere med en mål-RNA sekvens som skal spaltes og (b) er defineret ved en forudbestemt sekvens som i naturen ikke findes covalent bundet til henholdsvis sekvenserne C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, hvor sådanne mål-RNA sekvenser ikke er til stede i forbindelsen: 25. hvor hvert n og n’ betegner et helt tal som definerer antallet af ribo- nukleotider i oligonukleotidet med det forbehold at summen af n + n’ er , tilstrækkelig til at tillade at forbindelsen interagerer stabilt med mål-RNA sekvensen gennem baseparring.; - hvor hver * betegner baseparring mellem ribonukleotiderne på hver 30 side deraf; DK 175956 B1 - hvor hver fast linie betegner en kemisk binding som tilvejebringer co-valente bindinger mellem ribonukleotideme på hver side deraf; - hvor hvert m og m’ betegner et helt tal som er større end eller lig med 1; 5. hvor hver stiplet linie uafhængigt af hinanden betegner ente en kemisk binding som tilvejebringer covalente bindinger mellem de ribonukleoti-der som er placeret på hver side deraf, eller fravær af enhver sådan kemisk binding; og - hvor (X)b betegner et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller 10 fraværende med det forbehold at b betegner et helt tal som er større end eller lig med 2 hvis (X)b er tilstede.

10 G (XL· A I I C * G X * & ^X X * X (X) m * (*>· X X 15 '(X)b - hvor hvert X betegner et ribonukleotid som kan være ens eller forskellige; - hvor hvert (X)„ og (X)n· betegner et oligoribonukleotid som (a) er i 20 stand til at hybridisere med en mål-RNA sekvens som skal spaltes og (b) er defineret ved en forudbestemt sekvens som i naturen ikke findes covalent bundet til henholdsvis sekvenserne A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, hvor sådanne mål-RNA sekvenser ikke er til stede i forbindelsen: - hvor hvert n og n’ betegner et helt tal som definerer antallet af ribo- 25. nukleotider i oligonukleotidet med det forbehold at summen af n + n’ er tilstrækkelig til at tillade at forbindelsen interagerer stabilt med mål-RNA sekvensen gennem baseparring; - hvor hver * betegner baseparring mellem ribonukleotiderne på hver side deraf; 30. hvor hver fast linie betegner en kemisk binding som tilvejebringer co- valente bindinger mellem ribonukleotiderne på hver side deraf; DK 175956 B1 - hvor a betegner et helt tal som definerer et antal ribonukleotider med det forbehold at a kan være 0 eller 1, og hvis det er 0 er det A som er placeret 5’ til (X)a, bundet til det G som er placeret 3’ til (X)a; - hvor hvert m og m’ betegner et helt tal som er større end eller lig med 5 1; - hvor hver stiplet linie uafhængigt af hinanden betegner enten en kemisk binding som tilvejebringer covalente bindinger mellem de ribonukleotider som er placeret på hver side deraf, eller fravær af enhver sådan kemisk binding; og 10. hvor (X)b betegner et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med det forbehold at b betegner et helt tal som er større end eller lig med 2 hvis (X)b er tilstede.

11. Forbindelse, kendetegnet ved, at den omfatter transfervektoren ifølge krav 10 sammen med en farmaceutisk, veterinært eller landsbrugsmæssigt acceptabel bærer.

12. Prokaryot eller eukaryot celle, kendetegnet ved, at den omfatter en 25 nukleotidsekvens som er, eller som efter transkription giver anledning til forbindelsen ifølge ethvert af kravene 1,2, 3, 4, 5, 6 eller 7.

13. Eukaryot celle ifølge krav 12.

14. Plante- eller dyrecelle ifølge krav 13. DK 175956 B1

15. Plante som omfatter plantecellen ifølge krav 14.

16. Fremgangsmåde til inaktivering af en mål-RNA i en celle som omfatter kontakt mellem mål-RNA i cellen med forbindelsen ifølge ethvert af kravene 5 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7, kendetegnet ved, at forbindelsen er i stand til at påvirke mål-RNA sekvensen gennem baseparring, under sådanne betingelser, at forbindelsen stabilt påvirker mål-RNA'et gennem baseparring, og mål-RNA’et spaltes.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved at mål-RNA’er er et transcript af et gen som er endogent for cellerne.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at mål-RNA’et er et transcript af et gen som er exogent for cellerne. 15

19. Fremgangsmåde ifølge krav 16, 17 eller 18, kendetegnet ved, at cellen er en prokaryot eller eukaryot celle.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at cellen er en 20 plante- eller dyrecelle.

20 XG \ G (X). A I » ^ C * G G x * i X I I X * X 25 (XL * <*>.· X X X / N(XL 30 DK 175956 B1 - hvor hvert X betegner et ribonukleotid som kan være ens eller forskellige; - hvor hvert (X)n-i og (X)n· betegner et oligoribonukleotid som (a) er i stand til at hybridisere med en mål-RNA sekvens som skal spaltes og 5 (b) er defineret ved en forudbestemt sekvens som i naturen ikke findes covalent bundet til henholdsvis sekvenserne C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, hvor sådanne mål-RNA sekvenser ikke er til stede i forbindelsen: - hvor hvert n og n’ betegner et helt tal som definerer antallet af ribo- 10 nukleotider i oligonukleotidet med det forbehold at summen af n + n’er tilstrækkelig til at tillade at forbindelsen interagerer stabilt med mål- i RNA sekvensen gennem baseparring; - hvor hver * betegner baseparring mellem ribonukleotiderne på hver side deraf; 15. hvor hver fast linie betegner en kemisk binding som tilvejebringer co- valente bindinger mellem ribonukleotiderne på hver side deraf; - hvor a betegner et helt tal som definerer et antal ribonukleotider med det forbehold at a kan være 0 eller 1, og hvis det er 0 er det A som er placeret 5' til (X)a, bundet til det G som er placeret 3' til (X)a; 20. hvor hvert m og m’ betegner et helt tal som er større end eller lig med 1; - hvor hver stiplet linie uafhængigt af hinanden betegner enten en kemisk binding som tilvejebringer covalente bindinger mellem de ribonukleotider som er placeret på hver side deraf, eller fravær af enhver 25 sådan kemisk binding; og - hvor (X)b betegner et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med det forbehold at b betegner et helt tal som er større end eller lig med 2 hvis (X)b er tilstede. 30 DK 175956 B1

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at plantecellen er plantebestanddel.

22. Anvendelse af forbindelsen ifølge ethvert af kravene 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7, eller af transfervektoren ifølge krav 10, til fremstilling af et medikament til behandling af en lidelse forbundet med et mål-RNA i mennesker eller dyr.

23. Anvendelse af en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1,2,3, 4, 5, 6 eller 30 7, eller af transfervektoren ifølge krav 10, til fremstilling af en forbindelse til inaktivering af mål-RNA i planter. DK 175956 B1

24. Anvendelse af en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1,2,3, 4, 5, 6 eller 7 eller af transfervektoren som ved transcription giver anledning til sådanne forbindelser, til fremstilling af et medikament til behandling af virussygdomme 5 i mennesker eller dyr.