NO308610B1

NO308610B1 - Ribozymer for anvendelse som midler for behandling av planter, fremgangsmÕte for fremstilling derav, og preparater omfattende slike ribozymer

Info

Publication number: NO308610B1
Application number: NO902661A
Authority: NO
Inventors: James Phillip Haseloff; Wayne Lyle Gerlach; Philip Anthony Jennings; Fiona Helen Cameron
Original assignee: Gene Shears Pty Ltd
Priority date: 1987-12-15
Filing date: 1990-06-14
Publication date: 2000-10-02
Also published as: DK175956B1; WO1989005852A1; NO20000369L; AU2800789A; NO312105B1; DK143390A; CN1033838A; FI902923A0; AR243935A1; CA1340831C; DE3852539T3; EP0321201A3; NZ227332A; FI104562B; NO902661D0; GR3015374T3; NO902661L; EP0321201A2; AU632993B2; MC2115A1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører ribozymer for anvendelse som midler for behandling av planter, en fremgangsmåte for fremstilling av slike ribozymer, preparater omfattende slike ribozymer, en transfervektor, preparater omfattende slike transfervektorer, en prokaryotisk eller eukariotisk celle, en fremgangsmåte for inaktivering av en target RNA i en celle, og en fremgangsmåte for inaktivering av en target RNA i planter.

Oppfinnelse vedrører en klasse av syntetiske RNA-molekyler og derivater derav, i det følgende benevnt ribozymer, som har høy spesifikk endoribonukleaseaktivitet.

Et antall naturlig forekommende RNA-molekyler som f.eks. Avocardo Sunblotch Viroid (ASBV), satelitt-RNA av Tobacco Ringspot Virus (sTobRV) og Lucerne Transient Streak Virus (sLTSV) undergår selvkatalysert kutting. Slik kutting synes å være en essensiell og særegen del av livssyklusen for disse og andre RNA.

Selvkatalyserte RNA-kuttereaksjoner deler et felles krav for toverdige metallioner og nøytral eller høyere pH, og resulterer i produksjon av RNA med ender med 5<1->hydroksyl og 2',3<1->cykliske fosfatgrupper (Prody et al., Science 231: 1577-1580 (1986) og Buzayan et al., Virology 151: 186-199

(1986)). Kuttereaksjonene katalyseres ved selve RNA, antagelig som et resultat av konformasjon som bringer reaktive grupper nær inntil hverandre. Setene av selvkatalysert kutting i naturlig forekommende RNA er lokalisert inne i sterkt konserverte regioner av RNA sekundær struktur (Buzayan et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83: 8859-8862

(1986) og Forster, A.C. og Symons, R.H. Cell 50: 9-16

(1987) ) .

Forsøk gjennomført med satelitt RNA av Tobacco Ringspot Virus (sTobRV) har ført til konstruksjon av nye endoribonukleaser (i det følgende benevnt "ribozymer"), d.v.s. enzymer omfattende RNA som katalyserer spesifikk kutting av RNA-targetmolekyler.

Betegnelsen ribozym som anvendt i den foreliggende beskrivelse referer til molekyler fullstendig bestående av RNA eller derivater derav.

Ribozymene i samsvar med oppfinnelser er distinkte fra RNA-endoribonuklease som forekommer naturlig i Tetrahymena Thermophila (kjent som IVS, eller L-19 IVS RNA) og som er utfyllende beskrevet av Thomas Cech og medarbeidere (Zaug,A.J. et al, Science (1984) 224: 574-578, Zaug, A.J. og Cech, T.R., Science (1986) 231: 470-475, Zaug, A.J. et al, Nature

(1986) 324: 429-433, publisert internasjonal patentsøknad

WO 88/04300 i navnet University Patents Inc.). Cech-endoribonukleasen har et aktivt sete med åtte basepar som hybridiseres til en target RNA-sekvens hvoretter kutting av target RNA foregår, med et krav til fritt guanosin eller guanosinderivater. De fragmenter som skriver seg fra kuttingen inneholder terminale 5'-fosfat og 3'-hydroksylgrup-per. Det begrensede antall nukleotider tilgjengelig for hybridisering til et RNA-substrat begrenser effektiviteten eller virkningsgraden av Cech-endoribonukleasen ettersom oligonukleotider med mindre enn tolv nukleotider generelt hybridiserer dårlig til targetsekvenser. Det viser seg også at et antall nukleotider i det aktive sete av Cech-endoribonukleasen kan behøve å bli konsérvert for effektiv endoribonukleaseaktivitet. Dette begrenser antallet av permutasjoner av aktive setesekvenser som kan bygges opp for å bevirke hybridisering til targetsekvenser, slik at området av RNA-targetsekvenser som kan kuttes av Cech-endoribonukleasen begrenses. Cech-endoribonukleasen modifiserer også RNA ved å addere et fritt guanosinnukleotid til 5'-enden av kuttet RNA.

I motsetning til dette hybridiserer ribozymene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse effektivt til en lang rekke target RNA-sekvenser og modifiserer ikke det kuttede target

RNA.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en forbindelse som er kjennetegnet ved at den har formelen:

hvori hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,

hvori hver av (X)nog (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen,

hvori hver av n og n' representerer et helt tall som definerer antallet ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n<1>er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,

hvor hver<*>representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,

hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,

hvori a representerer et helt tall som definerer et antall ribonukleotider med den betingelse at a kan være 0 eller 1 og hvis 0 er A som er lokalisert 5' til (X)abundet til G lokalisert 3' til (X)a,

hvori hver av m og m' representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,

hvori hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre

siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og

hvori (X)brepresenterer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)ber tilstede.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en forbindelse som er kjennetegnet ved at den har formelen:

hvori hver av (X)n_1og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen,

hvori hver av n og n<1>representerer et helt tall som definerer antall ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n' er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,

hvori hver<*>representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,

hvori hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre en forbindelse som er kjennetegnet ved at den har formelen:

hvori hver av (X)n.1og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen,

hvori hver av n og n<1>representerer et helt tall som definerer antall ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n' er større enn eller lik7og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,

hvori hver av m og m<1>representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre en forbindelse som er -kjennetegnet ved at den har formelen:

hvori Q representerer en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen,

hvori hver Y representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,

hvori hver av r og s representerer et helt tall som kan være større enn eller lik 0, og

hvori z representerer et helt tall større enn eller lik1.

En region i formlene ovenfor representerer armene eller flankerende sekvenser av et ribozym som hybridiserer til respektive deler av en target RNA-sekvens. Armene kan hybridisere langs den fulle lengde av target RNA eller del derav. En RNA-katalytisk region er avbildet i formlene ovenfor. Den katalytiske region kan inneholde ett eller flere ytterligere nukleotider som ikke skadelig påvirker katalytisk aktivitet. Slike addisjoner kan lett testes for ribozymaktivitet uten for mye eksperimentering ved å følge læren i den foreliggende beskrivelse. Den katalytiske region kan også danne en del av den hybridiserende region.

Oligoribonukleotidene kan omfatte opp til 5000 eller flere nukleotider.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre et preparat for anvendelse som middel for behandling av planter, som er kjennetegnet ved at det omfatter en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen i assosiasjon med en agrikulturelt tålbar bærer.

Ribozymene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan

fremstilles ved hjelp av metoder som er i og for seg kjent på området for syntese av RNA-molekyler, f.eks. i henhold til de anbefalte prosedyrer til Promega, Madison, WI, USA). Spesielt kan ribozymene i samsvar med oppfinnelsen fremstilles fra en tilsvarende DNA-sekvens (DNA som ved transkripsjon gir et ribozym, og som kan syntetiseres i henhold til metoder som er i og for seg kjent på området for syntese av DNA) operabelt knyttet til en RNA-polymerasepromoter som f.eks. en promoter for T7 RNA-polymerase eller SP6 RNA-polymerase. En DNA-sekvens tilsvarende et ribozym i samsvar med oppfinnelsen kan ligeres inn i en DNA-transfervektor, som f.eks. et plasmid eller bakteriofag DNA. Hvor transfervektoren inneholder en RNA-polymerasepromoter operabelt knyttet til DNA tilsvarende et ribozym, kan ribozymet fordel-aktig fremstilles ved inkubasjon med en RNA-polymerase. Ribozymer kan derfor fremstilles in vitro ved inkubasjon av RNA-polymerase med en RNA-polymerasepromoter operabelt knyttet til DNA tilsvarende et ribozym, i nærvær av ribonukleotider. In vivo kan prokaryotiske eller eukaryotiske celler (inkluderende mammalceller og planteceller) transfiseres med en passende transfervektor inneholdende genetisk material tilsvarende et ribozym i samsvar med den foreliggende oppfinnelse, operabelt knyttet til en RNA-polymerase-

promoter slik at ribozymet kan transkriberes i vertscellen. Transfervektorer kan være bakterieplasmider eller virale RNA eller DNA. Nukleotidsekvenser tilsvarende ribozymer blir generelt bragt under kontroll av. sterke promotere som f.eks. lac, SV40 sen, SV40 tidlig, metallotionin, eller n-promotere. Ribozymer kan direkte transkriberes in vivo fra en transfervektor, eller kan alternativt transkriberes som et større RNA-molekyl. F.eks. kan DNA tilsvarende ribozymsekvensene ligeres inn i 3<1->enden av f.eks. et bærergen, etter et trans-lasjonsstoppsignal. Større RNA-molekyler kan hjelpe til å stabilisere ribozymmolekylene mot nukleasebehandling inne i cellene. Ved translasjon kan bærergenet gi anledning til et protein, hvis nærvær direkte kan påvises, f.eks. ved enzymatisk reaksjon. Bærergenet kan f.eks. kode for et enzym.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen som er kjennetegnet ved at den omfatter trinnene med: a) ligering inn i en transfervektor omfattende DNA, RNA eller en kombinasjon derav av en riukleotidsekvens tilsvarende

den nevnte forbindelse,

b) nukleotidsekvensen fra trinn a) transkriberes med en RNA-polymerase, og

c) forbindelsen isoleres.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre en transfervektor, som er kjennetegnet ved. at den omfatter RNA eller DNA eller en kombinasjon derav inneholdende en nukleotidsekvens som ved transkripsjon gir anledning til en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre et preparat for anvendelse som middel for behandling av planter som er kjennetegnet ved at det omfatter en transfervektor i samsvar med oppfinnelsen, i assosiasjon med en agrikulturelt tålbar bærer.

Ved en foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av etribozym blir to syntetiske oligonukleotider av komplementær sekvens fremstilt ved standard prosedyrer (f.eks. under anvendelse av en Applied Biosystems Model 380A DNA Synthe-sizer (Applied Biosystems Inc., Foster City, California 94404)), og hybridisert sammen. Ett av oligonukleotidene koder for et ønsket ribozym. De respektive ender av de hyb-ridiserte oligonukleotider tilsvarer forskjellige restrik-sjonsenzymseter, f.eks. EcoRl ved en ende og Pstl ved den andre enden. Etter kutting med passende restriksjonsenzymer (EcoRl og Pstl i det ovennevnte eksempel) kan det dobbelttrådede DNA-fragment klones inn i en transfervektor. Hvor plasmidvektoren inneholder en RNA-polymerasepromoter opp-strøms fra DNA-sekvens tilsvarende et ribozym i samsvar med den foreliggende oppfinnelse, kan RNA-transkripter tilsvarende ribozymet passende fremstilles enten in vitro eller in vivo. Hvor ribozymet omfatter to halvdeler som holdes' sammen ved baseparing mellom komplementære nukleotider, kan hver halvdel av ribozymet fremstilles ved hjelp av de ovennevnte metoder, og halvdelene kan inkuberes sammen til å danne ribozymet.

De foretrukne ribozymer i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kutter target RNA som inneholder sekvensen X°UY, hvor X° er et hvilket som helst ribonukleotid, U er uracil og Y er adenin, cytosin eller uracil. X°U danner del av en baseparflankerende region og Y er ikke baseparet. Foretrukket, men ikke på noen måte obligatorisk, er X° guanidin, og X°UY er GUC eller GUA. Et hvilket som helst RNA-molekyl inneholdende disse sekvenser kan kuttes med ribozymene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Når først sekvensen av et RNA-transkript inneholdende sekvensen X°UY er blitt bestemt, kan armene av ribozymsekvensen syntetiseres til å være komplementære til og således hybridiserbare til RNA på den targetsekvens som flankerer X°UY-sekvensen. Ved hybridisering av armene av ribozymet til target RNA-sekvensen som flankerer X°UY-sekvensen, kutter den katalytiske region av ribozymet target RNA inne i X°UY-sekvensen. RNA-kutting lettes i nærvær av magnesium eller annet toverdig kation ved en pH på omtrent 8,0. Følgelig kan de foretrukne ribozymer i samsvar med oppfinnelsen bygges opp til å kutte hvilket som helst RNA med kjent sekvens. Den høye frekvens av restene kuttet av ribozymene i RNA (1:64 for GUC i et RNA med tilfeldig eller lik frekvens av basefordeling) betyr at et antall potensielle seter for ribozymkutting kan forutsies med pålitelighet i et hvilket som helst gitt RNA.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre en prokaryotisk eller eukaryotisk celle, som er kjennetegnet ved at den omfatter en nukleotidsekvens som,er, eller ved transkripsjon gir anledning til, en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedører videre en fremgangsmåte for inaktivering av en target RNA i en celle, som er kjennetegnet ved at den omfatter å kontakte target RNA inne i cellen med en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen, hvori forbindelsen er i stand til interagering gjennom baseparing med sekvensen av target RNA under betingelser slik at forbindelsen stabilt interagerer gjennom baseparing med target RNA og target RNA kuttes.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for inaktivering av en target RNA i planter, som er kjennetegnet ved at den omfatter anvendelse av en forbindelse i samsvar med oppfinnelsen eller av en transfervektor i samsvar med oppfinnelsen.

In vivo, dvs. inne i cellen eller cellene av en organisme, kan en transfervektor som f.eks. et bakterielt plasmid eller viralt RNA eller DNA, som koder for ett eller flere ribozymer, transfiseres inn i f.eks. celler (Llewellyn et al., J. Mol. Biol. (1987) 195: 115-123, 'Hanaham et al. J. Mol. Biol.

(1983) 166). Når den først er inne i cellen kan transfervektoren replikere og bli transkribert av cellulære polymeraser til å fremstille ribozym RNA som så kan inaktivere et ønsket target RNA. Alternativt kan en transfervektor inneholdende en eller flere ribozymsekvenser transfiseres inn i celler eller innføres i celler ved mikromanipulasjons-metoder som f.eks. mikroinjeksjbn, slik at transfervektoren eller en del derav blir integrert i genomet av vertcellen. Transkripsjon av det integrerte genetiske material gir anledning til ribozymer som virker til å inaktivere et ønsket target RNA.

Ribozymene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse har utstrakte biologiske anvendelser.

Ribozymene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse har også særlig anvendelse ved inaktivering av RNA-transkriptene i bakterier og andre prokaryotiske celler og planter. I bakterier kan RNA-transkripter av f.eks. bakteriofag, som bevirker bakteriecellens død, inaktiveres ved transfeksjon av en celle med en DNA-transfervektor som er i stand til å fremstille et ribozym i samsvar med den foreliggende oppfinnelse som inaktiverer fag DNA. Alternativt kan selve ribozymet adderes til og opptas av bakteriecellen for å bevirke kutting av fag RNA.

RNA-transkripter i planter kan inaktiveres under anvendelse av ribozymer som kodes for av en transfervektor som f.eks. Ti-plasmidet av Agrobacterium tumefaciens. Når slike vektorer transfekteres inn i en plantecelle fremstilles ribozymene under innvirkning av RNA-polymerase og kan bevirke kutting av en spesifikk target RNA-sekvens. Følgelig kan plantevirus med kjent RNA-sekvens, eller RNA-transkripter av plantegener, inaktiveres under anvendelse av ribozymer.

Endogene gentranskripter i planter eller andre celletyper kan inaktiveres under anvendelse av ribozymene i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Følgelig kan uønskede fenotyper eller karakteristikker moduleres. Det kan f.eks. ved å anvende ribozymene i henhold til den foreliggende oppfinnelse være mulig å fjerne stener fra frukt.

Oppfinnelsen skal nå illustreres ved henvisning til de etterfølgende eksempler og figurer.

I figurene vises:

Fig.1viser RNA-selvkutteseter av vi11type og muterte RNA, og en elektroforetisk profil som viser selvkatalyserte RNA-kutteprodukter. a) Oppsummerer de konserverte strukturer assosiert med naturlig forekommende RNA-kutteseter i ASBV, salamander-satelitt DNA-transkripter og satelitt RNA av sTobRV, LTSV, Velvet Tobacco Mottie virus, Solanum Nodiflorum Mottle virus og subterreng Clover Mottle virus. Nukleotidsekvenser som er konservert mellom disse strukturer er vist, mens andre er representert som X. Baseparing representert ved "<*>" og setet for RNA-kutting er forsynt med pil. b) Viser den konserverte nukleotidsekvens assosiert med kuttingen av (+) tråden av sTobRV RNA. Kuttesetet

er forsynt med pil.

c) En in vitro mutant av sTobRV inneholdende et innskudd av åtte nukleotider (vist i ramme) sammen med

en flankerende duplikasjon av tre nukleotider (UGU-rester 7 til 9) er vist.

d) Subklonede Haelll-fragmenter av villtype sTobRV og D-51 in vitro mutant ble hver transkribert i både (+)

og (-) orienteringer og radiomerkede transkripter fraksjonert ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese. Posisjonene av ukuttet 159 og 170 base-transkripter fra villtype (WT) og mutant(D-51) sekvenser er forsynt med pil. Størrelsen av kutteprodukter er vist.

Fig.2viser nukleotidsekvensen av et ribozym og produktene fra ribozymkutting separert ved hjelp av gelelektroforese. a) De innskutte nukleotider i D-51 mutanten (fig. lc) inneholder et BamHI-restriksjonsendonukleasesete.

BamHI ble anvendt for å kutte mutant DNA og de to sekvenser ble subklonet og transkribert separat in vitro. RNA-transkriptene er vist skjematisk, med potensielle baseparinger mellom RNA indikert med"*". Fragmentet inneholdende det med pil forsynte sete for kutting er omtalt som et S-RNA, mens fragmentet inneholdende ribozymet er betegnet Rz-RNA.

<b>)<t32p>]-Rz-RNA (101 baser) ble inkubert alene (bane1) og med umerket S-RNA (bane 2). [<32>P]-S-RNA ble

inkubert alene (bane 3) og med umerket og<32>P-merket Rz-RNA (baner 4 henholdsvis 5).

Fig. 3 viser en skjematisk modell av et ribozym i samsvar med en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse. Region A representerer kuttesekvensen inne i target RNA. Region B representerer en katalytisk region og regioner C representerer armene av ribozymet. Fig. 4 viser konstruksjonen av ribozymer som er targetrettet mot CAT (kloramfenikolacetyltransferase) gentran-skript. Ribozymer, betegnet RzCAT-1, 2 og 3, ble targetrettet mot tre seter inne i et 835 base in vitro transkript av CAT-genet. De relative lokaliseringer av. kuttesetene på transkriptet er vist skjematisk med de flankerende baser nummerert a). De tre ribozymsekvenser er vist ((b) til d)) med deres targetsekvenser. Aminosyresekvenser av CAT-genet er nummerert og de forutsagte seter for RNA-kutting er forsynt med pil. RzCAT-1 og 3 inneholder 24 basesekvenser avledet fra (+) tråd sTobRV (region B, fig. 3), mens RzCAT-2 inneholder en enkel U-A endring i denne region. Fig. 5 viser resultatene av CAT RNA-kutting med ribozymer RzCAT-1 til 3. 32 a) [ P]-CAT RNA ble gelfraksjonert etter inkubasjon alene (-) eller med en av tre ribozymer, RzCAT-1 til 3 (henholdsvis baner 1, 2 og 3). Lokaliseringen av fullengde-transkriptet er vist forsynt med pil. b) 51 -terminalbaseanalyse. 31 - fragmentene produsert 32 ved ribozymkutting av CAT mRNA ble [5'- P]-kinasebehandlet, gelrenset, underkastet fullstendig nukleasebehandling og de frigitte terminale rester fraksjonert ved hjelp av pH 3,5 polyakrylamidgelelektroforese. 5'-terminalnukleo-tidene, bestemt ved henvisning til markører (bane M), var A, U og G for fragmentene produsert ved hjelp av RzCAT-1 til 3 (henholdsvis baner 1, 2 og 3). Fig.6viser et tidsforløp for ribozym (RzCAT-1) katalytisk aktivitet mot CAT RNA. Mengdene av 13 9 nukleotid kuttingsproduktet ble kvantifisert og plottet. Innskuddet viser akkumulering av 13 9 basefragmentet med tiden, etter polyakrylamidgelelektroforese. Fig.7viser de relative grader av kutting av CAt RNA under forskjellige temperaturbetingelser. Substrat RNA er representert ved hjelp avi en heltrukket linje. I hvert tilfelle er kutteproduktet representert ved hjelp av en brutt linje. Fig.8avbilder tre ribozymer (tilsvarende RzCAT-2) med armer

eller flankerende sekvens, av varierende lengde.

Fig. 9 viser skjema for produksjon av et ribozym omfattende katalytisk antisense RNA inneholdende hver av kuttedomenene RzCAT-1 til 3. Fig.10 viser ribozymer som hybridiserer til targetsekvenser inneholdende GUA (10a) og GUU (10b) enheter i CAT mRNA. Fig.11 viser seter for selvkatalysert RNA-kutting i Citrus

Exocortis viroid (CEV) RNA og dets komplement.

Fig.12 viser ribozymet RzCEV25x(+) hybridisert til target CEV RNA(a), og en gelelektroforetisk profil av

(+)CEV RNA og komplementær (-)CEV RNA inkubert med RzCEV25x(+) (b, henholdsvis baner 1 og 2). Kutteproduktet er forsynkt med pil.

Fig.13 viser ribozymet RzCAT-2 som hybridiserer til sin targetsekvens (a) og ribozymet RzSCMoV(b). Det katalytiske domene i hvert ribozym er forsynt med ramme. Forskjeller i den katalytiske region av RzSCMoV ved sammenligning med RzCAT-2 er markert. Fig. 14 viser ribozymet RzCEV-2i som hybridiserer til en targetsekvens i Citrus Exocortis viroid (CEV) RNA. Kuttesetet tilsvarer nukleotidet 336 i CEV RNA-sekvensen. Endringen i nukleotidsekvens i det katalytiske domene, ved sammenligning med det katalytiske domene av sTobRV, er innsirklet (a). Fig.14(b) viser en elektroforetisk profil av en kontroll [(-) tråd av CEV] RNA, bane 7, og (+) tråden av CEV RNA, bane 8, etter inkubasjon med RzCEV2. Fig. 15 viser ribozymet RzCAT-2 (a) sammenlignet med ribozymet RzCAT-2B (b). Katalytiske domener er innrammet. Endringer i det katalytiske domene av RzCAT-2B sammenlignet med RzCAT-2 er også innrammet.

Fig. 16 viser et kart av plasmid pJ35SN, og

Fig. 17 er en grafisk fremstilling av gjennomsnittet av fire forsøk ved inhibering av CAT-ekspresjon i planter (tobakksprotoplaster).

De etterfølgende eksempler gis for å illustrere oppfinnelsen.

Reaksjoner og manipulasjoner som involverer DNA, som lige-ringer, restriksjonsenzymbehandlinger, bakteriell transformasjon, DNA-sekvensering etc. ble gjennomført ved hjelp av standard metoder, som f.eks. dem som er beskrevet av Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, 1982). Manipulasjoner som involverer RNA ble også gjennomført ved hjelp av standard metoder, som f.eks. dem som er beskrevet av

Uhlenbeck (Nature 328, 596-600 (1987)) og Haseloff og Gerlach (Nature 334, 585-591 (1988)).

EKSEMPEL 1

Selvkatalytsert kutting av mutert sTobRV RNA:

En oppstilling av domenene assosiert med naturlig forekommende RNA-kutteseter i ASBV, salamander-satelitt DNA-transkripter og satelitt RNA fra sTobRV, LTSV, Velvet Tobacco Mottle virus (VMoV), Solanum Nodiflorum Mottle virus (SNMV) og subterreng Clover Mottle virus (SCMoV) er vist i fig. la. Nukleotidsekvenser som er konservert mellom disse strukturer er vist, mens ikke-konserverte sekvenser er representert som X. En ekstra U er posisjonert etter rest -"-A i LTSV( + )

tråden.

Domenet assosiert med den selvkatalyserte kutting av (+) tråden av sTobRV ble undersøkt for å fastslå den enzymatiske substrataktivitet innenfor dette domene. Først ble klonet sTobRV cDNA mutagenisert under anvendelse av en oligo-nukleotidlinker (BamH 1) innskuddsprosedyre.

Konstruksjon av en vektor for in vitro ekspresjon av sTobRV: Et160bpTaq 1 - Spe 1-fragment av sTobRV cDNA ble isolert fra pSP653 (Gerlach et al. 1985, Virology 151: 172-185) og ligert til Acc 1 - Spe 1-kuttet,■fosfatasebehandlet pGEM4for å reformere Accl-setet. Et resulterende klon ble linearisert med Acc 1, fosfatasebehandlet og et 359 bp Taq 1-fragment av sTobRV cDNA ble innskutt. De resulterende kloner ble underkastet screening for nærvær av en sirkulært permutert520 bp sTobRV cDNA-sekvens inneholdende de terminalt over-flødige rester 277 til 81 (pTTS). sTobRV-sekvensen flankeres av promotere for T7 og SP6 RNA-polymeraser, og in vitro transkripsjon ga dannelse av RNA av (+) eller (-) orientering inneholdende to seter for selvkutting.

In vitro mutagenese:

Plasmidet pTTS (50/xg) ble linearisert med BamH 1, behandlet med Sl-nuklease og religert for å fjerne et enesteBamH1-sete. Den resulterende konstruksjon, pTTS-B, ble behandlet med 2 x IO<-4>enheter DNase 1 i 20 mM Tris-HCl, pH 7,0,15 mM MnCl2i ti minutter ved 37°C. De resulterende lineære DNA ble trimmet og/eller endefylt ved anvendelse av T4 DNA-polymerase, og renset ved hjelp av 0,7 % LGT-agarosegelelektroforese og ekstraksjon. Kinasebehandlet BamH 1 linker-sekvenser (CGGATCCG) ble ligert til det lineariserte plasmid over natten ved romtemperatur i nærvær av 5 % polyetylen-glykol. Deretter ble reaksjonsblandingene behandlet med BamH 1 og de lineære plasmid DNA renset på nytt ved hjelp av 0,7 % LGT agarosegelelektroforese (dette ble funnet nødvendig for å fjerne de siste spor av sirkulært plasmid, sammen med uligerte linkere). Plasmider ble resirkularisert under anvendelse av T4 DNA ligase og transformert inn i E. coli DH-1. Kolonier (større enn 1000) ble avskrapet fra agarplater, dyrket i væskekultur til metning og en blandet populasjon DNA fremstilt. De blandede sTobRV .cDNA- innskudd ble kuttet ut ved hjelp av behandling med restriksjonsenzym ved flankerendeEcoRl og Pstl-seter, renset ved hjelp av 1 % LGT agarosegel-elektrof orese , og subklonet inn i EcoRl - Pstl-kuttet, fosfatbehandlet pGEM 4. De resulterende transformanter ble på nytt slått sammen, dyrket i væskekultur og plasmid DNA fremstilt. Plasmid DNA ble behandlet med BamH 1 for å kutte bare de plasmider som inneholdt en BamH 1 linkersekvens, og de lineære former ble på nytt renset ved hjelp av to runder 0,7 % LGT agarosegelelektroforese, resirkularisert ved T4 DNA ligase, og transformert inn i E. coli DH-1. Individuelle transformanter ble underkastet screening for den tilnærmede posisjon av den innskutte BamH 1 linker inne i sTobRV-sekvensen ved hjelp av behandling med restriksjonsenzym, subklonet inn i M13 mpl9 og sekvensert via dideoksynukleotid-kjede-terminasjonsteknikk.

Et bibliotek av sTobRV-mutanter resulterte, og nukleotidse-kvensanalyse viste at hver mutant.inneholdt en innskutt BamH 1-linkersekvens (CGGATCCG) sammen med flankerende duplikerte eller utelatte sTobRV-sekvenser. Mutantene ble transkribert in vitro og RNA underkastet assay for deres evne til å under-gå kutting. Fra disse forsøk ble en 52-nukleotidsekvens identifisert som inneholdende både substrat- og kuttedelene av sTobRV RNA. Denne 52-nukleotidsekvens, avbildet i fig. lb, inneholdt domenet av konservert sekvens nødvendig for selvkutting av andre RNA (fig. la). En mutant, betegnet D-51, inneholdt en åtte nukleotid BamH 1-linkersekvens innskutt mellom tre duplikerte sTobRV-nukleotider nummerert 7 til 9. Denne mutant undergikk selvkatalysert RNA-kutting. 97 og 108 basepar Haelll- fragmenter inneholdende den 52-nukleotidkuttesekvens av villtypen og D-51 RNA (som vist i fig. lb og lc) ble kuttet ut fra sekvenserte plasmidkloner. Fragmentene ble ligert inn i Smal-setet av pGEM4 og underkastet screening for å oppnå begge orienteringer av innskuddet. Plasmidene ble linearisert under anvendelse av EcoRl og (+) og (-) tråd RNA av lengder 159 og 170 baser ble transkribert under anvendelse av 200 enheter/ml T7 RNA polymerase i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 2 mM sper-midin, 1000 enheter/ml RNasin, 500 txM ATP, CTP og GTP med 200/xM [a 3 2P]UTP. RNA ble fraksjonert ved elektroforese på en 10 % polyakrylamid, 7 molar urea, 25 % formamidgel, og auto-radiografert.

Som vist i fig. Id ble det ikke iakttatt noen kutting av (-) tråd RNA-transkriptene. Dette var som forventet, ettersom (-) tråden ikke inneholdt et selvkatalysert kuttesete. Med (+) trådene av både villtypen og D-51 sekvensene foregikk kutting, med kutting av D-51 RNA noe mindre effektivt enn av villtypen (fig. Id). Dette forsøk indikerer at den enkelttrådede løkkeregion ved den høyre side av 52-nukleotidsekvensen involvert i den selvkatalyserte kutting av RNA ikke er essensiell.

Separering av enzymatiske og substrataktiviteter:

Ved å anvende BamH 1-restriksjonsendonukleasesetet innskutt i D-51 ble de flankerte Haelll-BamH 1 og BamH 1-HaeIII-fragmenter oppnådd og hver ble subklonet inn i E. coli plasmid egnet for in vitro transkripsjon<1.>Dette førte til eliminer-ing av den muterte enkelttrådede løkke fra selvkuttedomenet, idet regionen ble splittet i to RNA-segmenter (fig. 2a). Det minste Haelll-BamH 1-fragment inneholdt nukleotidene 321 til9, inkluderende det aktuelle sete for kutting og ble betegnet S-fragmentet. BamH 1—HaeIII-fragmentet inneholdende sTobRV-nukleotider 7 til 48 ble betegnet ribozym- eller Rz-fragmentet. E. coli plasmidene anvendt for in vitro transkripsjon var pGEM3 og pGEM4 (Promega, Madison, WI, USA) . Disse ekspresjonsplasmider inneholder:

a) en kilde for replikasjon,

b) selekterbar medisinresistens (Amp<r>) gen,

c) et multippel kloningssete flankert av RNA polymerase-promotere som kan anvendes for in vitro produksjon av

transkripter.

T7DNA-polymerasebehandlet, Kpnl-behandlet Rz-pGEM3 og Xbal behandlet S-pGEM4 ble transkribert under anvendelse av SP6 RNA-polymerase under de samme betingelser som angitt i det foregående.

Som vist i fig. 2 viste hverken S eller Rz-RNA noen vesentlignedbrytning ved inkubering alene (fig. 2b, baner1og 3) under betingelser egnet for meget effektiv selvkutting (50°C,20mM MgCl2, pH 8,0). Det merkede Rz-RNA viste seg også uendret etter inkubasjon med S-RNA (fig. 2b, baner 2 og 5). Når S-RNA ble blandet med Rz-RNA opptrådte imidlertid effektiv kutting av S-RNA (fig. 2b, baner 4 og 5) og frem-bragte to fragmenter. Produktstørrelsene var i samsvar med kutting av S-RNA (84 baser) ved det normale sete mellom nukleotider nr. 359 og nr. 1, til å gi 5' og 3' proksimale fragmenter av henholdsvis nukleotider 67 og 17. Dette viser at S-RNA virket som et substrat for ribonukleolytisk kutting med Rz-RNA, som virker på en katalytisk måte.

En modell av et ribozym basert på den katalytiske region av sTobRV RNA er vist i fig. 3. Ribozymet har to armer eller flankerende sekvenser av enkelttrådet RNA vist ved C, som hybridiserer til komplementære sekvenser på et substrat RNA, d.v.s. RNA som skal kuttes. Hver flankerende sekvens vist ved C inneholder åtte ribonukleotider. Antallet av nukleotider inneholdt i region C er ikke kritisk. Tilstrekkelig nukleotider må imidlertid være tilstede til å tillate at ribozymet hybridiserer til et target RNA. Fire nukleotider i hver region C synes å være minimumsantallet for hybridisering .

Den katalytiske region B inneholder sekvenser som er sterkt konservert i naturlig forekommende kuttedomener (se fig. la). Fra en sammenligning med kuttedomener av de kjente sekvenser er lengden av baseparstammen II uviktig, og likeledes nærværet av en assosiert løkke ved en ende derav.

Kuttesetet inne i target RNA er avbildet ved A (i fig. 3) som GUC. På basis av foretatte forsøk (ikke vist) og andre av Koizumi (FEBS LETT 288, 288-230 (1988), og FEBS LETT 239, 285-288 (1988)) på kuttesetene i naturlig forekommende RNA, virker sekvensene GUA, GUC, CUC, AUC og UUC også som kutteseter inne i RNA.

EKSEMPEL 2

Demonstrasjon av konstruksjon, syntese og aktivitet av ribozymer med ny og høyspesifikk endoribonukleaseaktivitet: Som en illustrasjon av oppfinnelsen ble det konstruert tre ribozymer som er targetrettet mot transkriptet av et vanlig anvendt indikatorgen avledet fra bakterier, Tn9-kloramfenikolacetyltransferase (CAT) som kan tilveiebringe antibiotisk resistens i bakterier, planter og dyr og som lett kan bestemmes. Disse ribozymer, betegnet RzCAT-1 til 3 tilsvarer potensielle GUC-kutteseter i CAT RNA ved posisjoner henholdsvis 139-140, 494-495 og 662-663. Sekvensene av disse ribozymer er avbildet i fig. 4. i I hvert tilfelle var de flankerende sekvenser av ribozymet som hybridiserer til target CAT RNA åtte nukleotider lange. Den katalytiske region ble valgt til å tilsvare regionen av sTobRV RNA som vist i fig. 3.

i

CAT-genet ble oppnådd fra pGEM4 ;og subklonet som et BamH 1-fragment inn i pGEM-32 (fra Promega, Madison, WI, USA). Dette plasmid ble linearisert med HindiII og CAT-gentranskripter ble oppnådd under anvendelse av T7 RNA polymerase med

32

220/iM [a- P]UTP. Ribozymsekvenser ble syntetisert som oligodeoksynukleotider, henholdsvis RZ CAT-1, 2 og 3. De ble kinasebehandlet, ligert med fosfatasebehandlet EcoRI-Pstl-kuttet pGEM4 og inkubert med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase 1 før bakteriell transformasjon. EcoRI-lineariserte plasmider ble transkribert med T7 RNA-polymerase og produserte ribozym RNA. Ribozymer ble inkubert med CAT-transkript i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM MgCl2ved 50°C i 60 minutter, og produktene fraksjonert med 5 % polyakrylamid, 7M urea, 25 % formamidgelelektroforese før autoradiografi.

Når 840-nukleotid CAT-transkriptet ble inkubert med hvilken som helst av de tre ribozymer, forekom effektiv og høy sekvensspesifikk kutting (fig. 5) og produserte to RNA-fragmenter i hver reaksjon. Fragmentstørrelsene var i samsvar med de forutsagte seter for kutting, (d.v.s. 13 9 og 696, 494 og 341, 662 og 173 basefragmenter var henholdsvis 5' og 3'produktene fra RzCAT-1 til 3 katalysert kutting). Betingelsene for disse ribozymkatalyserte kuttinger var tilsvarende dem som iakttas for naturlig forekommende kuttereaksjoner (Foster, A.C. og Symons, R.H., Cell 49: 211-220

(1987) og Foster, A.C. og Symons, R.H., Cell 50: 9-16

(1987)), med mer effektiv kutting forekommende ved forhøyet pH, temperatur og toverdige kationkonsentrasjoner (data ikke vist). Når de er tilstede i molart overskudd katalyserte de tre ribozymer nesten fullstendig kutting av CAT RNA-substratet etter 60 minutter i 50 mM Tris HCL, pH 8,0, 20 mM MgCl2ved 50 °C. Under lignende betingelser med 0,1 ixM substrat og 3 xxM ribozymer var T ,_ av CAT mRNA-substratet henholdsvis 3,5, 3,5 og 2,5 minutter i nærvær av RzCAT-1 til 3. Ribozymsekvensene var inaktive overfor komplementet av substratet RNA (d.v.s. (+) tråden) og i form av oligodeoksyribonukleotider (data ikke vist). De 3' terminale kutte-fragmenter fra hver ribozymkatalysert reaksjon ble isolert og5'<32>P-kinasebehandlet (50 mM Tris HC1, pH 9, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT med 50 xxCi T- 3 2P ATP og fem enheter T4 polynukléotid-kinase i 30 minutter ved 37°C). Effektiv kinasebehandling av fragmentene indikerte at de hadde 5' terminale hydroksy-grupper, tilsvarende dem som produseres ved naturlig forekommende kuttereaksjoner.

Det terminale nukleotid av fragmentene produsert ved kutting av CAT-sekvensene med RzCAT-1 til 3 ble bestemt. Kort sagt ble radiomerkede fragmenter renset på en 5 % polyakrylamidgel og behandlet med et like stort volum av 500 enheter/ml RNase Tl, 25 enheter/ml RNase T2.og 0,125 mg/ml RNaseA i 50 mM ammoniumacetat, pH 4,5, i 12 0 minutter ved 3 7°C. Produktene ble fraksjonert på en 20 % polyakrylamidgel inneholdende 25 mM natriumcitrat, pH 3,5, og 7 molar urea. Fig. 5b viser at kuttingen av CAT-sekvensene ved RzCAT-1 til 3 foregår nøyaktig før de respektive nukleotider A,U og G.

Den terminale sekvens av CAT-genfragmentene ble bestemt direkte under anvendelse av den partielle enzymatiske behandlingsteknikk (Donis-Keller et al., Nucleic Acids Res.4: 2527-2538 (1980)) under anvendelse av basespesifikk partiell ribonukleolytisk kutting. Sekvensen av fragmentene bekreftet at kutting forekom ved de forventede steder inne i CAT RNA (ikke vist).

Enzymatisk katalyse:

For å demonstrere at ribozymer bevirker kutting av CAT mRNA-substratet på en katalytisk måte, ble hvert inkubert med et molart overskudd av substrat, under betingelser som bør begunstige både effektiv kutting'og produktdissosiasjon.

Fig. 6 viser resultatene av et forsøk hvor etter 75 minutter ved 50°C, pH 8,0 i 20 mM MgCl2, 10 pmol RzCAT-1 hadde katalysert spesifikk kutting av 163 pmol av et avkortet CAT mRNA (173 baser) substrat til å gi 5' og 3' fragmenter med henholdsvis 13 9 og 34 baser. Gjennomsnittlig hadde hvertribozym deltatt i mer enn ti kutteprosesser. Etter 75 minutter ved 50°C ble det bemerket noen ikke-spesifikk kutting av RNA som skyldes de ekstreme betingelser, men 70 % av de resterende intakte RNA (163 pmol) hadde akkumulert som 13 9 basefragmentet. Lignende resultater ble oppnådd forRzCAT-2 og 3 (data ikke vist), og således virker hvert som et RNA-enzym.

EKSEMPEL 3

Virkning av temperaturen på ribozymaktivitet:

Virkningen av reaksjonstemperaturen på in vitro graden for ribozymaktiviteten ble undersøkt.

Et tidsforløp for reaksjoner for ribozymer RzCAT-1 til 3 på CAT RNA-substrat ved 37°C og 50°C ble gjennomført.

Ved dette forsøk ble reaksjoner:for hvert ribozym utført dobbelt, under anvendelse av reaksjonsbetingelsene for ribozymkutting angitt i eksempel 2. En reaksjon ble inkubert ved 37°C og den andre ved 50°C, Prøver ble fjernet ved tidspunkter opp til 90 minutter og reaksjonsgraden ble analysert ved denaturerende plyakrylamidgelelektroforese.

Fig. 7 viser tidsforløpet for reaksjonen for hvert av ribozymene RzCAT-1 til 3 ved 37°C og 50°C. Reaksjonshastigheten for hvert ribozym øker med økt reaksjonstemperatur.

Tiden for 50 % (t-^) kutting av CAT RNA er angitt i tabell 1.

Som vist i tabell 1 er reaksjonshastigheten for ribozymer ved 37°C omtrent 20 ganger saktere enn reaksjonshastigheten ved 50°C.

EKSEMPEL 4

Virkningene av å variere armlengdene av ribozymer (eller flankerende sekvens) på ribozymkatalytisk aktivitet: Armene eller flankerende sekvenser av et ribozym (region i tidligere angitte formler) hybridiserer ribozymet til et target RNA hvoretter kutting av RNA foregår. Ved dette forsøk ble det undersøkt virkningen på kuttegraden av en targetsekvens ved å endre graden av komplementæritet og derav følgende lengde av bareparing av ribozymarmene til targetsekvensen.

Ribozymer ble fremstilt med 4, 8 og 12 basekomplentæritet til targetsekvensen RzCAT-2 på hver arm (fig. 8a). Ribozymene ble fremstilt ved hjelp av metodene i eksempel 2. Rib<p>zym-aktiviteten ble bestemt ved å inkubere ribozym RNA med CAT RNA som tidligere beskrevet.

Ribozymet med en 4 basekomplementæritet på hver arm kuttet ikke substrat RNA. Ribozymet med 8 basekomplementæritet på hver arm kuttet CAT-substratet og tilsvarende for ribozymet med 12 basekomplementæritet. Ribozymer med 12 basekomplementæritet kuttet target RNA mer effektivt, som bedømt ved reaksjonshastigheten in vitro, enn ribozymer med et mindre antall av basekomplementæriteter. Selv om det synes nødvendig å ha mer enn 4 basekomplementæritet, vil økning av lengden av den hybridiserende region av ribozymer øke deres reaksjonshastighet.

I et ytterligere forsøk ble reaksjonseffektivitet av et ribozym med (a) komplementæritet .til hele lengden av CAT-transkripttarget RNA og (b) multiple katalytiske domener undersøkt.

Fire GUC-targetseter i CAT RNA sekvenser ble valgt. Ribozymkatalytiske domener mot disse seter ble "innskutt" i en komplett antisense (-)-sekvens for CAT-transkriptet og den katalytiske aktivitet ble testet.

De fire valgte seter var de tre som er spesifisert ved RzCAT-1 til 3 beskrevet i det foregående og et ytterligere sete som kan representeres som følger:

hvori "192" refererer til aminosyren 192 i CAT-polypeptidet og en 1 refererer til kuttesetet,.

Oligodeoksyribonukleotider inneholdende ribozymkatalytiske domener og som spenner over hvert ay disse kutteseter ble anvendt for Ml3 mutageneseforsøk for å fremstille en sekvens inneholdende hele komplementet av CAT-sekvensen, men med de fire ribozymkatalytiske domener inskutt deri. M13 mutagenese ble gjennomført ved binding av oligonukleotider inneholdende ribozyminnskudd til enkelttrådede M13 DNA inneholdende uracil, etterfulgt av syntese av komplementære DNA inneholdende innskuddet. De komplementære DNA ble isolert etter kloning i en passende Escherichia coli stamme (T.A. Kunkel 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 488-492). Det resulterende dobbelttrådede cDNA ble klonet i en in vitro ekspresjonsvektor for å produsere ribozym RNA under anvendelse av T7-polymerase transkripsjonssystemet.Ribozymaktiviteten ble bestemt ved inkubasjon av ribozym RNA med CAT-transkript etterfulgt av gelelektroforese av reaksjonsblandingen, etter glyoksalbehandling for å denaturere nukleinsyrene.

Autolytisk kutting foregikk ved alle de forventede seter på CAT-transkriptet. Følgelig kan de flankerende sekvenser av armer eller et ribozym strekke seg langs den fulle lengde av RNA-transkriptet som skal kuttes.

Fig. 9 viser skjematisk produksjon av katalytisk antisense RNA inneholdende hvert av de fire ribozymer. Det katalytiske antisense RNA inneholder omtrent 900 baser.

Under de ovennevnte reaksjonsbetingelser danner ribozymet og targetsekvensene komplekser med høy molekylvekt antagelig ved hjelp av utstrakt baseparing. En sterk denaturerende behandling som f.eks. glyoksalbehandling er nødvendig for å resolvere reaksjonsprodukter under elektroforese.

EKSEMPEL 5

Targetsekvenser for ribozymkutting:

GUA-enheten i mRNA ble testet for å se om et ribozym ville bevirke RNA-kutting av denne sekvens.

Et spesifikt sete i CAT mRNA, inkluderende GUA-enheten

(fig. 10a) ble valgt og en passende ribozymsekvens ble fremstilt og testet for aktivitet. Ribozymet inneholdt armer av åtte ribonukleotider.

Syntetiske oligonukleotider tilsvarende ribozymet i fig. 10 ble fremstilt i samsvar med eksempel 2 og dobbelttrådet cDNA klonet inn i en in vitro ekspresjonsvektor (pGEM4, se det foregående) i E. coli for å produsere ribozym RNA under anvendelse av T7 polymerasetranskripsjonssystemet. Ribozymaktivitet ble bestemt ved inkubering av ribozym RNA med CAT mRNA etterfulgt av gelelektroforese av reaksjonsblandingen som tidligere beskrevet.

Ribozymet bevirket kutting av GUA-targetsetet (ikke vist). Følgelig er enheten GUA i RNA et substrat for ribozymer i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Dette var ikke fullstendig uventet ettersom et naturlig forekommende kutte sete i satelitt RNA av Lucerne Transient Streak virus krever gjenkjennelse av et GUA-sete.

På lignende måte ble en GUU-enhet i CAT RNA targetsekvensen testet med et passende ribozym (se fig. 10b), og kutting ble bevirket.

EKSEMPEL 6

Ribozymkutting av viralt RNA:

Viroid RNA i form av Citrus Exocortis viroid RNA ble kuttet under anvendelse av et ribozym i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.

To GUC-targetseter ble valgt i Citrus Exocortis viroid (CEV) RNA. Et sete i den komplementære trådsekvens ble også valgt. Ribozymer ble fremstilt mot alle disse seter og testet for aktivitet. Ribozymene ble betegnet CEV9x(+), CEV9x(-) og CEV25x(+). Fig. 11 viser de tre kutteseter i CEV RNA for hvert av disse ribozymer.

Ribozymer ble fremstilt i henhold til de tidligere metoder. Ribozym RzCEV25x(+) er vist i fig. 12. Dette ribozym kutter GUC-enheten ved nukleotid 116 av CEV RNA.

Fig. 12b viser kutting av CEV RNA med ribozym RzCEV9x(+). Ingen kutting iakttas med ribozym RzCAT9x(-).

Dette forsøk indikerer at ribozymer er aktive mot target RNA-sekvenser fra forskjellige kilder. Dette kunne forventes, ettersom alle RNA er dannet fra de grunnleggende ribonukleotid byggeblokker av adenin, guanin, cytosin og uracil, uansett deres animalske, plante- eller mikrobielle opprinnelse.

EKSEMPEL 7

Eksempler på ribozymer med variable katalytiske domener:

Et ribozym som er targetrettet mot et CAT-2 sete ble fremstilt under anvendelse av den katalytiske domenesekvens fra satelitt RNA av subterreng Clover Mottle virus (SCMoV). Tolv base-komplementæritet av ribozymarmflankerende sekvens ble innlemmet i konstruksjonen av ribozymet RzSCMoV. Ribozymene RzCAT-2 og RzSCMoV er vist i fig. 13a henholdsvis 13b. Løkkeregionen av RzSCMoV inneholder fem nukleotider med sekvensen AAAUC. Dette er i motsetning til løkkeregionen RzCAT-2 som inneholder fire nukleotider med sekvensen AGAG.

I tillegg inneholder RzSCMoV en C i den katalytiske region, i stedet for U<*>i RzCAT-2. De forskjellige sekvenser i RzSCMoV i sammenligning med RzCAT-2 er markert.

RzSCMoV ble fremstilt i henhold til eksempel 2. RzSCMoV var aktivt og gir to kutteprodukter som forventet.

Ved et ytterligere forsøk ble Citrus Exocortis viroid (CEV) targetsete ved nukleotid -336 i sitt komplementære RNA kuttet under anvendelse av et ribozym RzCEV2 med sekvensen angitt i fig. 14a. Løkkeregionen betegnet med bokstaven "L" i fig. 14 omfatter seks nukleotider med sekvensen 3'-CCTATA-5'. Dette er forskjellig fra løkkeregionen av sTobRV som omfatter fire nukleotider med sekvensen 3'-AGAG-5'. Dette ribozym kutter target CEV komplementært RNA ved posisjon -336 som vist i den elektroforetiske profil av fig. 14b.

Dette forsøk indikerer at antallet av nukleotider, og nukleotidsekvensen av løkkeregionen er uviktig ved ribozymaktiviteten. I disse forsøk ble ribozymet fremstilt ved hjelp av metoder som er beskrevet tidligere i beskrivelsen.

Ved et ytterligere forsøk ble virkningen av baseparing i det katalytiske område (stammeområde) på ribozymaktiviteten undersøkt.

Et modifisert ribozym tilsvarende RzCAT-2 men inneholdende fire ekstra basepar ble fremstilt og testet. I fig. 15a er sekvensen av ribozymet RzCAT-2 vist hybridisert til target CAT RNA. Testribozymet er vist ved 15b, med de ytterligere basepar innrammet. Testribozymet hadde sammenlignbar aktivitet med RzCAT-2. Dette indikerer at den baseparede region av det ribozymkatalytiske. domene kan ha varierende lengde uten å påvirke katalytisk aktivitet.

Det er iakttatt (data ikke vist) at den stabile in vivo form av sTobRV RNA-transkripter uttrykt i transgene planter primært er sirkulær, antagelig på grunn av ligering av 5' og 3'-enden. Bruken av to autolytiske kutteseter som flankerer en sekvens av interesse i et in vivo RNA-transkript vil således sannsynligvis føre til et sirkularisert produkt som kan ha større stabilitet enn lineære transkripter. Denne metode synes å tilveiebringe en ny metode for in vivo stabilisering av ribozymsekvenser. Denne betegnes sirk-kularisering.

EKSEMPEL 8

In vivo aktivitet av ribozymer:

In vivo aktivitet av ribozymer i planteceller undersøkes i dette eksempel.

Forsøksprosedyre

Plasmider inneholdende anti-CAT (CAT = kloramfenikolacetyltransferase) eller kombinert anti-CAT/ribozymgen-konstruksjoner (se det følgende) ble innført i tobakksprotoplaster i samme mengde og forhold til hverandre, sammen med et ytterligere plasmid som inneholdt en funksjonell CAT-genkonstruksjon. CAT-aktiviteter ble målt og sammenlignet med basisnivå for genaktivitet.

Materialer og metoder:

a) Elektroporeringer og CAT-bestemmelser.

Disse ble gjennomført som beskrevet i Llewellyn et al. J.

Mol. Biol. (1987) 195: 115-123.' Kort sagt ble protoplaster av Nicotiana plumbaginifolia linje T5 fremstilt fra en suspensjon to døgn etter subdyrking, suspendert i 10 mMHEPES, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,2M mannitol og innstilt til en densitet på 3 x 10<6>/ml. Elektroporering ble gjennomført under anvendelse av en enkelt 50 ms puls ved 250V. Protoplaster ble fortynnet ti ganger og dyrket i 20 timer ved 26°C i mørke. De ble brutt opp ved ultralydbehandling og ekstrakter oppnådd. Ekstraktene ble normalisert med hensyn til proteininnhold og bestemt for CAT-aktivitet in vitro

14

under anvendelse av C-kloramfenikol og acetyl CoA. Reaksjonsprodukter ble separert ved hjelp av tynnsjikt-kromatografi og visualisert ved hjelp av autoradiografi. Graden av reaksjoner ble beregnet ved produksjon av radio-14

aktive produktderivater fra C-kloramfenikolmodellen.

b) Genkonstruksjoner.

Genkonstruksjoner ble innført i 0,1 ml protoplastsuspensjoner

som plasmid DNA som var blitt renset fra bakterier ved ekstraksjon og to sykluser av CsCl-ekvilibriumdensitet gradientsentrifugering. De ble resuspendert i 10 mM Tris/l mM EDTA/pH=7,5for bruk.

Den aktive CAT-genkonstruksjon ble overført på plasmidet betegnet pCAT7+. Det ble avledet ved fusjon av en CAT-gensekvens (fra plasmid pCM4, se T.J. Close og R. Rodriguez, 1982, Gene 20: 305-316) inn i plasmidet pJ35SN (avledet fra p35SN, W.L. Gerlach et al., 1987, Nature 328: 802-805) slik at den aktive genkonstruksjon var:

35S refererer til 35S CaMV (Cauliflower Mosaic virus) promoter, NOS til nopalin syntetase polyadenyleringssignal, T/C til transkripsjon.

Sammen med 0,2 ixg av pCAT7+ ble det tilsatt forskjellige genkonstruksjoner i overskudd som beskrevet i det følgende. Genkonstruksjonene var inneholdt i plasmider med følgende betegnelser:

pJ3 5SN - Dette vektorplasmid, hvorav et kart er vist i fig. 16, inneholder en 35S CaMV promoter og plante-nopalinsyntase 3' polyadenyleringssignal, som kan avbildes som følger: pCAT7- - Dette inneholder CAT-gensekvensen innskutt i pJ3 5SN slik at transkripsjon,vil resultere i produksjon av antisense CAT RNA, som kan avbildes som følger: pCAT19- - Dette inneholder CAT-genet med fire katalytiske ribozymdomener inkludert deri (se eksempel 4 og fig. 9), innskutt i pJ35SN slik at transkripsjon vil resultere i fremstilling av antisense CAT RNA inneholdende fire katalytiske ribozymdomener, som kan avbildes som følger:

Resultater:

Den følgende tabell viser de relative CAT-aktiviteter i celler tyve timer etter elektroporering. Aktivitet uttrykkes som prosent omdannelse av kloramfenikolsubstrat ved et en times forsøk.

Følgende konklusjon kan trekkes fra disse resultater:

a) Innføring av CAT-genkonstruksjonen resulterer i vesentlig CAT-aktivitet - sammenlign 2A, B med IA, B. Det er

variabilitet mellom duplikatene. Fra de tendenser som

sees i de andre prøver (se "b" og "c" i det følgende) er

det sannsynlig at 2A viser en abnormt lav aktivitet.

b) Samtidig innføring av en antisense genkonstruksjon resulterer i en nedsettelse i aktivitetsnivået - sammenlign 3A, B og 4A, B med 2B. Graden av nedsettelse er direkte relatert til nivået av antisense gen tilsatt som

plasmid - sammenlign 3A, B og 4A, B.

c) Samtidig innføring av den kombinerte antisense/ribozym-genkonstruksjon resulterer i en nedsettelse i genaktivitet - sammenlign 5A, B og 6A, B med 2B. Videre er nedset-telsen mer markert enn for de tilsvarende nivåer av antisense genkonstruksjoner - sammenlign 5A, B med 3A, B og 6A, B med 4A, B.

De gjennomsnittlige resultater for fire in vivo forsøk er vist i fig. 17. I denne figur representerer "Kontroll" behandling 2. "Antisense" representerer behandling 4. "Katalytisk" representerer behandling 6 og "Bakgrunn" representerer behandling1.

Det katalytiske ribozym inhiberer CAT-aktivitet med gjennomsnitt på 47 %, sammenlignet med gjennomsnitt på 34 % for et antisense ribozym.

Innføring av ribozymbærende gener i planteceller inhiberer aktiviteten av genene som de er targetrettet mot. Videre er inhiberingen større enn for tilsvarende antisense RNA-molekyler .

Disse resultater viser at ribozymer vil være aktive i animalske, plante- eller mikrobielle celler mot et område av target RNA-molekyler.

Virkningsmekanismene for ribozymene i dette eksempel er uklare. F.eks. kan antisense ribozymet irreversibelt hybridisere til et target RNA og katalysere fosfodiester-båndkutting ved ett eller flere selekterte targetseter langs target RNA. Alternativt kan cellulære enzymer vikle opp antisense RNA fra sin targetsekvens, slik at target RNA kuttes opp i to eller flere fragmenter.

EKSEMPEL 9

In vivo aktivitet av ribozymer i animalske celler: Aktiviteten av ribozymer ved inaktivering av et target RNA i mammalceller er demonstrert i dette eksempel.

Materialer og metoder:

De aktive genkonstruksjoner som koder for ribozymer ble transfisert inn i den lett tilgjengelige apenyre-cellelinje COSI ved elektroporering. I denne metode ble 3 x10<6>/ml COSl-celler suspendert i en bufret saltløsning med 10 % FCS (føtalt kalveserum) bragt i kontakt med forskjellige genkonstruksjoner og en elektrisk utladning påsatt for å bevirke elektroporering av DNA inn i cellene. De transfiserte celler ble inkubert ved 37°C i 48 timer i dyrknings-medium før bestemmelse av CAT og luciferaseaktivitet. CAT-genkonstruksjonene ble overført på plasmidet betegnet pTK CAT (Miksicek et al., Cell 46: 283-290, 1986). Dette plasmid var avledet ved innføring av en CAT-gensekvens inn i plasmidet pSV2 slik at det er under kontroll av tymidin-kinasepromoteren av herpes simpleks virus.

Genkonstruksjoner som koder for ribozymer ble overført på plasmidet pSV232A (De Wet et al., Molecular and Cellular Biology 7: 725-737, 1987) inneholdende luciferasegenet fusjonert til SV40 tidlig promoter. DNA-kodende ribozymer ble ligert inn i Xbal-setet ved 3'-enden av luciferasegenet i henhold til standardmetodene til Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, 1982) .

De følgende konstruksjoner ble fremstilt under anvendelse av standardmetodene til Maniatis et al. (Supra): pFC58 - Denne plasmidvektor inneholder DNA som koder for ribozym RzCAT-1 fusjonert til 3'-enden av luciferasegenet i en ikke-funksjonell orientering.

Dette kan avbildes som følger:

hvor 232A refererer til pSV232A-sekvenser, SV40 tidlig refererer til den tidlige promoter av SV40 og liten T er DNA som koder for den lille T mellomliggende sekvens av SV40. Denne konstruksjon resulterer i konstruksjon av et RNA-molekyl som koder for luciferase og ribozymet RzCAT-1, idet det siste er i en orientering slik at det ikke ville ventes at det var katalytisk.

pFC4 - Dette plasmid er det samme som pFC58 med unntagelse

av at RzCAT-1 er erstattet med RzCAT-3.

pFCl-6- Dette plasmid er det samme som pFC58 med unntagelse av at RzCAT-1 er erstattet med RzCAT-3 i sense orienteringen 5'-3'.

pFC2 0 - Dette plasmid er det samme som pFCl-6 med unntagelse av at RzCAT-3 er erstattet med RzCAT-2 med åtte

nukleotidflankerende sekvenser.

pFC12 - Dette plasmid er det samme som pFC2 0 med unntagelse av at ribozymet RzCAT-2 ;inneholder tolv nukleotidflankerende sekvenser.

pFC50 - Dette plasmid inneholder CAT-genet med fire katalytiske ribozymdomener inkludert deri (se eksempel4og fig. 9) i sense orienteringen 5'-3', som ved transkripsjon gir anledning til et inaktivt ribozym.

Dette plasmid kan avbildes som følger:

pF54 - Dette plasmid er det samme som pFC50 med unntagelse av at CAT-genet og ribozymdomenene er i antisense 3'-5'

aktiv orientering.

pFC64 - Dette plasmid deler SV4 0'-promoteren og polyadenyleringssignaler med pFC50 og inneholder villtype CAT-genet uten noen innskutte ribozymdomener. Dette gen er i en antisense orientering og frembringer

således ikke CAT-protein.

pFC65 - Dette plasmid er det samme som pFC64 med unntagelse av at villtype CAT-genet er i sense 5'-3' orienteringen og er således produktivt for CAT-protein.

Bestemmelser:

Luciferaseaktivitet ble bestemt ved hjelp av metodene til

De Wet et al. (Supra). Kort sagt ble COS-celler lysert 48 timer etter transfeksjon, og cellelysatet ble inkubert med luciferin, substratet for luciferase, og luminiscensdetektert under anvendelse av en seintillasjonsteller.

CAT-aktivitet ble også målt under anvendelse av COS-cellelysater (cellelysater ble oppdelt i to, og hver del bestemt enten for luciferase eller CAT-aktivitet), i henhold til metoden til Sleigh, M.J., Anal. Biochem. 156: 251-256 (1986).

I in vivo forsøkene påvirket pFC58 og pFC4 ikke CAT-aktiviteten i transfiserte celler. Denne aktivitet ble betegnet med 100 % CAT-aktivitet og 0 % CAT-undertrykking. CAT-aktiviteten i celler transfisert med andre plasmider ble målt i forhold til pFC58. Prosent av CAT-undertrykkelse ble målt som

normalisert til luciferaseproduksjon. CATtest= CAT~kestem-

melsesresultat for testkonstruksjoner. CAT, . , ,<=>CAT-

J kontroll bestemmelse for kontroilkonstruksjoner (pFC4 og pFC58).

Luciferaseproduksjon er en intern kontroll for elektroporering og gir et mål på ribozymfremstilling inne i hver individuelt elektroporert vevsdyrkningsplate.

Resultater:

Alle behandlinger ble gjennomført i duplikat og en gjennomsnittlig verdi anført.

Behandlinger 5 til 10 ble gjennomført i duplikat og en gjennomsnittlig verdi anført.

Behandlinger ble gjennomført femdobbelt og en gjennomsnitts-verdi gitt.

Hver av behandlingene 13 til 16 ble gjennomført firedobbelt.

Sense CAT-konstruksjonen (behandling 16) medførte høye nivåer av CAT-aktivitet i seg selv og prosent undertrykkelse er derfor ikke anført (NA).

Et antall forsøk ble også gjennomført med TK-promoteren av pTKCAT erstattet med den humane metallotioneinpromoter. Når denne CAT-konstruksjon ble kotransfisert inn i COSl-celler med plasmider som koder for ett eller flere ribozymer ble det iakttatt en markert nedsettelse i CAT-aktiviteten.

De ovennevnte resultater viser klart den in vivo inakti-verende aktivitet av ribozymer i animalske celler.

Mens effektiviteten av ribozymene in vivo antas å skyldes en eller flere katalytiske regioner som er i stand til kutting

av et target RNA kan nærværet av slike regioner i "antisense" RNA-type ribozymer ikke faktisk føre til kutting in vivo hvis hele RNA/antisense RNA-molekylet ikke går i stykker. Uansett om molekylet går i stykker eller ikke, viser imidlertid de

foregående eksempler effektiviteten av ribozymet ved inaktivering av target RNA. Således er oppfinnelsen anvendbar for alle ribozymer med en katalytisk region i stand til å bevirke kutting og en hybridiserende region, uansett om kutting faktisk foregår i target RNA, d.v.s. den hybridiserende region kan være så stor at den bevirker at det kombinerte RNA/ribozym blir stående samlet og forhindrer at target RNA kuttes til separate komponenter selv om den katalytiske region i seg selv er i stand til å bevirke kutting.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert vedat den har formelen:

hvori hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig, hvori hver av (X)nog (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt:sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-1 target sekvens ikke er tilstede i forbindelsen, hvori hver av n og n' representerer et helt tall som definerer antallet ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n' er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing, hvor hver<*>representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, hvori a representerer et helt tall som definerer et antall ribonukleotider med den betingelse at a kan være 0 eller1og hvis 0 er A som er lokalisert 5' til (X)abundet til G lokalisert 3' til (X)a, hvori hver av m og m' representerer et helt tall som er større enn eller lik 1, hvori hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og hvori (X)brepresenterer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)ber tilstede.

2 . Forbindelse, karakterisert vedat den har formelen:

hvori hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig, hvori hver av (X)^-,^ og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen, hvori hver av n og n<1>representerer et helt tall som definerer antall ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n' er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing, hvori hver<*>representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, hvori a representerer et helt tall som definerer et antall ribonukleotider med den betingelse at a kan være 0 eller 1 og hvis 0 er A som er lokalisert 5' til (X)abundet til G lokalisert 3' til (X)a, hvori hver av m og m' representerer et helt tall som er større enn eller lik 1, hvori hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og hvori (X)brepresenterer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med dén betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)ber tilstede.

3. Forbindelse, karakterisert vedat den har formelen:

hvori hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig, hvori hver av (X)n_1og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen, hvori hver av n og n' representerer et helt tall som definerer antall ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n<1>er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing, hvor hver<*>representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, hvori hver av m og m' representerer et helt tall som er større enn eller lik 1, hvori hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og hvori (X)brepresenterer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)ber tilstede.

4. Forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-3,karakterisert vedat summen av n + n<1>er større enn eller lik 14.

5. Forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-4,karakterisert vedat hver av n og n' er større enn 6.

6. Forbindelse, karakterisert vedat den har formelen: 3 ' - [- (Y)r-Q- (Y)s-]2-5' hvori Q representerer en forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-5, hvori hver Y representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig, hvori hver av r og s representerer et helt tall som kan være større enn eller lik 0, og hvori z representerer et helt tall større enn eller lik1.

7. Forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene1-6,karakterisert vedat RNA-targetsekvensen som skal kuttes er en viral RNA-sekvens.

8 . Preparat, karakterisert vedat det omfatter forbindelsen som angitt i ett eller flere av kravene 1-7, i assosiasjon med en agrikulturelt tålbar bærer.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen ifølge ett eller flere av kravene 1-7, karakterisert vedat den omfatter trinnene med: a) ligering inn i en transfervektor omfattende DNA, RNA eller en kombinasjon derav av en nukleotidsekvens tilsvarende den nevnte forbindelse, b) nukleotidsekvensen fra trinn a) transkriberes med en RNA-polymerase, og c) forbindelsen isoleres.

10. Transfervektor, karakterisert vedat den omfatter RNA eller DNA eller en kombinasjon derav inneholdende en nukleotidsekvens som ved transkripsjon gir anledning til forbindelsen som angitt i ett eller flere av kravene 1-7.

11. Preparat, karakterisert vedat det omfatter transfervektoren som angitt i krav 10 i, assosiasjon med en agrikulturelt tålbar bærer.

12. Prokaryotisk eller eukaryotisk celle, karakterisert vedat den omfatter en nukleotidsekvens som er, eller ved transkripsjon gir anledning til, forbindelsen som angitt i ett eller flere av kravene 1-7.

13. Eukaryotisk celle som angitt i krav 12.

14. Plantecelle eller dyrecelle som angitt i krav 13.

15. Fremgangsmåte for inaktivering av en target RNA i en celle, karakterisert vedat den omfatter å kontakte target RNA inne i cellen med forbindelsen som angitt i ett eller flere av kravene 1-7, hvori forbindelsen er i stand til interagering gjennom baseparing med sekvensen av target RNA under betingelser slik at forbindelsen stabilt interagerer gjennom baseparing med target RNA og target RNA kuttes.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15,karakterisert vedat target RNA er et transkript av et gen som er endogent til cellen.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 15,karakterisert vedat target RNA er et transkript av et gen som er eksogent til cellen.

18. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 15-17, karakterisert vedat cellen er en prokaryotisk eller eukaryotisk celle.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 18,karakterisert vedat cellen er en plantecelle eller dyrecelle.

20. Fremgangsmåte for inaktivering av en target RNA i planter, karakterisert vedat den omfatter anvendelse av forbindelsen som angitt i ett eller flere av kravene 1-7 eller av transfervektoren som angitt i krav 10.