JPH03502638A

JPH03502638A - リボザイム

Info

Publication number: JPH03502638A
Application number: JP1500279A
Authority: JP
Inventors: ハセロフ、ジェイムス・フィリップ; ジャーラック、ウェイン・リール; ジェニングス、フィリップ・アンソニー; キャメロン、フィオナ・ヘレン
Original assignee: Gene Shears Pty Ltd
Current assignee: Gene Shears Pty Ltd
Priority date: 1987-12-15
Filing date: 1988-12-14
Publication date: 1991-06-20
Anticipated expiration: 2015-05-29
Also published as: EP0321201A3; FI104562B; ES2065919T3; NO308610B1; ATE115999T1; HU211891A9; NO902661D0; NO902661L; EP0321201B1; NO20000369D0; RO114469B1; NZ227332A; CN1033838A; DK143390D0; KR900700603A; CA1340831C; DE3852539D1; EP0321201A2; EP0640688A1; EP0321201B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】リボザイムこの発明は、高特異性エンドリボヌクレアーゼ活性を有する一種の合成ＲＮＡ分子およびそれらの誘導体（以後、これらをリボザイムと称す）に関するものである。

幾つかの天然ＲＮ　Ａ分子、例えばアポカード・サンブロツチ・ウィロイド（ＡＳＢＶ）、タバコ・リングスポット・ウィルスのサテライトＲＮＡ（ｓＴｏｂＲＶ）およびルサーンー過性条斑ウィルス（ｓＬＴＳｖ）のサテライトＲＮＡでは、自己触媒による開裂が行なわれる。

的で特有な部分であると思われる。

自己触媒によるＲＮＡ開裂反応は、２価金属イオンおよび中性または高いｐＨに関する共通の必要条件を共有することから、５°ヒドロキシルおよび２°３°環状燐酸基をもつ末端を有するＲＮＡが生成される（プロディ等、「サイエンスＪ２３１：　　１５７７−１５８０（１９８６）およびプザヤン等、パイロロジ− １５１：１８６−１９９（１９８６））。これらの開裂反応は、恐らく反応基を極めて接近させる立体配座の結果としてＲＮＡ自体により触媒される。天然ＲＮＡにおける自己触媒開裂部位は、ＲＮＡ二次構造の高度保存領域内に位置する（ブザヤン等、［プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ」、８３：８８５９−８８６２（１９８６）およびフォースター、Ａ。

Ｃ０およびサイモンズ、Ｒ，Ｈ，ｒセル」、５０：９−１６（１９８７））。

タバコ・リングスポット・ウィルスのサテライトＲＮＡ（ｓＴｏｂＲＶ）に関して我々が行なった実験の結果、新規エンドリボヌクレアーゼ（以後、「リボザイム」と称す）、すなわちＲＮＡ標的分子の特異的開裂を触媒するＲＮＡから成る酵素の設計が行なわれた。

この明細書で使用されているリボザイムという語は、ＲＮＡまたはその誘導体により全体的に構成される分子を指す。

この発明のりボザイムは、テトラヒメナ・テルモフィラにおいて天然で見出され（ＩＶＳまたはＬ−１９１ＶＳ　ＲＮＡとして知られている）、トーマス・チェックおよび共同研究者により充分に記載された（ザウグ、Ａ、Ｊ、等、「サイエンスＪ（１９８４）２２４：５７４−５７８、ザウグ、Ａ、Ｊ、およびチェック、Ｔ、Ｒ，、「サイエンスＪ（１９８６）２３１：４７０−４７５、ザウグ、Ａ、Ｊ、等、「ネイチャーＪ（１９８６）３２４：４２９−４３３、ユニバージティー・パテンツ・インコーホレイテッドによる国際特許出願公開第ＷＯ３８１０４３００号）ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼとは異なる。チェック・エンドリボヌクレアーゼは、遊離グアノシンまたはグアノシン誘導体に対する必要条件を満たす、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイゼーションする（その後、標的ＲＮ　Ａの開裂が行なわれる）８塩基対活性部位を宵する。開裂から生じるフラグメントは、末端５°燐酸および３°ヒドロキシル基を含（：５一般に１２未満のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは標的配列とハイブリダイゼーションしにくいため、ＲＮＡ基質とのハイブリッド形成にｔＩＪ用可能なヌクレオチドの数が限られていることから、チェック・エンドリボヌクレアーゼの有効性または効率も制限さメ−たものである。また、チェック・エンドリボヌクレアーゼの活性部位における若干のヌクレオチドは、有効なエンドリボヌクレアーゼ活性のために保存されることが必要であり得ると思われる。このことから、遺伝子工学技術により標的配列とのハイブリッド形成が行なわれ得る活性部位配列の順列の数が制限されることによって、チェック・エンドリボヌクレアーゼにより開裂され得るＲＮＡ標的配列の範囲も制限される。このチェック・エンドリボヌクレアーゼはまた、開裂したＲＮＡの５゜末端に遊離グアノシン・ヌクレオチドを付加することによりＲＮＡを修飾する。

有効にハイブリダイゼーションし、かつ開裂された標的ＲＮＡを修飾することはない。

この発明のりボザイムは、ヌクレオチド配列が標的ＲＮＡの少なくとも一部分と相補的であるハイブリダイゼーション領域および標的ＲＮ　Ａの開裂に適合した触媒領域を含む。このハイブリダイゼーション領域は９個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。

好ましい態様において、この発明のりボザイムは、１本鎖ＲＮＡにより形成された１つまたはそれ以上のアームを含み、標的ＲＮＡの少なくとも一部分と相補的な配列を有するハイブリダイゼーション領域を有する。前述の１つまたはそれ以上のアームは、前記標的ＲＮＡを開裂させ得る触媒領域と会合している。ハイブリダイゼーション領域がＲＮＡの単一アームを含む場合、前記アームは少なくとも９個のヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーション領域がＲＮＡの２つまたはそれ以上のアームを含む場合、前記アームにおけるヌクレオチドの合計は９ヌクレオチドより大きい。

この発明は、−態様において、式（１）％式％（１）Ｘは任意のりボヌクレオチドを表し、各Ｘ残基は同一または異なり得、。およびｎ゛の合計は６より大きく、ｎおよびｎ゛は同一または異なり得、（★）は相補的リボヌクレオチド間の塩基対を表し、ＸｏおよびＸ”は、オリゴリボヌクレオチド間に塩基対を形成させ得るべくそれらの全長の少なくとも一部分に沿って相補的な配列のオリゴリボヌクレオチドを表すか、またはＸｏおよびＸｏは一緒になって単−ＲＮＡ配列（ただし、この配列の少なくとも一部分は、相補的ヌクレオチド間における塩基対形成により形成されたステムを含む）を形成し、そして所望により、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵのうちの一つから選ばれた追加ヌクレオチドが式（１）におけるＬＡの後に挿入され得る］で示されるリボザイムを提供する。

式（１）の領域（Ｉ）は、標的ＲＮＡ配列の各部分とハイブリッドを形成するりボザイムのアームまたは近接配列を表す。これらのアームは、標的ＲＮＡの全長またはその一部分に沿ってハイブリダイゼ−ジョンし得る。ＲＮＡ触媒領域は、式（１）の領域（ｆｆ）に描かれている。触媒領域は、触媒活性に対して逆に作用することのない１つまたはそれ以上の追加ヌクレオチドを含み得る。それらの追加は、この明細書の教理に従い、過剰な実験を要することなく、リボザイム活性に関して容易に試験され得る。前記触媒領域はまた、ハイブリダイゼーション領域の一部分を形成し得る。

オリゴリボヌクレオチドＸ゛およびＸ“は、５０００以下またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。

この発明は、さらに別の実施態様において、式（２）％式％（）Ｘは任意のりボヌクレオチドを表し、各Ｘ残基は同一または異なり得、（、★）は相捕的リボヌクレオチド間の塩基対を表し、ｎおよびｎｏは前記の意味であり、ｍおよびｍｏは１またはそれ以上であって、同一または異なり得、Ｂは、結合、塩基対、リボヌクレオチドまたは少なくとも２個のりボヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチドを表し、そして所望により、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれか一つから選ばれた追加ヌクレオチドが式（２）におけるＩＡの後に挿入され得る］で示されるリボザイムを提供する。

おいて自体公知の方法により製造され得る。（例えば、アメリカ合衆国ライスコンシン、マディランのプロメガにより推奨されたプロトコルに従う）。特に、この発明のりボザイムは、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター、例えばＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＦ３　　ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに機能し得るように結合された対応するＤＮＡ配列（転写によりリボザイムを生成し、ＤＮＡの合成に関する技術分野において自体公知の方法に従い合成され得るＤＮＡ）から製造され得る。この発明のりボザイムに対応するＤＮＡ配列は、ＤＮＡ転移ベクター、例えばプラスミドまたはバクテリオファージＤＮＡにライゲーションされ得る。転移ベクターが、リボザイムに対応するＤＮＡに機能し得るように結合されたＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む場合、このリボザイムは、ＲＮＡポリメラーゼとのインキュベーションにより好都合に生成され得る。従って、リボザイムは、リボヌクレオチドの存在下、リボザイムに対応するＤＮＡに機能し得るように結合されたＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターとＲＮＡポリメラーゼとのインキュベージクンによりインビトロで製造され得る。インビボの場合、原核生物または真核生物細胞（は乳類および植物細胞を含む）は、リボザイムが宿主細胞において転写されるようにＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターに機能し得るように結合された、この発明によるリボザイムに対応する遺伝物質を含む適当な転移ベクターによりトランスフェクションされ得る。転移ベクターは、細菌性プラスミドまたはウィルス性ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。一般に、リボザイムに対応するヌクレオチド配列は、強力なプロモーター、例えばＩａｃ、５ｖ４０後期、ＳＶ４０初期、メタロチオニンまたはλプロモーターの制御下に置かれる。リボザイムは、転移ベクターからインビボで直接転写され得るか、または別法として、さらに大きなＲＮＡ分子の一部として転写され得る。例えば、リボザイム配列に対応するＤＮＡは、担体遺伝子の３°末端へ、例えば翻訳停止シグナルの後にライゲーションされ得る。さらに大きなＲＮＡ分子は、細胞内におけるヌクレアーゼ消化に対してリボザイム分子を安定させるのを助は得る。

素反応により直接検定され得る。例えば、担体遺伝子は酵素をコードし得る。

この発明は、さらに別の態様において、リボザイムの転写を行わせるべくプロモーターに機能し得るように結合されたりボザイムに対応するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ転移ベクターを提供する。

リボザイムの好ましい一製造方法においては、相捕的配列を有する２種の合成オリゴヌクレオチドを標準的方法により製造しく例えば、アプライド・バイオシステムズ・モデル３８０ＡＤＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ・インコーホレイテッド、フォスター・シティ−、カリフォルニア９４４０４）を使用）、−緒にハイブリダイゼーションする。一方のオリゴヌクレオチドは所望のりボザイムをコードする。ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドの各末端は、異なる制限酵素部位、例えば一端ではＥ　ｃｏＲ■および他端ではＰｓｔｌに対応する。適当な制限酵素（前記の例ではＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌ）による開裂後、２本鎖ＤＮＡフラグメントは転移ベクターにクローン化され得る。プラスミド・ベクターがこの発明のりボザイムに対応するＤＮＡ配列から上流にＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含む場合、リボザイムに対応するＲＮＡ転写物は、インビトロまたはインビボで好都合に製造され得る。リボザイムが、相捕的ヌクレオチド間における塩基対形成により結合された半分ずつの２成分から成る場合、リボザイムの半分を構成する成分は各々上記方法に従い製造され得、前記２成分を一緒にインキュベーションすることによりリボザイムが形成され得る。

この発明の好ましいりボザイムは、配列Ｘ’　ＵＹ（式中、Ｘｏは任意のりボヌクレオチドであり、Ｕはウラシルであり、Ｙはアデニン、シトシンまたはウラシルである）を含む標的ＲＮＡを開裂する。

Ｘ’　Ｕは塩基対近接領域の一部分を形成し、Ｙは塩基対を形成していない。好ましくは、Ｘ″はグアニジンであり、Ｘ０ＵＹはＧＵＣまたはＧＵＡであるが、決してこれらの限定されるわけではない。

これらの配列を含むＲＮＡ分子は全て、この発明のりボザイムにより開裂され得る。一旦配列Ｘ’　ｔＪＹを含むＲＮＡ転写物の配列が決定されると、リボザイム配列のアームは、Ｘ’　ＵＹ配列に近接する標的配列におけるＲＮＡと相捕的、すなわち前記ＲＮＡと、１％イブリダイゼーション可能な形に合成され得る。

Ｘ’　ＵＹ配列に近接する標的ＲＮＡ配列とりボザイムのアームがハイブリダイゼーションすると、リボザイムの触媒領域は、Ｘ’　ＵＹ配列内で標的ＲＮＡを開裂する。ＲＮＡ開裂は、約８．０のｐＨでマグネシウムまたは他の２価カチオンが存在すると容易になる。

従って、この発明の好ましいりボザイムを遺伝子工学技術に付すことにより、配列が既知のＲＮＡを全て開裂することができる。ＲＮＡにおいてリボザイムにより開裂される残基の頻度が高い場合（塩基分布がランダムで頻度が均等であるＲＮＡにおけるＧＵＣの場合１　：６４）とは、可能性がある幾つかのりボザイム開裂部位が、所定の標的ＲＮＡにおいて確信をもって予測され得ることを意味する。

この発明は、別の態様において、標的ＲＮＡ配列とこの発明のりボザイムを反応させることを含む、前記標的ＲＮＡ配列の不活化方法を提供する。

インビボ、すなわち生物の細胞（複数ら可）内において、１種またはそれ以上のりボザイムをコードする転移ベクター、例えば細菌性プラスミドまたはウィルス性ＲＮＡもしくはＤＮＡは、細胞中へトランスフェクションされ得る（例、レウエリン等、「ジャーナル・才ブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（１９８７）１９５：１１５−１２３、ハナハン等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（１９８３）１６６）。一旦細胞の内側に入ると、転移ベクターは複製され、細胞ポリメラーゼにより転写されてリボザイムＲＮＡを生成し、次いで所望の標的ＲＮＡを不活化させ得る。別法として、１つまたはそれ以上のりボザイム配列を含む転移ベクターは、転移ベクターまたはその一部分が宿主細胞のゲノムへ組み込まれるように、顕微操作技術、例えば顕微注射法により細胞中へトランスフェクションまたは細胞中へ導入され得る。組み込まれた遺伝物質の転写によりリボザイムが生成され、それが作用して所望の標的ＲＮＡが不活化される。

この発明のりボザイムは、広範な治療および生物学的適用性を有する。例えば、ヒトおよび動物において病原となるウィルスは、ウィルス感染した対象に、そのウィルスのＲＮＡ転写物とハイブリダイゼーションし、それを開裂させるのに適合したこの発明のりポザイムを投与することにより不活化され得る。それらのりボザイムは、非経口または他の投与手段により送達され得る。別法として、病原性ウィルスに感染した対象に対し、遺伝子工学技術による処理を行うことによってＲＮＡプロモーターに機能し得るように結合されたリボザイムに対応するＤＮＡを組み込ませた非毒性ウィルス、例えばワクシニアまたはアデノウィルスを投与することもあり得る。この方法は、遺伝子工学的処理に付されたウィルスによりトランスフェクションされた宿主動物の細胞においてリボザイムが転写されることによって、病原性ウィルスの標的ＲＮ　Ａ転写物が開裂および／または不活化される形で行なわれる。この発明のりボザイムは、例えばヘルペス・シンプレックスウィルス（ＨＳＶ）またはエイズ・ウィルス（ＨＩＶ）が原因となるウィルス性疾患に特別な適用性を有する。

この発明のりボザイムはまた１、細菌および他の原核生物細胞、植物および動物におけるＲＮＡ転写物の不活化に対して特別な適用性を有する。細菌において、細菌性細胞死を誘発する例えばバクテリオファージのＲＮＡ転写物は、ファージＤＮＡを不活化させるこの発明によるリボザイムを生産し得るＤＮＡ転移ベクターで細胞をトランスフェクションすることにより不活化され得る。別法として、リボザイム自体を細菌細胞に加え、これに取り込ませることにより、ファージＲＮＡの開裂が行なわれ得る。

植物におけるＲＮＡ転写物は、転移ベクター、例えばアグロバクテリウム・ツメファシェンスのＴｉプラスミドによりコードされたりボザイムを用いて不活化され得る。これらのベクターにより植物細胞をトランスフェクションすると、リボザイムがＲＮＡポリメラーゼの作用下で生産され、特定の標的ＲＮＡ配列の開裂を行い得る。

従って、ＲＮＡ配列が既知の植物ウィルスまたは植物遺伝子のＲＮＡ転写物は、リボザイムを用いて不活化され得る。

植物、動物または他の細胞タイプにおける内在性遺伝子転写物は、この発明のりボザイムを用いて不活化され得る。従って、望ましくない表現型または特徴は調節され得る。例えば、この発明のりボザイムを用いることにより、果実から種を除去したり、または心身に有害な蛋白質の生産または特定蛋白質の過剰生産により誘発されるヒトの遺伝性疾患を処置することは可能であり得る。

以下、非限定的実例のみを通して、後記非限定的実施例および図面によりこの発明の説明を行う。

図面中、第１図は、野生型および突然変異型ＲＮ　ＡのＲＮＡ自己開裂部位を示し、電気泳動プロフィールは自己触媒によるＲＮＡ開裂産物を示す。

（ａ）は、ＡＳＢＶ、いもりサテライトＤＮＡ転写物並びに５ＴｏｂＲＶ、ＬＴＳＶ、ベルベット・タバコ斑点ウィルス、ソラヌム・ノディフロルム斑点ウィルスおよび地中性クローバ−斑点ウィルスのサテライトＲＮＡにおける天然ＲＮＡ開裂部位を伴う保存構造の概略を示す。これらの構造間で保存されているヌクレオチド配列が示されており、他の配列はＸとして表されている。塩基対形成を「 ★」により表し、ＲＮＡ開裂部位を矢印で示す。

（ｂ）は、５ＴｏｂＲＶ　ＲＮＡの（十）鎖の開裂と関連のある保存されたヌクレオチド配列を示す。開裂部位を矢印で示す。

（Ｃ）３ヌクレオチド（ＵＧＵ残基７〜９）の近接重複と一緒に８ヌクレオチド（四角で囲んだ部分）の挿入を含む５ＴｏｂＲＶのインビトロ突然変異体を示す。

（ｄ）野生型５ＴｏｂＲＶおよびＤ−５１インビトロ突然変異体のサブクローン化されたＨａｅｌｌｌフラグメントを、各々（＋）および（−）の両方向に転写させ、放射性標識した転写物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画した。野生型（ＷＴ）および突然変異体（Ｄ−５１）配列からの非開裂１５９および１７０塩基転写物の位置を矢印で示す。開裂産物の大きさを示す。

第２図は、リボザイムのヌクレオチド配列およびゲル電気泳動により分離されたりボザイム開裂産物を示す。

（ａ）Ｄ−５１突然変異体（第１ｃ図）において挿入されたヌクレオチドは、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。ＢａｍＨＩを用いて突然変異ＤＮＡを開裂させ、２つの配列をインビトロで別々にサブクローン化および転写した。ＲＮＡ転写物を図で示し、ＲＮＡ間に存在し得る塩基対を「★」で示す。矢印で示した開裂部位を含むフラグメントを５−ＲＮＡと称し、リボザイムを含むフラグメントをＲｚ−ＲＮＡと称す。

（ｂ）［’″Ｐ］−Ｒｚ−ＲＮＡ（１０１塩基）を単独（レーンｌ）および非標識５−ＲＮＡと（レーン２）インキュベーションした。［”Ｐ］−５−ＲＮＡを単独（レーン３）並びに非標識および３１ｐ標識Ｒｚ−ＲＮＡ（各々レーン４および５）とインキュベーションした。

第３図は、この発明の一実施態様によるリボザイムの概略的モデルを示す。領域Ａは標的ＲＮＡ内の開裂配列を表す。領域Ｂは触媒領域を表し、領域Ｃはリボザイムのアームを表す。

第４図は、ＣＡＴ（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子転写物を標的とするりボザイムの設計図を示す。ＲｚＣＡＴ−１，２および３と名付けられたりボザイムは、ＣＡＴ遺伝子の８３５塩基インビトロ転写物内の３つの部位を標的とするものであった。近接する塩基に番号を付して、転写物における開裂部位の相対的位置を図示する（ａ）。３種のりボザイム配列をそれらの標的配列と共に示す（（ｂ）〜（ｄ））。ＣＡＴ遺伝子のアミノ酸配列に番号を付け、予測されるＲＮＡ開裂部位を矢印で示す。ＲｚＣＡＴ−１および３は、（＋）鎖５ＴｏｂＲＶから誘導された２４塩基配列（領域Ｂ。

第３図）を含み、ＲｚＣＡＴ−２は、この領域における単−Ｕ−Ａ変化を含む。

第５図は、リボザイムＲｚＣＡＴ−１〜３によるＣＡＴ　ＲＮＡ開裂の結果を示す。

（ａ）単独（−）または３種のりボザイムＲｚＣＡＴ−１〜３のいずれか１つ（それぞれレーン１，２および３）とのインキュベーション後、Ｃ”Ｐ］−ＣＡＴ　ＲＮＡをゲル分画した。完全長の転写物の位置を矢印で示す。

（ｂ）　５　’末端塩基分析。ＣＡＴ　ｍＲＮＡのりボザイム開裂により生成された３゛フラグメントを、［５°　Ｓ！ｐ］−キナーゼ処理に付し、ゲル精製し、完全なヌクレアーゼ消化に付し、解離された末端残基をｐＨ３、５ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に、より分画した。マーカー（レーンＭ）を基準にして測定された５′末端ヌクレオチドは、ＲｚＣＡＴ−１〜３により生成されたフラグメントにおいてＡＸＵおよびＧであった（それぞれレーン１，２および３）。

第６図は、ＣＡＴ　ＲＮＡに対するリボザイム（ＲＺＣＡＴ−１）触媒活性の時間推移を示す。１３９ヌクレオチド開裂産物の量を定量およびプロットした。挿入図は、−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動後の１３９塩基フラグメントの経時的蓄積状況を示す。

第７図は、異なる温度条件下でのＣＡＴ　ＲＮＡの開裂の相対的割合を示す。基質ＲＮＡを実線で表す。各場合における開裂生成物を破線で表す。

第８図は、様々な長さのアームまたは近接配列を有する３種のりボザイム（ＲｚＣＡＴ−２に対応）を示す。

第９図は、開裂ドメインＲｚＣＡＴ−１〜３の各々を含む触媒性アンチセンスＲＮＡを含むリボザイムの生成に関する概略を示す。

第１０図は、ＣＡＴ　ｍＲＮＡにおいてＧＵＡ（１０ａ）およびＧＵＵ（１０ｂ）モティーフを含む標的配列とハイブリッドを形成しているリボザイムを示す。

第１１図は、柑橘エクソコーティス・ウィロイド（ＣＥＶ）ＲＮＡおよびその補体における自己触媒によるＲＮＡ開裂部位を示す。

第１２図は、標的ＣＥＶ　ＲＮＡとハイブリダイゼーションしたりボザイムＲｚＣＥ　Ｖ　２５　ｘ（＋Ｘａ）、並びにＲｚＣＥＶ２５ｘ（＋）とインキュベーションした（＋）ＣＥＶ　ＲＮＡおよび相補的（−）ＣＥＶ　ＲＮＡのゲル電気泳動プロフィールを示す（ｂ、各々レーン１および２゜開裂産物を矢印で示す）。

第１３図は、標的配列（ａ）とハイブリッドを形成しているリボザイムＲｚＣＡＴ−２およびリボザイムＲｚＳＣＭｏＶ（ｂ）を示す。各リボザイムにおける触媒ドメインを線で囲む。ＲｚＣＡＴ−２と比べた場合のＲｚＳＣＭｏＶの触媒ドメインにおける差異に印を付している。　第１４図は、柑橘エクソコーティス・ウィロイド（ＣＥＶ）ＲＮＡにおいて標的配列とハイブリッドを形成しているリボザイムＲｚＣＥＶ−２を示す。開裂部位は、ＣＥＶ　ＲＮＡ配列におけるヌクレオチド−３３６に対応する。触媒ドメインにおけるヌクレオチド配列を５ＴｏｂＲＶの触媒ドメインと比較した場合の変化を円で囲む（ａ）。第１４ｂ図は、ＲｚＣＥＶ２とのインキュベーション後における、対照［ＣＥＶの（−）鎖コＲＮＡ（レーン７）およびＣＥＶ　ＲＮＡの（＋）鎖（レーン８）の電気泳動プロフィールを示す。

第１５図は、リボザイムＲＺＣ，Ａ　Ｔ　−２Ｃａ）とりボザイムＲｚＣＡＴ〜２　Ｂ　（ｂ）を比較したものを示す。触媒ドメインを線で囲む。また、ＲｚＣＡＴ−２と比較した場合のＲｚＣＡＴ−２Ｂの触媒ドメインにおける変化を線で囲む。

第１６図は、プラスミドＰＪ３５ＳＮの地図を示す。

第１７図は、植物（タバコ原形質体）におけるＣＡＴ発現の明害に関する４実験の平均のグラフを示す。

以下、実施例によりこの発明の説明を行うが、それらはこの発明を制限するものではない。

ＤＮＡに関する反応および操作、例えばライゲーション、制限酵素消化、細菌の形質転換、ＤＮＡ配列決定等は、標準的技術、例えばマニアチス等（モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−１１９８２）により記載された技術に従い実施された。またＲＮＡに関する操作は、標準的技術、例えばウーレンベック（ネイチャー３２８．５９６−６００（１９８７））並びにハセロフおよびゲルラッハ（ネイチャー３３４．５８５−５９１（１９８８））により記載された技術に従い行なわれた。

実施例１突然変異５ＴｏｂＲＶ　ＲＮＡの自己触媒による開裂；第１ａ図に示されている通り、ＡＳＢＶ、いもりサテライトＤＮＡ転写物並びに５ＴｏｂＲＶ、ＬＴＳＶ、ベルベット・タバコ斑点ウィルス（Ｖ　ＭＯＶ　）、ソラヌム・ノディフロルム斑点ウィルス（ＳＮＭＶ）および地中性クローバ−斑点ウィルス（ＳＣＭｏＶ）のサテライトＲＮＡにおいて天然ＲＮＡ開裂部位を伴う領域の一致する部分を調べた。これらの構造間で保存されているヌクレオチド配列が示され、非保存配列はＸとして表されている。特別のＵは、ＬＴＳＶ（＋）ｌｌにおける残基ＩＡの後に位置する。

５ＴｏｂＲＶの（＋）鎖の自己触媒開裂と関係のある領域について試験することにより、この領域内における酵素基質活性を確認した。

まず、オリゴヌクレオチド・リンカ−（ＢａｍＨｌ）挿入プロトコルを用いて、クローン化５ＴｏｂＲＶ　ｃＤＮＡに突然変異を生じさせた。

５ＴｏｂＲＶのインビトロ発現用ベクターの構築：５ＴｏｂＲＶ　ｃＤＮＡの１６０ｂｐ４ａｑｌ−ＳｐｅｌフラグメントをｐＳＰ６５３から分離しくゲルラッハ等、１９８５、パイロロジー上したｌ）ＧＥＭ４にライゲーションすることにより、Ａｃｃ１部位を再形成させた。生成したクローンをＡｃｃｌにより線状にし、ホスファターゼ処理を行い、５ＴｏｂＲＶ　ｃＤＮＡの３５９ｂｌ）　Ｔａｑｌフラグメントを挿入した。生成したクローンを、末端重複残基２７７〜８１を含む環状に変化した５２０ｂｐ　５ＴｏｂＲＶ　ｃＤＮＡ配列（ｐＴＴＳ）の存在についてスクリーニングした。５ＴｏｂＲＶ配列の側面にはＴ７およびＳＦ３　　ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが位置し、インビトロ転写の結果、２つの自己開裂部位を含む（＋）または（−）配向のＲＮＡが生成された。

インビトロ突然変異ニプラスミドｐＴＴＳ（５０μｇ）をＢａｍＨｌにより線状にし、Ｓｌヌクレアーゼで処理し、再ライゲージタンすることにより、特有のＢａｍＨ１部位を除去した。生成した構築物ｐＴＴＳ−Ｂを、３７℃で１０分間２０ミリモルのトリＸ＝ＨＣ１、ｐＨ７，０，１５ミリモルＭｎＣ１を中２　Ｘ　１０−’単位のデオキシリボヌクレアーゼｌにより処理した。生成した線状ＤＮＡを、Ｔ４　　ＤＮＡポリメラーゼの使用により平滑断端化および／または末端補充し、０．７％ＬＧＴアガロースゲル電気泳動および抽出により精製した。キナーゼ処理したＢａｍＨ１リンカ−配列（ＣＧＧＡＴＣＣＧ）を、５％ポリエチレングリコールの存在下室温で一夜線状化されたプラスミドにライゲージジンした。続いて、反応物をＢａｍＨ１消化し、０．７％ＬＧＴアガロＬＧＴアガロースゲル電気泳動により線状プラスミドＤＮＡを再精製した（これは、ライゲーションしていないリンカ −と−緒に最終的痕跡量の環状プラスミドを除去するために必要であることが見出された）。Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドを再び環状にし、エシェリヒア・コリＤＨ−１に形質転換した。コロニー（１０００より大）を寒天プレートから削り取り、液体培地中で飽和状格に生育させ、プラスミドＤＮＡの混合集団を調製した。近接するＥｃｏＲ。

！およびＰｓｔ１部位における制限酵素消化により混合５ＴｏｂＲＶ　ｃＤＮＡ挿入物を切除し、Ｉ％ＬＧＴアガロースゲル電気泳動により４にサブクローニングした。生成した形質転換体を再びプールし、液体培地中で培養し、プラスミドＤＮＡを製造した。プラスミドＤＮＡをＢａｍＨｌで処理することにより、ＢａｍＨｌリンカ−配列を含むプラスミドのみを開裂させ、２ラウンドの０．７％［、ＧＴアガａ−スゲル電気泳動により線状形態を再び精製し、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼにより再び環状にし、エシェリヒア・コリＤＨ−１に形質転換した。個々の形質転換体を、制限酵素消化により５ＴｏｂＲＶ配列内に挿入されたＢａｆｆ１Ｈ１リンカ−のおおよその位置についてスクリーニングし、Ｍ２Ｓ　ｌｌ１ｐ１９にサブクローニングし、ジデオキシヌクレオチド鎖終結技術により配列決定した。

生成されたｓ’ｌ”ｏｂＲＶ突然変異体のライブラリーおよびヌクレオチド配列分析は、各突然変異体が、近接する重複または欠失５ＴｏｂＲＶ配列と一緒にＢａｍＨ１リンカ−配列（ＣＧＧＡＴＣＣＧ）を含むことを示した。これらの突然変異体をインビトロ転写し、ＲＮＡの開裂遂行能力について検定した。これらの実験から、５２−ヌクレむものとして確認された。第１ｂ図に描かれたこの５２ヌクレオチド配列は、他のＲＮＡの自己開裂に要求される保存配列ドメインを含んでいた（第１ａ図）。Ｄ−５１と命名されたー突然変異体は、７〜９と番号付けされた３つの重複５ＴｏｂＲＶヌクレオチドＩＪＪこ挿入された８ヌクレオチドＢａｍＨＩリンカー配列を含んでいた。この突然変異体では自己触媒によるＲＮＡ開裂が行なわれた。

野生型およびＤ−５１ＲＮＡの５２−ヌクレオチド開裂配列（第１ｂおよびｌｃ図に示されている）を含む９７および１０８塩基対Ｈａｅ１１１フラグメントを、配列決定されたプラスミド、・クローンから取り出した。これらのフラグメントをｐＧＥＭ４のＳｍａ１部位にライゲーションし、スクリーニングした結果、両配向の挿入物が得られた。ＥＣ０ＲＩを用いてプラスミドを線状化し、５０ミリモルのトリス−ＨＣＬｐＨ７，５，１０ミリモルＮａＣ１，６ミリモルＭｇＣｌ、、２ミリモルのスペルミジン、１０００単位／ｌｌｌＩ２リボヌクレアシン、５００マイクロモルのＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰおよび２００マラーゼを用いることにより、長さ１５９および１７０塩基の（＋）および（−）鎖ＲＮＡを転写した。１０％ポリアクリルアミド、７モル尿素、２５％ホルムアミド・ゲルにおける電気泳動によりＲＮＡを分画し、オートラジオグラフィーに付した。

第１ｄ図に示されている通り、（−）鎖ＲＮＡ転写物の開裂は歓楽されなかった。（−）鎖は自己触媒による開裂部位を含まないため、これは予想通りのことであった。開裂は野生型およびＤ−５１の両配列の（＋）鎖により行なわれ、Ｄ− ５１ＲＮＡの開裂は野生型の場合よりも幾分効率が劣っていた（第１ｄ図）。この実験は、ＲＮＡの自己触媒開裂に関与する５２−ヌクレオチド配列の右側の１本鎖ループ領域が本質的なものではないことを示す。

酵素および基質活性の分離：Ｄ−５１に挿入されたＢａｍＨ１制限エンドヌクレアーゼ部位を用いて、近接するＨａｅｌｌｌ　−ＢａｍＨ１およびＢａｍＨ１−Ｈａｅｌｌｌフラグメントを得、インビトロ転写に適したエシェリヒア・コリ・プラスミドに各々をサブクローニングした。これによって自己開裂領域から突然変異１本鎖ループが排除され、この領域は２つのＲＮＡ断片に分離される（第２ａ図）。小さい方のＨａｅｌｌｌ−ＢａｍＨ１フラグメントは、実際の開裂部位を含めてヌクレオチド３２１〜９を含んでおり、Ｓフラグメントと名付けられた。５ＴｏｂＲＶヌクレオチド７〜４８を含むＢａｍＨ１−ＨａｅｌｌｌフラグメントをリボザイムまたはＲｚフラグメントと名付けられた。インビトロ転写に使用されるエシェリヒア・コリ・プラスミドは、ｐＧＥＭ３およびＩ）ＧＥＭ４であった（プロメガ、マディラン、ライスコンシン、アメリカ合衆国）。これらの発現プラスミドは、（ａ）複製開始点、（ｂ）選択可能な薬剤耐性（Ａｎｐｒ）遺伝子、（Ｃ）転写物のインビトロ生成に使用され得るＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターが近接する多重クローニング部位を含む。

上記と同じ条件下でＳＦ３　　ＲＮＡポリメラーゼを用いて、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ処理した、Ｋｐｎｌ消化Ｒｚ−ｐＧＥＭ３およびＸｂａｌ消化Ｓ−ｐＧＥＭ４を転写させた。

第２図に示されている通り、高い効率での自己開裂に適した条件下（５０℃、２０ミリモルＭｇＣ１，，ｐＨ８，０）単独でインキュベーションした場合（第２ｂ図、レーン！および３）、ＳおよびＲｚ−ＲＮＡは両方とも顕著な分解は示さなかった。標識Ｒｚ−ＲＮＡはまた、５−ＲＮＡとのインキュベーション後ら不変であると思われた（第２ｂ図、レーン２および５）。しかしながら、５−ＲＮＡをＲｚ−ＲＮＡと混合した場合、２つのフラグメントを生ずる５−ＲＮＡの有効な開裂が行なわれた（第２ｂ図、レーン４および５）。生成物のサイズは、ヌクレオチド＃３５９および＃１間の通常部位における５−ＲＮＡ（８４塩基）の開裂と一致しており、各々６７および１７ヌクレオチドから絞る５″および３° 近接フラグメントが得られた。これは、５−ＲＮＡが、触媒的に作用するＲｚ− ＲＮＡによるリボヌクレオチド分解的開裂の基質として作用したことを示す。

５ＴｏｂＲＶ　ＲＮＡの触媒ドメイ、ンに基づくりボザイムのモデルを第３図に示す。このリボザイムは、Ｃで示された１本鎖ＲＮＡの２つのアームまたは近接配列を有し、基質ＲＮＡ、すなわち開裂されるべきＲＮＡにおける相補的配列とハイブリダイゼーションする。

Ｃで示された各近接配列は、８リボヌクレオチドを含む。領域Ｃに含まれるヌクレオチドの数は厳密ではない。しかしながら、リボザイムを標的ＲＮＡどハイブリダイゼーションさせるためには、充分な数のヌクレオチドが存在しなければならない。各領域Ｃにおいてハイブリダイゼーションに必要とされるヌクレオチドの数は、最低４であると思われる。

触媒ドメインＢは、天然開裂ドメインに高い率で保存されている配列を含む（第１ａ図参照）。既知配列の開裂ドメインとの比較結果によると、その一端において会合したループの存在と同様、塩基対ステム■の長さは重要ではない。

標的ＲＮＡ内の開裂部位は、Ａにおいて（第３図）ＧＵＣとして描かれている。

天然ＲＮＡの開裂部位に関する我々の実験（示さず）および小泉による他の実験（ＦＥＢＳレターズ２８８．２２８−２３９８８））に基づくと、配列ＧＵＡＳＧＵＣ，ＣＵＣ，ＡＵＣおよびＵＵＣはまた、ＲＮＡ内で開裂部位として作用する。

実施例２新規高特異性エンドリボヌクレアーゼ活性を有するリボザイムの遺伝子の転写物を標的とする３種のりボザイム、Ｔｎ９クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を設計した。これらは、細菌、植物および動物において抗生物質耐性を提供し得、容易に検定され得る。ＲｚＣＡＴ−１〜３と名付けられたこれらのりボザイムは、各々１３９−１４０位、４９４−４９５位および６６２−６６３位のＣＡＴ　ＲＮＡにおける可能なＣＵＣ閑裂部位に対応する。

これらのりボザイムの配列を第４図に示す。各場合とも、標的ＣＡＴ　ＲＮＡとハイブリッドを形成するりボザイムの近接配列は長さ８のヌクレオチドであった。触媒ドメインは、第３図に示された５ＴｏｂＲＶ　ＲＮＡの場合と一致するように選ばれた。

ＣＡＴ遺伝子をｐＣＭ４から得、ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＧＥＭ３２（プロメガ、マディラン、ライスコンシン、アメリカ合衆国）にサブクローニングした。このプラスミドをＨｉｎｄｌｌｌにより線状化し、２２０マイクロモルの［α−”Ｐ］ＵＴＰと共にＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼを用いてＣＡＴ遺伝子転写物を得た。各々オリゴデオキシヌクレオチドＲｚＣＡＴ−１，２および３としてリボザイム配列を合成した。それらをキナーゼ処理し、ホスファターゼ処理したＥｃｏＲｌ−ＰｓｔＩ切断ｐＧＥＭ４とライゲーションし、細菌の形質転換前にＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウ・フラグメントとインキュベーションした。

ＥｃｏＲＩ線状化プラスミドをＴ７　ＲＮＡポリメラーゼで転写することにより、リボザイムＲＮＡが生成された。

５０℃で６０分間５０ミリモルのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ８，０，２０ミリモルＭｇ０１を中でリボザイムをＣＡＴ転写物とインキュベーションし、オートラジオグラフィーを行う前に、５％ポリアクリルアミド、７モル尿素、２５％ホルムアミド・ゲル電気泳動により生成物を分画した。

３種のりボザイムのいずれか１つと８４０ヌクレオチドＣＡＴ転写物をインキュベーションすると、有効で高い配列特異的開裂が行なわれ（第５図）、各反応において２つのＲＮＡフラグメントが生成した。フラグメントの大きさは、予測され１こ開裂部位と一致していた（すなわち、１３９および６９６．４９４および３４１，６６２および１７３塩基フラグメントは、各々ＲｚＣＡＴ−１〜３触媒開裂による５°および３゛生成物であった）。これらのりボザイム触媒開裂に必要とされる条件は、天然開裂反応の場合に観察されるもの（フォスター、Ａ、Ｃ，およびサイモンズ、Ｒ，Ｈ，、「セルＪ４９：２１１−２２０（１９８７）およびフォスター、Ａ、Ｃ，およびサイモンズ、Ｒ，Ｈ，、［セルＪ５０：９−１６（１９８７））と類似しており、高いｐＨ値、温度および２価カチオン濃度ではさらに有効な開裂が行なわれた（データは示さず）。モル過剰で存在する場合、３種のりボザイムは、５０ミリモルのトリスＨＣＩ、、ｐＨ８，０，２０ミリモルＭｇＣ１、中５０℃で６０分後ＣＡＴ　ＲＮＡ基質の殆ど完全な開裂を触媒した。０．１マイクロモルの基質および３マイクロモルのリボザイムによる類似条件下、ＣＡＴ　ｍＲＮＡ基質のＴ、八は、各々Ｒ２ＣＡＴ−１〜３の存在下において３．５．３．５および２．５分であつｆ二。

リボザイム配列は、基質ＲＮＡの補体（すなわち（＋）鎖）に対してオリゴデオキシリボヌクレオチドの形態では不活性であった（データは示さず）。各リボザイム触媒反応による３°末端開裂フラグメントを単離し、５゛末端開裂フラグメントを３！Ｐ−キナーゼ処理（３０分間３７℃で５０ミリモルのトリスＨＣＩ、Ｉ）Ｈ９，１０ミリモルＭｇＣ１，，５０μ　Ｃｉγ−３″Ｐ　ＡＴＰ含有ｌＯミリモルＤＴＴおよび５単位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）した。フラグメントの有効なキナーゼ処理の結果、それらは天然開裂反応において生成されるものと同様に５゛末端ヒドロキシ基を有することが示された。

ＲｚＣＡＴ−１〜３によるＣＡＴ配列の開裂により生成されたフラグメントの末端ヌクレオチドを測定した。簡単に述べると、放射能標識したフラグメントを５％ポリアクリルアミドゲルにおいて精製し、３７℃で１２０分間５０ミリモルの酢酸アンモニウム、ｐＨ４，５中、等容量の５００単位／ｚ（ｉリボヌクレアーゼＴ１．２５単位／１．ＱリボヌクレアーゼＴ２および０．１２５ｘｖ／ｘ（ｌリボヌクレアーゼＡにより消化した。２５ミリモルくえん酸ナトリウム、ｐＨ３゜５および７モル尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて生成物を分画した。第５ｂ図は、ＲｚＣＡＴ−１〜３によるＣＡＴ配列の開裂が各々ヌクレオチドＡＳＵおよびＧの前で正確に行なわれることを示す。

塩基特異的部分リボヌクレオチド分解的開裂を用いた部分酵素消化技術（ドニスーケラー等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ４：２５２７−２５３８（１９８０））の使用により、ＣＡＴ遺伝子フラグメントの末端配列を直接測定した。

フラグメントの配列は、開裂がＣＡＴ　ＲＮＡ内の予測された位置（示さず）で行なわれることを確認するものであった。

酵素的触媒：リボザイムが触媒的方法でＣＡＴ　ｍＲＮＡ基質の開裂を誘発することを立証するため、有効な開裂および生成物解離の両方に有利となるべき条件下、各々をモル過剰の基質とインキュベーションした。

第６図は、２０ミリモルＭｇＣ１ｔ中ｐ）（８、０，５０℃で７５分後、ｌＯピコモルのＲｚＣＡＴ−１の触媒作用による１６３ピコモルの先端を切ったＣＡＴ　ｍＲＮＡ（１７３塩基）基質の特異的開裂によって、各々１３９および３４塩基の５°および３゛フラグメントが得られた場合の実験結果を示す。平均的に、各リボザイムは１０を越える開裂事象に関与した。５０°Ｃで７５分後、極端な条件故にある程度のＲＮＡの非特異的開裂は認められたが、残りの無傷ＲＮＡ（１６３ピコモル）の７０％は１３９塩基フラグメントとして蓄積した。

ＲｚＣＡＴ−２および３の場合も似ｆ二結果が得られることから（データは示さず）、各々ＲＮＡ酵素としての作用を示す。

実施例３リボザイム活性に対する温度の影響：リポザイム活性のインビトロ速度に対する反応温度の影響を調べた。

３７℃および５０℃でのＣＡＴ　ＲＮＡ基質に対するリボザイムＲｚＣＡＴ−１〜３の反応の時間推移を試験しｒ：にの実験では、実施例２記載のりボザイム開裂に関する反応条件を用いて、各リボザイムの反応を２回ずつ繰り返した。一方の反応は３７℃で、他方は５０℃でインキュベーションした。９０分までの時点で試料を採取し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により反応の程度を分析した。第７図は、３７℃および５０℃でのりボザイムＲｚＣＡＴ−１〜３の各々に関する反応の時間推移を示す。

各リボザイムの反応速度は、反応温度の上昇に伴って増加した。

ＣＡＴ　ＲＮＡの５０％（ｔ＋／ｚ）開裂の所要時間を第１表に示す。

第１表ＲｚＣＡＴ−Ｉ　　　ＲｚＣＡＴ−２ＲｚＣＡＴ−３５０℃　　３．５　　　　　　３．５　　　　　　２．５３７℃　５５．０　　　　　７０．０　　　　　６５．０第１表に示す通り、３７℃でのりボザイムの反応速度は、５０℃での反応速度よりも約２０倍遅い。

実施例４リボザイム触媒活性７二対するりボザイムの様々なアーム（または近接配列）の長さの影響：リボザイムのアームまたは近接配列（式（１）の領域（１））により、リボザイムが標的ＲＮＡとハイブリッドを形成した後、ＲＮＡの開裂が行なわれる。この実験では、標的配列に対するリボザイム・アームの相補性およびそれに伴う塩基対形成の長さの度合を変えることにより、標的配列の開裂速度に対する影響を調べた。

各アームで標的配列ＲｚＣＡＴ−２７こ対して４．８および】２の塩基相補性を有するリボザイムを製造した（第８ａ図）。実施例２の方法に従いリボザイムを製造した。前記と同様に、リボザイムＲＮＡをＣＡＴ　ＲＮＡとインキュベーションすることにより、リボザイム活性を測定し几。

各アームにおいて４塩基相補性を有するリボザイムは、基質ＲＮＡを開裂しなかった。各アームにおいて８塩基相補性を有するリポザイムはＣＡＴ基質を開裂し、１２塩基相浦性を有するリボザイムも同様であった。インビトロ反応速度から判断すると、１２塩基相補性を有するリボザイムは、それより塩基相補性の数が少ないリボザイムよりも有効に標的ＲＮＡを開裂した。４より大きい塩基相補性を有することは必要と思われるが、リボザイムのハイブリッド形成領域の長さを増すと、それらの反応速度も増加する。

第２実験では、（ａ）　ＣＡ　Ｔ転写物標的ＲＮＡの全長に対する相補性および（ｂ）多重触媒ドメインを有するリボザイムの反応効率を調べた。

ＣＡＴ　ＲＮＡ配列における４つのＧＵＣ標的部位を選んだ。これらの部位に対するリボザイム触媒ドメインを、ＣＡＴ転写物の完全アンチセンス（＝）配列に「挿入」し、触媒活性を試験した。

選ばれた４つの部位は、前述のＲｚＣＡＴ−１〜３により具体的に示された３部位および下記の通り示され得るさらに別の部位であった。

新規ＣＡＴ部位＃１９２Ｈｉｓ　　　Ｈｉｓ　　　Ａｌａ　　　Ｖａｌ　　　Ｃｙｓ　　　Ａｓｐ　　　Ｇｌｙ５°　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ＣＡＵ　　ＣＡＵ　　ＧＣＣＧＵＣＵＧＵ　　ＧＡＵ　　ＧＧＣ［式中、ｒｌ　９２Ｊは、ＣＡＴポリペプチドにおけるアミノ酸１９２を示し、　　は開裂部位を示す］リボザイム触媒ドメインを含み、これらの開裂部位の各々をスパンニングするオリゴデオキシリボヌクレオチドをＭ１３突然変異誘発実験に使用することにより、ＣＡＴ配列の完全な補体を含み、かつ４つのりボザイム触媒ドメインがその中に挿入されている配列を製造した。リボザイム挿入体を含むオリゴヌクレオチドを、ウラシルを含む１本鎖Ｍ１３ＤＮＡに結合し、次いで前記挿入体を含む相補的ＤＮＡを合成することにより、Ｍ１３突然変異誘発を遂行した。適当なエシェリヒア・コリ株でクローニング後、相補的ＤＮＡを回収した（Ｔ、Ａ、クンケル、１９８５、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイＪ８２：４８８−４９２）。生成した２本練ｃＤＮＡをインビトロ発現ベクターでクローン化することにより、Ｔ７ポリメラーゼ転写システムを用いてリボザイムＲＮＡを製造した。

グリオキサル処理により核酸を変性させた後、リボザイムＲＮＡをＣＡＴ転写物とインキュベージジンし、次いで反応混合物のゲル電気泳動によりリボザイム活性を測定した。

自己分解的開裂は、ＣＡＴ転写物上の予想される全ての部位において行なわれた。従って、アーム又はリボザイムの近接配列は、開裂されるＲＮＡ転写物の全長に沿って伸び得る。

第９図は、４つのりボザイムの各々を含む触媒性アンチセンスＲＮＡの製法を図示したものである。触媒性アンチセンスＲＮＡは、約９００の塩基を含む。

上記反応条件下、リボザイムおよび標的配列は、恐らくは広範な塩基対形成により高分子量複合体を形成する。強力な変性処理、例えばグリオキサル処理は、電気泳動中における反応生成物の溶解に必要である。

実施例５リボザイム開裂の標的配列：ｍＲＮＡにおけるＧＵＡモチーフを試験することにより、リボザイムがこの配列でのＲＮＡ開裂に作用するか否かを調べた。

ＧＵＡモチーフ（第１０ｂ図）を含むＣＡＴ　ｍＲＮＡの特定部位を選択し、適当なりボザイム配列を製造し、活性について試験した。

リボザイムは８リボヌクレオチドのアームを含んでいた。

実施例２に従って、第１Ｏ図のりボザイムに対応する合成オリゴヌクレオチドを製造し、２重鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをエシェリヒア・コリにおいてインビトロ発現ベクター（＋）ＧＥＭ４、上記参照）にクローン化することにより、Ｔ７ポリメラーゼ転写システムを用いてリボザイムＲＮＡを製造した。リボザイムＲＮＡとＣＡＴ　ｍＲＮＡをインキュリリボザイム活性を測定した。

リボザイムは、ＧＵＡ標的部位での開裂に影響を与えた（図示せず）。従って、ＲＮＡにおけるモチーフＧＵＡは、この発明のりボザイムの基質である。ルサーン（アルファルファ）一過性条斑ウィルスのサテライトＲＮＡにおける天然開裂部位はＧＵＡ部位の認識を必要とするため、これはある程度予想されることであった。

同様に、適当なりボザイムによりＣＡＴ　ＲＮＡ標的配列におけるＧＵＵモチーフを試験した結果（第１０ｂ図参照）、開裂が行なわれた。

実施例６ウィルスＲＮＡのリボザイム開裂：この発明のりボザイムを用いて、柑橘エクソコーティス・ウィロイドＲＮＡ０形でウィロイドＲＮＡを開裂した。

柑橘エクソコーティス・ウィロイド（ＣＥＶ）ＲＮＡにおいて、２つのＧＵＣ標的部位を選んだ。また相補鎖配列において１部位を選んだ。これらの部位全てに対してリボザイムを製造し、活性について試験した。これらのりボザイムをＣＥＶ９Ｘ（＋）、ＣＥＶ９Ｘ（−）およびＣＥＶ　２５Ｘ（＋）と名付けた。第１１図は、これらのりボザイムの各々に関するＣＥＶ　ＲＮＡにおける３つの開裂部位を示す。

前記方法に従いリボザイムを製造した。リボザイムＲｚＣＥＶ２５ｘ（＋）を第１２図に示す。このリボザイムは、ＣＥＶ　ＲＮＡのヌクレオチド１１６においてＧＵＣモチーフを開裂する。

第１２ｂ図は、リボザイムＲｚＣＥＶ９ｘ（＋）によるＣＥＶ　ＲＮＡの開裂を示す。リボザイムＲＺＣＥＶ９Ｘ（−）の場合開裂は観察されない。

この実験は、リボザイムが様々な供給源から得られた標的ＲＮＡ配列に対して活性を有することを示す。動物、植物または微生物といった供給源とは関係無く、ＲＮＡは全て、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルの塩基性リボヌクレオチド・ビルディングブロックから形成されるため、これは予想されることである。

地中性クローバ−斑点ウィルス（ＳＣＭｏＶ）のサテライトＲＮＡから得た触媒ドメイン配列を用いて、ＣＡＴ−２部位を標的とするりボザイムを製造した。す゛ボザイム・アーム近接配列の１２塩基相補性をリボザイムＲｚＳＣＭｏＶの設計に組み入れた。リボザイムＲｚＣＡＴ−２およびＲｚＳＣＭｏＶをそれぞれ第１３ａ図および第１３ｂ図に示すａ　Ｒｚ　Ｓ　ＣＭ　ｏ　Ｖのループ領域は、配列ＡＡＡＵＣを有する５ヌクレオチドを含む。これは、配列ＡＧＡＧを有する４ヌクレオチドを含むＲｚＣＡＴ−２のループ領域とは対照的である。さらに、ＲｚＳＣＭｏＶは、ＲｚＣＡＴ−２におけるＵ★の代わりに触媒ドメインにＣを含む。ＲｚＣＡＴ−２と比較した場合、ＲｚＳＣＭ。

Ｖにおける配列は著しい差異を示す。

実施例２に従いＲｚＳＣＭｏＶを製造した。ＲｚＳＣＭｏＶは活性を示し、予想通り２つの開裂産物を生じた。

別の実験では、第１４ａ図に示された配列を有するリボザイム（Ｒ３６における柑橘エクソコーティス・ウィロイド（ＣＥＶ）標的部位を開裂させた。第１４１ｉＵでｒＬＪという文字で示されたループ領域は、配列３°−ＣＣＴＡＴＡ−５ ’を有する６ヌクレオチドを含む。これは、配列３°−ＡＧＡＧ−５°を有する４ヌクレオチドを含む５ＴｏｂＲＶのループ領域とは異なる。このリボザイムは、第１４ｂ図の電気泳動プロフィールで示されている通り一３３６位の標的ＣＥＶ相補的ＲＮＡを開裂する。

この実験は、ヌクレオチドの数およびループ領域のヌクレオチド配列がリボザイム活性において重要ではないことを示す。この実験では、この明細書において前述した方法に従ってリボザイムを製造した。

別の実験では、リボザイム活性に対する触媒ドメイン（ステム領域）における塩基対形成の影響を調べた。

ＲｚＣＡＴ−２に対応するが、余分に４塩基対を含む修飾されたりボザイムを製造および試験した。第１５ａ図は、リボザイムＲｚＣている状態を示す。第１５ｂ図は、線で囲んだ追加塩基対を有する試験リボザイムを示す。試験リボザイムはＲｚＣＡＴ−２と同等の活性を有していた。これは、触媒活性に影響を与えること無く、リボザイム触媒ドメインの塩基対形成領域が様々な長さを有し得ることを示す。

我々は、トランスジェニック植物において発現された５ＴｏｂＲＶＲＮＡ転写物の安定したインビボ形態が、恐らくは５′および３゛末端のライゲーションの結果、主として環状を呈することを観察した（データは示さず）。従って、インビボＲＮＡ転写物において興味の対象である配列に近接する２つの自己分解的開裂部位を用いることにより、線状転写物よりも高い安定性を示し得る環状化生酸物が生成されると思われる。この方法は、リボザイム配列の新規インビボ安定化方法を提供すると思われる。これを環状化と呼ぶ。

実施例８リボザイムのインビボ活性：この実施例では、植物細胞におけるリボザイムのインビボ活性を抗−〇　Ａ　Ｔ　（ＣＡ　Ｔ　＝クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ）または抗−〇ＡＴ／リボザイム遺伝子の組み合わせ構築物（下記参照）を含むプラスミドを、機能的ＣＡＴ遺伝子構築物を含む別のプラスミドと一緒に、互いに同じ量および相対比率でりパコ・プロトプラストへ導入した。ＣＡＴ活性を測定し、遺伝子活性の基本レベルと比較した。

原材料および方法：（ａ）エレクトロポレーションおよびＣＡＴ検定。

レウエリン等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（１９８７）ｌ　９５：１１５−１２３における記載に従い、これらを実施した。簡単に述べると、ニコチアナ・プルムバギニフオリア・ラインＴ５のプロトプラストを、１０ミリモルＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，２，１５０ミリモルＮａＣｌ、０．２モルのマンニトールに懸濁し、３　Ｘ　Ｉ　Ｏ”／ｘｉ！の密度に調節した継代培養２日後の＠濁液から調製した。２５０Ｖで単一５０ｍ５パルスを用いてエレクトロポレーションを行った。プロトプラストを１０倍に希釈し、暗闇中２６℃で２０時間培養した。それらを音波処理により崩壊させ、抽出物を得た。

抽出物を蛋白質含有員に関して正規化し、１４ｃｍクロラムフェニコールおよびアセチルＣｏＡを用いてインビトロＣＡＴ活性について検定した。反応生成物を薄層クロマトグラフィーにより分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。１４Ｃ−クロラムフェニコール鋳型からの放射性生成物誘導体の生成により、反応の程度を計算した。

（ｂ）遺伝子構築物。

抽出および２サイクルのＣｓＣ１平衡密度勾配遠心分離により細菌から精製したプラスミドＤＮＡとして、遺伝子構築物を０　、１　ｘＱプロトプラスト懸濁液に導入した。それらを１０ミリモルのトリス／ｌミリモルＥＤＴＡ／ｐＨ＝７．５に再懸濁して用いた。

活性ＣＡＴ遺伝子構築物をｐＣＡＴ７〒と名付けたプラスミドに組み入れた。それは、プラスミドｐＪ　３５ＳＮ（ｐ３５ＳＮから誘導、Ｗ、Ｌ、ゲルラッハ等、１９８７、［ネイチャーＪ３２８：８０２−８０５）へのＣＡＴ遺伝子配列（プラスミドＩ）ＣＭ４から、Ｔ、Ｊ、クローズおよびＲ，ロドリゲス、１９８２、［ジーンＪ２０：３０５−３１６参照）の融合により誘導されたものであり、その結果、活性遺伝子構築物は次の通りとなった。

（ただし、３５Ｓは３５Ｓ　　ＣａＭＶ（カリフラワー・モザイクウィルス）プロモーターを指し、ＮＯＳはツバリン・シンセターゼ・ポリアデニル化シグナルを指し、Ｔ／Ｃは転写を指す）。

０．２μ９のｐＣＡＴ７＋と一緒に、下記の様々な遺伝子構築物を過剰量で追加した。遺伝子構築物は下記名称のプラスミドに組み入れられた。

ｐＪ３５ＳＮ−このベクター・プラスミド（この地図は第１６図に示す）は、３５ＳＣａＭＶプロモーターおよび植物ツバリン・シンセターゼ・、３°ポリアデニル化シグナルを含ｐＣＡＴ７−−これは、転写の結果、アンチセンスＣＡＴ　ＲＮＡが生成されるようにｐＪ３５ＳＮに挿入されたＣＡＴ遺伝子配列を含み、次の通りに描かれ得る。

ｐＣＡＴ１９−−これは、転写の結果、４つの触媒リボザイム領域を含むアンチセンスＣＡＴ　ＲＮＡが生成されるようにｐＪ３５ＳＮへ挿入された、４つの触媒リボザイム領域（実施例４および第９図参照）が中に含まれているＣＡＴ遺伝子を含み、次の通りに描かれ得る。

触媒ドメイン挿入体結果。

下表は、エレクトロポレーションの２０時間後の細胞における相対ＣＡＴ活性を示す。１時間検定におけるクロラムフェニコール基質の変換パーセントとして活性を表す。

エレクトロポレーションしたプラスミドμ９処理　　ｐＣＡＴ７　＋　　　ｐＪ３５ＳＮ　　　ｐＣＡＴ７−　　　ｐｃＡＴ１９−　変換％５Ｂ　　　０．２　　　　　　　　　　　　　　　　９　　　２２６Ａ　　　　０．２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８　　　　１４６Ｂ　　　　０．２　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８　　　　１６（各処理についてｒＡＪおよびｒＢＪは複製物である）これらの結果から次の結論が得られる。

（ａ）　ＣＡ　Ｔ遺伝子構築物導入の結果、顕著なＣＡＴ活性が得られる一２Ａ、ＢをＩＡ、Ｂと比較せよ。複製駒間には可変性が存在する。他の試料（下記ｒｂＪおよびｒｃＪ参照）において見られる傾向から、２Ａは異常に低い活性を示すと思われる。

（ｂ）アンチセンス遺伝子構築物の同時導入の結果、活性のレベルが減少する一３Ａ、Ｂおよび４ＡＳＢを２Ｂと比較せよ。減少の程度は、プラスミドとして加えられたアンチセンス遺伝子のレベルと直接的関連性を示す一３Ａ、Ｂおよび４Ａ、Ｂを比較せよ。

（Ｃ）アンチセンス／リボザイム遺伝子の組み合わせ構築物の同時導入の結果、遺伝子活性は減少する一５Ａ、Ｂおよび６Ａ、Ｂを２Ｂと比較せよ。さらに、この減少は、アンチセンス遺伝子構築物の対応するレベルの場合よりも著しい一５ＡＳＢを３Ａ、Ｂと、お上び６Ａ、Ｂを４Ａ、Ｂと比較せよ。

４つのインビボ実験に関する平均的結果を第１７図に示す。この図において、「対照Ｊは処理２を表す。「アンチセンス」は処理４を表す。「触媒」は処理６を表し、「基底値」は処理１を表す。

触媒性リボザイムは、アンチセンス・リボザイムの場合の平均３４％と比べ、平均４７％の割合でＣＡＴ活性を阻害する。

植物細胞へのりボザイム担持遺伝子の導入により、それらが標的とする遺伝子の活性は阻害される。さらに、阻害率は、対応するアンチセンスＲＮＡ分子の場合より、も大きい。

これらの結果は、リボザイムが、一連の標的ＲＮＡ分子に対し動物、植物または微生物細胞において活性を呈することを示す。

この実施例におけるリボザイムの作用の機構は不明瞭である。例えば、アンチセンス・リボザイムは、標的ＲＮＡと不可逆的にハイブリダイゼーションし、標的ＲＮＡに沿った１つまたはそれ以上の選択された標的部位におけるホスホジエステル結合の開裂を触媒し得る。別法として、細胞性酵素は、標的ＲＮ　Ａが２つまたはそれ以上のフラグメントに開裂されるように、アンチセンスＲＮＡをその標的配列から巻き戻し得る。

実施例９動物細胞におけるリポザイムのインビボ活性：この実施例では、は乳類細胞におけるリボザイムの標的ＲＮＡ不活化活性を立証する。

原材料および方法：リボザイムをコードする活性遺伝子構築物を、エレクトロポレーションにより広く利用可能なサル腎臓セルラインＣＯＳ　１へトランスフェクションした。この方法では、ＩＯ％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有緩衝食塩水に懸濁した３　Ｘ　Ｉ　Ｑ　”／ｘ（ｌのＣＯＳ　ｆ！ｉｔ胞を、様々な遺伝子構造物と接触させ、放電を適用することにより、細胞へのＤＮＡのエレクトロポレーションを行った。ＣＡＴおよびルシフェラーゼ活性の検定前に、トランスフェクションされた細胞を培養培地中３７℃で４８時間インキニベーションした。

ＣＡＴ遺伝子構造物をｐＴＫ　ＣＡＴと名付けられたプラスミド（ミクシチェク等、「セルＪ４６：２８３−２９０．１９８６）に組み入れた。このプラスミドは、単純性はう疹ウィルスのチミジン・キナーゼ・プロモーターの制御下で行なわれる形で、プラスミドＩ）ＳＶ２にＣＡＴ遺伝子配列を導入することにより誘導された。

リボザイムをコードする遺伝子構造物を、ＳＶ４０初期プロモーターと融合されたルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドＩ）ＳＶ２３２Ａ（デ・ウェット等、［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジーＪ７：７２５−７３７．１９８７）に組み入れた。マニアチス等の標準的方法（モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−１１９８２）に従い、リボザイムをコードするＤＮＡを、ルシフェラーゼ遺伝子の３゛末端のＸｂａＩ部位にライゲーションした。

マニアチス等の標準的技術（前出）を用いて、次の構造物を製造した。

ｐＦＣ５８−このプロモーター・ベクターは、非機能的配向でルシフェラーゼ遺伝子の３゛末端に融合され１ニリボザイムＲｚＣＡＴ−１をコードするＤＮＡを含む。

これは次のように描かれ得る。

（式中、２３２ＡはｐＳＶ２３２Ａ配列を示し、ＳＶ４０初期はＳＶ４０の初期プロモーターを示し、小ＴはＳＶ４０の小Ｔ介在配列をコードするＤＮＡを指す。この構造物は、結果的にルシフェラーゼおよびリボザイムＲｚＣＡＴ−１をコードするＲＮＡ分子を生威し、後者の場合触媒性であるとは予想されないような配向を呈する。

ｐＦＣ４−このプラスミドは、ＲｚＣＡＴ−１をＲｚＣＡＴ−３と置き換えた点以外、ｐＦＣ５８と同じである。

ｐＰ　Ｃ１−６−このプラスミドは、ＲｚＣＡＴ−１をセンス配向（５゛−３° ）でＲｚＣＡＴ−３と置き換えた点以外、ｐＦＣ５８と同じである。

１）Ｆｅ２０−このプラスミドは、ＲｚＣＡＴ−３を、８ヌクレオチド近接配列を有するＲｚＣＡＴ−２と置き換えた点以外、ｐＦ　Ｃ１−６と同じである。

ｐＦＣ１２−このプラスミドは、リボザイムＲｚＣＡＴ−２が１２ヌクレオチド近接配列を含む点以外、ｐＦｃ２０と同じである。

ｐＦｃ５０−このプラスミドは、センス方向（５’−３°）でその中に含む形で４つの触媒リボザイム領域（実施例４および第９図参照）を伴い、転写により不活性リボザイムを生成するＣＡＴ遺伝子を含む。このプラスミドは次のように描かれ得る。

ｐＦｃ５４−このプラスミドは、ＣＡＴ遺伝子およびリボザイム領域がアンチセンス（３’−５°）活性配向である点以外、ｐＦｃ５０と同じである。

ｐＦＣ６４−このプラスミドは、ｐｐｃｓｏとＳＶ４０プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを共有し、挿入リボザイムドメインを伴わない野生型ＣＡＴ遺伝子を含む。この遺伝子はアンチセンス配向であるため、ＣＡＴ蛋白質を製造しない。

１）Ｆｅ１２−このプラスミドは、野生型ＣＡＴ遺伝子がセンス（５’−３’）配向であるためＣＡ、Ｔ蛋白質の生産性を有する点以外、ｐＦ　Ｃ６４と同じである。

検定法：デ・ウェット等（前出）の方法に従いルシフェラーゼ活性を検定した。簡単に述べると、トランスフェクションの４８時間後ｃｏｓ細胞を溶解し、細胞リゼイトをルシフェラーゼの基質であるルシフェリンとインキュベージジンし、シンチレーション計数管を用いてルミネセンスを検出した。

また、スレイン、Ｍ、Ｊ、、「アナリティカル・バイオケミストリーＪｌ　５６：２５１−２５６（１９８６）の方法に従い、ＣＯ，Ｓ細胞リゼイトを用いてＣＡＴ活性を測定した（細胞リゼイトを２つに分け、各部分をルシフェラーゼまたはＣＡＴ活性について検定した）。

インビボ検定において、ｐＦｃ５８およびｐＦ　Ｃ４は、トランスフェクションされた細胞においてＣＡＴ活性を示さなかった。この活性を１００％ＣＡＴ活性および０％ＣＡＴ抑圧として定める。ｐＦＣ５８に関して、他のプラスミドによりトランスフェクションされた細胞におけるＣＡＴ活性を測定した。ＣＡＴ抑圧の％を、ルシフェラーゼ生産に対して正規化した、として測定した。ＣＡＴ試験＝試験構造物に関するＣＡＴ検定結果。

ＣＡＴ対照＝対照構造物（ｐＦ　Ｃ４およびｐＦＣ５８）に関するＣＡＴ検定結果。

ルシフェラーゼ生産は、エレクトロポレーションの内部対照であり、個々にエレクトロポレーションした各組織培養プレート内におけるリボザイム生産の尺度を与える。

級果：実験（ｉ）　　　　　　　・エレクトロポレーションされたプラスミドのμ９／１．５Ｘ　１０”細胞処理　ｐＴＫＣＡＴ　　　ｐＦＣ５８ｐＦｃ２０　　　ｐＦｃｌ−６ｐＦｃｌ２　　ＣＡＴ抑圧％処理は全て２回反復して実施され、平均値が与えられた。

実験（ｉｉ）エレクトロポレーションされたプラスミドのμ９／１．５Ｘ１０”細胞処理　ｐＴＫＣＡＴ　　　ｐＦＣ−１−６ｐＦｃ２０　　　ｐＦｃｌ２　　　ｐＦＣ４ＣＡＴ抑圧％処理５〜ＩＯは２回反復して実施され、平均値が与えられた。

実験（ｉｉｉ　）エレクトロポレーションされたプラスミドのμｇ／ｌ、５ｘ１０”細胞処理　ｐＴＫＣＡＴ　　　ｐＦＣ−１−６ｐＦＣ４ＣＡＴ抑圧％処理は５回反復して実施され、平均値が与えられた。

実験（１ｖ）エレクトロポレーションされたプラスミドのμ９処理　ｐＴＫＣＡＴ　　　ｐＦＣ−５０ｐＦＣ５４ｐＦＣ６４’ｐＦＣ６５ＣＡＴ抑圧％処理１３〜１６は各々４回反復して実施された。

センスＣＡＴ構造物（処理１６）は１．独自に高レベルのＣＡＴ活性の生産性を示した。従って、抑圧％は該当無しくＮＡ）である。

また、ｐＴＫＣＡＴのＴＫプロモーターをヒト・メタロチオネイン・プロモーターと置き換えて幾つかの実験を行った。このＣＡＴ構造物を、１つまたはそれ以上のりボザイムをコードするプラスミドと共にＣＯＳ　１細胞へトランスフェクションすると、ＣＡＴ活性の著しい減少が観察された。

上記結果は、動物細胞におけるリボザイムのインビボ不活化活性を明白に立証している。

リボザイムのインビボ有効性は、標的ＲＮＡを開裂し得る１つまたはそれ以上の触媒ドメインによるものであると信じられているが、「アンチセンスＪＲＮＡ型すボザイ、ムにそれらの領域が存在しても、全ＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡ分子がばらばらにならない場合には、現実にはインビボ開裂は誘導され得ない。しかしながら、分子がばらばらに、なるか否かとは無関係に、前記実施例は、標的ＲＮＡの不活化におけるリボザイムの有効性を立証している。すなわち、この発明は、開裂が標的ＲＮＡにおいて実際に行なわれるか否かとは無関係に、開裂を誘導し得る触媒ドメインおよびハイブリダイゼーション領域を有する全てのりボザイムに適用可能である。すなわち、ハイブリダイゼーシジン領域は、組み合わせたＲＮＡ／リボザイムを一緒に持続させ、触媒ドメインがそれ自体開裂を誘発し得る場合でも、標的ＲＮＡが別々の成分に開裂されるのを阻止するのに充分な程度大きいものであり得る。

Ｓ’　　　ＣＡＴＱＮＡ　　庫云写４ｆｆｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３’ＲｚＣＡＴ−１９位：＃２４＋ＩＭｌ−ｒｌｅ−−１ノ＋ｌ＾ｌ−１”：１ｍ５沓″″ＡＵ九八“Ｈ，ｐ２“ Ａδ′ＵＪこＵＣ”＾゛入３ＲｚＣＡＴ−２８１立：ＲｚＣＡＴ−３４’？４立：　　　　　−分一暮賀　　中３１ケＥ＠扮一纂賀　　　＋５１　値底物分中基質　　−３１生底゛物分中幕ｖ　　　　　−ｓ’生底゛ｑ勿１’ｌ”ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｆｉＦ′ＩＧ、／Ｊａ。

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Ｆｔｃ、　／４σ。

Ｆσ、／４ｂ。

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口ＣＡＴ泥性Ｆｔｃ、／７１ＬＩＩｅｒ１１ａ＋ＩａｎａＬ４．ＩｃａｔｌａｌＩＩｎ、ＫＷ／ＡシＪｌｌａｌＤＯら７１

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヌクレオチド配列が標的ＲＮＡの少なくとも一部分と相補的であるハイブリダイゼーション領域、および前記標的ＲＮＡの開裂に適合した触媒ドメインを含み、ハイブリダイゼーション領域が９またはそれ以上のヌクレオチドを含むものであるリボザイム。
（２）１本鎖ＲＮＡにより形成された１つまたはそれ以上のアームを含み、標的ＲＮＡの少なくとも一部分と相補的な配列を有するリボザイムであって、前述の１つまたはそれ以上のアームが標的ＲＮＡを開製し得る触媒ドメインと会合しており、ハイブリダイゼーション領域がＲＮＡの単一アームを含む場合、このアームは少なくとも９つのヌクレオチドを含み、ハイブリダイゼーション領域がＲＮＡの２つまたはそれ以上のアームを含む場合、前記アームにおけるヌクレオチドの合計は９ヌクレオチドよりも大である、リボザイム。
（３）触媒ドメインを通じて互いに会合したＲＮＡの２つの１本鎖アームを有する、請求項２記載のリボザイム。
（４）開製された標的ＲＮＡを修飾しない、請求項１〜３のいずれか１項記載のリボザイム。
（５）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは任意のリボヌクレオチドを表し、各Ｘ残基は同一または異なり得、ｎおよびｎ′の合計は６より大きく、ｎおよびｎ′は同一または異なり得、（★）は相補的リボヌクレオチド間の塩基対を表し、Ｘ′およびＸ′′は、オリゴリボヌクレオチド間に塩基対を形成させ得るべく、それらの全長の少なくとも一部分に沿った相補的配列のオリゴリボヌクレオチドを表すか、またはＸ′およびＸ′′は一緒になって単一ＲＮＡ配列（ただし、この配列の少なくとも一部分は、相補的ヌクレオチド間における塩基対形成により形成されたステムを含む）を形成し、そして所望により、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれか一つから選ばれた追加ヌクレオチドが１Ａの後に挿入され得る］で示されるリボザイム。
（６）式（２） ▲数式、化学式、表等があります▼（２）［式中、Ｘは任意のリボヌクレオチドを表し、各Ｘ残基は同一または異なり得、（★）は相補的リボヌクレオチド間の塩基対を表し、ｎおよびｎ′は前記の意味であり、Ｂは、結合、塩基対、リボヌクレオチドまたは少なくとも２個のリボヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチドを表し、ｍおよびｍ′は１またはそれ以上であって、同一または異なり得、そして所望により、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれか一つから選ばれた追加ヌクレオチドが１Ａの後に挿入され得る］を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のリボザイム。
（７）ｎおよびｎ′の合計が１６またはそれより大である、請求項５または６のいずれか１項記載のリボザイム。
（８）触媒ドメインが、配列Ｘ°ＵＹ（式中、Ｘ°は任意のリボヌクレオチドであり、Ｕはウラシルであり、Ｙは、アデニン、シトシンまたはウラシルである）の後の標的ＲＮＡを開製し得る、請求項１〜７のいずれか１項記載のリボザイム。
（９）近接配列を通して連結された多重触媒ドメインを含み、各近接配列が不活化が望まれる標的ＲＮＡと相補的な配列を含むものであるリボザイム。
（１０）環状化により安定化された、請求項１〜９のいずれか１項記載のリボザイム。
（１１）請求項１〜１０のいずれか１項記載の触媒アンチセンス配列により構成されるリボザイム。
（１２）標的ＲＮＡを請求項１〜１１のいずれか１項記載のリボザイムと反応させることを含む、標的ＲＮＡの不活化または開裂方法。
（１３）細胞またはその前駆体へトランスフェクションしたＤＮＡまたはＲＮＡ転移ベクターからのリボザイムの転写、または宿主ゲノムに組み込まれたリボザイムをコードする遺伝子の発現の結果として、リボザイムが所望の細胞標的ＲＮＡとハイブリダイゼーションし、これを不活化するといった形で、不活化が原核生物または真核生物細胞においてインビボで行なわれる、請求項１２記載の方法。
（１４）細胞が植物または動物細胞である、請求項１３記載の方法。
（１５）標的ＲＮＡが細胞にとって内在性または外性、例えばウイルスＲＮＡである、請求項１３または１４記載の方法。
（１６）標的ウイルスＲＮＡが、ＨＩＶ（エイズ）、肝炎またはほ乳類における他のウイルス誘発性疾患のＲＮＡから選択される、請求項１５記載の方法。
（１７）ウイルスＲＮＡがバクテリオファージＲＮＡである、請求項１５記載の方法。
（１８）処置を必要とする対象に、請求項１〜１１のいずれか１項記載のリボザイムの有効量を投与することを含む、ヒトまたはほ乳類におけるウイルス疾患の処置方法であって、前記リボザイムがウイルスＲＮＡの転写物とハイブリダイゼーションし、これらを不活化するものである方法。
（１９）請求項１〜１４のいずれか１項記載のリボザイムを植物に投与することを含む、植物におけるウイルスまたはウイロイド性疾患の処置方法であって、前記リボザイムがウイルスＲＮＡの転写物とハイブリダイゼーションし、これらを不活化するものである方法。
（２０）医薬的、獣医学的または農業的に許容し得る担体または賦形剤と共に請求項１〜１１のいずれか１項記載のリボザイムを含む組成物。
（２１）請求項１〜１１のいずれか１項記載のリボザイムの製造方法であって、（ａ）リボザイムに対応するヌクレオチド配列を、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせから成る転移ベクターにライゲーションし、（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼにより段階（ａ）のヌクレオチド配列を転写し、（ｃ）所望によりリボザイムを精製する段階を含む方法。
（２２）転写により請求項１〜１１のいずれか１項記載のリボザイムを生成するヌクレオチド配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡまたはそれらの組み合わせから成る転移ベクター。
（２３）細菌性プラスミドまたはファージＤＮＡである、請求項２２記載の転移ベクター。
（２４）転写により請求項１〜１１のいずれか１項記載のリボザイムを生成するヌクレオチド配列を含む原核生物または真核生物細胞。