CN110833624B - α1-AT表达载体在制备输血相关急性肺损伤保护剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α1‑AT表达载体在制备输血相关急性肺损伤保护剂中的应用。该α1‑AT表达载体可以以基因转染的方式将α1‑AT在小鼠体内长期稳定的高效表达，高效表达的α1‑AT能够抑制AMs向M1极化，使M2/M1的比例升高，对TRALI具有良好的预防效果；诱导TRALI发生后用α1‑AT进行干预，肺湿重/干重比、直肠温度、肺组织病理、死亡率等实验的结果均能证实α1‑AT对TRALI具有保护作用。本发明提供的α1‑AT表达载体可用于作为输血相关急性肺损伤保护剂，具有较高的实际应用价值，在医学领域具有广阔的应用前景。

Description

α1-AT表达载体在制备输血相关急性肺损伤保护剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及α1-AT表达载体在制备输血相关急性肺损伤保护剂中的应用。

背景技术

输血相关急性肺损伤(Transfusion-related acute lung injury,TRALI)是指因输血后6h内发生的以非心源性肺水肿和急性呼吸窘迫综合征为主要临床表现的疾病，发病后病情危重，死亡率高，是引起输血相关死亡的首要原因。虽然TRALI多于发生后48-96h内恢复，但重症者也可发生其他严重并发症或死亡，结果取决于是否得到及时诊断和正确治疗。

TRALI的致病机制尚不完全清楚，其症状在输血数分钟至40小时内突然出现，临床表现为寒战、发热、呼吸困难、发绀、咳嗽、咳泡沫水样痰，查体可发现肺部湿啰音，严重患者出现低血压、休克、肾功能衰竭，甚至死亡。

迄今缺乏有效的TRALI救治方法，临床上主要采取对症治疗，其治疗方法除停止输注血液制品外，还根据症状的轻重采取不同的治疗，包括供氧、通气支持、充足补液等,如出现肺水肿的相关症状，就使用治疗肺水肿的药物。可见，目前尚且没有能够特异性缓解TRALI临床症状的药物。

因此，探索有效的药物用来保护因输血带来的急性肺损伤，即研发一种TRALI的保护剂，用来缓解TRALI的临床症状，预防TRALI的发生，是当前TRALI防治研究中的重要研究方向。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种α1-AT在制备输血相关急性肺损伤特异性保护剂中的应用，即α1-AT在制备输血相关急性肺损伤保护剂中的应用。

第二方面，本发明提供α1-AT在制备AMs向M1型巨噬细胞极化的抑制剂中的应用。

第三方面，本发明提供α1-AT在制备AMs活化过程中减少M1型巨噬细胞使M2/M1的比例升高的调节剂的应用。

所述保护剂为可溶性蛋白形式的α1-AT或α1-AT表达载体；所述抑制剂为可溶性蛋白形式的α1-AT或α1-AT表达载体；所述调节剂为可溶性蛋白形式的α1-AT或α1-AT表达载体。

所述α1-AT表达载体在体内(优选在肝脏内)以基因转染的方式高效表达α1-AT。

α1-AT在体内通过抑制肺泡巨噬细胞AMs向M1型巨噬细胞极化，使M2型巨噬细胞与M1型巨噬细胞的比例升高。

所述α1-AT表达载体的构建方法为：以人肝脏基因组DNA为模板，分别使用引物1和引物2组成的引物对、引物3和引物4组成的引物对，PCR扩增BglⅡhAAT-1206－355ScaⅠ及ScaⅠhAAT-348－+45I-PpoⅠ调控序列，并将获得的调控序列通过BglⅡ/I-PpoⅠ位点插入pCIneo真核表达载体，替代pCIneo载体的CMV启动子，获得载体，命名为ATTP-pCIneo；以人肝脏mRNA为模板，在引物5和引物6组成的特异引物对的引导下，PCR扩增α1-AT基因编码序列，通过EcoRⅠ/SalⅠ位点插入ATTP-pCIneo，获得由α1-AT启动子调控α1-AT基因表达的真核表达载体，命名为ATTP-pCIneo-hAAT；引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6的序列见序列表1。

所述α1-AT启动子的序列见序列表2。

hAAT的序列见序列表3。

所述基因转染为水动力基因转染，具体为：将α1-AT真核表达载体ATTP-pCIneo-hAAT加入生理盐水中，在5～8s内高压注射入小鼠尾静脉。

本发明发现了α1-AT(α1-抗胰蛋白酶)的一种新用途，即通过基因转染的方式将α1-AT在小鼠体内长期稳定的高效表达或直接输注α1-AT本身实现缓解TRALI的症状，保护机体免受TRALI的伤害。实验证明：在高压下经小鼠尾静脉快速注射大体积含α1-AT表达载体的生理盐水，从而在小鼠体内主要是在小鼠肝脏实现α1-AT的编码基因的高效表达，高效表达的α1-AT能够抑制肺泡巨噬细胞(AMs)向M1型巨噬细胞极化，使M2型/M1型巨噬细胞的比例升高，对TRALI具有减轻症状、甚至避免发生的保护效果。实验还证明：在高效表达α1-AT的小鼠身上诱导TRALI发生，然后对肺湿重/干重比、直肠温度、肺组织病理、死亡率等指标进行检测，其结果均能证实α1-AT对TRALI具有保护作用。本发明提供的α1-AT表达载体或α1-AT可用于作为输血相关急性肺损伤的保护剂，具有较高的实际应用价值，在医学领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1所示为确证TRALI模型建立成功的结果图；

图2所示为TRALI发生过程中AMs活化状态的检测结果图；

图3所示为清除AMs细胞对TRALI的保护效果图；

图4所示为巨噬细胞极化后的表型变化特征柱状图；

图5所示为输注不同极化类型的巨噬细胞对TRALI的影响程度图；

图6所示为水动力转染α1-AT表达载体14d后血清中α1-AT的表达水平图；

图7所示为小鼠体内α1-AT高表达对TRALI的保护效果图；

图8所示为小鼠体内α1-AT对TRALI的保护效果图；

图9所示为α1-AT对TRALI发生过程中AMs极化类型的鉴定结果图。

具体实施方式

α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1antitrypsin,α1-AT)，又称α1-蛋白酶抑制剂，是机体重要的急性时相反应蛋白，是由肝细胞合成的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制弹性蛋白酶、胰蛋白酶、血浆素、凝血酶等蛋白酶的活性，可以保护体内的正常组织不受蛋白酶的损伤。由于α1-AT的上述功能，目前已经将其用于因遗传性α1-AT缺乏引起的肺气肿的终身替补治疗和因遗传性α1-AT缺乏引起的肺部疾病的防治，并且在肺癌、胰腺移植、移植物抗宿主病等的治疗中发挥重要作用。然而目前并没有用α1-AT防治TRALI的相关报道。

发明人对TRALI进行了以下几点的进一步研究，并发现：

一、肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophages,AMs)是肺泡腔内的常驻吞噬细胞，是肺组织抵御疾病的第一道防线，在肺损伤和修复中发挥重要作用。

二、鉴于AMs在肺脏天然免疫中的重要作用，发明人首先通过以下实验研究了AMs在TRALI的致病过程中的作用。具体实验过程如下：

(1)、清除AMs对TRALI临床症状的影响

这一实验采用liposomal clodronate(氯膦酸盐脂质体)清除AMs。雄性6～8周龄Balb/c小鼠随机分为2组，一组为对照组，另一组为clodronate组，分别通过气管给予100μlPBS-liposomes(对照组)或clodronate-liposomes(clodronate组)，然后两组小鼠均腹腔注射0.1mg/kg LPS，并于24h后尾静脉注射2.25mg/kg抗H2Kd单克隆抗体诱导TRALI的发生。

对两组小鼠存活率、直肠温度及组织病理变化进行比较，结果见图3：清除AMs后(A幅和B幅)，clodronate组小鼠存活率(C幅)及直肠温度(D幅)均升高，HE染色结果也证实clodronate组小鼠肺脏肺泡间隔显著变窄，肺泡间质内纤维蛋白渗出液及以中性粒细胞等的减少，说明清除AMs对TRALI的症状具有缓解作用。

然而，多样性和异质性是AMs的重要特点，它不仅本身具有表型和功能可变的特点，且还会随着微环境的改变而发生相应的特定方向的改变，这就决定了AMs的多种功能角色。在此情况下，发明人转换思路，发现：在不同微环境中AMs可以发生不同性质的极化，成为具有不同表面分子和功能特征的亚型，通常将其分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞两种。M1型巨噬细胞表达大量的CD86和CD197等分子；M2型巨噬细胞高特异性地表达甘露糖受体CD206和CD209。

(2)、输注不同极化类型的巨噬细胞对TRALI临床症状的影响

通过分离纯化BALB/c小鼠骨髓巨噬细胞，并分别加入不同细胞因子进行诱导极化96h，流式细胞术分析各类诱导极化后的巨噬细胞的存在状态，以获得不同极化类型的巨噬细胞，尤其是M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞的基本特征，发现LPS+IFN-γ诱导的巨噬细胞高表达M1型巨噬细胞的表面标志分子CD86、CD197，而IL-4+IL-10+TGF-β1诱导的巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞的表面特异性标志分子CD209、CD206(见图4)，且均与M0组有显著的统计学差异。随后，将极化的巨噬细胞M1、M2，与H2Kd单克隆抗体分别尾静脉输注给LPS预刺激后的BALB/c小鼠，输注后不同时间点检测直肠温度。

结果见图5，发现输注M1型巨噬细胞的TRALI小鼠直肠温度波动幅度大，而输注M2型巨噬细胞的TRALI小鼠较未进行细胞输注的TRALI组直肠温度下降幅度小，且呈稳步回升的趋势(A幅)。在肺湿/干比方面，M1组与未进行细胞输注的TRALI组无统计学差异，但M2组肺脏湿/干比显著低于M1组和未进行细胞输注的TRALI组，且有统计学差异(B幅)。生存率方面发现，M2组小鼠全部存活，M1组及未进行细胞输注的TRALI组存活率均为50％，M2组与其它两组相比较，P值＜0.01(C幅)。从病理学表现来看(D幅)，M1组肺泡间质水肿较未进行细胞输注的TRALI组、M2组更为明显，肺组织损伤较为严重，而M2组肺大部分表现为弥漫性充血水肿，有中性粒细胞聚集，但中性粒细胞聚集较未进行细胞输注的TRALI组及M1组少。

以上实验结果均表明，输注M1型巨噬细胞(简称M1)加重了TRALI肺损伤程度及临床症状，输注M2型巨噬细胞(简称M2)则可以使肺损伤程度减轻。可见，输注不同亚型的巨噬细胞可以改变TRALI的临床症状，如减轻肺水肿，体温上升，死亡率下降等。

(3)、TRALI发生后AMs细胞向M1型巨噬细胞极化

M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞是AMs被活化后极化形成的两种不同表面分子和功能特征的亚型，但TRALI发生后，AMs细胞如何极化尚未可知。

雄性6～8周龄Balb/c小鼠随机分为2组，一组正常饲养作为空白对照组，另一组建立TRALI小鼠模型，作为TRALI组。对空白对照组、TRALI组小鼠进行肺泡灌洗，对灌洗液中的AMs进行流式细胞术分析。

结果发现，与空白对照组相比，TRALI组肺泡灌洗液中巨噬细胞表面标志CD197高表达(75.8％)，CD86也有明显的上调，两组之间有统计学差异，而两组的表面标志CD206、CD209均未见明显改变(如图2所示)。由于CD197、CD86是M1型巨噬细胞表面标志分子，而CD209、CD206则是M2型巨噬细胞表面标志分子。因此，可以得出的结论为：在TRALI发生过程中，AMs活化后是主要是向M1方向极化的。可以据此推测：很可能是因为AMs活化后主要是向M1方向极化，不利于损伤修复，而导致TRALI的发展。这一推测从实验(2)、输注不同极化类型的巨噬细胞对TRALI临床症状的影响中可以证实：M1会加重了TRALI肺损伤程度及临床症状，M2则可以使肺损伤程度减轻。因此，得出结论：TRALI发生过程中，由于AMs主要是向M1方向极化，从而不利于损伤的修复，导致了TRALI的进一步发展。

虽然TRALI的致病机制尚不明确，但是以上实验可以看出AMs参与了TRALI的发病：1)、清除AMs细胞，能够减轻TRALI的临床症状；2)、输注诱导极化的M1型巨噬细胞可以加重TRALI小鼠症状以及肺损伤严重程度，死亡率虽与阴性对照组无差异，但死亡发生较早，而M2型巨噬细胞输注能够减轻TRALI的临床症状，并降低死亡率；3)、在TRALI致病过程中，AMs细胞的表面标志物CD86、CD197表达上调，提示其主要向M1方向极化而不利于肺脏损伤的修复。这些结果均说明了AMs向M1的极化现象是导致TRALI的重要原因，M1和M2的比例会影响TRALI的发生及发展。基于此，发明人提出了一个大胆的想法：将AMs作为TRALI防治的新靶点，即通过调节AMs的活化方向，降低其向M1的极化，进而使得M2/M1的比例提升，以达到减轻TRALI症状的目的。

本发明通过研究确证可以通过调节AMs的极化方向，使得M2/M1的比例升高，从而达到改善TRALI症状的目的，并突破性地发现α1-AT可用于调节AMs的极化方向，控制M2/M1的比例，从而能将其用作TRALI的保护剂，因此，提出了α1-AT在保护TRALI中的新用途。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、基于“二次打击学说”建立TRALI小鼠模型

经脂多糖(LPS)预处理、MHCⅠ类抗体二次打击诱导TRALI发生，并分析小鼠肺组织病理、肺湿重/干重比、直肠温度、死亡率等指标对该模型进行了验证，结果显示经脂多糖(LPS)预处理、MHCⅠ类抗体二次打击诱导TRALI的小鼠模型可用。本实施例经脂多糖(LPS)预处理、MHCⅠ类抗体二次打击建立起的TRALI小鼠模型能够在一定程度上模拟TRALI的临床表现，可重复性强，为解释探索TRALI的救治措施奠定了基础。

具体步骤如下：

雄性6～8周龄Balb/c小鼠随机分为5组(分别命名为a、b、c、d及e组)，每组5只，a组为空白对照组；b组腹腔注射0.1mg/kg LPS(溶于100μl NS中)；c组腹腔注射0.1mg/kg LPS，并回笼正常饲养24h后尾静脉注射100μlNS；d组尾静脉注射2.25mg/kg抗H²Kd单克隆抗体(MHCⅠ类抗体)由杂交瘤细胞株34-1-2S(购自美国模式培养物集存库)分泌而来，溶于100μlNS中)；e组(TRALI模型组)腹腔注射0.1mg/kg LPS，并回笼正常饲养24h后尾静脉注射2.25mg/kg抗H2Kd单克隆抗体，建立TRALI小鼠模型。

实验结果如下：

1)、小鼠外观及症状观察：e组(TRALI模型组)小鼠经LPS刺激及MHCⅠ类单克隆抗体二次打击后30min左右，小鼠均出现呼吸浅快，呼吸困难，呼吸节律不规整，行动迟缓，毛发凌乱，口鼻泡沫样分泌物增多，小鼠鼻尖和四肢末梢明显紫绀，甚至死亡等表现，符合TRALI急性肺损伤典型的症状及体征。而a、b、c、d组小鼠行动自如，毛色光滑，呼吸节律规整，四肢末梢及鼻尖无紫绀，无死亡。

肺组织病理变化(图1A)：a组有结构完整、形态正常、大小均匀的肺泡及肺泡上皮细胞，肺间质间隙无中性粒细胞浸润，肺泡间隔无增宽，微血管无充血和淤血，b、c、d组可见肺间质内少量中性粒细胞浸润及淤血，其它结构及肺泡形态未见明显异常改变；E组(TRALI模型组)：小鼠的肺组织结构损伤严重，肺泡壁出现广泛的断裂损伤，肺泡腔内充满大量红细胞及中性粒细胞，肺泡间隔显著增宽，肺泡间质内充满了纤维蛋白渗出液及中性粒细胞，组织间隙内充满大量红细胞。符合TRALI发生后致急性肺损伤的典型表现。

2)、肺组织湿重/干重比值(图1B)：与a、b、c、d组比较，e组(TRALI模型组)小鼠右肺湿重/干重比值显著增加(P<0.001)，符合TRALI发生后致急性肺水肿的典型表现。

3)、小鼠直肠温度(图1C)：MHCI类单克隆抗体输注后不同时间点对直肠温度进行连续监测。与对照组(a、b、c、d)比较，e组(TRALI模型组)小鼠在抗体输注后15min直肠温度开始下降，120min小鼠直肠温度具有明显统计学差异(P<0.001)，符合TRALI发生后致体温降低的临床表现。

实施例2、基因转染实现α1-AT在体内长期稳定高表达

水动力基因转染技术是一种简单高效的非病毒活体基因转染技术,为了实现小鼠体内α1-AT长期稳定的高效表达，本发明通过水动力基因转染技术将α1-AT表达质粒转染至BALB/c小鼠体内，并对血清中α1-AT浓度进行检测。

本发明所述具体方法包括以下步骤：

(1)α1-AT表达载体的构建

以人肝脏基因组DNA为模板，分别使用引物对1/2及引物对3/4，PCR扩增BglⅡhAAT-1206－355ScaⅠ及ScaⅠhAAT-348－+45I-PpoⅠ调控序列，并将获得的调控序列通过BglⅡ/I-PpoⅠ位点插入pCIneo真核表达载体，替代pCIneo载体的CMV启动子，获得载体ATTP-pCIneo；以人肝脏mRNA为模板，在特异引物对5/6的引导下，PCR扩增α1-AT基因编码序列-hAAT，通过EcoRⅠ/SalⅠ位点插入ATTP-pCIneo，获得由α1-AT启动子调控α1-AT基因表达的真核表达载体ATTP-pCIneo-hAAT。

引物序列如下：

引物1 5’-GGAAGATCTGGATCCTGTGGTCACTCGCCT-3’

引物2 5’-AAAAGTACTACCATTTACTGAGTCACCCCAAA-3’

引物3 5’-AAAAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTA-3’

引物4 5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’

引物5 5’-CCGGAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCT-3’

引物6 5’-CCGGTCGACTCCAGCTCAACCCTTCTTTA-3’

α1-AT启动子序列如下：

AGATCTGGATCCTGTGGGTCACTCGCCTGGTAGAGCCCCAAGGTGGAGGCATAAATGGGACTGGTGAATGACAGAAGGGGCAAAAATGCACTCATCCATTCACTCTGCAAGTATCTACGGCACGTACGCCAGCTCCCAAGCAGGTTTGCGGGTTGCACAGCGGGCGATGCAATCTGATTTAGGCTTTTAAAGGGATTGCAATCAAGTGGGGCCCCACTAGCCTCAACCCTGTACCTCCCCTCCCCTCCACCCCCAGCAGTCTCCAAAGGCCTCCAACAACCCCAGAGTGGGGGCCATGTATCCAAAGAAACTCCAAGCTGTATACGGATCACACTGGTTTTCCAGGAGCAAAAACAGAAACAGGCCTGAGGCTGGTCAAAATTGAACCTCCTCCTGCTCTGAGCAGCCTGGGGGGCAGACTAAGCAGAGGGCTGTGCAGACCCACATAAAGAGCCTACTGTGTGCCAGGCACTTCACCCGAGGCACTTCACAAGCATGCTTGGGAATGAAACTTCCAACTCTTTGGGATGCAGGTGAAACAGTTCCTGGTTCAGAGAGGTGAAGCGGCCTGCCTGAGGCAGCACAGCTCTTCTTTACAGATGTGCTTCCCCACCTCTACCCTGTCTCACGGCCCCCCATGCCAGCCTGACGGTTGTGTCTGCCTCAGTCATGCTCCATTTTTCCATCGGGACCATCAAGAGGGTGTTTGTGTCTAAGGCTGACTGGGTAACTTTGGATGAGCGGTCTCTCCGCTCTGAGCCTGTTTCCTCATCTGTCAAATGGGCTCTAACCACTCTGATCTCCCAGGGCGGCAGTAAGTCTTCAGCATCAAGCATTTTGGGGTGACTCAGTAAATGGTAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGCTACCTTAAGAGAG

hAAT序列如下：

GAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTGAGGATCCCCAGGAAGACAGATACATCCCACCATGATCAGGATCACCCAACCTTCAACAAGATCACCCCCAACCTGGCTGAGTTCGCCTTCAGCCTATACCGCCAGCTGGCACACCAGTCCAACAGCACCAATATCTTCTTCTCCCCAGTGAGCATCGCTACAGCCTTTGCAATGCTCTCCCTGGGGACCAAGGCTGACACTCACGATGAAATCCTGGAGGGCCTGAATTTCAACCTCACGGAGATTCCGGAGGCTCAGATCCATGAAGGCTTCCAGGAACTCCTCCGTACCCTCAACCAGCCAGACAGCCAGCTCCAGCTGACCACCGGCAATGGCCTGTTCCTCAGCGAGGGCCTGAAGCTAGTGGATAAGTTTTTGGAGGATGTTAAAAAGTTGTACCACTCAGAAGCCTTCACTGTCAACTTCGGGGACACCGAAGAGGCCAAGAAACAGATCAACGATTACGTGGAGAAGGGTACTCAAGGGAAAATTGTGGATTTGGTCAAGGAGCTTGACAGAGACACAGTTTTTGCTCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAGGCAAATGGGAGAGACCCTTTGAAGTCAAGGACACCGAGGAAGAGGACTTCCACGTGGACCAGGTGACCACCGTGAAGGTGCCTATGATGAAGCGTTTAGGCATGTTTAACATCCAGCACTGTAAGAAGCTGTCCAGCTGGGTGCTGCTGATGAAATACCTGGGCAATGCCACCGCCATCTTCTTCCTGCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGAAAATGAACTCACCCACGATATCATCACCAAGTTCCTGGAAAATGAAGACAGAAGGTCTGCCAGCTTACATTTACCCAAACTGTCCATTACTGGAACCTATGATCTGAAGAGCGTCCTGGGTCAACTGGGCATCACTAAGGTCTTCAGCAATGGGGCTGACCTCTCCGGGGTCACAGAGGAGGCACCCCTGAAGCTCTCCAAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACGAGAAAGGGACTGAAGCTGCTGGGGCCATGTTTTTAGAGGCCATACCCATGTCTATCCCCCCCGAGGTCAAGTTCAACAAACCCTTTGTCTTCTTAATGATTGAACAAAATACCAAGTCTCCCCTCTTCATGGGAAAAGTGGTGAATCCCACCCAAAAATAACTGCCTCTCGCTCCTCAACCCCTCCCCTCCATCCCTGGCCCCCTCCCTGGATGACATTAAAGAAGGGTTGAGCTGGAGTCGAC

(2)水动力基因转染技术转染α1-AT表达载体

BALB/c小鼠随机分为两组，命名为α1-AT组和Vector组，将α1-抗胰蛋白酶真核表达载体ATTP-pCIneo-hAAT及阴性对照ATTP-pCIneo质粒各取10μg，分别加入体积为小鼠体重10％的生理盐水(NS)中，在5～8s内高压快速注射入α1-AT组和Vector组小鼠尾静脉。注射后消毒，小鼠回笼后正常饲养。第一次注射1周后用同样的水动力转染方法重复注射一次。

(3)血清α1-AT浓度的检测

检测水动力基因转染α1-AT14d后的小鼠血清中α1-AT浓度：96孔板内加入羊抗α1-AT多克隆抗体(5μg/ml)，4℃下孵育16h；用PBST洗板后每孔加入130μl含10％FBS的PBST，37℃温育1h后拍干；每孔再加入100μl经梯度稀释的已知浓度的α1-AT标准品及待检测样品，37℃温育40min；用PBST洗板，拍干，每孔加入100μl 1:400稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗α1-AT多克隆抗体，37℃温育40min；最后再用PBST洗板，测其450nm波长下吸光度值，根据标准品的浓度与吸光度值间的数量关系计算出待检样品中α1-AT的浓度(见图6中的左图)。

结果显示，α1-AT组中α1-AT浓度高达30000ng/ml，而阴性对照Vector组则远低于5000ng/ml，表明α1-AT可以在BALB/c小鼠体内持续高效表达，见图6中的右图。

实施例3、α1-AT基因表达对TRALI起到保护作用

本发明已证明肺泡巨噬细胞AMs活化后主要是向M1方向极化而不利于修复损伤，本实施例进一步证明α1-AT能抑制巨噬细胞向M1极化，并进一步应用α1-AT调控TRALI发病过程中AMs的M1和M2比例，为TRALI防治提供新的解决方案。

在验证实施例2水动力基因转染α1-AT在小鼠体内长期稳定高效表达的基础之上，进一步研究该蛋白酶抑制剂α1-AT对TRALI肺损伤的保护作用。通过对实施例2获得的水动力转染α1-AT后的BALB/c小鼠诱导TRALI发生，观察α1-AT高效表达对TRALI小鼠肺损伤的干预效果。

具体实施步骤如下：

(1)将BALB/c小鼠随机分为2组，分别为α1-AT^-组和α1-AT⁺组。

(2)水动力转染α1-AT：α1-AT⁺组和α1-AT^-组小鼠在实验前1-2w分别进行尾静脉水动力转染ATTP-pCIneo-hAAT及阴性对照ATTP-pCIneo质粒(体积为小鼠体重的10％)。

(3)TRALI模型的建立及观察：实验前24h，两组小鼠均给予LPS刺激(i.p.0.1mg/kg)，实验当天，两组小鼠尾静脉注射2.25mg/kg H2Kd单克隆抗体诱导TRALI发生，并观察小鼠状态。在规定的时间点(0，15，30，60，120min)检测直肠温度，并记录死亡时间；H2Kd单克隆抗体输注后2h结束观察，断颈处死各组小鼠，解剖取肺HE染色用于病理学观察，留取小鼠右肺组织，计算各组小鼠右肺脏湿干比(W/D)。

实验结果显示：与α1-AT^-组相比，α1-AT⁺组小鼠肺损伤各项指标显著减轻，体现在：

1)症状表现：在抗体输注后，α1-AT^-组小鼠均出现不同程度的呼吸困难，鼻尖及四肢末梢紫绀，活动减少。α1-AT⁺组小鼠呼吸困难及紫绀较轻，小鼠一般状态较好。直肠温度监测发现，在发生TRALI后，α1-AT⁺组小鼠直肠温度与α1-AT^-组相比，下降幅度小(见图7A)

2)肺脏大体观察可见α1-AT^-组的小鼠肺脏水肿较轻，可以清晰辨认肺脏大体轮廓。α1-AT^-组可见小鼠肺脏充血水肿严重，体积增大，渗出液较多(图7B)。观察结果通过测量肺脏湿干比得到证实(图7C)。

3)病理学观察：与α1-AT^-组相比，α1-AT⁺组虽存在肺泡间质水肿、中性粒细胞浸润，但肺泡壁及肺泡间质充血水肿较轻，无明显间隔断裂，可清晰辨认肺泡结构，蛋白渗出液较少，中性粒细胞浸润不明显(图7D)。

4)存活率方面，α1-AT⁺组小鼠存活率为60％，α1-AT^-组小鼠存活率为40％(图7E)。

实验结果证实，α1-AT可以减轻TRALI肺损伤程度，改善TRALI症状，提高生存率。

实施例4：α1-AT对TRALI起到保护作用

(1)将BALB/c小鼠随机分为2组，分别为α1-AT^-组和α1-AT⁺组。

(2)α1-AT⁺组小鼠在实验前2w隔一天给予一次α1-AT蛋白溶液(将α1-AT蛋白溶于PBS缓冲液中制得)，每次按小鼠体重给予120mg/kg的α1-AT蛋白，α1-AT^-组给予PBS缓冲液作为对照。

(3)TRALI模型的建立及观察：实验前24h，两组小鼠均给予LPS刺激(i.p.0.1mg/kg)，实验当天，两组小鼠尾静脉注射2.25mg/kg H2Kd单克隆抗体诱导TRALI发生，并观察小鼠状态。在规定的时间点(0，15，30，60，120min)检测直肠温度，并记录死亡时间；H2Kd单克隆抗体输注后2h结束观察，断颈处死各组小鼠，解剖取肺组织，计算各组小鼠右肺脏湿干比(W/D)。

实验结果显示：与α1-AT^-组相比，α1-AT⁺组小鼠呼吸困难及紫绀较轻，小鼠一般状态较好，肺脏湿干比(W/D)明显下降(图8A)，存活率提高(图8B)。

实施例5、α1-AT调节M1/M2的比例对TRALI起到保护作用

延续实施例3，通过流式细胞术鉴定α1-AT^-组和α1-AT⁺组的TRALI小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞极化类型，结果发现，经水动力转染过α1-AT的TRALI小鼠(即α1-AT⁺组)，肺泡中巨噬细胞M1型巨噬细胞表面标志分子CD86和CD197表达下调明显，与对照组(即α1-AT^-组)相比具有统计学差异，而M2型巨噬细胞表面标志性分子CD206表达两组之间未见明显差异(图9)。实验结果表明，α1-AT在TRALI发生过程中，通过抑制巨噬细胞AMs向M1型巨噬细胞极化，调节了M1/M2的比例，使M2/M1的比例升高，从而发挥对肺损伤的保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> α1-AT表达载体在制备输血相关急性肺损伤保护剂中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaagatctg gatcctgtgg tcactcgcct 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaagtacta ccatttactg agtcacccca aa 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaagtacta ccatttactg agtcacccca aa 32

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggactctctt aaggtagcga ttcactgtcc caggtcagt 39

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggaattca atcgacaatg ccgtcttct 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggtcgact ccagctcaac ccttcttta 29

<210> 7

<211> 1273

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agatctggat cctgtgggtc actcgcctgg tagagcccca aggtggaggc ataaatggga 60

ctggtgaatg acagaagggg caaaaatgca ctcatccatt cactctgcaa gtatctacgg 120

cacgtacgcc agctcccaag caggtttgcg ggttgcacag cgggcgatgc aatctgattt 180

aggcttttaa agggattgca atcaagtggg gccccactag cctcaaccct gtacctcccc 240

tcccctccac ccccagcagt ctccaaaggc ctccaacaac cccagagtgg gggccatgta 300

tccaaagaaa ctccaagctg tatacggatc acactggttt tccaggagca aaaacagaaa 360

caggcctgag gctggtcaaa attgaacctc ctcctgctct gagcagcctg gggggcagac 420

taagcagagg gctgtgcaga cccacataaa gagcctactg tgtgccaggc acttcacccg 480

aggcacttca caagcatgct tgggaatgaa acttccaact ctttgggatg caggtgaaac 540

agttcctggt tcagagaggt gaagcggcct gcctgaggca gcacagctct tctttacaga 600

tgtgcttccc cacctctacc ctgtctcacg gccccccatg ccagcctgac ggttgtgtct 660

gcctcagtca tgctccattt ttccatcggg accatcaaga gggtgtttgt gtctaaggct 720

gactgggtaa ctttggatga gcggtctctc cgctctgagc ctgtttcctc atctgtcaaa 780

tgggctctaa ccactctgat ctcccagggc ggcagtaagt cttcagcatc aagcattttg 840

gggtgactca gtaaatggta gtacttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag 900

tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc 960

ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta 1020

agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact 1080

cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg 1140

ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg 1200

aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaatcgc 1260

taccttaaga gag 1273

<210> 8

<211> 1340

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaattcaatc gacaatgccg tcttctgtct cgtggggcat cctcctgctg gcaggcctgt 60

gctgcctggt ccctgtctcc ctggctgagg atccccagga agacagatac atcccaccat 120

gatcaggatc acccaacctt caacaagatc acccccaacc tggctgagtt cgccttcagc 180

ctataccgcc agctggcaca ccagtccaac agcaccaata tcttcttctc cccagtgagc 240

atcgctacag cctttgcaat gctctccctg gggaccaagg ctgacactca cgatgaaatc 300

ctggagggcc tgaatttcaa cctcacggag attccggagg ctcagatcca tgaaggcttc 360

caggaactcc tccgtaccct caaccagcca gacagccagc tccagctgac caccggcaat 420

ggcctgttcc tcagcgaggg cctgaagcta gtggataagt ttttggagga tgttaaaaag 480

ttgtaccact cagaagcctt cactgtcaac ttcggggaca ccgaagaggc caagaaacag 540

atcaacgatt acgtggagaa gggtactcaa gggaaaattg tggatttggt caaggagctt 600

gacagagaca cagtttttgc tctggtgaat tacatcttct ttaaaggcaa atgggagaga 660

ccctttgaag tcaaggacac cgaggaagag gacttccacg tggaccaggt gaccaccgtg 720

aaggtgccta tgatgaagcg tttaggcatg tttaacatcc agcactgtaa gaagctgtcc 780

agctgggtgc tgctgatgaa atacctgggc aatgccaccg ccatcttctt cctgcctgat 840

gaggggaaac tacagcacct ggaaaatgaa ctcacccacg atatcatcac caagttcctg 900

gaaaatgaag acagaaggtc tgccagctta catttaccca aactgtccat tactggaacc 960

tatgatctga agagcgtcct gggtcaactg ggcatcacta aggtcttcag caatggggct 1020

gacctctccg gggtcacaga ggaggcaccc ctgaagctct ccaaggccgt gcataaggct 1080

gtgctgacca tcgacgagaa agggactgaa gctgctgggg ccatgttttt agaggccata 1140

cccatgtcta tcccccccga ggtcaagttc aacaaaccct ttgtcttctt aatgattgaa 1200

caaaatacca agtctcccct cttcatggga aaagtggtga atcccaccca aaaataactg 1260

cctctcgctc ctcaacccct cccctccatc cctggccccc tccctggatg acattaaaga 1320

agggttgagc tggagtcgac 1340

Claims (22)

1.α1-AT在制备输血相关急性肺损伤保护剂中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述保护剂为可溶性蛋白形式的α1-AT或α1-AT表达载体。

3.α1-AT在制备AMs向M1型巨噬细胞极化的抑制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述抑制剂为可溶性蛋白形式的α1-AT或α1-AT表达载体。

5.α1-AT在制备AMs活化过程中减少M1型巨噬细胞使M2/M1的比例升高的调节剂的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述调节剂为可溶性蛋白形式的α1-AT或α1-AT表达载体。

7.根据权利要求2或4或6所述应用，其特征在于，所述α1-AT表达载体在体内以基因转染的方式高效表达α1-AT。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述α1-AT表达载体在肝脏内以基因转染的方式高效表达α1-AT。

9.根据权利要求2或4或6所述应用，其特征在于，α1-AT在体内通过抑制肺泡巨噬细胞AMs向M1型巨噬细胞极化，使M2型巨噬细胞与M1型巨噬细胞的比例升高。

10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，α1-AT在体内通过抑制肺泡巨噬细胞AMs向M1型巨噬细胞极化，使M2型巨噬细胞与M1型巨噬细胞的比例升高。

11.根据权利要求8所述应用，其特征在于，α1-AT在体内通过抑制肺泡巨噬细胞AMs向M1型巨噬细胞极化，使M2型巨噬细胞与M1型巨噬细胞的比例升高。

12.根据权利要求2或4或6所述应用，其特征在于，所述α1-AT表达载体的构建方法为：以人肝脏基因组DNA为模板，分别使用引物1和引物2组成的引物对、引物3和引物4组成的引物对，PCR扩增BglⅡhAAT-1206－355ScaⅠ及ScaⅠhAAT-348－+45I-PpoⅠ调控序列，并将获得的调控序列通过BglⅡ/I-PpoⅠ位点插入pCIneo真核表达载体，替代pCIneo载体的CMV启动子，获得载体，命名为ATTP-pCIneo；以人肝脏mRNA为模板，在引物5和引物6组成的特异引物对的引导下，PCR扩增α1-AT基因编码序列，通过EcoRⅠ/SalⅠ位点插入ATTP-pCIneo，获得由α1-AT启动子调控α1-AT基因表达的真核表达载体，命名为ATTP-pCIneo-hAAT；

引物1的序列为5’-GGAAGATCTGGATCCTGTGGTCACTCGCCT-3’；

引物2的序列为5’-AAAAGTACTACCATTTACTGAGTCACCCCAAA-3’；

引物3的序列为5’-AAAAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTA-3’；

引物4的序列为5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’；

引物5的序列为5’-CCGGAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCT-3’；

引物6的序列为5’-CCGGTCGACTCCAGCTCAACCCTTCTTTA-3’。

13.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述α1-AT表达载体的构建方法为：以人肝脏基因组DNA为模板，分别使用引物1和引物2组成的引物对、引物3和引物4组成的引物对，PCR扩增BglⅡhAAT-1206－355ScaⅠ及ScaⅠhAAT-348－+45I-PpoⅠ调控序列，并将获得的调控序列通过BglⅡ/I-PpoⅠ位点插入pCIneo真核表达载体，替代pCIneo载体的CMV启动子，获得载体，命名为ATTP-pCIneo；以人肝脏mRNA为模板，在引物5和引物6组成的特异引物对的引导下，PCR扩增α1-AT基因编码序列，通过EcoRⅠ/SalⅠ位点插入ATTP-pCIneo，获得由α1-AT启动子调控α1-AT基因表达的真核表达载体，命名为ATTP-pCIneo-hAAT；

引物1的序列为5’-GGAAGATCTGGATCCTGTGGTCACTCGCCT-3’；

引物2的序列为5’-AAAAGTACTACCATTTACTGAGTCACCCCAAA-3’；

引物3的序列为5’-AAAAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTA-3’；

引物4的序列为5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’；

引物5的序列为5’-CCGGAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCT-3’；

引物6的序列为5’-CCGGTCGACTCCAGCTCAACCCTTCTTTA-3’。

14.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述α1-AT表达载体的构建方法为：以人肝脏基因组DNA为模板，分别使用引物1和引物2组成的引物对、引物3和引物4组成的引物对，PCR扩增BglⅡhAAT-1206－355ScaⅠ及ScaⅠhAAT-348－+45I-PpoⅠ调控序列，并将获得的调控序列通过BglⅡ/I-PpoⅠ位点插入pCIneo真核表达载体，替代pCIneo载体的CMV启动子，获得载体，命名为ATTP-pCIneo；以人肝脏mRNA为模板，在引物5和引物6组成的特异引物对的引导下，PCR扩增α1-AT基因编码序列，通过EcoRⅠ/SalⅠ位点插入ATTP-pCIneo，获得由α1-AT启动子调控α1-AT基因表达的真核表达载体，命名为ATTP-pCIneo-hAAT；

引物1的序列为5’-GGAAGATCTGGATCCTGTGGTCACTCGCCT-3’；

引物2的序列为5’-AAAAGTACTACCATTTACTGAGTCACCCCAAA-3’；

引物3的序列为5’-AAAAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTA-3’；

引物4的序列为5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’；

引物5的序列为5’-CCGGAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCT-3’；

引物6的序列为5’-CCGGTCGACTCCAGCTCAACCCTTCTTTA-3’。

15.根据权利要求12所述应用，其特征在于，所述α1-AT启动子的氨基酸序列为SEQ IDNO：7。

16.根据权利要求12所述应用，其特征在于，hAAT的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。

17.根据权利要求15所述应用，其特征在于，hAAT的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。

18.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述基因转染为水动力基因转染，具体为：将α1-AT真核表达载体ATTP-pCIneo-hAAT加入生理盐水中，在5～8s内高压注射入小鼠尾静脉。

19.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述基因转染为水动力基因转染，具体为：将α1-AT真核表达载体ATTP-pCIneo-hAAT加入生理盐水中，在5～8s内高压注射入小鼠尾静脉。

20.根据权利要求10所述应用，其特征在于，所述基因转染为水动力基因转染，具体为：将α1-AT真核表达载体ATTP-pCIneo-hAAT加入生理盐水中，在5～8s内高压注射入小鼠尾静脉。

21.根据权利要求11所述应用，其特征在于，所述基因转染为水动力基因转染，具体为：将α1-AT真核表达载体ATTP-pCIneo-hAAT加入生理盐水中，在5～8s内高压注射入小鼠尾静脉。

22.根据权利要求13所述应用，其特征在于，所述基因转染为水动力基因转染，具体为：将α1-AT真核表达载体ATTP-pCIneo-hAAT加入生理盐水中，在5～8s内高压注射入小鼠尾静脉。

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