JP2022529262A - ミトコンドリアを含むエアロゾル化組成物及びその使用方法 - Google Patents

ミトコンドリアを含むエアロゾル化組成物及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ミトコンドリアを含有するエアロゾル化組成物、当該組成物を調製及び使用する方法、ならびに当該組成物を投与するための装置に関する。

Description

優先権の主張
本出願は、２０１９年４月１５日出願の米国仮出願第６２／８３４，０２０号の利益を主張する。上述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、ミトコンドリアを含有するエアロゾル化組成物、当該組成物を調製及び使用する方法、ならびに当該組成物を投与するための装置に関する。
ミトコンドリアは、有核真核細胞の細胞質に見られる二重膜結合オルガネラである。ミトコンドリアは、赤血球を除く人体のほぼすべての細胞に見られる。ミトコンドリアは、細胞のエネルギー代謝の主要部位であり、異なる細胞機能のためにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成する。典型的には、ＡＴＰに対する細胞の必要量の９０％超が細胞自体のミトコンドリアによって供給される。
ミトコンドリアは、特化した機能を有する２つの同心膜から構成される。ミトコンドリア内膜は、ＡＴＰシンターゼのためのタンパク質を含有する。多数の必須膜タンパク質を含有するミトコンドリア外膜は、オルガネラ全体を取り囲む。
ミトコンドリアの構造は、いくつかの現生原核生物との顕著な類似性を有する。実際、ミトコンドリアは、有核細胞が好気性原核生物を貪食したときの古代共生に源を発すると考えられている。共生関係において、宿主細胞は、エネルギー産生のために、貪食された原核生物に依存するようになり、原核生物の細胞は、宿主細胞によって提供される保護環境に依存し始めた。
細胞代謝におけるミトコンドリアの主要な機能により、ミトコンドリアにおける損傷及び機能不全は、様々なヒト疾患を引き起こすことができる。ミトコンドリアに対する損傷は、傷害、毒性、化学療法、及び加齢関連変化によって引き起こされることがある。特に、虚血／再灌流傷害はミトコンドリア障害を引き起こすことができ、このことは酸素消費及びエネルギー合成に負の影響を及ぼすことになる。ミトコンドリアを包含する処置は、ミトコンドリア関連障害に特に有用である可能性がある。一部の早期処置は、筋肉内注射及び動脈内注射によってミトコンドリアを投与することを包含している。様々な目的のために異なる投与経路を経て対象の様々な標的部位にミトコンドリアを投与する必要がある。
本開示は、ミトコンドリアを含有する組成物（例えば、エアロゾル化組成物）、当該組成物を調製及び使用する方法、ならびに当該組成物を投与するための装置を提供する。一態様では、本開示は、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を含有する組成物を、気道を経て投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該組成物は、エアロゾル化組成物である。いくつかの実施形態では、当該組成物は、液体溶液である。
一態様では、本開示は、呼吸器障害に罹患している対象を処置する方法であって、治療有効量のミトコンドリアを含む組成物を対象に気道を経て投与することを含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、エアロゾル化組成物である。いくつかの実施形態では、当該組成物は、ネブライザー、気化器、鼻用スプレー、加圧定量噴霧器、又は呼吸起動型加圧定量噴霧器を使用することによって、対象への投与前にエアロゾル形態へと変換される。
いくつかの実施形態では、当該組成物のエアロゾル形態は、０．０１～１０００マイクロリットル（例えば、０．１～１０００マイクロリットル、１～１０００マイクロリットル、０．１～１００マイクロリットル、０．１～５００マイクロリットル、又は１～５００マイクロリットル）の中央値のサイズを有する液滴を含む。いくつかの実施形態では、当該液滴は、少なくとも０．０１、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００マイクロリットルのサイズを有する。いくつかの実施形態では、当該液滴は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００マイクロリットル未満のサイズを有する。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、呼吸応答能のあるミトコンドリアを含む。
いくつかの実施形態では、当該対象は、呼吸不全、呼吸機能低下、肺炎、肺がん、皺、脱毛症、及び／又はがんに罹患している。いくつかの実施形態では、当該対象は、急性肺損傷に罹患している。
いくつかの実施態様では、当該組成物中のミトコンドリアの濃度は、約１×１０４～５×１０９ｍｌ－１（例えば、約１×１０５～５×１０８ｍｌ－１、１×１０６～５×１０８ｍｌ－１、１×１０７～５×１０８ｍｌ－１、１×１０５～１×１０８ｍｌ－１、１×１０６～１×１０８ｍｌ－１、１×１０７～１×１０８ｍｌ－１、１×１０６～５×１０７ｍｌ－１、１×１０６～１×１０７ｍｌ－１、１×１０６～５×１０７ｍｌ－１、５×１０６～１×１０８ｍｌ－１）である。いくつかの実施形態では、当該濃度は、少なくとも又は約１×１０４ｍｌ－１、５×１０４ｍｌ－１、１×１０５ｍｌ－１、５×１０５ｍｌ－１、１×１０６ｍｌ－１、５×１０６ｍｌ－１、１×１０７ｍｌ－１、５×１０７ｍｌ－１、１×１０８ｍｌ－１、５×１０８ｍｌ－１、又は１×１０９ｍｌ－１、５×１０９ｍｌ－１、又は１×１０１０ｍｌ－１である。いくつかの実施形態では、当該濃度は、１×１０４ｍｌ－１、５×１０４ｍｌ－１、１×１０５ｍｌ－１、５×１０５ｍｌ－１、１×１０６ｍｌ－１、５×１０６ｍｌ－１、１×１０７ｍｌ－１、５×１０７ｍｌ－１、１×１０８ｍｌ－１、５×１０８ｍｌ－１、又は１×１０９ｍｌ－１、５×１０９ｍｌ－１、又は１×１０１０ｍｌ－１未満である。
いくつかの実施形態では、当該対象は、１回用量あたり１×１０５～１×１０９個のミトコンドリア（例えば、１回用量あたり１×１０５～５×１０８個、１×１０６～５×１０８個、１×１０７～５×１０８個、１×１０５～１×１０８個、１×１０６～１×１０８個、１×１０７～１×１０８個、１×１０６～５×１０７個、１×１０６～１×１０７個、１×１０６～５×１０７個、５×１０６～１×１０８個のミトコンドリア）が投与される。いくつかの実施形態では、当該用量は、１回用量あたり少なくとも１×１０４個、５×１０４個、１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、又は１×１０９個、５×１０９個、又は１×１０１０個のミトコンドリアである。いくつかの実施形態では、当該用量は、１回用量あたり１×１０４個、５×１０４個、１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、又は１×１０９個、５×１０９個、又は１×１０１０個未満のミトコンドリアである。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリアは、自家、同種、又は異種である。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、７～８のｐＨを有するＫ＋－ＨＥＰＥＳ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、血清、及び血漿からなる群から選択される溶液をさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、トレハロース、スクロース、マンノース、グリシン、プロリン、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ベタイン、及びサルコシンからなる群から選択される１つ以上のオスモライトをさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、医薬品をさらに含む。いくつかの実施形態では、当該組成物は、医薬として許容され得る希釈剤、賦形剤、又は担体をさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、治療薬又は診断薬をさらに含み、当該治療薬又は当該診断薬は、共有結合によって当該ミトコンドリアに連結されているか、当該ミトコンドリア内に包埋されているか、又は当該ミトコンドリア内に内在化している。いくつかの実施形態では、当該治療薬又は当該診断薬は、治療用診断薬である。いくつかの実施形態では、当該治療薬又は当該診断薬は、抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、当該治療薬又は当該診断薬は、共有結合によってミトコンドリアに連結されている。
いくつかの実施形態では、当該治療薬又は当該診断薬は、当該ミトコンドリア内に包埋されているか又は当該ミトコンドリア内に内在化している。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリアは、遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリアは、外因性ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリアは、外因性のポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核ＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡを含む。
一態様では、本開示は、緩衝液を含む複数の液滴を含むエアロゾル化組成物であって、当該複数の液滴中の少なくとも１つの液滴は、少なくとも１つのミトコンドリアを含む、エアロゾル化組成物に関する。
いくつかの実施形態では、当該緩衝液は、７～８のｐＨを有するＫ＋－ＨＥＰＥＳ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、血清、及び血漿からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、トレハロース、スクロース、マンノース、グリシン、プロリン、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ベタイン、及びサルコシンからなる群から選択される１つ以上のオスモライトをさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、医薬品をさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、医薬として許容され得る希釈剤、賦形剤、又は担体をさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、治療薬又は診断薬をさらに含み、当該治療薬又は当該診断薬は、共有結合によって当該ミトコンドリアに連結されているか、当該ミトコンドリア内に包埋されているか、又は当該ミトコンドリア内に内在化している。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリア薬は、治療薬、化学療法薬、又は診断薬からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリア薬は、抗体又は抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリア薬は、共有結合によってミトコンドリアに連結されている。いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリア薬は、ミトコンドリア内に包埋されているか又はミトコンドリア内に内在化している。
いくつかの実施形態では、当該複数の液滴は、１～１０００マイクロリットルの中央値のサイズを有する。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリアは、遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリアは、外因性ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該ミトコンドリアは、外因性ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該対象への投与前のミトコンドリアは、酵素を含む組成物と共にインキュベートされる。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、自家ミトコンドリア、同種ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、又はそれらの混合物を含む。
一態様では、本開示は、ミトコンドリアを対象に気道を経て送達するための装置であって、筐体と、ミトコンドリアを含む組成物のために当該筐体内に配備されたリザーバと、エアロゾル化形態の組成物を生成するためのエアロゾル発生器と、当該組成物がそれを経て当該対象の気道に送達される出口とを備える装置に関する。
いくつかの実施形態では、当該装置は、ネブライザー、鼻用スプレー、又は噴霧器である。いくつかの実施形態では、エアロゾル発生器は、超音波ネブライザーである。
いくつかの実施形態では、エアロゾル発生器は、振動メッシュ装置である。いくつかの実施形態では、エアロゾル発生器は、空気圧縮機を備え、該空気圧縮機は圧縮空気を組成物に流し、当該組成物をエアロゾル形態に変える。
一態様では、本開示は、ミトコンドリアを対象に気道を経て送達するための装置であって、筐体と、当該筐体内に配備されたミトコンドリアを含む組成物と、当該組成物を当該筐体から当該対象の気道に送達し、当該組成物がそれを経て通過するにつれて当該組成物をエアロゾル化するよう構成された出口とを備える上記装置を提供する。
他に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法及び材料を本明細書に説明し、当該技術分野で公知の他の適切な方法及び材料もまた使用することができる。当該材料、方法、及び例は実例にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及されるすべての公表物、特許出願、特許、配列、データベース登録、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
ミトコンドリアを単離する方法を示す概略図である。 生検パンチを使用して取得した骨格筋組織である。 位相差照明下での（明視野、ＢＦ）（左パネル）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓで標識した蛍光下での（中央パネル）単離されたミトコンドリアの顕微鏡画像、及びマージ画像（右パネル）である。 組織湿重量１グラムあたりのミトコンドリア収量についての結果を示すプロットである。 単離されたミトコンドリアの透過型電子顕微鏡画像である。 ミトコンドリア複合体Ｉ～Ｖについての活性アッセイの結果を示す棒グラフである。 状態３（活性）酸素消費量（ＡＤＰ刺激呼吸）についての結果を示す棒グラフである。 大胸筋由来の自家ミトコンドリアにおけるリンゴ酸誘発性（複合体Ｉ）及びコハク酸誘発性（複合体ＩＩ）酸素消費についての呼吸制御指数（ＲＣＩ、状態３／状態４）についての結果を示す棒グラフである。 心筋細胞内に局在する移植ミトコンドリアを示す重ね合わせた顕微鏡画像である。 心筋細胞内に局在する移植ミトコンドリアを示す重ね合わせた顕微鏡画像である。 心筋細胞内に局在する移植ミトコンドリアを示す重ね合わせた顕微鏡画像である。 心筋細胞内に局在する移植ミトコンドリアを示す重ね合わせた顕微鏡画像である。 肺動脈を経た血管注入によって肺に送達された１８Ｆローダミン６－Ｇミトコンドリア（６×１０７個）を投与したラットの陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって取得した代表的な横断画像を示す画像である。 肺動脈を経た血管注入によって肺に送達された１８Ｆローダミン６－Ｇミトコンドリア（６×１０７個）を投与したラットのＰＥＴによって取得した代表的な冠状画像を示す画像である。 肺動脈を経た血管注入によって肺に送達された１８Ｆローダミン６－Ｇミトコンドリア（６×１０７個）を投与したラットのＰＥＴによって取得した肺の代表的な画像を示す画像である。 ネブライザーによる外因性ミトコンドリアの投与後のマウス肺組織の免疫組織化学的染色の画像である。 肺動脈による外因性ミトコンドリアの投与後のマウス肺組織の免疫組織化学的染色の画像である。 左肺の２時間の急性肺損傷（ＡＬＩ）虚血及び２４時間の回復後のマウス肺の画像である。赤い丸は、ＡＬＩ手技に供する肺を示す。右肺はＲとして示され、左肺はＬとして示されている。心臓（Ｈ）は中央に示されている。 ２４時間の回復後に２時間の左肺虚血に供したマウス肺（ｎ＝４）における肺抵抗を示す棒グラフである。ビヒクル又はミトコンドリアを、左肺動脈（Ｖ）を経て又はネブライザー（Ｎ）によって血管内送達した。 ２４時間の回復後に２時間の左肺虚血に供したマウス肺における弾性を示す棒グラフである。ビヒクル又はミトコンドリアを、左肺動脈（Ｖ）を経て又はネブライザー（Ｎ）によって血管内送達した。 呼吸緩衝液のみ（偽）又はミトコンドリア（呼吸緩衝液中の３×１０７個のミトコンドリア）を投与したＢＡＬＢ／ｃＪマウスの全血試料に対するリアルタイムＰＣＲによって決定された循環遊離ｍｔＤＮＡの定量を示す棒グラフである。 ヘマトキシリン及びエオシンで染色した肺組織の画像である。 Ｍａｓｓｏｎの３色で染色した肺組織の画像である。 右下葉由来の肺組織の透過型電子顕微鏡の画像である。 ミトコンドリア取り込み及び生体内分布の定量を示す画像である。いずれも肺動脈幹への注射を介してＷｉｓｔａｒ系ラットの肺に送達された１８Ｆ－ローダミン６Ｇ標識ミトコンドリア（１×１０９個）のＰＥＴ－マイクロＣＴ撮像。 ミトコンドリア取り込み及び生体内分布の定量を示す画像である。噴霧を介したエアロゾルとしてＷｉｓｔａｒ系ラットの肺に送達された１８Ｆ－ローダミン６Ｇ標識ミトコンドリア（１×１０９個）のＰＥＴ－マイクロＣＴ撮像。 肺組織内に取り込まれた血管送達を介して送達されたヒト心臓線維芽細胞由来の外因性ミトコンドリアを実証する免疫組織化学的画像（１００倍）である。 肺組織内に取り込まれた噴霧を介して送達されたヒト心臓線維芽細胞由来の外因性ミトコンドリアを実証する免疫組織化学的画像（１００倍）である。 血管送達を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての動的コンプライアンスの肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 血管送達を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての抵抗性の肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 血管送達を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての組織ダンピングの肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 血管送達を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての最大吸気量の肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 血管送達を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての最大吸気圧の肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 噴霧を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての動的コンプライアンスの肺機能分析の結果を示す。 噴霧を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての抵抗性の肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 噴霧を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての組織ダンピングの肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 噴霧を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての最大吸気量の肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 噴霧を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての最大吸気圧の肺機能分析の結果を示す棒グラフである。 肺機能分析、特に代表的な圧力－体積ループの結果を示す。 血管送達を介してビヒクルを受け入れる肺についての肺組織切片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）画像、ミエロペルオキシダーゼ染色（ＭＰＯ）画像、ＴＵＮＥＬ画像、及び透過型電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す画像である。スケールバー：５００μｍ。 血管送達を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての肺組織切片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）画像、ミエロペルオキシダーゼ染色（ＭＰＯ）画像、ＴＵＮＥＬ画像、及び透過型電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す画像である。スケールバー：５００μｍ。 噴霧を介してビヒクルを受け入れる肺についての肺組織切片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）画像、ミエロペルオキシダーゼ染色（ＭＰＯ）画像、ＴＵＮＥＬ画像、及び透過型電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す画像である。スケールバー：５００μｍ。 噴霧を介してミトコンドリアを受け入れる肺についての肺組織切片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）画像、ミエロペルオキシダーゼ染色（ＭＰＯ）画像、ＴＵＮＥＬ画像、及び透過型電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す画像である。スケールバー：５００μｍ。 偽群についての肺組織切片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）画像、ミエロペルオキシダーゼ染色（ＭＰＯ）画像、ＴＵＮＥＬ画像、及び透過型電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す画像である。スケールバー：５００μｍ。 血管送達を介したビヒクル（ビヒクルＶ）、血管送達を介したミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｖ）、及び偽群を受け入れる肺についての２４時間の再灌流時の肺組織傷害の重症度を示す棒グラフである。２時間の虚血及び２４時間の再灌流の後、Ｈ＆Ｅ染色切片（１５倍）を、すでに説明した点数化システムを使用して肺傷害の重症度について評価した。組織傷害が悪いほど、点数（１～５）は高かった。組織傷害分析の重症度は、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ肺及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ肺における肺構造の破壊の徴候がないまま、炎症細胞浸潤及び間質鬱血の有意な低下を示す。 血管送達を介したビヒクル（ビヒクルＶ）、血管送達を介したミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｖ）、及び偽群を受け入れる肺についての２４時間の再灌流時の好中球計数を示す棒グラフである。２時間の虚血及び２４時間の再灌流の後、Ｈ＆Ｅ染色切片（１５倍）を、すでに説明した点数化システムを使用して肺傷害の重症度について評価した。組織傷害が悪いほど、点数（１～５）は高かった。組織傷害分析の重症度は、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ肺及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ肺における肺構造の破壊の徴候がないまま、炎症細胞浸潤及び間質鬱血の有意な低下を示す。 血管送達を介したビヒクル（ビヒクルＶ）、血管送達を介したミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｖ）、及び偽群を受け入れる肺についての２４時間の再灌流時の１００個の核あたりのＴＵＮＥＬ標識した核を示す棒グラフである。２時間の虚血及び２４時間の再灌流の後、Ｈ＆Ｅ染色切片（１５倍）を、すでに説明した点数化システムを使用して肺傷害の重症度について評価した。組織傷害が悪いほど、点数（１～５）は高かった。組織傷害分析の重症度は、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ肺及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ肺における肺構造の破壊の徴候がないまま、炎症細胞浸潤及び間質鬱血の有意な低下を示す。 噴霧を介したビヒクル（ビヒクルＮｅｂ）、血管送達を介したミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｎｅｂ）、及び偽群を受け入れる肺についての２４時間の再灌流時の肺組織傷害の重症度を示す棒グラフである。２時間の虚血及び２４時間の再灌流の後、Ｈ＆Ｅ染色切片（１５倍）を、すでに説明した点数化システムを使用して肺傷害の重症度について評価した。組織傷害が悪いほど、点数（１～５）は高かった。組織傷害分析の重症度は、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ肺及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ肺における肺構造の破壊の徴候がないまま、炎症細胞浸潤及び間質鬱血の有意な低下を示す。 噴霧を介したビヒクル（ビヒクルＮｅｂ）、血管送達を介したミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｎｅｂ）、及び偽群を受け入れる肺についての２４時間の再灌流時の好中球計数を示す棒グラフである。２時間の虚血及び２４時間の再灌流の後、Ｈ＆Ｅ染色切片（１５倍）を、すでに説明した点数化システムを使用して肺傷害の重症度について評価した。組織傷害が悪いほど、点数（１～５）は高かった。組織傷害分析の重症度は、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ肺及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ肺における肺構造の破壊の徴候がないまま、炎症細胞浸潤及び間質鬱血の有意な低下を示す。 噴霧を介したビヒクル（ビヒクルＮｅｂ）、血管送達を介したミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｎｅｂ）、及び偽群を受け入れる肺についての２４時間の再灌流時の１００個の核あたりのＴＵＮＥＬ標識した核を示す棒グラフである。２時間の虚血及び２４時間の再灌流の後、Ｈ＆Ｅ染色切片（１５倍）を、すでに説明した点数化システムを使用して肺傷害の重症度について評価した。組織傷害が悪いほど、点数（１～５）は高かった。組織傷害分析の重症度は、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ肺及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ肺における肺構造の破壊の徴候がないまま、炎症細胞浸潤及び間質鬱血の有意な低下を示す。 血管送達を介したビヒクル（ビヒクルＶ）、血管送達を介したミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｖ）、噴霧を介したビヒクル（ビヒクルＮｅｂ）、噴霧を介したミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｎｅｂ）、及び偽群を受け入れる肺についての２４時間の再灌流時の湿重量と乾燥重量の比を百分率で示す棒グラフである。２時間の虚血及び２４時間の再灌流の後、Ｈ＆Ｅ染色切片（１５倍）を、すでに説明した点数化システムを使用して肺傷害の重症度について評価した。組織傷害が悪いほど、点数（１～５）は高かった。組織傷害分析の重症度は、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ肺及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ肺における肺構造の破壊の徴候がないまま、炎症細胞浸潤及び間質鬱血の有意な低下を示す。 ＢＡＬサイトカイン分析からの定量結果を示し、値はすべて、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。全群についてｎ＝４である。
本開示は、ミトコンドリア（例えば、生存可能かつ機能的なミトコンドリア）を含有する組成物、当該組成物を調製及び使用する方法、ならびに当該組成物を対象の気道に投与するための装置に関する。本開示は、ミトコンドリアを対象に気道を経て有効に投与することができ、ミトコンドリアを含む組成物のエアロゾル化形態を気道に送達することは、動脈内投与と同様に予想外に有効であることを示す。
本開示はまた、生存可能かつ機能的なミトコンドリアを含む医薬組成物を安全かつ確実に生成することができる方法も提供する。本明細書に説明するような医薬組成物は、治療価値の上昇、商業的価値の上昇、及び治療用量あたりのより低い製造コストを有することができる。
一態様では、本開示は、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を、気道を裏打ちし及び取り囲む細胞に送達する方法を提供する。このような医薬組成物は、細胞によって取り込まれることができ、細胞内にいったん局在化すると、当該ミトコンドリアは１つ以上の生物学的効果を付与することができる。これらの生物学的効果には、呼吸を経て細胞のためのエネルギーを産生すること、ＡＴＰを産生すること（すなわち、ＡＤＰからＡＴＰに変換すること）、細胞代謝を調節すること、クエン酸回路又はクレブス回路を開始すること、熱を産生すること、カルシウムイオンを貯蔵すること、ミトコンドリア活性酸素種を経てシグナル伝達すること、膜電位を調節すること、アポトーシスがプログラムされた細胞死を誘導すること、カルシウムシグナル伝達（例えば、カルシウム誘起性アポトーシス）にかかわること、ヘム及び／又はステロイドを合成すること、ならびにホルモンシグナル伝達を開始することなどがあるが、これらに限定されない。
エアロゾル化組成物
本開示は、単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬を含むエアロゾル化組成物を提供する。本開示は、エアロゾル化組成物中の又はエアロゾルの形態の細胞オルガネラ（例えば、ミトコンドリア）が生存可能かつ機能的なままであることができ、したがって対象の気道に有効に投与されることができることを示す。
本明細書で使用される場合、「エアロゾル」という用語は、キャリヤーガス中の微粒子又は液滴の懸濁液を指す。本明細書で使用される場合、「エアロゾル化」という用語は、組成物をエアロゾルの形態に変換するプロセス又は挙動を指す。エアロゾル化組成物は、複数の粒子（例えば、液滴、固体粒子、液体の液滴、又はヒドロゲル粒子）を含む。いくつかの実施形態では、当該粒子は、約５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、若しくは１０００μｍの、又はこれら未満のサイズ（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、当該粒子は、約５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、若しくは１０００μｍの、又はこれらより大きなサイズ（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、当該粒子は、５００ｎｍ～１０μｍ、５００ｎｍ～１００μｍ、１μｍ～１０μｍ、１μｍ～１００μｍ、５μｍ～１００μｍ、１０μｍ～１００μｍ、又は１μｍ～５００μｍのサイズ（例えば、直径）を有する。本明細書で使用される場合、「直径」という用語は、両方の終点が粒子の表面上にある最長直線セグメントの長さを指す。
いくつかの実施形態では、エアロゾル化組成物は、異なるサイズを有する粒子（例えば、液滴）を含む。いくつかの実施形態では、粒子の約又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、５００ｎｍ～１０μｍ、５００ｎｍ～１００μｍ、１μｍ～１０μｍ、１μｍ～１００μｍ、５μｍ～１００μｍ、１０μｍ～１００μｍ、又は１μｍ～５００μｍのサイズ（例えば、直径）を有する。
いくつかの実施形態では、当該エアロゾル化組成物中の粒子は、約５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、若しくは１０００μｍの、又はこれら未満の中央値のサイズ（例えば、中央値の直径）を有することができる。いくつかの実施形態では、当該粒子は、約５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、若しくは１０００μｍの、又はこれらより大きな中央値のサイズ（例えば、中央値の直径）を有することができる。いくつかの実施形態では、当該粒子は、５００ｎｍ～１０μｍ、５００ｎｍ～１００μｍ、１μｍ～１０μｍ、１μｍ～１００μｍ、５μｍ～１００μｍ、１０μｍ～１００μｍ、又は１μｍ～５００μｍの中央値のサイズ（例えば、中央値の直径）を有することができる。本明細書で使用される場合、「中央値のサイズ」という用語は、体積基準で決定されるような中央値のサイズ（例えば、直径）を指す。中央値のサイズという用語が使用される場合、体積基準で集団の５０％がこのサイズよりも大きいか又は小さいように集団を半分に分ける粒径を説明すると理解される。
エアロゾル化組成物は、当該技術分野で公知の様々な装置によって製造することができる。投与前に組成物をエアロゾル形態に変換することができる例示的な装置には、例えば、ネブライザー、気化器、鼻用スプレー、噴霧器、ソフトミスト噴霧器、ジェット式ネブライザー、超音波ネブライザー、加圧定量噴霧器、呼吸起動型加圧定量噴霧器、又は振動メッシュ装置がある。これらの装置は、例えば、酸素、空気、窒素、又は圧縮空気を含む様々なキャリヤーガスを使用することができる。
エアロゾル化前の組成物は、１つ以上の医薬として許容され得る担体を含むことができる。医薬として許容され得る担体には、ミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬の貯蔵、安定性、投与、細胞ターゲティング及び／又は送達を促進する上で有用な化合物又は組成物があってよい。医薬として許容され得る担体には、限定されないが、適切なビヒクル、希釈剤、溶媒、賦形剤、ｐＨ調整剤、オスモライト、塩、着色料、レオロジー改質剤、潤滑剤、コーティング、充填剤、消泡剤、ポリマー、ヒドロゲル、界面活性剤、乳化剤、アジュバント、防腐剤、リン脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドならびにそれらの誘導体、ワックス、油及び水がある。いくつかの実施形態では、単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬を、インビボでの送達のために水、生理食塩水、緩衝液、呼吸緩衝液、又は無菌ミトコンドリア緩衝液に懸濁する。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は呼吸緩衝液を含むがこれらに限定されない医薬として許容され得る塩、緩衝液又は緩衝系を、本明細書に説明する組成物に含めることができる。リポソームなどのインビボでの細胞への送達を促進する能力を有するビヒクルを利用して、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬の標的細胞への送達を促進することができる。
例示的な緩衝液としては、呼吸緩衝液（例えば、２５０ｍｍｏｌ／Ｌスクロース、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ＋－ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ＋－ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０））があるが、これに限定されない。例示的なオスモライトとしては、トレハロース、スクロース、マンノース、グリシン、プロリン、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ベタイン、及びサルコシンがあるが、これらに限定されない。
単離されたミトコンドリア及び複合ミトコンドリア薬
本明細書に説明する方法において使用するためのミトコンドリアは、何らかの供給源から単離又は提供することができ、例えば、培養細胞又は組織から単離することができる。例示的な細胞としては、筋肉組織細胞、心臓線維芽細胞、培養細胞、ＨｅＬａ細胞、前立腺がん細胞、酵母、血球、培養細胞、及びとりわけ、これらの何らかの混合物があるが、それらに限定されない。例示的な組織としては、肝臓組織、骨格筋、心臓、脳、血液、及び脂肪組織（例えば、褐色脂肪組織）があるが、これらに限定されない。ミトコンドリアは、自家供給源、同種供給源、及び／又は異種供給源の細胞から単離することができる。いくつかの例では、ミトコンドリアは、遺伝子改変を有する細胞、例えば、改変ｍｔＤＮＡ又は改変核ＤＮＡを有する細胞から単離される。
ミトコンドリアは、当業者に公知の方法によって細胞又は組織から単離することができる。いくつかの実施形態では、組織試料又は細胞試料を収集し、次いで均質化する。均質化後、ミトコンドリアを反復遠心分離によって単離する。あるいは、当該細胞均質化液をナイロンメッシュフィルターで濾過することができる。ミトコンドリアを単離する典型的な方法は、例えば、各々が、参照により組み込まれたＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６，Ｈ９４－Ｈ１０５．ＰＭＣ２６３７７８４（２００９）、Ｆｒｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ，ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｉｌｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２（２），２８７－２９５（２００７）、米国特許出願公開第２０１８／００５７６１０号明細書、及び米国特許出願公開第２０１８／００５７６１０号明細書において説明されている。
処置のためのミトコンドリアは、自家供給源、同種供給源、及び異種供給源の細胞又は組織から単離することができる。いくつかの例では、ミトコンドリアを対象の培養細胞又は組織から回収し、これらのミトコンドリアを同じ対象に投与して戻す。いくつかの他の場合では、第２の対象の培養細胞又は組織からミトコンドリアを回収し、これらのミトコンドリアを第１の対象に投与する。いくつかの場合では、ミトコンドリアを異なる種（例えば、マウス、ブタ、酵母）由来の培養細胞又は組織から回収する。
本開示はまた、複合ミトコンドリア薬を含む組成物も提供する。複合ミトコンドリア薬としては、例えば、治療薬、診断薬、及び／又は造影剤などの作用薬と物理的に会合したミトコンドリアがある。
治療薬は、治療用途又は予防用途を有する何らかの作用薬であってよい。例示的な治療薬としては、例えば、とりわけ、虚血関連障害のための治療薬、がんを処置するための細胞毒性薬がある。いくつかの例では、ミトコンドリアは、特定の細胞、例えば、腫瘍細胞に治療薬を送達することができる。治療薬は、例えば、いったん細胞内に入ると、細胞がもはや正常に機能することができない及び／又は生存することができないように細胞を阻害、破壊、停止、改変及び／又は変化させる細胞内阻害剤、不活性化剤、毒素、停止物質及び／又は細胞分裂抑制物質／細胞毒性物質であってよい。治療薬は、細胞の適切な機能を回復させるための作用薬、例えば、遺伝子療法のためのＤＮＡベクターであることができる。治療薬は、例えば、無機化合物若しくは有機化合物、小分子（５００ダルトン未満）若しくは大分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾したタンパク質、若しくは抗体などのタンパク質性分子、又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、若しくは三重らせん核酸分子などの核酸分子であることができる。いくつかの実施形態では、治療薬は、何らかの公知の生物（例えば、動物、植物、細菌、真菌、原生生物、又はウイルスに由来）又は合成分子のライブラリーに由来する天然産物であることができる。いくつかの実施形態では、治療薬は、モノマー化合物又はポリマー化合物であることができる。いくつかの例示的な治療薬としては、細胞毒性薬、ＤＮＡベクター、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、反応性ペプチド、ナノ粒子、ミクロスフェア、及び蛍光分子がある。
診断薬は、診断用途を有する作用薬である。ミトコンドリアは診断薬を細胞内に運搬するので、いくつかの実施形態では、診断薬は、細胞内の容態、例えば、細胞内でのｐＨ及び酸化ストレスを決定するように設計することができる。
造影剤は、撮像技術において使用するために採用される作用薬である。技術又は種類としては、Ｘ線、計算機断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、シンチグラフィー、蛍光、超音波などがあるが、これらに限定されない。造影剤は、蛍光性及び／又は放射性であることができる。いくつかの実施形態では、造影剤はまた、診断薬であることもできる。例示的な造影剤としては、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒフルオロホア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（登録商標）ＲＦＰ、ＢａｃＭａｍ２．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、ｐＨ感受性ｐＨｒｏｄｏ蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、１８Ｆ－ローダミン６Ｇ、１８Ｆ標識ローダミンＢ、磁性酸化鉄ナノ粒子、ならびに金系及び白金系のナノ粒子があるが、これらに限定されない。
先に考察したように、複合ミトコンドリア薬は、ミトコンドリアと、互いに直接的な及び／又は間接的な物理的接触にある作用薬とを含む。例えば、作用薬は、ミトコンドリアに連結されていることができるか、ミトコンドリアに結合していることができるか、ミトコンドリア膜内に包埋されていることができるか、又はミトコンドリア内に完全に若しくは部分的に封入されていることができる。いくつかの例では、医薬をミトコンドリアに共有結合させることができる。いくつかの例では、作用薬は、共有結合（例えば、カルボキサミド結合及びジスルフィド結合）を経て直接的に、又はリンカー（例えば、ペプチドリンカー）若しくは別の共有結合した作用薬を経て間接的にミトコンドリア膜の構成要素に連結される。他の例では、作用薬は、例えば、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、及び／又は静電相互作用などを経て、ミトコンドリアに非共有結合することができる。
いくつかの実施形態では、複合ミトコンドリア薬は、２つ以上の異なる種類の作用薬、例えば、２つの異なる種類の治療薬、３つの異なる種類の造影剤、１つの治療薬及び１つの造影剤、治療薬及び診断薬などを含むことができる。当業者は、何らかの変法が可能であることを認識するであろう。
ミトコンドリアと作用薬とを連結するための１つの特に有用なリンカーは、注射の際に作用薬の徐放を提供する。このことは、例えば、ヒドラゾン官能基を使用して達成することができる。例えば、ヒドラゾンは、ミトコンドリア膜上の構成要素に作用薬を共有結合させるように形成される。この複合ミトコンドリア薬がいったん細胞によって取り込まれると、ｐＨの変化がヒドラゾンの加水分解をもたらし、結合した作用薬を細胞内に放出する。
いくつかの実施形態では、治療薬、診断薬、及び／又は造影剤を、官能化表面化学的性質を用いてミトコンドリア外膜に連結することができる。いくつかの場合では、ヘテロ二官能性化学的性質は、治療薬、診断薬、及び／又は造影剤をミトコンドリア表面に連結することができ、ヘテロ二官能性化学的性質がいったん内在化すると、これらの作用薬は、細胞間エステラーゼとの（例えば、アセトキシメチルエステルとの相互作用を介した）相互作用を経て、又はＵＶ光活性化若しくは近赤外光活性化戦略を経て放出されることができる。ＵＶ光活性化戦略及び近赤外光活性化戦略は、例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，’’Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｉｅｌｄ ｏｆ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｌｉｇｈｔ－Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ，’’Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６．３（２０１６）：２１１１－２１２５、Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ，’’Ｐｈｏｔｏｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，’’Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７．１０（２０１４）：３０５２－３０６０、Ｂａｒｈｏｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，’’Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，’’Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２１９（２０１５）：３１－４２、及び米国特許出願公開第２０１８／００５７６１０号明細書において説明されている。それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
いくつかの例では、本明細書に説明する組成物が２種類以上の複合ミトコンドリア薬を含むことができることを当業者は認識するであろう。例えば、本質的に各ミトコンドリアが複数の種類の作用薬と会合しているミトコンドリアを含む組成物が含まれる。また、ミトコンドリアを含む組成物であって、各ミトコンドリアが１種類の作用薬とのみと対形成しているが、当該組成物がミトコンドリア／作用薬対形成の混合物を含む、組成物も含まれる。
複合ミトコンドリア薬を作製する方法
当業者は、何通りもの方法で、例えば、ミトコンドリアに付着させること、ミトコンドリア膜内に部分的に若しくは完全に包埋すること、ミトコンドリア内に閉じ込めること、又はミトコンドリア内に封入することによって、ミトコンドリアに作用薬を連結することができることを認識するであろう。
いかなる理論又はいかなる特定のアプローチにも拘束されることを意図しないが、ミトコンドリアの外膜は接着性であり、したがって様々な作用薬との組み合わせに特に適していると考えられる。いくつかの実施形態では、医薬は、単にインキュベーションによってミトコンドリアの外膜に付着させることができる。例えば、有効量の医薬を、単離されたミトコンドリアに好ましい温度、例えば、０℃～２６℃、０℃～４℃、又は約０℃、４℃、２６℃で、緩衝液、例えば、呼吸緩衝液中で、単離されたミトコンドリアと完全に混合することができる。この手順は、有効量の医薬（例えば、ナノ粒子、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター）をミトコンドリアに付着させるのに有用である。
いくつかの実施形態では、有機カチオン（例えば、ローダミン及びテトラメチルローザミン）は、ミトコンドリア膜上の電位のため、機能するミトコンドリアによって容易に封鎖される。健常なミトコンドリア膜は、膜電位と称される、オルガネラの内部と外部との間の電位差を維持する。この膜電位は、ミトコンドリアの機能的プロセスの直接的な結果であり、ミトコンドリアが適切に機能していない場合に失われる可能性がある。脂質可溶性カチオンは、それらの正電荷ならびに内膜脂質及びマトリックス水性空間の両方におけるそれらの可溶性の結果としてミトコンドリアによって封鎖される。同様に、いくつかの他の実施形態では、アニオンを、その負電荷のため、ミトコンドリアの外膜に付着させることができる。ミトコンドリアをこれらの医薬と連結するために、有効量の医薬は、単離されたミトコンドリアに好ましい温度、例えば、約０℃又は４℃で、緩衝液、例えば、呼吸緩衝液中で、単離されたミトコンドリアと完全に混合されるべきである。
治療薬、診断薬、及び／又は造影剤は、化学結合を経てミトコンドリア膜上のリン脂質、ペプチド、又はタンパク質に連結することができる。例えば、フルオロホア（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．））及び金属粒子（例えば、３０ｎｍの磁性酸化鉄ナノ粒子（Ｓｉｇｍａ））を含む分子は、スクシンイミジルエステル複合体を使用して、インタクトなミトコンドリアの外膜上に露出したタンパク質及びペプチド上の露出したアミン基に共有結合することができる。これらの反応性試薬は、タンパク質のアミン末端及びリジン残基のε－アミノ基を含む非プロトン化脂肪族アミン基と反応し、安定したカルボキサミド結合をつくる。別の例では、医薬、例えば、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド市、現Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ケンブリッジ市）を機能性ミトコンドリアと混合すると、それらは酸化され、次いでミトコンドリア上のタンパク質及びペプチド上のチオールと反応して複合体を形成する。
ミトコンドリアの表面に治療薬、診断薬、及び／又は造影剤を付着させるために利用可能な多数の反応性化学部分が存在する（例えば、カルボン酸、官能化アミンなど）。
作用薬は、タンパク質結合、アミン結合又は他の付着方法を介して、ミトコンドリア外膜又はミトコンドリア内膜のいずれかに付着させることができる。あるいは、又は加えて、作用薬は、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、及び／又は静電相互作用を経てミトコンドリア膜に付着させることができる。
多くの例では、治療薬、診断薬及び造影剤は、単離されたミトコンドリアと単に混合されることができ、緩衝液（例えば、呼吸緩衝液）中で十分な時間（例えば、数分、５分、１０分、又は１時間）、好ましい条件（例えば、０℃～２６℃、０℃～４℃、又は約０℃、４℃、２６℃、ｐＨ７．２～８．０）でインキュベートされることができる。
複合ミトコンドリア薬を調製する例示的な方法は、ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６，Ｈ９４－Ｈ１０５．ＰＭＣ２６３７７８４（２００９）、及びＭａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ｆｒｏｍ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４，Ｈ９６６－９８２．ＰＭＣ３６２５８９２（２０１３）、ならびに米国特許出願公開第２０１８００５７６１０号明細書において説明されている。上述の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
処置方法
本明細書に説明する方法には、様々な疾患（例えば、肺障害、呼吸障害）、虚血再灌流傷害、及び本明細書に説明する様々な他の疾患の処置のための方法が含まれる。一般に、本方法は、本明細書に説明するような単離されたミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を含む治療有効量の組成物を、このような処置を必要とするか、又は必要とすると判定された対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、当該組成物は、気道を経て投与される。
この文脈で使用される場合、「処置する」とは、障害の少なくとも１つの症状（例えば、呼吸困難、過呼吸、低い血中酸素レベル、肺不全、呼吸不全、心不全（例えば、右心不全））を改善することを意味する。いくつかの実施形態では、当該処置は、肺機能の改善（例えば、血中酸素レベルの上昇、抵抗の低減、エラスタンスの低減）をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に説明する方法は、肺線維症、肺感染症（例えば、コロナウイルスによる）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺塞栓、肺がん、肺高血圧、又はリンパ脈管筋腫症を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に説明する方法は、肺炎を処置するために使用することができる。
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書を通して相互交換可能に使用されており、本発明の方法による処置が提供される動物、ヒト又は非ヒトを説明する。獣医学的及び非獣医学的応用が本発明によって企図されている。
ヒト患者は、成人又は新生児などの小児であってよい。例えば、ヒト対象は、少なくとも又は約６０歳、例えば、少なくとも約６５歳、７０歳、７５歳、又は少なくとも若しくは約８０歳であってよい。ヒト対象は、１８歳未満又は約１８歳、例えば、１５歳、１０歳、９歳、８歳、７歳、６歳、５歳、４歳、３歳、２歳、又は１歳未満若しくは約１歳であってよい。
ヒトに加えて、対象には、非ヒト、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、及び霊長類が含まれることができるが、これらに限定されない。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ目、ブタ（例えば、子ブタ、ミニチュアブタ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ならびに他の家畜、農場動物、及び動物園動物が含まれる。
本明細書に説明する組成物の投与は、様々な手段、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜、直腸投与、鼻内投与、鼻腔内滴下、通気（例えば、鼻用スプレー）、吸入（鼻又は口腔を経た）、肺内投与、気管内投与、腹腔内注射、注入、又はこれらの何らかの組み合わせによって達成することができる。いくつかの実施形態では、当該組成物は、気道を経て投与される。
一態様では、単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬を肺又は心臓に送達して、気絶を低下させ、外科手技（例えば、肺手術又は心臓手術）からの臓器の離脱を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、当該方法は、気道を経て、単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬を投与することを包含する。
一態様では、単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬は、耳、眼、皮膚（例えば、しわを低減させるため）、又は頭部（例えば、脱毛症のため）に送達することができる。
本明細書に説明する組成物は、１回だけの処置、あるいはそれに代わるものとして複数回の処置、例えば、約１、２、５、８、１０、２０、３０、５０、若しくは６０日間、１年間間欠的に若しくは継続して、無期限、又はミトコンドリア若しくは複合ミトコンドリア薬の投与がもはや必要ではないと医療従事者が判断するまで、続行する処置経過として対象に投与することができる。
単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬は、５分ごとに又は１２～２４時間ごとに単回用量として又は複数回投与送達されて対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、単離されたミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、５～１０分ごとに（例えば、５分ごとに、１０分ごとに）対象に投与することができる。
いくつかの場合では、ミトコンドリアの効果は、単離時と使用時との間の時間の長さに依存することは特筆される。したがって、いくつかの例では、当該ミトコンドリアは、単離されたばかりでありかつ生存可能である。当該ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、当該ミトコンドリアを単離してから約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約１２０分以内に対象に投与することができる。いくつかの例では、当該ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、当該ミトコンドリア単離加工を開始してから約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約１２０分以内に対象に投与される。ミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬は、いくつかの場合では、使用前に短時間（例えば、約又は少なくとも１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分）保存することができる。
いくつかの場合では、凍結解凍したミトコンドリアは生存不可能であり、かつ本明細書に説明するある特定の処置、例えば虚血／再灌流傷害の処置に有効ではないことにも特筆される。したがって、いくつかの場合では、当該ミトコンドリアは、組織及び／又は細胞からの単離の後に凍結解凍されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に説明する組成物及び方法は、肺、耳、眼、皮膚、頭皮と関係する障害を処置するために使用することができる。例えば、本明細書に説明する組成物及び方法は、がん、皺（例えば、皮膚上の皺）又は脱毛症を処置するために使用することができる。いくつかの場合では、本明細書に説明する組成物及び方法は、様々な組織及び臓器（例えば、肺、耳、眼、皮膚）の機能を増強するためである。
気道を経た投与
肺上皮を裏打ちする粘液（厚さ１～１０μｍ）及び肺胞（厚さ０．１～０．２μｍ）を裏打ちする界面活性剤は、外来粒子の肺吸収に対する物理的障壁を構成する。さらに、膜結合型（上皮及び内皮）及び細胞内（マクロファージ、リンパ球、好中球及びマスト細胞）のプロテアーゼ及びペプチダーゼは、投与されたペプチド及びタンパク質を容易に分解する（Ａｇｕ ｅｔ ａｌ，’’Ｔｈｅ ｌｕｎｇ ａｓ ａ ｒｏｕｔｅ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．’’ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２．４（２００１）：１９８）。肺マクロファージはまた、短命ペルオキシダーゼ、炎症性及び免疫調節性メディエーター（顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン、ロイコトリエン及びプロテアーゼを含む）、ならびに他の分子を、宿主防御機構の一部として分泌又は放出することも示されている。
それにもかかわらず、本開示は、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を含む組成物を、気道を経て投与することが、肺の機能を有効に促進することができ、肺の抵抗を低減させることができ、肺のエラスタンスを低減させることができ、虚血面積を低減させることができ、ならびに／又は肺における浮腫及び細胞損傷を低減させることができることを示す。
本明細書に説明する組成物は、様々な手段、例えば、鼻内投与、鼻腔内滴下、通気（例えば、鼻用スプレー）、吸入（鼻又は口腔を経た）、肺内投与、気管内投与、又はこれらの何らかの組み合わせによって気道を経て投与することができる。本明細書で使用される場合、「鼻腔内滴下」という用語は、治療薬を鼻及び鼻の膜へと直接送達する手技であって、治療薬の一部は気管を通過し、肺へと送達されることができる手技を指す。
処置を必要とする肺の機能が制限される場合があるため、治療薬は時には、気道投与を経て肺の標的部位（例えば、細気管支又は肺胞）に有効に送達することができない。これらの場合では、気道をきれいにすることができる作用薬を最初に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、これらの作用薬は、気管支路の拡張、及び／又は筋肉の血管拡張を誘導することができる。このような作用薬としては、β２アドレナリン受容体作動薬、抗コリン作動薬、コルチコステロイドがあるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、喘息を処置するための作用薬を使用することができる。
気道を経て投与するのに適した医薬組成物は、例えば、液体溶液、水溶液（水溶性の場合）、又は分散液などを含むことができる。いくつかの実施形態では、これらの組成物は、１つ以上の界面活性剤を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「気道」という用語は、鼻、喉、咽頭、喉頭、気管、気管支、及び肺の何らかの部分を含む、鼻から肺胞までの空気路を指す。いくつかの実施形態では、当該組成物は、肺又は呼吸器系の何らかの部分に投与される。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、当該組成物をエアロゾル形態に変換することができる送達システム、例えば、ネブライザー、気化器、鼻用スプレー、噴霧器、ソフトミスト噴霧器、ジェット式ネブライザー、超音波ネブライザー、加圧定量噴霧器、呼吸起動型加圧定量噴霧器、又は振動メッシュ装置によって対象に投与することができる。本明細書で使用される場合、「噴霧器」という用語は、鼻又は口腔を経て吸入される（自然に又は機械的に肺に押し込まれてのいずれかで呼吸される）スプレー又は乾燥粉末の形態の組成物を投与するための装置を指す。いくつかの実施形態では、噴霧器には、例えば、受動的又は能動的な人工呼吸器（気管内チューブの有無にかかわらず機械的）、ネブライザー、乾燥粉末噴霧器、定量噴霧器、及び加圧定量噴霧器がある。ミトコンドリアがいったん細胞の近くに沈着又は局在すると、ミトコンドリアのサブセットが当該細胞によって取り込まれることができる。
いくつかの実施形態では、当該装置は、溶液及び懸濁液を、装置のマウスピースから直接吸入することができる小さなエアロゾル粒子（例えば、液滴）へと分解するために、空気（例えば、酸素、圧縮空気）又は超音波出力を使用することができる。いくつかの実施形態では、当該装置は、液体リザーバの頂部で振動し、それによって孔を経て非常に微細な液滴のミストを押し出すレーザドリル孔（例えば、１０００～７０００個の孔）を備えたメッシュ／膜を使用する。
当該送達システムはまた、単位用量送達システムも有することができる。１回の用量あたり送達される溶液又は懸濁液の体積は、約５～約２０００マイクロリットル、約１０～約１０００マイクロリットル、又は約５０～約５００マイクロリットルのいずれかであることができる。これらの様々な剤形についての送達システムは、単位用量又は複数回用量パッケージのいずれかの滴下ボトル、プラスチックスクイーズユニット、アトマイザー、ネブライザー又は医薬エアロゾルであることができる。
いくつかの実施形態では、当該装置は、定量噴霧器が取り付けられた小型の硬質ボトルである。当該定量は、規定の容積のチャンバ内へと組成物を引き込むことによって送達することができ、このチャンバは、チャンバ内の液体が圧縮されたときに噴霧を形成することによってエアロゾル化するような寸法の開口部とエアロゾル製剤とを有する。チャンバを圧縮して組成物を投与する。ある特定の装置では、チャンバはピストン装置である。このような装置は市販されている。
あるいは、絞り時にスプレーを形成することによってエアロゾル製剤をエアロゾル化するように寸法決めされた開き口又は開口部を有するスクイーズボトルを使用することができる。開口部は、通常、ボトルの頂部に見られ、エアロゾル製剤の効率的な投与のために、頂部は、一般に、鼻腔内に部分的に適合するように先細である。好ましくは、鼻用噴霧器は、測定された用量の治療薬の投与のために、定量のエアロゾル製剤を提供することができる。
いくつかの実施形態では、肺内への吸入のための液体製剤のエアロゾル化は、噴射剤を包含する。噴射剤は、当該技術分野で一般的に使用される何らかの噴射剤であってよい。このような有用な噴射剤の具体的な非限定例は、クロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、若しくは、トリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２－テトラフルオロエタンを含む炭化水素、又はこれらの組み合わせである。
本開示はまた、様々な肺疾患に罹患している対象を処置する上での使用のためのエアロゾル製剤及び剤形も提供する。一般に、このような剤形は、医薬として許容され得る希釈剤中に治療薬を含有する。このようなエアロゾル製剤中の医薬として許容され得る希釈剤には、無菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液などがあるが、それらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明又は医薬製剤において使用されることのできる希釈剤は、一般にｐＨ７．０～８．０の範囲（例えば、ｐＨ７．４）のリン酸緩衝生理食塩水若しくは緩衝生理食塩水、又は水である。
エアロゾル製剤はまた、場合により、医薬として許容され得る担体、希釈剤、可溶化剤又は乳化剤、界面活性剤及び賦形剤を含むこともできる。
製剤は、担体を含むことができる。担体は、循環系において可溶性であり、かつ生理学的に許容され得る高分子であり、生理学的に許容され得るとは、当業者が治療投与計画の一部として患者への当該担体の注射を受け入れることを意味する。担体は、好ましくは、クリアランスのための許容可能な血漿半減期を有する循環系において比較的安定である。このような高分子には、大豆レシチン、オレイン酸及びソルビタントリオレエート（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）があるが、これらに限定されない。
製剤はまた、ｐＨ維持、溶液安定化、又は浸透圧の調節に有用な他の作用薬も含むことができる。作用薬の例としては、塩化ナトリウム又は塩化カリウムなどの塩、及びグルコース、ガラクトース又はマンノースなどの炭水化物などがあるが、これらに限定されない。
本開示はさらに、本明細書に説明するような組成物及び別の治療上有効な作用薬を含むエアロゾル製剤を企図する。
いくつかの実施形態では、当該組成物を血管内に投与することができる。血液は、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を標的部位、例えば、臓器、組織、又は損傷部位に運ぶことができる。例えば、肺血管（例えば、肺静脈）は、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を肺に運ぶことができる。いくつかの場合では、本明細書に説明する組成物は、肺、耳、眼、及び皮膚の機能を改善するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、局所効果又は全身効果のために経口経路又は鼻呼吸経路によって投与される。医薬として許容され得る溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によって噴霧することができる。噴霧溶液は噴霧装置から直接吸入することができ、又は噴霧装置はフェイスマスク又は間欠的陽圧呼吸器に取り付けることができる。溶液、懸濁液、又は粉末の組成物は、適切な様式で製剤を送達する装置から経口的に又は経鼻的に投与することができる。吸入による投与については、当該組成物は、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器若しくはディスペンサー、又はネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達することができる。このような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号明細書、米国特許第６，６９５，２２７号明細書、米国特許第７，４３１，２２２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２２４６０８号明細書において説明されるものがあり、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、いくつかの実施形態では、エアロゾル組成物は、気道、肺、耳、眼、鼻腔、直腸、皮膚、及び頭部に投与することができる。いくつかの実施形態では、当該組成物は、肺、鼻腔、直腸、腸、皮膚、及び眼の部位のがん又は腫瘍を処置するために、これらの部位に送達される。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、定量スプレー、スクイーズボトル、加圧定量噴霧器、人工呼吸器、又はフェイスマスク及びテントを経て投与される。加圧定量噴霧器及び乾燥粉末噴霧器などのエアロゾル送達システムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＮｅｗｍａｎ，Ｓ．Ｐ，Ａｅｒｏｓｏｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｕｎｇ，Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．ａｎｄ Ｄａｖｉａ，Ｄ．ｅｄｉｔｏｒｓ，ｐｐ．１９７－２２において開示されている。対象はまた、人工呼吸器を経て当該組成物を吸入することもでき、当該人工呼吸器は、患者の快適性及び必要性に基づいた流量に設定されることになる。当該流量は、肺グラフィック（すなわち、呼吸数、１回換気量など）によって決定される。当該組成物は、フェイスマスク又はテントを使用して対象による吸入を可能にするように調製することもできる。ある特定の場合では、当該組成物は、例えば、病院環境にいない受け手の断続的な処置を可能にするために、携帯用装置（例えば、携帯用噴霧装置）内に包装され、定量で投与することができる。異なる濃度の組成物を当該容器内に包装することができる。
当該組成物を肺胞に有効に送達する簡便な方法は、十分に小さな粒子を製造する（例えば、５．０ミクロン（μｍ）未満の平均粒径を有する粒子、より好ましくは約０．２～約４．０μｍの平均粒径を有する粒子、及び最も好ましくは約０．２～約２μｍの平均粒径を有する粒子を製造する）ネブライザーを選択することである。実質的な肺胞沈着を達成するために小さな平均粒径を選択する代わりに、非常に多い薬用量の組成物を、より大きな平均粒径で投与することができる。このようなアプローチでは、特定の組成物が必要な薬用量で刺激し過ぎない場合、肺胞内沈着を可能にするために０．５～約５μｍの範囲の直径を有する全集団において十分な数の粒子が存在することが有益である。近位気道送達については、平均粒径はより大きくてよい。例えば、適切な平均粒径は、一般に、約１５μｍ未満、例えば、約４μｍ～約１５μｍ、例えば、約５μｍ～約１０μｍであってよい。当該組成物は、何らかの適切な方法によってエアロゾル化することができる。ヒト又は他の霊長類での使用のために、エアロゾルは、マウスピース、フェイスマスクなどを経てエアロゾルを送達する医療用ネブライザーシステムを使用して発生させることができ、当該医療用ネブライザーシステムから対象はエアロゾルを肺内に引き込むことができる。様々なネブライザーが当該技術分野で公知であり、本明細書に説明するような方法において使用することができる。例えば、米国特許第４，２６８，４６０号、米国特許第４，２５３，４６８号、米国特許第４，０４６，１４６号、米国特許第３，８２６，２５５号、米国特許第４，６４９，９１１号、米国特許第４，５１０，８２９号を参照されたく、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ネブライザーシステムの選択は、肺胞送達が所望であるか又は気道送達（すなわち、気管、一次気管支、二次気管支又は三次気管支など）が所望であるかに依存することになる。
肺胞送達に有用なネブライザーの例としては、Ａｃｏｍ１ネブライザー及びＲｅｓｐｉｒｇａｒｄ ＩＩ（商標）ネブライザーシステムがあり、いずれもＭａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，コロラド州イングルウッド市から市販されている。本発明と共に使用するための他の市販のネブライザーとしては、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州メリーランドハイツ地区）から入手可能なＵｌｔｒａＶｅｎｔ（商標）ネブライザー、Ｗｒｉｇｈｔネブライザー（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｌａｎｃｅｔ（１９５８）３：２４－２５）、及びＤｅＶｉｌｂｉｓｓネブライザー（Ｍｅｒｃｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｉｎｄ．ＨＹＲ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．（１９６８）２９：６６－７８、Ｔ．Ｔ．Ｍｅｒｃｅｒ，Ｃｈｅｓｔ（１９８１）８０：６（Ｓｕｐ）８１３－８１７）がある。気道送達に有用なネブライザーには、喘息の処置において典型的に使用されるネブライザーがある。このようなネブライザーもまた市販されている。当業者は、例えば、７段Ｍｅｒｃｅｒカスケードインパクタ（Ｉｎｔｒｏｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ニューメキシコ州アルバカーキ市）を用いて、それによって発生した平均粒径を測定することによって、特定のネブライザーの有用性を判定することができる。
対象に送達される組成物の総量は、エアロゾル化される総量、ネブライザーの種類、粒径、対象の呼吸パターン、肺疾患の重症度、及びエアロゾル化溶液中の濃度、ならびに吸入療法の長さを含むいくつかの要因に依存することになる。肺胞内で測定される組成物の量は、エアロゾル中に存在する組成物の量から予想されるであろう量よりも実質的に少ないことがあり、その理由は、組成物の大部分が対象によって呼気され得るか、又はネブライザー装置の内面に捕捉され得るからである。
当業者は、特にエアロゾルの粒径が最適化されている場合に、有効なプロトコルを容易に設計することができる。いくつかの場合では、より重症の容態を処置するとき、より高用量を投与することが有用である。必要な場合、達成された結果に応じて、処置を臨機応変に繰り返すことができる。処置を繰り返す場合、哺乳動物宿主は、処置に対する有害な免疫応答がないことを確実にするために監視されることができる。処置の頻度は、１用量あたり投与される組成物の量、ならびに対象の健康及び病歴などの多くの要因に依存する。本明細書で使用される場合、組成物の「噴霧された量」又は「エアロゾル化された量」は、実際に装置をエアロゾルとして離れる量、すなわち、装置内に入れられた量から、処置セッションの終了時にリザーバ内及び装置の内面上に保持された量を減らした量を意味する。
肺障害
本明細書に説明する治療薬は、様々な肺障害を処置するために使用することができる。対象は、当該処置から利益を得ることができる何らかの肺疾患、例えば、虚血、灌流傷害、形成不全肺、先天性横隔膜ヘルニア（ＣＤＨ）、ポーランド症候群、胸壁疾患（例えば、漏斗胸）、肺全摘除術、気管支肺形成異常、肺傷害、及び吸入傷害、喘息、嚢胞性線維症などを罹患していることができる。例えば、対象は、形成不全肺を有することができる。いくつかの実施形態では、単離されたミトコンドリアを含む有効量の組成物は、対象に、例えば、気道を経て投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に説明する方法は、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、呼吸不全、呼吸機能低下、及び／又は肺炎症を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に説明する方法は、肺線維症、肺感染症（例えば、ウイルス、コロナウイルス、かぜ、細菌、又は真菌による）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺塞栓、肺がん、肺高血圧、又はリンパ脈管筋腫症を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に説明する方法は、肺炎を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、対象は、不十分な、不完全な、又は遅い肺発達を有すると特定されることができる。あるいは又は加えて、対象は、肺にある損傷を有していることがある。例えば、対象は、常習喫煙者又は煤煙吸入に頻繁にさらされる労働者であることができる。
虚血関連傷害の処置
本明細書に説明する方法は、虚血性肺を処置するために使用することができる。例えば、有効量の単離されたミトコンドリアは、気道を経て投与することができる。当該ミトコンドリアは、肺内の細胞によって内在化することができる。
再灌流傷害とは、一定期間の虚血又は酸素欠乏の後に血液が組織に戻るときの血液供給による組織損傷である。虚血期間中に酸素及び栄養素がないことは、血流が回復すると炎症及び酸化的損傷をもたらす。炎症応答はさらに、当該組織における再灌流傷害につながる。それゆえ、いくつかの場合では、処置はまた、免疫抑制剤を患者に投与することも包含する。当該免疫抑制剤は、例えば、別個に投与することができるが、ミトコンドリア薬との同時処置として投与することができる。あるいは、又は加えて、当該免疫抑制剤は、処置に使用することができる複合ミトコンドリア薬を形成するために、ミトコンドリアに連結することができる。特に有用な免疫抑制剤は、ビスホスホナートである。
いくつかの実施形態では、当該対象は、急性肺損傷（ＡＬＩ）に罹患している。急性肺損傷はしばしば、急性呼吸不全及び難治性低酸素血症と関係している。いくつかの実施形態では、対象は、左心房高血圧の非存在下での肺水腫と一致する両側性肺浸潤物を有する。ＡＬＩは、多種多様な医学的容態及び外科的容態を複雑にし、肺傷害又は沈殿因子に対する肺応答を反映する。ＡＬＩについての最も一般的な理由は、虚血／再灌流傷害（ＩＲＩ）である。ＩＲＩは、体外ガス交換、心肺バイパス及び肺換気で生じることができ、肺機能及び細胞生存率に対して顕著な影響を有すること、ならびに小児患者及び成人患者のいずれにおいても罹病率及び死亡率の上昇に有意に寄与することが示されている。心臓手術を受けている成人患者におけるＡＬＩの発生率は、５３．８％～７３．５％の範囲であると推定されている。小児患者では、機械的換気を必要とする患者の８～１０％にＡＬＩが存在する。小児患者及び成人患者のいずれにおいても、ＡＬＩの予測死亡率は、２０～７５％である。現在、肺生存及び肺機能を上昇させることを目的として、ＩＲＩを経て発症するＡＬＩを処置するための実行可能な方法論はない。
本明細書に説明する方法は、ＡＬＩを処置するために使用することができる。例えば、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を含む有効量のエアロゾル化組成物を対象の気道に投与することができる。例えば、約又は少なくとも１×１０７個のミトコンドリアを肺に投与することができる。注入されたミトコンドリアは、内皮細胞によって内在化し、酸素消費の増強を提供することができ、肺の抵抗及びエラスタンスを低減させ、コンプライアンスを上昇させ、ならびに／又は虚血面積を低減させることができる。
血管拡張及び血流
本明細書に説明する方法は、平均血圧又は心拍数を変化させることなく血流を有意に増大させることができる。心拍数を増加させずに血流を増大させる能力は、狭心症型傷害及び虚血／再灌流関連傷害、ならびに血流及び酸素送達の増加が必要とされるであろう組織損傷領域において臨床上使用可能となる。したがって、本明細書に説明する方法は、血管内の血餅又は閉塞を除去するために動脈介入に使用することができる。
本明細書に説明する方法はまた、様々な臓器又は組織（例えば、心臓又は肺）の血流及び／又は酸素送達を上昇させ、臓器の血管拡張を誘発するために使用することもできる。いくつかの例では、単離されたミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、臓器（例えば、心臓又は肺）における血管抵抗を低下させるために使用することができる。単離されたミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、血流を上昇させるために使用することができる。単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬は、造影剤に添加することができ、臓器の閉塞の特定及び除去に使用することができる。
当該組成物の効果は、単離から使用時までの時間に依存することは特筆される。血管拡張作用は、単離からの時間が長くなるにつれて低下する。いかなる理論にも拘束されることを意図しないが、単離されたばかりのミトコンドリアは、血流を上昇させることができるある特定の化学物質を有すると仮定される。それゆえ、いくつかの方法では、当該ミトコンドリアは、単離されたばかりでありかつ生存可能である。例えば、当該ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、当該ミトコンドリア単離加工を開始した時点から又は当該ミトコンドリアが単離されてから約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約１２０分以内に対象に投与される。いくつかの場合では、当該ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、当該ミトコンドリア単離加工を開始した時点から又は当該ミトコンドリアが単離されてから約２０分～約６０分（例えば、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分）以内に対象に投与される。
いくつかの場合では、血流を上昇させることは望ましくない（例えば、肺における虚血／再灌流を処置すること、がんを処置すること）。これらの場合では、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、使用前に短時間（例えば、約３０～約６０分）保存することができる。この方法は、血流の上昇を引き起こすことなく組織生存率を高めること（例えば、虚血／再灌流傷害を処置すること）に使用することができる。これらの場合では、当該ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、当該ミトコンドリア単離加工を開始した時点から又は当該ミトコンドリアが単離されてから少なくとも６０約分（例えば、約６５分、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１１０分、約１２０分）で対象に投与される。
撮像
造影剤は、ミトコンドリアと造影剤との同時インキュベーションによって、ミトコンドリアに付着させることができることが多い。このような造影剤としては、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製のＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ及びｐＨｒｏｄｏフルオロホア、１８Ｆ－ローダミン６Ｇ、及び酸化鉄ナノ粒子があるが、これらに限定されない。
造影剤を含む複合ミトコンドリア薬は、気道を経て対象に投与することができる。標識したミトコンドリアを含有する組織は、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、マイクロコンピュータ断層撮影法（μＣＴ）、及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、明視野顕微鏡、及び３次元超解像顕微鏡法などの撮像技術を使用して検査することができる。当業者であれば、他の撮像技術又は撮像様式を使用することができることを認識するであろう。当該撮像技術又は撮像様式には、Ｘ線、シンチグラフィー、蛍光及び超音波があるが、これらに限定されない。
陽電子放出断層撮影法は、体内で３次元画像を生成する撮像技術であり、本明細書に説明する方法において使用することができる。当該システムは、陽電子放出放射性同位体（トレーサー）によって間接的に放出されるガンマ線の対を検出する。次いで、体内のトレーサー濃度の３次元画像を計算機解析によって構築する。有用なレポーター基としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１ＴＩ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈなどの放射性同位体がある。いくつかの方法では、ミトコンドリアは、放射性同位体、例えば、１８Ｆによって、又は放射性同位体を組み込んだ分子、例えば、１８Ｆ－ローダミン６Ｇ、１８Ｆ標識ローダミンＢによって標識することができる。ミトコンドリアが標的細胞によって内在化した後、ＰＥＴ撮像技術又は同様の技術は、標的細胞を観察するために採用することができる。
磁気共鳴画像法は、身体の解剖学的構造及び生理学的プロセスを撮像するための医療撮像技術であり、本明細書に説明する方法において使用することができる。いくつかの例では、磁気共鳴画像法は、いくつかの他の撮像技術、例えば、ＰＥＴと組み合わせて使用することができる。いずれの装置からも取得された画像は、同じ切片において連続して撮影することができ、単一の重ね合わせた（同時登録した）画像へと結合することができる。ＰＥＴ／ＭＲＩ走査は、例えば、研究、医療、及び農業の目的のため、ヒト及び動物の健康状態を診断するために使用することができる。
マイクロコンピュータ断層撮影法は、元の物体を破壊することなく仮想モデルを再創造するために使用することができ、本明細書に説明する方法において使用することができる物理的物体の断面を創造するためにＸ線を使用する。いくつかの例では、マイクロコンピュータ断層撮影法は、いくつかの他の撮像技術、例えば、ＰＥＴと組み合わせて使用することができる。いずれの装置からも取得された画像は、同じ切片において連続して撮影することができ、単一の重ね合わせた（同時登録した）画像へと結合することができる。したがって、体内の代謝活性又は生化学的活性の空間分布を示すＰＥＴによって得られた機能的撮像は、ＣＴ走査によって得られる解剖学的撮像とより正確に整列又は相関させることができる。２次元及び３次元画像再構成は、一般的なソフトウェア及び制御システムの関数としてレンダリングすることができる。
３次元構造化照明顕微鏡法、３次元ＳＩＭ、又は３次元超解像顕微鏡法は、細胞の内側の構造の完全な３次元可視化を可能にし、本明細書に説明する方法において使用することができる。構造化照明顕微鏡法は、空間的に構造化された照明光を使用することによって、従来の広視野蛍光顕微鏡法の空間分解能を２倍にすることができる撮像法である。構造化照明顕微鏡法は、観測可能領域の外側の周波数空間から情報を収集することによって空間分解能を増強する。
説明されている方法、すなわち、ミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬を投与することを含む方法は、がん（例えば、肺がん、脳がん、膵がん、黒色腫、前立腺がん、結腸がん）、心血管疾患（例えば、心筋梗塞、粥状硬化）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、糖尿病、過敏性腸症候群、セリアック病、クローン病）、及び炎症性疾患などの様々な疾患を診断するのに有用である。
撮像目的のために作用薬を使用する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ１８－ｌａｂｅｌｅｄ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ，ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｃｅｒ，Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ４０，１０４３－１０４８，ＰＭＣ３８２０３６４（２０１３）、Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ，１８Ｆ－ｌａｂｅｌｅｄ ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ，Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ４２，７９６－８０３，ＰＭＣ４５６７４１５（２０１５）、及びＰａｃａｋ ｅｔ ａｌ，Ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ，ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｌａｂｅｌ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９，ｅ１０８６９５，ＰＭＣ４１７７３９０（２０１４）において説明されている。上述の各々は、本明細書に説明する方法において有用であることができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
薬物送達
本明細書は、例えば、患者の細胞及び／又は組織に医薬を送達する方法を提供する。ミトコンドリアは、アクチン依存性内在化プロセスを経て組織細胞によって取り込まれ、それによって医薬を細胞内へ直接送達する方法を提供する。いくつかの例では、複合ミトコンドリア薬は、気道を経て肺組織又は血管へと入る。
抗体又は抗原結合断片をミトコンドリアに連結又は付着させることができる。抗体又は抗原結合断片をミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬に連結させることにより、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬が特定の部位を、例えば、細胞及び／又は組織を標的とするようにさせることができることを、当業者は認識するであろう。いくつかの例では、抗体又は抗原結合断片は、特定の細胞型、例えば、肺内平滑筋細胞、免疫細胞、マクロファージなどを標的とするように設計される。
いくつかの実施形態では、本開示は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、ベクター、ペプチド、又はタンパク質を標的部位（例えば、肺組織）に送達する方法を提供する。単離されたミトコンドリアは、核酸又はペプチドを細胞内へと送達するための担体として使用することができる。いくつかの例では、核酸ポリマーを含む複合ミトコンドリア薬は、疾患を引き起こす対象における突然変異した遺伝子を置換するか、突然変異した遺伝子を不活性化若しくは「ノックアウト」するか、又は新たな遺伝子を対象内へと導入するかのために投与することができる。例示的な核酸ポリマーとしては、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、又は三重らせん核酸分子があるが、これらに限定されない。ある特定の例では、核酸ポリマーは、ＤＮＡ、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡである。
心毒性の最小化
化学療法は、様々ながんのための一般的な処置であるが、いくつかの重篤な合併症も引き起こす。化学療法誘発性心毒性は、化学療法薬の臨床上の使用を制限する１つの合併症である。アントラサイクリンなどのある特定の化学療法薬は、急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病に対して非常に有効であるが、ミトコンドリアに対するその効果のために心臓に特に有害である。ミトコンドリアへの損傷はさらに、化学療法誘発性心毒性につながる。Ａｎｇｓｕｔａｒａｒｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ．Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ．２０１５；２０１５：７９５６０２．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１５／７９５６０２（２０１５）、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．４：３４６．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１４．００３４６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（２０１４）。
本開示は、化学療法誘発性心毒性を最小限にする方法を提供する。当該方法は、気道を経て、有効量の単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬を患者に投与することを包含する。患者が（例えば、医師又は獣医によって処方されたので）化学療法を用いて処置される必要がある場合、当該患者は、当該化学療法の投与前、投与中、及び／又は投与後に、ミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬で処置することができる。例えば、患者は、投与直後に開始して、単独処置として、あるいは約１、２、５、８、１０、２０、３０、５０、若しくは６０日間、１年間、無期限に又は医師がミトコンドリア及び／若しくは複合ミトコンドリア薬の投与がもはや必要ではないと判断するまで断続的に又は持続的に継続して、ミトコンドリア及び／あるいは複合ミトコンドリア薬で処置することができる。
臓器／組織移植
本開示はまた、臓器、組織、細胞塊及び／又は単離された細胞を移植する方法も特徴とする。当該方法は、臓器、組織、細胞塊及び／又は単離された細胞をミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬へ移植前に曝露するステップを含むことができる。このような曝露は、インサイツ及び／又はエクスビボ生じることができる。臓器、組織及び／又は単離された細胞は、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬（例えば、エアロゾル化組成物）を含む組成物に曝露することができる。
ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を含む組成物への臓器又は組織の曝露は、当該技術分野で公知の何らかの方法によってエクスビボで及び／又はインサイツで実施することができる。例えば、当該曝露は、臓器又は組織を完全に又は部分的に組成物中に浸漬するのに十分な容積を有する何らかのチャンバ又は空間においてエクスビボで実施することができる。別の例として、臓器を何らかの適切な容器内に入れ、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を含む組成物に臓器が組成物の持続流に曝露されるように臓器を「洗い流さ」せることによって、臓器は、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬を含む組成物に曝露することができる。
ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬の有効量とは、インビボ及び／又はインビトロで臓器又は細胞の生存を増強し及び／又は機能を改善するのに有効な量である。個々の細胞又は細胞塊、例えば、移植ドナー及び／又はレシピエントの移植との関連において、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬の有効量とは、細胞又は細胞塊の生存を増強するために、例えば、細胞若しくは細胞塊の喪失を低減させるのに、及び／又は移植した細胞若しくは細胞塊の機能的な挙動を改善するのに十分な、移植ドナー及び／又はレシピエントに投与される量である。臓器及び組織の移植、例えば、移植ドナー及び／又はレシピエントの関連において、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬の有効量とは、関心対象の臓器、組織又は細胞の生存を増強するのに、例えば、臓器若しくは組織を構成する細胞の喪失を低減させるのに、及び／また臓器の機能的な挙動を改善するのに十分な、移植ドナー及び／又はレシピエントに投与される量である。
いくつかの例では、気道を経た組成物の投与は、臓器がドナーから回収される前に実施される。いくつかの例では、気道を経た組成物の投与は、臓器がレシピエントへと移植された後に実施される。いくつかの例では、組成物（例えば、エアロゾル化組成物）の投与は、臓器の採取前、臓器の収集後、次いでレシピエント内への再移植後に実施される。いくつかの例では、組成物の投与は、移植手術（例えば、肺移植、心臓移植）中に実施される。
がんの処置
本明細書に説明する方法はまた、がん（例えば、肺がん）の処置も提供する。本明細書に説明するような組成物が気道を経て対象に投与された後、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は腫瘍細胞によって取り込まれることができる。いくつかの実施形態では、がん細胞を死滅させるために、細胞分裂抑制薬又は細胞毒性薬を腫瘍に送達することができる。いくつかの実施形態では、治療薬は、化学療法薬、例えばアントラサイクリンである。
本開示の方法及び組成物を使用して処置することができるがんとしては、例えば、口腔／咽頭がん、食道がん、喉頭がん、肺がん、又は気道における何らかのがんがある。
さらに、いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片をミトコンドリアに連結又は付着させることができる。抗体又は抗原結合断片をミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬に連結させることにより、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬が特定の部位を、例えば、細胞及び／又は組織を標的とするようにさせることができることを、当業者は認識するであろう。いくつかの例では、抗体又は抗原結合断片は、特定の細胞型、例えばがん細胞を標的とするように設計される。
薬用量
「有効量」とは、有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患又は疾患症状の発症を予防するのに必要な量である予防有効量と同じであっても異なっていてもよい。有効量は、１回以上の投与、適用又は薬用量で投与することができる。治療薬の治療有効量（すなわち、有効な薬用量）は、選択される治療薬による。当該組成物は、１日１回以上から隔日に１回を含む１週間に１回以上まで投与されるものであることができる。当業者は、疾患又は障害の重症度、従来の処置、対象の全身の健康状態及び／又は年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されないある特定の要因が、対象を有効に処置するのに必要とされる薬用量及びタイミングに影響を及ぼすことがあることを認識するであろう。その上、治療有効量の本明細書に説明する治療薬を用いた対象の処置は、単回処置又は一連の処置を含むことができる。
治療薬の薬用量、毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物又は実験動物において標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を呈する作用薬が好ましい。毒性のある副作用を呈する作用薬を使用することができるが、未感染細胞に対する潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を低減させるために、このような作用薬が罹患組織の部位を標的とする送達システムを設計するように注意を払うべきである。ヒト患者についての安全範囲をどのように推定するかは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．’’Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｙ：ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｓａｆｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｄｏｓｅ ｉｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．’’ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）（２００５）において説明されている。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための薬用量の範囲を定式化する上で使用することができる。このような作用薬の薬用量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。当該薬用量は、採用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動してよい。本発明の方法において使用される何らかの作用薬について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
当業者は、ミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬、例えば、患者に投与されるべきミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬を含む組成物の量が、例えば、とりわけ、処置される障害の種類、投与経路、処置期間、処置される領域のサイズ、及び／又は患者における処置部位の位置に応じて変化することを認識するであろう。当業者は、これら及び他の変数に応じて投与される薬用量を決定することができるであろう。例えば、合計約１×１０１０～１×１０１４個のミトコンドリアを、（例えば、肺内の局在虚血を処置するために）対象に投与することができる。小さな中心病変の場合では、１×１０３～１×１０６個のミトコンドリアを患者に投与することができる。それゆえ、ミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬（又はそれを含む組成物）の有効量は、所望の治療効果をもたらすのに十分なミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬の総量である。有効量は、例えば、少なくとも又は約１×１０２個のミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬、例えば、１×１０３～約１×１０１４個、約１×１０４～約１×１０１３個、約１×１０５～約１×１０１２個、約１×１０６～約１×１０１１個、約１×１０７～約１×１０１０個、約１×１０３～約１×１０７個、約１×１０４～約１×１０６個、約１×１０７～約１×１０１４個、又は約１×１０８～約１×１０１３個、約１×１０９～約１×１０１２個、約１×１０５～約１×１０８個、又は少なくとも若しくは約１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個、１×１０１３個、又は少なくとも若しくは約１×１０１４個又は例えば、１×１０１４個を超えるミトコンドリアであることができる。本明細書で使用される場合、患者への投与の文脈における「総量」という用語は、実施されている薬用量投与計画に応じて、単回投与又は複数回投与におけるミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬の総量を指すことができる。
医薬組成物
本開示は、単離されたミトコンドリアを含む組成物、複合ミトコンドリア薬を含む組成物、単離されたミトコンドリアと複合ミトコンドリア薬とのいずれも含む組成物、及びこのような組成物を使用する方法を提供する。
本明細書に説明する医薬組成物は、ミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬ならびに医薬として許容され得る担体を含むことができる。本明細書で使用される場合、「医薬として許容され得る担体」という言語は、医薬投与と適合性のある生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌薬及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。いくつかの実施形態では、医薬として許容され得る担体は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、クレブス緩衝液、タイロード溶液、造影剤、若しくはオムニパーク、又はこれらの混合物である。いくつかの実施形態では、医薬として許容され得る担体は、無菌ミトコンドリア緩衝液（３００ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｋ＋－ＨＥＰＥＳ（カリウム緩衝（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、ｐＨ７．２）、１ｍＭ Ｋ＋－ＥＧＴＡ、（カリウム緩衝エチレングリコール四酢酸、ｐＨ８．０））である。いくつかの実施形態では、医薬として許容され得る担体は、呼吸緩衝液（２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｋ－ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、及び０．５ｍＭ Ｋ－ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０））である。
医薬組成物は、典型的には、その意図された投与経路と適合するように製剤される。
医薬組成物は、種々の臨床用途、例えば、撮像、創傷の処置、傷害の処置、臓器の保存、臓器又は組織におけるミトコンドリア機能の改善、及びスキンケアのために製剤されることができる。いくつかの場合では、医薬として許容され得る担体は、撮像目的のための造影剤である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、防腐薬、抗菌薬（例えば、抗生物質）、抗真菌薬、消毒薬、鎮痛薬、麻酔薬、ステロイド、栄養補助食品、エーテル油などを含むことができる。麻酔薬は、手術中又は処置中の疼痛を予防することができる薬物である。例示的な鎮痛薬としては、パラセタモール、非ステロイド系抗炎症薬、サリチラート、イブプロフェン及びリドカインがあるが、これらに限定されない。例示的な抗菌薬としては、ジクロロベンジルアルコール、アミルメタクレゾール及び抗生物質があるが、これらに限定されない。例示的な抗生物質としては、ペニシリンカルバペネム、セファロスポリン、アミノグリコシド、バシトラシン、グラミシジン、ムピロシン、クロラムフェニコール、チアンフェニコール、リンコマイシン、クリンダマイシン、マクロライド、ノボビオシン、ポリミキシン、リファマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、バンコマイシン、テイコプラニン、ストレプトグラミン、葉酸拮抗薬、スルホンアミド、トリメトプリム、ピリメタミン、ニトロフラン、メテナミンマンデル酸、メテナミン馬尿酸、ニトロイミダゾール、キノロン、フルオロキノロン、イソニアジド、エタンブトール、ピラジンアミド、パラ－アミノサリチル酸、サイクロセリン、カプレオマイシン、エチオナミド、プロチオナミド、チアセタゾン及びビオマイシンがある。防腐薬は、感染、敗血症、又は腐敗の可能性を低減させるために生体組織／皮膚に適用することができる抗菌物質である。例示的な防腐薬としては、クロルヘキシジン及びその塩、ベンザルコニウム及びその塩、トリクロサン及び塩化セチルピリジウムがあるが、これらに限定されない。例示的な抗真菌薬としては、トルナフタート、ミコナゾール、フルコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、テルビナフィン、アムホテリシン、ナイスタチン及びナタマイシンがあるが、これらに限定されない。例示的なステロイドとしては、プレドニゾンアセタート、プレドニゾンバレラート、プレドニゾロン、アルクロメタゾンジプロピオナート、フルオシノロンアセトニド、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、デソニド、ピバレート（ｐｉｖｏｌａｔｅ）、ピバル酸クロコルトロン（ｃｌｏｃｏｒｔｏｌｏｎｅ ｐｉｖｏｌａｔｅ）、トリアムシノロンアセトニド、プレジカルバート、プロピオン酸フルチカゾン、フルランドレノリド、モメタゾンフロアート、デソキシメタゾン、ベタメタゾン、ベタメタゾンジプロピオナート、ベタメタゾン吉草酸エステル、ベタメタソンプロピオナート、ベタメタゾンベンゾアート、酢酸ジフロラゾン、フルオシノニド、ハルシノニド、アムシノニド、ハロベタソールプロピオナート、及びプロピオン酸クロベタゾールがあるが、これらに限定されない。例示的な栄養補助食品としては、ビタミン、ミネラル、草本製品及びアミノ酸があるが、これらに限定されない。ビタミンとしては、ビタミンＡ、ビタミンＢ群のもの、ビタミンＣ、ビタミンＤ群のもの、ビタミンＥ及びビタミンＫがあるが、これらに限定されない。エーテル油としては、ミント、セージ、モミ、ラベンダー、バジル、レモン、ビャクシン、ローズマリー、ユーカリ、マリーゴールド、カモミール、オレンジなどに由来するものがあるが、これらに限定されない。これらの作用薬の多くは、例えば、その全体が参照により組み込まれる国際公開第２００８１５２６２６号に説明されている。
ミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬を含む組成物は、何らかの形態、例えば液体、半固体、又は固体で製剤されることができる。例示的な組成物としては、とりわけ、液体、クリーム、軟膏、膏薬、油、エマルション、リポソーム製剤がある。
単離されたミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、臓器、組織、又は細胞移植での使用のために設計された組成物中に含めることができる。当該組成物は、単離されたミトコンドリア及び／又は複合ミトコンドリア薬と、インサイツ又はエクスビボでの患者及び／又は臓器への投与に、例えば、エクスビボでの臓器、組織又は細胞の維持に適している液体とを含むことができる。一般に、当該液体は、水溶液である。溶液の例としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｃｅｉｓｉｏｒ（商標）溶液、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（商標）溶液、Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液、クエン酸溶液、組織培養培地（例えば、Ｄｕｌｖｅｃｃｏ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ））、ヒスチジン－トリプトファン－ケトグルタラート（ＨＴＫ）溶液、及びウィスコンシン大学（ＵＷ）溶液（Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｍｏｒｒｉｓ ａｎｄ Ｍａｌｔ，Ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）がある。
ウィスコンシン大学冷蔵保存液は、臓器移植のための標準的な溶液と考えられている。当該液は、以下を含む。すなわち、１００ｍＭラクトビオン酸カリウム、２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、３０ｍＭラフィノース、５ｍＭアデノシン、３ｍＭグルタチオン、１ｍＭアロプリノール、及び５０ｇ／Ｌヒドロキシエチルデンプンである。単離されたミトコンドリア又は複合ミトコンドリア薬は、臓器、組織及び細胞の保存のためにこれらの液体に添加することができる。
気道（例えば、鼻、気管切開、又は気管内チューブ（ＥＴＴ））などのある特定の経路を経て投与されるとき、界面活性剤は、当該組成物が遠位気道に到達することを可能にすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に説明する組成物（例えば、液体溶液、水溶液（水溶性の場合）、エアロゾル製剤、分散液、無菌粉末など）は、１つ以上の界面活性剤を含むことができる。
界面活性剤は、非イオン性、カチオン性、アニオン性、及び双性イオン性の界面活性剤からなる群から選択することができる。界面活性剤の混合物もまた使用することができる。例示的な種類の界面活性剤としては、アルコールエーテルスルファート、アルコールスルファート、アルカノールアミド、アルキルスルホナート、アミンオキシド、両性界面活性剤、アニオン界面活性剤、ベタイン誘導体、カチオン界面活性剤、ジスルホナート、ドデシルベンゼン、スルホン酸、エトキシ化アルコール、エトキシ化アルキルフェノール、エトキシ化脂肪酸、グリセロールエステルヒドロトロープ、ラウリルスルファート、モノグリセリド及びジグリセリド、非イオン性界面活性剤、リン酸エステル、第四級界面活性剤、ならびにソルビタン誘導体がある。
気道を経た送達に適しているように、いくつかの他の適切な医薬担体も使用することができる。これらの担体としては、例えば、リポソーム、ナノ粒子及びミクロ粒子、シクロデキストリン、マイクロエマルション、ミセル、懸濁液、又は溶液がある。いくつかの実施形態では、これらの担体は、脂質（例えば、リポソーム、ニオソーム、マイクロエマルション、脂質ミセル、固体脂質ナノ粒子）で作製されるか、又はポリマー（例えば、ポリマーミセル、デンドリマー、ポリマーナノ粒子、ナノゲル（ｎｏｎｏｇｅｌ）、ナノカプセル）で構成される。これらの担体は、制御された様式で治療薬を肺に運ぶことができる。ナノキャリアもまた使用することができる。標的臓器の局所療法は、一般に、臨床上有効な結果を達成するために、より少ない総用量を必要とする。この目標を達成するために、ナノキャリアは、緩徐に分解し、刺激に反応し、部位特異的となるように操作されることができる。
本明細書に説明する医薬組成物は、投与のための取扱説明書を添付して、容器、パック、又はディスペンサーの中に含めることができる。本明細書に説明する医薬組成物はまた、エアロゾル化形態に（例えば、適切なネブライザーによって）変換されるのに適している形態で調製することもできる。
本発明は、以下の例においてさらに説明されるが、それらの例は、特許請求の範囲において説明される本発明の範囲を制限するものではない。
例１：対象由来の自家骨格筋からのミトコンドリアの単離
ミトコンドリアを自家骨格筋組織から単離した。組織の供給源は、手術の執刀地点及びその近辺に依存していた。非常に有効なミトコンドリア移植は、典型的には単離されたばかりの、生存可能な、かつ機能的なミトコンドリアを必要とする。生存不可能なミトコンドリア（例えば、予め凍結されたミトコンドリア）、ミトコンドリア画分（タンパク質、複合体Ｉ～Ｖ）、ミトコンドリアＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに外因性ＡＴＰ又はＡＤＰは、通常、十分な機能性を有さない。
方法
生存可能な呼吸応答能のあるミトコンドリアの単離を可能にするために、２０～３０分で実施することができるミトコンドリアの単離及び精製のための迅速な方法を開発した（図１）。この方法の主な利点は、（１）６番目の生検パンチを使用して単離することができる少量の組織（＜０．０１ｇ組織）しか必要とせず、（２）手動均質化法を用いて容易に達成されない組織の均一かつ一貫した均質化を可能にする標準化された組織解離プロセスを使用しており、かつ（３）遠心分離よりもむしろ、微分濾過の使用により、時間のかかる繰返しの遠心分離工程がなくなり、調製時間が短縮される、ことである。簡単に述べると、６番目の生検パンチを使用して２つの骨格筋組織小片（＜０．１グラム）を得た。組織を５ｍＬ量の単離緩衝液（３００ｍｍｏｌ／Ｌスクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ－ＫＯＨ、ｐＨ７．４）中で均質化し、次いで、氷上でスブチリシンＡ酵素と共に１０分間インキュベートした。次いで、消化した組織を単離緩衝液で予め濡らしておいた一連のフィルタで濾過し、続いてミトコンドリアを９×Ｇで４℃で５分間の遠心分離によって沈殿させた。
結果
図２Ａ～図２Ｇは、骨格筋からのミトコンドリアの単離についての代表的な結果を示す。図２Ａは、生検パンチを使用して得られた骨格筋組織を示す。図２Ｂは、位相差照明下での（明視野、ＢＦ）（左パネル）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓで標識した蛍光下での（中央パネル）単離されたミトコンドリアの代表的な顕微鏡画像を示す。マージ画像は右側のパネルに示されている。この方法によって得られたミトコンドリアは、９９％を超える生存率を有する。図２Ｃは、組織湿重量１グラムあたりのミトコンドリア収量についての結果を示す。図２Ｄは、単離されたミトコンドリアの代表的な透過型電子顕微鏡画像を示す。単離されたミトコンドリアは電子密度が高く、ミトコンドリアの０．０１％未満が破壊又は損傷していた（＊）。図２Ｅは、ミトコンドリア複合体Ｉ～Ｖについての代表的な活性結果を示す。図２Ｆは、状態３（活性）酸素消費量（ＡＤＰ刺激呼吸）についての代表的な結果を示す。図２Ｇは、エネルギーを与えられた自家の大胸筋ミトコンドリアにおけるリンゴ酸塩誘発性（複合体Ｉ）及びコハク酸塩誘発性（複合体ＩＩ）の酸素消費についての呼吸制御指数（ＲＣＩ、状態３／状態４）についての代表的な結果を示す。本データは、単離されたミトコンドリアが膜電位及び生存率を維持していることを示した。加えて、本データは、リンゴ酸塩誘発性複合体Ｉ及びコハク酸塩誘発性複合体ＩＩについての酸素消費量及び呼吸制御指数が、いくつかの他の方法によって単離されたミトコンドリアのそれと等しいことを示した。
例２：単離されたミトコンドリアは、心筋への注射後少なくとも２８日間存在し、生存可能であった
例１に説明するような方法によっていったん単離した後、ミトコンドリアをミトコンドリア移植のために直ちに使用した。
ミトコンドリア投与量
自家ミトコンドリアの至適用量を決定するために実験を行った。これらの実験は、組織湿重量１グラムあたり２×１０５個のミトコンドリアが最適な有効性を提供することを実証した。
単離したミトコンドリアの送達
単離したミトコンドリアを、血管注入による肺の虚血領域への直接注射、又はネブライザーのいずれかによって送達した。
（ａ）．ミトコンドリアの直接注射は、ミトコンドリアの局所的な分布を提供する。２８ゲージ針付きツベルクリン注射器を用いて、ミトコンドリアを肺動脈又は右心房へと注射した。
（ｂ）．ミトコンドリアの血管内送達は、組織へのミトコンドリア送達を単純化し、組織内での自家ミトコンドリアの広範な分布を可能にする。
（ｃ）．ミトコンドリアのネブライザー送達。適用性を高め、早期の非外科的介入及び術後介入を可能にするために、自家ミトコンドリアをネブライザーによって肺に送達した。
血管送達は局所送達を提供する。右心房及び肺動脈を経た血管内送達による自家ミトコンドリアの送達の安全性及び有効性を実証するために予備実験を行った。予備実験の結果は、これらの経路のいずれかを経て送達される自家ミトコンドリアの移植が、ミトコンドリアの組織特異的送達及び取り込みを提供し、安全かつ有効であり、２時間の虚血及び２４時間の回復後に肺機能を有意に増強することを実証した。
結果
蛍光顕微鏡法及びＭＲＩは、移植されたミトコンドリアは、心筋への注射後少なくとも２８日間存在し、生存可能であることを実証した。ミトコンドリアの大部分は最初、細胞間の間隙内に認められた。送達後３０分以内に、移植されたミトコンドリアは、エンドサイトーシスによって細胞内に内在化され、サルコメアのＺ線間の筋鞘の近くに、ならびに内因性の損傷したミトコンドリアの周りの及び核の近くのクラスター内に存在する心筋細胞内で見られた。注入されたミトコンドリアの列挙は、注入されたミトコンドリアの４３．５２％±４．４６（平均±ＳＥＭ）が心筋細胞に付着しているか又は心筋細胞内に認められることを示した。三次元超解像顕微鏡法及び透過型電子顕微鏡法を使用して、ヒトｉＰＳ由来心筋細胞及び初代心臓線維芽細胞におけるエンドサイトーシスされた外因性ミトコンドリアの細胞内運命を決定した。本結果は、単離されたミトコンドリアが数分以内に心臓細胞に組み込まれ、次いでエンドサイトーシスによって細胞内へと輸送され、そこで内因性ミトコンドリアネットワークと融合したことを示した。
図３Ａ～図３Ｄは、心筋細胞内の細胞外ミトコンドリアの取り込み及びエンドサイトーシス輸送の代表的な結果を示す。図３Ａは、金標識ＨＣＦミトコンドリアに２．５、５、及び１０分間曝露し、ＴＥＭによって撮像したｉＰＳ－ＣＭの代表的な画像を示す。標識されたミトコンドリアは、電子密度の高い沈着物を有しており、細胞の外側で、頂端細胞表面に隣接して、エンドサイトーシスを受けて、及び細胞の内側で（左から右で、矢印によって示す）、３回の試験時すべてにおいて明らかであった。画像は、５分での４つの実験の代表とし、スケールバーは０．５μｍであった。図３Ｂは、４時間での初期エンドソームとの外因性ミトコンドリアの共局在化の４色３次元ＳＲ－ＳＩＭからの代表的な画像を示す。核をＤＡＰＩで染色し、内因性ミトコンドリアと外因性ミトコンドリアのいずれもをＭＴＣ０２抗体で検出した。マージ画像（左）及び各色（右）を示しており、スケールバーは１０μｍであった。図３Ｃは、１時間でのＨＣＦミトコンドリア及び後期エンドソームの代表的な重ね合わせ顕微鏡画像を示しており、スケールバーは、１０μｍであった。図３Ｄは、４時間でのミトコンドリアとリソソームとの代表的な重ね合わせ顕微鏡画像を示しており、スケールバーは、１０μｍであった。図３Ｃ及び図３Ｄでは、矢印は、抗ミトコンドリアＭＴＣ０２抗体とも反応した各区画と関係する外因性ミトコンドリアの例を示す。核をＤＡＰＩで染色し、画像は各時点（０．５、１、２、及び４時間）で分析された１２個の別個の体積を表しており、スケールバーは、０．５μｍであった。
連続１２リード心電図分析及び光学マッピングによって証明されるように、移植したミトコンドリアは催不整脈性ではなかった。心室頻拍、徐脈、細動、又は伝導系の欠陥又は再分極の不均一性はなかったので、ミトコンドリア移植と関係する連続ＥＣＧ、ＱＲＳ持続時間又は補正ＱＴ間隔に変化はない。自家ミトコンドリアの注入時、又は移植後４週間までのいずれかの時点のいずれにおいても、心室壁運動障害、左心室肥大、弁機能不全、線維症、又は心膜液貯留に変化はなかった。加えて、移植されたミトコンドリアは、免疫応答又は炎症応答を生じなかった。自己免疫応答を、間接免疫蛍光を使用して抗ミトコンドリア抗体によって測定したところ、検出不能であった。
移植されたミトコンドリアは、細胞外及び細胞内のいずれにおいても作用することができる。いったん移植されると、ミトコンドリアは、現在まで行われた試験時間の限界である少なくとも２８日間、生存性及び機能を維持する。移植されたミトコンドリアはまた、心筋のＡＴＰレベル及びＡＴＰ合成を直ちに上昇させることもでき、心筋プロテオームを迅速に変化させることもできる。注入の１０分後のプロテオーム分析は、心室機能の改善が心外膜心エコー法によって最初に観察されると、ミトコンドリアについてのタンパク質経路ならびにエネルギー及び細胞呼吸の前駆体代謝産物の生成が、対照心臓と比較して処置心臓において有意に高いことを示した（Ｐ＜０．０５、濃縮スコア＞２．０）。移植後１０～６０分で、移植されたミトコンドリアは、アクチン依存性エンドサイトーシスによって心筋細胞内へと内在化した。二核心筋細胞内へと内在化したミトコンドリアの数は、１時間後に核１個あたり４０．９±１１個、２４時間後に２１８．７±６３．７個であった。いったん内在化すると、移植されたミトコンドリアは、細胞ＡＴＰ含量をさらに増加させ（ｐ＜０．０５）、心臓保護サイトカイン（上皮成長因子、成長関連がん遺伝子、ＩＬ－６及び単球走化性タンパク質３）を上方調節する。これらのサイトカインは、細胞成長、増殖、及び遊走を刺激し、血管新生を増強し、心筋細胞アポトーシスに対する保護を提供し、心筋細胞再生とは無関係に機能的心臓回復及び心臓リモデリングを改善することによって心機能の増強と関係している。虚血はまた、ミトコンドリアＤＮＡを損傷し、ＡＴＰ合成を低減させることもするが、こうした変化はヒトにおける心臓手術後の不十分な回復と関係していた。本例は、ミトコンドリア移植が、損傷ミトコンドリアＤＮＡを無傷ミトコンドリアＤＮＡと少なくとも部分的に置き換え、心筋細胞機能を救済したことを実証した。
例３：動物及びヒトにおける予備試験
ミトコンドリア移植の有効性を、一連のインビトロ及びインビボ動物心臓灌流モデルにおいて検証した。これらの試験からの結果は、ミトコンドリア移植が心筋細胞生存率を救済し、虚血再灌流傷害後の虚血後心筋機能を有意に増強することを実証した。
単離された灌流した心臓及びインサイツ局所虚血心臓モデルにおける虚血／再灌流プロトコルを使用して、自家ミトコンドリア移植が安全かつ有効であることが実証された。本試験は、ミトコンドリアの直接的送達及び血管送達のいずれもが虚血／再灌流傷害を有意に改善し、心筋細胞生存率及び心筋の虚血後機能回復を増強することを実証した。これらの効果は、インサイツ生存実験の終点である少なくとも２８日間明らかであった。
有意なＩＲＩを有する小児患者は、体外膜型人工肺（ＥＣＭＯ）による機械的支援を必要とする。ＥＣＭＯの使用は、救命技術であることが示されているが、出血、全身性炎症応答及び感染症、との合併症につながる可能性があり、したがって限られた期間でしか使用することができない。心筋回復がＥＣＭＯ支援期間内に達成されていない場合、患者は最終的にＥＣＭＯの合併症に屈し、このことは患者が挿管されている間及び挿管された後のいずれにおいてもＩＲＩを引き起こす可能性がある。試験は、７２時間以内にＥＣＭＯ支援から離脱できない患者が重大な予後指標であり、全生存率が３０％未満であることを示している。ヒトパイロット試験を実施し、自家ミトコンドリアの直接注射が、５人の小児患者において心室機能を有意に改善して、ＥＣＭＯからの挿管離脱を可能にしたことを実証した。患者のいずれもがいかなる有害作用も経験せず、不整脈、心筋内血腫又は炎症応答の合併症はなかった。このパイロット試験は、ＩＲＩ患者の心機能を改善するための自家ミトコンドリア移植の新規技術の最初の臨床応用であった。
例４：エアロゾル形態の外因性ミトコンドリアを気道に投与すると、気道を裏打ちする細胞への局在化（及び当該細胞内での内在化）が生じる
エアロゾル形態として調製され、気道に投与された外因性ミトコンドリアが、気道を裏打ちする細胞への局在化（及び内在化）をもたらすかどうかを評価するために、標識したミトコンドリアを含むエアロゾルを調製し、ネブライザーシステムを使用して投与し、肺組織内の生体分布を評価した。
方法
動物モデル
肺虚血／再灌流傷害のマウスモデルを実験のために選択した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、十分に特徴付けられており、結果の比較を可能にするＡＬＩにおける使用のための確立されたモデルである。
生体内分布
肺内の外因性ミトコンドリアの生体内分布の可視化を、可視化及び分布解析を強化するためにマウスよりもむしろラットにおいて行った。マウスモデルは、生体内分布を検出するのに十分な面積を用意しない。簡単に述べると、ウィスター系ラット（２００ｇ）をペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔し、０．５％イソフルラン吸入で維持した。２０ゲージのプラスチックカテーテルを使用した経口気管内挿管法を実施し、ラットを１回換気量１０ｍＬ／ｋｇ及び呼吸数１３０～１４０回／分で機械的に換気した。左開胸術を第３肋間腔において実施し、肺動脈を露出させた。外因性ミトコンドリアの生体内分布を、１８Ｆローダミン６－Ｇでヒト心臓線維芽細胞ミトコンドリアを標識することによって決定した。ラット、マウス又はブタのモデルにおけるヒトミトコンドリアの使用は、モノクローナル抗ヒトミトコンドリア抗体に対する免疫反応性に基づいて、天然ミトコンドリアと移植ミトコンドリアとの区別を可能にする。
血管送達
１８Ｆローダミン６－Ｇ標識ヒト心筋線維芽細胞ミトコンドリアを、４０ゲージ針を備えたツベルクリン注射器を使用して、左肺動脈への注射を介して、呼吸緩衝液（２５０ｍｍｏｌ／Ｌ スクロース、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ＋－ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ＋－ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０）中の０．３ｍＬのボーラスとして送達した。
ネブライザー送達
９０μＬの呼吸緩衝液中の１８Ｆローダミン６－Ｇ標識ヒト心筋線維芽細胞ミトコンドリアを、Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔネブライザーを使用して全肺に４０秒間送達した（１０秒間の噴霧とそれに続く１分間の定期的な機械的換気、４回繰返し）。
ミトコンドリア濃度の測定
ミトコンドリアを３０分間循環させておき、送達後、洗い出しを可能にし、次いで、ラットを二酸化炭素過剰投与によって安楽死させた。ミトコンドリア生体内分布を、Ａｌｂｉｒａ ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＣＴ Ｐｒｅｃｌｉｌｎｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｒｕｋｅｒ，マサチューセッツ州ビレリカ町）を使用した陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）及びマイクロコンピュータ断層撮影法（μＣＴ）によって決定した。
送達されたミトコンドリアの細胞取り込みを定量する
肺組織内の外因性ミトコンドリアの存在を確認し、肺細胞取り込みを特定するために、肺切片を左右の肺から得て、パラフィンで固定し、免疫組織化学的分析に供した。
結果
図４Ａ～図４Ｃは、ラットモデルにおいて肺動脈を経た血管注入によって肺に送達され、Ａｌｖｉｒａ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｒｕｋｅｒ，マサチューセッツ州ビレリカ町）を使用した陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及びマイクロコンピュータ断層撮影法（μＣＴ）を使用して撮像した１８Ｆローダミン６－Ｇミトコンドリア（６×１０７個）の結果を示す。これらの結果は、ミトコンドリアを肺に送達すると、移植されたミトコンドリアが肺全体に特異的に分布することを示す。
図５Ａ～図５Ｂは、ネブライザーによって肺動脈を経て送達されたマウス肺組織内の外因性ミトコンドリアの免疫組織化学的検出及び細胞取り込みの結果を示す。ヒト心臓線維芽細胞ミトコンドリアを、抗ヒトミトコンドリア抗体（ＭＴＣ０２［ビオチン］－Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ市、カタログ番号ａｂ７９４７９）及びＶｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム市）及びＡＥＣ＋基質色原体（Ｄａｋｏ，Ａｇｉｌｅｎｔ，カリフォルニア州サンタクララ市）を使用して検出した。ラット、マウス又はブタのモデルにおけるヒトミトコンドリアの使用は、モノクローナル抗ヒトミトコンドリア抗体に対する免疫反応性に基づいて、天然ミトコンドリアと移植ミトコンドリアとの区別を可能にする。図面では、ミトコンドリアは黒色の点として示されている。ミトコンドリアを、肺内皮細胞、肺細胞、実質、及び肺胞の内部及び周辺で検出した。
例５：エアロゾル形態として調製され、気道に投与される外因性ミトコンドリアは、急性肺虚血（ＡＬＩ）の症状を改善することができる
エアロゾル形態として調製され、マウスの気道に投与された外因性ミトコンドリアが、マウス急性肺虚血（ＡＬＩ）モデルにおいてＡＬＩの症状を改善するのに十分であるかどうかを評価するために、標識したミトコンドリアを含むエアロゾルを調製し、ネブライザーシステムを使用して投与し、アッセイを実施して肺の機能及び完全性を評価した。
方法
動物モデル
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８～１０週齢）Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，メイン州バーハーバー町）を使用した。すべての実験は、Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの施設内動物管理使用委員会によって承認され、動物の管理及び使用に関する米国国立衛生研究所の指針に準拠した。
ミトコンドリア単離
ミトコンドリアを、同系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得られた骨格筋から単離した。同系ミトコンドリアの単回注射又は連続注射に対する直接的又は間接的、急性又は慢性の同種反応性、同種認識又は損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）反応はない。簡単に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の骨格筋を摘出し、同系ミトコンドリアを単離するために直ちに使用した。ミトコンドリアを単離し、単離したミトコンドリアの数及び生存率を決定した。単離したミトコンドリアを０．３ｍＬの呼吸緩衝液中に懸濁し、直ちにミトコンドリア移植に使用した。
マウス肺ＡＬＩモデル：
虚血／再灌流傷害を誘発するために、手術を行い、左肺門を２時間閉塞した。簡単に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔し、手術中、０．５％イソフルラン吸入で維持した。２０ゲージのプラスチックカテーテルを使用した経口気管内挿管法を実施し、マウスを１回換気量１０ｍＬ／ｋｇ及び呼吸数１３０～１４０回／分で機械的に換気した。左開胸術を第３肋間腔において実施し、左肺門を露出させた。
急性肺虚血：
左肺門を微小血管クランプ（Ｒｏｂｏｚ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，米国メリーランド州 ゲイザースバーグ市）を使用して呼気終了時に２時間閉塞し、１回換気量を７．５ｍＬ／ｋｇまで低減させた。外科的切開部を、（ヘパリン６０ＵＩ／１ｍｌ）を含有するヘパリン溶液中に浸漬したガーゼによって被覆した。虚血期の終了時に、クリップを除去した。
実験群：
動物を３つの実験群へと無作為化した。
（ａ）．血管送達（Ｖ）：虚血期及びクリップの除去の直後に、動物を無作為に選択して、０．３ｍＬの呼吸緩衝液（ビヒクル－Ｖ）又はミトコンドリアを含有する０．３ｍＬの呼吸緩衝液（ミトコンドリア－Ｖ）のいずれかを投与した。ビヒクル及びミトコンドリアを、４０ゲージの針を備えたツベルクリン注射器を使用した左肺動脈への注射を介して、０．３ｍＬのボーラスとして送達した。ミトコンドリア濃度を本明細書に説明する方法によって決定した。
（ｂ）．噴霧（Ｎ）：虚血期及びクリップの除去の直後に、動物を無作為に選択して、９０μＬの呼吸緩衝液（ビヒクル－Ｎ）又はミトコンドリアを含有する９０μＬの呼吸緩衝液（ミトコンドリア－Ｎ）のいずれかを投与した。ビヒクル及びミトコンドリアを、Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔネブライザーを使用して全肺に４０秒間送達した（１０秒間の噴霧とそれに続く１分間の定期的な機械的換気、４回繰返し）。ミトコンドリア濃度を決定した。ネブライザー試験（右葉及び左葉を含む）においては２／３ほど大きな体積になることを考慮して、３倍濃度を使用した。
（ｃ）：偽対照マウスを肺門クランプなしで開胸し、ケージに戻す前に２時間機械的に換気した。偽対照群は、麻酔、切開外傷及び手術中の動物組織に対する潜在的外傷によって引き起こされる特定の効果を分離するために必要とされる。
ＡＬＩの改善を可能にするために必要とされる至適ミトコンドリア濃度を決定すること。
組織湿重量１グラムあたり２×１０５個の自家ミトコンドリアが心臓における心臓保護を提供する。ＡＬＩの肺における安全性及び有効性のための至適ミトコンドリア濃度を決定するために、いくつかの用量、具体的には組織湿重量１グラムあたり２×１０５個、２×１０６個及び２×１０７個のミトコンドリアを試験した。
肺機能分析
２４時間の回復（虚血肺の再灌流）後、ペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりマウスを麻酔した。プラスチックの１８ゲージのカテーテルを用いた気管切開術又は気管内挿管法を実施し、マウスを機械的に換気した。中央開腹術及び胸骨切開術を実施して肺を露出させ、左肺門をクランプして傷害を受けた左肺の機能を評価した。１回換気量（ＴＶ）を５ｍＬ／ｋｇまで低減させ、次いでマウスを特殊な齧歯類人工呼吸器（ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ，ＳＣＲＥＱ、カナダ国ケベック州モントレール市）に接続して、左肺の最大吸気圧（ＰＩＰ）、呼吸器系の抵抗（Ｒｒｓ）、呼吸器系のコンプライアンス（Ｃｒｓ）、呼吸器系のエラスタンス（Ｅｒｓ）及び組織ダンピング（Ｇ）を評価した。
損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）分析
同系又は同種のミトコンドリアの注射と関係する何らかのＤＡＭＰ関連傷害があるかどうかを決定するために、循環遊離ミトコンドリアＤＮＡを検出した。循環遊離ｍｔＤＮＡの推定を可能にする独自のプライマーを使用し、この方法は、ｍｔＤＮＡの正確な定量に影響を及ぼす可能性のある核ミトコンドリア挿入配列を考慮する。簡単に述べると、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキットを製造元の説明書によって使用して、全ＤＮＡ（核及びミトコンドリア）を抽出した（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア地区）。ＤＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，デラウェア州ウィルミントン市）によって定量し、１０ｎｇ／ｕＬに調整した。循環遊離ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって分析した。
マウスｍｔＤＮＡ（ｍＭｉｔｏＦ１、（５’→３’）ＣＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡ（配列番号１）、ｍＭｉｔｏＲ１（５’→３’）ＣＣＡＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＴ（配列番号２））、及びマウスβ２ミクログロブリン（ｍＢ２ＭＦ１：（５’→３’）ＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＡＴＡＣＴＧ（配列番号３）、ｍＢ２ＭＲ１：（５’→３’）：：ＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＡＴ（配列番号４））についてのプライマー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ケンタッキー州ルイビル市）を使用して、マウスｍｔＤＮＡを増幅した。リアルタイムＰＣＲを、ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア地区）を用いて実施した。すべてのアッセイは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ ｒｅａｌｐｌｅｘ２機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，ニューヨーク州ホーポーグ地区）を使用して行った。リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）条件は、９５℃で５分間のプレインキュベーション、続いて９５℃で１０秒間の４０サイクルの変性、５６℃で１５秒間のアニーリング及び６０℃で１５秒間の伸長からなる。定量的ＰＣＲの実行が完了した後、９５℃で５秒間融解すること、６５℃で６０秒間冷却すること、続いて蛍光を継続的に監視しながら９５℃まで加熱すること、最後に４０℃で３０秒間冷却することからなる融解曲線分析を実施した。ｍｔＤＮＡ倍数変化を、式２－ΔＣｔ（ΔＣｔ＝ＣｔＭｔＤＮＡ－ＣｔＢ２Ｍ）を使用して単一コピー核ＤＮＡに対して正規化した。
肺の完全性を評価するための染色した肺組織の撮像
肺を収集し、３等分に分割した。肺の上部を使用して、湿／乾燥（ｗ／ｄ）重量比を計算することによって組織浮腫を評価した。回収直後に肺を秤量し（湿重量）、７０℃のオーブン内に７２時間入れた後、再度重量（乾燥重量）を測定し、ｗ／ｄ重量比を計算した。肺の中央部を直ちに１０％ホルマリン中で固定した。組織をパラフィン包埋し、厚さ５μｍで薄片化した。連続切片をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ミエロペルオキシダーゼ染色及びＴＵＮＥＬアッセイに使用した。肺の基底部を透過型電子顕微鏡法に使用して、肺内の構造的損傷を解析した。Ｈ＆Ｅ染色切片を、点数化システムを使用して肺傷害の重症度の読み出しとして評価した。断面あたり２５枚の無作為（２０倍）視野を解析した。肺傷害を、気腔又は血管壁における炎症細胞の浸潤又は凝集に基づいて等級分類した。
等級１：壁のみ、
等級２：気腔中に数個の細胞（１～５個の細胞）、
等級３：中間、及び
等級４：重度（気腔の鬱血）。
間質の鬱血及び硝子質膜形成については、以下の等級が使用される。
等級１：正常肺、
等級２：中等度（肺切片の２５％）、
等級３：中間（肺切片の２５～５０％）、及び
等級４：重度（肺切片の５０％）、
出血については、以下の等級が使用される。
等級０：なし、及び
等級１：あり。
結果
図６は、左肺の２時間のＡＬＩ虚血及び２４時間の回復後のマウス肺の代表的な肉眼検査画像を示す。虚血手技に供した肺を赤色の丸によって示す。右肺はＲとして示されており、左肺はＬとして示されている。心臓（Ｈ）は各画像において示されている。ビヒクル肺は、重度の浮腫及び細胞損傷を呈した（ビヒクル－Ｖ）。対照的に、ミトコンドリア処置を受けた肺は、肉眼検査による細胞構造を保存した。
図７Ａ～図７Ｂは、マウス肺における肺の完全性、具体的には肺の抵抗及びエラスタンスの定量した測定を示す（ｎ＝４）。２４時間の回復後に２時間の左肺虚血に供したマウス肺における抵抗（図７Ａ）及びエラスタンス（図７Ｂ）を測定した。ビヒクル又はミトコンドリアを、左肺動脈（Ｖ）を経て又はネブライザー（Ｎ）によって血管内送達した。ミトコンドリアの濃度は、肺組織湿重量１グラムあたり２×１０７個のミトコンドリアとした。ネブライザーによって送達されたミトコンドリアは、追加の肺体積を考慮して、肺組織湿重量１グラムあたり６×１０７個のミトコンドリアとした。これらの結果は、血管によって又はネブライザーを使用したエアロゾルによって送達されるミトコンドリア移植が、ビヒクル処置肺と比較して肺の抵抗及びエラスタンスを有意に保存することを実証している。結果はまた、偽対照（虚血なし）と、左肺動脈を経て血管内に、又はネブライザーによって送達されたミトコンドリアを投与された虚血性肺との間に有意差がないことも示す。組織ダンピング及び肺コンプライアンスについても同様の結果が得られた。
図８Ａは、呼吸緩衝液のみ（偽）又はミトコンドリア（呼吸緩衝液中の３×１０７個）を投与したＢＡＬＢ／ｃＪマウスの全血試料に対するリアルタイムＰＣＲによって決定された循環遊離ｍｔＤＮＡの定量を示す。腹腔内注射の１０日後に血液試料を得た。ｍｔＤＮＡ倍数変化（平均±ＳＥＭ）を単一コピー核ＤＮＡ（β２ミクログロブリン）に対して正規化した。結果は、偽と比較して、ミトコンドリア注入による循環遊離ｍｔＤＮＡの増加を示さない（Ｐ＝０．９６）。図８Ｂは、ヘマトキシリン・エオシン染色した肺組織の代表的な顕微鏡写真を示す。図８Ｃは、Ｍａｓｓｏｎの３色で染色した肺組織の代表的な顕微鏡写真を示す。肺の組織学的性質は、偽と比較して、ミトコンドリア注入を用いた連続肺切片において超微細構造の差異を示さなかった。すべての切片は、気道及び肺胞からの正常な上皮を示す。図８Ｄは、右下葉からの代表的な透過型電子顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡画像は、保存された内皮及び基底膜をすべての群において示す。スケールバーは、１μｍである。矢印は肺胞腔を示す。肺組織の組織学的及び電子顕微鏡での解析は、炎症又は細胞損傷の証拠を示さなかった。ＴＴＣ染色によって決定される心筋細胞壊死の証拠はなく、心筋組織又は肺内皮若しくは基底膜損傷におけるコラーゲン含量の増加の証拠はなかった。
例６：エアロゾル形態として調製され、気道に投与される外因性ミトコンドリアは、ブタＡＬＩモデルにおいて症状を改善するのに十分である
ブタの肺は、ヒトの肺に匹敵する体積を有し、呼吸機能の研究に有利なモデルとなる。ブタ肺は、ヒト肺に匹敵する細胞の系統及び組成を有する。ブタ気道の一般的な解剖学的分布は、いくつかのわずかな例外を除いてヒトのそれを再現している。ブタ気道を取り囲む軟骨は、ヒトよりも広く分布しており、気管気管支樹のさらに下方に広がっている。ブタ肺は、小葉に達する前の最後の軟骨板の後に３世代の細気管支しか有さないが、ヒトはおおよそ１０世代を有する。他のわずかな違いとしては、ヒトよりも長いブタ終末細気管支、及びより短くあまり十分に定義されていないブタ呼吸細気管支がある。また、ヒトと同様に、ブタは、粘膜表面を保護し、炎症応答を誘起し、適応免疫応答を統合するために必要な先天免疫エフェクターの全一式を、気道内に有する。したがって、ヒトにおいて使用されるのと同じ道具及びプロトコルを使用して大きな動物モデル（例えば、ブタモデル）において実験を再現することは、ヒトにおける臨床上の使用とのより良好な関連性を提供することができる。
方法
動物モデル
ヨークシャーブタ（雄雌、４０～５０ｋｇ）を各群に無作為に割り当てる。ブタモデルは、臨床上の関連性の点で多くの利点を有する。ブタの生理学的性質は、成人のヒトによく似ており、当該モデルは、ヒトの実施への移行の前の実験による証明のための外科的関連性を提供することができる。ブタ肺は、正常なヒト肺のための優れたモデルであり、確立された肺虚血－再灌流傷害モデルである。
実験プロトコル
ブタをテラゾール（４～６ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）及びキシラジン（１．１～２．２ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）で誘導し、続いて耳介静脈カテーテル留置を行う。動物にカフ付き気管内チューブを挿管し、ベースラインでＰａＣＯ２ ３５～４５ｍｍＨｇを得るように調整したＴＶ１０ｍｌ／ｋｇ、ＦｉＯ２ ０．４、ＰＥＥＰ ５ｃｍＨ２Ｏ、ＲＲ １２～１５回／分で体積制御性換気を介して機械的に換気する。全身麻酔をイソフルラン（最大３％）で誘導し、０．５～４％）を使用して維持する。
採血
大腿動脈カテーテルを経皮的に配置して、平均動脈圧（ＭＡＰ）を監視し、手技全体を通して動脈採血する。あるいは、切開を介して配置した頸動脈カテーテルを利用することができる。大腿静脈又は頸静脈には、ＣＶＰ監視及び静脈採血のために経皮的に配置されたカテーテルを挿管することができる。超音波を用いてこれらの血管に挿管することができない場合、切開を行い、カテーテルを直接的な可視化の下で血管内に配置する。次いで、創傷をＶｉｃｒｙｌ糸又はＰＤＳ糸（４－０）で縫合する。ヘパリンナトリウム２００ＵＩ／ｋｇは、目標ＡＣＴが＞３００秒に達するように左肺門のクランプ前に耳介静脈を介して付与される。ＡＣＴは、手術全体を通してチェックされ、必要な場合、凝固は、ＡＣＴ＞３００秒を維持するために追加のヘパリン用量で調整することができる。手術中に心室細動が発生した場合、１％リドカイン（５ｍＬ、静脈内）が対象に付与される。乳酸リンゲル溶液又は生理食塩水は、動脈血圧を支持するために手技全体を通して耳介静脈又は大腿静脈を介して注入される。深麻酔の確認後、左肺門にアクセスするために、第５肋間腔にわたって左開胸術を実施する。あるいは、開胸アプローチにおいて肺門へのアクセスが制限されている場合、胸骨正中切開術を使用することができる。ＰＡＰ監視のために肺動脈にＰＶＣ臍帯カテーテルを挿管する。次いで、左心房を、ＰＶＣ臍帯カテーテルを使用して左心耳を介して挿管して、採血のためにＬＡＰを測定する。中心温は、加熱パッドを使用して継続的に監視及び維持される。
血流監視
上行大動脈及び主肺動脈を切開することができ、血流を監視するために、遷音速流プローブが取り付けられる。
心筋機能の評価
心筋機能は、コンダクタンスカテーテルをＲＶ及びＬＶ腔内へと直接配置することによって評価することができる。カテーテルは、巾着縫合を経て挿入することができる。巾着縫合は、出血を防止し、カテーテルを定位置に固定することができる。あるいは、ＲＶカテーテルは、頸静脈を介して中心静脈系を介して配置することができる。記録は、本実験全体を通して連続的に得ることができる。
心エコー法
心エコー検査を行って心筋機能を決定することができる。心外膜２次元心エコー図は、ベースライン、自家ミトコンドリア又は呼吸緩衝液の注射の直前、及び注射の３時間後に得られる。
ミトコンドリアの単離
大胸筋又は腹直筋を位置決めして切離することができ、生検パンチを使用して２つの小さな筋組織片（おおよそ０．０１ｇ）を外科的に摘出し、無菌条件下でミトコンドリアの単離に使用することができる。ミトコンドリアの単離は、臨床上の関連性を維持するために、現行の実験室標準に従って３０分未満で実施することができる。
左肺急性虚血
左主気管支は、何らかの気管支循環を切除するために１ｃｍの長さにわたって抜去することができる。肺門－動脈、静脈及び気管支を９０分間クランプする。換気は、ＴＶ６ｍｌ／ｋｇ、ＰＥＥＰ５ｃｍＨ２Ｏまでの片肺換気用に調整することができ、ＦｉＯ２はＳＯ２レベルに基づいて調整される。片肺換気を９０分間維持する。虚血期中に最大気道圧Ｐｍａｘが２０～２２ｃｍＨ２Ｏの高さまで上昇する場合、肺の圧力外傷を防ぐために、体積制御換気をＰｍａｘ２０～２２ｃｍＨ２Ｏの圧力制御換気に切り替えることができる。気管支クランプは、吸気及び呼気の動作のないしぼんだ左肺によって視覚的に確認することができる。
実験群：
（ａ）偽対照群－左肺門を切開することができるが、クランプすることはできず（左肺虚血は存在しない）、動物を９０分間、次いで再灌流中にさらに３時間監視することができる。９０分間の左肺虚血の後、肺門クランプを解放することができ、左肺は、無菌呼吸緩衝液の単回１５ｍＬ注射（ビヒクル－Ｖ）又はミトコンドリアを含有する無菌呼吸緩衝液の単回１５ｍＬ注射（ミトコンドリア－Ｖ）のいずれかを投与される。
（ｂ）ミトコンドリア又はビヒクルの注射の血管送達は、１８ゲージの針を使用して左肺動脈にボーラスとして投与することができる。注射部位をサイズ４－０のＰｒｏｌｅｎｅ糸で縫合して、出血を制御することができる。
（ｃ）ネブライザー送達は、人工呼吸器回路に取り付けられた市販等級のネブライザー（Ａｌｌｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を使用して実施することができる。
再灌流は、３時間継続することができる。当該動物は、この時間、麻酔下のままである。
データ収集
ＭＡＰ、ＣＶＰ、ＰＡＰ、ＬＡＰは、ベースライン、再灌流期の開始時、自家ミトコンドリア又は呼吸緩衝液の注入直前、及び再灌流中の１、２、３時間時に記録される。最大吸気圧、プラトー吸気圧、ならびにＡＢＧの動脈血及び混合静脈血の呼吸測定は、ベースライン、再灌流期の開始時、自家ミトコンドリア又は呼吸緩衝液の注射の直前、及び再灌流中の１、２、３時間時に実施される。
気管支肺胞洗浄
左肺及び右肺の洗浄は、再灌流期の終了時に実施することができる。最初に左肺の後葉の、次いで右肺の気管を介して口腔を経てカテーテルを導入した後、気管支鏡の誘導下で洗浄を実施することができる。次いで、３０ｍｌの生理食塩水を肺へと導入することができ、１分後に体液を吸引することができる。この後、さらに１５ｍｌの生理食塩水を肺へと導入し、１分後に吸引することができる。吸引された流体は、さらなる分析のために採取することができる。ＢＡＬ液を直ちに４℃、５００×Ｇで５分間遠心分離することができ、上清を回収し、サイトカイン及びケモカインの発現レベルを決定するためのさらなる分析まで－８０℃で保存することができる。サイトカイン及びケモカインの分析は、Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カナダ国、アルバータ州、カルガリー市）によって実施することができる。以下のバイオマーカーを試験することができる。すなわち、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７Ａ、ＩＰ－１０、ＫＣ、ＬＩＦ、ＬＩＸ、ＭＣＰ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、ＶＥＧＦである。すべての試料を３連で実行することができる。
主要な結果の測定
例えば、ＨＲ、ＬＶＰＤＰ、ＣＦ、ＬＶＥＤＰ、＋ｄＰ／ｄＴ、ＣＯ、ＰＶＲ、ＬＡＰ、ならびに、例えば、酸素－ＰａＯ２、ＰｐｖＯ２、ＯＩ、ＳＯ２、ＡａＤＯ２、コンプライアンス、エラスタンス、抵抗、Ｃｄｙｎ、ＰＥＥＰ、Ｃｃｓ、ＰＩＰ、Ｒｒｓ、Ｃｒｓ、Ｅｒｓ及びＧ（左肺の組織ダンピング）及び肺圧、体積ループを含む肺機能測定を含む血行動態測定は、ベースライン、再灌流期の開始時、自家ミトコンドリア又は呼吸緩衝液の処置の直前、及び再灌流の１、２、３時間時に実施することができる。再灌流期の終了時に、左右の肺の気管支肺胞洗浄を実施する。生化学的及びプロテオミクスの、サイトカインの、ケモカインの及び免疫の応答を決定することができる。肺炎症応答は、ＰＰＩ、ＯＩ、組織学的性質、及び炎症性サイトカインの発現を分析することによって検査することができる。肺アポトーシスは、ＴＵＮＥＬ及び肺浮腫によって決定することができる。虚血前後の肺機能を各ミトコンドリア濃度について決定することができ、生化学的及び組織学的な分析は、各濃度についての有効性を決定するために実施することができる。
統計計画及びデータ解析
出力解析は、１群あたり６匹の動物の試料サイズが、群内標準偏差の２倍に等しい差を検出するために８５％を超える出力を提供し（α＝０．０５、両側）、群内標準偏差の２．５倍に等しい差を検出するために８２％を提供する（α＝０．００８３、両側、ボンフェローニは、５群間の事後比較についての有意水準を調整した）ことを示した。所見の有無については、１群あたり６匹の動物は、当該動物の少なくとも４０％で生じる効果を検出する９５％の出力を有するであろうが、１群あたり１０匹の動物は、当該動物の少なくとも２６％で生じる効果を検出する９５％の出力を有するであろう。１０匹の動物の試料は、独立した群のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ｎＱｕｅｒｙ Ａｄｖｉｓｏｒ第７．０版、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、アイルランド国、コーク市）を用いて、１０％（有効数＝１．０）のプールされた標準偏差を仮定して、処置群と対照群との間に１０％以上の平均の差を検出するために８０％の統計学的出力（両側α＝０．０５、β＝０．２０）を提供することができる。この試料サイズはまた、マン・ホイットニーのＵ検定の検出力を用いて、群間の２４時間の差を捕捉するために８０％の出力を提供することもできる。予備試験及び動物の死亡率に基づいて、典型的には、各実験群はおおよそ６～１０匹の動物からなる。平均±全データの平均の標準誤差を全変数について計算する。データが正規分布している場合、対応のある両側ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定、又は他の連続データについてはＷｉｌｃｏｘｏｎ符号順位検定を使用して、単純な介入前と介入後の比較を行う。動物に対して単一の正規分布変数のみが存在するとき、一元配置分散分析を使用して群を比較し、一般化線形モデルフレームワークの拡張を使用して他の変数の効果を評価する。動物について複数の測定値がある場合、分散の混合モデル解析（ＭＭ－ＡＮＯＶＡ）を使用して、一定の効果として群及び／又は薬物を用いて統計的有意性を評価し、群内対象因子として経時的な反復測定を組み込むことができる。一般に、自己回帰相関（ＡＲ（１））相関を使用して、経時的な測定値間の関連性をモデル化することができる。ＡＲ（１）は、経時的なデータをモデル化するための標準的な方法であり、互いに近い測定値は、さらに離れた測定値よりも相関が高いことを意味する。正規分布していない変数については、データ変換を実行してデータを正規化することができる（例えば、対数変換）か、又は一般化推定方程式を使用してデータを解析することができる。
統計的有意性
Ｐ＜０．０５の閾値は統計的有意性を示す。群間の事後比較は、ボンフェローニ補正を使用して多重比較のために調整される。有効性は、フィッシャーの直接確率検定を用いて比較することができる。無作為化は、均一（０、１）数生成器を使用した１：１の割り当てに基づいて、Ｒソフトウェアパッケージを使用して実行することができる。統計解析は、ＳＡＳ第９．３版（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ノースカロライナ州、ケーリー町）を使用して行うことができる。
結果
エアロゾル形態として調製され、気道に投与される外因性ミトコンドリアは、ブタＡＬＩモデルにおいて症状を改善するのに十分であると予想される。
例７：エアロゾル形態として調製され、気道に投与される外因性ミトコンドリアは、マウスＡＬＩモデルにおいて症状を改善するのに十分である
エアロゾル形態として調製され、マウスの気道に投与された外因性ミトコンドリアが、マウス急性肺虚血（ＡＬＩ）モデルにおいてＡＬＩの症状を改善するのに十分であるかどうかを評価するために、標識したミトコンドリアを含むエアロゾルを調製し、ネブライザーシステムを使用して投与し、アッセイを実施して肺の機能及び完全性を評価した。
方法
動物
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８～１０週齢、ｎ＝３５、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，メイン州バーハーバー町）を使用した。すべての実験は、Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの施設内動物管理使用委員会によって承認され、動物の管理及び使用に関する米国国立衛生研究所の指針に準拠した。
ミトコンドリアの単離
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝６）由来の腓腹筋を摘出し、同系ミトコンドリアを単離するために直ちに使用した。ミトコンドリアを単離し、単離したミトコンドリアの数及び生存率を上述のとおり決定した。単離したミトコンドリアを、血管送達群用の０．３ｍＬの呼吸緩衝液（２５０ｍｍｏｌ／Ｌスクロース、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ＋－ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ＋－ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０）又は噴霧送達群用の９０μＬの呼吸緩衝液のいずれかの中で懸濁し、ミトコンドリア移植のために直ちに使用した。
マウス肺ＩＲＩモデル
実験プロトコルを図１に示す。手術は、いくつかの修正を加えて上述の手技によって実施した。簡単に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝２９）をペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔し、手術中、０．５％イソフルラン吸入で維持した。２０ゲージのプラスチックカテーテルを使用した経口気管内挿管法を実施し、マウスを１回換気量１０ｍＬ／ｋｇ及び呼吸数１３０～１４０回／分で機械的に換気した。左開胸術を第３肋間腔において実施し、左肺門を露出させた。左肺門を微小血管クランプ（Ｒｏｂｏｚ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，米国メリーランド州 ゲイザースバーグ市）を使用して呼気終了時に２時間閉塞し、１回換気量を７．５ｍＬ／ｋｇまで低減させた。外科的切開部を、（ヘパリン６０ＵＩ／１ｍｌ）を含有するヘパリン溶液中に浸漬したガーゼによって被覆した。虚血期の終了時に、クリップを除去した。動物を２つの実験群、すなわち、血管送達（Ｖ）群又は噴霧（Ｎｅｂ）群へと無作為に分けた。再灌流開始時の血管送達群では、０．３ｍＬの呼吸緩衝液中の１×１０８個のミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｖ、ｎ＝６）又は０．３ｍＬの呼吸緩衝液（ビヒクルＶ、ｎ＝７）のいずれかを、４０ゲージの針を備えたツベルクリン注射器を使用して左肺動脈への注射を介して左肺に送達した。再灌流開始時の噴霧群を介した送達では、９０μＬの呼吸緩衝液中の３×１０８個のミトコンドリア（Ｍｉｔｏ Ｎｅｂ、ｎ＝６）又は９０μＬの呼吸緩衝液（ビヒクルＮｅｂ、ｎ＝６）のいずれかを合計４０秒間の時間にわたって肺全体に送達した（１０秒間の噴霧とそれに続く１分間の定期的な機械的換気、４回繰返し）。マウスを回復させておき、ケージに２４時間戻した。偽対照マウス（偽、ｎ＝４）を、肺門クランプなしで開胸し、ケージに戻す前に機械的に２時間換気した。
ミトコンドリアの生体内分布及び取り込み
追加の実験では、ウィスター系ラット（２００～２５０ｇ、ｎ＝６、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州、ウースター市）を、肺内のミトコンドリア取り込みの可視化のために使用した。ドナーラット（ｎ＝２）を同系ミトコンドリア単離及び１８Ｆ－ローダミン６Ｇミトコンドリア標識に使用した。ウィスター系ラット（ｎ＝３）を麻酔し、２～３％イソフルラン吸入で維持した。その後、一組のラットにおいて、胸骨切開術を実施し、肺動脈幹を露出させた。１８Ｆ－ローダミン６Ｇ標識ミトコンドリア（０．５ｍＬの呼吸緩衝液中１×１０９個）を、３０ゲージの針を備えたツベルクリン注射器を使用して肺幹への注射を介して肺に送達した。
ウィスター系ラットの別の群（ｎ＝３）では、１８Ｆ－ローダミン６Ｇ標識ミトコンドリア（０．３ｍＬの呼吸緩衝液中１×１０９個）をエアロゾルとして噴霧を介して肺に送達した。ミトコンドリア送達の１０分後、動物をＣＯ２チャンバ内で安楽死させ、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及びマイクロコンピュータ断層撮影法（μＣＴ）によって撮像した。
別のセットのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝４）では、すでに説明したように２９、ヒト心筋線維芽細胞からミトコンドリアを単離し、ネブライザーを介して及び肺動脈を介してマウス肺組織に送達した。マウス肺内のヒトミトコンドリアの使用は、モノクローナル抗ヒトミトコンドリア抗体（ビオチン－ＭＴＣＣ２、Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州、ケンブリッジ市）に対する免疫反応性に基づいて、内因性マウスミトコンドリアと移植ヒトミトコンドリアとの区別を可能にした。ミトコンドリアを、抗ヒトミトコンドリア抗体を使用して検出し、上述のとおりＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム市）及びＡＥＣ＋基質色原体（Ｄａｋｏ、Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州サンタクララ市）を用いて可視化した。
肺機能
２４時間の再灌流後、ペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりマウスを麻酔した。プラスチックの１８ゲージのカテーテルを用いた気管切開術及び気管内挿管法を実施し、マウスを機械的に換気した。次に、中央開腹術及び胸骨切開術を実施して肺を露出させ、右肺門をクランプして傷害を受けた左肺の機能を評価した。ＴＶを５ｍＬ／ｋｇまで低減させ、次いでマウスを特殊な齧歯類人工呼吸器（ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ，ＳＣＲＥＱ、カナダ国ケベック州モントレール市）に接続して、左肺の呼吸器系の動的コンプライアンス（動的コンプライアンス）、呼吸器系の抵抗（抵抗）、（周辺組織の抵抗の指標としての）組織ダンピング、最大吸気圧、及び呼吸能力を評価した。
組織分析
２４時間の再灌流後、左肺を回収し、各肺を３つの部分に分割した。
左肺の上部を使用して、湿／乾燥（ｗ／ｄ）重量比を計算することによって組織浮腫を評価した。回収直後に肺を秤量し（湿重量）、７０℃のオーブン内に７２時間入れた後、再度重量（乾燥重量）を測定し、ｗ／ｄ重量比を計算した。
左肺の中央部を直ちに１０％ホルマリン中で固定した。組織をパラフィン包埋し、厚さ５μｍで切片化した。連続切片をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ミエロペルオキシダーゼ染色及びＴＵＮＥＬアッセイに使用した。
Ｈ＆Ｅ染色した切片を、上述の点数化システムを使用して肺傷害の重症度について評価した。１枚の切片あたり５つの無作為な（１５倍）視野を解析した。肺傷害を、以下を使用して等級分類した。等級１は、正常な肺組織学的性質を表し、等級２は、軽度の好中球白血球浸潤及び軽度から中程度の間質鬱血を示し、等級３は、中程度の好中球白血球浸潤、血管周囲浮腫形成及び肺構造の部分的破壊を表し、等級４は、高密度好中球白血球浸潤、膿瘍形成及び肺構造の完全な破壊を含んでいた。
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色を上述のとおり実施し、切片を好中球浸潤について評価した。好中球数を、１枚の切片あたり５つの無作為な（１５倍）視野で測定した。
ＴＵＮＥＬアッセイをすでに説明したように２９実施した。ＴＵＮＥＬ陽性核の数は、１枚の切片あたり１６個の無作為な（１０倍）視野で計数した全細胞の百分率として表した。
左肺の基底部を透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）についてすでに説明したように使用して、肺内の構造的損傷を解析した。
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）分析
肺機能評価後、１ｍＬの生理食塩水を使用して左肺をＢＡＬした。ＢＡＬ液を直ちに４℃、５００×Ｇで５分間遠心分離し、上清を回収し、サイトカイン及びケモカインの発現レベルをＥｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カナダ国、アルバータ州、カルガリー市）によって決定するためのさらなる分析まで－８０℃で保存した。以下のバイオマーカーを試験した。すなわち、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７Ａ、ＩＰ－１０、ＫＣ、ＬＩＦ、ＬＩＸ、ＭＣＰ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、ＶＥＧＦとした。すべての試料を３連で実行した。
統計解析
すべてのデータを、処置に対して盲検化された観察者によって収集した。すべてのデータを、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。群間比較を一元配置ＡＮＯＶＡで評価したＢＡＬ分析結果を除くすべてのデータについて、ノンパラメトリックマン・ホイットニーＵ検定によって統計解析を実施した。統計学的有意性は、正確な両側Ｐ＜０．０５によって定義した。
結果
放射性標識したミトコンドリアの肺取り込み
血管送達（図９Ａ）又は噴霧（図９Ｂ）のいずれかを介して送達された１８Ｆ－ローダミン６Ｇ放射性標識ミトコンドリアは、肺によって拡散で取り込まれ、身体のその他の領域には存在しなかった。
ヒトミトコンドリアの肺組織取り込み
血管送達（図１０Ａ）又は噴霧（図１０Ｂ）のいずれかを介して送達されたヒト心臓線維芽細胞由来の外因性ミトコンドリアを、肺内皮細胞、肺細胞、実質、及び肺胞の内部及び周辺で検出した。
肺機能の性能
２時間の虚血及び２４時間の再灌流後、血管送達を介してミトコンドリアを投与されたマウスは、動的コンプライアンス（１０．７９±１．１１μＬ／ｃｍＨ２Ｏ）及び最大吸気量（０．２４±０．０２ｍＬ）の有意な上昇、ならびに抵抗（２．０２±０．２８ｃｍＨ２Ｏ）、組織ダンピング（１０．４９±０．９１ｃｍＨ２Ｏ／ｍＬ）及び最大吸気圧（９．４８±０．４０ｃｍＨ２Ｏ）の有意な低下を、ビヒクルＶ（それぞれ５．９１±０．４６、０．１２７±０．０１、３．３３±０．４０、２０．０２±２．７５及び１１．９６±０．７４、各々Ｐ＜０．０５、図１１Ａ～Ｅ）と比較して有していた。Ｍｉｔｏ Ｖ群のすべての肺機能パラメータは、偽肺と比較して有意に異ならなかった（それぞれ９．７５±０．３５、０．１８±０．０１、１．５１±０．２０、９．４６±０．６３及び８．６２±０．２０、各々Ｐ＞０．０５、図１１Ａ～Ｅ）。ビヒクルＶ肺のすべてのパラメータは、偽肺と比較して、最大吸気量（Ｐ＞０．０５）以外、有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。
２時間の虚血及び２４時間の再灌流後、噴霧を介してミトコンドリアを投与されたマウスは、動的コンプライアンス（７．８８±１．０５μＬ／ｃｍＨ２Ｏ）及び最大吸気量（０．１８±０．０２ｍＬ）の有意な上昇、ならびに抵抗（２．１３±０．２３ｃｍＨ２Ｏ）、組織ダンピング（１３．６３±１．５５ｃｍＨ２Ｏ／ｍＬ）及び最大吸気圧（１０．１８±０．４０ｃｍＨ２Ｏ）の有意な低下を、ビヒクルＮｅｂ（それぞれ５．１３±０．９３、０．１０±０．０２、４．７４±０．８３、３４．０２±５．０４及び１１．８２±０．５３、各々Ｐ＜０．０５、図１２Ａ～Ｄ）と比較して有していた。
Ｍｉｔｏ Ｎｅｂ群のすべての肺機能パラメータは、偽肺と比較して、最大吸気圧（８．６２±０．２０、Ｐ＜０．０５）以外、有意に異ならなかった（それぞれ９．７５±０．３５、０．１８±０．０１、１．５１±０．２０及び９．４６±０．６３、各々Ｐ＞０．０５、図３Ｄ～Ｆ、Ｉ、Ｊ）。ビヒクルＮｅｂ肺のすべてのパラメータは、偽肺と比較して、有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。
代表的な圧力－体積ループは、Ｍｉｔｏ Ｖ、Ｍｉｔｏ Ｎｅｂ及び偽群と比較して、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂがより小さな肺気量容量及びより高い圧力を有することを実証した（図１３）。
肺組織の損傷
Ｈ＆Ｅ分析は、それぞれビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ肺及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ肺において、肺構造の破壊の徴候を伴わずに炎症細胞浸潤及び間質鬱血の有意な低下を示した（血管送達群についてそれぞれ、等級１．８±０．１、等級２．５±０．１、噴霧群についてそれぞれ、等級１．７±０．１、等級２．５±０．１、いずれもＰ＜０．０５、図１４、図１５Ａ～Ｅ）。すべての群と比較して、偽肺において肺組織の有意に改善された保存が観察された（等級１．３±０．１、Ｐ＜０．０５）。
それぞれビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ群及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ群で好中球数の有意な低下が観察された（血管送達群についてそれぞれ、１２０．２±５．５、１５９．９±６．５、噴霧群についてそれぞれ、７７．８±３．８、１２５．７±４．９、いずれもＰ＜０．０５、図１４、図１５Ｂ、図１５Ｅ）。Ｍｉｔｏ Ｖ肺、ビヒクルＶ肺及びビヒクルＮｅｂ肺と比較して、偽肺では好中球数が有意に低減した（５５．３±３．６、Ｐ＜０．０５）。偽群ではＭｉｔｏ Ｎｅｂと比較して好中球数に有意差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。
ＴＵＮＥＬ分析は、それぞれビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂと比較して、Ｍｉｔｏ Ｖ群及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ群でアポトーシス陽性核数の有意な低下を示した（血管送達群についてそれぞれ、１．３８±０．２５、１．５５±０．１８、噴霧群についてそれぞれ、３．１±０．３８、３．１５±０．２５、いずれもＰ＜０．０５）。Ｍｉｔｏ Ｖ群及びＭｉｔｏ Ｎｅｂ群と比較して、偽肺におけるアポトーシス陽性核数に有意差はなかった（０．３±０．１、Ｐ＜０．０５）（図１４、図１５Ｃ、図１５Ｆ）。
２４時間の再灌流の後、左下葉からのＴＥＭは、ビヒクルＶ及びビヒクルＮｅｂならびにＭｉｔｏ Ｖ及びＭｉｔｏ Ｎｅｂにおいて保存された内皮ならびに基底膜を示した。肺胞腔に差はない。このことは、基底膜の損傷がないことを示している（図４）。
ビヒクルＶの左肺（８８．９±０．５％）と右肺（８７．１±１．１％）、Ｍｉｔｏ Ｖの左肺（８８．５±０．３％）と右肺（８８．３±０．６％）、ビヒクルＮｅｂの左肺（８７．５±１．１％）と右肺（８９．２±１．１％）、及びＭｉｔｏ Ｎｅｂの左肺（８８．５±１．２％）と右肺（８９．３±０．６％）、ならびに偽の左肺（８８．７±１．０％）と右肺（９０．１±１．０％、各々Ｐ＞０．０５、図１５Ｇ）の間に、湿重量対乾燥重量の百分率に有意差は認められなかった。
気管支肺胞洗浄サイトカイン
２４時間の再灌流では、群間でサイトカイン及びケモカインに有意差はなかった（図１６）。
考察
ＩＲＩ中の活性酸素種誘導毒性、細胞生体エネルギー論の不全、アポトーシスの上方調節、サイトカイン産生、及び自然免疫からなるミトコンドリア損傷は、急性肺損傷において有意な役割を担っている。本研究では、本発明者らは、肺ＩＲＩのマウスモデルにおけるミトコンドリア移植の有効性及び安全性を実証した。虚血傷害後の２４時間の再灌流後、ミトコンドリア移植は肺機能性能を改善し、肺組織傷害を低下させる。
マウス肺ＩＲＩを調べた従来の研究では、６０分～９０分の虚血時間を利用した。これらの実験は、肺組織損傷の詳細な分析を提供した。しかしながら、当該実験は、いかなる機能分析も提供しなかったか、又は肺機能を非生理学的な単離されたエクスビボシステムで測定したかのいずれかであった。本発明者らの研究では、インビボでの機能測定を達成するためにＦｌｅｘｉＶｅｎｔ機を使用した。本発明者らの予備実験に基づいて、本発明者らは、２時間の虚血時間を選択した。虚血時間が短いと、肺ＩＲＩが不十分となり、本発明者らの研究群間の機能評価及び比較分析が可能にならなかったであろう。１８Ｆ－ローダミン６Ｇ放射性標識ミトコンドリアを使用して、送達されたミトコンドリアの分布を実証した。本発明者らは、血管送達又は噴霧のいずれかを介して、放射性標識されたミトコンドリアを送達した。本発明者らの結果は、両群における肺全体のミトコンドリア分布を示す。エアロゾルとして噴霧を介して送達されたミトコンドリアは、気管及び気管支樹に沿って認められ、ミトコンドリアが最初の接触中にすでに気道組織に付着していることを示唆した。
本発明者らの研究では、ヒトミトコンドリアを使用して、移植されたミトコンドリアの細胞取り込みを決定した。ヒトミトコンドリアは、移植されたミトコンドリアの標的化された標識を可能にし、それゆえ、内因性マウスミトコンドリアを標識する可能性を排除する。ヒトミトコンドリアは、肺全体のすべての細胞内で認められ、脈管系又は噴霧のいずれかを介して送達されたミトコンドリアが有効に移植されたことを実証した。
２つの異なるミトコンドリア送達法を本研究において使用した。当該ミトコンドリアは、標的とされる臓器に脈管系を介して送達されることができる。低侵襲性であるが、依然として臨床的に適切であり、容易に利用される方法を可能にするために、噴霧を介した送達を追加試験群として使用した。２４時間の再灌流後、ビヒクル肺と比較すると、血管送達及び噴霧のいずれもを介してミトコンドリアを投与された肺において有意な機能改善が観察された。１つの機能パラメータであるＰＩＰでは、Ｍｉｔｏ ＶとビヒクルＶとの間に有意差が観察されたが、Ｍｉｔｏ ＮｅｂとビヒクルＮｅｂとを比較すると、有意差は観察されなかった。このことは、脈管系を介して送達されるミトコンドリアの有効性の上昇を含意している可能性があった。しかしながら、この観察結果は、噴霧を介して送達されるミトコンドリアが、脈管系を介して送達されるミトコンドリアほど遠くに送達されないという事実によって説明することができ、より高濃度のミトコンドリアを送達することが、同様に気管及び気管支樹への取り込みという理由で好ましいであろう。噴霧によって送達される至適ミトコンドリア濃度が必要であることを決定するために実験を実施することができる。また、組織分析は、Ｍｉｔｏ Ｖ及びＭｉｔｏ Ｎｅｂのビヒクル群と比較すると、Ｍｉｔｏ Ｖ及びＭｉｔｏ Ｎｅｂのいずれにおいても２４時間の再灌流後に細胞生存率の有意な改善を示したことを特筆することも重要である。
結論として、本発明者らは、肺ＩＲＩのマウスモデルにおけるミトコンドリア移植の有効性及び安全性を実証した。虚血傷害に続く２４時間の再灌流後、ミトコンドリア移植は肺機能を改善し、肺組織傷害を低下させる。これらの結果は、肺組織をＩＲＩから保護するためにこの療法を使用することができ、したがって、肺移植、心肺蘇生、肺塞栓症、敗血症、及び心肺バイパス又は機械的循環支援中の低血圧事象及び手技などのいくつかの臨床ノシナリオにおいて罹病率及び死亡率を低減させることができることを示唆している。
他の実施形態
本発明をその発明を実施するための形態と併せて説明してきたが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、これを制限することを意図するものではないことは理解されるものとする。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
配列表１ ＜２２３＞マウスｍＭｉｔｏＦ１のためのプライマー
配列表２ ＜２２３＞マウスｍＭｉｔｏＲ１のためのプライマー
配列表３ ＜２２３＞ｍＢ２ＭＲ１のためのプライマー
配列表４ ＜２２３＞ｍＢ２ＭＲ１のためのプライマー

Claims (46)

  1. 呼吸器障害に罹患している対象を処置する方法であって、治療有効量のミトコンドリアを含む組成物を対象に気道を経て投与することを含む、上記方法。
  2. 組成物が、エアロゾル化組成物である、請求項１に記載の方法。
  3. 組成物が、ネブライザー、気化器、鼻用スプレー、加圧定量噴霧器、又は呼吸起動型加圧定量噴霧器を使用することによって、対象への投与前にエアロゾル形態へと変換される、請求項１に記載の方法。
  4. 組成物のエアロゾル形態が、１～１０００マイクロリットルの中央値のサイズを有する液滴を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 組成物が、呼吸応答能のあるミトコンドリアを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 対象が、呼吸不全、呼吸機能低下、肺炎、肺がん、皺、脱毛症、及び／又はがんに罹患している、請求項１に記載の方法。
  7. 対象が、急性肺損傷に罹患している、請求項１に記載の方法。
  8. 組成物中のミトコンドリアの濃度が、約１×１０５～５×１０８ｍｌ－１である、請求項１に記載の方法。
  9. 対象に、１回用量あたり約１×１０５～１×１０９個のミトコンドリアが投与される、請求項１に記載の方法。
  10. ミトコンドリアが、自家の、同種、又は異種である、請求項１に記載の方法。
  11. 組成物が、７～８のｐＨを有するＫ＋－ＨＥＰＥＳ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、血清、及び血漿からなる群から選択される溶液をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  12. 組成物が、トレハロース、スクロース、マンノース、グリシン、プロリン、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ベタイン、及びサルコシンからなる群から選択される１つ以上のオスモライトをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  13. 組成物が、医薬品をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  14. 組成物が、医薬として許容され得る希釈剤、賦形剤、又は担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  15. 組成物が、治療薬又は診断薬をさらに含み、治療薬又は診断薬が、共有結合によってミトコンドリアに連結されているか、ミトコンドリア内に包埋されているか、又はミトコンドリア内に内在化している、請求項１に記載の方法。
  16. 治療薬又は診断薬が、治療用診断薬である、請求項１５に記載の方法。
  17. 治療薬又は診断薬が、抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１５に記載の方法。
  18. 治療薬又は診断薬が、共有結合によってミトコンドリアに連結されている、請求項１５に記載の方法。
  19. 治療薬又は診断薬が、ミトコンドリア内に包埋されているか又はミトコンドリア内に内在化している、請求項１５に記載の方法。
  20. ミトコンドリアが、遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
  21. ミトコンドリアが、外因性ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
  22. ミトコンドリアが、外因性のポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核ＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  23. ミトコンドリアが、生存可能な呼吸応答能のあるミトコンドリアである、請求項１に記載の方法。
  24. エアロゾル化組成物であって、
    緩衝液を含む複数の液滴であって、複数の液滴中の少なくとも１つの液滴が、
    少なくとも１つのミトコンドリアを含む、上記複数の液滴
    を含む、上記エアロゾル化組成物。
  25. 緩衝液が、７～８のｐＨを有するＫ＋－ＨＥＰＥＳ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、血清、及び血漿からなる群から選択される、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  26. トレハロース、スクロース、マンノース、グリシン、プロリン、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ベタイン、及びサルコシンからなる群から選択される１つ以上のオスモライトをさらに含む、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  27. 医薬品をさらに含む、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  28. 医薬として許容され得る希釈剤、賦形剤、又は担体をさらに含む、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  29. 組成物が、治療薬又は診断薬をさらに含み、治療薬又は診断薬が、共有結合によってミトコンドリアに連結されているか、ミトコンドリア内に包埋されているか、又はミトコンドリア内に内在化している、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  30. ミトコンドリア薬が、治療薬、化学療法薬、又は診断薬からなる群から選択される、請求項２９に記載のエアロゾル化組成物。
  31. ミトコンドリア薬が、抗体又は抗原結合断片を含む、請求項２９に記載のエアロゾル化組成物。
  32. ミトコンドリア薬が、共有結合によってミトコンドリアに連結されている、請求項２９に記載のエアロゾル化組成物。
  33. ミトコンドリア薬が、ミトコンドリア内に包埋されているか又はミトコンドリア内に内在化している、請求項２９に記載のエアロゾル化組成物。
  34. 複数の液滴が、１～１０００マイクロリットルの中央値のサイズを有する、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  35. ミトコンドリアが、遺伝子改変されている、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  36. ミトコンドリアが、外因性ポリペプチドを含む、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  37. ミトコンドリアが、外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  38. 対象への投与前のミトコンドリアが、酵素を含む組成物と共にインキュベートされる、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  39. 自家ミトコンドリア、同種ミトコンドリア、異種ミトコンドリア、又はそれらの混合物を含む、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  40. 約１×１０３～約１×１０１４個、約１×１０４～約１×１０１３個、約１×１０５～約１×１０１２個、約１×１０６～約１×１０１１個、約１×１０７～約１×１０１０個、約１×１０３～約１×１０７個、約１×１０４～約１×１０６個、約１×１０７～約１×１０１４個、又は約１×１０８～約１×１０１３個、約１×１０９～約１×１０１２個、約１×１０５～約１×１０８個、又は少なくとも若しくは約１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個、１×１０１３個、又は少なくとも若しくは約１×１０１４個のミトコンドリアを含む、請求項２４に記載のエアロゾル化組成物。
  41. ミトコンドリアを対象に気道を経て送達するための装置であって、
    筐体と、
    ミトコンドリアを含む組成物のために筐体内に配備されたリザーバと、
    エアロゾル化形態の組成物を生成するためのエアロゾル発生器と、
    組成物がそれを経て対象の気道に送達される出口と、
    を備える、上記装置。
  42. 装置が、ネブライザー、鼻用スプレー、又は噴霧器である、請求項４１に記載の装置。
  43. エアロゾル発生器が、超音波ネブライザーである、請求項４１に記載の装置。
  44. エアロゾル発生器が、振動メッシュ装置である、請求項４１に記載の装置。
  45. エアロゾル発生器が、空気圧縮機を備え、該空気圧縮機が圧縮空気を組成物に流し、組成物をエアロゾル形態に変える、請求項４１に記載の装置。
  46. ミトコンドリアを対象に気道を経て送達するための装置であって、
    筐体と、
    筐体内に配備されたミトコンドリアを含む組成物と、
    組成物を筐体から対象の気道に送達し、組成物がそれを経て通過するにつれて組成物をエアロゾル化するよう構成された出口と、
    を備える、上記装置。
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