ES2601497T3 - Métodos para tratar afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que inhibe MASP-2 por union específica a SEC ID NO:6 para usar en el tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad, o la prevención o el tratamiento de una reacción inflamatoria resultante del trasplante de un órgano o tejido.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para tratar afecciones asociadas con la activacion del complemento dependiente de MASP-2 Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos para inhibir los efectos adversos de la activacion del complemento dependiente de MASP-2.

Antecedentes de la invencion

El sistema del complemento proporciona un mecanismo de accion temprana para iniciar y ampliar la respuesta inflamatoria a la infeccion microbiana y otros ataques agudos (M.K. Liszewski y J.P. Atkinson, 1993, en Fundamental Immunology, Tercera Edicion, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York). Si bien la activacion del complemento proporciona una defensa de primera lmea valiosa contra patogenos potenciales, las actividades del complemento que promueven una respuesta inflamatoria protectora pueden tambien representar una amenaza potencial al hospedante (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). Por ejemplo, los productos proteoltticos C3 y C5 atraen y activan neutrofilos. Estas celulas activadas son indiscriminadas en su liberacion de enzimas destructivas y pueden causar dano organico. Ademas, la activacion del complemento puede causar la deposicion de componentes del complemento ltticos en celulas hospedantes aledanas asf como tambien en dianas microbianas, produciendo la lisis de la celula hospedante.

El sistema del complemento se ha implicado como contribuyente a la patogenesis de diversas enfermedades agudas y cronicas, incluidos infarto de miocardio, revascularizacion que le sigue a accidente cerebrovascular, smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), lesion de reperfusion, choque septicemico, fuga capilar que le sigue a quemaduras termicas, inflamacion post-derivacion cardiopulmonar, rechazo de trasplante, artritis reumatoidea, esclerosis multiple, miastenia grave y enfermedad de Alzheimer. Practicamente en todas estas afecciones, el complemento no es la causa, sino uno de los diversos factores implicados en la patogenesis. No obstante, la activacion del complemento puede ser un mecanismo patologico importante y representa un punto para el control clmico en muchos de estos estados de enfermedad. El reconocimiento cada vez mayor de la importancia de la lesion del tejido mediada por el complemento en una diversidad de estados de enfermedad subraya la necesidad de farmacos eficaces inhibidores del complemento. No se ha aprobado ningun farmaco para uso en seres humanos que se dirija espedficamente e inhiba la activacion del complemento.

Actualmente, esta ampliamente aceptado que el sistema del complemento puede activarse a traves de tres vfas distintas: la via clasica, la via de lectinas y la via alternativa. La via clasica es usualmente desencadenada por la union de un anticuerpo a una partfcula extrana (es decir, un antfgeno) y por lo tanto requiere la exposicion previa a ese antfgeno para la generacion del anticuerpo espedfico. Dado que la activacion de la via clasica esta asociada con el desarrollo de una respuesta inmune, la via clasica es parte del sistema inmunologico adquirido. En contraste, tanto la ruta de las lectinas como la ruta alternativa son independientes de la inmunidad clonal y forman parte del sistema inmunologico innato.

La primera etapa en la activacion de la via clasica es la union de una molecula de reconocimiento espedfica, C1q, a IgG e IgM de union a antfgenos. La activacion del sistema del complemento produce la activacion secuencial de cimogenos de serina proteasa. La C1q esta asociada con las proenzimas de serina proteasa C1r y C1s como un complejo llamado C1 y, tras la union de C1q a un complejo inmune, a la escision autoproteolttica del sitio Arg-Ile de C1r le sigue la activacion por C1r de C1s, que adquiere asf la capacidad de escindir C4 y C2. La escision de C4 en dos fragmentos, denominados C4a y C4b, permite que los fragmentos C4b formen enlaces covalentes con los grupos hidroxilo o amino adyacentes y la subsiguiente generacion de convertasa C3 (C4b2b) a traves de la interaccion no covalente con el fragmento C2b de C2 activada. La convertasa C3 (C4b2b) activa C3, lo que lleva a la generacion de la convertasa C5 (C4b2b3b) y a la formacion del complejo de ataque a la membrana (C5b-9) que puede causar lisis microbiana. Las formas activadas de C3 y C4 (C3b y C4b) se depositan covalentemente en las superficies diana exogenas, que son reconocidas por los receptores del complemento en multiples fagocitos.

Independientemente, el primer paso en la activacion del sistema del complemento por la via de lectinas es tambien la union de moleculas de reconocimiento espedficas, seguida por la activacion de serina proteasas asociadas. No obstante, en lugar de la union de complejos inmunes por C1q, las moleculas de reconocimiento en la via de lectinas son protemas unidas a carbohidratos (lectina de union a manano (MBL), H-ficolina, M-ficolina y L-ficolina) (J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, 2002; Holmskov et al, Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). Ikeda et al. fueron los primeros en demostrar que, al igual que C1q, la MBL podfa activar el sistema del complemento tras la union a eritrocitos recubiertos con manano en un modo dependiente de C4 (K. Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987). La MBL, un miembro de la familia de la protema colectina, es una lectina dependiente del calcio que se une a carbohidratos con grupos 3 y 4-hidroxi orientados en el plano ecuatorial del anillo piranosa. Por lo tanto, los ligandos prominentes para MBL son D-manosa y N-acetil-D- glucosamina, mientras que los carbohidratos que no cumplen este requerimiento esterico tienen afinidad indetectable hacia MBL (Weis, W.I., et al., Nature 360:127-134, 1992). La interaccion entre MBL y azucares

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monovalentes es extremadamente debil, con constantes de disociacion tipicamente en el intervalo 2 mM. La MBL logra union firme y espedfica a ligandos de glicano por interaccion con multiples residuos de monosacaridos simultaneamente (Lee, R.T., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, 1992). La MBL reconoce los patrones del carbohidrato que comunmente decoran a microorganismos tales como bacterias, levadura, parasitos y ciertos virus. En contraste, la MBL no reconoce la D-galactosa ni el acido sialico, los penultimos y ultimos azucares que usualmente decoran glucoconjugados complejos "maduros" presentes en glucoprotemas de la superficie celular y en el plasma de mairnferos. Se cree que esta especificidad de union ayuda a proteger contra la autoactivacion. No obstante, la MBL se une con gran afinidad a grupos de glicanos “precursores” de gran contenido de manosa en glucoprotemas y glucolfpidos unidos por N secuestrados en la reticula endoplasmatica y en el Golgi de celulas mamfferas (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, 1982). En consecuencia, las celulas danadas son dianas potenciales para la activacion de la via de lectinas mediante la union a la MBL.

Las ficolinas poseen un tipo distinto de dominio de lectina que la MBL, llamado dominio de tipo fibrinogeno. Las ficolinas se unen a residuos de azucar en un modo independiente del Ca++. En seres humanos, se han identificado tres clases de ficolinas, L-ficolina, M-ficolina y H-ficolina. Ambas ficolinas del suero, L-ficolina y H-ficolina, tienen en comun una especificidad hacia N-acetil-D-glucosamina; no obstante, la H-ficolina tambien se une a N-acetil-D- galactosamina. La diferencia en la especificidad del azucar de L-ficolina, H-ficolina y MBL significa que las diferentes lectinas pueden ser complementarias y dirigir glucoconjugados diferentes aunque superpuestos. Este concepto es respaldado por el informe reciente que indica que, de las lectinas conocidas en la via de lectinas, solamente L- ficolina se une espedficamente al acido lipoteicoico, un glucoconjugado de la pared celular que se halla en todas las bacterias grampositivas (Lynch, N.J., et al., J. Immunol. 172:1198-1202, 2004). Las colectinas (es decir, MBL) y las ficolinas no portan similitud importante en la secuencia de aminoacidos. No obstante, los dos grupos de protemas tienen organizaciones de dominios similares y, al igual que C1q, se agrupan en estructuras oligomericas, que maximizan la posibilidad de la union a multiples sitios. Las concentraciones sericas de MBL son altamente variables en poblaciones sanas, y esto es controlado geneticamente por el polimorfismo/mutaciones tanto en las regiones promotoras con codificantes del gen de MBL. Como protema de fase aguda, la expresion de MBL ademas aumenta durante la inflamacion. La L-ficolina esta presente en el suero a concentraciones similares a la MBL. Por lo tanto, la rama de L-ficolina de la via de lectinas es potencialmente comparable con la rama de MBL en cuanto a fuerza. La MBL y las ficolinas tambien pueden funcionar como opsoninas, que requieren la interaccion de estas protemas con receptores de fagocitos (Kuhlman, M., et al., J. Exp. Mecl. 169:1733, 1989; Matsushita, M., et al,. J. Biol. Chem. 271:2448-54, 1996). No obstante, las identidades del receptor o los receptores en las celulas fagodticas no han sido establecidas.

La MBL humana forma una interaccion espedfica y de gran afinidad a traves de su dominio de tipo colageno con serina proteasas de tipo C1r/C1s, denominadas serina proteasas asociadas a MBL (MASP). Hasta la fecha, se han descrito tres MASP. Primero, se identifico una "MASP" de una sola enzima y se caracterizo como la enzima responsable del inicio de la cascada del complemento (es decir, escision de C2 y C4) (Ji, Y.H., et al., J. Immunol. 150:571-578, 1993). Posteriormente, resulto que la MASP es de hecho una mezcla de dos proteasas: MASP-1 y MASP-2 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510, 1997). No obstante se demostro que el complejo MBL-MASP-2 solo es suficiente para la activacion del complemento (Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165:2093-2100, 2000). Asimismo, solamente la MASP-2 escindio C2 y C4 en altas tasas (Ambrus, G., et al., J. Immunol. 170:1374-1382, 2003). Por consiguiente, la MASP-2 es la proteasa responsable de activar C4 y C2 para generar la convertasa C3, C4b2b. Esta es una diferencia importante del complejo C1, en donde la accion coordinada de dos serina proteasas espedficas (C1r y C1s) conduce a la activacion del sistema del complemento. Recientemente, se aislo una tercera proteasa nueva, MASP-3 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 y MASP-3 son productos alternativamente empalmados del mismo gen. Las funciones biologicas de MASP-1 y MASP-3 permanecen irresueltas.

Las MASP son organizaciones de dominios identicos a aquellos de C1r y C1s, los componentes enzimaticos del complejo C1 (Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, 2000). Estos dominios incluyen un dominio morfogenico veg/oseo de erizo de mar/C1r/C1s N-terminal (CUB), un dominio de tipo factor de crecimiento epidermico, un segundo dominio CUB, un tandem de los dominios de la protema de control del complemento y un dominio de serina proteasa. Como en las C1 proteasas, la activacion de MASP-2 ocurre a traves de la escision de un enlace Arg-Ile adyacente al mismo dominio de la serina proteasa, que divide la enzima en cadenas A y B unidas a disulfuro, en donde la ultima consiste en el dominio de serina proteasa. Recientemente, se describio una deficiencia geneticamente determinada de MASP-2 (Stengaard-Pedersen, K., et al., New Eng. J. Mecl. 349:554-560, 2003). La mutacion de nucleotidos sencillos conduce a un intercambio Asp-Gly en el dominio CUBI y torna la MASP-2 incapaz de unirse a MBL.

La MBL esta tambien asociada con una protema no enzimatica denominada protema asociada a MBL de 19 kDa (MAp19) (Stover, C.M., J. Immunol. 162:3481-90, 1999) o protema pequena asociada a MBL (sMAP) (Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863, 1999). La MAp19 se forma por el empalme alternativo del producto genico de MASP 2 y comprende los primeros dos dominios de MASP-2, seguidos por una secuencia extra de cuatro aminoacidos unicos. Los genes de MASP 1 y MASP 2 estan ubicados en los cromosomas 3 y 1, respectivamente (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466, 2002).

Varias lmeas de evidencia sugieren que hay diferentes complejos de MBL-MASP y una gran fraccion de las MASP

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totales en el suero no forma complejo con MBL (Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887, 2000). Tanto la ficolina H como la L estan asociadas con MASp y activan la via del complemento de lectinas, al igual que la MBL (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). La via de lectinas y la via clasica forman una convertasa C3 (C4b2b) y las dos v^as convergen en esta etapa.

Se cree en gran medida que la via de lectinas tiene una funcion importante en la defensa del hospedante contra infecciones. Los datos solidos de la participacion de la MBL en la defensa del hospedante provienen del analisis de pacientes con niveles sericos reducidos de MBL funcional (Kilpatrick, D.C., Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, 2002). Dichos pacientes exhiben susceptibilidad a infecciones fungicas y bacterianas recurrentes. Estos smtomas por lo general son evidentes de manera temprana en la vida, durante una obvia vulnerabilidad a medida que se disipa la titulacion de anticuerpos derivados de la madre, pero antes de que se desarrolle un repertorio completo de respuestas de anticuerpos. Este smdrome a menudo proviene de mutaciones en varios sitios en la porcion de colageno de la MBL, que interfieren con la formacion correcta de oligomeros de MBL. No obstante, ya que la MBL puede funcionar como una opsonina independiente del complemento, no se sabe hasta que grado el aumento de susceptibilidad a infecciones se debe a la activacion del complemento.

Si bien existen muchos datos que implican tanto a la via del complemento clasica como a la alternativa en la patogenesis de enfermedades humanas no infecciosas, la funcion de la via de lectinas esta ahora comenzando a ser evaluada. Estudios recientes aportan datos que indican que la activacion de la via de lectinas puede ser responsable de la activacion del complemento y de la inflamacion relacionada en lesion de isquemia/ reperfusion. Collard et al. (2000) indicaron que las celulas endoteliales cultivadas, sometidas a estres oxidativo se unen a MBL y exhiben deposicion de C3 tras la exposicion a suero humano (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, 2000). A su vez, el tratamiento de sueros humanos con anticuerpos monoclonales anti-MBL bloqueantes inhibio la union a MBL y la activacion del complemento. Estos hallazgos se extendieron a un modelo de rata de isquemia de miocardio- reperfusion en el que las ratas tratadas con anticuerpo bloqueante dirigido contra MBL de rata exhibieron significativamente menos dano del miocardio tras la oclusion de una arteria coronaria, que las ratas tratadas con un anticuerpo control (Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413-1418, 2001). El mecanismo molecular de la union de MBL al endotelio vascular despues de estres oxidativo no esta del todo claro; un estudio reciente sugiere que la activacion de la via de lectinas despues del estres oxidativo puede ser mediada por la union de MBL a citoqueratinas endoteliales vasculares y no a glucoconjugados (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, 2001). Otros estudios han implicado a la via clasica y a la via alternativa en la patogenesis de la lesion de isquemia/reperfusion, y la funcion de la via de lectinas en esta enfermedad sigue siendo controvertida (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

En contraste con las vfas clasica y de lectinas, no se han hallado iniciadores de la via alternativa que cumplan las funciones de reconocimiento que efectuan la C1q y las lectinas en las otras dos vfas. Actualmente se acepta ampliamente que la via alternativa es desencadenada espontaneamente por superficies externas y anormales (bacterias, levadura, celulas infectadas por virus o tejido danado). Hay cuatro protemas plasmaticas directamente implicadas en la via alternativa: C3, factores B y D y properdina. La generacion proteolftica de C3b de C3 nativo se requiere para que funcione la via alternativa. Dado que la convertasa C3 de la via alternativa (C3bBb) contiene C3b como una subunidad esencial, la cuestion con respecto al origen de la primera C3b mediante la via alternativa ha presentado un enigma y ha promovido una investigacion considerable.

C3 pertenece a la familia de protemas (junto con C4 y a-2 macroglobulina) que contienen una rara modificacion post- traduccion conocida como enlace tioester El grupo tioester esta compuesto por una glutamina cuyo grupo carbonilo terminal esta unido al grupo sulfhidrilo de una cistema a tres aminoacidos de distancia. Este enlace es inestable y el grupo carbonilo electrofilo de la glutamina puede formar un enlace covalente con otras moleculas mediante los grupos hidroxilo o amino. El enlace tioester es razonablemente estable cuando se secuestra dentro de un bolsillo hidrofilo de C3 intacta. Sin embargo, la escision proteolftica de C3 a C3a y C3b resulta en la exposicion del enlace tioester altamente reactivo en C3b y mediante este mecanismo, C3b se acopla covalentemente a una diana. Ademas de su funcion bien documentada en la union covalente de C3b a dianas del complemento, tambien se cree que el tioester de C3 tiene una funcion pivotal en desencadenar la via alternativa. Segun la teona “poco avanzada” y ampliamente aceptada, la via alternativa es iniciada por la generacion de una convertasa de fase fluida, iC3Bb, que se forma a partir de C3 con tioester hidrolizado (iC3; C3(H2O)) y factor B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, 1984). iC3 de tipo C3b se genera a partir de C3 nativa mediante hidrolisis espontanea lenta del tioester interno en la protema (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154:856-867, 1981). A traves de la actividad de la convertasa iC3Bb, las moleculas de C3b se depositan en la superficie diana, iniciando de este modo la via alternativa.

Se sabe muy poco acerca de los iniciadores de activacion de la via alternativa. Se cree que los activadores incluyen paredes de celulas de levadura (cimosano), muchos polisacaridos puros, eritrocitos de conejo, ciertas inmunoglobulinas, virus, hongos, bacterias, celulas tumorales animales, parasitos y celulas danadas. La unica caractenstica en comun con estos activadores es la presencia de carbohidrato, pero la complejidad y variedad de las estructuras de los carbohidratos ha hecho diffcil que se puedan establecer los determinantes moleculares compartidos, los cuales se reconocen.

La via alternativa puede tambien proporcionar un potente bucle de ampliacion para la convertasa de las via C3 de

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lectinas/clasica (C4b2b), ya que cualquier C3b generado puede participar con el factor B en la formacion de la convertasa C3 de la via alternativa (C3bBb) adicional. La convertasa C3 de la v^a alternativa se estabiliza mediante la union de properdina. La properdina extiende seis a diez veces la semivida de la convertasa C3 de la v^a alternativa. La adicion de C3b a la convertasa C3 conduce a la formacion de la convertasa C5 de la via alternativa.

Se ha pensado que las tres vfas (es decir, la clasica, la de lectinas y la alternativa) convergen en C5, que se escinde para formar productos con multiples efectos proinflamatorios. Se ha hecho referencia a la via de convergencia como la via del complemento terminal. C5a es la anafilatoxina mas potente, que induce alteraciones en el musculo liso y en el tono vascular, asf como tambien permeabilidad vascular. Es tambien una poderosa quimiotaxina y un activador de neutrofilos y monocitos. La activacion celular mediada por C5a puede ampliar significativamente las respuestas inflamatorias, induciendo la liberacion de multiples mediadores inflamatorios adicionales, incluidas citocinas, enzimas hidrolfticas, metabolitos de acido araquidonico y especies de oxfgeno reactivas. La escision de C5 conduce a la formacion de C5b-9, tambien conocida como el complejo de ataque a la membrana (MAC). Existe ahora una fuerte evidencia de que la deposicion de MAC sublftica puede cumplir una funcion importante en la inflamacion, ademas de su funcion como complejo formador de poros ltticos.

Compendio de la invencion

La presente invencion proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que inhibe MASP-2 por union espedfica a la SEC ID NO:6 para usar en el tratamiento de la degeneracion macular asociada al envejecimiento, o la prevencion o el tratamiento de una reaccion inflamatoria debida a un trasplante de organos o tejido.

Se describe en la presente invencion un metodo para inhibir los efectos adversos de la activacion del complemento dependiente de mAsP-2 en un sujeto vivo. El metodo incluye la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP- 2. En este contexto, la frase "activacion del complemento dependiente de MASP-2" se refiere a la activacion del complemento de la ruta alternativa que ocurre mediante el sistema MASP-2 dependiente de lectina. El agente inhibidor de MASP-2 puede inhibir la activacion del complemento mediante el sistema MASP-2 dependiente de lectina sin inhibir sustancialmente la activacion del complemento a traves del sistema dependiente de C1q clasico, de modo tal que el sistema dependiente de C1q permanece funcional.

El agente inhibidor de MASP-2 puede ser un anticuerpo anti-MASP-2 o su fragmento. El anticuerpo anti-MASP-2 puede tener la funcion efectora reducida. En algunas realizaciones, el agente inhibidor de MASP-2 es un peptido inhibidor de MASP-2 o un inhibidor de MASP-2 no peptfdico.

Tambien se describen composiciones para inhibir los efectos adversos de la activacion del complemento dependiente de MASP-2, que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Tambien se describen metodos para elaborar un medicamento para uso en la inhibicion de los efectos adversos de la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en sujetos vivos que lo necesitan, que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehfculo farmaceutico. Tambien se proporcionan metodos para elaborar medicamentos para uso en la inhibicion de la activacion del complemento dependiente de MASP-2 para el tratamiento de cada una de las afecciones, enfermedades o trastornos que se describen a continuacion en este documento.

Los metodos, composiciones y medicamentos descritos en este documento son utiles para inhibir los efectos adversos de la activacion del complemento dependiente de MASP-2 in vivo en sujetos mamfferos, incluidos seres humanos que sufren una afeccion o lesion patologica aguda como se describira en mas detalle en la presente invencion. Dichas afecciones o lesiones incluyen, aunque sin limitarse a ello, la activacion del complemento mediada por MASP-2 en trastornos autoinmunes asociados y/o en afecciones inflamatorias.

En la presente memoria se describen metodos para el tratamiento de lesiones de reperfusion por isquemia, tratando a un sujeto que experimenta una reperfusion isquemica, lo que incluye, de manera no taxativa, despues de la reparacion de un aneurisma aortico, derivacion cardiopulmonar, renastomosis vascular en relacion con, por ejemplo, trasplante de organo (p. ej., de corazon, pulmon, hugado, rinon) y/o reimplante de una extremidad/dfgito, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, reanimacion hemodinamica despues de procedimientos de choque y/o quirurgicos, con una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehfculo farmaceutico.

En la presente memoria se describen metodos para la inhibicion de aterosclerosis, tratando a un sujeto que sufre de o es propenso a aterosclerosis, con una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehfculo farmaceutico.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que experimenta una afeccion vascular que incluye, sin limitacion, afecciones cardiovasculares, afecciones cerebrovasculares, afecciones perifericas (p. ej. musculoesqueleticas) afecciones vasculares, afecciones renovasculares, vasculares mesentericas/entericas y revascularizacion a trasplantes y/o reimplantes, tratando a dichos pacientes con una cantidad terapeuticamente eficaz de agente inhibidor de MASP-2. Dichas afecciones incluyen, sin limitacion, el tratamiento de: vasculitis, incluida nefritis purpura de Henoch-Schonlein, vasculitis

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asociada a lupus eritematoso sistemico, vasculitis asociada a artritis reumatoidea (tambien llamada artritis reumatoidea maligna), vasculitis del complejo inmunologico y enfermedad de Takayasu; cardiomiopatfa dilatada; angiopatfa diabetica; enfermedad de Kawasaki (arteritis); embolia gaseosa venosa (vGe); y/o restenosis que sigue a la colocacion de un stent, aterectoirna rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutanea (PTCA).

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece trastornos gastrointestinales inflamatorios, incluidos, aunque sin limitarse a ello, pancreatitis, diverticulitis y trastornos intestinales que incluyen enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y smdrome de intestino irritable.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una afeccion pulmonar, lo que incluye, aunque sin limitacion, smdrome de dificultad respiratoria aguda, lesion pulmonar aguda relacionada con una transfusion, lesion pulmonar aguda por isquemia/reperfusion, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, asma, granulomatosis de Wegener, enfermedad antimembrana basal glomerular (enfermedad de Goodpasture), smdrome de aspiracion de meconio, smdrome de bronquiolitis obliterante, fibrosis pulmonar idiopatica, lesion pulmonar aguda secundaria a quemadura, edema pulmonar no cardiogenico, depresion respiratoria relacionada con transfusion y enfisema.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que se ha sometido, se esta sometiendo o se sometera a un procedimiento de reperfusion extracorporeo, incluidos, aunque sin limitarse a ello, hemodialisis, plasmaferesis, leucoferesis, oxigenacion por membrana extracorporea (ECMO), precipitacion de LDL por oxigenacion por membrana extracorporea inducida por heparina (HELP) y derivacion cardiopulmonar (CPB).

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una afeccion musculoesqueletica, lo que incluye, aunque sin limitarse a ello, artrosis, artritis reumatoidea, artritis reumatoidea juvenil, gota, artropatfa neuropatica, artritis soriasica, espondilitis anquilosante u otras espondiloartropatfas y artropatfas cristalinas o lupus eritematoso sistemico (SLE).

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece afecciones renales que incluyen, aunque sin limitarse a ello, glomerulonefritis esangioproliferativa, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis membranoproliferativa (glomerulonefritis mesangiocapilar), glomerulonefritis post- infecciosa aguda (glomerulonefritis postestreptococica), glomerulonefritis crioglobulinemica, nefritis por lupus, nefritis por purpura de Henoch-Schonlein o nefropatfa de IgA.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una afeccion de la piel que incluye, aunque sin limitacion, dermatosis bullosa autoinmune, espongiosis eosinofflica, penfigoide bulloso, epidermolisis bullosa adquirida y herpes gestacional, y otros trastornos de la piel, o provenientes de una lesion por quemadura termica o qrnmica que implica fuga capilar.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que ha recibido un trasplante de organo u otro tejido, lo que incluye, aunque sin limitarse a ello, alotrasplante o xenotrasplante de organos enteros (p.ej., rinon, corazon, tugado, pancreas, pulmon, cornea, etc.) o injertos (p. ej., valvulas, tendones, medula osea, etc.).

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece un trastorno o lesion del sistema nervioso central o un trastorno o lesion del sistema nervioso periferico que incluye, sin limitacion, esclerosis multiple (MS), miastenia grave (MG), enfermedad de Huntington (Hd), esclerosis lateral amiotrofica (ALS), smdrome de Guillain Barre, reperfusion que le sigue a accidente cerebrovascular, discos degenerativos, traumatismo cerebral, enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Alzheimer (AD), smdrome de Miller-Fisher, traumatismo cerebral y/o desmielinacion por hemorragia y meningitis.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece un trastorno de la sangre que incluye, aunque sin limitarse a ello, septicemia o una afeccion que resulta de septicemia, incluidos, sin limitacion, septicemia severa, choque septicemico, smdrome de dificultad respiratoria aguda resultante de septicemia y smdrome de respuesta inflamatoria sistemica. Se dan a conocer metodos relacionados para el tratamiento de otros trastornos de la sangre, incluido choque hemorragico, anemia hemolttica, purpura tromobictopenica trombotica autoinmune (TTP), smdrome uremico hemolttico (HUS) u otras afecciones destructivas de la medula/sangre.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece una afeccion urogenital que incluye, aunque sin limitarse a ello, enfermedad de vejiga dolorosa, enfermedad de vejiga sensorial, cistitis abacteriana cronica y cistitis intersticial, esterilidad masculina y femenina, disfuncion placentaria y aborto espontaneo y pre-eclampsia.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece diabetes no obesa (diabetes de tipo 1 o diabetes mellitus insulinodependiente) o complicaciones de angiopatfa, neuropatfa o retinopatfa por diabetes de tipo 1 o de tipo 2 (del adulto).

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Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que recibe tratamiento de quimioterapia y/o radioterapia, incluido sin limitacion el tratamiento de afecciones cancerosas, administrando un inhibidor de MASP-2 a dicho paciente en forma periquimioterapeutica o por perirradioterapia, es decir, antes y/o durante y/o despues de la administracion de agente(s) quimioterapeutico(s) y/o radioterapia. La administracion de la terapia periquimoterapeutica o por perirradioterapia de inhibidores de MASP-2 puede ser util para reducir los efectos colaterales de la terapia quimoterapeutica o la radioterapia. Tambien se describen metodos para el tratamiento de malignidades, administrando un agente inhibidor de MASP-2 en un vehmulo farmaceuticamente aceptable a un paciente que sufre una malignidad.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece un trastorno endocrino, administrando a dicho sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehmulo farmaceutico. Las afecciones sujetas al tratamiento de acuerdo con la presente invencion incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, tiroiditis de Hashimoto, estres, ansiedad y otros trastornos hormonales potenciales que implican la liberacion regulada de prolactina, factor de crecimiento o factor de crecimiento de tipo insulina y adrenocorticotropina de la glandula hipofisis.

Se describen metodos para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto que padece degeneracion macular relacionada con la edad u otra afeccion oftalmologica mediada por el complemento, administrando una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehmulo farmaceutico a un sujeto que padece dicha afeccion.

Breve descripcion de los dibujos

Los aspectos precedentes y muchas de las ventajas concomitantes de la presente invencion se apreciaran mas facilmente a medida que los mismos se entiendan mejor por referencia a la siguiente descripcion detallada tomada junto con los dibujos adjuntos, en donde:

La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra el nuevo descubrimiento de que la nueva via del complemento alternativa requiere la activacion de MASP-2 dependiente de la via de lectinas para la activacion del complemento;

La Figura 2 es un diagrama que ilustra la estructura genomica de la MASP-2 humana;

La Figura 3A es un diagrama esquematico que ilustra la estructura de dominio de la protema MASP-2 humana;

La Figura 3B es un diagrama esquematico que ilustra la estructura de dominio de la protema MAp19 humana;

La Figura 4 es un diagrama que ilustra la estrategia de inactivacion de genes de MASP-2 murinos;

La Figura 5 es un diagrama que ilustra el constructo de minigen de MASP-2;

La Figura 6A presenta resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 produce la perdida de la activacion de C4 mediada por la via de lectinas segun lo medido por la falta de deposicion de C4b en manano;

La Figura 6B presenta resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 produce la perdida de la activacion de C4 mediada por la via de lectinas segun lo medido por la deposicion de C4b en cimosano;

La Figura 6C presenta resultados que demuestran niveles relativos de activacion de C4 en muestras de suero obtenidas de MASP-2+/-; MASP-2-/- y de cepas de tipo salvaje segun lo medido por deposicion de C4b en manano y en cimosano;

La Figura 7A presentas resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 produce la perdida de activacion de C3 mediada por la via de lectinas y mediada por la via alternativa, segun lo medido por la falta de deposicion de C3b en manano;

La Figura 7B presenta resultados que demuestran que la deficiencia de MASP-2 produce la perdida de la activacion de C3 mediada por la via de lectinas y por la via alternativa, segun lo medido por la falta de deposicion de C3b en cimosano;

La Figura 8 presenta resultados que demuestran que la adicion de MASP-2 recombinante de murino a muestras de suero MASP-2-/- recupera la activacion de C4 mediada por la via de lectinas in un modo dependiente de la concentracion de protemas, segun lo medido por la deposicion de C4b en manano;

La Figura 9 presenta resultados que demuestran que la via clasica es funcional en la cepa de MASP-2-/-; y

La Figura 10 presenta resultados que demuestran que el sistema de activacion del complemento dependiente de MASP-2 se activa en la fase de isquemia/reperfusion que le sigue a la reparacion de un aneurisma aortico abdominal.

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Descripcion de la lista de secuencias

SEC ID NO:1 ADNc de MAp19 humana

SEC ID NO:2 protema MAp19 humana (con Kder)

SEC ID NO:3 protema MAp19 humana (madura)

SEC ID N0:4 ADNc de MASP-2 humana

SEC ID N0:5 protema MASP-2 humana (con Ifder)

SEC ID NO:6 protema MASP-2 humana (madura)

SEC ID NO:7 ADNg de MASP-2 humana (exones 1-6)

AN^GENOS: (CON REFERENCIA A LA PROTE^NA MADURA MASP-2)

SEC ID NO:8 secuencia CUBI (aa 1-121)

SEC ID NO:9 secuencia CUBEGF (aa 1-166)

SEC ID NO: 10 CUBEGFCUBII (aa 1-293)

SEC ID NO: 11 region EGF (aa 122-166)

SEC ID NO: 12 dominio de serina proteasa (aa 429 - 671)

SEC ID NO: 13 dominio de serina proteasa inactivo (aa 610-625 con Ser618 para la mutacion Ala)

SEC ID NO: 14 TPLGPKWPEPVFGRL (peptido CUBI)

SEC ID NO: 15

TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLC GQ (peptido CUBI)

SEC ID NO: 16 TFRSDYSN (nucleo de la region de union a MBL)

SEC ID NO: 17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (region de union a MBL) SEC ID NO: 18 IDECQVAPG (PEPTIDO EGF)

SEC ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (nucleo de la region de union a serina proteasa) INHIBIDORES DE PEPTIDOS:

SEC ID N0:20 ADNc de longitud total MBL SEC ID NO:21 protema de longitud total MBL SEC ID NO:22 OGK-X-GP (union de consenso)

SEC ID NO:23 OGKLG SEC ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G SEC ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO SEC ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG SEC ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (h-ficolina humana)

SEC ID NO:28

GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPN GAOGEO (ficolina humana p35)

SEC ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (sitio de escision C4)

INHIBIDORES DE EXPRESION:

SEC ID N0:30 ADNc del dominio CUBI-EGF (nucleotidos 22-680 de SEC ID NO:4)

SEC ID NO:31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'

Nucleotidos 12-45 de SEC ID NO:4 incluido el sitio de inicio de la traduccion MASP-2 (sentido)

SEC ID NO:32

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5 'G AC ATT ACCTTCCGCTCCG ACTCC A ACG AG A AG3'

Nucleotidos 361-396 de SEC ID NO:4 que codifican una region que comprende la union al sitio de MBL,MASP-2 (sentido)

SEC ID NO:33

5 AGC AGCCCTG A AT ACCC ACGGCCGT ATCCC A A A3'

Nucleotidos 610-642 de SEC ID NO:4 que codifican una region que comprende el dominio CUBII CEBADORES DE CLONACION:

SEC ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (5' PCR para CUB)

SEC ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (3' PCR PARA CUB)

SEC ID NO:36 GGA ATTCCT AC AGGGCGCT (3' PCR PARA CUBIEGF) SEC ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (3' PCR PARA CUB IEGFCUBII)

SEC ID NOS:38-47 son cebadores de clonacion para el anticuerpo humanizado

SEC ID NO:48 es un enlace peptidico 9 aa

VECTOR DE EXPRESION:

SEC ID NO:49 es el inserto del minigen MASP-2

SEC ID NO: 50 es el ADNc de MASP-2 murina

SEC ID NO: 51 es la protema MASP-2 murina (con lfder)

SEC ID NO: 52 es la protema MASP-2 murina madura

SEC ID NO: 53 ADNc de MASP-2 de rata

SEC ID NO: 54 es la protema MASP-2 de rata (con lfder)

SEC ID NO: 55 es la protema MASP-2 de rata madura

SEC ID NO: 56-59 son los oligonucleotidos para mutagenesis del sitio dirigido de MASP-2 humana que se usan para generar MASP-2A humana

SEC ID NO: 60-63 son los oligonucleotidos para mutagenesis de sitio dirigido de MASP-2 murina que se usan para generar MASP-2A murina

SEC ID NO: 64-65 son los oligonucleotidos para mutagenesis de sitio dirigido de MASP-2 de rata que se usan para generar MASP-2A de rata

Descripcion detallada

La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de los presentes inventores de que la MASP-2 es necesaria para iniciar la activacion de la via del complemento alternativa. A traves del uso de un modelo de raton con genes inactivados de MASP-2-/-, los presentes inventores han demostrado que es posible inhibir la activacion de la via del complemento alternativa mediante la via de MASP-2 mediada por lectinas, dejando la via clasica intacta, estableciendo asf la activacion de MASP-2 dependiente de lectinas como un requerimiento para la activacion del complemento alternativa en ausencia de la via clasica. La presente invencion describe tambien el uso de MASP-2 como diana terapeutica para inhibir la lesion celular asociada con la activacion de la via del complemento alternativa mediada por lectinas, dejando intacto el componente de la via clasica (dependiente de C1q) del sistema inmunologico.

I. Definiciones

A menos que se defina espedficamente en este documento, todos los terminos utilizados en la presente memoria tienen el significado que entendena el experto en la tecnica de la presente invencion. Las siguientes definiciones se proveen con fines de claridad con respecto a los terminos que se utilizan en la memoria y en las reivindicaciones para describir la presente invencion.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "activacion del complemento dependiente de MASP-2" se refiere a la activacion del complemento de la ruta alternativa que ocurre mediante la activacion de MASP-2 dependiente de lectina.

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Tal como se emplea en la presente memoria, el termino 'Ma alternativa" se refiere a la activacion del complemento que es desencadenada, por ejemplo, por cimosano de paredes de celulas de hongos y levadura, lipopolisacarido (LPS) de membranas exteriores gramnegativas y eritrocitos de conejo, como tambien de muchos polisacaridos puros, eritrocitos de conejo, virus, bacterias, celulas tumorales animales, parasitos y celulas danadas, y que tradicionalmente se ha cre^do que surge de la generacion proteolftica espontanea de C3b del factor del complemento C3.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "via de lectinas" se refiere a la activacion del complemento que ocurre mediante la union espedfica de protemas de union a los carbohidratos del suero y no del suero, incluidas lectina de union a manano (MBL) y ficolinas.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "via clasica" se refiere a la activacion del complemento que es desencadenada por el anticuerpo unido a una partmula extrana y que requiere la union de la molecula de reconocimiento C1q.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "agente inhibidor de MASP-2" se refiere a cualquier agente que inhibe o actua con la MASP-2 e inhibe eficazmente la activacion del complemento dependiente de MASP-2, incluidos los anticuerpos anti-MASP-2 y sus fragmentos de union a MASP-2, peptidos naturales y sinteticos, moleculas pequenas, receptores de MASP-2 solubles, inhibidores de expresion e inhibidores naturales aislados. Los agentes de inhibicion de MASP-2 utiles en el metodo de la invencion pueden reducir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 por mas de 20%, tal como mas de 50%, tal como mas de 90%. En una realizacion, el agente inhibidor de MASP-2 reduce la activacion del complemento dependiente de MASP-2 por mas de 90% (es decir, resultando en la activacion del complemento de MASP-2 de solamente 10% o menos).

Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "anticuerpo" abarca anticuerpos y sus fragmentos de anticuerpos, derivados de cualquier mairnfero que produzca anticuerpos (p. ej., raton, rata, conejo y primate, incluidos seres humanos), que se une espedficamente a polipeptidos de MASP-2 o sus porciones. Los anticuerpos ilustrativos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes; anticuerpos multiespedficos (p. ej., anticuerpos biespedficos); anticuerpos humanizados; anticuerpos murinos; anticuerpos quimericos, anticuerpos monoclonales de raton-humanos, de raton-primate, de primate-humano; y anticuerpos anti-idiotipo, y pueden ser cualquier molecula intacta o sus fragmentos.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porcion derivada de o relacionada con un anticuerpo anti-MASP-2 de longitud total, que en general incluye la union al antfgeno o su region variable. Los ejemplos ilustrativos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y Fv, fragmentos scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Tal como se emplea en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo "Fv" o "scFv monocatenario" comprende los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en donde estos dominios estan presentes en una cadena de polipeptidos sencilla. En general, el polipeptido Fv ademas comprende un enlazador de polipeptidos entre los dominios Vh y Vl, que permite que el scFv forme la estructura deseada para union del antfgeno.

Tal como se emplea en la presente memoria, un "anticuerpo quimerico" es una protema recombinante que contiene los dominios variables y regiones determinantes de complementaridad derivadas de un anticuerpo de una especie no humana (p. ej., roedor), mientras el resto de la molecula de anticuerpos deriva de un anticuerpo humano.

Tal como se emplea en la presente memoria, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo quimerico que comprende una secuencia minima que conforma regiones determinantes de complementaridad espedficas de inmunoglobulina humana que es trasplantada en un marco de anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son protemas tfpicamente recombinantes en las que solamente las regiones determinantes de complementaridad del anticuerpo son de origen no humano.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "lectina de union a manano" ("MBL") es equivalente a protema de union a manano ("MBP").

Tal como se emplea en la presente memoria, el "complejo de ataque a la membrana" ("MAC") hace referencia a un complejo de los cinco componentes principales terminales del complemento (C5-C9) que se inserta y rompe las membranas. Tambien se denomina C5b-9.

Tal como se emplea en la presente memoria, "un sujeto" incluye a todos los mamfferos, incluidos sin limitacion, seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, ovejas, cabras, vacas, conejos, cerdos y roedores.

Tal como se emplean en la presente memoria, los residuos de aminoacidos se abrevian de la siguiente manera: alanina (Ala;A), asparagina (Asn;N), acido aspartico (Asp;D), arginina (Arg;R), cistema (Cys;C), acido glutamico (Glu;E), glutamina (Gln;Q), glicina (Gly;G), histidina (His;H), isoleucina (Ile;I), leucina (Leu;L), lisina (Lys;K), metionina (Met;M), fenilalanina (Phe;F), prolina (Pro;P), serina (Ser;S), treonina (Thr;T), triptofano (Trp;W), tirosina (Tyr;Y) y valina (Val;V).

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En el sentido mas amplio, los aminoacidos naturales pueden dividirse en grupos en funcion de la caractenstica qmmica de la cadena lateral de los respectivos aminoacidos. Por aminoacido "hidrofobo" se entiende o bien lie, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys o Pro. Por aminoacido "hidrofilo" se entiende o bien Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg o His. Este agrupamiento de aminoacidos puede ademas dividirse en otra subclase de la siguiente manera. Por aminoacido "hidrofilo no cargado" se entiende o bien Ser, Thr, Asn o Gln. Por aminoacido "acido" se entiende o bien Glu o Asp. Por aminoacido "basico" se entiende o bien Lys, Arg o His.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "sustitucion de aminoacidos conservadores" se ilustra con una sustitucion entre aminoacidos dentro de cada uno de los siguiente grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptofano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina.

El termino "oligonucleotido", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN) o sus mimeticos. Este termino tambien abarca aquellas oligonucleobases compuestas por nucleotidos, azucares y enlaces internucleosfdicos covalentes (esqueleto) naturales, asf como tambien oligonucleotidos que tienen modificaciones no naturales.

II. La via alternativa, una nueva comprension

La via alternativa del complemento fue descrita por primera vez por Louis Pillemer y sus colegas a principios de los anos cincuenta en base a estudios en los que se uso cimosano elaborado a partir de las paredes celulares de levadura para activar el complemento (Pillemer, L. et al., J. Exp. Med. 103:1-13, 1956; Lepow, I.H., J. Immunol. 125:471-478, 1980). Desde entonces, el cimosano es considerado el ejemplo canonico de un activador espedfico de la via alternativa en suero de seres humanos y de roedores (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, 1984; Van Dijk, H., et al., J. Immunol. Methods 85:233-243, 1985; Pangbum, M.K., Methods in Enzymol. 162:639-653, 1988). Un ensayo practico y muy utilizado para la activacion de la via alternativa consiste en incubar suero en pocillos plasticos recubiertos con cimosano y determinar la cantidad de deposicion de C3b en la fase solida despues de la incubacion. Como se espera, hay una deposicion sustancial de C3b en los pocillos recubiertos con cimosano despues de la incubacion con suero de raton normal (Figura 7B). Sin embargo, la incubacion de suero de ratones deficientes de MASP-2 homocigotos en pocillos recubiertos con cimosano produce una reduccion sustancial en la deposicion de C3b en comparacion con aquella del suero normal. Asimismo, el uso del suero de ratones heterocigotos para deficiencia del gen MASP 2 en este ensayo produce niveles de deposicion de C3b que son intermedios entre aquellos obtenidos con suero de ratones deficientes de MASP-2 homocigotos y suero de ratones normales. Los resultados paralelos tambien se obtienen usando pocillos recubiertos con manano, otro tipo de polisacarido conocido por activar la via alternativa (Figura 7A). Dado que los ratones normales y los deficientes de MASP-2 comparten la misma informacion genetica, excepto por el gen MASP 2, estos resultados inesperados demuestran que la MASP-2 cumple una funcion esencial en la activacion de la via alternativa.

Estos resultados ofrecen una fuerte evidencia de que la via alternativa no es una via independiente, autonoma de la activacion del complemento como se describe esencialmente en todos los libros de texto medicos y en los artfculos de revision recientes sobre el complemento. La vision actual y ampliamente sostenida es que la via alternativa se activa en la superficie de ciertas dianas particuladas (microbios, cimosano, eritrocitos de conejo) a traves de la ampliacion de la activacion de C3 espontanea "poco avanzada". Sin embargo, la ausencia de activacion importante de la via alternativa en el suero de ratones con genes inactivados de MASP-2 por dos "activadores" conocidos de la via alternativa hace que sea improbable que la "teona poco avanzada" describa un mecanismo fisiologico importante de activacion del complemento.

Ya que se sabe que la proteasa MASP-2 tiene una funcion espedfica y bien definida como enzima responsable del inicio de la cascada del complemento de lectina, estos resultados implican la activacion de la via de lectinas por cimosano y manano como un primer paso cntico para la activacion subsiguiente de la via alternativa. C4b es un producto de activacion generado por la via de lectinas, pero no por la via alternativa. De conformidad con este concepto, la incubacion de suero de raton normal con pocillos recubiertos con cimosano o manano produce la deposicion de C4b en los pocillos y esta deposicion de C4b se reduce sustancialmente cuando los pocillos recubiertos se incuban con suero de ratones deficientes de MASP-2 (Figuras 6A, 6B y 6C).

La ruta alternativa, ademas de su funcion ampliamente aceptada como una via independiente para la activacion del complemento, puede tambien proporcionar un bucle de ampliacion para la activacion del complemento inicialmente desencadenada por las vfas clasica y de lectinas (Liszewski, M.K. y J.P. Atkinson, 1993, en Fundamental Immunology, Tercera Edicion, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York; Schweinie, J.E., et al., J. Clin. Invest. 84:1821-1829, 1989). En este mecanismo de ampliacion mediado por la via alternativa, la convertasa C3 (C4b2b) generada por activacion o bien de las cascadas del complemento clasica o de lectinas escinde C3 en C3a y C3b, y proporciona asf C3b que puede participar en la formacion de C3bBb, la convertasa C3 de la via alternativa. La explicacion probable de la ausencia de activacion de la via alternativa en suero de genes inactivados de MASP-2 es que se requiere la via de lectinas para la activacion del complemento inicial por cimosano, manano y otros "activadores" putativos de la via alternativa, mientras que la via alternativa cumple una funcion crucial en la ampliacion de la activacion del complemento. En otros terminos, la via alternativa es un bucle de ampliacion de proaccion dependiente de las vfas del complemento de lectinas y clasica para la activacion, en lugar de una cascada

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lineal independiente.

En lugar de que la cascada del complemento se active a traves de tres v^as distintas (vfas clasica, alternativa y de lectinas) como se contemplo anteriormente, nuestros resultados indican que es mas preciso visualizar el complemento como compuesto por dos sistemas principales, que corresponden, en una primera aproximacion, a las ramas innata (lectina) y adquirida (clasica) del sistema de defensas inmunologico del complemento. Las lectinas (MBP, M-ficolina, H-ficolina y L-ficolina) son las moleculas de reconocimiento espedficas que desencadenan el sistema del complemento innato, y el sistema incluye el bucle de ampliacion de la via de lectinas y la via alternativa asociada. C1q es la molecula de reconocimiento espedfica que desencadena el sistema de complemento adquirido y el sistema incluye el bucle de ampliacion de la via clasica y de la via alternativa asociada. Hacemos referencia a estos dos sistemas de activacion principales del complemento como el sistema del complemento dependiente de lectinas y el sistema del complemento dependiente de Clq, respectivamente.

Ademas de su funcion esencial en la defensa inmune, el sistema del complemento contribuye al dano del tejido en muchas afecciones clmicas. Por lo tanto, existe una necesidad imperativa de desarrollar inhibidores del complemento terapeuticamente eficaces para prevenir estos efectos adversos. Al reconocer que el complemento esta compuesto por dos sistemas principales de activacion del complemento, se llega a la conclusion de que sena muy conveniente inhibir espedficamente solamente el sistema de activacion del complemento que causa una patologfa particular sin desactivar por completo las capacidades de defensa inmunes del complemento. Por ejemplo, en los estados de enfermedad en los que la activacion del complemento es mediada predominantemente por el sistema del complemento dependiente de lectinas, sena ventajoso inhibir espedficamente solamente este sistema. Esto dejana intacto el sistema de activacion del complemento dependiente de C1q para manejar el procesamiento del complejo inmunologico y ayudar en la defensa del hospedante contra las infecciones.

El componente de protema preferido para dirigir en el desarrollo de agentes terapeuticos a fin de inhibir espedficamente el sistema del complemento dependiente de lectinas es MASP-2. De todos los componentes de protemas del sistema del complemento dependiente de lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina, MASP-2, C2- C9, Factor B, Factor D y properdina), solamente la MASP-2 es unica para el sistema del complemento dependiente de lectinas y requerida para que el sistema funcione. Las lectinas (MBL, H-ficolina, M-ficolina y L-ficolina) son tambien componentes unicos en el sistema del complemento dependiente de lectinas. No obstante, la perdida de uno cualquiera de los componentes de lectina no necesariamente inhibina la activacion del sistema debido a la redundancia de lectinas. Sena necesario inhibir las cuatro lectinas con el fin de garantizar la inhibicion del sistema de activacion del complemento dependiente de lectinas. Asimismo, ya que tambien se sabe que la MBL y las ficolinas tienen actividad opsonica independiente del complemento, la inhibicion de la funcion de las lectinas resultana en la perdida de este mecanismo beneficioso de defensa del hospedante contra las infecciones. En cambio, esta actividad opsonica de las lectinas independiente del complemento permanecena intacta si la MASP-2 fuese la diana inhibidora. Un beneficio agregado de la MASP-2 como diana terapeutica para inhibir el sistema de activacion del complemento dependiente de lectinas es que la concentracion en el plasma de MASP-2 esta entre las mas bajas de cualquier protema del complemento (~ 500 ng/ml); por lo tanto, correspondientemente a las bajas concentraciones de inhibidores de MASP-2 de gran afinidad, se puede requerir la obtencion de una inhibicion total (Moller-Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).

III. Funcion de la MASP-2 en diversas enfermedades y afecciones y metodos terapeuticos que usan MASP-2 como agentes inhibidores

Lesion de isquemia y reperfusion

Le lesion de isquemia y reperfusion (I/R) ocurre cuando el flujo sangumeo se restaura despues de un periodo de isquemia extenso. Es una causa comun de morbimortalidad en un amplio espectro de enfermedades. Los pacientes quirurgicos son vulnerables despues de la reparacion de un aneurisma aortico, derivacion cardiopulmonar, reanastomosis revascular en relacion, por ejemplo, con trasplantes de organos (p. ej., corazon, pulmon, hfgado, rinon) y reimplante de dfgitos/extremidades, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio y reanimacion hemodinamica que le sigue a choque y/o procedimientos quirurgicos. Los pacientes con enfermedades ateroscleroticas son propensos a infartos de miocardio, accidentes cerebrovasculares e isquemia de las extremidades inferiores e intestinal inducida por embolias. Los pacientes con traumatismo frecuentemente sufren de isquemia temporaria de las extremidades. Ademas, cualquier causa de perdida de sangre masiva produce una reaccion de isquemia y reperfusion en todo el cuerpo.

La patofisiologfa de la lesion de isquemia y reperfusion es compleja, con por lo menos dos factores importantes que contribuyen al proceso de activacion del complemento y a la estimulacion de neutrofilos con lesion concomitante mediada por radicales de oxfgeno. En la lesion I/R, la activacion del complemento se describio por primera vez durante el infarto de miocardio hace mas de 30 anos, y ha conducido a numerosas investigaciones sobre la contribucion del sistema del complemento a la lesion del tejido por I/R (Hill, J.H., et al., J. Exp. Med. 133:885-900, 1971). Los datos acumulados senalan ahora al complemento como mediador fundamental en la lesion I/R. La inhibicion del complemento ha sido exitosa para limitar la lesion en varios modelos animales de I/R. En estudios iniciales, se logro la reduccion de C3 despues de la infusion del factor de veneno de cobra, que se informo como beneficiosa durante la I/R en rinon y corazon (Maroko, P.R., et al., 1978, J. Clin Invest. 61:661-670, 1978; Stein,

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S.H., et al., Miner Electrolyte Metab. 11:256-61, 1985). No obstante, la forma soluble del receptor del complemento 1 (sCR1) fue el primer inhibidor espedfico del complemento utilizado para la prevencion de la lesion de I/R de miocardio (Weisman, H.F., et al., Science 249:146-51, 1990). El tratamiento con sCR1 durante la I/R de miocardio atenua el infarto asociado con deposicion reducida de complejos C5b-9 a lo largo del endotelio coronario e infiltracion reducida de leucocitos despues de la reperfusion.

En I/R de miocardio experimental, el inhibidor de Cl esterasa (Cl INH) administrado antes de la reperfusion previene la deposicion de C1q y reduce significativamente el area de necrosis del musculo cardiaco (Buerke, M., et al., 1995, Circulation 91:393-402, 1995). Los animales geneticamente deficientes de C3 tienen menos necrosis del tejido local despues de la isquemia musculoesqueletica intestinal (Weiser, M.R., et al., J. Exp. Mecl. 183:2343-48, 1996).

El complejo de ataque a la membrana es el veldculo principal de lesion dirigida al complemento, y los estudios en animales deficientes de C5 han demostrado menos lesiones locales y remotas en modelos de lesion de I/R (Austen, W.G. Jr., et al., Surgery 126:343-48, 1999). Se ha demostrado que un inhibidor de la activacion del complemento, CiTy soluble (gen Y relacionado con el receptor del complemento 3++), es eficaz contra lesiones cuando se administra antes y despues del inicio de la reperfusion intestinal en murinos (Rehrig, S., et al., J. Immunol. 167:592127, 2001). En un modelo de isquemia musculoesqueletica, el uso del receptor soluble del complemento 1 (sCR1) tambien redujo la lesion muscular cuando se administro despues del inicio de la reperfusion (Kyriakides, C., et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281:C244-30, 2001). En un modelo porcino de I/R de miocardio, los animales tratados con anticuerpo monoclonal ("MoAb") a la anafilatoxina C5a antes de la reperfusion demostraron atenuacion del infarto (Amsterdam, E.A., et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268:h448-57, 1995). Las ratas tratadas con MoAb de C5 demostraron una atenuacion del tamano del infarto, infiltracion de neutrofilos y apoptosis en el miocardio (Vakeva, A., et al., Circulation 97:2259-67, 1998). Estos resultados experimentales destacan la importancia de la activacion de la patogenesis de la lesion de I/R.

No esta claro que via del complemento (clasica, de lectinas o alternativa) esta predominantemente implicada en la activacion del complemento en la lesion de I/R. Weiser et al. demostraron una funcion importante de las vfas de lectinas y/o clasica durante la I/R esqueletica, demostrando que los ratones con genes inactivados de C3 o C4 estuvieron protegidos contra lesion de I/R en base a la importante reduccion de la permeabilidad vascular (Weiser, M.R., et al., J. Exp. Mecl. 183:2343-48, 1996). En contraste, los experimentos de I/R renal con ratones con genes inactivados de C4 no demuestran una proteccion importante del tejido, mientras que los ratones con genes inactivados de C3, C5 y C6 estuvieron protegidos contra lesion, lo que indica que la activacion del complemento durante la lesion I/R renal ocurre a traves de la via alternativa (Zhou, W., et al., J. Clin. Invest. 105:1363-71, 2000). Usando ratones deficientes del factor D, Stahl et al. recientemente presentaron datos de una importante funcion de la via alternativa en la I/R intestinal en ratones (Stahl, G., et al., Am. J. Pathol. 162:449-55, 2003). En contraste, Williams et al. sugirieron una funcion predominante de la via clasica para el inicio de la lesion de I/R en el intestino de ratones, demostrando una reduccion de la tincion del organo para C3 y proteccion de la lesion en ratones deficientes de C4 e IgM (Ragl-/-) (Williams, J.P., et al., J. Appl. Physiol. 86:938-42, 1999).

El tratamiento de ratas en el modelo de I/R de miocardio con anticuerpos monoclonales contra lectina de union a manano (MBL) en ratas produjo una reduccion de la lesion de reperfusion post-isquemica (Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413-18, 2001). Los anticuerpos de MBL tambien redujeron la deposicion del complemento en las celulas endoteliales in vitro despues del estres oxidativo, indicando una funcion para la via de lectinas en la lesion de I/R de miocardio (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-56, 2000). Existen tambien datos de que la lesion de I/R en algunos organos puede estar mediada por una categona espedfica de IgM, denominada anticuerpos naturales, y la activacion de la via clasica (Fleming, S.D., et al., J. Immunol. 169:2126-33, 2002; Reid, R.R., et al., J. Immunol. 169:5433-40, 2002).

Se han desarrollado varios inhibidores de la activacion del complemento como agentes terapeuticos potenciales para prevenir la morbimortalidad resultante de complicaciones de I/R de miocardio. Dos de estos inhibidores, sCR1 (TP10) y anti-C5 scFv humanizado (Pexelizumab), han completado ensayos clmicos de fase II. Pexelizumab ha completado ademas un ensayo clmico de fase III. Si bien TP 10 fue bien tolerado y beneficioso para pacientes en los ensayos iniciales de fase I/II, los resultados de un ensayo de fase II que finalizo en febrero de 2002 no pudieron alcanzar el criterio principal de valoracion. No obstante, el analisis de subgrupos de datos de pacientes de sexo masculino en poblaciones de alto riesgo que se sometieron a procedimientos a corazon abierto demostraron mortalidad y tamano del infarto significativamente reducidos. La administracion de un anti-C5 scFv humanizado redujo la mortalidad general del paciente asociada con infarto de miocardio agudo en los ensayos de fase II COMA y COMPLY, pero no pudo alcanzar el criterio principal de valoracion (Mahaffey, K.W., et al., Circulation 108:1176-83, 2003). Recientemente se dieron a conocer los resultados de un ensayo clmico anti-C5 scFv de fase III (PRIMO- CABG) para mejorar resultados inducidos quirurgicamente despues de una derivacion de arteria coronaria. Si bien no se alcanzo el criterio principal de valoracion para este estudio, el estudio demostro una reduccion general en la morbimortalidad postoperatoria.

Asf, un aspecto de la invencion se dirige al tratamiento de lesiones de isquemia y reperfusion, tratando a un sujeto que experimenta isquemia y reperfusion con una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP- 2 en un veldculo farmaceutico. El agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto por administracion intra-arterial, intravenosa, intracraneal, intramuscular, subcutanea u otra administracion parenteral y potencialmente

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oral para inhibidores no peptidergicos, y mas adecuadamente por administracion intra-arterial o intravenosa. La administracion de las composiciones inhibidoras de MASP-2 de la presente invencion adecuadamente comienzan inmediatamente despues o lo mas pronto posible despues de un evento de isquemia y reperfusion. En casos en los que la reperfusion ocurre en un entorno controlado (p. ej., despues de la reparacion de un aneurisma aortico, trasplante de organo o reimplante de extremidades o dfgitos amputados o traumatizados), el agente inhibidor de MASP-2 puede administrarse antes y/o durante y/o despues de la reperfusion. La administracion se puede repetir periodicamente segun lo determinado por el medico para un efecto terapeutico optimo.

Otras enfermedades y afecciones vasculares

El endotelio esta muy expuesto al sistema inmunologico y es particularmente vulnerable a las protemas del complemento presentes en el plasma. Se ha demostrado que la lesion vascular mediada por el complemento contribuye a la patofisiologfa de varias enfermedades del sistema cardiovascular, incluida la aterosclerosis (Seifert, P.S., et al., Atherosclerosis 73:91-104, 1988), lesion de isquemia y reperfusion (Weisman, H.F., Science 249:146-51, 1990) e infarto de miocardio (Tada, T., et al., Virchows Arch 430:327-332, 1997). Los datos indican que la activacion del complemento puede extenderse a otras afecciones vasculares.

Por ejemplo, hay datos de que la activacion del complemento contribuye a la patogenesis de muchas formas de vasculitis, incluyendo: nefritis por purpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistemico, vasculitis asociada a artritis reumatoidea (tambien llamada artritis reumatoidea maligna), vasculitis del complejo inmune y enfermedad de Takayasu. La nefritis por purpura de Henoch-Schonlein es una forma de vasculitis sistemica de los vasos pequenos con patogenesis inmune, en donde la activacion del complemento a traves de la via de lectinas que produce dano endotelial inducido por C5b-9 es reconocida como un mecanismo importante (Kawana, S., et al., Arch. Dermatol. Res. 282:183-7, 1990; Endo, M., et al., Am J. Kidney Dis. 35:401-7, 2000). El lupus eritematoso sistemico (SLE) es un ejemplo de enfermedades autoinmunes que afecta multiples organos, incluida la piel, los rinones, articulaciones, superficies serosas y el sistema nervioso central, y frecuentemente se asocia con vasculitis severa. Los anticuerpos anti-endoteliales IgG y los complejos de IgG capaces de unirse a las celulas endoteliales estan presentes en los sueros de pacientes con SLE activo, y los depositos de complejos inmunes de IgG y complemento se hallan en las paredes de los vasos sangumeos de pacientes con vasculitis por SLE (Cines, D.B., et al., J. Clin. Invest. 73:611-25, 1984). La artritis reumatoidea asociada con vasculitis, tambien llamada artritis reumatoidea maligna (Tomooka, K., Fukuoka Igaku Zasshi 80:456-66, 1989), vasculitis del complejo inmune, vasculitis asociada con hepatitis A, vasculitis leucocitoclastica y la artritis conocida como enfermedad de Takayasu, forman otro grupo pleomorfico de enfermedades humanas en las que la citotoxicidad dependiente del complemento contra celulas endoteliales y de otros tipos cumple una funcion documentada (Tripathy, N.K., et al., J. Rheumatol. 28:805-8, 2001).

Las pruebas tambien indican que la activacion del complemento cumple una funcion en la cardiomiopatfa dilatada. La cardiomiopatfa dilatada es un smdrome caracterizado por agrandamiento cardiaco y funcion sistolica deteriorada del corazon. Datos recientes indican que la inflamacion constante del miocardio puede contribuir al desarrollo de la enfermedad. Se sabe que C5b-9, el complejo de ataque a la membrana terminal del complemento, se correlaciona en gran medida con la deposicion de inmunoglobulina y la expresion de TNF-alfa en el miocardio. En biopsias de miocardio de 28 pacientes con cardiomiopatfa dilatada, se demostro la acumulacion de C5b-9 en el miocardio, indicando que la activacion cronica del complemento mediada por inmunoglobulina en el miocardio puede contribuir, en parte, a la progresion de la cardiomiopatfa dilatada (Zwaka, T.P., et al., Am. J. Pathol. 161(2):449-57, 2002).

Asf, un aspecto de la invencion esta dirigido al tratamiento de una afeccion vascular, incluidas afecciones cardiovasculares, afecciones cerebrovasculares, afecciones vasculares perifericas (p. ej., musculoesqueletica), afecciones renovasculares y afecciones vasculares mesentericas/entericas, administrando una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehfculo farmaceutico. Dichas afecciones para las cuales se cree que la invencion es adecuada incluyen, aunque sin limitarse a ello: vasculitis, incluida nefritis por purpura de Henoch-Schonlein, vasculitis asociada a lupus eritematoso sistemico, vasculitis asociada a artritis reumatoidea (tambien llamada artritis reumatoidea maligna), vasculitis del complejo inmune y enfermedad de Takayasu; cardiomiopatfa dilatada, angiopatfa diabetica; enfermedad de Kawasaki (arteritis); y embolia gaseosa venosa (VGE). Ademas, dado que la activacion del complemento ocurre como consecuencia de traumatismo luminal y de respuesta inflamatoria a cuerpo extrano asociada con procedimientos de intervencion cardiovascular, se cree que las composiciones inhibidoras de MASP-2 de la presente invencion pueden tambien utilizarse en la inhibicion de restenosis que le sigue a la colocacion de un stent, aterectomfa rotacional y/o angioplastia coronaria transluminal percutanea (PTCA), o bien solas o combinadas con otros agentes inhibidores de restenosis tales como aquellos descritos en la patente de EE. UU. num. 6.492.332 para Demopulos.

El agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto por administracion intra-arterial, intravenosa, intramuscular, intratecal, intracraneal, subcutanea u otra administracion, potencialmente por via oral para inhibidores no peptidergicos. La administracion se puede repetir periodicamente segun lo determinado por el medico para un efecto terapeutico optimo. Para la inhibicion de restenosis, la composicion inhibidora de MASP-2 se puede administrar antes y/o durante y/o despues de la colocacion de un o del procedimiento de aterectomfa o angioplastia. Alternativamente, la composicion inhibidora de MASP-2 puede revestirse o incorporarse al stent.

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Trasplante

La activacion del sistema del complemento contribuye significativamente a la reaccion inflamatoria despues del trasplante de organos solidos. En el alotrasplante, el sistema del complemento puede ser activado por isquemia/reperfusion y posiblemente, por anticuerpos dirigidos contra el injerto (Baldwin, W.M., et al., Springer Seminol Immunopathol. 25:181-197, 2003). En xenotrasplante de no primates a primates, los activadores principales del complemento son anticuerpos preexistentes. Los estudios en modelos animales han demostrado que el uso de inhibidores del complemento puede prolongar significativamente la supervivencia del injerto (ver a continuacion). Por consiguiente, existe una funcion establecida del sistema del complemento en la lesion organica despues del trasplante del organo, y por lo tanto los inventores consideran que el uso de los inhibidores del complemento dirigidos a MASP-2 puede prevenir el dano al injerto despues de un alo o xenotrasplante.

Los mecanismos inmunes innatos, particularmente el complemento, cumplen una funcion mas importante en las repuestas inflamatorias e inmunes contra el injerto que lo que se habfa reconocido previamente. Por ejemplo, la activacion de la via del complemento alternativa parece mediar la lesion de isquemia/reperfusion renal, y las celulas tubulares proximales pueden ser la fuente y el sitio de ataque de los componentes del complemento en este escenario. El complemento producido localmente en el rinon tambien cumple una funcion en el desarrollo de respuestas inmunes mediadas por anticuerpos y celulas contra el injerto.

C4d es el producto de degradacion del factor del complemento activado C4, un componente de las vfas clasica y dependiente de lectinas. La tincion de C4d ha emergido como un marcador util del rechazo humoral tanto en el ambito agudo como en el cronico y condujo a un interes renovado en la significancia de la formacion de anticuerpos anti-donante. La asociacion entre C4d y signos morfologicos de rechazo celular agudo es estadfsticamente significativa. El C4d se halla en 24-43% de los episodios de tipo I, en 45% de rechazo de tipo II y en 50% de rechazo de tipo III (Nickeleit, V., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 13:242-251, 2002; Nickeleit, V., et al., Nephrol. Dial. Transplant 18:2232-2239, 2003). Se encuentran en desarrollo una serie de terapias que inhiben el complemento o reducen la smtesis local como medio para lograr un mejor desenlace clmico despues del trasplante.

La activacion de la cascada del complemento ocurre como consecuencia de una serie de procesos durante el trasplante. La terapia actual, si bien eficaz para limitar el rechazo celular, no aborda todas las barreras enfrentadas. Estas incluyen rechazo humoral y nefropatfa o disfuncion cronica por el aloinjerto. Si bien la respuesta general al organo trasplantado es consecuencia de una serie de mecanismos efectores por parte del hospedante, el complemento puede cumplir una funcion clave en algunos de estos. En este ambito de trasplante renal, la smtesis local del complemento por las celulas tubulares proximales parece ser de particular importancia.

La disponibilidad de los inhibidores espedficos del complemento puede proveer la oportunidad de un resultado mejorado despues del trasplante de organos. Los inhibidores que actuan por un mecanismo que bloquea el ataque del complemento pueden ser particularmente utiles, ya que mantienen la promesa de una mayor eficacia y evitacion de la disminucion del complemento sistemico en un receptor ya inmunocomprometido.

El complemento tambien cumple una funcion cntica en el rechazo de xenoinjertos. Por ende, los inhibidores del complemento eficaces son de gran interes como potenciales agentes terapeuticos. En el trasplante de organos de cerdo a primate, el rechazo hiperagudo (HAR) produce la deposicion de anticuerpos y la activacion del complemento. Se han ensayado multiples estrategias y dianas para prevenir el rechazo del xenoinjerto hiperagudo en la combinacion cerdo a primate. Estos planteamientos se han logrado mediante la eliminacion de anticuerpos naturales, eliminacion del complemento con el factor de veneno de cobra o prevencion de la activacion de C3 con el inhibidor del complemento soluble sCR1. Ademas, el bloqueante 2 (CAB-2) de la activacion del complemento, una protema quimerica soluble recombinante derivada del factor acelerado de decaimiento (DAF) humano y la protema del cofactor de membrana, inhibe las convertasas C3 y C5 de ambas vfas, clasica y alternativa. CAB-2 reduce la lesion del tejido mediada por el complemento de un corazon de cerdo perfundido ex vivo con sangre humana. Un estudio de la eficacia de CAB-2 cuando se trasplanto un corazon de cerdo en forma heterotopica en monos rhesus que no recibieron inmunosupresion demostro que la supervivencia del injerto era notablemente prolongada en monos que recibieron CaB-2 (Salerno, C.T., et al., Xenotransplantation 9:125-134, 2002). CAB-2 inhibio marcadamente la activacion del complemento, como se muestra mediante la fuerte reduccion en la generacion de C3a y SC5b-9. En el rechazo de injertos, la deposicion de tejido de iC3b, C4 y C9 fue similar o ligeramente reducida de los controles, y la deposicion de IgG, IgM, C1q y fibrina no cambio. Por lo tanto, este planteamiento para la inhibicion del complemento revoco el rechazo hiperagudo de corazones de cerdo trasplantados a monos rhesus. Estos estudios demuestran los efectos beneficios de la inhibicion del complemento en la supervivencia, y los inventores creen que la inhibicion de MASP-2 puede ser util en el xenotrasplante.

Otro planteamiento se ha centrado en determinar si los anticuerpos monoclonales anti-complemento 5 (C5) podnan prevenir el rechazo hiperagudo (HAR) en un modelo de trasplante de corazon de rata a raton presensibilizado y si estos MoAb, combinados con ciclosporina y ciclofosfamida, podnan lograr la supervivencia del injerto a largo plazo. Se hallo que el anti-C5 MoAb previene el HAR (Wang, H., et al., Transplantation (68:1643-1651, 1999). Los inventores creen por lo tanto que otras dianas en la cascada del complemento, tales como MASP-2, podnan tambien ser valiosas para prevenir HAR y rechazo vascular agudo en el xenotrasplante clmico futuro.

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Si bien la funcion fundamental del complemento en el rechazo hiperagudo observado en xenoinjertos esta bien establecida, esta emergiendo una funcion mas sutil en el trasplante alogenico. Se conoce desde hace mucho un vinculo entre el complemento y la respuesta inmune adquirida, con el hallazgo de que los animales que carecen del complemento montaron respuestas de anticuerpos subnormales despues de la estimulacion antigenica. Se ha demostrado que la opsonizacion de antigeno con el producto de division del complemento C3d incrementa en gran medida la eficacia de la presentacion de antigenos a las celulas B, y se ha demostrado que actuan mediante la implicacion del receptor del complemento de tipo 2 en ciertas celulas B. Este trabajo se ha extendido al ambito del trasplante en un modelo de injerto de piel en ratones, en donde los ratones deficientes de C3 y C4 tuvieron un notable efecto en la produccion de alo-anticuerpos, debido a la falla de clase alterna a IgG de gran afinidad. La importancia de estos mecanismos en el trasplante renal aumenta debido a la significancia de los anticuerpos anti- donante y al rechazo humoral.

El trabajo previo ya ha demostrado el aumento de la smtesis de C3 por celulas tubulares proximales durante el rechazo del aloinjerto que le sigue a un trasplante renal. La funcion del complemento sintetizado localmente se ha examinado en un modelo de trasplante renal de raton. Los injertos de donantes C3-negativos trasplantados a receptores suficientes de C3 demostraron supervivencia prolongada (>100 dfas) comparados con los injertos control de donantes C3-positivos, que fueron rechazados dentro de los 14 dfas. Ademas, la respuesta proliferativa de las celulas T anti-donante en receptores de injertos C3-negativos se redujo notablemente en comparacion con aquella de los controles, lo que indica un efecto de C3 localmente sintetizado en la imprimacion de las celulas T.

Estas observaciones sugieren la posibilidad de que la exposicion del antfgeno del donante a las celulas T ocurra primero en el injerto y que el complemento localmente sintetizado potencie la presentacion de antfgenos, o bien por opsonizacion del antfgeno del donante o proporcionando senales adicionales tanto a las celulas presentadoras de antfgenos como a las celulas T. En el ambito del trasplante renal, las celulas tubulares que producen el complemento tambien demuestran la deposicion del complemento en su superficie celular.

Asf, un aspecto de la invencion se dirige a la prevencion o el tratamiento de reaccion inflamatoria resultante de trasplante de tejido u organo solido, administrando una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehfculo farmaceutico al receptor del trasplante, incluidos sujetos que han recibido alotrasplante o xenotrasplante de organos enteros (p. ej., rinon, corazon, hngado, pancreas, pulmon, cornea, etc.) o injertos (p. ej., valvulas, tendones, medula osea, etc.). El agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto por administracion intra-arterial, intravenosa, intramuscular, subcutanea u otra administracion parenteral, o potencialmente por administracion oral para inhibidores no peptidergicos. La administracion puede ocurrir durante el periodo agudo que sigue al trasplante y/o durante la terapia post-trasplante a largo plazo. Adicionalmente o en lugar de la administracion post-trasplante, el sujeto puede ser tratado con el agente inhibidor de MASP-2 antes del trasplante y/o durante el procedimiento de trasplante, y/o pre-tratando el organo o tejido que se ha de trasplantar con el agente inhibidor de MASP-2. El pretratamiento del organo o tejido puede comprender aplicar una disolucion, gel o pasta que contenga el agente inhibidor de MASP-2 a la superficie del organo o tejido, pulverizando o irrigando la superficie, o el organo o tejido puede ser embebido en una disolucion que contenga el inhibidor de MASP-2.

Afecciones oftalmologicas

La degeneracion macular relacionada con la edad (AMD) es una enfermedad de ceguera que afecta a millones de adultos, aun asf, las secuelas de los eventos bioqmmicos, celulares y/o moleculares que llevan al desarrollo de la AMD no se entienden del todo. La AMD provoca la destruccion progresiva de la macula que se ha correlacionado con la formacion de depositos extracelulares llamados drusas que estan situados en y alrededor de la macula, detras de la retina y entre el epitelio pigmentario retiniano (RPE) y la coroides. Estudios recientes han revelado que las protemas asociadas con inflamacion y procesos inmunes son prevalentes entre los constituyentes asociados a las drusas. Se han detectado transcripciones que codifican un numero de estas moleculas en celulas retinianos, de RPE y coroideas. Estos datos tambien demuestran que las celulas dendnticas, que son potentes celulas presentadoras de antfgenos, estan mtimamente asociadas con el desarrollo de drusas, y que la activacion del complemento es una via clave que esta activa tanto dentro de las drusas como a lo largo de la interface de la coroides del RPE (Hageman, G.S., et al., Prog. Retin. Eye Res., 20:705-732, 2001).

Varios estudios independientes han demostrado una fuerte asociacion entre la AMD y un polimorfismo genetico en el gen para el factor del complemento H (CFH) en el que la probabilidad de AMD aumenta con un factor de 7,4 en individuos homocigotos para el alelo de riesgo (Klein, R.J. et al., Science, 308:362-364, 2005; Haines et al., Science 308:362-364. 2005; Edwards et al., Science 308:263-264, 2005). El gen de CFH ha sido mapeado al cromosoma lq31, una region que habfa sido implicada en la AMD por seis exploraciones de enlaces (vease, p. ej., D.W. Schultz et al., Hum. Mol. Genet. 12:3315, 2003). Se sabe que el CFH es un regulador clave del sistema del complemento. Se ha demostrado que el CFH en las celulas y en la circulacion regula la actividad del complemento inhibiendo la activacion de C3 a C3a y C3b, e inactivando el C3b existente. Se ha observado la deposicion de C5b-9 en la membrana de Brusch, en los pilares intercapilares y dentro de las drusas en pacientes con AMD (Klein et al.). Los experimentos de inmunofluorescencia sugieren que en AMD, el polimorfismo de CFH puede dar origen a la deposicion del complemento en capilares de coroides y vasos de coroides (Klein et al.).

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El inhibidor del complemento asociado a la membrana, el receptor del complemento 1, tambien esta localizado en las drusas, pero no se detecta en las celulas de RPE en inmunohistoqmmica. En contraste, un segundo inhibidor del complemento asociado a la membrana, la protema del cofactor de la membrana, esta presente en celulas de RPE asociadas a drusas, asf como tambien en elementos subestructurales pequenos y esfericos dentro de las drusas. Estos elementos previamente no identificados demuestran una fuerte inmunorreactividad para los fragmentos proteoltticos del componente del complemento C3 que estan caractensticamente depositados en sitios de activacion del complemento. Se propone que estas estructuras representan sedimentos residuales de celulas de RPE degenerantes que son dianas de ataque al complemento (Johnson, L.V., et al., Exp. Eye Res. 73/887-896, 2001).

Asf, un aspecto de la invencion proporciona un metodo para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 para tratar la degeneracion macular relacionada con la edad u otra afeccion oftalmologica mediada por el complemento, administrando una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 en un vehmulo farmaceutico a un sujeto que padece dicha afeccion u otra afeccion oftalmologica mediada por el complemento. La composicion inhibidora de MASP-2 se puede administrar localmente al ojo, tal como por irrigacion o aplicacion de la composicion en la forma de un gel, balsamo o gotas. Alternativamente, el agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar al sujeto en forma sistemica, tal como por administracion intra-arterial, intravenosa, intramuscular, por inhalacion, nasal, subcutanea u otra administracion parenteral, o potencialmente por administracion oral para agentes no peptidergicos. La composicion del agente inhibidor de MASP-2 se puede combinar con uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como aquellos descritos en la publicacion de solicitud de patente estadounidense num. 2004-0072809-A1. La administracion se puede repetir segun lo determinado por un medico hasta que la afeccion se haya resuelto o haya sido controlada.

IV. Agentes inhibidores de MASP-2

En un aspecto, la presente invencion proporciona metodos para inhibir los efectos de la activacion del complemento dependiente de MASP-2. Los agentes inhibidores de MASP-2 se administran en una cantidad eficaz para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en un sujeto vivo. Al poner en practica este aspecto de la invencion, los agentes inhibidores de MASP-2 representativos incluyen moleculas que inhiben la actividad biologica de MASP-2 (tal como los inhibidores de moleculas pequenas, anticuerpos anti-MASP-2 o peptidos bloqueantes que interactuan con MASP-2 o interfieren con una interaccion protema-protema) y moleculas que reducen la expresion de MASP-2 (tales como las moleculas de acido nucleico antisentido de MASP-2, moleculas de ARNi espedficas de MASP-2 y ribozimas de MASP-2), previniendo asf que la MASP-2 active las vfas del complemento alternativas. Los agentes inhibidores de MASP-2 se pueden usar solos como terapia primaria o combinados con otros agentes terapeuticos como terapia adyuvante para potenciar los beneficios terapeuticos de otros tratamientos medicos.

La inhibicion de la activacion del complemento dependiente de MASP-2 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un complemento del sistema del complemento que ocurre como resultado de la administracion de un agente inhibidor de MASP-2 de acuerdo con los metodos de la invencion: la inhibicion de la generacion o produccion de productos del sistema de activacion del complemento dependientes de MASP-2 C4b, C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC) (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2), la reduccion de la activacion del complemento alternativa evaluada en un ensayo hemolftico que emplea globulos rojos de conejo o cobaya insensibilizados, la reduccion de escision de C4 y deposicion de C4b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2) o la reduccion de la escision de C3 y la deposicion de C3b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2).

Segun la presente invencion, se utilizan agentes inhibidores de MASP-2 que son eficaces para inhibir el sistema de activacion del complemento dependiente de MASP-2. Los agentes inhibidores de MASP-2 utiles en la practica de este aspecto de la presente invencion incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-MASP-2 y sus fragmentos, peptidos inhibidores de MASP-2, moleculas pequenas, receptores solubles de MASP-2 e inhibidores de expresion. Los agentes inhibidores de MASP-2 pueden inhibir el sistema de activacion del complemento dependiente de MASP-2 bloqueando la funcion biologica de la MASP-2. Por ejemplo, un agente inhibidor puede bloquear eficazmente las interacciones de una protema MASP-2 a otra, interferir con la dimerizacion o el ensamblaje de MASP-2, bloquear la union a Ca2+, interferir con el sitio activo de serina proteasa MASP-2, o pueden reducir la expresion de la protema MASP-2.

En algunas realizaciones, los agentes inhibidores de MASP-2 inhiben selectivamente la activacion del complemento de MASP-2, dejando funcionalmente intacto el sistema de activacion del complemento dependiente de C1q.

En una realizacion, un agente inhibidor de MASP-2 util en los metodos de la invencion es un agente inhibidor de MASP-2 espedfico que se une espedficamente a un polipeptido que comprende la SEC ID NO:6 con una afinidad de por lo menos 10 veces mas que otros antfgenos del sistema del complemento. En otra realizacion, un agente inhibidor de MASP-2 se une espedficamente a un polipeptido que comprende la SEC ID NO:6 con una afinidad de union de por lo menos 100 veces mas que otros antfgenos en el sistema del complemento. La afinidad de union del agente inhibidor de MASP-2 se puede determinar usando un ensayo de union adecuado.

El polipeptido de MASP-2 exhibe una estructura molecular similar a MASP-1, MASP-3, y C1r y C1s, las proteasas del sistema del complemento C1. La molecula de ADNc expuesta en la SEC ID NO:4 codifica un ejemplo

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representativo de MASP-2 (que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEC ID NO:5) y proporciona el polipeptido de MASP-2 humano con una secuencia Ifder (aa 1-15) que se escinde despues de la segregacion, resultando en la forma madura de MASP-2 humana (SEC ID NO:6). Como se muestra en la FIGURA2, el gen MASP 2 humano abarca doce exones. El ADNc de MASP-2 humano es codificado por los exones B, C, D, F, G, H, I, J, K y L. Un empalme alternativo produce la protema de 20 kDa denominada protema asociada a MBL 19 ("MAp19") (SEC ID NO:2), codificada por (SEC ID NO:1) que surge de los exones B, C, D y E, como se muestra en la FiGuRA 2. La molecula de ADNc expuesta en la SEC iD N0:50 codifica la MASP-2 de murino (que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEC ID NO:51) y proporciona el polipeptido de MASP-2 murino con una secuencia lfder que se escinde despues de la segregacion, resultando en la forma madura de MASP-2 murina (SEC ID NO:52). La molecula de ADNc expuesta en la SEC ID NO:53 codifica la MASP-2 de rata (que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEC ID NO:54) y proporciona el polipeptido MASP-2 de rata con una secuencia lfder que se escinde despues de la segregacion, resultando en la forma madura de MASP-2 de rata (SEC ID NO:55).

Los expertos en la tecnica reconoceran que las secuencias descrita en las SEC ID NO:4, SEC ID NO:50 y SEC ID NO:53 representan alelos sencillos de MASP-2 humana, murina y de rata, respectivamente, y que se espera que ocurran la variacion alelica y el empalme alternativo. Las variantes alelica de las secuencias de nucleotidos que se muestran en las SEC ID NO:4, SEC ID N0:50 y SEC ID NO:53, incluidas aquellas que contienen mutaciones silenciosas y en las que las mutaciones producen cambios en las secuencias de aminoacidos, se encuentran dentro del alcance de la presente invencion. Las variantes alelicas de la secuencia de MASP-2 se pueden clonar por sonda de ADNc o bibliotecas genomicas de distintos individuos de acuerdo con procedimientos estandar.

Los dominios de la protema MASP-2 humana (SEC ID NO:6) se muestran en la FIGURA 3A e incluyen un dominio de la protema morfogenica C1r/C1s/de erizo de mar Vegf/osea N-terminal (CUBI) (aa 1-121 de SEC ID NO:6), un dominio de tipo factor de crecimiento epidermico (aa 122-166), un segundo dominio CUBI (aa 167-293), ademas de un tandem de dominios de protemas de control del complemento y un dominio de serina proteasa. El empalme alternativo del gen MASP 2 resultante en MAp19 que se muestra en la FIGURA 3B. MAp19 es una protema no enzimatica que contiene la region CUBI-EGF N-terminal de MASP-2 con cuatro residuos adicionales (EQSL) derivados del exon E, como se muestra en la FIGURA 2.

Se ha demostrado que varias protemas se unen a, o interaction con MASP-2 a traves de interacciones de protema a protema. Por ejemplo, se sabe que MASP-2 se une y forma complejos dependientes del Ca2+ con protemas lectina MBL, H-ficolina y L-ficolina. Se ha demostrado que cada complejo MASP-2/lectina activa el complemento a traves de la escision dependiente de MASP-2 de las protemas C4 y c2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M. et al., J. Exp. Med. 775:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). Los estudios han demostrado que los dominios CUBI-EGF de MASP-2 son esenciales para la asociacion de MASP-2 con MBL (Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001). Se ha demostrado tambien que los dominios CUBIEGFCUBII median la dimerizacion de MASP-2, que se requiere para la formacion de un complejo activo de MBL (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275/30962-30969, 2000). En consecuencia, se pueden identificar agentes inhibidores de MASP-2 que se unen a o interfieren con la regiones diana de MASP-2 conocidas por ser importantes para la activacion del complemento dependiente de MASP-2.

Anticuerpos anti-MASP-2

En algunas realizaciones de este aspecto de la invencion, el agente inhibidor de MASP-2 comprende un anticuerpo anti-MASP-2 que inhibe el sistema de activacion del complemento dependiente de MASP-2. Los anticuerpos anti- MASP-2 utiles en este aspecto de la invencion incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales o recombinantes derivados de cualquier mairnfero que produzca anticuerpos y pueden ser fragmentos multiespedficos, quimericos, humanizados, anti-idiotipo y de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, fragmentos de Fv, fragmentos de scFv y anticuerpos monocatenarios como se describe en este documento.

Se han descrito varios anticuerpos anti-MASP-2 en la bibliograffa, algunos de los cuales se mencionan a continuacion en la TABLA 1. Estos anticuerpos anti-MASP-2 previamente descritos se pueden ensayar por su capacidad de inhibir el sistema de activacion del complemento dependiente de MASP-2 usando los ensayos aqrn descritos. Una vez que se identifica un anticuerpo anti-MASP-2 que funciona como un agente inhibidor de MASP-2, se puede usar para producir anticuerpos anti-idiotipo y usarse para identificar otras moleculas de union a MASP-2, como se describira en mas detalladamente a continuacion.

Tabla 1: Anticuerpos espedficos de MASP-2 de la bibliograffa

ANTfGENO

TIPO DE ANTICUERPO REFERENCIA

MASP-2 recombinante

Policlonal de rata Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 37:803-811,2000

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ANTlGENO

TIPO DE ANTICUERPO REFERENCIA

Fragmento CCP1/2-SP (MoAb 8B5) recombinante humano

MoAb de rata (subclase IgG1) Moller-Kristensen, M., et al.,

J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003

MAp19 (MoAb 6G12) recombinante humano

MoAb de rata Moller-Kristensen, M., et al.,

(reaccion cruzada con MASP-2)

(subclase IgG1) J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003

MASP-2

MoAb de raton Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 35:409

Anticuerpos anti-MASP-2 con funcion efectora reducida

Los anticuerpos anti-MASP-2 para uso pueden tener funcion efectora reducida para reducir la inflamacion que puede surgir de la activacion de la via del complemento clasica. Se ha demostrado que la capacidad de las moleculas de IgG de desencadenar la via del complemento clasica reside dentro de la porcion Fc de la molecula (Duncan, A.R., et al., Nature 332:738-740 1988). Las moleculas IgG en las que la porcion Fc de la molecula ha sido extrafda por escision enzimatica estan desprovistas de esta funcion efectora (vease Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988). Por consiguiente, los anticuerpos con funcion efectora reducida pueden generarse como consecuencia de la ausencia de la porcion Fc de la molecula, teniendo una secuencia Fc geneticamente modificada que minimiza la funcion efectora, o siendo o bien el isotipo IgG2 o IgG4 humano.

Los anticuerpos con funcion efectora reducida pueden producirse por manipulacion biologica molecular estandar de la porcion Fc de las cadenas pesadas de IgG, como se describe en el Ejemplo 9 del presente documento y tambien en Jolliffe, et al., hit'I Rev. Immunol. 10:241-250, 11993, y en Rodrigues, et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1998. Los anticuerpos con funcion efectora reducida tambien incluyen los isotipos IgG2 e IgG4 humanos que tienen la capacidad reducida de activar el complemento y/o interactuar con los receptores de Fc (Ravetch, J.V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol. Today 14:215-221, 1993). Los anticuerpos humanizados o completamente humanos espedficos de MASP- 2 humana comprendidos por los isotipos IgG2 o IgG4 se pueden producir mediante uno de los diversos metodos conocidos por el experto en la tecnica, como se describe en Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, 1998.

Produccion de anticuerpos anti-MASP-2

Los anticuerpos anti-MASP-2 se pueden producir usando polipeptidos MASP-2 (p. je., MASP-2 de longitud total) o usando peptidos que portan el epftopo de MASP-2 antigenico (p. ej., una porcion del polipeptido MASP-2). Los peptidos inmunogenicos pueden ser tan pequenos como de tan solo cinco residuos de aminoacidos. Por ejemplo, el polipeptido MASP-2, incluida la secuencia de aminoacidos completa de SEC ID NO:6, se pueden usar para inducir anticuerpos anti-MASP-2 utiles en el metodo de la invencion. Dominios de MASP-2 particulares conocidos por estar implicados en las interacciones protema-protema, tal como los dominios CUBI y CUBIEGF, asf como tambien la region que abarca el sitio activo de serina proteasa, se pueden expresar como polipeptidos recombinantes, como se describe en el Ejemplo 5, y usarse como antfgenos. A su vez, los peptidos que comprenden una porcion de por lo menos 6 aminoacidos del polipeptido MASP-2 (SEC ID NO:6) son tambien utiles para inducir anticuerpos MASP-2. Ejemplos adicionales de antfgenos derivados de MASP-2 utiles para inducir los anticuerpos de MASP-2 se dan a conocer en la TABLA 2 a continuacion. Los peptidos y polipeptidos MASP-2 utilizados para crear anticuerpos se pueden aislar como polipeptidos naturales o como peptidos recombinantes o sinteticos y como polipeptidos recombinantes cataltticamente inactivos, tal como MASP-2A, como se describe en mas detalle en los Ejemplos 5-7. En algunas realizaciones de este aspecto de la invencion, los anticuerpos anti-MASP-2 se obtienen usando una cepa de raton transgenico, como se describe en los Ejemplos 8 y 9 como se describira en detalle a continuacion.

Los antfgenos utiles para producir anticuerpos anti-MASP-2 tambien incluyen polipeptidos de fusion, tales como fusiones de MASP-2 o su porcion con un polipeptido de inmunoglobulina o con protema unida a maltosa. El inmunogeno del polipeptido puede ser una molecula de longitud total o su porcion. Si la porcion del polipeptido es de tipo hapteno, dicha porcion puede unirse o enlazarse ventajosamente a un vehiculo macromolecular (como una hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de suero bovino (BSA) o toxoide de tetano) para inmunizacion.

Tabla 2: Antfgenos derivados de MASP-2

SEC ID NO:

Secuencia de aminoacidos

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SEC ID NO:6

Protema MASP-2 humana

SEC ID NO:51

Protema MASP-2 murina

SEC ID NO:8

Dominio CUBI de MASP-2 humana (aa 1-121 de SEC ID NO:6)

SEC ID NO:9

Dominios CUBIEGF de MASP-2 humana (aa 1-166 de SEC ID NO:6)

SEC ID NO: 10

Dominios CUBIEGFCUBII de MASP-2 humana (aa 1-293 de SEC IDNO:6)

SEC ID NO: 11

Dominio EGF de MASP-2 humana (aa 122-166 de SEC ID NO:6)

SEC ID NO: 12

Dominio serina proteasa de MASP-2 humana (aa 429-671 de SEC ID NO:6)

SEC ID NO: 13 GKDSCRGDAGGALVFL

Forma mutante inactivada de serina-proteasa (aa 610-625 de SEC ID NO:6 con Ser 618 mutado)

SEC ID NO: 14 TPLGPKWPEPVFGRL

Peptido CUBI humano

SEC ID NO: 15: TAPPGYRLRLYFTHFDLEL SHLCEYDFVKLSSGAKVL ATLCGQ

Peptido CUBI humano

SEC ID NO: 16: TFRSDYSN

Region de union a MBL en el dominio CUBI humano

SEC ID NO: 17: FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF

Region de union a MBL en el dominio CUBI humano

SEC ID NO: 18 IDECQVAPG

Peptido EGF

SEC ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALY

Peptido del sitio activo serina-proteasa

Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales contra MASP-2 se pueden preparar inmunizando a un animal con el polipeptido MASP- 2 o con su porcion inmunogenica, usando metodos conocidos por aquellos con experiencia en la tecnica. Vease, por ejemplo, Green, et al., "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pagina 105, y como se describe en el Ejemplo 6. La inmunogenicidad de un polipeptido MASP-2 se puede incrementar a traves del uso de un adyuvante, incluidos geles minerales, tales como hidroxido de aluminio o adyuvante de Freund (completo o incompleto), sustancias activas superficiales tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. Los anticuerpos policlonales tipicamente se generan en animales tales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, cobayas, cabras u ovejas. Alternativamente, un anticuerpo anti-MASP-2 util en la presente invencion puede tambien derivar de un primate subhumano. Las tecnicas generales para generar diagnostica y terapeuticamente anticuerpos utiles en babuinos se pueden encontrar, por ejemplo, en Goldenberg et al., publicacion de patente internacional num. WO 91/11465, y en Losman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990. Los sueros que contienen anticuerpos inmunologicamente activos se producen luego de la sangre de dichos animales inmunizados, usando procedimientos convencionales conocidos en la tecnica.

Anticuerpos monoclonales

En algunas realizaciones, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2. Los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 son altamente espedficos, dirigiendose contra un solo epttopo de MASP-2. Tal como se emplea en la presente invencion, el modificador "monoclonal" indica que el caracter del anticuerpo se obtiene de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se interpretara que requiere la produccion del anticuerpo por ningun metodo particular. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener usando cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpos por lmeas celulares continuas en cultivo, tal como el metodo del hibridoma descrito por Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975, o se pueden elaborar por metodos de ADN recombinante (vease, p. ej., la patente de EE. UU. num. 4.816.567 para Cabilly). Los anticuerpos monoclonales pueden tambien aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas en Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991, y Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquiera de sus subclases.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener inyectando a un mairnfero adecuado (p. ej., un raton BALB/c) una composicion que comprende un polipeptido de MASP-2 o su porcion Despues de un periodo de tiempo predeterminado, los esplenocitos se extraen del raton y se suspenden en un medio de cultivo celular. Los esplenocitos luego se condensan con una lmea celular inmortal para formar un hibridoma. Los hibridomas formados

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se desarrollan en cultivo celular y se estudian por su capacidad de producir anticuerpo monoclonal contra MASP-2. Un ejemplo que describe mejor la produccion de anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 se provee en el Ejemplo 7. (Vease tambien Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, paginas 2.5.1-2.6.7, 1991).

Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden obtener mediante el uso de ratones transgenicos que han sido modificados para producir anticuerpos humanos espedficos en respuesta a una exposicion antigenica. En esta tecnica, los elementos de locus de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana se introducen en cepas de ratones de lmeas de celulas madre derivadas de embriones que contienen rupturas dirigidas de los locus de cadena pesada y de cadena ligera de la inmunoglobulina endogena. Los ratones transgenicos pueden sintetizar anticuerpos humanos espedficos para anffgenos humanos, tales como los anffgenos de MASP-2 descritos en este documento, y los ratones se pueden usar para producir hibridomas que segregan el anticuerpo de MASP-2 humano, condensando celulas B de dichos animales a lmeas celulares adecuadas de mieloma usando tecnologfa de Kohler-Milstein convencional, como se describe en el Ejemplo 7. Los ratones transgenicos con un genoma de inmunoglobulina humana se comercializan (p. ej., de Abgenix, Inc., Fremont, CA y Medarex, Inc., Annandale, N.J.). Los metodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgenicos se describen, por ejemplo, en Green, L.L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; y Taylor, L.D., etal., Int. Immun. 6:579, 1994.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar de cultivos de hibridoma mediante una diversidad de tecnicas bien consolidadas. Dichas tecnicas de aislamiento incluyen cromatograffa de afinidad con Protema A Sepharose, cromatograffa de exclusion de tamano y cromatograffa de intercambio ionico (vease, por ejemplo, Coligan en las paginas 2.7.1-2.7.12 y en las paginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, paginas 79-104, 1992).

Una vez producidos, los anticuerpos policlonales, monoclonales o derivados de fagos se ensayan primero por su union a MASP-2 espedfica. Se puede utilizar una diversidad de ensayos conocidos por los expertos en la tecnica para detectar anticuerpos que se unen espedficamente a MASP-2. Los ensayos ilustrativos incluyen inmunotransferencia Western o analisis de inmunoprecipitacion por metodos convencionales (p. ej., como se describe en Ausubel et al.), inmunoelectroforesis, ensayos inmunosorbentes unidos a enzimas, membrana de transferencia puntual, ensayos de inhibicion o competicion y ensayos sandwich (como se describe en Harlow y Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Una vez que se identifican los anticuerpos que se unen espedficamente a MASP-2, los anticuerpos anti-MASP-2 se ensayan por su capacidad de funcionar como agentes inhibidores de MASP-2 en uno de varios ensayos tales como, por ejemplo, un ensayo de escision de C4 espedfica de lectinas (descrito en el Ejemplo 2), un ensayo de deposicion de C3b (descrito en el Ejemplo 2) o un ensayo de deposicion de C4b (descrito en el Ejemplo 2).

El experto en la tecnica puede determinar facilmente la afinidad de los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (vease, p. ej., Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949). En una realizacion, los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 utiles para los metodos de la invencion se unen a MASP-2 con una afinidad de union de <100 nM, preferiblemente <10 nM y lo mas preferiblemente <2 nM.

Anticuerpos quimericos/humanizados

Los anticuerpos monoclonales utiles en el metodo de la invencion incluyen anticuerpos quimericos en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena(s) es identica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, asf como tambien fragmentos de dichos anticuerpos (patente estadounidense num. 4.816.567 para Cabilly, y Morrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acacl. Sci. EE, UU. 81:6851-6855, 1984).

Una forma de anticuerpo quimerico util en la invencion es un anticuerpo anti-MASP-2 monoclonal humanizado. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son anticuerpos quimericos, que contienen la secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo las regiones determinantes de complementaridad (CDR) no humanas (p. ej. de raton), de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina del raton a un dominio variable humano. Tfpicamente, los residuos de anticuerpos humanos se sustituyen luego en las regiones marco de las contrapartes no humanas. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se realizan para refinar mas el desempeno del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera practicamente todo de por lo menos uno, y habitualmente dos dominios variables, en donde todos o practicamente todos los bucles corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o practicamente todas las regiones marco Fv son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprendera tambien por lo menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), ffpicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, veanse Jones, P.T., et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L., et al., Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992.

Los anticuerpos humanizados utiles en la invencion incluyen anticuerpos monoclonales humanos que incluyen por lo

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menos una region CDR3 de union a MASP-2. Ademas, las porciones de Fc se pueden reemplazar como para producir IgA o IgM, ademas de anticuerpos de IgG humanos. Dichos anticuerpos humanizados tendran utilidad clmica particular porque reconoceran espedficamente MASP-2 humana, pero no evocaran una respuesta inmune en seres humanos contra el anticuerpo propiamente dicho. En consecuencia, son mas adecuados para administraciones in vivo en seres humanos, especialmente cuando es necesaria la administracion repetida o a largo plazo.

Un ejemplo de la generacion de un anticuerpo anti-MASP-2 humanizado de un anticuerpo monoclonal anti-MASP-2 murino se provee en el Ejemplo 10. Las tecnicas para producir anticuerpos monoclonales tambien se describen, por ejemplo, en Jones, P.T., et al., Nature 321:522, 1986; Carter, P., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE. UU. 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I., et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., paginas 399-434, 1996; y en la patente estadounidense num. 5.693.762 para Queen, 1997. Ademas, existen entidades comerciales que sintetizan anticuerpos humanizados de regiones espedficas de anticuerpos murinos, como Protein Design Labs (Mountain View, CA).

Anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos anti-MASP-2 tambien se pueden preparar usando metodos recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos humanos se pueden preparar usando bibliotecas de expresion de inmunoglobulina humana (disponibles, por ejemplo, de Stratagene, Corp., La Jolla, CA) para producir fragmentos de anticuerpos humanos (Vjj, Vl, Fv, Fd, Fab o F(ab')2)- Estos fragmentos se usan luego para construir anticuerpos humanos completos similares a aquellos usados para producir anticuerpos quimericos.

Anticuerpos anti-idiotipo

Una vez que se identifican los anticuerpos anti-MASP-2 con la actividad inhibidora deseada, estos anticuerpos se pueden utilizar para generar anticuerpos anti-idiotipo que se asemejan a una porcion de MASP-2 usando tecnicas conocidas en el campo. Vease, p. ej., Greenspan, N.S., et al., FASEb J. 7:437, 1993. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a MASP-2 e inhiben competitivamente una interaccion de las protemas MASP-2 requerida para la activacion del complemento se pueden utilizar para generar anti-idiotipos que se asemejan al sitio de union a MBL en la protema MASP-2 y por ende se unen y neutralizan un ligando de union de MASP-2, tal como, por ejemplo, MBL.

Fragmentos de inmunoglobulina

Los agentes inhibidores de MASP-2 utiles en el metodo de la invencion abarcan no solamente moleculas de inmunoglobulina intactas, sino tambien fragmentos conocidos, incluidos fragmentos de Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y Fv, scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Se sabe bien en la tecnica que solamente una pequena porcion de una molecula de anticuerpo, el paratopo, esta implicada en la union del anticuerpo a su epftopo (vease, p. ej., Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). Las regiones pFc' y Fc del anticuerpo son efectoras de la via del complemento clasica, pero no estan implicadas en la union al antfgeno. Un anticuerpo del cual la region pFc' ha sido enzimaticamente escindida, o que ha sido producido sin la region pFc', se denomina fragmento F(ab')2 y retiene ambos sitios de union al antfgeno de un anticuerpo intacto. Un fragmento de F(ab')2 aislado se denomina fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de union al antfgeno. De modo similar, un anticuerpo del cual la region Fc ha sido enzimaticamente escindida, o que ha sido producido sin la region Fc, se denomina fragmento Fab, y retiene uno de los sitios de union al antfgeno de una molecula de anticuerpo intacta.

Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por hidrolisis proteolftica, tal como por digestion de pepsina o papama de anticuerpos enteros por metodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir por escision enzimatica de anticuerpos con pepsina para proveer un fragmento 5S denominado F(ab')2- Este fragmento puede ademas escindirse empleando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reaccion de escision puede realizarse usando un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escision de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escision enzimatica que usa pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos metodos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. num. 4.331.647 para Goldenberg; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman, et al., en Methods in Enzymology, 1:422, Academic Press, 1967; y en Coligan en las paginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.

En algunas realizaciones, el uso de los fragmentos de anticuerpo que carecen de la region Fc se prefieren para evitar la activacion de la via del complemento clasica que se inicia tras la union de Fc al receptor de Fcy. Hay varios metodos mediante los cuales uno puede producir un MoAb que evita las interacciones con el receptor de Fcy. Por ejemplo, la region Fc de un anticuerpo monoclonal puede eliminarse qmmicamente usando digestion parcial por enzimas proteolfticas (tales como digestion de ficina), generando asf, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de

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union al antfgeno, tales como fragmentos Fab o F(ab)2 (Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28:69-71, 1991).

Alternativamente, el isotipo de IgG humano y4 IgG, que no se une a los receptores de Fcy, se puede usar durante la construccion de un anticuerpo humanizado como se describe en este documento. Los anticuerpos, anticuerpos monocatenarios y dominios de union al antigeno que carecen del dominio Fc pueden tambien modificarse usando tecnicas recombinantes como se describe en la presente memoria.

Fragmentos de anticuerpos monocatenarios

Alternativamente, uno puede crear moleculas de union a peptidos sencillos espedficas de MASP-2 en donde las regiones Fv de las cadenas pesada y ligera estan conectadas. Los fragmentos Fv pueden estar conectados por un enlazador peptfdico para formar una protema de union al antigeno monocatenaria (scFv). Estas protemas de union al antigeno monocatenarias se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios Vh y Vl que estan conectados por un oligonucleotido. El gen estructural se inserta en un vector de expresion, que posteriormente se introduce en una celula hospedante tal como E. coli. Las celulas hospedantes recombinantes sintetizan una cadena de polipeptido sencilla con un peptido enlazador que une los dos dominios V. Los metodos para producir scFv se describen, por ejemplo, en Whitlow, et al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et al., Science 242:423, 1988; patente estadounidense num. 4.946.778 para Ladner; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, 1993.

Como un ejemplo ilustrativo, un scFv espedfico de MASP-2 se puede obtener exponiendo los linfocitos al polipeptido de MASP-2 in vitro y seleccionando bibliotecas que exhiben anticuerpos en fago o vectores similares (por ejemplo, a traves del uso de protema o peptido de MASP-2 inmovilizado o marcado). Los genes que codifican los polipeptidos que tienen dominios de union a polipeptidos de MASP-2 potenciales se pueden obtener ensayando bibliotecas de peptidos aleatorias exhibidas en fago o en bacterias tales como E. coli. Estas bibliotecas que exhiben peptidos aleatorios se pueden usar para detectar peptidos que interactuan con MASP-2. Las tecnicas para crear y detectar dichas bibliotecas que exhiben peptidos se conocen en la tecnica (patente estadounidense num. 5.223.409 para Lardner; patente estadounidense num. 4.946.778 para Ladner; patente estadounidense num. 5.403.484 para Lardner; patente estadounidense num. 5.571.698 para Lardner; y Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996), y las bibliotecas que exhiben peptidos aleatorios y kits para ensayar dichas bibliotecas estan comercialmente disponibles, por ejemplo, de CLONTeCh Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo anti-MASP-2 util en este aspecto de la invencion es un peptido que codifica una region determinante de complementaridad (CDR) que se une a un epftopo en un antfgeno de MASP-2 e inhibe la activacion del complemento dependiente de MASP-2. Los peptidos CdR ("unidades de reconocimiento mmimo") se pueden obtener construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interes. Dichos genes se preparan, por ejemplo, usando la reaccion en cadena de la polimerasa para sintetizar la region variable de ARN de celulas que producen anticuerpos (vease, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods en Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pagina 166, Cambridge University Press, 1995; y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pagina 137, Wiley-Liss, Inc., 1995).

Los anticuerpos de MASP-2 descritos en este documento se administran a un sujeto que lo necesita para inhibir la activacion del complemento dependiente de MASP-2. En algunas realizaciones, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo anti-MASP-2 monoclonal de gran afinidad humano o humanizado con funcion efectora reducida.

V. Composiciones farmaceuticas y metodos de administracion

Dosis

En otro aspecto, la invencion da a conocer composiciones para inhibir los efectos adversos de la activacion del complemento dependiente de MASP-2, que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 y un vehmulo farmaceuticamente aceptable. El agente inhibidor de MASP-2 se puede administrar a un sujeto que lo necesita en una dosis terapeuticamente eficaz para tratar o aliviar afecciones asociadas con la activacion del complemento dependiente de MASP-2. Una dosis terapeuticamente eficaz se refiere a la cantidad del agente inhibidor de MASP-2 suficiente para generar un alivio de los smtomas de la afeccion.

La toxicidad y la eficacia terapeutica de los agentes inhibidores de MASP-2 se pueden determinar por procedimientos farmaceuticos convencionales que emplean modelos animales, como el modelo de raton MASP-2 -/- murino que expresa el transgen de MASP-2 humano descrito en el Ejemplo 3. Con el uso de dichos modelos animales, se pueden determinar el NOAEL (nivel de efecto adverso no observado) y la MED (dosis mmimamente eficaz) empleando metodos convencionales. La relacion de dosis entre los efectos NOAEL y MED es la relacion terapeutica, que se expresa como la relacion NOAEL/MED. Los agentes inhibidores de MASP-2 que exhiben grandes relaciones o indices terapeuticos son los que mas se prefieren. Los datos obtenidos de ensayos de cultivos celulares y estudios animales se pueden usar para formular una gama de dosis para uso en seres humanos. La

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dosis del agente inhibidor de MASP-2 preferiblemente yace dentro del intervalo de concentraciones circulantes que incluyen MED con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificacion y la ruta de administracion que se utilicen.

Para cualquier formulacion de compuestos, la dosis terapeuticamente eficaz se puede estimar usando modelos animales. Por ejemplo, se puede formular una dosis en un modelo animal para logar un intervalo de concentracion en plasma circulante que incluya la MED. Los niveles cuantitativos del agente inhibidor de MASP-2 en el plasma tambien pueden medirse, por ejemplo, por cromatograffa de lfquidos de alta resolucion.

Ademas de los estudios de toxicidad, la dosis eficaz puede tambien estimarse en base a la cantidad de protema MASP-2 presente en un sujeto vivo y a la afinidad de union del agente inhibidor de MASP-2. Se ha demostrado que los niveles de MASP-2 en sujetos humanos normales esta presente en el suero en niveles bajos en el intervalo de 500 ng/ml, y los niveles de MASP-2 en un sujeto particular, se pueden determinar usando un ensayo cuantitativo para MASP-2 descrito en Moller-Kiistensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003.

En general, la dosis de las composiciones administradas que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 vana dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la estatura, el sexo y el estado medico general del sujeto, y de los antecedentes medicos previos. A modo ilustrativo, los agentes inhibidores de MASP-2, tales como anticuerpos anti-MASP-2, se pueden administrar en intervalos de dosis de aproximadamente 0,010 a 10,0 mg/kg, preferiblemente de 0,010 a 1,0 mg/kg, mas preferiblemente 0,010 a 0,1 mg/kg del peso corporal del sujeto.

La eficacia terapeutica de las composiciones y metodos inhibidores de MASP-2 de la presente invencion en un sujeto determinado, y las dosis adecuadas, se pueden determinar de acuerdo con ensayos del complemento conocidos por el experto en la tecnica. El complemento genera diversos productos espedficos. Durante la ultima decada, se han desarrollado y se encuentran disponibles en el mercado ensayos sensibles y espedficos para la mayona de estos productos de activacion, incluidos los pequenos fragmentos de activacion C3a, C4a y C5a y los grandes fragmentos de activacion iC3b, C4d, Bb y sC5b-9. La mayona de estos ensayos utilizan anticuerpos monoclonales que reaccionan con antfgenos nuevos (neoantfgenos) expuestos en el fragmento, pero no en las protemas naturales de las cuales estan formados, lo que hace que estos ensayos sean muy simples y espedficos. La mayona se basan en tecnologfa ELISA, aunque el radioinmunoensayo es todavfa utilizado en ocasiones para C3a y C5a. Estos ultimos ensayos miden tanto los fragmentos no procesados como sus fragmentos 'desArg', que son las formas importantes encontradas en la circulacion. Los fragmentos no procesados y C5adeSArg son rapidamente aclarados por la union a los receptores de la superficie celular y en consecuencia estan presentes en concentraciones muy reducidas, mientras que C3adeSArg no se une a las celulas y se acumula en el plasma. La medicion de C3a proporciona un indicador sensible de la activacion del complemento independiente de la via. La activacion de la via alternativa se puede evaluar midiendo el fragmento Bb. La deteccion del producto de fase fluida de activacion de la via de ataque a la membrana, sC5b-9, aporta datos de que el complemento esta siendo activado hasta la culminacion. Dado que tanto la via de lectinas como la clasica generan los mismos productos de activacion, C4a y C4d, la medicion de estos dos fragmentos no provee ninguna informacion sobre cual de estas dos vfas ha generado los productos de activacion.

Agentes adicionales

Las composiciones y metodos que comprenden los agentes inhibidores de MASP-2 pueden opcionalmente comprender uno o mas agentes terapeuticos adicionales, que pueden aumentar la actividad del agente inhibidor de MASP-2 o que proveen funciones terapeuticas relacionadas en un modo aditivo o sinergico. Por ejemplo, uno o mas agentes inhibidores de MASP-2 pueden administrarse en combinacion con uno o mas agentes antiinflamatorios y/o analgesicos. Se determinara la inclusion y seleccion de un agente(s) adicional para lograr un resultado terapeutico deseado. Los agentes antiinflamatorios y/o analgesicos adecuados incluyen: antagonistas de los receptores de serotonina; agonistas de los receptores de serotonina; antagonistas de los receptores de histamina; agonistas de los receptores de bradiquinina; inhibidores de calicrema; antagonistas de los receptores de taquinina, incluidos antagonistas de subtipo de receptores neuroquinina1 y neuroquinina2; antagonistas de los receptores del peptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP); antagonistas de los receptores de interleucina; inhibidores de enzimas activos en la via sintetica para metabolitos de acido araquidonico, incluidos inhibidores de la isoforma PLA2 e inhibidores de la isoforma PLCy, inhibidores de ciclooxigenasa (COX) (que pueden ser o bien COX-1, COX-2 o inhibidores de COX-1 y -2 no selectivos), inhibidores de lipooxigenasa; antagonistas de los receptores de prostanoides incluidos antagonistas de los subtipos de receptores de ecosanoides EP-1 y EP-4 y antagonistas de los subtipos de receptores de tromboxano; antagonistas de los receptores de leucotrienos incluidos los antagonistas de los subtipos de receptores de leucotrienos B4 y antagonistas de los subtipos de receptores de leucotrienos D4; agonistas de los receptores de opioides, incluidos agonista de los subtipos de receptores de p-opioides, 8-opioides y K-opioides; agonistas y antagonistas de purinoceptores incluidos antagonistas de receptores P2X y P2Y; abridores de los canales de potasio sensibles a trifosfato (ATP); inhibidores de MAP cinasa; inhibidores de acetilcolina nicotmicos; y agonistas de los receptores alfa adrenergicos (incluidos agonistas de alfa-1, alfa-2 y alf-1 y 2 no selectivos).

Cuando se usa en la prevencion o el tratamiento de restenosis, el agente inhibidor de MASP-2 de la presente invencion puede combinarse con uno o mas agentes anti-restenosis para administracion concomitante. Los agentes anti-restenosis adecuados incluyen: agentes antiplaquetarios incluidos inhibidores y antagonistas de receptores de

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trombinas, antagonistas de los receptores de adenosina difosfato (ADP) (tambien conocidos como antagonistas de los receptores del purinoceptor-i), inhibidores y antagonistas de los receptores de tromboxano y antagonistas de los receptores de glucoprotemas de la membrana plaquetaria; inhibidores de las moleculas de adhesion celular, incluidos inhibidores de selectina e inhibidores de integrina; agentes anti-quimiotacticos; antagonistas de los receptores de interleucina; e inhibidores de senalizacion intracelular incluidos: inhibidores de la protema cinasa C (PKC) y protema tirosina fosfatasas, moduladores de protema tirosina cinasa intracelular, inhibidores de dominios de homologfa2 de src (SH2) y antagonistas de los canales de calcio.

Los agentes inhibidores de MASP-2 de la presente invencion se pueden administrar tambien en combinacion con uno o mas de otros inhibidores del complemento. Ningun inhibidor del complemento esta actualmente aprobado para uso en seres humanos, no obstante, se ha demostrado que algunos agentes farmacologicos bloquean el complemento in vivo. Muchos de estos agentes son tambien toxicos o son inhibidores solamente parciales (Asghar, S.S., Pharmacol. Rev. 36:223-44, 1984), y el uso de los mismos ha sido limitado al uso como herramientas de investigacion. K76COOH y mesilato de nafamstat son dos agentes que han demostrado cierta eficacia en modelos animales de trasplante (Miyagawa, S., et al., Transplant Proc. 24:483-484, 1992). Tambien se ha demostrado que las heparinas de bajo peso molecular son eficaces para regular la actividad del complemento (Edens, R.E., et al., Complement Today, pag. 96-120, Basel: Karger, 1993). Se cree que estos inhibidores de moleculas pequenas pueden ser utiles como agentes para usar en combinacion con los agentes inhibidores de MASP-2 de la presente invencion.

Otros inhibidores del complemento naturales pueden ser utiles en combinacion con los agentes inhibidores de MASP-2 de la presente invencion. Los inhibidores biologicos del complemento incluyen el factor del complemento soluble 1 (sCR1). Este inhibidor natural se puede hallar en la membrana exterior de las celulas humanas. Otros inhibidores de membranas incluyen DAF, MCP y CD59. Se han ensayado formas recombinantes por su actividad anti-complemento in vitro e in vivo. Se ha demostrado que sCR1 es eficaz en el xenotrasplante, en donde el sistema del complemento (tanto de la via alternativa como de la clasica) desencadena el smdrome de rechazo hiperactivo al cabo de minutos de perfundir la sangre por el organo recien trasplantado (Platt J.L., et al., Immunol. Today 11:450-6, 1990; Marino I.R., et al., Transplant Proc. 1071-6, 1990; Johnstone, P.S., et al., Transplantation 54:573-6, 1992). El uso de sCR1 protege y extiende el tiempo de supervivencia del organo trasplantado, implicando a la via del complemento en la patogenesis de la supervivencia del organo (Leventhal, J.R. et al., Transplantation 55:857-66, 1993; Pruitt, S.K., et al., Transplantation 57:363-70, 1994).

Los inhibidores del complemento adicionales adecuados para uso en combinacion con las composiciones de la presente invencion tambien incluyen, a modo de ejemplo, MoAb tales como aquellos desarrollados por Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut, y MoAb anti-properdina.

Cuando se usan en el tratamiento de las artritis (p. ej., artrosis y artritis reumatoidea), los agentes inhibidores de MASP-2 de la presente invencion se pueden combinar con uno o mas agentes condroprotectores, que pueden incluir uno o mas promotores de anabolismo del cartflago y/o uno o mas inhibidores de catabolismo del cartflago, y adecuadamente tanto un agente anabolico como un agente inhibidor catabolico, para administracion concomitante. Los agentes condroprotectores de promocion anabolica adecuados incluyen agonistas de los receptores de interleucina (IL) incluidos IL-4, IL-10, IL-13, rhIL-4, rhIL-10 y rhIL-13, e IL-4, IL-10 o IL-13 quimerica; agonistas de la superfamilia del factor-p de crecimiento transformador, incluidos TGF-p, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, protemas morfogenicas oseas incluidas BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-1) y OP-2/BMP-8, factores de diferenciacion del crecimiento incluidos GDF-5, GDF-6 y GDF-7, TGF-p y BMP recombinantes, y TGF-p y BMP quimericos; factores de crecimiento de tipo insulina incluidos IGF-1; y factores de crecimiento de fibroblastos incluidos bFGF. Los agentes condroprotectores inhibidores catabolicos adecuados incluyen antagonistas de los receptores de interleucina-1 (IL-1) (IL-lra), incluidos los receptores de IL-1 humana soluble (shulL-lR), rshulL-lR, rhlL- lra, anticuerpo anti-ILl, AF11567 y AF12198; antagonistas de los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (TNF-a), incluidos los receptores solubles que incluyen sTNFRl y sTNFRII, receptores solubles de TNF recombinante y receptores solubles de TNF quimerico incluidos rhTNFR:Fc quimerico, receptores solubles de fusion de Fc y anticuerpos anti-TNF; inhibidores de ciclooxigenasa-2 (espedficos de COX-2), incluidos 697, SC-58451, celecoxib, rofecoxib, nimesulide, diclofenac, meloxicam, piroxicam, NS-398, RS-57067, SC-57666, SC-58125, flosulide, etodolac, L-745,337 y DFU-T-614; inhibidores de protema cinasa activada por mitogenos (MAPK), incluidos inhibidores de ERK1, ERK2, SAPK1, SAPK2a, SAPK2b, SAPK2d, SAPK3, incluidos inhibidores de SB 203580, SB 203580 yodo, SB202190, SB 242235, SB 220025, RWJ 67657, RWJ 68354, FR 133605, L-167307, PD 98059, PD 169316; inhibidores del factor nuclear kappa B (NFkB), incluidos ester feniletflico de acido cafeico (CAPE), DM- CAPE, peptido SN-50, ditiocarbamato de himenialdisina y pirrolidona; inhibidores de oxido mtrico sintasa (NOS), incluidos N6-monometil-L-arginina, 1400W, difenilenoyodo, S-metil isotiourea, S-(aminoetil) isotiourea, L-N6-(l- iminoetil)lisina, 1,3-PBITU, 2-etil-2-tiopseudourea, aminoguanidina, N(1)-nitro-L-arginina y N(1)-nitro-L-arginina metil ester, inhibidores de metaloproteinasas de matriz (MMP), incluidos inhibidores de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14 y MMP-15, e incluidos U-24522, minociclina, 4-Abz- Gly-Pro-D-Leu- D-Ala-NHOH, Ac-Arg-Cys-Gly-Val-Pro-Asp-NH2, TIMP1 rhumano, TIMP2 rhumano y fosforoamidon; moleculas de adhesion celular, incluidos agonistas y antagonistas de integrina, incluidos aVp3 MoAb LM 609 y equistatina; agentes anti-quimiotacticos incluidos receptores de F-Met-Leu-Phe, receptores de IL-8, receptores de MCP-1 y receptores de MlP1-I/RANTES; inhibidores de senalizacion intracelular, incluidos (a) inhibidores de protema cinasa, incluidos (i) inhibidores de protema cinasa C (PKC) (isozima) incluida calfostatina C, G-6203 y GF 109203X,

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y (ii) inhibidores de protema tirosina cinasa; (b) moduladores de protema tirosina fofatasas intracelulares (PTPases); y (c) inhibidores de dominios SH2 (dominios de Homologfa2 src).

Para algunas aplicaciones, puede ser beneficioso administrar los agentes inhibidores de MASP-2 de la presente invencion en combinacion con un agente inhibidor de espasmos. Por ejemplo, para aplicaciones urogenitales, puede ser beneficioso incluir por lo menos un agente inhibidor de espasmos del musculo liso y/o por lo menos un agente anti-inflamacion, y para procedimientos vasculares puede ser util incluir por lo menos un inhibidor de vasoespasmos y/o por lo menos un agente anti-inflamacion y/o por lo menos un agente anti-restenosis. Los ejemplos adecuados de agentes inhibidores de espasmos incluyen antagonistas de los subtipos de receptores de serotonina2; antagonistas de los receptores de taquiquinina; donantes de oxido mtrico; abridores de los canales de calcio sensibles a ATP; antagonistas de los canales de calcio; y antagonistas de los receptores de endotelina.

Vehmulos farmaceuticos y vehmulos de administracion

En general, las composiciones del agente inhibidor de MASP-2 de la presente invencion, combinadas con cualquier otro agente terapeutico seleccionado, estan adecuadamente contenidas en un vehmulo farmaceuticamente aceptable. El vehmulo es no toxico y biocompatible y se selecciona como para no afectar perjudicialmente la actividad biologica del agente inhibidor de MASP-2 (y cualquier otro agente combinado con estos). Los vehmulos farmaceuticamente aceptables ilustrativos para peptidos se describen en la patente estadounidense num. 5.211.657 para Yamada. Los anticuerpos anti-MASP-2 y los peptidos inhibidores utiles en la invencion se pueden formular en preparaciones en formas solida, semisolida, en gel, lfquida o gaseosa, tal como comprimidos, capsulas, polvos, granulos, unguentos, disoluciones, supositorios, inhalantes e inyecciones que permiten la administracion oral, parenteral o quirurgica. La invencion tambien contempla la administracion local de las composiciones recubriendo los dispositivos medicos y similares.

Los vehmulos adecuados para administracion parenteral por inyeccion, infusion o irrigacion, o topica incluyen agua destilada, disolucion salina fisiologica tamponada con fosfato, disoluciones de Ringer normales o lactadas, disolucion de dextrosa, disolucion de Hank o propanodiol. Ademas, los aceites esteriles, fijos pueden emplearse como disolvente o medio de suspension. Para este proposito, puede emplearse cualquier aceite biocompatible incluidos mono o digliceridos. Ademas, los acidos grasos tales como acido oleico encuentran uso en la preparacion de inyectables. El vehmulo y el agente se pueden combinar como un lfquido, suspension, gel polimerizable o no polimerizable, pasta o balsamo.

El vehmulo puede comprender tambien un vehmulo de administracion para sostener (es decir, extender, demorar o regular) la administracion del agente(s) o para potenciar la administracion, absorcion, estabilidad o farmacocinetica del agente(s) terapeutico. Dicho vehmulo de administracion puede incluir, a modo de ejemplo no limitativo, micropartmulas, microesferas, nanoesferas o nanopartmulas compuestas por protemas, liposomas, carbohidratos, compuestos organicos sinteticos, compuestos inorganicos, hidrogeles polimericos o copolimericos y micelas polimericas. Los sistemas de administracion adecuados de hidrogel y micelas incluyen los copolfmeros de PEO:PHB:PEO y los complejos de copolfmero/ciclodextrina descritos en el documento WO 2004/009664 A2 y PEO y los complejos de PEO/ciclodextrina descritos en el documento US 2002/0019369 Al. Dichos hidrogeles se pueden inyectar localmente en el sitio de accion destinado o por via subcutanea o intramuscular para formar una formulacion de liberacion sostenida.

Para administracion intra-articular, el agente inhibidor de MASP-2 se puede transportar en los vehmulos lfquidos o geles anteriormente descritos que son inyectables, en los vehmulos de administracion sostenida anteriormente descritos que son inyectables o en acido hialuronico o un derivado de acido hialuronico.

Para administracion oral de agentes no peptidergicos, el agente inhibidor de MASP-2 se puede transportar en una carga o diluyente inerte tal como sacarosa, almidon de mafz o celulosa.

Para administracion topica, el agente inhibidor de MASP-2 se puede transportar en un unguento, locion, crema, gel, gota, supositorio, aerosol, lfquido o polvo, o en gel o sistemas de administracion microcapsular mediante un parche transdermico.

Diversos sistemas de administracion nasal y pulmonar, incluidos aerosoles, inhaladores dosificadores, inhaladores en polvo seco y nebulizadores estan siendo desarrollados y pueden adaptarse adecuadamente para administracion de la presente invencion en un vehfculo de administracion en aerosol, inhalante o nebulizador, respectivamente.

Para administracion intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV), se pueden usar los sistemas de administracion apropiadamente esteriles (p. ej., lfquidos, geles, suspensiones, etc.) para administrar la presente invencion.

Las composiciones de la presente invencion pueden tambien incluir excipientes biocompatibles, tales como agentes de dispersion o humectantes, agentes de suspension, diluyentes, tampones, potenciadores de penetracion, emulsionantes, aglutinantes, espesantes, saponferos (para administracion oral).

Vehfculos farmaceuticos para anticuerpos y peptidos

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Mas espedficamente con respecto a anticuerpos anti-MASP-2 y peptidos inhibidores, las formulaciones ilustrativas pueden administrarse por via parenteral como formulaciones inyectables de una disolucion o suspension del compuesto en un diluyente fisiologicamente aceptable con un vehmulo farmaceutico que puede ser un lfquido esteril tal como agua, aceites, disolucion salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, las sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes de pH y similares pueden estar presentes en composiciones que comprenden anticuerpos anti-MASP-2 y peptidos inhibidores. Los componentes adicionales de las composiciones farmaceuticas incluyen petroleo (tal como de origen animal, vegetal o sintetico), por ejemplo, aceite de soja y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vedculos lfquidos preferidos para disoluciones inyectables.

Los anticuerpos anti-MASP-2 y los peptidos inhibidores pueden tambien administrarse en la forma de una inyeccion de liberacion lenta o preparacion de implante que se puede formular en un modo tal como para permitir una liberacion sostenida o pulsatil de los agentes activos.

Modos de administracion

Las composiciones farmaceuticas que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar en una diversidad de formas dependiendo de si lo mas adecuado es un modo local o sistemico de administracion para la afeccion que se este tratando. Ademas, como se describio anteriormente en la presente invencion con respecto a los procedimientos de reperfusion extracorporea, los agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar a traves de la introduccion de las composiciones de la presente invencion a la sangre o el plasma recirculante. A su vez, las composiciones de la presente invencion se pueden administrar recubriendo o incorporando las composiciones en un dispositivo medico.

Administracion sistemica

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "administracion sistemica" tiene como fin incluir, aunque sin limitarse a ello, las rutas orales y parenterales, incluida la ruta intramuscular (IM), subcutanea, intravenosa (IV), intra-arterial, de inhalacion, sublingual, bucal, topica, transdermica, nasal, rectal, vaginal y otras rutas de administracion, que resulta eficazmente en la dispersion del agente administrado a uno o multiples sitios de accion terapeutica prevista. Las rutas preferidas de administracion sistemica para las presentes composiciones incluyen la ruta intravenosa, intramuscular, subcutanea y de inhalacion. Se ha de apreciar que la ruta de administracion sistemica exacta para los agentes seleccionados utilizados en las composiciones particulares de la presente invencion se determinara en parte en funcion de la susceptibilidad del agente a las vfas de transformacion metabolica asociadas con una ruta de administracion determinada. Por ejemplo, los agentes peptidergicos pueden administrarse de la forma mas adecuadas por rutas que no sean la ruta oral.

Los anticuerpos y polipeptidos inhibidores de MASP-2 se pueden administrar a un sujeto que lo necesita por cualquier medio adecuado. Los metodos de administracion de anticuerpos y polipeptidos de MASP-2 incluyen la administracion por las rutas de administracion oral, pulmonar, parenteral (p. ej., inyeccion intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutanea), inhalacion (como mediante la formulacion de un polvo fino), transdermica, nasal, vaginal, rectal o sublingual, y se pueden formular en formas de dosificacion adecuadas para cada ruta de administracion.

A modo de ejemplo representativo, los anticuerpos y peptidos inhibidores de MASP-2 se pueden introducir a un cuerpo vivo por aplicacion a una membrana corporal capaz de absorber los polipeptidos, por ejemplo, las membranas nasales, gastrointestinales y rectales. Los polipeptidos tfpicamente se aplican a la membrana absorbente junto con un potenciador de penetracion. (veanse, p. ej., Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:2l3, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, Nueva York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release, 13:241, 1990). Por ejemplo, STDHF es un derivado sintetico de acido fusfdico, un tensioactivo esteroideo que es similar en estructura a las sales biliares, y se ha utilizado como potenciador de penetracion para administracion nasal. (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dic. 1990.)

Los anticuerpos y polipeptidos inhibidores de MASP-2 se pueden introducir en asociacion con otra molecula, tal como un lfpido, para proteger a los polipeptidos de la degradacion enzimatica. Por ejemplo, la union covalente de los polfmeros, especialmente polietilenglicol (PEG), se ha utilizado para proteger a ciertas protemas de la hidrolisis enzimatica en el cuerpo y prolongar asf la semivida (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). Se han descrito muchos sistemas polimericos para la administracion de protemas (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989).

Recientemente, se han desarrollado liposomas con mejor estabilidad y semivida en la circulacion en suero (vease, p. ej., la patente estadounidense num. 5.741.516 para Webb). Asimismo, se han revisado diversos metodos de preparaciones de liposomas y de tipo liposomas como vedculos de farmacos potenciales (veanse, p. ej., la patente

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estadounidense num. 5.567.434 para Szoka; patente estadounidense num. 5.552.157 para Yagi; patente estadounidense num. 5.565.213 para Nakamori; patente estadounidense num. 5.738.868 para Shinkarenko; y patente estadounidense num. 5.795.587 para Gao).

Para aplicaciones transdermicas, los anticuerpos y polipeptidos inhibidores de MASP-2 se pueden combinar con otros ingredientes adecuados, tales como vefuculos y/o adyuvantes. No hay limitaciones con respecto a la naturaleza de dichos otros ingredientes, excepto que deben ser farmaceuticamente aceptables para la administracion prevista, y no pueden degradar la actividad de los ingredientes activos de la composicion. Los ejemplos de vehuculos adecuados incluyen unguentos, cremas, geles o suspensiones, con o sin colageno purificado. Los anticuerpos y polipeptidos inhibidores de MASP-2 pueden tambien impregnarse en parches transdermicos, yesos y vendas, preferiblemente en forma lfquida o semilfquida.

Las composiciones de la presente invencion se pueden administrar sistemicamente en forma periodica en intervalos determinados para mantener un nivel deseado de efecto terapeutico. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar por inyeccion subcutanea, cada dos a cuatro semanas o en intervalos menos frecuentes. El esquema de dosificacion sera determinado por el medico, teniendo en cuenta diversos factores que pueden influir en la accion de la combinacion de agentes. Estos factores incluiran el grado de progreso de la afeccion que se este tratando, la edad, el sexo y el peso del paciente, y otros factores clmicos. La dosis para cada agente individual variara como una funcion del agente inhibidor de MASP-2 que se incluya en la composicion, ademas de la presencia y naturaleza de cualquier vefuculo de administracion de farmacos (p. ej., un vefuculo de liberacion sostenida). A su vez, la cantidad de la dosis se podra ajustar para que represente una variacion en la frecuencia de la administracion y en la conducta farmacocinetica del agente(s) administrado.

Administracion local

Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "local" abarca la aplicacion de un farmaco en o alrededor de un sitio de accion localizada prevista, y puede incluir, por ejemplo, la administracion topica a la piel u otros tejidos afectados, administracion oftalmica, intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV), intra-articular, intracavitaria, intracraneal o intravesicular, colocacion o irrigacion. Se puede preferir la administracion local para posibilitar la administracion de una dosis inferior, a fin de evitar efectos colaterales sistemicos, y para un control mas preciso del tiempo de administracion y concentracion de los agentes activos en el sitio de administracion local. La administracion local proporciona una concentracion conocida en el sitio diana, independientemente de la variabilidad entre pacientes en el metabolismo, el torrente circulatorio, etc. El control de la dosis mejorado tambien se provee mediante el modo directo de administracion.

La administracion local de un agente inhibidor de MASP-2 se puede lograr en el contexto de metodos quirurgicos para tratar una enfermedad o afeccion, tal como por ejemplo durante procedimientos de cirugfa de derivacion arterial, aterectomfa, procedimientos con laser, procedimientos ultrasonicos, angioplastfa con globo y colocacion de stent. Por ejemplo, un inhibidor de MASP-2 se puede administrar a un sujeto junto con un procedimiento de angioplastia con globo. Un procedimiento de angioplastia con globo implica insertar un cateter que tiene un globo desinflado en una arteria. El globo desinflado se posiciona proximo a la placa aterosclerotica y se infla de manera tal que la placa queda comprimida contra la pared vascular. En consecuencia, la superficie del globo esta en contacto con la capa de las celulas endoteliales vasculares en la superficie del vaso sangumeo. El agente inhibidor de MASP- 2 puede unirse al cateter de angioplastia con globo en un modo que permita la liberacion del agente en el sitio de la placa aterosclerotica. El agente se puede unir al cateter con globo de acuerdo con procedimientos estandar conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el agente se puede conservar en un compartimiento del cateter con globo hasta que el globo se infle, momento en el cual se libera al entorno local. Alternativamente, el agente se puede impregnar en la superficie del globo, de modo tal de entrar en contacto con las celulas de la pared arterial a medida que el globo se infla. El agente puede tambien administrarse en un cateter con globo perforado tal como aquellos descritos en Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85\ 1110-1117, 1992. Vease tambien la solicitud PCT WO 95/23161 publicada para un procedimiento ilustrativo de como acoplar una protema terapeutica a un cateter de angioplastia con globo. Asimismo, el agente inhibidor de MASP-2 puede incluirse en un gel o recubrimiento polimerico aplicado a un stent, o puede incorporarse al material del stent, de manera tal que el stent eluya el agente inhibidor de MASP-2 despues de la colocacion vascular.

Las composiciones inhibidoras de MASP-2 utilizadas en el tratamiento de artritis y otros trastornos musculoesqueleticos se pueden administrar localmente por inyeccion intra-articular. Dichas composiciones pueden adecuadamente incluir un vehuculo de liberacion sostenida. Como otro ejemplo de casos en los que puede ser conveniente la administracion local, las composiciones inhibidoras de MASP-2 utilizadas en el tratamiento de afecciones urogenitales puede instilarse adecuadamente en forma intravesical o dentro de otra estructura urogenital.

Recubrimientos en un dispositivo medico

Los agentes inhibidores de MASP-2 tales como anticuerpos y peptidos inhibidores se pueden inmovilizar en (o dentro) de una superficie de un dispositivo medico implantable o acoplable. La superficie modificada tipicamente estara en contacto con el tejido vivo despues del implante al cuerpo de un animal. Por "dispositivo medico implantable o acoplable" se entiende cualquier dispositivo que se implante o acople al tejido del cuerpo de un animal,

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durante la operacion normal del dispositivo (p. ej., stents y dispositivos de administracion de farmacos implantables). Dichos dispositivos medicos implantables o acoplables pueden estar hechos de, por ejemplo, nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, poliestireno, polivinilcloruro, polipropileno, polietileno, dextrano, Sepharose, agar, almidon, nylon, acero inoxidable, titanio y polfmeros biodegradables y/o biocompatibles. La union de la protema a un dispositivo se puede lograr con cualquier tecnica que no destruya la actividad biologica de la protema enlazada, por ejemplo acoplando uno o ambos residuos N-C-terminales de la protema al dispositivo. El acoplamiento tambien se puede realizar en uno o mas sitios internos en la protema. Se pueden usar tambien multiples acoplamientos (tanto internos como en los extremos de la protema). Una superficie de un dispositivo medico implantable o acoplable se puede modificar para incluir grupos funcionales (p. ej., carboxilo, amida, amino, eter, hidroxilo, ciano, nitrido, sulfanamido, acetilmicotmico, epoxido, silanico, anfudrico, succimmico, azido) para inmovilizar allf las protemas. Las qmmicas de acoplamiento incluyen, aunque sin limitarse a ello, la formacion de esteres, eteres, amidas, azido y derivados de sulfanamido, cianato y otros enlaces a los grupos funcionales disponibles en los anticuerpos de MASP- 2 o peptidos inhibidores. Los anticuerpos o fragmentos inhibidores de MASP-2 tambien se pueden acoplar en forma no covalente por adicion de un marcador de afinidad a la protema, tal como GST (D.B. Smith y K.S. Johnson, Gene 67:31, 1988), polihistidinas (E. Hochuli et al., J. Chromatog. 411:77, 1987) o biotina. Dichos marcadores de afinidad se pueden usar para el acoplamiento reversible de la protema a un dispositivo.

Las protemas tambien se pueden unir en forma covalente a la superficie del cuerpo de un dispositivo, por ejemplo, por activacion covalente de la superficie del dispositivo medico. A modo de ejemplo representativo, la protema(s) matricelular se puede acoplar al cuerpo del dispositivo mediante cualquiera de los siguientes pares de grupos reactivos (en donde un miembro del par esta presente en la superficie del cuerpo del dispositivo y el otro miembro del par esta presente en la protema(s) matricelular): acido hidroxflico/carboxflico para producir un enlace ester; hidroxilo/anhidrido para producir un enlace ester; hidroxilo/isocianato para producir un enlace uretano. Una superficie del cuerpo de un dispositivo que no posee grupos reactivos utiles se puede tratar con grabado de plasma por descarga de radiofrecuencia (RFGD) para generar grupos reactivos con el fin de permitir la deposicion de protema(s) matricelular (p. ej., tratamiento de plasma con oxfgeno para introducir grupos que contienen oxfgeno; tratamiento de plasma con propilamino para introducir grupos amino).

Los agentes inhibidores de MASP-2 que comprenden moleculas de acido nucleico tales como inhibidores de peptidos que codifican ARNi o ADN antisentido se pueden embeber en matrices porosas acopladas al cuerpo de un dispositivo. Las matrices porosas representativas utiles para preparar la capa superficial son aquellas preparadas a partir de tendon o colageno dermico, que se pueden obtener de una diversidad de fuentes comerciales (p. ej., Sigma y Collagen Corporation), o matrices de colageno preparadas como se describe en las patentes estadounidenses num. 4.394.370 para Jefferies y 4.975.527 para Koezuka. Un material de colageno se denomina UltraFiber™ y se obtiene de Norian Corp. (Mountain View, California).

Ciertas matrices polimericas pueden tambien emplearse, si se desea, e incluyen polfmeros de ester acnlico y polfmeros de acido lactico, como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses num. 4.526.909 para Urist y 4.563.489 para Urist. Los ejemplos particulares de polfmeros utiles son aquellos de ortoesteres, anfudridos, propileno-cofumaratos, o un polfmero de uno o mas monomeros de acido a-hidroxicarboxflico, (p. ej., un acido a- hidroxiacetico (acido glicolico) y/o un acido a-hidroxipropionico (acido lactico)).

Esquemas de tratamiento

En aplicaciones profilacticas, las composiciones farmaceuticas se administran a un sujeto susceptible a, o que conlleva riesgo de, una afeccion asociada con la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riego de desarrollar smtomas de la afeccion. En aplicaciones terapeuticas, las composiciones farmaceuticas se administran a un sujeto del que se sospecha que padece, o que ya padece, una afeccion asociada con la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en una cantidad terapeuticamente eficaz suficiente para aliviar, o por lo menos reducir parcialmente, los smtomas de la afeccion. En ambos esquemas profilacticos y terapeuticos, las composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar en varias dosis hasta lograr un resultado terapeutico suficiente en el sujeto. La aplicacion de las composiciones inhibidoras de MASP-2 de la presente invencion se puede llevar a cabo por administracion unica de la composicion, o en una secuencia limitada de administraciones, para el tratamiento de una afeccion aguda, p. ej., lesion por reperfusion u otra lesion traumatica. Alternativamente, la composicion se puede administrar en intervalos periodicos durante un periodo de tiempo extendido para el tratamiento de afecciones cronicas, p. ej., artritis o psoriasis.

Los metodos y composiciones de la presente invencion se pueden usar para inhibir la inflamacion y procesos relacionados que tfpicamente resultan de procedimientos medicos y quirurgicos diagnosticos y terapeuticos. Para inhibir dichos procedimientos, la composicion inhibidora de MASP-2 de la presente invencion se puede aplicar en un peri-procedimiento. Tal como se emplea en la presente memoria "peri-procedimiento" se refiere a la administracion de la composicion inhibidora pre-procedimiento y/o intra-procedimiento y/o post-procedimiento, es decir, antes del procedimiento, antes y durante el procedimiento, antes y despues del procedimiento, antes, durante y despues del procedimiento, durante el procedimiento, durante y despues del procedimiento, o despues del procedimiento. La aplicacion peri-procedimiento se puede llevar a cabo por administracion local de la composicion al sitio quirurgico o del procedimiento, como por inyeccion o irrigacion continua o intermitente del sitio o por administracion sistemica.

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Los metodos adecuados para la administracion peri-operatoria local de disoluciones del agente inhibidor de MASP-2 se describen en las patentes estadounidenses num. 6.420.432 para Demopulos y 6.645.168 para Demopulos. Los metodos adecuados para administracion local de composiciones condroprotectoras incluido el agente(s) inhibidor de MASP-2 se describen en la solicitud de patente internacional PCT WO 01/07067 A2. Los metodos y composiciones adecuados para administracion sistemica dirigida de composiciones condroprotectoras, incluido el agente(s) inhibidor de MASP-2, se describen en la solicitud de patente internacional PCT WO 03/063799 A2.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran simplemente el mejor modo contemplado ahora para practicar la invencion, pero no deben interpretarse como limitativos de la invencion.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la generacion de una cepa de raton deficiente de MASP-2 (MASP-2-/-) pero suficiente de MAp19 (MAp19+/+).

Materiales y metodos: Se diseno el vector de direccionamiento pKO-NTKV 1901 para alterar los tres exones que codifican el extremo C-terminal de MASP-2 murina, incluido el exon que codifica el dominio de serina proteasa, como se muestra en la FIGURA 4. Se uso PKO-NTKV 1901 para transfectar la lmea celular ES, E14.1a (SV129 Ola). Se seleccionaron clones resistentes a neomicina y sensibles a timidina cinasa. Se seleccionaron 600 clones ES y, de estos, se identificaron cuatro clones diferentes y se verifico por analisis que conteman el evento de direccionamiento selectivo y la recombinacion esperada, como se muestra en la FIGURA 4. Las quimeras se generaron a partir de estos cuatros clones positivos por transferencia de embriones. Las quimeras luego se retrocruzaron en el fondo de genes C57/BL6 para crear machos transgenicos. Los machos transgenicos se cruzaron con hembras para generar F1 en donde 50% de la descendencia mostro heterocigosidad para el gen MASP-2 alterado. Los ratones heterocigotos se entrecruzaron para generar descendencia deficiente de MASP-2 de homocigotos, resultando en ratones heterocigotos y de tipo salvaje en la proporcion de 1:2:1, respectivamente.

Resultados y fenotipo: Los ratones deficientes de MASP-2-/- homocigotos resultantes se hallaron viables y fertiles, y se verifico que eran deficientes de MASP-2 por analisis Southern para confirmar el correcto evento de direccionamiento, por analisis Northern para confirmar la ausencia de ARNm de MASP-2 y por analisis Western para confirmar la ausencia de la protema MASP-2 (no se muestran los datos). La presencia de ARNm de MAp19 y la ausencia de ARNm de MASP-2 se confirmaron ademas usando RT-PCR resuelta en tiempo en una maquina LightCycler. Los ratones MASP-2-/- continuan expresando MAp19, MASP-1 y ARNm y protema MASP-3 como se espera (no se muestran los datos). La presencia y abundancia de ARNm en los ratones MASP-2-/- para Properdina, Factor B, Factor D, C4, C2 y C3 se evaluo por analisis LightCycler y se hallo identico a aquel de los controles de la camada de tipo salvaje (no se muestran los datos). El plasma de los ratones MASP-2-/- homocigotos es totalmente deficiente de la activacion del complemento mediada por la via de lectinas y la activacion del complemento mediada por la via alternativa, como se describe en mas detalle en el Ejemplo 2.

Generacion de una cepa de MASP-2-/- en un fondo C57BL6 puro: Los ratones MASP-2-/- se retrocruzan con una lmea C57BL6 pura por nueve generaciones antes del uso de la cepa MASP-2-/- como modelo animal experimental.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra que se requiere MASP-2 para la activacion del complemento mediante la via alternativa y la via de lectinas.

Metodos y materiales:

Ensayo de escision de C4 espedfica de la via de lectinas: Se ha descrito un ensayo de escision de C4 por Petersen, et al., J. Immunol. Methods 257:107 (2001) que mide la activacion de la via de lectinas resultante de acido lipoteicoico (LTA) de S. aureus, que se une a L-ficolina. El ensayo descrito en el Ejemplo 11 se adapto para medir la activacion de la via de lectinas mediante MBL recubriendo la placa con LPS y manano o cimosano antes de anadir suero de ratones MASP-2 -/- como se describe a continuacion. El ensayo tambien se modifico para eliminar la posibilidad de la escision de C4 debido a la via clasica. Esto se logro utilizando un tampon de dilucion de muestras que contema NaCl 1 M, lo cual permite la union de gran afinidad de los componentes de reconocimiento de la via de lectinas a sus ligandos, pero evita la activacion de C4 endogena, excluyendo asf la participacion de la via clasica al disociar el complejo C1. En smtesis, en las muestras de suero de ensayo modificadas (diluidas en gran cantidad de sal (tampon de NaCl 1 M) se anaden placas recubiertas con ligando, seguidas de la adicion de una cantidad constante de C4 purificada en un tampon con una concentracion fisiologica de sal. Los complejos de reconocimiento unidos que contienen MASP-2 escinden C4, generando la deposicion de C4b.

Metodos de ensayo:

1) Placas de microtitulacion Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, Cat. No. 442404, Fisher Scientific) se recubrieron con 1 |j/ml de manano (M7504 Sigma) o cualquier otro ligando (p. ej., los mencionados a continuacion) diluido en tampon

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de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6).

Se emplearon los siguientes reactivos en el ensayo:

a. manano (1 jg/pocillo manano (M7504 Sigma) en 100 |jl tampon de recubrimiento):

b. cimosano (1 jg/pocillo cimosano (Sigma) en 100 jl tampon de recubrimiento);

c. LTA (jg/pocillo en 100 jl tampon de recubrimiento o 2 jg/pocillo en 20 jl metanol)

d. 1 jg de Mab 4H5 espedfico de H-ficolina en tampon de recubrimiento

e. PSA de Aerococcus viridans (2 jg/pocillo en 100 jl tampon de recubrimiento)

f. 100 jl/pocillo de S. aureus DSM20233 fijada a formalina (OD550=0,5) en tampon de recubrimiento.

2) Las placas se incubaron durante toda la noche a 4C.

3) Despues de incubar durante toda la noche, los sitios de union a la protema residual se saturaron incubando las placas con tampon bloqueador HSA-TBS al 0,1% (0,1% (p/v) HSA en Tris-CL 10 mM, NaCl 140 mM, NaN3 1,5 mM, pH 7,4) durante 1-3 horas; luego lavando las placas 3X con TBS/tween/Ca2+ (TBS con 0,05% Tween 20 y CaCl2 5 mM, MgCl21 mM, pH 7,4).

4) Las muestras de suero a ensayar se diluyeron en tampon de union a MBL (NaCl 1 M) y las muestras diluidas se anadieron a las placas y se incubaron durante la noche a 4C. Los pocillos que recibieron solamente tampon se usaron como controles negativos.

5) Despues de la incubacion durante la noche a 4°C, las placas se lavaron 3X con TBS/tween/Ca2+. C4 humano (100 jl/pocillo de 1 jg/ml diluido en BBS (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl2 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4)) se anadio luego a las placas y se incubo durante 90 minutos a 37°C. Las placas se lavaron nuevamente 3X con TBS/tween/Ca2+.

6) Se detecto la deposicion de C4b con un C4c antihumano de pollo conjugado a fosfatasa alcalina (diluido 1:1000 en TBS/tween/Ca2+, que se anadio a las placas y se incubo durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego nuevamente 3X con TBS/tween/Ca2+.

7) Se detecto fosfatasa alcalina anadiendo 100 jl de disolucion de sustrato de p-nitrofenil fosfato, incubando a temperatura ambiente durante 20 minutos y leyendo la OD405 en una lectora de placas de microtitulacion.

Resultados: Las FIGURAS 6A-B muestran la cantidad de deposicion de C4b en manano (FIGURA 6A) y cimosano (FIGURA 6B) en diluciones en suero de MASP-2+/+ (cruces), MASP-2+/- (drculos cerrados) y MASP-2-/- (triangulos cerrados). La FIGURA 6C muestra la actividad relativa de la convertasa C4 en las placas recubiertas con cimosano (barras blancas) o manano (barras sombreadas) de ratones MASP-2-/+ (n=5) y ratones MASP-2-/- (n=4) en relacion con ratones de tipo salvaje (n=5) en base a la medicion de la cantidad de deposicion de C4b normalizado al suero de tipo salvaje. Las barras de error representan la desviacion estandar. Como se muestra en las FIGURAS 6A-C, el plasma de ratones MASP-2-/- es totalmente deficiente de la activacion del complemento mediada por la via de lectinas en placas recubiertas con manano y cimosano. Estos resultados demuestran claramente que MASP-2, pero no MASP-1 ni MASP-3, es el componente efector de la via de lectinas.

Ensayo de deposicion de C3b:

1) Se recubren placas de microtitulacion Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, cat. No. 442404, Fisher Scientific) con 1 jg/pocillo manano (M7504 Sigma) o cualquier otro ligando diluido en tampon de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6) y se incuba durante toda la noche a 4°C.

2) Se saturan sitios de union a protema residual incubando la placa con tampon de bloqueo HSA-TBS al 0,1% (0,1% (p/v) HSA en Tris-CL 10 mM, NaCl 140 mM, NaN 1,5 mM, pH 7,4) durante 1-3 horas.

3) Las placas se lavan en TBS/tw/Ca++ (TBS con 0,05% Tween 20 y CaCl2 5 mM) y se anade BBS diluido a las muestras de suero (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl2 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4). Los pocillos que reciben solamente tampon se usan como controles negativos. Un conjunto control de muestras de suero obtenidas de ratones MASP-2-/- de tipo salvaje se despojan de C1q antes del uso en el ensayo. El suero de los ratones despojados de C1q se preparo usando Dynabeads acoplados a la protema A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) recubiertas con C1q IgG antihumano de conejo (Dako, Glostmp, Dinamarca), de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

4) Despues de incubar durante toda la noche a 4°C y de otro lavado con TBS/tw/Ca++, se detecta C3 convertida y unida con anticuerpo C3c antihumano policlonal (Dako A 062) diluido en TBS/tw/Ca++ a 1:1000). El anticuerpo secundario es IgG anticonejo de cabra (molecula entera) conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma Immunochemicals A-

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3812) diluido 1:10.000 en TBS/tw/Ca++. La presencia de la via del complemento alternativa (AP) se determina por adicion de 100 jl disolucion de sustrato (conjuntos de comprimidos de nitrofenilfosfato Sigma Fast, Sigma) y se incuba a temperatura ambiente. La hidrolisis se supervisa cuantitativamente midiendo la absorcion a 405 nm en una lectora de placas de microtitulacion. Se prepara una curva estandar para cada analisis, usando diluciones en serie de muestras de plasma/suero.

Resultados: Los resultados que se muestran en las FIGURAS 7A y 7B son de sueros mezclados de varios ratones. Las cruces representan suero de MASP-2+/+, los drculos rellenos representan suero de MASP-2+/+ desprovistos de C1q, los cuadrados abiertos representan suero de MASP-2-/- y los triangulos abiertos representan suero de MASP- 2-/- desprovistos de C1q. Como se muestra en las FIGURAS 7A-B, el suero de los ratones MASP-2-/- ensayados en un ensayo de deposicion de C3b produce niveles muy bajos de activacion de C3 en placas recubiertas de manano (FIGURA 7A) y cimosano (FIGURA 7B). Este resultado demuestra claramente que se requiere MASP-2 para contribuir a la generacion inicial de C3b proveniente de C3 para iniciar la via del complemento alternativa. Este es un resultado sorprendente en funcion de la vision ampliamente aceptada de que los factores del complemento C3, el factor B, el factor D y properdina forman una via alternativa funcional independiente en la que C3 puede someterse a un cambio de configuracion conformacional espontaneo a una forma de "tipo C3b" que luego genera convertasa de fase fluida iC3Bb y deposita moleculas C3b en las superficies de activacion tales como cimosano.

MASP-2 recombinante reconstituye la activacion de C4 dependiente de la vfas de lectinas en suero de ratones MASP-2-/-

Con el fin de establecer que la ausencia de MASP-2 fue la causa directa de la perdida de la activacion de C4 dependiente de lectinas en los ratones MASP-2-/-, se examino el efecto de anadir protema MASP-2 recombinante a muestras de suero en el ensayo de escision de C4 anteriormente descrito. Se produjeron protemas recombinantes de MASP-2 murina funcionalmente activa y MASP-2A murina cataltticamente inactiva (en donde el residuo serina del sitio activo en el dominio de serina proteasa se sustituyo con el residuo alanina), y se purificaron como se describe a continuacion en el Ejemplo 5. El suero agrupado de ratones 4 MASP-2 -/- se pre-incubo con concentraciones de protema en aumento de MASP-2 murina recombinante o MASP-2A murina recombinante inactiva y se ensayo la actividad de la convertasa C4 como se describio anteriormente.

Resultados: Como se muestra en la FIGURA 8, la adicion de la protema MASP-2 recombinante murina funcionalmente activa (se muestra como triangulos abiertos) al suero obtenido de los ratones MASP-2 -/- restauro la activacion de C4 dependiente de la via de lectinas en un modo dependiente de la concentracion de la protema, mientras que la protema MASP-2A murina catalfticamente inactiva (se muestra como asteriscos) no restauro la activacion de C4. Los resultados que se muestran en la FIGURA 8 se normalizan a la activacion de C4 observada con el suero de raton de tipo salvaje mezclado (se muestra como una lmea de puntos).

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la generacion de una cepa de raton transgenico que es MASP-2-/- murina, MAp19+/+ y que expresa un transgen de MASP-2 humano (gen inactivado de MASP-2 murina (knock-out) y gen modificado de MASP-2 humana (knock-in).

Materiales y metodos: Se construyo un minigen que codifica MASP-2 humana llamado "mini hMASP-2" (SEC ID NO:49) como se muestra en la FIGURA 5, que incluye una region promotora del gen MASP 2 humano, incluidos los primeros 3 exones (exon 1 a exon 3) seguido de secuencia de ADNc que representa la secuencia codificadora de los siguiente 8 exones, codificando asf la protema MASP-2 de longitud total promovida por su promotor endogeno. El constructo de mini hMASP-2 se inyecto en huevos fertilizados de MASP-2-/- con el fin de reemplazar el gen MASP 2 murino deficiente por el de MASP-2 humana expresada en forma transgenica.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe el aislamiento de la protema MASP-2 humana en la forma de proenzima de suero humano.

Metodo de aislamiento de MASP-2 humana: Se ha descrito un metodo para aislar MASP-2 de suero humano en Matsushita et al., J. Immunol. 165:2637-2642, 2000. En smtesis, se pasa el suero humano por una columna de manano de levadura-Sepharose usando tampon de imidazol 10 mM (pH 6,0) que contiene NaCl 0,2 M, CaCh 2,0 mM, NPGB 0,2 mM, p-APMSFy 20 jM 2% mannitol. Las proenzimas mAsP-1 y MaSP-2 forman complejo con MBL y se eluye con el tampon anteriormente mencionado que contiene manosa 0,3 M. Para separar las proenzimas MASP- 1 y MASP-2 de MBL, se aplican preparaciones que contienen el complejo a anti-MBL-Sepharose y luego se eluyen las MASP con tampon de imidazol que contiene EDTA 20 mM y NaCl 1 M. Finalmente, las proenzimas MASP-1 y MASP-2 se separan unas de otras pasando por anti-MASP-l-Sepharose en el mismo tampon que se uso para anti- MBL-Sepharose. Se recupera la MASP-2 en los efluentes, mientras que MASP-1 se eluye con tampon de glicina 0,1 M (pH 2,2).

Ejemplo 5

Este ejemplo describe la expresion recombinante y la produccion de protemas de MASP-2 humana, de rata y murina

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recombinante de longitud total, polipeptidos derivados de MASP-2 y formas mutantes catalfticamente activadas de MASP-2

Expresion de MASP-2 humana, murina y de rata de longitud total:

La secuencia de ADNc de longitud total de MASP-2 humana (SEC ID NO: 4) tambien se subclono en el vector de expresion mamftero pCI-Neo (Promega), que promueve la expresion eucariota bajo el control de la region del potenciador/promotor de CMV (se describe en Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)). El ADNc de raton de longitud total (SEC ID N0:50) el ADNC de MASP-2 de rata (SEC ID nO:53) se subclonaron cada uno en el vector de expresion pED. Los vectores de expresion de MASP-2 se transfectaron luego a la lmea celular de ovario de hamster chino adherente DXB1 usando el procedimiento de transfeccion de fosfato de calcio estandar descrito en Maniatis et al., 1989. Las celulas transfectadas con estos constructos se desarrollaron muy lentamente, implicando que la proteasa codificada es citotoxica.

En otro planteamiento, el constructo del minigen (SEC ID NO:49) que contiene ADNc humano de MASP-2 promovido por su promotor endogeno se transfecta transitoriamente a celulas de ovario de hamster chino (CHO). La protema MASP-2 humana se segrega en el medio de cultivo y se afsla como se describe a continuacion.

Expresion de MASP-2 catalfticamente inactiva de longitud total:

Fundamentos: La MASP-2 es activada por la escision autocatalftica despues de que los subcomponentes de reconocimiento MBL o ficolinas (o bien L-ficolina, H-ficolina o M-ficolina) se unen a su respectivo patron de carbohidrato. La escision autocatalftica que resulta en la activacion de MASP-2 a menudo sucede durante el procedimiento de aislamiento de MASP-2 de suero, o durante la purificacion que le sigue a la expresion recombinante. Con el fin de obtener una preparacion de protemas mas estable para uso como antfgeno, se creo una forma catalfticamente inactiva de MASP-2, disenada como MASP-2A,que reemplaza el residuo serina que esta presente en la tnada catalftica del dominio de proteasa con un residuo alanina en rata (SEC ID NO:55 Ser617 a Ala617); en raton (SEC ID NO:52 Ser617 a Ala617); o en ser humano (SEC ID NO:3 Ser618 a Ala618).

Con el fin de generar protemas MASP-2A humanas y murinas catalfticamente inactivas, se llevo a cabo mutagenesis dirigida al sitio usando los oligonucleotidos que se exponen en la TABLA 5. Los oligonucleotidos de la TABLA 5 se disenaron para renaturalizar a la region del ADNc humano y murino que codifica la serina enzimaticamente activa y el oligonucleotido que contienen una incompatibilidad con el fin de cambiar el codon de serina al codon de alanina. Por ejemplo, se usaron oligonucleotidos PCR de SEC ID NOS:56-59 en combinacion con ADNc de MASP-2 humana (SEC ID NO:4) para ampliar la region desde el codon de partida hasta la serina enzimaticamente activa y desde la serina hasta el codon finalizador para generar la lectura abierta completa de la MASP-2A mutada que contiene la mutacion Ser618 a Ala618. Los productos de PCR se purificaron despues de la electroforesis en gel de agarosa, y se generaron superposiciones de adenosina sencillas usando un procedimiento de factor de cola estandar. La MASP-2A con cola de adenosina se clono luego al vector pGEM-T easy, transformada en E. coli.

Se genero una protema MASP-2A de rata catalfticamente inactiva convirtiendo a cinasa y renaturalizando la SEC ID NO:64 y la SEC ID NO:65 combinando estos dos oligonucleotidos en cantidades molares equivalentes, calentando a 100°C durante 2 minutos y enfriando lentamente hasta temperatura ambiente. El fragmento renaturalizado resultante tiene extremos compatibles con Pst1 y Xba1 y se inserto en lugar del fragmento Pst1-Xba1 de ADNc de MASP-2 de rata de tipo salvaje (SEC ID NO: 53) para generar MASP-2A de rata.

5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEC ID NO: 64)

5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (SEC ID NO: 65)

Se subclono MASP-2A humana, murina y de rata o bien en uno de los vectores de expresion de mamftero pED o pCI-Neo y se transfecto en la lmea celular de ovario de hamster chino DXB1 como se describe a continuacion.

En otro planteamiento, la forma catalfticamente inactiva de MASP-2 se construye usando el metodo descrito en Chen et al., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001. En smtesis, el plasmido que contiene el ADNc de MASP-2 humano de longitud total (descrito en Thiel et al., Nature 386:506, 1997) se digiere con Xho1 y EcoR1 y el ADNC de MASP-2 (descrito en la presente como SEC ID NO:4) se clona en los correspondientes sitios de restriccion del vector de transferencia del baculovirus pFastBac1 (Life Technologies, NY). El sitio activo de serina proteasa de MASP-2 en Ser618 se altera luego a Ala618 sustituyendo los oligonucleotidos bicatenarios que codifican el aminoacido de la region pepftdica 610-625 (SEC ID NO: 13) con los aminoacidos de la region nativa 610 a 625 para crear un polipeptido de longitud total de MASP-2 con un dominio de proteasa inactiva. Construccion de plasmidos de expresion que contienen regiones de polipeptidos derivados de Masp-2 humana.

Los siguientes constructos se producen usando el peptido de senales de MASP-2 (residuos 1-15 de SEC ID NO: 5) para segregar diversos dominios de MASP-2. Se prepara un constructo que expresa el dominio humano CUBI de MASP-2 (SEC ID NO:8) por PCR ampliando la region que codifica los residuos 1-121 de MASP-2 (SEC ID NO:6) (correspondientes al dominio N-terminal de CUBI). Se prepara un constructo que expresa el dominio humano

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CUBIEGF de MASP-2 (SEC ID NO:9) por PCR ampliando la region que codifica los residuos 1-166 de MASP-2 (SEC ID NO:6) (correspondientes al dominio N-terminal de CUBIEGF). Se prepara un constructo que expresa el dominio humano CUBIEGFCUBII de MASP-2 (SEC ID NO: 10) por PCR ampliando la region que codifica los residuos 1-293 de MASP-2 (SEC ID NO:6) (correspondientes al dominio N-terminal de CUBIEGFCUBII). Los dominios precedentemente mencionados se amplfan por PCR usando VentR polimerasa y pBS-MASP-2 como molde, de acuerdo con metodos de PCR establecidos. La secuencia del cebador 5' del cebador sentido (5'- CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SEC ID NO:34) introduce un sitio de restriccion BamHI (subrayado) en el extremo 5' de los productos de PCR. Los cebadores antisentido para cada uno de los dominios de MASP-2, que se exponen a continuacion en la TABLA 5 estan disenados para introducir un codon finalizador (negrita) seguido por un sitio EcoRI (subrayado) al final de cada producto de PCR. Una vez ampliados los fragmentos de ADN se digieren con BamHI y EcoRI y se clonan en los sitios correspondientes del vector pFastBacl. Los constructos resultantes se caracterizan por mapeo de restriccion y se confirman por secuenciacion de ADNds.

TABLA 5: Cebadores de PCR para MASP-2)

Dominio de MASP-2

Cebador PCR en 5' Cebador PCR en 3'

SEC ID NO:8 CUBI (aa 1-121 de SEC ID NO:6)

5 'CGGGATCCATGA GGCTGCTGACCCT C-3' (SEC ID NO:34) 5'GGAATTCCTAGGCTGCAT A (SEC ID NO:35)

SEC ID NO:9 CUBIEGF (aa 1-166 de SEC ID NO:6)

5 'CGGGATCCATGA GGCTGCTGACCCT C-3' (SEC ID NO:34) 5 'GGA ATTCCTAC AGGGCGC T-3' (SEC ID NO:36)

SEC ID NO: 10 CUBIEGFCUBII (aa 1-293 de SEC ID NO:6)

5 'CGGGATCCATGA GGCTGCTGACCCT C-3' (SEC ID NO:34) 5 'GG AATTCCTAGTAGTGGA T 3' (SEC ID NO:37)

SEC ID NO:4 MASP-2 humana

5'ATGAGGCTGCTG ACCCTCCTGGGCC TTC 3' (SEC ID NO: 56) 5 'TT AAAATCACTAATTATG TTCTCGATC 3' (SEC ID NO: 59) hMASP-2_inverso

SEC ID NO:4 ADNc de MASP-2 humana

5 CAGAGGTGAC GC AGGAGGGGCAC 3' (SEC ID NO: 58) hMASP-2_ala_directo 5'GTGCCCCTCCTGCGTCAC CTCTG 3' (SEC ID NO: 57) hMASP- 2_ala_inverso

SEC ID N0:50 ADNc de MASP-2 murina

5'ATGAGGCTACTC ATCTTCCTGG3' (SEC ID NO: 60) mMASP-2_directo 5 'TT AG A A ATT ACTT ATT AT GTTCTCAATCC3' (SEC ID NO: 63) mMASP-2_inverso

SEC ID N0:50 ADNc de MASP-2 murina

5 CCCCCCCTGCGT CACCTCTGCAG3' (SEC ID NO: 62) mMASP-2_ala_directo 5 CTGCAGAGGTGACGCAG GGGGGG 3' (SEC ID NO: 61) mMASP-2_ala_inverso

Expresion eucariota recombinante de MASP-2 y produccion de protema MASP-2A de raton, rata y ser humano enzimaticamente inactiva

Los constructos de expresion de MASP-2 y MASP-2A anteriormente descritos se transfectaron en celulas DXB1 usando el procedimiento de transfeccion de fosfato de calcio estandar (Maniatis et al., 1989). MASP-2A se produjo en medio libre de suero para garantizar que las preparaciones no estuviesen contaminadas con otras protemas del suero. Se cosecho el medio de celulas confluentes todos los segundos dfas (cuatro veces en total). El nivel de MASP-2A recombinante promedio en aproximadamente 1,5 mg/litro de medio de cultivo para cada una de las tres especies.

Purificacion de la protema MASP-2A: Se purifico MASP-2A (mutante Ser-Ala anteriormente descrito) por cromatograffa de afinidad en columnas MBP-A-agarosa. Esta estrategia permitio la rapida purificacion sin el uso de marcas externas. MASP-2A (100-200 ml de medio diluido con un volumen equivalente de tampon de carga (Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, que contema NaCl 150 mM y CaCl2 25 mM) se cargo a una columna de afinidad de MBP-agarosa (4 ml) pre-equilibrada con 10 ml de tampon de carga. Despues de lavar con otros 10 ml de tampon de carga, la protema se eluyo en fracciones de 1 ml con Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, que contema NaCl 1,25 M y EDTA 10 mM. Las fracciones que conteman MASP-2A se identificaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. En caso de ser necesario, se purifico MASP-2A adicionalmente por cromatograffa de intercambio ionico en una columna MonoQ (HR 5/5). Se dializo la protema con Tris-Cl 50 mM a pH 7,5, que contema NaCl 50 mM y se cargo a una columna equilibrada en el mismo tampon. Despues del lavado, se eluyo MASP-2A con un gradiente de NaCl de 0,05-1 M en 10 ml.

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Resultados: Se obtuvieron rendimientos de 0,25-0,5 mg de la protema MASP-2A a partir de 200 ml de medio. La masa molecular de 77,5 kDa determinada por MALDI-MS es mayor que el valor calculado del polipeptido no modificado (73,5 kDa) debido a la glucosilacion. La union de glicanos en cada uno de los sitios de W-glucosilacion representa la masa observada. MASP-2A migra como una sola banda en los geles de SDS-poliacrilamida, demostrando que no se procesa de manera proteolttica durante la biosmtesis. La masa molecular promedio en peso determinada por ultracentrifugacion de equilibrio concuerda con el valor calculado para los homodfmeros del polipeptido glucosilado.

Produccion de polipeptidos de MASP-2 recombinantes humanos

Otro metodo para producir polipeptidos recombinantes derivados de MASP-2 y MASP2A se describe en Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068-5077, 2001. En smtesis, celulas de insecto Spodoptera frugiperda (celulas Sf9 Ready-Plaque de Novagen, Madison, WI) se desarrollan y mantienen en medio libre de suero Sf900II (Life Technologies) enriquecido con 50 lU/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies). Las celulas de insecto Trichoplusia ni (High Five) (provistas por Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, Francia) se mantienen en medio TC100 (Life Technologies) que contiene FCS al 10% (Dominique Dutscher, Brumath, Francia) enriquecido con 50 lU/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina. Se generan baculovirus recombinantes usando el sistema Bac-to-Bac (Life Technologies). El ADN de bacmido se purifica usando el sistema de purificacion Qiagen midiprep (Qiagen) y se usa para transfectar las celulas de insecto Sf9 usando Cellfectin en medio SFM Sf900 II (Life Technologies) como se describe en el protocolo del fabricante. Se recogen partfculas recombinantes del virus 4 dfas despues, se titulan por ensayo de placas del virus y se amplfan como lo describen King y Possee, en The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., Londres, pag. 111-114, 1992.

Las celulas High Five (1,75 x 107 celulas/175-cm2 matraz de cultivo de tejido) se infectan con los virus recombinantes que contienen los polipeptidos de MASP-2 a una multiplicidad de la infeccion de 2 en medio SFM Sf900 II a 28° C durante 96 h. Los sobrenadantes se recogen por centrifugacion y se anade diisopropil fosforofluoridato a una concentracion final de 1 mM.

Los polipeptidos de MASP-2 se segregan en el medio de cultivo. Los sobrenadantes de cultivo se dializan contra NaCl 50 mM, CaCl 1 mM, hidrocloruro de trietanolamina 50 mM, pH 8,1, y se cargan a 1,5 ml/min a una columna Q- Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) (2,8 x 12 cm) equilibrada en el mismo tampon. La elucion se realiza aplicando un gradiente lineal de 1,2 litros a NaCl 350 mM en el mismo tampon. Las fracciones que contienen los polipeptidos de MASP-2 recombinantes se identifican por analisis Western blot, se precipitan por adicion de (NHO2SO4 a 60% (p/v) y se dejan durante la noche a 4°C. Los sedimentos se resuspenden en NaCl 145 mM, CaCl 1 mM, hidrocloruro de trietanolamina 50 mM, pH 7,4 y se aplican a una columna tSk G3000 SWG (7,5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA) equilibrada en el mismo tampon. Los polipeptidos purificados luego se concentran hasta 0,3 mg/ml por ultrafiltracion en microconcentradores Microsep (p.m. lfmite de corte = 10.000) (Filtron, Karistein, Alemania).

Ejemplo 6

Este ejemplo describe un metodo para producir anticuerpos monoclonales contra polipeptidos de MASP-2.

Materiales y metodos:

Antfgenos de MASP-2: Se produce antisuero de MASP-2 antihumano policlonal inmunizando a conejos con los siguientes polipeptidos de MASP-2 aislados: MASP-2 humana (SEC ID nO:6) aislada de suero como se describe en el Ejemplo 4; MASP-2 humana recombinante (SEC ID NO:6), MASP-2A que contiene el dominio de proteasa inactivo (SEC iD NO: 13), como se describe en los Ejemplos 4-5; y CUBI recombinante (SEC ID NO:8), cUbEGFI (SEC ID NO:9) y CUBEGFCUBII (SEC ID NO: 10) expresados como se describio anteriormente en el Ejemplo 5.

Anticuerpos policlonales: Conejos de seis semanas de vida, imprimados con BCG (vacuna bacillus Calmette-Guerin) se inmunizan por inyeccion de 100 |jg de polipeptido MASP-2 a 100 jg/ml en disolucion salina esteril. Las inyecciones se aplican cada 4 semanas con titulacion de anticuerpo monitoreada por ensayo ELISA como se describe en el Ejemplo 7. Se recogen sobrenadantes de cultivo para purificacion de anticuerpos por cromatograffa de afinidad de la protema A.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe un metodo para producir anticuerpos monoclonales murinos contra polipeptidos de MASP-2 de rata o humanos.

Materiales y metodos:

Ratones macho A/J (Harlan, Houston, Tex.), 8-12 semanas de vida, reciben inyecciones subcutaneas de 100 jg de polipeptidos rMASP-2 o rMASP-2A humanos o de rata (preparados como se describe en el Ejemplo 4 o en el Ejemplo 5) en adyuvante de Freund completo (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) en 200 jl de disolucion salina

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tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. En intervalos de dos semanas, los ratones reciben dos veces inyecciones subcutaneas de 50 pg de polipeptido rMASP-2 o rMASP-2A humano o de rata en adyuvante de Freund incomplete. En la cuarta semana, los ratones reciben una inyeccion de 50 pg de polipeptido rMASP-2 o rMASP-2A de rata o humano en PBS y se fusionan 4 dfas despues.

Para cada fusion, se preparan suspensiones unicelulares del bazo de un raton inmunizado y se usan para la fusion con celulas de mieloma Sp2/0. Se fusionan 5x108 de las celulas Sp2/0, y 5x108 de las celulas de bazo se fusionan en medio que contiene 50% polietilenglicol (P.M. 1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) y dimetilsulfoxido al 5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Las celulas luego se ajustan hasta una concentracion de 1,5x105 celulas de bazo por 200 pl de la suspension en medio Iscove (Gibco, Grand Island, N.Y.), enriquecido con suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 0,4 pM y timidina 16 pM. Se anaden 200 pl de la suspension celular a cada pocillo de aproximadamente veinte placas de microcultivo de 96 pocillos. Despues de aproximadamente diez dfas, los sobrenadantes de cultivo se extraen para estudio de reactividad con el factor de MASP-2 purificado en un ensayo ELISA.

Ensayo de ELISA: Pocillos de placas de microensayo Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) se recubren anadiendo 50 pl de hMASP-2 purificada a 50 ng/ml de rMASP-2 rata (o rMASP-2A) durante la noche a temperatura ambiente. La baja concentracion de MASP-2 para el recubrimiento permite la seleccion de anticuerpos de gran afinidad. Despues de extraer la disolucion de recubrimiento agitando la placa, se anaden 200 pl de BLOTTO (leche en polvo desnatada) en PBS a cada pocillo durante una hora para bloquear los sitios no espedficos. Una hora despues, los pocillos se lavan con un tampon PBST (PBS que contiene 0,05% Tween 20). Se recogen 50 pl de sobrenadantes de cultivo de cada pocillo de fusion y se mezclan con 50 pl de BLOTTO y luego se anaden a los pocillos individuales de las placas de microensayo. Despues de una hora de incubacion, los pocillos se lavan con PBST. Los anticuerpos murinos unidos se detectan luego por reaccion con IgG antirraton de cabra conjugada (espedfico de Fc) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.) y se diluyen a 1:2.000 en BLOTTO. La disolucion de sustrato de peroxidasa que contiene 0,1% 3,3,5,5 tetrametil benzidina (Sigma, St. Louis, Mo.) y 0,0003% peroxido de hidrogeno (Sigma) se anade a los pocillos para desarrollo de color durante 30 minutos. La reaccion finaliza por adicion de 50 pl de H2SO4 2M por pocillo. Se lee la densidad optica a 450 nm de la mezcla de reaccion con una lectora de ELISA BioTek (BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

Ensayo de union a MASP-2:

Los sobrenadantes de cultivo con un resultado positivo en el ensayo ELISA de MASP-2 descrito anteriormente se pueden ensayar en un ensayo de union para determinar la afinidad de union que tienen los agentes inhibidores de MASP-2 para MASP-2. Tambien se puede usar un ensayo similar para determinar si los agentes inhibidores se unen a otros antfgenos en el sistema del complemento.

Se recubren pocillos de placas de microtitulacion de poliestireno (placas de union medianas de 96 pocillos, Coming Costar, Cambridge, MA) con MASP-2 (20 ng/100 pl/pocillo, Advanced Research Technology, San Diego, CA) en disolucion salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 durante la noche a 4°C. Despues de aspirar la disolucion de MASP-2, los pocillos se bloquean con PBS que contiene 1% de albumina de suero bovino (BSA; Sigma Chemical) durante 2 h a temperatura ambiente. Los pocillos sin recubrimiento de MASP-2 sirven como controles de fondo. Alteuotas de sobrenadantes de hibridoma o MoAbs anti-MASP-2 purificados, en concentraciones variables en disolucion de bloqueo, se anaden a los pocillos. Despues de una incubacion de 2 h a temperatura ambiente, los pocillos se enjuagan abundantemente con PBS. Se detecta MoAb anti-MASP-2 unido a MASP-2 por adicion de IgG anti-raton de cabra conjugada a peroxidasa (Sigma Chemical) en disolucion de bloqueo, que se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se enjuaga nuevamente en forma abundante con PBS, y se anaden 100 pl de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). La reaccion de TMB se inactiva por adicion de 100 pl de acido fosforico 1M, y la placa se lee a 450 nm en una lectora de microplacas (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Los sobrenadantes de cultivo de las celulas positivas se ensayan luego por su capacidad de inhibir la activacion del complemento en un ensayo funcional tal como el ensayo de escision de C4 descrito en el Ejemplo 2. Las celulas en pocillos positivos se clonan luego por dilucion limitativa. Se ensayan los MoAb nuevamente para reactividad con hMASP-2 en un ensayo ELISA como se describio previamente. Los hibridomas seleccionados se desarrollan en matraces giratorios y el sobrenadante de cultivo se recoge para purificacion de anticuerpos por cromatograffa de afinidad de la protema A.

Ejemplo 8

Este ejemplo describe la generacion de un raton con genes inactivados MASP-2-/- que expresa MASP-2 humana para uso como modelo en el que seleccionar los agentes inhibidores de MASP-2.

Materiales y metodos: Se cruzan un raton MASP-2-/- descrito en el Ejemplo 1 y un raton MASP-2-/- que expresa un constructo del transgen de MASP-2 humano (genes modificados de MASP-2) descrito en el Ejemplo 3, y la progenie, que consiste en MASP-2-/- murino, MAp19+ murino, MASP-2+ murino, se usa para identificar agentes inhibidores de MaSP-2 humana.

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Dichos modelos animales se pueden usar como sustratos de prueba para la identificacion y eficacia de agentes inhibidores de MASP-2 tales como anticuerpos anti-MASP-2 humanos, peptidos y no peptidos inhibidores de MASP- 2 y composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-2. Por ejemplo, el modelo animal se expone a un compuesto o agente que se sabe desencadena la activacion del complemento dependiente de MASP-2 y un agente inhibidor de MASP-2 se administra al modelo animal en un tiempo y concentracion suficientes para producir una reduccion de los smtomas de la enfermedad en el animal expuesto.

Ademas, los ratones MASP-2-/- murino, MAp19+, MASP-2+ humano se pueden usar para generar lmeas celulares que contienen uno o mas tipos de celulas implicadas en una enfermedad asociada a MASP-2 que se pueden usar como modelo de cultivo celular para ese trastorno. La generacion de lmeas celulares continuas de animales transgenicos se conoce en la tecnica, vease, por ejemplo Small, J.A., et al., Mol. Cell Biol., 5:642-48, 1985.

Ejemplo 9

Este ejemplo describe un metodo para producir anticuerpos humanos contra MASP-2 humana en un raton con genes inactivados de MASP-2 que expresa MASP-2 humana e inmunoglobulinas humanas.

Materiales y metodos:

Se genero un raton MASP-2-/- como se describe en el Ejemplo 1. Se construyo luego un raton que expresa MASP-2 humana como se describe en el Ejemplo 3. Un raton MASP-2-/- homocigoto y un raton MASP-2-/- que expresa MASP-2 humana se cruzan cada uno con un raton derivado de una lmea de celulas madre embrionaria modificada para contener alteraciones dirigidas de locus de la cadena ligera y la cadena pesada de inmunoglobulina endogena y expresion de por lo menos un segmento del locus de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, el segmento del locus de inmunoglobulina humana incluye secuencias no reordenadas de los componentes de las cadenas pesada y ligera. Tanto la inactivacion de los genes de inmunoglobulina endogena como la introduccion de genes de

inmunoglobulina exogena se pueden lograr por recombinacion homologa dirigida. Los mairnferos transgenicos

resultantes de este proceso son capaces de reordenar funcionalmente las secuencias del componente de

inmunoglobulina y expresar un repertorio de anticuerpos de diversos isotipos codificados por genes de

inmunoglobulina humana, sin expresar genes de inmunoglobulina endogena.

La produccion y propiedades de los mamfferos que tienen estas propiedades se describe, por ejemplo, en Thomson, A.D., Nature 148:1547-1553, 1994, y en Sloane, B.F., Nature Biotechnology 14:826, 1996. Las cepas geneticamente modificadas de ratones en los que los genes de anticuerpo de raton son inactivados y funcionalmente reemplazados con genes de anticuerpo humano se comercializa (p. ej., XenoMousi®, disponible de Abgenix, Fremont CA). Los ratones de la descendencia resultante son capaces de producir MoAb humano contra MASP-2 humana que son adecuados para uso en terapia humana.

Ejemplo 10

Este ejemplo describe la generacion y produccion de anticuerpos anti-MASP-2 murinos humanizados y fragmentos de anticuerpos.

Se genera un anticuerpo monoclonal murino anti-MASP-2 en ratones macho A/J, como se describe en el Ejemplo 7. El anticuerpo murino luego se humaniza como se describe a continuacion para reducir su inmunogenicidad reemplazando las regiones constantes murinas con sus contrapartes humanas para genera un fragmento de IgG y Fab quimerico del anticuerpo, que es util para inhibir los efectos adversos de la activacion del complemento dependiente de MASP-2 en sujetos humanos de acuerdo con la presente invencion.

1. Clonacion de genes de regiones variables anti-MASP-2 de celulas de hibridoma murino. Se afsla ARN total de las celulas de hibridoma que segregan MoAb anti-MASP-2 (obtenido como se describe en el Ejemplo 7) usando RNAzol segun el protocolo del fabricante (Biotech, Houston, Tex.). El ADNc de la primera cadena se sintetiza de ARN total usando oligo dT como el cebador. Se efectua analisis PCR usando los cebadores 3' derivados de la region C constante de inmunoglobulina, y conjuntos de cebadores degenerados derivados del peptido lfder o de la primera region marco de genes Vh o Vk murinos como los cebadores 5'.

El analisis de PCR anclado se lleva a cabo como lo describen Chen y Platsucas (Chen, P.F., Scancl. J. Immunol. 35:539-549, 1992). Para la clonacion del gen Vk, se prepara ADNc bicatenario usando un cebador Notl-MAKl (5 '- TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEC ID NO: 38). Los adaptadores renaturalizados ADI (5'- GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEC ID NO:39) y AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEC ID N0:40) se ligan a ambos terminos 5' y 3' del ADNc bicatenario. Los adaptadores en los extremos 3' se extraen por digestion de Notl. El producto digerido luego se usa como molde en PCR con el oligonucleotido AD1 como el cebador 5' y MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SEC ID NO:41) como el cebador 3'. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 500 bp se clonan en pUC19. Se seleccionan varios clones para analisis de secuencias a fin de verificar que la secuencia clonada abarque la region constante de inmunoglobulina murina esperada. Los oligonucleotidos Notl-MAKl y MAK2 derivan de la region VKy tienen 182 y 84 bp, respectivamente, en direccion 3' del primer par de bases del gen C kappa. Se eligen clones que incluyen Vk completo y el peptido lfder.

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Para la clonacion del gen Vh, se prepara ADNc usando el cebador Notl MAGI (5'-

CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SEC ID NO:42). Los adaptadores renaturalizados ADI y AD2 se ligan a ambos terminos 5' y 3' del ADNc bicatenario. Los adaptadores en los extremos 3' se extraen por digestion de Notl. El producto digerido se usa como molde en PCR con el oligonucleotido AD1 y MAG2 (5'-

CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEC ID NO:43) como cebadores. Los fragmentos de ADN de 500 a 600 bp de longitud se clonan en pUC19. Los oligonucleotidos Notl-MAGl y MAG2 derivan de la region Cy.7.1 murina y tienen 180 y 93 bp, respectivamente, en direccion 3' desde el primer bp del gen Cy.7.1 murino. Se eligen clones que incluyen el Vh completo y el peptido lfder.

2. Construccion de vectores de expresion para IgG y Fab de MASP-2 quimericos. Se usaron los genes Vh y Vk

clonados anteriormente descritos como moldes en una reaccion PCR para anadir el consenso Kozak al extremo 5' y el donante de empalme al extremo 3' de la secuencia de nucleotidos. Despues de analizar las secuencias para confirmar la ausencia de errores de la reaccion PCR, los genes Vh y Vk se insertan en cassettes de vectores de expresion que contienen C.y1 y C. kappa humanos, respectivamente, para dar pSV2neoVH-huCYl y pSV2neoV- huCY. Los ADN de plasmido purificados en gradientes de CsCl de los vectores de cadena pesada y ligera se usan para transfectar celulas COS por electroporacion. Despues de 48 horas, el sobrenadante de cultivo se ensaya por ELISA para confirmar la presencia de aproximadamente 200 ng/ml de IgG quimerica. Las celulas se cosechan y se prepara ARN total. El ADNc de la primera cadena se sintetiza a partir del ARN total usando oligo dT como el cebador. Este ADNc se usa como molde en la reaccion PCR para generar los fragmentos de ADN, Fd y kappa. Para el gen Fd, se lleva a cabo una reaccion PCR usando 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEC ID NO:44) como el cebador 5' y un cebador 3' derivado de CH1 (5'-

CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEC ID NO:45). Se confirma que la secuencia de ADN contiene Vh y Vk y el dominio CH1 de IgG1 humana. Despues de la digestion con las enzimas correctas, los fragmentos de ADN Fd se insertan en los sitios de restriccion Hindlll y BamHI del cassette del vector de expresion pSV2dhfr-TUS para dar pSV2dhfrFd. El plasmido pSV2 se comercializa y consiste en segmentos de ADN de diversas fuentes: ADN pBR322 (lmea delgada) contiene el origen pBR322 de replicacion de ADN (pBR ori) y el gen de resistencia a lactamasa ampicilina (Amp); ADN SV40, representado por sombreado y marcado mas gruesos, contiene el origen SV40 de replicacion de aDn (SV40 ori), promotor temprano (5' a los genes dhfr y neo), y la senal de poliadenilacion (3' a los genes dhfr y neo). La senal de poliadenilacion derivada de SV40 (pA) tambien esta dispuesta en el extremo 3' del gen Fd.

Para el gen kappa, se lleva a cabo reaccion PCR usando 5'-A AG A A AGCTTGCCGCC ACC ATGTTCTC ACT AGCTCT - 3' (SEC ID NO:46) como el cebador 5' y un cebador 3' derivado de Ck (5'- CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SEC ID NO:47). Se confirma que la secuencia de ADN contiene las regiones Vh completa y Vk humana. Despues de la digestion con enzimas de restriccion correctas, los fragmentos de ADN kappa se insertan en los sitios de restriccion Hindlll y BamHI del cassette del vector de expresion pSV2neo- TUS para dar pSV2neoK. La expresion de ambos genes Fd y .kappa es promovida por elementos potenciadores y promotores derivados de HCMV. Ya que el gen Fd no incluye el residuo de aminoacidos cistema implicado en el enlace disulfuro intercadenas, este Fab quimerico recombinante contiene cadenas pesada y ligera no covalentemente unidas. Este Fab quimerico esta disenado como cFab.

Para obtener Fab recombinante con un enlace disulfuro inter-cadena pesada y ligera, el gen Fd anteriormente mencionado se puede extender para incluir la secuencia codificadora de 9 aminoacidos adicionales (EPKSCDKTH SEC ID NO:48) de la region bisagra de IgGl humana. El segmento de ADN BstEII-BamHI que codifica 30 aminoacidos en el extremo 3' del gen Fd se puede reemplazar con los segmentos de ADN que codifican el Fd extendido, resultando en pSV2dhfrFd/9aa.

3. Expresion y purificacion de IgG anti-MASP-2 quimerica

Para generar lmeas celulares que segregan IgG anti-MASP-2 quimerica, se transfectan celulas NSO con ADN de plasmido purificado de pSV2neoVH-huC.Yl y pSV2neoV-huC kappa por electroporacion. Las celulas transfectadas se seleccionan en presencia de 0,7 mg/ml G4l8. Las celulas se desarrollan en un matraz giratorio de 250 ml usando medio que contiene suero.

El sobrenadante de cultivo de un matraz de cultivo centnfugo de 100 ml se carga en una columna de 10 ml PROSEP-A (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.). La columna se lava con 10 volumenes de lecho de PBS. El anticuerpo unido se eluye con tampon de citrato 50 mM, pH 3,0. Se anade un volumen equivalente de Hepes 1 M, pH 8,0 a la fraccion que contiene el anticuerpo purificado para ajustar el pH a 7,0. Se extraen las sales residuales por intercambio de tampones con PBS por ultrafiltracion de la membrana Millipore (P.M. valor de corte: 3.000). La concentracion de protema del anticuerpo purificado se determina por el metodo BCA (Pierce).

4. Expresion y purificacion de Fab anti-MASP-2 quimerico

Para generar lmeas celulares que segregan Fab anti-MASP-2 quimerico, se transfectan celulas CHO con ADN de plasmido purificado de pSV2dhfrFd (o pSV2dhfrFd/9aa) y pSV2neokappa, por electroporacion. Las celulas transfectadas se seleccionan en presencia de G418 y metotrexato. Las lmeas celulares seleccionadas se amplfan en concentraciones en aumento de metotrexato. Las celulas se subclonan en forma unicelular por dilucion limitativa.

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Las lmeas celulares subclonadas unicelulares de gran produccion se desarrollan luego en un cultivo giratorio de 100 ml que usa medio libre de suero.

Se purifica Fab anti-MASP-2 quimerico por cromatograffa de afinidad, usando un MoAb anti-idiopatico de raton a MoAb de MASP-2. Un MoAB de MASP-2 anti-idiopatico se puede preparar inmunizando a ratones con MoAb anti- MASP-2 murino conjugado con hemocianina de lapa californiana (kLh) y seleccionando la union de MoAb espedfica que se puede completar con MASP-2 humana. Para la purificacion, 100 ml de sobrenadante de cultivos giratorios de celulas CHO que producen cFab o cFab/9aa se cargan a una columna de afinidad acoplada con un MoAb de MASP- 2 anti-idiotipo. La columna luego se lava a fondo con PBS antes de eluir el Fab unido con dietilamina 50 mM, pH 11,5. Se extraen las sales residuales por intercambio de tampones como se describio precedentemente. La concentracion de protema del Fab purificado se determina por el metodo BCA (Pierce).

La capacidad de la IgG de MASP-2 quimerica, cFab y cFAb/9aa para inhibir las vfas del complemento dependientes de MASP-2 se puede determinar usando los ensayos que se describen en el Ejemplo 2.

Ejemplo 11

Este ejemplo describe un ensayo de escision de C4 in vitro que se utiliza como estudio funcional para identificar agentes inhibidores de MASP-2 capaces de bloquear la activacion del complemento dependiente de MASP-2-vfa L- ficolina/P35, H-ficolina, M-ficolina o manano.

Ensayo de escision de C4: Un ensayo de escision de C4 ha sido descrito por Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001, el cual mide la activacion de la via de lectinas resultante de acido lipoteicoico (LTA) de S. aureus que se une a L-ficolina.

Reactivos: Se prepara S. aureous (DSM20233) fijada a formalina de la siguiente manera:

se desarrollan bacterias durante toda la noche a 37°C en medio de sangre y soja tnptico, se lava tres veces con PBS, luego se fija durante 1 h a temperatura ambiente en PBS/0,5% formalina y se lava otras tres veces con PBS, antes de resuspenderse en tampon de recubrimiento (Na2Co315 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6).

Ensayo: Los pocillos de una placa de microtitulacion Nunc MaxiSorb (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) se recubren con: 100 |jl de S. aureus DSM20233 fijada a formalina (OD550 = 0,5) en tampon de recubrimiento con 1 |jg de L-ficolina en tampon de recubrimiento.

Despues de incubar durante toda la noche, los pocillos se bloquean con albumina de suero humano al 0,1% (HSA) en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4), luego se lavan con TBS que contiene 0,05% Tween 20 y CaCl2 5 mM (tampon de lavado). Las muestras de suero humano se diluyen en Tris-HCl 20 mM, NaCl 1 M, CaCl210 mM, 0,05% Triton X-100, 0,1% HSA, pH 7,4, lo que previene la activacion de C4 endogena y disocia el complejo C1 (compuesto por C1q, C1r y C1s). Los agentes inhibidores de MASP-2, incluidos MoAb anti-MASP-2 y peptidos inhibidores se anaden a las muestras de suero en concentraciones variables. Las muestras diluidas se anaden a la placa y se incuban durante la noche a 4° C. Despues de 24 horas, las placas se lavan a fondo con tampon de lavado, luego se anaden a cada pocillo 0,1 jg de C4 humana purificada (obtenida como se describe en Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993) en 100 (jl de barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCh 2 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4. Despues de 1,5 h a 37°C, las placas se lavan nuevamente y se detecta la deposicion de C4b usando C4c antihumano de pollo conjugado a fosfatasa alcalina (se obtiene de Immunsystem, Uppsala, Suecia) y se mide usando el sustrato colorimetrico fosfato de p-nitrofenilo.

Ensayo de C4 en manano: El ensayo anteriormente descrito se adapta para medir la activacion de la via de lectinas mediante MBL recubriendo la placa con LSP y manano antes de anadir suero mezclado con diversos agentes inhibidores de MASP-2.

Ensayo de C4 en H-ficolina (Hakata Ag): El ensayo anteriormente descrito se adapta para medir la activacion de la via de lectinas mediante H-ficolina recubriendo la placa con LPS y H-ficolina antes de anadir suero mezclado con diversos agentes inhibidores de MASP-2.

Ejemplo 12

El siguiente ensayo demuestra la presencia de activacion de la via clasica en ratones de tipo salvaje y MASP-2-/-.

Metodos: Se generaron complejos inmunes in situ recubriendo placas de microtitulacion (Maxisorb, Nunc, cat. No. 442404, Fisher Scientific) con 0,1% de albumina de suero humana en Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de incubacion durante la noche a 4°C con antisuero de suero completo anti oveja (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Escocia) diluido 1:1000 en TBS/tween/Ca2+. Las muestras de suero se obtuvieron de ratones de tipo salvaje y MASP-2-/- y se anadieron a las placas recubiertas. Se prepararon muestras control en las que C1q se despojo de las muestras de suero de tipo salvaje y MASP-2-/-. El suero de raton despojado de C1q se preparo usando Dynabeads acoplada a protema A (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) recubierta con C1q IgG antihumana de conejo (Dako, Glostrap, Dinamarca), segun las instrucciones del proveedor. Las placas

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se incubaron durante 90 minutos a 37°C. El C3b unido se detecto con un anticuerpo policlonal anti-C3c humano (Dako A 062) diluido en TBS/tw/ Ca++ a 1:1000. El anticuerpo secundario es IgG anti-conejo de cabra.

Resultados: La FIGURA 9 expone los niveles relativos de deposicion de C3b en placas recubiertas con IgG en suero de tipo salvaje, suero de MASP-2-/-, suero de MASP-2-/- despojado de C1q de tipo salvaje y suero de MASP-2-/- despojado de C1q. Estos resultados demuestran que la v^a clasica esta intacta en la cepa de raton MASP-2-/-.

Ejemplo 13

El siguiente ensayo se usa para estudiar si un agente inhibidor bloquea la via clasica, analizando el efecto de un agente inhibidor de MASP-2 bajo condiciones en las que la via clasica es iniciada por complejos inmunes.

Metodos: Para ensayar el efecto de un agente inhibidor de MASP-2 en condiciones de activacion del complemento en las que la via clasica es iniciada por complejos inmunes, muestras de 50 pl por triplicado que contienen 90% NHS se incuban a 37°C en presencia de 10 pg/ml de complejo inmune (IC) o PBS, y tambien se incluyen muestras por triplicado paralelas (+/-IC) que contienen anticuerpo monoclonal anti-properdina 200 nM durante la incubacion a 37°C. Despues de una incubacion de dos horas a 37°C, se anade EDTA 13 mM a todas las muestras para detener la activacion adicional del complemento, y las muestras se enfnan inmediatamente a 5°C. Las muestras luego se conservan a -70°C antes de ensayarse para productos de activacion del complemento (C3a y sC5b-9) usando kits ELISA (Quidel, Catalogos num. A015 y A009) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los Ejemplos 14-16 y 18-23 son ejemplos de referencia incluidos con fines informativos.

Ejemplo 14

Este ejemplo demuestra que el sistema de activacion del complemento de MASP-2 dependiente de lectinas se activa en la fase de isquemia/reperfusion que le sigue a una reparacion de aneurisma aortico abdominal.

Fundamento y diseno experimental: Los pacientes que se someten a una reparacion de aneurisma aortico abdominal (aAa) estan sujetos a una lesion de isquemia-reperfusion, que es mediada en gran medida por la activacion del complemento. Investigamos la funcion de la via de activacion del complemento de lectinas dependiente de MASP-2 en lesion de isquemia y reperfusion en pacientes que se someten a una reparacion de AAA. El consumo de lectina de union a manano (MBL) en suero se uso para medir la cantidad de activacion de la via de lectinas dependiente de MASP-2 que ocurrio durante la reperfusion.

Aislamiento de muestras del suero de pacientes: Se incluyo en este estudio un total de 23 pacientes que se sometieron a reparacion de AAA infrarrenal electiva y 8 pacientes control que se sometieron a cirugfa abdominal mayor.

Para los pacientes que se sometieron a reparacion de AAA, se tomaron muestras de sangre sistemicas de la arteria radial de cada paciente (con una via arterial) en cuatro puntos de tiempo definidos durante el procedimiento: punto de tiempo 1: induccion de anestesia; punto de tiempo 2: justo antes del pinzamiento arterial; punto de tiempo 3: justo antes de la extraccion de la pinza aortica; y punto de tiempo 4: durante la reperfusion.

Para los pacientes control que se sometieron a cirugfa abdominal mayor, se tomaron muestras de sangre sistemicas en la induccion de la anestesia y dos horas despues del comienzo del procedimiento.

Ensayo de los niveles de MBL: Se ensayo la muestra de plasma de cada paciente para niveles de lectina unida a manano (MBL) usando tecnicas de ELISA.

Resultados: Los resultados de este estudio se exponen en la FIGURA 10, que presenta un grafico que muestra el cambio medio en porcentaje en los niveles de MBL (eje y) en cada uno de los diversos puntos de tiempo (eje x). Los valores de partida para MBL son 100%, en donde se muestran reducciones relativas en lo sucesivo. Como se muestra en la FIGURA 10, los pacientes con AAA (n=23) exhiben una reduccion significativa en los niveles de MBL en plasma, promediando aproximadamente 41% de reduccion al momento de la isquemia/reperfusion que le sigue a AAA. En contraste, en pacientes control (n=8) sometidos a cirugfa abdominal mayor, se observo solamente un consumo leve de MBL en las muestras de plasma.

Los datos presentados proveen una fuerte indicacion de que la via de lectinas dependiente de MASP-2 del sistema del complemento se activa en la fase de isquemia/reperfusion que le sigue a la reparacion de AAA. La reduccion de los niveles de MBL parece estar asociada a la lesion de isquemia-reperfusion porque los niveles de MBL caen significativa y rapidamente cuando el vaso mayor pinzado se reperfunde despues del final de la operacion. En contraste, los sueros control de pacientes que se someten a cirugfa abdominal mayor sin un ataque de isquemia- reperfusion importante solamente exhiben una ligera disminucion de los niveles de MBL en plasma. En vista de la contribucion bien establecida de la activacion del complemento en la lesion de reperfusion, concluimos que la activacion de la via de lectinas dependiente de MASP-2 en celulas endoteliales isquemicas es un factor importante en la patologfa de la lesion de isquemia/reperfusion. Por consiguiente, se esperana que un bloqueo o una reduccion transitoria en la via de lectinas dependiente de MASP-2 de la activacion del complemento tuviese un impacto

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terapeutico beneficioso significativo para mejorar el resultado de los procedimientos clmicos y de las enfermedades que implican ataque isquemico transitorio, p. ej., infarto de miocardio, infarto de intestino, quemaduras, trasplantes y accidentes cerebrovasculares.

Ejemplo 15

Este ejemplo describe el uso de la cepa MASP-2-/- como un modelo animal para ensayar los agentes inhibidores de MASP-2 utiles para tratar la artritis reumatoidea.

Antecedentes y fundamentos: Modelo de artritis murina: Ratones transgenicos (tg) receptores de celulas T (TCR K/BxN son un modelo recientemente desarrollado de artritis inflamatoria (Kouskoff, V., et al., Cell 87:811-822, 1996; Korganow, A.S., et al., Immunity 10:451-461, 1999; Matsumoto, I., et al., Science 286:1732-1735, 1999; Maccioni M. et al., J. Exp. Med. 195(8): 1071-1077, 2002). Los ratones K/BxN desarrollan espontaneamente una enfermedad autoinmune con la mayona de las caractensticas clmicas, histologicas e inmunologicas de la RA en seres humanos (Ji, H., et al., Immunity 16:157-168, 2002). El receptor murino es espedfico de las articulaciones, pero es iniciado y luego perpetuado por autorreactividad de las celulas T, luego B a glucosa-6-fosfato isomerasa ("GPI"), un antigeno que se expresa en forma ubicua. Asimismo, la transferencia de suero (o Igs anti-GPI purificados) de ratones K/BxN artnticos a animales sanos provoca artritis al cabo de varios dfas. Tambien se ha demostrado que los anticuerpos anti-GPI policlonales o una agrupacion de anticuerpos anti-GPI monoclonales del isotipo IgGl inducen artritis cuando se inyectan en receptores sanos (Maccioni et al., 2002). El modelo murino es relevante a RA humana, ya que se ha descubierto que el suero de pacientes con RA tambien contiene anticuerpos anti-GPI, lo cual no sucede en individuos normales. Se ensayo un raton deficiente de C5 en este sistema y se hallo que bloquea el desarrollo de artritis (Ji, H., et al., 2002, supra). Hubo tambien una fuerte inhibicion de la artritis en ratones nulos de C3, lo que implica a la via alternativa, no obstante, los ratones nulos de MBP-A desarrollaron artritis. En los ratones, sin embargo, la presencia de MBP-C puede compensar la perdida de MBP-A.

En base a las observaciones descritas en este documento, la MASP-2 cumple una funcion esencial en el inicio de las vfas de lectinas y alternativa, el modelo artntico K/BxN es util para estudiar los agentes inhibidores de MASP-2 que son eficaces para uso como agentes terapeuticos para tratar la RA.

Metodos: Se obtiene el suero de ratones K/BxN artriticos a los 60 dias de vida, se mezcla y se inyecta (150-200 pj

1. p.) en receptores MASP-2-/- (obtenidos como se describe en el Ejemplo 1); y en las camadas control con o sin agentes inhibidores de MASP-2 (MoAb, peptidos inhibidores y similares descritos en este documento) en los dfas 0 y

2. Un grupo de ratones normales tambien se pre-trata con un agente inhibidor de MASP-2 por dos dfas antes de recibir la inyeccion de suero. Un grupo mas de ratones recibe una inyeccion de suero en el dfa 0, seguida por un agente inhibidor de MASP-2 en el dfa 6. Se evalua un mdice clinico con el paso del tiempo con un punto para cada pata afectada, A punto para una pata con solamente inflamacion leve. El espesor del tobillo se mide tambien con una pinza (el espesor se define como la diferencia desde la medicion del dfa 0).

Ejemplo 16

Este ejemplo describe un ensayo para inhibicion del dano al tejido mediado por el complemento en un modelo ex vivo de corazones de conejo perfundidos con plasma humano.

Antecedentes y fundamentos: La activacion del sistema del complemento contribuye al rechazo hiperagudo de xenoinjertos. Estudios previos han demostrado que el rechazo hiperagudo puede ocurrir en ausencia de anticuerpos antidonantes mediante la activacion de la via alternativa (Johnston, P.S., et al., Transplant Proc. 23:877-879, 1991).

Metodos: Para determinar si los agentes inhibidores anti-MASP-2 aislados, tales como anticuerpos anti-MASP-2 obtenidos como se describe en el Ejemplo 7 son capaces de inhibir la via del complemento en dano al tejido, los fragmentos de MoAb y anticuerpos anti-MASP-2 se pueden ensayar usando un modelo ex vivo en el que los corazones de conejos aislados se perfunden con plasma humano diluido. Se demostro previamente que este modelo causa dano al miocardio de conejos debido a la activacion de la via del complemento alternativa (Gralinski, M.R., et al., Immunopharmacology 34:79-88, 1996).

Ejemplo 17

Este ejemplo describe un ensayo que mide la activacion de neutrofilos que es util como indicador de una dosis eficaz de un agente inhibidor de MASP-2 para el tratamiento de afecciones asociadas con la via dependiente de lectinas de acuerdo con los metodos de la invencion.

Metodos: Un metodo para medir la elastasa de los neutrofilos ha sido descrito en Gupta-Bansal, R., et al., Molecular Immunol. 37:191-201, 2000. En resumen, el complejo de elastasa y a1-antitripsina del suero se mide con un ensayo sandwich de dos sitios que utiliza anticuerpos contra elastasa y a-i-antitripsina. Se recubren placas de microtitulacion de poliestireno con una dilucion 1:500 de anticuerpo de elastasa antihumano (The Binding Site, Birmingham, Reino Unido) en PBS durante la noche a 4°C. Despues de aspirar la disolucion de anticuerpos, los pocillos se bloquean con PBS que contiene 0,4% HAS durante 2 h a temperatura ambiente. Se anaden a los pocillos alfcuotas (100 pl) de muestras de plasma que son tratadas con o sin un agente inhibidor de MASP-2. Despues de una incubacion de a 2 h

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a temperatura ambiente, los pocillos se enjuagan abundantemente con PBS. El complejo de elastasa-ai-antitrisina ligado se detecta por adicion de una dilucion 1:500 de anticuerpo ai-antitripsina conjugado a peroxidasa en disolucion de bloqueo que se deja incubar por 1 h a temperatura ambiente. Despues de lavar la placa con PBS, se anaden alfcuotas de 100 pl de sustrato TMB. La reaccion de TMB se inactiva por adicion de 100 pl de acido fosforico, y la placa se lee a 450 nm en una lectora de microplacas.

Ejemplo 18

Este ejemplo describe un modelo animal para ensayar agentes inhibidores de MASP-2 utiles para tratar la isquemia de miocardio/reperfusion.

Metodos: Un modelo de isquemia de miocardio-reperfusion ha sido descrito por Vakevaetal., Circulation 97:22592267, 1998, y Jordan et al., Circulation 104(12): 1413-1418, 2001. El modelo descrito se puede modificar para uso en ratones MASP-2-/- y MASP-2+/+ de la siguiente manera. En resumen, se anestesian ratones macho adultos. Se canulan la vena yugular y la traquea, y se mantiene la ventilacion con 100% oxfgeno con un ventilador para roedores ajustado para mantener el CO2 exhalado entre 3,5% y 5%. Se realiza una toracotoirna izquierda y se coloca una sutura a 3 o 4 mm del origen de la arteria coronaria izquierda. Cinco minutos antes de la isquemia, los animales reciben el agente inhibidor de MASP-2, tal como anticuerpos anti-MASP-2 (p. ej., en un intervalo de dosis entre 0,01 y 10 mg/kg). Se inicia entonces la isquemia ajustando la sutura alrededor de la arteria coronaria y se mantiene durante 30 minutos, seguida por cuatro horas de reperfusion. Los animales con operacion simulada se preparan de manera identica sin ajuste de la sutura.

Analisis de deposicion de C3 del complemento: Despues de la reperfusion, las muestras para inmunohistoqmmica se obtienen de la region central del ventnculo izquierdo, se fijan y se congelan a -80°C hasta procesarse. Los cortes de tejido se incuban con anticuerpo de C3 antirrata de cabra conjugado a HRP. Los cortes de tejido se analizan para presencia de tincion de C3 en presencia de agentes inhibidores anti-MASP-2 segun lo comparado con los animales control con operacion simulada y los animales MASP-2-/- para identificar los agentes inhibidores de MASP-2 que reducen la deposicion de C3 in vivo.

Ejemplo 19

Este ejemplo describe el uso de la cepa de MASP-2-/- como un modelo animal para ensayar los agentes inhibidores de MASP-2 por su capacidad de proteger el tejido trasplantado contra lesion de isquemia/reperfusion.

Antecedentes/Fundamentos: Se sabe que la lesion de isquemia/reperfusion ocurre en el organo de un donante durante el trasplante. El grado de dano al tejido se relaciona con la longitud de la isquemia y es mediado por el complemento, como lo demuestran diversos modelos y el uso de los agentes inhibidores del complemento como el receptor soluble de tipo 1 (CR1) (Weisman et al., Science 249:146-151, 1990; Mulligan et al., J. Immunol. 148:14791486, 1992; Pratt et al., Am. J. Path. 163(4):1457-1465, 2003). Se ha descrito un modelo animal para trasplante por Pratt et al., Am. J. Path. 163(4): 1457-1465, que se puede modificar para uso con el modelo de raton MaSp-2-/- y/o para uso como sistema del modelo a MASP-2+/+ en el que seleccionar agente inhibidores de MASP-2 por su capacidad de proteger el tejido trasplantado de lesion de isquemia/reperfusion. La purga del rinon del donante con el fluido de perfusion antes del trasplante proporciona una oportunidad de introducir agentes inhibidores anti-MASP-2 en el rinon del donante.

Metodos: Se anestesian ratones MASP-2-/- y/o MASP-2+/+. El rinon izquierdo del donante se diseca y la aorta se liga en sentido cefalico y caudal hacia la arteria renal. Un cateter Portex (Portex Ltd, Hythe, Reino Unido) se inserta entre las ligaduras y el rinon se perfunde con 5 ml de disolucion de perfusion renal Soltran (Baxter Health Care, Reino Unido) que contiene agentes inhibidores de MASP-2 tales como anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en un intervalo de dosis de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg) por un periodo de por lo menos 5 minutos. El trasplante renal se realiza luego y los ratones se controlan con el transcurso del tiempo.

Analisis de receptores de trasplantes: Se cosechan trasplantes renales en distintos intervalos de tiempo y se analizan los cortes de tejido usando anti-C3 para determinar el grado de deposicion de C3.

Ejemplo 20

Este ejemplo describe el uso de un modelo animal de artritis inducida por colageno (CIA) para ensayar agentes inhibidores de MASP-2 para tratar artritis reumatoidea (RA).

Antecedentes y fundamentos: La artritis inducida por colageno (CIA) representa una poliartritis inducible en cepas susceptibles de roedores y primates despues de la inmunizacion con colageno natural de tipo II y se reconoce como modelo relevante para artritis reumatoidea humana (RA) (veanse Courtney et al., Nature 283: 666 (1980); Trenthan et al., J. Exp. Med. 146: 857 (1977)). Tanto la RA como la CIA se caracterizan por inflamacion articular, formacion de pannus y erosion de cartflagos y huesos. La cepa murina susceptible a CIA, DBA/1LacJ es un modelo desarrollado de CIA en el que los ratones desarrollan artritis clmicamente severa despues de la inmunizacion con colageno bovino de tipo II (Wang et al., J. Immunol. 164: 4340-4347 (2000). Una cepa de raton deficiente de C5 se cruzo con DBA/1LacJ, y se hallo que la cepa resultante era resistente al desarrollo de artritis CIA (Wang et al., 2000, supra).

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En base a las observaciones descritas en este documento de que la MASP-2 cumple una funcion esencial en el inicio de las vfas de lectinas y alternativa, el modelo de artritis CIA es util para seleccionar agentes inhibidores de MASP-2 eficaces para uso como agentes terapeuticos para tratar la RA.

Metodos: Se genera un raton MASP-2-/- como se describe en el Ejemplo 1. El raton MASP-2-/- se cruza luego con un raton derivado de la cepa DBA/1LacJ (The Jackson Laboratory). FI y la subsiguiente descendencia se entrecruza para producir MASP-2-/- homocigoto en la lmea DBA/lLacJ.

La inmunizacion de colageno se lleva a cabo como se describe en Wang et al., 2000, supra. En smtesis, ratones DBA/1LacJ de tipo salvaje y ratones MASP-2-/- DBA/1LacJ se inmunizan con colageno bovino de tipo II (BCII) o colageno de raton de tipo II (MCII) (se obtienen de Elastin Products, Owensville, MO), disuelto en acido acetico 0,01 M a una concentracion de 4 mg/ml. Cada raton recibe una inyeccion intradermica en la base del rabo con 200 ug CII y 100 ug de micobacterias. Los ratones se vuelven a inmunizar despues de 21 dfas y se examinan a diario para el aspecto de la artritis. Se evalua un mdice artntico con el tiempo con respecto a la gravedad de la artritis en cada pata afectada.

Los agentes inhibidores de MASP-2 se seleccionan en los ratones DBA/1LacJ CIA de tipo salvaje inyectando un agente inhibidor de MASP-2 tal como anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en una forma de dosificacion de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg) al momento de la inmunizacion de colageno, o bien sistemica o localmente en una o mas articulaciones y se evalua el mdice artntico con el tiempo como se describio anteriormente. Los anticuerpos monoclonales anti-hMASP-2 como agentes terapeuticos se pueden evaluar facilmente en un modelo de raton a MASP-2-/-, hMASP-+/+ DBA/1LacJ CIA con genes inactivados.

Ejemplo 21

Este ejemplo describe el uso de un modelo animal de (NZB/W) F1 para ensayar agentes inhibidores de MASP-2 utiles para tratar la glomerulonefritis mediada por el complejo inmune.

Antecedentes y fundamentos: Los ratones F1 New Zealand black x New Zealand white (NZB/W) desarrollan espontaneamente un smdrome autoinmune de similitudes notables con la glomerulonefritis mediada por el complejo inmune humano. Los ratones F1 NZB/W sucumben invariablemente a la glomerulonefritis alrededor de los 12 meses de edad. Como se analizo anteriormente, se ha demostrado que la activacion del complemento cumple una funcion importante en la patogenesis de la glomerulonefritis mediada por el complejo inmune. Se ha demostrado ademas que la administracion de un MoAb anti-C5 en el modelo de raton F1 NZB/W resulto en la mejona significativa del curso de la glomerulonefritis (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8563-8568 (1996)). En funcion de las observaciones descritas en este documento de que la MASP-2 cumple una funcion esencial en el inicio de las vfas de lectinas y alternativa, el modelo animal de F1 NZB/W es util para seleccionar agentes inhibidores de MASP-2 eficaces para uso como agentes terapeuticos para tratar la glomerulonefritis.

Metodos: Se genera un raton MASP-2-/- como se describe en el Ejemplo 1. El raton MASP-2-/- se cruza luego por separado con un raton derivado de las cepas de NZB y NZW (The Jackson Laboratory). F1 y la subsiguiente descendencia se entrecruzan para producir MASP-2-/- homocigoto en ambos fondos geneticos NZB y NZW. Para determinar la funcion de MASP-2 en la patogenesis de la glomerulonefritis en este modelo, se compara el desarrollo de esta enfermedad en individuos FI resultantes de las cruzas de ratones NZB x NZW de tipo salvaje o MASP-2-/- NZB x MASP-2-/-NZW. En intervalos semanales, se recogen muestras de orina de los ratones F1 MASP-2+/+ y MASP-2-/- y se vigilan los niveles de protema en la orina para presencia de anticuerpos anti-ADN (como se describe en Wang et al., 1996, supra). Tambien se lleva a cabo el analisis histopatologico de los rinones para vigilar la cantidad de deposicion en la matriz mesangial y el desarrollo de glomerulonefritis.

El modelo animal F1 NZB/W es tambien util para seleccionar agentes inhibidores de MASP-2 eficaces para uso como agentes terapeuticos a fin de tratar la glomerulonefritis. A las 18 semanas de vida, se inyectan ratones F1 NZB/W de tipo salvaje por ruta intraperitoneal con agentes inhibidores anti-MASP-2, tales como los anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en un intervalo de dosis de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg) a una frecuencia semanal o quincenal. Los marcadores histopatologicos y bioqmmicos anteriormente mencionados de glomerulonefritis se usan para evaluar el desarrollo de la enfermedad en los ratones y para identificar agentes inhibidores de MASP-2 utiles para el tratamiento de esta enfermedad.

Ejemplo 22

Este ejemplo describe el uso de un anillo tubular como modelo para ensayar agentes inhibidores de MASP-2 utiles para prevenir el dano al tejido resultante de la circulacion extracorporea (ECC) como un circuito de derivacion a cardiopulmonar (CPB).

Antecedentes y fundamentos: Como se describio anteriormente, los pacientes que se someten a ECC durante un CPB sufren una reaccion inflamatoria sistemica, que es en parte causada por la exposicion de la sangre a las superficies artificiales del circuito extracorporeo, pero ademas por factores independientes de la superficie como traumatismo quirurgico y lesion de isquemia-reperfusion (Butler, J., et al., Ann. Thorac. Surg. 55:552-9, 1993; Edmunds, L.H., Ann. Thorac. Surg. 66 (Supl):S12-6, 1998; Asimakopoulos, G., Perfusion 14:269-77, 1999). Tambien

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se ha demostrado que la via del complemento alternativa cumple una funcion predominante en la activacion del complemento en circuitos de CPB, resultante de la interaccion de la sangre con las superficies artificiales de los circuitos de CPB (vease Kirklin et al., 1983, 1986, anteriormente analizado). En consecuencia, en base a las observaciones descritas en este documento de que la MASP-2 cumple una funcion esencial en la inhibicion de las vfas de lectinas y alternativa, el anillo tubular es util para seleccionar agentes inhibidores de MASP-2 eficaces para uso como agentes terapeuticos con el fin de prevenir o tratar una reaccion inflamatoria desencadenada por exposicion extracorporea.

Metodos: Se utiliza una modificacion de un anillo tubular previamente descrito para circuitos de derivacion cardiopulmonar (vease Gong et al., .J. Clinical Immunol. 16(4):222-229 (1996)) como se describe en Gupta-Bansal et al., Molecular Immunol. 37:191-201 (2000). En smtesis, se extrae sangre de un sujeto sano en un tubo Vacutanier de 7 ml (que contiene 7 unidades de heparina por ml de sangre completa). Un tubo de polietileno similar al que se usa en los procedimientos de CPB (p. ej., I.D. 2,92 mm; O.D. 3,73 mm, longitud: 45 cm) se rellena con 1 ml de sangre y se cierra en un bucle con una pieza corta de un tubo de silicona. Un tubo control que contiene sangre heparinizada con EDTA 10 mM se incluyo en el estudio como control de fondo. La muestra y los tubos control se giraron verticalmente en un bano de agua durante 1 hora a 37° C. Despues de la incubacion, las muestras de sangre se transfirieron a tubos microfugos de 1,7 ml que conteman EDTA, resultando en una concentracion final de EDTA 20 mM. Las muestras se centrifugaron y se recogio el plasma. Se anaden agentes inhibidores de MASP-2, tales como anticuerpos anti-MASP-2 a la sangre heparinizada inmediatamente antes de la rotacion. Las muestras de plasma se someten luego a ensayos para medir la concentracion de C3a y C5b-9 soluble como se describe en Gupta-Bansal et al., 2000, supra.

Ejemplo 23

Este ejemplo describe el uso de un sistema modelo de ligadura y puncion del ciego (CLP) en ratones para ensayar agentes inhibidores de MASP-2 utiles para tratar septicemia o una afeccion resultante de septicemia, incluido choque septicemico, smdrome de dificultad respiratoria aguda resultante de septicemia y smdrome de respuesta inflamatoria sistemica.

Antecedentes y fundamentos: Como se analizo anteriormente, se ha demostrado en numerosos estudios que la activacion del complemento tiene una funcion importante en la patogenesis de la septicemia (vease Bone, R.C., Annals. Internal. Mecl. 115:457-469, 1991). El modelo de roedor de CLP es un modelo reconocido que imita el curso clmico de la septicemia en seres humanos y se considera un modelo sustituto razonable para septicemia en seres humanos (vease Ward, P., Nature Review Immunology Vol 4: 133-142 (2004). Un estudio reciente ha demostrado que el tratamiento de animales CLP con anticuerpos anti-C5a produjo bacteremia y una supervivencia muy mejorada (Huber-Lang et al., J. of Immunol. 169: 3223-3231 (2002). En consecuencia, en base a las observaciones descritas en este documento de que la MASP-2 cumple una funcion esencial en el inicio de las vfas de lectinas y alternativa, el modelo de roedor de CLP es util para seleccionar agentes inhibidores de MASP-2 eficaces para uso como agentes terapeuticos a fin de prevenir o tratar la septicemia o una afeccion resultante de septicemia.

Metodos: El modelo CLP se adapta del modelo descrito en Huber-Lang et al., 2004, anteriormente mencionado de la siguiente manera. Se anestesian animales MASP-2-/- y MASP-2+/+. Se realiza una incision abdominal en la lmea media de 2 cm y se liga firmemente el ciego debajo de la valvula ileocecal, evitando la obstruccion intestinal. El ciego luego se punza con una aguja numero 21. La incision abdominal se cierra luego en capas con sutura de seda y grapas para piel (Ethicon, Summerville, NJ). Inmediatamente despues de CLP, los animales reciben una inyeccion de un agente inhibidor de MASP-2 tal como anticuerpos monoclonales anti-MASP-2 (en un intervalo de dosis de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg). Los anticuerpos monoclonales anti-hMASP-2 como agentes terapeuticos se pueden evaluar facilmente en un modelo de CLP con genes modificados de raton de MASP-2-/-, hMASP-+/+. El plasma de los ratones se analiza luego para niveles de anafilatoxinas derivadas del complemento y ataque respiratorio usando los ensayos descritos en Huber-Lang et al., 2004, supra.

Claims (13)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que inhibe MASP-2 por union espedfica a SEC ID NO:6 para usar en el tratamiento de la degeneracion macular asociada a la edad, o la prevencion o el tratamiento de una reaccion inflamatoria resultante del trasplante de un organo o tejido.
2. 2. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun la reivindicacion 1, en el que el agente inhibidor de MASP- 2 inhibe selectivamente la activacion del complemento dependiente de MASP-2 sin inhibir sustancialmente la activacion del complemento dependiente de C1q.
3. 3. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el anticuerpo de MASP-2 o el fragmento del mismo se une espedficamente a un polipeptido que comprende la SEC ID NO: 6 con una afinidad al menos 10 veces mayor que con la que se une a un antfgeno diferente en el sistema complementario.
4. 4. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el anticuerpo de MASP-2 o el fragmento del mismo se une espedficamente a un polipeptido que comprende la SEC ID NO: 6.
5. 5. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el anticuerpo de MASP-2 o el fragmento del mismo se une al polipeptido en una posicion entre los residuos de aminoacidos 1-176 de la SEC ID NO: 6.
6. 6. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el anticuerpo anti-MASP-2 o el fragmento del mismo es un anticuerpo recombinante.
7. 7. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el anticuerpo anti-MASP-2 tiene una funcion efectora reducida.
8. 8. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el anticuerpo anti-MASP-2 es un anticuerpo quimerico humanizado o humano.
9. 9. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el anticuerpo anti-MASP-2 se produce en un animal transgenico deficiente en MASP-2.
10. 10. Un anticuerpo o fragmento del mismo para usar segun la reivindicacion 1, en el que el trasplante de organo o tejido se selecciona del grupo que consiste en alotrasplante de organo, xenotrasplante de organo, injerto de organo e injerto de tejido.
11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende una catidad terapeuticamete eficaz de un anticuerpo anti-MASP- 2 o un fragmento del mismo como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para usar como se describe en las reivindicaciones 1 a 10.
12. 12. Una composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 11, en la que la composicion se formula para suministro sistemico.
13. 13. Una composicion farmaceutica para usar segun la reivindicacion 11, en la que la composicion se formula para suministro subcutaneo.