FI104562B - Ribotsyymit - Google Patents

Description

1 104562 .

RIBOTSYYMIT

Tämä keksintö koskee synteettisten RNA-molekyylien ja niiden johdannaisten luokkaa, joihin alempana viitataan ribotsyymeillä, joilla on korkea spesifinen endoribonukleaasiaktiivisuus.

5 Useissa luonnollisesti esiintyvissä RNA-molekyyleissä, kuten avocardo sunblotch -viroidissa (ASBV), tupakan ringspot-viruksen (sTobRV) satelliitti-RNA:issa ja sinimailasen ohimenevässä juo-vaviruksessa (sLTSV) tapahtuu itsekatalysoitua pilkkomista. Tämä pilkkominen näyttää olevan olennainen ja ainutlaatuinen osa näi-10 den ja muiden RNA:iden elämänkiertoa.

Itsekatalysoivilla RNA-pilkkomisreaktioilla on yhteinen diva-lenttien metalli-ionien ja neutraalin tai korkeamman pH:n tarve, ja ne johtavat RNA:n tuotantoon, jonka päässä on 5'-hydroksyyli-ja 2',3'-sykliset fosfaattiryhmät (Prody et ai., Science 15 231:1577-1580 (1986) ja Buzayan et ai., Virology 151:186-199 (1986)). RNA:t itse katalysoivat pilkkomisreaktioita, todennäköisesti rakenteen tuloksena, joka tuo reaktiiviset ryhmät välittömään läheisyyteen. Itsekatalysoivat pilkkomiskohdat sijaitsevat luonnollisesti esiintyvissä RNA:issa RNA:n sekundaarira-20 kenteen erittäin konservoituneissa alueissa (Buzayan et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:8859-8862 (1986) ja Forster, A.C. ja Symons, R.H. Cell 50:9-16 (1987)).

Kokeet, joita olemme toteuttaneet tupakan ringspot-viruksen (sTobRV) satelliitti-RNA:illa, ovat johtaneet uusien endori-25 bonukleaasien suunnitteluun (joihin alempana viitataan "ribotsyymeillä”), toisin sanoen entsyymien, jotka muodostuvat RNA:sta, joka katalysoi RNA-kohdemolekyylien spesifisen pilkko-. misen.

Termi ribotsyymi, jota on käytetty tarkassa määrittelyssä, viit-30 taa molekyyleihin, jotka muodostuvat kokonaan RNA:sta tai sen johdannaisista.

Tämän keksinnön ribotsyymit ovat erilaisia kuin RNA-endoribonuk- leaasi, jota esiintyy luonnostaan Tetrahymena Thermophilassa (tunnetaan IVS:nä tai L-19 IVS RNA:na) ja jota Thomas Cech ja 104562 2 työtoverit ovat laajalti Riivanneet (Zaug, A.J. et ai. Science (1984) 224:574-578; Zaug, A.J. ja Cech, T.R., Science (1986) 231:470-475; Zaug, A.J., et ai, Nature (1986) 324:429-433; University Patents Inc. on julkaissut Kansainvälisen patenttihake- r 5 muksen No. WO 88/04300). Cech-endoribonukleaasilla on kahdeksan emäsparin aktiivinen kohta, joka hybridisoituu kohde-RNA-jakson kanssa, jonka jälkeen kohde-RNA pilkotaan, mikä vaatii vapaan guanosiinin tai guanosiinin johdannaisia. Kappaleet, jotka syntyvät pilkkomisen tuloksena, sisältävät päissään 5’-fosfaatti-10 ia 3'-hydroksyyliryhmät. Rajoitettu määrä nukleotideja, joita on tarjolla hybridisaatioon RNA-substraatin kanssa, rajoittaa yleensä Cech-endoribonukleaasin tehokkuutta tai vaikuttavuutta, oligonukleotidit, joissa on vähemmän kuin kaksitoista nukleotidia, hybridisoituvat huonosti kohdejaksoihin. Näyttää myös sil-15 tä, että Cech-endoribonukleaasin aktiivisen kohdan nukleotidien täytyy olla konservoituneita, jotta endoribonukleaasi toimisi tehokkaasti. Tämä rajoittaa aktiivisten kohtien jaksojen uudel-

M

leenjärjestelyjen määrää, joita käytetään siihen, että aktiiviset kohdat hybridisoituisivat tehokkaasti kohdejaksoihin. Sen 20 vuoksi rajoittuvat RNA-kohdejaksojen, joita Cech-endoribonukle-aasi pystyy pilkkomaan, vaihtelun rajat. Cech-endoribonukleaasi myös muuttaa RNA:ta lisäämällä vapaan guanosiini-nukleotidin pilkotun RNA:n 5’-päähän.

Tämän keksinnön ribotsyymit päinvastoin hybridisoituvat tehok-25 kaasti suuren määrän eri kohde-RNA-jaksojen kanssa, eivätkä muu- : · ta pilkottua kohde-RNA:ta.

Tämän keksinnön ribotsyymit sisältävät hybridisaatioalueen, jonka nukleotidijakso on komplementaarinen ainakin osalle kohde-RNA: ta, ja katalyyttisen alueen, joka soveltuu pilkkomaan kohde-30 RNA:ta. Hybridisaatioalue sisältää ainakin 9 nukleotidia.

Esitetyssä näkökannassa tämän keksinnön ribotsyymeillä on hybridisaatioalue, joka sisältää yhden tai useamman varren, jotka muodostuvat yksijuosteisesta RNA:sta ja jolla on jakso, joka on komplementaarinen ainakin osalle kohde-RNA:ta, mainitut yksi tai 35 useampi varsi ovat liittyneenä katalyyttiseen alueeseen, joka pystyy pilkkomaan kyseessä olevaa kohde-RNA:ta; ja ribotsyymin 1 hybridisaatioalue sisältää yhden RNA-varren, jossa on ainakin 9 lii v 3 1045C2 nukleotidia, ja lisäksi hybridisaatioalue sisältää 2 tai useampia RNA-varsia, joiden sisältämien nukleotidien summa on suurempi kuin 9 nukleotidia.

Yhdessä tämän keksinnön ilmentymässä nimitetään kaavan 1 ribot-5 syymi: 3' 5* <X)nX *<*>n· (I) A C (I)

A U

10 G XA G (II) (1)

C * G G A

I I * X* x- 5' 3* 15 jossa; X edustaa mitä tahansa ribonukleotia ja jokainen X-tähde voi olla sama tai eri; n:n ja n’:n summa on suurempi kuin 6 ja n ja n’ voivat olla sama tai eri; (*) edustaa emäsparia komplementaaristen ribonukleotidien välillä; X' ja X'' edustavat komplementaarisen jakson oligonukleotideja ainakin osalla komplemen->0 taarista jaksoa mahdollistaen emäspariutumisen oligoribonukle-otidien välillä, tai X' ja X'' yhdessä muodostavat yhden RNA-. '· jakson, josta ainakin osa sisältää varren, joka on muodostunut, ’ kun komplementaariset nukleotidit ovat emäspariutuneet; ja va linnaisesti lisänukleotidi, A, G, C tai U, voidaan liittää lA:n l5 jälkeen kaavassa (1).

Kaavan (1) alue (I) edustaa ribotsyymin varsia tai reunustavia . jaksoja, jotka hybridisoituvat kohde-RNA-jakson kullekin kuulu viin osiin. Varret voivat hybridisoitua kohde-RNA:n koko pituuden tai sen osan kanssa. RNA-katalyyttinen alue kuvataan kaavan * 104562 1 alueella (II). Katalyyttinen alue saattaa sisältää yhden tai useamman lisänukleotidin, joka ei haitallisesti vaikuta katalyyttiseen aktiivisuuteen. Tällaisten lisäysten jälkeen voidaan helposti testata ribotsyymiaktiivisus ilman tarpeetonta kokeilua tarkan määrittelyn opetusten jälkeen. Katalyyttinen alue voi i myös muodostaa osan hybridisaatioaluetta.

Oligoribonukleotidit X’ ja X’' voivat sisältää 5000 nukleotidia tai enemmänkin.

Tämän keksinnön lisäerityisilmentymän mukaan nimitetään kaavan 2 ribotsyymi: 0 3* 5· (X)nA X(X)n,

AC A U

G XA 6 5 C * G G A (2)

X * X X

X · X

wm · <*V

XX

0 B

Ά i ·, * jossa; X edustaa mitä tahansa ribonukleotidia ja jokainen X-täh-4 de voi olla sama tai eri; {*} edustaa emäspariutumista komple- 104562 5 mentaaristen ribonukleotidien välillä; n ja n' ovat kuten aikaisemmin on selitetty; m ja m' ovat 1 tai enemmän ja voivat olla sama tai eri; B edustaa sidosta, emäsparia, ribonukleotidia tai oligoribonukleotidia, joka sisältää ainakin 2 ribonukleotidia; 5 ja valinnaisesti lisänukleotidi, A, G, C tai U voidaan liittää lA:n jälkeen kaavaan (2).

Tämän keksinnön ribotsyymejä voidaan valmistaa alalla sisänsä tunnetuilla RNA-molekyylien synteesimenetelmillä. (Esimerkiksi, Promega, Madison, WI, USArn suosittamien etikettien mukaan).

10 Erityisesti tämän keksinnön ribotsyymit voidaan valmistaa vastaavasta DNA-jaksosta (DNA, josta transkription tuloksena saadaan ribotsyymi ja jota voidaan valmistaa alalla sisänsä tunnettujen DNA:n synteesimenetelmien mukaan), joka on käyttökelpoi-sesti liitetty RNA-polymeraasin promoottoriin kuten T7 RNA-poly-15 meraasin tai SP 6 RNA-polymeraasin promoottoriin. Tämän keksinnön ribotsyymiä vastaava DNA-jakso voidaan liittää DNA-siirtäjä-vektoriin kuten plasmidiin tai bakteriofaagi-DNA:hän. Jos siir-täjävektori sisältää RNA-polymeraasipromoottorin käyttökelpoisesta liitettynä ribotsyymiä vastaavaan DNA:han, ribotsyymiä 20 voidaan tuottaa sopivasti inkuboimalla RNA-polymeraasin kanssa. Ribotsyymejä voidaan siksi tuottaa in vitro ribonukleotidien läsnäollessa inkuboimalla RNA-polymeraasia RNA-polymeraasipro-moottorin kanssa, joka on käyttökelpoisesti liitettynä ribotsyymiä vastaavaan DNA:han. In vivo prokaryoottiset tai eukaryootti-25 set solut (sisältäen nisäkäs- ja kasvisolut) voidaan transfek-toida sopivalla siirtäjävektorilla, joka sisältää tämän keksinnön mukaista ribotsyymiä vastaavaa geneettistä materiaalia käyttökelpoisesti liitettynä RNA-polymeraasipromoottoriin siten, että ribotsyymiä transkriboidaan isäntäsolussa. Siirtäjävektorit 30 voivat olla bakteerin plasmideja tai viruksen RNAita tai DNA:ta.

. Ribotsyymejä vastaavat nukleotidijaksot sijoitetaan yleensä vah- : vojen promoottorien valvonnan alaisuuteen kuten esimerkiksi lac- , SV 40 myöhäisen, SV 40 aikaisen, metallotioniinin tai -^-promoottorin alaisuuteen. Ribotsyymit voidaan suoraan transkriboida 35 in-vivo siirtäjävektorista tai vaihtoehtoisesti ne voidaan transkriboida osana suurempaa RNA-molekyyliä. Esimerkiksi ribotsyymi jaksoja vastaava DNA voidaan liittää kantajageenin 3’-päähän, esimerkiksi translaaton lopetussignaalin jälkeen. Isommat RNA-molekyylit voivat auttaa ribotsyymimolekyylejä solussa ta- 6 104562 pahtuvaa nukleaasipilkkomista vastaan. Kantajageenistä voi translaation jälkeen syntyä proteiini, joka voidaan suoraan määrittää esimerkiksi entsymaattisella reaktiolla. Kantajageeni voi esimerkiksi koodata entsyymiä.

5 Tämän keksinnön lisäpuolena on se, että se antaa käyttöön DNA-siirtäjävektorin, joka sisältää ribotsyymiä vastaavan DNA-jak-son, joka on käyttökelpoisesti liitettynä promoottoriin ottaen huomion ribotsyymin transkription.

Yhdessä esitetyssä ribotsyymin tuotantomenetelmässä kaksi komp-10 lementaarisen jakson synteettistä oligonukleotidia valmistetaan 1 tavallisilla menetelmillä ( esimerkiksi käyttämällä Applied Bio- systems Model 380A DNA-syntetisaattoria (Applied Biosystems Inc., Foster City California 94404)), ja hybridisoidaan yhteen. Toinen oligonukleotideista koodaa haluttua ribotsyymiä. Hybri- 15 disoituneiden oligonukleotidien kukin pää vastaa restriktioent-syymien pilkkomiskohtia esimerkiksi Eco Rl toisessa päässä ja Pstl toisessa päässä. Kun on pilkottu sopivilla restriktioent-syymeillä (Eco Rlrllä ja Pstl:llä yllä olevassa esimerkissä), kaksijuosteinen DNA-kappale voidaan kloonata siirtäjävektoriin. 20 Jos plasmidivektori sisältää RNA-polymeraasipromoottorin tämän keksinnön ribotsyymiä vastaavan DNA-jakson 5'-puolella, ribotsyymiä vastaavat RNA-transkriptit voidaan sopivasti valmistaa joko in-vitro tai in-vivo. Jos ribotsyymi koostuu kahdesta puoliskosta, jotka ovat yhdessä siten, että komplementaariset nuk-25 leotidit emäspariutuvat, kumpikin ribotsyymin puolisko voidaan valmistaa yllä olevien menetelmien mukaan, ja inkuboimalla niitä , yhdessä muodostuu ribotsyymi.

Tämän keksinnön'esittämät entsyymit pilkkovat kohde-RNA:ta, joka sisältää X°UY-jakson, jossa X° on mikä tahansa ribonukleotidi, U ’ 30 on urasiili ja Y on adeniini, sytosiini tai urasiili. X°U muo dostaa osan emäspariutuneesta reunustavasta alueesta ja Y ei ole emäspariutunut. Mieluummin, mutta ei suinkaan yksinomaan, X° on guanidiini, ja X°UY on GUC tai GUA. Mikä tahansa RNA-molekyyli, - joka sisältää näitä jaksoja, voidaan pilkkoa tämän keksinnön 35 ribotsyymeillä. Kun RNA-transkriptijakso, joka sisältää X°UY-jakson, on määritelty, ribotsyymijakson varret voidaan valmistaa i komplementaarisiksi ja täten hybridisoituviksi kohde-RNA-jakson im 104562 7 kanssa, joka reunustaa X°UY-jaksoa. Ribotsyymin varsien hybri-disoituessa kohde-RNA-jakson kanssa, joka reunustaa X°UY-jaksoa, ribotsyymin katalyyttinen alue pilkkoo kohde-RNA:ta X°UY-jakson kohdalta. RNA:n pilkkominen helpottuu, kun läsnä on magnesiumia 5 tai muita divalentteja kationeja, kun pH on noin 8,0.

Siis tämän keksinnön esittämiä entsyymejä voidaan muokata pilkkomaan mitä tahansa RNA:ta, jonka jakso tunnetaan. Ribotsyymien pilkkomien RNAissa olevien tähteiden suuri taajuus (1:64 GUC:lle RNA:ssa, kun emäkset jakautuvat satunnaisesti ja tasaisesti) 10 tarkoittaa sitä, että kohtien, joita ribotsyymi voi mahdollisesti pilkkoa, määrä voidaan varmasti ennustaa mistä tahansa annetusta kohde-RNA:sta.

Tämän keksinnön toisen näkökannan mukaan annetaan käyttöön menetelmä, jolla kohde-RNA-jakso inaktivoidaan, mikä sisältää kysei-15 sen kohde-RNA-jakson reaktion tämän keksinnön ribotsyymin kanssa .

In-vivo, toisin sanoen organismin solussa tai soluissa, voidaan siirtäjävektori, kuten bakteerin plasmidi tai viruksen RNA tai DNA, joka kcodaa yhtä tai useampaa ribotsyymiä, transfektoida 20 soluihin, esimerkiksi (Llewellyn et ai., J. Mol. Biol. (1987) 195: 115-123; Hanahan et ai. J. Mol. Biol. (1983) 166). Kun siirtäjävektori on solussa, voi vektori replikoitua ja solun polymeraasit voivat transkriboida sitä tuottaen ribotsyymi-RNA:- « itä, jotka sitten inaktivoivat halutun kohde-RNA:n. Vaihtoehtoi-25 sesti siirtäjävektori, joka sisältää yhden tai useamman ribotsyymi jakson, voidaan transfektoida soluihin tai saattaa soluun mikromanipulaatiotekniikkojen avulla kuten mikroruiskeella, siten, että siirtäjävektori tai osa siitä liittyy isäntäsolun ge-nomiin. Integroituneen geneettisen materiaalin transkriptio syn-: 30 nyttää ribotsyymejä, jotka inaktivoivat haluttua kohde-RNA:ta.

Tämän keksinnön ribotsyymeillä on laajoja biologisia sovellutuksia.

„ 104562

O

Tämän keksinnön ribotsyymejä voidaan erityisesti soveltaa bakteerien ja muiden prokaryoottisten solujen, kasvien ja eläinten RNA-transkriptien inaktivaatioon. Bakteereissa esimerkiksi bakteriofaagien RNA-transkriptit, jotka aiheuttavat baktee-5 risolun kuoleman, voidaan inaktivoida transfektoimalla solu DNA-siirtäjävektorilla, joka inaktivoi faagi-DNA:n. Vaihtoehtoisesti itse ribotsyymi voidaan lisätä bakteerisoluun ja bakteerisolu voi ottaa sisäänsä ribotsyymiä vaikuttamaan faagi-RNA:n pilkkomiseen.

LO

Kasvien RNA-transkripteja voidaan inaktivoida käyttämällä ri-{ botsyymejä, joita koodaa siirtäjävektori kuten Agrobacterium i tumefaciensin Ti-plasmidi. Kun tällaisia vektoreja transfek-toidaan kasvisoluun, RNA-polymeraasi tuottaa ribotsyymejä, .5 jotka voivat vaikuttaa erityisen kohde-RNA-jakson pilkkomiseen. Niinpä kasviviruksia, joiden RNA-jakso tunnetaan, tai kasvigeenien RNA-transkripteja voidaan inaktivoida käyttämällä ribotsyymejä.

Kasvien, eläinten tai muiden solutyyppien sisäsyntyiset geeni-:0 transkriptit voidaan inaktivoida käyttämällä tämän keksinnön ribotsyymejä. Niinpä epämieluisia ilmiasuja ja ominaisuuksia voidaan muuttaa. Saattaa esimerkiksi olla mahdollista, käyttämällä tämän keksinnön ribotsyymejä, poistaa hedelmistä kiviä.

V

« · 104562 9 Tätä keksintöä valaistaan nyt vain rajoittamattomalla esimerkillä, viitaten seuraaviin rajoittamattomiin esimerkkeihin ja kuviin.

Kuvissa: KUVA 1 esittää villityypin ja mutantti-RNA:iden RNA:n itsepilk-komiskohtia; ja elektroforeettinen kuva esittää itsekatalysoitu-ja RNA-pilkkomistuotteita.

a) Yhteenveto konservoituneista rakenteista, jotka liittyvät ASBV:n, vesiliskon satelliitti-DNA-transkriptien ja sTobRV-.n, 0 LTSV:n, samettitupakkatäpläviruksen, solanum nodiflorum -täplä-viruksen ja maanalaisen apilatäpläviruksen satelliitti-RNA:iden luonnollisesti esiintyviin RNA:n pilkkomiskohtiin. Esitetään nukleotidijaksot, jotka ovat konservoituneita näiden rakenteiden välillä, kun taas muita edustaa X. Emäspariutuminen esitetään 5 ",M:llä ja RNA-pilkkomiskohta nuolella.

b) Esittää konservoitunutta nukleotidijaksoa, joka liittyy sTobRV RNA:n (+)juosteen pilkkomiseen. Pilkkomiskohta osoitetaan nuolella.

c) sTobRV:n in vitro -mutantti, joka sisältää insertin, jossa on 0 kahdeksan nukleotidia (osoitettu laatikoimalla) ja niitä reunus- « tava kolmen nukleotidin (UGU-tähteet 7:stä 9:ään) kahdentuma.

d) Villityyppisen sTobRV:n ja D-51 in vitro -mutantin kloonatut Hae III -kappaleet transkriboitiin kukin sekä { + ) että (-) orientaatiossa ja radioaktiivisella aineella leimatut transkrip- 5 tit erotettiin koonsa mukaan toisistaan polyakryyliamidigee-: lielektroforeesilla. Villityypin (WT)ja mutantin (D-51) jaksojen pilkkomattomien 159 ja 170 emäksen transkriptien paikat on osoitettu nuolella; pilkkomistuotteiden koot on osoitettu.

KUVA 2 esittää ribotsyymin nukleotidijakson ja ribotsyymipilkko-0 mistuotteet erotettuna geelielektroforeesilla.

a) Insertoidut nukleotidit D-51-mutantissa (kuva le), joka sisältää Bam Hl -restriktioendonukleaasikohdan. Bam Hl:.tä käytet- 104562 10 tiin mutantti-DNA:n halkaisemiseen, ja kaksi jaksoa kloonattiin ja transkriboitiin erikseen in vitro. RNA-transkriptit osoitetaan kaavamaisesti, mahdolliset emäspariutumiset RNA:iden välillä osoitetaan "‘":llä. Kappaleeseen, joka sisältää nuolella osoi-5 tetun pilkkomiskohdan, viitataan S-RNA:lla, kappale, joka sisältää ribotsyymin, osoitetaan Rz-RNA:lla.

b) (1JP) -Rz-RNA: ta (101 emästä) inkuboitiin yksin (rivi 1) ja leimaamattoman S-RNA:n kanssa (rivi 2). (JIP)-S-RNA: ta inkuboitiin yksin (rivi 3), ja leimaamattoman ja ,2P:llä leimatun Rz-10 RNA:iden kanssa (rivit 4 & 5 tässä järjestyksessä).

KUVA 3 esittää tämän keksinnön erään ilmentymän mukaisen ribotsyymin kaavamaisen mallin. Alue A edustaa pilkkomisjaksoa kohde-RNA:ssa. Alue B edustaa katalyyttistä aluetta ja C-alueet edustavat ribotsyymin varsia.

15 KUVA 4 esittää ribotsyymejä, jotka on muotoiltu CAT (kloram-fenikcliasetyylitransferääsi)-geenitranskriptia vastaan. Ribot-syymit, joiden nimitykset ovat RzCAT-1, 2 ja 3, ovat CAT-geenin 835 emäksen in vitro -transkriptissä olevia kolmea kohtaa vastaan. Transkriptin pilkkomiskohtien vastaavat paikat osoitetaan 20 kaavamaisesti ja reunustavat emäkset en numeroitu (a). Kolme I ribotsyymijaksoa osoitetaan {(b:stä (d):hen) kohdejaksoineen.

CAT-geenin aminohappojaksot on numeroitu ja ennustetut RNA:n pilkkomiskohdat on osoitettu nuolella. RzCAT-1 ja 3 sisältävät 24 emäksen jakson, joka on saatu sTobRVrn (+)juosteesta (alue B, 25 kuva 3), kun taas RzCAT-2 sisältää yhden U-A-vaihdon tällä alueella.

KUVA 5 esittää tulokset, kun CAT-RNA on pilkottu RzCAT-1-, RzCAT-2- ja RzCAT-3-ribotsyymeillä.

* a) (KP)-CAT-RNA:t erotettiin geelillä sen jälkeen, kun niitä oli 30 inkuboitu yksin (-) tai RzCAT-1-, RzCAT-2- tai RzCAT-3-ribotsyy-min kanssa (rivit 1, 2 & 3 vastaavasti). Täysipitkän transkriptin paikka osoitetaan nuolella.

* b) 5'-pään emäsanalyysi. CAT-lähetti-RNA:n ribotsyymipilkkomisen 1 tuottamat 3'-kappaleet (5 '-i:P)-kinasoitiin, puhdistettiin gee- Π 104562

Iillä, pilkottiin kokonaan nukleaasilla ja vapautuneet pään tähteet erotettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla pH:n ollessa 3,5. 5’-pään nukleotidit, jotka määritettiin vertaamalla markkereihin (rivi M), olivat A, U ja G, kun kappaleet oli tuo-5 tettu RzCAT-l:llä, RzCAT-2:lla ja RzCAT-3:lla (rivit 1, 2 ja 3 vastaavasti).

KUVA 6 esittää ribotsyymin (RzCAT-1) katalyyttistä aktiivisuutta CAT-RNA:ta vastaan ajan suhteen. 139 nukleotidin pilkkomistuot-teen määrät mitattiin ja tehtiin Northern blot -analyysi. Liite 10 osoittaa 139 emäksen kappaleen kerääntymisen ajan suhteen, mikä on saatu selville polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen.

KUVA 7 osoittaa CAT-RNA:n suhteelliset pilkkomisnopeudet eri lämpötilaolosuhteissa. Substraatti-RNA esitetään yhtenäisellä viivalla. Jokaisessa tapauksessa pilkkomistuote esitetään katko-15 viivalla.

KUVA 8 kuvaa kolmea ribotsyymiä (vastaavat RzCAT-2:ta), joilla on eripituisia varsia tai reunustava jakso.

KUVA 9 esittää tuotantojärjestelmän ribotsyymiä varten, jossa on katalyyttiselle RNA:lle komplementaarinen jakso, jossa on jokai-20 nen pilkkova alue RzCAT l:stä 3:een.

KUVA 10 esittää ribotsyymejä hybridisoituneena kohdejaksoihin, ! jotka sisältävät GUA (10 a) ja GUU (10 b) aiheet CAT-lähetti- RNA:ssa.

KUVA 11 esittää itsekatalysoivat RNA:n pilkkomiskohdat citrus-25 kasvin exocortis-viroidi(CEV)RNA:ssa ja sen komplementissa.

KUVA 12 esittää RzCEV25x(+)-ribotsyymiä hybridisoituneena kohde-CEV-RNA:han (a) ja RzCEV25x(+):n kanssa inkuboitujen (+)CEV RNA:n ja komplementaarisen (-)CEV R.NA:n geelielektroforeettista kuvaa (b, rivit 1 ja 2 vastaavasti). Pilkkomistuote on osoitettu 30 nuolella.

KUVA 13 esittää RzCAT-2-ribotsyymin hybridisoituneena kohdejak-soonsa (a) ja RzSCMoV-ribotsyymiin (b). Molempien ribotsyymien h 104562 katalyyttinen alue on laatikoitu. RzSCMoV:n katalyyttisen alueen erot verrattuna RzCAT-2:een on merkitty.

KUVA 14 esittää RzCEV-2-ribotsyymin hybridisoituneena kohdejak-soon, joka on citrus-kasvin exocortis-viroidin(CEV) RNA:s s a.

5 Pilkkomiskohta vastaa 336-nukleotidia CEV-RNA-jaksossa. Nukle-otidijakson muutos katalyyttisessä alueessa, kun verrataan sTobRV:n katalyyttiseen alueeseen, on ympyröity (a). Kuva 14(b) esittää kontrolli (CEV:n (-)juoste)RNA:n elektroforeettista kuvaa, rivi 7 ja CEV-RNA:n (+)juosteen kuvaa, rivi 8, sen jälkeen, 10 kun on inkuboitu RzCEV2:n kanssa.

KUVA 15 esittää RzCAT-2-ribotsyymiä (a) verrattuna RzCAT-2B-ri-botsyymiin (b). Katalyyttiset alueet on laatikoitu. Vaihdokset RzCAT-2B:n katalyyttisessä alueessa verrattuna RzCAT-2:een on myös laatikoitu; 15 KUVA 16 esittää pJ35SN-plasmidin kartan; ja KUVA 17 on neljän kokeen, joissa tutkittiin CAT-ilmenemisen in-hibitiota kasveissa (tupakan protoplastit), keskiarvon graafinen esitys.

Seuraavilla esimerkeillä valaistaan tätä keksintöä eikä niitä 20 ole laadittu rajoittamaan tätä keksintöä.

DNA:n käsittävät reaktiot ja käsittelyt, kuten ligaatiot, res-triktioentsyymipilkkomiset, bakteeritransformaatio, DNA-sekvens-sointi jne. toteutettiin normaalimenetelmien mukaan, kuten Ma-niatiksen ym. kuvaamilla (Molecular Cloning, Cold Spring 25 Harbour, 1982). RMArn käsittävät käsittelyt toteutettiin myös standardimenetelmien mukaan, kuten Uhlenbeckin kuvaamilla (Natu-re 328, 596-600 (1987)) ja Haseloffin ja Gerlachin kuvaamilla (Nature 334, 585-591 (1988)).

13 104562 ESIMERKKI 1

Mutatoidun sTobRV-RNA:n itsekatalysoitu pilkkominen:

Vakiorakennealueet, jotka liittyvät luonnollisesti esiintyviin RNA-pilkkomiskohtiin ASBVrssä, vesiliskon satelliitti-DNA-tran-5 skripteissa ja sTobRV:n, LTSV:n, samettitupakkatäpläviruksen (VMoV), solanum nodiflorum -täpläviruksen (SNMV) ja maanalaisen apilatäpläviruksen (SCMoV) satelliitti-RNA:issa, kuten on esitetty kuvassa la. Nukleotidijaksot, jotka ovat konservoituneita näiden rakenteiden välillä, on osoitettu, kun taas rakenteita, 10 jotka eivät ole konservoituneet, edustaa X. lA-tähteen jälkeen on ylimääräinen U LTSV(+)juosteessa.

Alue, joka liittyy sTobRV:n (+)juosteen itsekatalysoivaan pilkkomiseen, tutkittiin, jotta varmistuttiin entsymaattisesta subs-traattiaktiivisuudesta tässä alueessa. Ensin kloonatut sTobRV-15 cDNA:t mutagenisoitiin käyttämällä oligonukleotidilinkkeri-(BamHl)-insertioetikettiä.

sTobRVrn in vitro ilmenemisvektorin rakentaminen: sTobRV-cDNA:n 160 bp Taq 1-Spel-kappale eristettiin pSP653:sta (Gerlach et ai. 19S5, Virology 151: 172-185) ja ligoitiin Acc 1-20 spe 1-pilkottuun, fosfataasilla käsiteltyyn pGEM 4:ään uudistamaan Acc 1-kohtaa. Syntynyt klooni linearisoitiin Acc l:llä, käsiteltiin fosfataasilla ja siihen liitettiin sTobRV-cDNA:n 359 bp Taq 1-kappale. Syntyneistä klooneista etsittiin kloonit, joissa oli rengasmainen järjestyksensä vaihtanut 520 bp sTobRV-25 cDNA-jakso, jonka päässä oli 277:stä 81:een tarpeetonta tähdettä (pTTS). sTobRV-jaksoa reunustavat T7- ja SP6-RNA-polymeraasien promoottorit, ja in vitro transkription tuloksena syntyi (+) tai * · (-) orientaation RNA:ita, joilla oli kaksi itsepilkkomiskohtaa.

In vitro -mutaqeneesi: 30 pTTS-plasmidi (50 Mg) linearisoitiin Bam Hl:llä, käsiteltiin Sl-nukleaasilla ja ligoitiin uudelleen, jotta ainoa Bam Hl-kohta ’ poistuisi. Syntynyt rakenne, pTTS-B, käsiteltiin 2x10'' yksiköllä DNAasi 1: tä 20 mM Tris-HCl:ssä pH 7,0, 15 mM MnCl2:ssa 10 min 37° 14 104562 C:ssa. Syntyneet lineaariset DNA:t viimeisteltiin ja/tai päät täytettiin käyttämällä T4 DNA-polymeraasia, ja puhdistettiin 0,7% LGT agaroosigeelielektroforeesilla ja uuttamalla. Ki-nasoidut Bam Hl-linkkerijaksot (CGGATCCG) ligoitiin linearisoi-• tuun plasmidiin yön yli huoneenlämmössä, kun läsnä oli 5% poly-etyleeniglykolia. Myöhemmin reaktiot pilkottiin Bam Hiillä, ja lineaariset DNA:t puhdistettiin uudelleen 0,7% LGT agaroosigee-lielektroforeesilla (tämän havaittiin olevan tarpeellista, jotta viimeiset rengasmaisen plasmidin hituset ja ligoitumattomat 0 linkkerit poistuisivat). Plasmidit tehtiin jälleen rengasmaisiksi käyttämällä T4 DNA-ligaasia ja transformoitiin E. coli DH-= l:een. Pesäkkeet (suurempia kuin 1000) raaputettiin agarmaljoil ta, kasvatettiin nesteviljelmässä kyllästyspisteeseen asti ja valmistettiin plasmidi-DNA:iden sekapopulaatio. Eri sTobRV-cDNA-5 insertit irrotettiin pilkkomalla restriktioentsyymillä reunustavista EcoRl- ja Pstl-kohdista, puhdistettiin 1%LGT agaroosigeelielektrof oreesilla , ja kloonattiin EcoRl-Pstl:llä katkaistuun, fosfataasilla käsiteltyyn pOEM 4:ään. Syntyneet transformantit yhdistettiin jälleen, kasvatettiin nesteviljelmässä ja valmis-^ 0 tettiin plasmidi-DNA. Plasmidi-DNA:t käsiteltiin Bam Hiillä, jotta pilkottaisiin vain ne plasmidit, joissa oli Bam Hl-linkke-j rijakso, ja lineaariset muodot puhdistettiin jälleen ajamalla j kaksi kertaa 0,7% LGT agaroosigeelielektroforeesi, tehtiin ren gasmaiseksi T4 DNA-ligaasin avulla, ja transformoitiin E. coli 5 DH-l:een. Yksittäisistä transformanteista etsittiin sTobRV-jaksossa olevan insertoidun Bam Hl-linkkerin likimääräinen paikka pilkkomalla restriktioentsyymillä, kloonattiin M13 mpl9:ään ja sekvenssoitiin dideoksinukleotidi-ketjunlopetustekniikalla.

Tulokseksi saatiin sTobRV-mutanttien kirjasto, ja nukleotidijak-0 soanalyysi osoitti, että jokaisessa mutantissa oli insertoitunut Bam Hl-linkkerijakso (CGGATCCG) sekä reunustavia kahdentuneita __i_ * * tai deletoituneita sTobRV-jaksoja. Mutantit transkriboitiin in vitro ja määritettiin RNAiiden kyky pilkoutua. Näistä kokeista tunnistettiin 52 nukleotidin jakso, joka sisälsi sTobRV-RNA:n 5 sekä substraatti- että pilkkomisosat. Tämä 52 nukleotidin jakso, * joka on kuvattu kuvassa Ib, sisälsi konservoidun jakson alueen, jota tarvitaan muiden RNAiiden itsepilkkomiseen (kuva la). Yksi ’ mutantti, jota nimitettiin D-51:ksi, sisälsi kahdeksan nukleoti- J“ din Bam Hl-linkkerijakson, joka oli liittynyt kolmen kahdentu- 104562 15 neen sTobRV-nukleotidin väliin, jotka numeroitiin 7:stä 9:ään. Tämä mutantti kävi läpi itsekatalysoidun RNA-pilkkomisen.

97 ja 108 emäsparin Hae III-kappaleet, joissa oli villityypin ja D-51-RNA:iden (kuten on esitetty kuvassa Ib ja le) 52 nukleotidin pilkkomisjakso, irrotettiin sekvenssoiduista plasmidikloo-neista. Kappaleet liitettiin pGEM 4:n Sma 1-kohtaan ja etsittiin insertin molemmat orientaatiot. Plasmidit linearisoitiin käyttämällä EcoRl:tä ja 159 ja 170 emäksen pituiset {+) ja (-)juoste-RNA:t transkriboitiin käyttämällä 200 yksikköä /ml T7 RNA-poly-0 meraasia 50 mM Tris-HCl:ssä pH 7,5, 10 mM NaClrssa, 6 mM

MgCl,:ssa, 2 mM spermidiinissä, 1000 yksikköä/ml RNAasissa, 500 μ, M ATP:ssä, CTP:ssä ja GTP:ssä 200 μ M (°fnP)UTP:n kanssa. RNA:t erotettiin koonsa mukaan 10% polyakryyliamidi, 7 molaarinen urea, 25% formamidigeelielektroforeesilla, ja autoradiografioi-5 tiin.

Kuten osoitetaan kuvassa Id, ei havaittu (-)juoste-RNA-transkriptien pilkkomista. Tämä oli kuten oli oletettu, koska (-)juoste ei sisältänyt itsekatalysoivaa pilkkomiskohtaa. Sekä villityypin että D-51-jaksojen (+)juesteissa tapahtui pilkkomis-;0 ta, jolloin D-51-RNA:n pilkkominen oli jonkin verran tehottomampaa kuin villityypin RNA:n pilkkominen (kuva Id). Tämä koe osoittaa, että yksijuosteinen silmukka-alue, joka on RNA:n itse-katalysoituun pilkkomiseen liittyvän 52 nukleotidin jakson oikealla puolella, ei ole olennainen.

« >5 Entsymaattisen ja substraattiaktiivisuuksien erottaminen: Käyttämällä Bam Hl-restriktioendonukleaasikohtaa, joka oli liitetty D-51reen, saatiin reunustavat Hae III-Bam Hl- ja Bam Hl-Hae III-kappaleet ja kukin kloonattiin E. coli-plasmidiin, joka ' oli sopiva in-vitro-transkriptiota varten. Tämä johti itsekata- 5Q lysoivan alueen mutatoidun yksijuosteisen silmukan poistamiseen, halkaisemalla alue kahteen RNA-osaan (kuva 2a). Pienempi Hae III-Bam Hl-kappale sisälsi nukleotidit 321:stä 9:ään, mukaan lukien varsinaisen pilkkomiskohdan ja se nimettiin S-kappaleek-si. Bam Hl-Hae III-kappale, joka sisälsi sTobRV-nukleotidit 55 7:stä 48:aan, nimettiin ribotsyymiksi tai Rz-kappaleeksi. In-vitro transkriptioon käytetyt plasmidit olivat pGEM3 ja pGEM4 104562 (Promega, Madison, WI, U.S.A.). Nämä ilmenemisplasmidit sisältävät : a) replikaation aloituskohdan; b) selektiivisen lääkeresistenssi (Ampr)-geenin; 5 c) monikloonauskohdan, jota reunustavat RNA-polymeraasipromoot-torit, joita voidaan käyttää transkriptien in vitro -tuotantoon.

T7 DNA-polymeraasilla käsitelty, Knp l:llä pilkottu Rz-pGEM3 ja Xba l:llä pilkottu S-pGEM4 transkriboitiin käyttämällä SP6 RNA-polymeraasia samoissa olosuhteissa kuin edellä.

10 Kuten esitetään kuvassa 2, kumpikaan S- tai Rz-RNA:sta ei merkittävästi hajonnut, kun niitä inkuboitiin yksin (kuva 2b, rivit 1 ja 3} olosuhteissa, jotka ovat sopivat erittäin tehokkaalle itsepilkkomiselle (50° C, 20mM MgCl., pH 8,0). Leimattu Rz-RNA ei myöskään näyttänyt muuttuneen S-RNA:n kanssa inkuboinnin jälkeen 15 (kuva 2b, rivit 2 ja 5). Kuitenkin, kun S-RNA:ta sekoitettiin Rz-RNA:n kanssa, tapahtui S-RNA:n tehokasta pilkkomista (kuva 2b, rivit 4 ja 5) tuottaen kaksi kappaletta. Tuotteiden koot vastasivat S-RNA:n (84 emästä) pilkkomista normaalista kohdasta nukleotidien #359 ja #1 väliltä, jolloin syntyivät 67 ja 17 nuk-20 leotidin 5'- ja 3'-tyvenpuoleiset kappaleet vastaavasti. Tämä osoittaa, että S-RNA toimi substraattina ribonukleolyyttiselle pilkkomiselle, jonka suoritti Rz-RNA, joka toimi katalyyttisellä tavalla.

Ribotsyymin malli, joka perustuu sTobRV-RNA:n katalyyttiselle 25 alueelle, on esitetty kuvassa 3. Ribotsyymillä on kaksi kaksi-juosteista RNA-vartta tai reunustavaa jaksoa, jotka on esitetty C:ssä, ja jotka hybridisoituvat substraatti-RNA:ssa oleviin komplementaarisiin jaksoihin, se on RNA:han, joka pilkotaan. Jokainen C:ssä esitetty reunustava jakso sisältää 8 ribonukle-' 30 otidia. C-alueessa olevien nukleotidien määrä ei ole ratkaiseva.

Nukleotideja täytyy kuitenkin olla riittävästi, jotta ribotsyymi voi hybridisoitua kohde-RNA:han. Neljä nukleotidia jokaisessa C-alueessa näyttää olevan vähimmäismäärä hybridisaatiota varten.

Katalyyttinen B-alue sisältää jaksoja, jotka ovat erittäin kon--f ’ 35 servoituneita luonnollisesti esiintyvissä pilkkomisalueissa (katso kuva la). Kun on verrattu tunnettujen jaksojen pilkkomis-

SS

„ 104562 alueita, on havaittu, ettei II-emäsparirungon pituus ole tärkeä, kuten ei ole sen yhdessä päässä liittyneenä oleva silmukkakaan.

Kohde-RNA:ssa oleva pilkkomiskohta on kuvattu A:ssa (kuvassa 3) GUC:nä. Meidän tutkimustemme (ei ole esitetty) ja Koizumin (FEBS 5 LETT 228; 288-230 (1988); ja FEBS LETT 239; 285-288 (1988)) perusteella luonnollisesti esiintyvien RNA:iden pilkkomiskohdissa jaksot GUA, GUC, CUC, AUC ja UUC myös toimivat pilkkomiskohtina RNA:ssa.

ESIMERKKI 2 10 Ribotsvvmien, joilla on uusi ja erittäin tarkoin määrätty endo-ribonukleaasiaktiivisuus, suunnittelun, valmistamisen ia aktiivisuuden osoittaminen: Tämän keksinnön esimerkkinä on suunniteltu 3 ribotsyymiä, joiden kohteena on bakteereista saadun yleisesti käytetyn indikaattori-15 geenin, Tn 9 kloramfenikoliasetyylitransferaasin (CAT), transkripti, joka saa aikaan antibioottiresistenssin bakteereissa, kasveissa ja eläimissä ja joka voidaan helposti määrittää. Nämä ribotsyymit, jotka on nimetty RzCAT-l:ksi, RzCAT-2:ksi ja RzCAT-3:ksi, vastaavat mahdollisia GUC-pilkkomiskohtia CAT-RNA:-20 ssa kohdissa 139-140, 494-495 ja 662-663 vastaavasti. Näiden ribotsyymien jaksot on kuvattu kuvassa 4. Jokaisessa tapauksessa kohde-CAT-RNA:han hybridisoituvan ribctsyymin reunustavat jaksot olivat 8 nukleotidin pituisia. Katalyyttinen alue valittiin vastaamaan sTobRV-RNA:n katalyyttistä aluetta, joka on esitetty 25 kuvassa 3.

CAT-geeni saatiin pCM4:stä ja kloonattiin Bam Hl-kappaleena pGEM-32:een (Promega, Madison, WI, U.S.A.:n tuote). Tämä plasmi-1 di linearisoitiin Hind III:lla ja CAT-geenitranskriptit saatiin käyttämällä T7 RNA-polymeraasia 220 μ M («* -l,P) UTP :n kanssa.

30 Ribotsyymijaksot valmistettiin oligodeoksinukleotideina, RzCAT-l:nä, 2:na ja 3:na, vastaavasti. Ne kinasoitiin, liitettiin fos-fataasilla käsiteltyyn EcoRl-Pstl:llä leikattuun pGEM4:ään ja inkuboitiin DNA-polymeraasi l:n Klenow-kappaleen kanssa ennen bakteeritransformaatiota. EcoRl:llä linearisoidut plasmidit 35 transkriboitiin T7 RNA-polymeraasilla, mikä tuotti ribotsyymi- 104562

IP

RNA:ita. Ribotsyymejä inkuboitiin CAT-transkriptien kanssa 50 mM Tris-HCl:ssä pH 8,0, 20 mM MgCl,:ssa 50° C:ssa 60 min, ja tuotteet erotettiin koonsa mukaan 5% polyakryyliamidi 7 M urea, 25% formamidigeelielektroforeesilla ennen autoradiografiaa.

Kun 840-nukleotidin CAT-transkriptia oli inkuboitu minkä tahansa kolmen ribotsyymin kanssa, tapahtui tehokasta ja erittäin jakso-yksityiskohtaista pilkkomista (kuva 5), joka tuotti jokaisessa reaktiossa 2 RNA-kappaletta. Kappalekoot vastasivat ennustettuja pilkkomiskohtia (se on 139 ja 696, 494 ja 341, 662 ja 173 emäk-.0 sen kappaleet olivat RzCAT-l:n, 2:n ja 3:n katalysoimien pilkko-; misten 5'- ja 3'-tuotteet vastaavasti). Näiden ribotsyymikata- lysoitujen pilkkomisten vaatimat olosuhteet olivat samoja kuin : ne, joita on havaittu luonnollisesti esiintyvissä pilkkomisreak- tioissa (Foster, A.C. ja Symons, R.H., Cell 49:211-220 (1987) ja 15 Foster,A.C. ja Symons,R.H. Cell 50:9-16 (1987)), ja tehokkaampaa pilkkomista tapahtui, kun pH:ta, lämpötilaa ja divalenttien kationien konsentraatioita kohotettiin (tietoja ei esitetä). Kun kolmea ribotsyymiä oli molaarinen ylimäärä, ne katalysoivat melkein täydellisen CAT-RNA-substraatin pilkkomisen 60 min jälkeen 20 50 mM Tris-HCl:ssä, pH 8,0, 20 mM MgClj:ssa 50° C:ssa. Samanlai sissa olosuhteissa, kun oli 0,1 M-M substraattia ja 3 M· M ribotsyymejä, CATmRNA-substraatin T, oli 3,5, 3,5 ja 2,5 min, kun vastaavasti oli läsnä RzCAT-l:tä, 2:ta ja 3:a. Ribotsyymijaksot i eivät toimineet substraatti-RNA:n komplementtia (se on (+)juos- 25 tetta) tai oligoribonukleotidimuotoja vastaan (tietoja ei esite- : tä). Jokaisesta ribotsyymin katalysoimasta reaktiosta 3'-pään pilkkomiskappaleet eristettiin ja 5'"P-kinasoitiin (50 mM Tris- ! HC1 pH9, 10 mM MgClj, 10 mM dTT 50 Ci ^-"P ATP:n kanssa ja 5 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia 30 min ajan 37 0 C:ssa). Kap- 30 paleiden tehokas kinasoituminen osoitti, että niiden 5'-päässä oli hydroksyyliryhmiä, jotka olivat samanlaisia kuin ne, joita : · * 1 luonnollisesti esiintyvät pilkkomisreaktiot tuottavat.

RzCAT-1, 2 ja 3 pilkkoivat CAT-jaksoja, jolloin syntyi kappalei-^ ta, joiden päiden nukleotidit määritettiin. Lyhyesti, radioak- 35 tiivisella aineella leimatut kappaleet puhdistettiin 5% polyak- " ryyliamidigeelillä ja pilkottiin samalla tilavuudella 500 yksik- !· · t * köä/ml RNAasi Tl:tä, 25 yksikköä/ml RNAasi T2:ta ja 0,125 mg/ml

-U

~ RNAasi A:ta 50 mM ammoniumasetaatissa pH 4,5 120 min 37 0 C:ssa.

-nm IP 104562

Tuotteet erotettiin koonsa mukaan 20% polyakryyliamidigeelillä, joka sisälsi 25 mM natriumsitraattia, pH 3,5 ja 7 molaarista ureaa. Kuva 5b osoittaa, että CAT-jaksojen pilkkominen RzCAT-l:llä, 2:11a ja 3:11a tapahtuu juuri ennen nukleotideja A, U ja 5 G, vastaavasti.

CAT-geenikappaleiden päiden jakso määritettiin suoraan käyttämällä osittaista entsymaattista pilkkomistekniikkaa (Donis-Kel-ler et ai., Nucleic Acids Res. 4: 2527-2538 (1980)), käyttämällä emäsyksityiskohtaista osittaisribonukleolyyttistä pilkkomista.

IQ Kappaleiden jakso vahvisti, että pilkkominen tapahtui odotetuissa paikoissa CAT-RNA:ssa (ei esitetä).

Entsymaattinen katalyysi:

Jotta todistettaisiin, että ribotsyymit aiheuttavat CATmRNA-substraatin pilkkomista katalyyttisellä tavalla, jokaista inku-15 boitiin substraatin molaarisen ylimäärän kanssa olosuhteissa, joiden pitäisi suosia sekä tehokasta pilkkomista että tuotteiden hajoamista. Kuva 6 esittää kokeen tulokset, jossa 75 min jälkeen 50 0 C:ssa, pH 8,0 20 mM MgCl, :ssa, 10 pmoolia RzCAT-l:tä oli katalysoinut 163 pmoolin typistetyn CATmRNA(173 emästä)subs-20 traatin erityispilkkomisen, jolloin syntyi 139 ja 34 emäksen 5'-ja 3'-kappaleet vastaavasti. Keskimäärin jokainen ribotsyymi oli osallistunut yli kymmeneen pilkkomistapahtumaan. 75 minuutin jälkeen 50° C:ssa havaittiin jonkin verran RNA:n pilkkomista, ' joka ei ollut ominaista, mikä johtui äärimmäisistä olosuhteista, 25 mutta 70% jäljelle jääneistä pilkkomattomista RNA:ista (163 pmoolia) oli kasaantunut 139 emäksen kappaleena. Samanlaisia tuloksia saatiin RzCAT-2:lle ja 3:lle (tietoja ei esitetä), ja täten jokainen toimii RNA-entsyyminä.

I ESIMERKKI 3 30 Lämpötilan vaikutus ribotsyymiaktiivisuuteen:

Tutkittiin reaktiolämpötilan vaikutusta ribotsyymiaktiivisuuden in-vitro-nopeuteen.

Toteutettiin reaktioiden ajankulku RzCAt-1-, 2- ja 3-ribotsyy- 20 104562 o o meille CAT-RNA-substraatilla 37 C:ssa ja 50 C:ssa.

Tässä kokeessa jokaiselle ribotsyymille pystytettin rinnakkais- reaktiot käyttämällä ribotsyymipilkkomiselle reaktio-oloja, jot- 0 ka on mainittu esimerkissä 2. Toista reaktiota mkuboitiin 37 5 C:ssa, toista 50 ° C:ssa. Näytteitä otettiin tietyin välein 90 minuutin ajan ja reaktion määrä analysoitiin denaturoivalla po- lyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Kuva 7 esittää reaktion ajankulkua jokaiselle ribotsyymille, RzCAT-l:stä 3:een 37° C:ssa 0 ja 50 C:ssa. Jokaisen ribotsyymm reaktionopeus kasvaa, kun 10 reaktiolämpötila nousee.

Aika, joka kuluu siihen, että CAT-RNA:sta on pilkottu 50% (t,) , I on merkitty taulukkoon 1.

TAULUKKO 1

RzCAT-l RzCAT-2 RzCAT-3 _______tl/2 (min)_ 15 50*C 3.5 3.5 2.5 , 37*C 55.0 . 70.0 65.0 h Kuten taulukossa 1 on esitetty, ribotsyymien reaktionopeus 37° j C:ssa on noin 20 kertaa hitaampaa kuin reaktionopeus 50° C:ssa.

ESIMERKKI 4 t I. 20 Ribotsyymien eripituisten varsien (tai reunustavan jakson) vaikutukset ribotsyymin katalyyttiseen aktiivisuuteen:

Ribotsyymin varret tai reunustavat jaksot (kaava l:n alue(II)) hybridisoivat ribotsyymin kohde-RNA:han, minkä jälkeen tapahtuu I RNA:n pilkkominen. Tässä kokeessa muutettiin ribotsyymin varsien « 25 komplementaarisuuden laajuutta ja siitä seuraavaa emäspariutumi- sen pituutta ribotsyymivarsien emäspariutuessa kohdejaksoihin ja 104562 21 tutkittiin näiden muutosten vaikutusta kohdejakson pilkkomisno-peuteen.

. Tuotettiin ribotsyymejä, joilla oli 4, 8 ja 12 emäksen komple- mentaarisuus kohdejaksoon nähden ja RzCAT-2 joka varressa (kuva 5 8a). Ribotsyymit valmistettiin esimerkin 2 menetelmien mukaan.

Ribotsyymiaktiivisuus määritettiin inkuboimalla ribotsyymi-RNA:ta CAT-RNA:n kanssa, kuten on kuvattu aikaisemmin.

Ribotsyymi, jolla oli 4 emäksen komplementaarisuus joka varressa, ei pilkkonut substraatti-RNA:ta. Ribotsyymi, jolla oli 8 10 emäksen komplementaarisuus joka varressa, pilkkoi CAT-substraat-tia kuten pilkkoi ribotsyymi, jolla oli 12 emäksen komplementaarisuus. Ribotsyymit, joilla oli 12 emäksen komplementaarisuus, pilkkoivat kohde-RNA:ta tehokkaammin, päätellen in-vitro-reak-tionopeudesta, kuin ribotsyymit, joissa oli vähemmän komplemen-15 taarisia emäksiä. Vaikka näyttää siltä, että tarvitaan enemmän kuin neljä komplementaarista emästä, ribotsyymien hybridisoitu-van alueen pituuden lisääminen nostaa niiden reaktionopeutta.

Toisessa kokeessa tutkittiin ribotsyymin reaktiotehokkuutta, kun ribotsyymillä oli (a) komplementaarisuus koko CAT-transkripti-20 kohde-RNA:n pituudelle ja (b) useita katalyyttisiä alueita.

Valittiin neljä GUC-kohdepaikkaa CAT-RNA-jaksoissa. Ribotsyymin katalyyttiset alueet näitä paikkoja vastaan "liitettiin" CAT-transkriptin kokonaiseen vastamerkitys(-)jaksoon ja katalyyttinen aktiivisuus testattiin.

25 Neljä valittua paikkaa olivat kolme aikaisemin kuvattua RzCAT-l:lle, 2:lle ja 3:lle ominaista paikkaa ja lisäksi paikka, joka voidaan esittää seuraavasti: v

Uusi CAT-paikka #192 30 His Bis Ala Vai Cys Asp Gly 5' CAU CAU GCC GUC UGU GAU GGC 3 t 9 22 104562 jossa "192" viittaa 192-aminohappoon CAT-polypeptidissä ja viittaa pilkkomiskohtaan.

Oligodeoksiribonukleotideja, jotka sisälsivät ribotsyymin katalyyttiset alueet ja jotka ulottuivat näiden jokaisen pilkkomis-'> kohdan yli, käytettiin M13-mutageneesikokeisiin tuottamaan jakson, jossa oli koko CAT-jakson komplementti, mutta siten, että siinä oli liittyneenä neljä ribotsyymin katalyyttistä aluetta. M13-mutageneesi suoritettiin yhdistämällä oligonukleotidit, joissa oli ribotsyymi-insertiot, yksijuosteisiin M13-DNA:ihin, LO joissa oli urasiili ja tämän jälkeen valmistettiin komplementaariset DNA:t, jotka sisälsivät insertion. Komplementaariset DNA:t saatiin kloonaamalla ne sopivassa Escherichia coli -kannassa, (T.A. Kunkel 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82: 488-492). Tulokseksi saatu kaksijuosteinen cDNA kloonattiin in-vitro-il-L5 menemisvektoriin, jotta voitaisiin tuottaa ribotsyymi-RNA:ta käyttämällä T7-polymeraasitranskriptiojärjestelmää. Ribotsyy-miaktiivisuus määritettiin inkuboimalla ribotsyymi-RNA:ta CAT-transkriptin kanssa, minkä jälkeen reaktioseos käsiteltiin gly-oksaalilla, jotta nukleiinihapot denaturoituisivat, ja tämän ’0 jälkeen ajettiin geelielektroforeesi.

Pilkkominen tapahtui itsestään kaikissa odotetuissa kohdissa CAT-transkriptissä. Niinpä varsien tai ribotsyymin reunustavat jaksot voivat kurkottaa pilkottavan RNA-transkriptin koko pituudelle.

* >5 Kuva 9 esittää kaavamaisesti jokaisen neljän ribotsyymin sisältävän katalyyttisen vastamerkitys-RNA:n tuotannon. Katalyyttinen vastamerkitys-RNA sisältää noin 900 emästä.

Edellä kerrotuissa olosuhteissa ribotsyymi- ja kohdejaksot muo-• dostavat komplekseja, joilla on suuri molekyylipaino, luultavas- 50 ti laajalla emäspariutumisella. Tarvitaan vahvaa denaturoimiskä-sittelyä, kuten glyoksaalikäsittelyä, jotta reaktiotuotteet ero-1 aisivat toisistaan elektroforeesin aikana.

rl ui i , 104562 ESIMERKKI 5

Ribotsyymipilkkomisen kohdeiaksot:

Testattiin GUA-aihe mRNA:ssa, jotta saataisiin selville, pilk-kooko ribotsyymi RNA:ta tämän jakson kohdalta.

Valittiin CATmRNA:sta erityinen kohta, joka sisälsi GUA-aiheen (kuva 10a) ja valmistettiin sopiva ribotsyymijakso ja sen aktiivisuus testattiin. Ribotsyymi sisälsi varret, joissa oli 8 ri-bonukleotidia.

Kuvan 10 ribotsyymiä vastaavat synteettiset oligonukleotidit D valmistettiin esimerkin 2 mukaan ja kaksijuosteiset cDNA:t kloonattiin in-vitro-ilmenemisvektoriin (pGEM4, katso edellä) E. coliin, jotta tuotettaisiin ribotsyymi-RNA:ta käyttämällä T7 polymeraasitranskriptiojärjestelmää. Ribotsyymiaktiivisuus määritettiin inkuboimalla ribotsyymi-RNA:ta CATmRNA:n kanssa, minkä j jälkeen reaktioseos ajettiin geelielektroforeesissa kuten on aikaisemmin kuvattu.

Ribotsyymi aiheutti pilkkomisen GUA-kohdepaikassa (ei esitetä). Niinpä GUA-aihe RNA:ssa on tämän keksinnön ribotsyymien substraatti. Tämä ei ollut täysin odottamatonta, koska yksi luonnol-) lisesti esiintyvä pilkkomiskohta sinimailasen ohimenevän juova-viruksen satelliitti-RNA:ssa vaatii GUA-kohdan tunnistamisen.

9

Samoin testattiin GUU-aihe CAT-RNA-kohdejaksossa sopivan ribot-syymin kanssa (katso kuva 10b) ja pilkkomista tapahtui.

ESIMERKKI 6 : , Virus-RNA:n ribotsvymipilkkominen:

Viroidi-RNA, citrus-kasvin exocortis-viroidi-RNA:n muodossa, pilkottiin käyttämällä tämän keksinnön ribotsyymiä.

Kaksi GUC-kohdepaikkaa valittiin citrus-kasvin exocortis-vi-roidi(CEV)RNA:sta. Valittiin myös yksi kohta komplementaarisesta juostejaksosta. Valmistettiin ribotsyymit näitä kaikkia kohtia M 104562 vastaan ja testattiin niiden aktiivisuus. Ribotsyymit merkittiin CEV9x(+):ksi, CEV9x{-/:ksi ja CEV25x(+):ksi. Kuva 11 esittää kolme pilkkomiskohtaa CEV-RNA:ssa näille jokaiselle ribotsyymil-le.

5 Ribotsyymit valmistettiin aikaisempien menetelmien mukaan. Ri-botsyymi RzCEV25x(+) esitetään kuvassa 12. Tämä ribotsyymi pilkkoo GUC-aiheen CEV-RNA:n nukleotidin 116 kohdalta.

Kuva 12(b) esittää CEV-RNA:n pilkkomisen ribotsyymi

RzCEV9x(+):11a. Ribotsyymi RzCEV9x(-):n ei havaittu pilkkovan.

10 Tämä koe osoittaa, että ribotsyymit ovat aktiivisia monenlaisista lähteistä olevia kohde-RNA-jaksoja vastaan. Tämä oli odotettua, koska kaikki RNA:t on muodostettu adeniinin, guaniinin, sytosiinin ja urasiilin perusribonukleotidirakennuspalikoista, huolimatta niiden eläin-, kasvi- tai mikrobialkuperästä.

15 ESIMERKKI 7

Esimerkkejä ribotsyymeistä, joilla on eri katalyyttisiä alueita

Valmistettiin ribotsyymi, jonka kohteena oli CAT-2-kohta, käyttämällä katalyyttistä aluejaksoa maanalaisesta apilatäpläviruk-sesta(SCMoV). Ribotsyymivartta reunustavan jakson kaksitoista 20 komplementaarista emästä liitettiin RzSCMoV-ribotsyymiin. Ribot-syymit RzCAT-2 ja RzSCMoV esitetään kuvissa 13a ja 13b vastaavasti. RzSCMoV:n silmukka-alue sisältää 5 nukleotidia, jotka muodostavat jakson AAAUC. Tätä verrataan RzCAT-2:n silmukka-alu- eeseen, jossa on 4 nukleotidia, jotka muodostavat jakson AGAG.

25 Lisäksi RzSCMoV sisältää C:n katalyyttisessä alueessa RzCAT-2:n U*:n tilalla. Eri jaksot RzSCMoV:ssä verrattuna RzCAT-2:een on : merkitty.

RzSCMoV tuotettiin esimerkin 2 mukaan. RzSCMoV oli aktiivinen ja sai aikaan kaksi pilkkomistuotetta, kuten odotettiin.

”! 50 Toisessa kokeessa pilkottiin citrus-kasvin exocortis-viroidin- t (CEV) komplementaarisen RNA:n kohdepaikka nukleotidin -336 koh- = dalta käyttämällä ribotsyymiä (RzCEV2), jolla oli jakso, joka on κ 104562 mainittu kuvassa 14a. Silmukka-alue, joka on merkitty '^"-kirjaimella kuvassa 14, sisältää kuusi nukleotidia, jotka muodostavat jakson 3'-CCTATA-5'. Tämä on erilainen kuin sTobRVtn silmukka-alue, joka sisältää neljä nukleotidia, jotka muodostavat jak-5 son 3'-AGAG-5'. Tämä ribotsyymi pilkkoo kohde-CEV-komplementaa-ri-RNA:ta -336-paikasta kuten on esitetty kuvan 14b elektrofo-reettisessa kaavakuvassa.

Tämä koe osoittaa, että silmukka-alueen nukleotidien määrä ja nukleotidijakso ei ole tärkeä ribotsyymiaktiivisuudelle. Näissä 10 kokeissa ribotsyymi tuotettiin menetelmien mukaan, jotka on aikaisemmin kuvattu yksityiskohtaisessa selvityksessä.

Toisessa kokeessa tutkittiin katalyyttisessä alueessa (runko-alue) tapahtuvan emäspariutumisen vaikutusta ribotsyymiaktiivi-suuteen.

15 Valmistettiin ja testattiin ribotsyymi, joka vastasi RzCAT-2:ta, mutta se sisälsi lisäksi neljä ylimääräistä emäsparia. Kuvassa 15a esitetään RzCAT-2-ribotsyymin jakso hybridisoituneena kohde-CAT-RNA:han. Testiribotsyymi esitetään kuvassa 15b siten, että lisäemäsparit on laatikoitu. Testiribotsyymillä oli RzCAT-2:een -0 verrattava aktiivisuus. Tämä osoittaa, että ribotsyymin katalyyttisen alueen emäspariutunut alue voi olla eripituinen ilman, että se vaikuttaa katalyyttiseen aktiivisuuteen.

Olemme havainneet (tietoja ei esitetä), että sTobRV-RNA-transkriptien pysyvä in vivo -muoto, joka ilmenee transgeenisis-5 sä kasveissa, on enimmäkseen rengasmainen, mikä luultavasti johtuu 5'- ja 3'-päiden liittymisestä yhteen. Siksi kahden auto-lyyttisen pilkkomiskohdan, jotka reunustavat mielenkiinnon koh-. teenä olevaa jaksoa in vivo -transkriptissä, käyttö todennäköi- • t : sesti johtaa rengasmaiseen tuotteeseen, joka saattaa olla pysy- 0 vämpi kuin lineaariset transkriptit. Tämä ensi askel näyttää antavan käyttöön uuden menetelmän ribotsyymijaksojen in vivo -pysyvyydelle. Tätä nimitetään sirkularisaatioksi.

26 104562 ESIMERKKI 8

Ribotsyymien in-vivo-aktiivisuus: Tässä esimerkissä tutkitaan ribotsyymien in-vivo-aktiivisuutta kasvisoluissa.

5 Koe-etiketti:

Plasmidit, joissa oli anti-CAT (CAT= kloramfenikoliasetyyli-transferääsi) tai yhdistetty anti-CAT/ribotsyymi-geenirakennel-mat (katso alla), vietiin tupakan protoplasteihin siten, että molempia oli sama määrä ja samassa suhteessa, ja samalla proto-10 plasteihin vietiin toinen plasmidi, joka sisälsi toimivan CAT-geenirakennelman. CAT-aktiivisuudet mitattiin ja niitä verrattiin geeniaktiivisuuden perustasoon.

Aineisto ia menetelmät: a) Elektroporaatiot ja CAT-määritykset.

15 Nämä suoritettiin kuten Llewellyn ym. ovat kuvanneet (J. Mol. Biol. (1987) 195:115-123). Lyhyesti, Nicotiana plumbaqinifolia linjan T5 protoplastit valmistettiin kahden päivän viljelysus-pensiosta, jossa oli 10 mM HEPES:stä, pH 7,2, 150 mM NaCl:a, 0,2 M mannitolia ja jonka tiheys oli 3xl0‘/ml. Elektroporaatio 20 toteutettiin käyttämällä yhtä 50 ms pulssia 250 V:lla. Protoplastit laimennettiin 10-kertaisesti ja viljeltiin 20 tuntia 26° C:ssa pimeässä. Ne hajotettiin sonikaation avulla ja saatiin uutteet. Uutteet vakioitiin proteiinipitoisuuden suhteen ja määritettiin CAT-aktiivisuus in vitro käyttämällä l,C-kloramfeniko-• 25 lia 3a asetyyli-CoA:ta. Reaktiotuotteet erotettiin ohutlevykro- ' matografian avulla ja saatiin näkyviin autoradiografiän avulla.

Reaktioiden laajuus laskettiin sen avulla, miten radioaktiivisia tuotejohdannaisia tuotettiin I4C-kloramfenikolimallista.

b) Geenirakennelmat.

— % 30 Geenirakennelmat vietiin 0,1 ml protoplastisuspensioihin plasmi-= di-DNA:issa, jotka oli puhdistettu bakteereista uuttamisen avul- a ! i 27 104562 la ja kahteen kertaan CsCl-tasapainotiheysgradienttisentrifugaa-tiolla. Ne suspendoitiin uudelleen 10 mM Tris/ ImM EDTA / pH = 7,5:hän käyttöä varten.

Aktiivinen CAT-geenirakennelma syntyi plasmidissa, joka nimitettiin pCAT7+:ksi. Se saatiin fuusioimalla CAT-geenijakso (pCM4-plasmidista, katso T.J. Close ja R. Rodriguez, 1982, Gene 20:305-316) pJ35SN-plasmidiin (saatu p35SN:stä( W.L. Gerlach et ai., 1987, Nature 328: 802-805) siten, että aktiivinen geenira-kennelma oli: 3 s; ____3 ·

35S CAT * NOS

35S viittaa 35S CaMV (cauliflower mosaic -virus)promoottoriin, NOS nopaliinisyntetaasipolyadenylaatiosignaaliin, T/C transkriptioon.

3 0,2 μ g pCAT7+:n kanssa lisättiin eri geenirakennelmia ylimäärä kuten on kuvattu alla. Geenirakennelmat olivat plasmideissa, jotka on nimetty seuraavasti: pJ35SN - Tämä vektori, jonka kartta on esitetty kuvassa 16, sisältää 35S CaMV -promoottorin ja kasvin nopaliinisyntetaasi-3'-] polyadenylaatiosignaalin, ja sitä voidaan kuvata seuraavasti: 5_ 3'

35S | NOS

« * „ 104562 pCAT7- - Tämä sisältää CAT-geenijakson liitettynä pJ35SN:ään siten, että transkription tuloksena syntyy vastamerkitys-CAT-RNAtta, ja sitä voidaan kuvat seuraavasti: 51__._,3'

5 3SS > C CAT HOS

pCAT19- - Tämä sisältää CAT-geenin, jossa on neljä katalyyttistä ribotsyymialuetta (katso esimerkki 4 ja kuva 9), liitettynä pJ35SN:ään siten, että transkription tuloksena syntyy vastamer-kitys-CAT-RNA:ta, jossa on neljä katalyyttistä ribotsyymialuetta 10 ja sitä voidaan kuvata seuraavasti: 5' _3'

3SS 1 CAT _ KOS

katalyyttiset alueinsertiot

Tulokset: 15 Seuraava taulukko esittää suhteellisia CAT-aktiivisuuksia soluissa 20 tuntia elektroporaation jälkeen. Aktiivisuus ilmenee siten, kuinka monta prosenttia kloramfenikolia on muutettu 1 tunnin kokeessa.

y*s v t " • 29 104562 μ g plasmidia elektroporoitu Käsittely Muutos IA 0 IB 0 ^ 2A 0.2 18 21 2B 0.2 16 46 3A 0.2 9 9 28 3B 0.2 99 32 4A 0.2 18 26 1ΰ 4B 0.2 18 19 5A 0.2 9 9 19 5B 0.2 9 22 6A 0.2 18 14 6B 0.2 18 16 15 (joka käsittelylle "A” ja "B" ovat rinnakkaiset) Näistä tuloksista voidaan vetää seuraava johtopäätös: • * * a) CAT-geenirakennelman käyttöön ottaminen johtaa merkittävään CAT-aktiivisuuteen - vertaa 2A:ta ja B:tä lA:n ja B:n kanssa. Rinnakkaisten välillä on vaihtelevuutta. Muiden näytteiden (kat- 0 so "b" ja "c" alla) antaman suuntauksen perusteella on todennäköistä, että 2A esittää epänormaalin alhaista aktiivisuutta.

b) Vastamerkitysgeenirakennelman samanaikainen käyttöön ottaminen johtaa aktiivisuustason laskuun - vertaa 3A,B:tä ja 4A,B:tä 30 104562 2B:n kanssa. Vähennystaso On suoraan suhteessa lisätyn plasmi-dissa olevan vastamerkitysgeenin tasoon - vertaa 3A:ta ja B:tä 4A:n ja B:n kanssa.

c) Yhdistetyn vastamerkitys/ribotsyymi -geenirakennelman saraan-7 aikainen käyttöön ottaminen johtaa geeniaktiivisuuden vähenemiseen - vertaa 5A,B:tä ja 6A,B:tä 2B:n kanssa. Lisäksi väheneminen on ilmeisempää kuin vastamerkitysgeenirakennelmien vastaavilla tasoilla - vertaa 5A:ta ja B:tä 3A,B:n kanssa ja 6A,B:tä 4A,B:n kanssa.

LO Neljän in-vivo-kokeen keskiarvotulokset on esitetty kuvassa 17. Tässä kuvassa "kontrollia" esittää käsittely 2. "Vastamerkitys-tä" esittää käsittely 4. "Katalyyttistä" edustaa käsittely 6 ja "taustaa" edustaa käsittely 1.

Katalyyttinen ribotsyymi inhiboi CAT-aktiivisuutta keskimäärin -5 47% verrattuna vastamerkitysribotsyymin 34% keskiarvoon.

Ribotsyymin omaavien geenien käyttöön ottaminen kasvisoluissa inhiboi niiden kohdegeenien aktiivisuutta. Lisäksi inhiboiminen on suurempaa kuin vastaavilla vastamerkitys-RNA-molekyyleillä.

Nämä tulokset osoittavat, että ribotsyymit ovat aktiivisia ?0 eläin-, kasvi- tai mikrobisoluissa kohde-RNA-molekyylien sarjaa vastaan.

Ribotsyymien toimintamekanismit tässä esimerkissä ovat epäselviä. Esimerkiksi vastamerkitysribotsyymi voi palautumattomasti hybridisoitua kohde-RNA:han ja katalysoida fosfodiesterisidoksen !5 pilkkoutumisen yhdessä tai useammassa valitussa paikassa kohde-RNA:ssa. Vaihtoehtoisesti solun entsyymit voivat avata vastamer-kitys-RNA:n sen kohdejaksosta siten, että kohde-RNA pilkotaan kahteen tai useampaan kappaleeseen.

M 104562 ESIMERKKI 9

Ribotsvvmien in-vivo-aktiivisuus eläinsoluissa:

Ribotsyymien aktiivisuus inaktivoida kohde-RNA nisäkässoluissa esitellään tässä esimerkissä.

5 Aineisto ia menetelmät:

Aktiiviset geenirakennelmat, jotka koodaavat ribotsyymejä, transfektoitiin yleisesti saatavaan apinan COSl-munuaissolulin-jaan elektroporaation avulla. Tässä menetelmässä 3xl0‘ / ml COS1-soluja suspendoitiin puskurisuolaan 10% FCS:n (vasikan sikiösee-10 rumin) kanssa, ja ne joutuivat tekemisiin eri geenirakennelmien kanssa ja käytettiin sähköpurkausta aiheuttamaan DNA:n elektro-poraatiota soluihin. Transfektoituja soluja inkuboitiin 37° C:ssa 48 tuntia viljelyelatusaineessa ennen CAT- ja luciferaasi-aktiivisuuskoetta.

15 CAT-geenirakennelmat olivat pTK CAT:ksi nimetyssä plasmidissa (Miksicek et ai., Cell 46:283-290, 1986). Tämä plasmidi saatiin viemällä CAT-geenijakso pSV2-plasmidiin siten, että se on herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasipromoottorin valvonnan alla.

Geenirakennelmat, jotka koodasivat ribotsyymejä, olivat pSV232A-20 plasmidissa (De Wet et ai., Molecular and Cellular Biology 7:725-737, 1987), joka sisälsi luciferaasi-geenin fuusioituna SV40:n aikaiseen promoottoriin. Ribotsyymejä koodaava DNA liitettiin luciferaasi-geenin 3'-pään Xba I -kohtaan Maniatiksen ym. normaalimenetelmien mukaan (Molecular Cloning, A Laboratory 25 Manual, Cold Spring Harbour, 1982).

• c * Seuraavat rakennelmat valmistettiin käyttämällä Maniatiksen ym. normaalitekniikoita (yllä): pFC58 - Tämä plasmidi sisältää DNA:n, joka koodaa RzCAT-l-ribot- syymiä, joka on fuusioitu luciferaasi-geenin 3'-päähän toimimat- 3Q tomassa orientaatiossa.

J2 104562 Tämä voidaan kuvata seuraavasti: »a I K |SMTU | l »a jossa 232A viittaa pSV232A-jaksoihin, SV 40 early viittaa SV40:n > aikaiseen promoottoriin ja small T on DNA, joka koodaa SV 40:n pientä T-intronia. Tämä rakennelma johtaa luciferaasia ja RzCAT-1-ribotsyymiä koodaavan RNA-molekyylin tuotantoon, jolloin RzCAT-1 on orientaatiossa, jonka ei olettaisi olevan katalyyttinen.

.0 pFC4 - Tämä plasmidi on samanlainen kuin pFC58 paitsi, että RzCAT-1 on korvattu RzCAT-3:lla.

pFCl-6 - Tämä plasmidi on sama kuin pFC58 paitsi, että RzCAT-1 on korvattu RzCAT-3:lla, joka on merkityksellisessä orientaatiossa (5'-3').

5 pFC20 - Tämä plasmidi on sama kuin pFCl-6 paitsi, että RzCAT-3 on korvattu RzCAt-2:lla, jolla on kahdeksan nukleotidin reunustava jakso.

pFC12 - Tämä plasmidi on sama kuin pFC20 paitsi, että RzCAT-2-ribotsyymi sisältää kahdentoista nukleotidin reunustavat jaksot.

tr * „ 104562 pFC50 - Tämä plasmidi sisältää CAT-geenin, jossa on lisäksi neljä katalyyttistä ribotsyymialuetta (katso esimerkki 4 ja kuva 9) merkityksellisessä orientaatiossa (5'-3'), jolloin transkription tuloksena syntyy toimimaton ribotsyymi. Tätä plasmidia voidaan 5 kuvata seuraavasti: CAT-geeni sisältää ribotsyymialueet 5V4Q CAT gene containing Poly myöhäinen ribozvme domains^ A» 10 RNA ei ole katalyyttinen pFC54 - Tämä plasmidi on sama kuin pFC50 paitsi, että CAT-geeni ja ribotsyymialueet ovat merkityksettömässä (3'—5') toimivassa orientaatiossa.

15 pFC64 - Tässä plasmidissa on pFC50:n SV 40 -promoottori ja poly-adenylaatiosignaalit ja se sisältää villityyppisen CAT-geenin, jossa ei ole liittyneenä ribotsyymialueita. Tämä geeni on vasta-merkitysorientaatiossa eikä täten tuota CAT-proteiinia.

pFC65 - Tämä plasmidi on sama kuin pFC64 paitsi, että villityyp-20 pinen CAT-geeni on merkityksellisessä (5* —3*) orientaatiossa ja täten tuottaa CAT-proteiinia.

Kokeet:

Luciferaasi-aktiivisuus määritettiin De Wet:n ym. (yllä) menetelmien mukaan. Lyhyesti, COS-solut lyysattiin 48 tuntia trans-15 fektion jälkeen, ja solulysaattia inkuboitiin luciferinin kanssa, joka on luciferaasin substraatti, ja luminesenssi huomattiin käyttämällä tuikelaskinta.

• · CAT-aktiivisuus mitattiin myös käyttämällä COS-solulysaatteja » (solulysaatit jaettiin kahteen, ja kummastakin osasta määritet-0 tiin joko luciferaasi- tai CAT-aktiivisuus) M.J. Sleighin menetelmän mukaan (Anal. Biochem. 156: 251-256, (1986).

In-vivo-kokeissa pFC58 ja pFC4 eivät vaikuttaneet CAT-aktiivi-suuteen transfektoiduissa soluissa. Tämä aktiivisuus nimettiin „ 104562 100% CAT-aktiivisuudeksi ja 0% CAT-suprssioksi. CAT-aktiivisuus muilla plasmideilla transfektoiduissa soluissa mitattiin suhteessa pFC58:aan. CAT-supression % arvioitiin 100 - (CATt,,t! .) x 100 \CATCOntrol / joka on vakioitu luciferaasi-tuotannolle. CATltIli = CAT-koetulos testirakennelmille. CATtlI,ril » CAT-koe kontrollirakennelmille (pFC4 ja pFC58).

M

Luciferaasi-tuotanto on sisäinen elektroporaation kontrolli, ja 0 antaa ribotsyymituotannon määrän jokaisessa yksittäisessä elekt-roporoidussa kudosviljelymaljassa.

Tulokset: ·: Koe (i) μ g elektroporoitua plasmidia / 1,5x10 solua

5 Käsittely pTKCAT pFC58 pFC20 pFCl-6 pFC12 % CAT

Supressio 1 5 2 56 2 5 11 53 3 5 2 40 20 4 5 2 0

Kaikki käsittelyt toteutettiin rinnakkaisina ja keskiarvo on annettu.

» 104562

Koe (ii) μ g elektroporoitua plasmidia / 1,5x10* solua

Käsittely pTKCAT pFC-1-6 pFC20 pFC12 pFC4 % CAT

Supressio 5 5 2 75 5 6 5 2 75 7 5 4 62 6 5 11 70 9 5 4 51 10 5 2 0 10 Käsittelyt 5:stä 10:een toteutettiin rinnakkaisina ja keskiarvo on annettu.

Koe (iii) μ g elektroporoitua plasmidia / 1,5x10* solua

Käsittely PFCl-6 pFC4 % CAT

Supressio 5 11 5 2 66 12 5 2 0 Käsittelyt toteutettiin viisinkertaisina ja keskiarvo on annettu.

Koe (iv) •: 1 μ g elektroporoitua plasmidia

pTKCAT pFCSO pFC54 pFC64 pFC65 ' % CAT

Käsihhely 5uprpss i o 13 5 2 0 K 5 2 26 15 5 2 2

16 0 2 NA

Jokainen käsittely 13:sta 16:een toteutettiin nelinkertaisena.

Merkityksellinen CAT-rakennelma (käsittely 16) tuotti korkeita CAT-aktiivisuustasoja omasta takaa. Siksi %supressio ei hae paikkaansa.

Lukuisa määrä kokeita toimitettiin myös siten, että pTKCAT:n TK- « 104562 promoottori korvattiin ihmisen metallotioneiinipromoottorilla. Kun tämä CAT-rakennelma transfektoitiin COSl-soluihin yhdessä plasmidin kanssa, joka koodaa yhtä tai useampaa ribotsyymiä, havaittiin ilmeinen CAT-aktiivisuuden lasku.

Yllä olevat tulokset selvästi osoittavat, että ribotsyymit lopettavat kohde-RNA:n toiminnan in-vivo eläinsoluissa.

Vaikka ribotsyymien tehokkuuden in-vivo uskotaan aiheutuvan yhdestä tai useammasta katalyyttisestä alueesta, jotka pystyvät pilkkomaan kohde-RNA:ta, tällaisten alueitten läsnäolo "vasta-0 merkitys"-RNA-tyyppisissä ribotsyymeissä ei saata itse asiassa johtaa pilkkomiseen in vivo, jos koko RNA/vastamerkitys-RNA-mo-lekyyli ei mene palasiksi. Kuitenkin huolimatta siitä, meneekö molekyyli palasiksi tai ei, edelliset esimerkit osoittavat, että ribotsyymi on tehokas lopettamaan kohde-RNA:n toiminnan. Täten 5 keksintö on sopiva kaikille ribotsyymeille, joilla on katalyyttinen alue, joka pystyy aiheuttamaan pilkkomista ja hybridisoi-tuva alue, huolimatta siitä, tapahtuuko pilkkominen todella koh-de-RNA:ssa. Se on. Hybridisoituva alue voi olla niin iso, että se aiheuttaa sen, että yhdistyneet RNA/ribotsyymi pysyvät yhdes-0 sä ja tämä estää kohde-RNA:n pilkkomisen erotettuihin komponentteihin, vaikka katalyyttinen alue itsessään pystyy aiheuttamaan pilkkomista.

Claims (23)

1. 37 1Π 4 Γ 6 2
2. 1. Yhdiste tunnettu siitä, että sen kaava on: ' v τ o w 3 ' (X) —- A X-(X)»· 5' A C I \ : A U \ \ G (XU A 9 * 9 gO x * x x * x φ. * 00 .· xv / '%(X)> % jossa kukin X merkitsee ribonukleotidiä, joka voi olla « samanlainen tai erilainen kuin muut; ’ jossa (X)n ja (X) n· kumpikin merkitsevät oligoribonukleotidiä, (a) joka.pystyy hybridisoitumaan pilkottavan RNA-kohdejakson kanssa/ ja (b) jolla on ennalta määrätty jakso, joka ei luontaisesti esiinny kovalenttisesti sitoutuneena jaksoihin A-A-A-G-C- ja X-C-U-G-A-, vastaavasti, tällainen RNA-kohdejakso ei esiinny yhdisteessä; jossa n ja n1 kumpikin merkitsevät kokonaislukua, joka määrittää ribonukleotidien lukumäärän oligonukleotidissä sillä ehdolla, että summa n+n' on riittävä sallimaan yhdisteen pysyvän ,β ~ 104562 vuorovaikutuksen emäspariuturaisen välityksellä RNA-kohdejakson kanssa; jossa kukin * merkitsee emäspariutumista sen kummallakin puolella sijaitsevien ribonukleotidien välillä; jossa kukin yhtenäinen viiva merkitsee kemiallista sidosta, joka * muodostaa kovalenttisen sidoksen niiden ribonukleotidien välillä, jotka sijaitsevat sen kummallakin puolella; jossa a merkitsee kokonaislukua, joka määrittelee ribonukleotidien lukumäärän sillä ehdolla, että a voi olla 0 tai 1, ja jos se on 0, niin silloin (X)a:n 5'-puolella oleva A on sitoutunut (X)a:n 3'-puolella olevaan G:hen; jossa m ja m1 kumpikin merkitsevät kokonaislukua, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 1; f jossa kukin katkoviivoista riippumattomasti merkitsee joko kemiallista sidosta, joka muodostaa kovalenttisen sidoksen sen kummallakin puolella olevien ribonukleotidien välille, tai että mitään sellaista kemiallista sidosta ei ole; ja * ! jossa (X)b merkitsee oligoribonukleotidiä, joka on läsnä tai f puuttuu sillä ehdolla, että b merkitsee kokonaislukua, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 2, jos (X)b on läsnä. ·. 2. Yhdiste tunnettu siitä, että sen kaava on: m 104562 3' .(X)rrCA^ X-(X)R. 5' A C I \ A U \ G \ G {XK A I 1 Av. C * G G X * X X X * X (X). * (X).· X X \ / ' (X)i jossa kukin X merkitsee ribonukleotidiä, joka voi olla samanlainen tai erilainen kuin muut; jossa kukin (X)n_x ja (X)n. merkitsevät oligoribonukleotidiä, (a) joka pystyy hybridisoitumaan pilkottavan RNA-kohdejakson kanssa ja (b) jolla on ennalta määrätty jakso, joka ei luontaisesti esiinny kovalenttisesti sitoutuneena jaksoihin C-A-A-A-G-C- ja X-C-U-G-A-, vastaavasti, tällainen RNA-kohdejakso ei esiinny yhdisteessä;* jossa kukin n ja n' merkitsevät kokonaislukua, joka määrittää ribonukleotidien lukumäärän oligonukleotidissä sillä ehdolla, että summa n+n' on riittävä sallimaan yhdisteen pysyvän vuorovaikutuksen RNA-kohdejakson kanssa emäspariutumisen välityksellä; • * » · • _ jossa kukin * merkitsee emäspariutumista sen kummallakin puolella sijaitsevien ribonukleotidien välillä; jossa kukin yhtenäinen viiva merkitsee kemiallista sidosta, joka muodostaa kovalenttisen sidoksen niiden ribonukleotidien välillä, jotka sijaitsevat sen kummallakin puolella,· 40 104562 jossa a merkitsee kokonaislukua, joka määrittelee ribonukleotidien lukumäärän sillä ehdolla, että a voi olla 0 tai 1, ja jos se on 0, niin silloin (X)a:n 5'-puolella oleva A on sitoutunut (X)a:n 3'-puolella olevaan G:hen; jossa kukin m ja m' merkitsevät kokonaislukua, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 1; jossa kukin katkoviivoista riippumattomasti merkitsee joko kemiallista sidosta, joka muodostaa kovalenttisen sidoksen sen kummallakin puolella olevien ribonukleotidien välille, tai että mitään sellaista kemiallista sidosta ei ole; ja jossa (X)b merkitsee oligoribonukleotidiä, joka on läsnä tai puuttuu sillä ehdolla, että b merkitsee kokonaislukua, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 2, jos (X)b on läsnä.
3. 3. Yhdiste tunnettu siitä, että sen kaava on·. t 3- m—ch x-(x)„. 5· \ \ A C • I \ .A U I \ G A G I /\ \ c * 9 G A .· x * X Xxx X * X (X). * Φ- X X > / \ X Ä(x)V A 4i 104562 jossa kukin X merkitsee ribonukleotidiä, joka voi olla samanlainen tai erilainen kuin muut; jossa kukin (X)n.x ja (X)n. merkitsevät oligoribonukleotidiä, (a) joka pystyy hybridisoitumaan pilkottavan RNA-kohdejakson kanssa ja (b) jolla on ennalta määrätty jakso, joka ei luontaisesti esiinny kovalenttisesti sitoutuneena jaksoihin C-A-A-A-G-C- ja X-C-U-G-A-, vastaavasti, tällainen RNA-kohdejakso ei esiinny yhdisteessä; jossa kukin n ja n' merkitsevät kokonaislukua, joka määrittää ribonukleotidien lukumäärän oligonukleotidissä sillä ehdolla, että summa n+n' on riittävä sallimaan yhdisteen pysyvän vuorovaikutuksen RNA-kohdejakson kanssa emäspariutumisen välityksellä; e jossa kukin * merkitsee emäspariutumista sen kummallakin puolella sijaitsevien ribonukleotidien välillä; jossa kukin yhtenäinen viiva merkitsee kemiallista sidosta, joka muodostaa kovälenttisen sidoksen niiden ribonukleotidien välillä,,' jotka sijaitsevat sen kummallakin puolella; i jossa kukin m ja m' merkitsevät kokonaislukua, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 1; jossa kukin katkoviivoista riippumattomasti merkitsee joko kemiallista sidosta, joka muodostaa kovälenttisen sidoksen sen kummallakin puolella olevien ribonukleotidien välille, tai että mitään sellaista kemiallista sidosta ei ole; ja 42 104562 jossa (X)b merkitsee oligoribonukleotidiä, joka on läsnä tai puuttuu sillä ehdolla, että b merkitsee kokonaislukua, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 2, jos (X)b on läsnä.
4. 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen yhdiste tunnettu siitä, että summa n+n' on suurempi tai yhtä suuri kuin 14.
5. 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1, 2, 3 tai 4 mukainen yhdiste tunnettu siitä, että kukin n ja n' on suurempi kuin 6.
6. 6. Yhdiste tunnettu siitä, että sen kaava on: 3'- [-(Y)r-Q-(Y)s-! z -5' jossa Q merkitsee minkä tahansa patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4 tai 5 mukaista yhdistettä; jossa kukin Y merkitsee ribonukleotidiä, joka voi olla samanlainen tai erilainen kuin muut; jossa kukin r ja s merkitsee kokonaislukua, joka voi olla suurempi tai yhtä suuri kuin 0; ja « jossa z merkitsee kokonaislukua, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 1. f f
7. 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 5 tai 6 mukainen yhdiste tunnettu siitä, että pilkottava RNA-kohdejakso on viruksen RNA-jakso. 1 Ϊ Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 5, 6 tai 7 mukaisen yhdisteen käsittävä koostumus tunnettu siitä, että se on yhteistoiminnassa, 104562 maataloudellisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.
8. 9. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 5, 6 tai 7 mukaisen yhdisteen valmistamiseksi tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) mainittua yhdistettä vastaava nukleotidijakso liitetään siirtäjävektoriin, joka koostuu DNÄ:sta, RNA:sta tai niiden yhdistelmästä; (b) (a)-vaiheen nukleotidijakso transkriboidaan RNA-polymeraasilla; ja (c) yhdiste otetaan talteen.
9. 10. RNA:sta, DNA:sta tai niiden yhdistelmästä koostuva siirtäjävektori tunnettu siitä, että se sisältää < nukleotidijakson, joka transkriptiossa tuottaa minkä tahansa patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 5, 6 tai 7 mukaista yhdistettä.
10. 11. Patenttivaatimuksen 10 siirtäjävektorin sisältävä koostumus tunnettu siitä, että se on yhteistoiminnassa maataloudellisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.
11. 12. Prokaryoötti- tai eukaryoottisolu tunnettu siitä, . että se sisältää nukleotidijakson, joka on minkä tahansa * « patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 5, 6 tai 7 mukainen yhdiste tai tuottaa sitä transkriptiossa. 1 2 Eukaryoottisolu tunnettu siitä, että se on 2 patenttivaatimuksen 12 mukainen. 44 104562
12. 14. Kasvi- tai eläinsolu tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksen 13 mukainen
13. 15. Menetelmä kohde RNA:n inaktivoimiseksi solussa tunnettu siitä, että menetelmä käsittää kohde RNA:n saattamisen solun sisällä kosketuksiin minkä tahansa patenttivaatimuksen 1,2,3,4,5,6 tai 7 mukaisen yhdisteen kanssa, joka pystyy vuorovaikutukseen emäspariutumisen välityksellä kohde-RNA:n jakson kanssa sellaisissa olosuhteissa, joissa yhdiste on pysyvästi vuorovaikutuksessa emäspariutumisen välityksellä kohde-RNA:n kanssa ja kohde-RNA pilkkoutuu.
14. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että kohde-RNA on solulle endogeenisen geenin transkripti.
15. 17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että kohde-RNA on solulle eksogeenisen geenin transkripti. i
16. 18. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 15,16 tai 17 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että solu on prokaryootti-tai eukaryoottisolu. 1 •ra Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että solu on kasvi- tai eläinsolu. 45 104562
17. 20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1,2,3,4,5,6 tai 7 mukaisen yhdisteen tai patenttivaatimuksen 10 mukaisen siirtäjävektorin käyttö koostumuksen valmistamiseksi tunnettu siitä, että kohde-RNA inaktivoidaan kasveissa. 104562 46