CN113016721A - 中华眼镜蛇咬伤猪模型的制备及用途 - Google Patents
中华眼镜蛇咬伤猪模型的制备及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种中华眼镜蛇咬伤猪模型的制作方法、眼镜蛇蛇毒对猪的半数致死量（LD50）以及动物模型的用途。将眼镜蛇蛇毒冻干粉溶解后按2mg/kg注射入猪腿部肌肉处，6h后即可获得目标动物模型，以解决现有技术中，尚无中华眼镜蛇咬伤大型动物模型的问题。该模型具有成功率高、重复性强、病理改变稳定等优势。眼镜蛇咬伤病情较长，该模型模拟人类被眼镜蛇咬伤，能够较好的贴近人类被眼镜蛇咬伤后的生理病理动态过程，有助于动态分析眼镜蛇咬伤后的发病临床表现和机制。该模型可为研究中华眼镜蛇蛇毒的在人体代谢变化以及肌肉坏死机理提供良好的动物模型，为研究眼镜蛇咬伤的临床表征、病理生理机制、精准化治疗、抗毒蛇咬伤药物的筛选及抗蛇毒血清疗效的评价等研究提供创新技术方法支撑。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种中华眼镜蛇咬伤猪模型的制作方法以及用途。
背景技术
毒蛇咬伤（蛇伤）是被世界卫生组织列为一个易忽视的重要的热带/亚热带疾病之一，全球每年约有500万蛇伤事件发生，造成约2.5万—12.5万人死亡。据流行病学调查显示，中华眼镜蛇咬伤的发病率（16.68%）居蛇伤的第2位，且眼镜蛇是我国分布最广的剧毒蛇种之一。眼镜蛇毒为混合毒，包括神经毒素和血循毒素等，神经毒表现为呼吸困难、呼吸麻痹、心力衰竭；血循毒表现为心脏受损，呈现中毒性心肌病，患者出现血压下降、脉搏细速、休克直至死亡。目前眼镜蛇咬伤的临床诊断和治疗面临着挑战，已成为医疗卫生行业的突出问题。为准确诊断、科学评价眼镜蛇咬伤的发展进程及生理病理变化，迫切需要建立一种与眼镜蛇咬伤病症相似的动物模型，方能使研究更符合临床实际情况，但目前尚未发现有关于眼镜蛇咬伤动物模型的构建制作的相关文献。
眼镜蛇以捕杀老鼠为食，是鼠类等动物的天敌，长期的物种进化也决定了蛇毒素会对鼠类等动物造成快速的死亡，无法动态分析蛇伤发展进程。而形态均一，遗传性及耐受性稳定的猪的组织器官、血常规、生化等指标与人类相似度较高，采用猪为模型制备眼镜蛇咬伤的动物模型，能够较好的符合人被毒蛇咬伤后的发病机制、代谢变化以及生理病理的动态过程，有助于动态分析蛇伤的发展进程，为研究中华眼镜蛇毒的体内代谢变化及致肌肉坏死机理提供良好的动物模型。
发明内容
为解决以上问题：本发明提供一种中华眼镜蛇咬伤猪的动物模型制作方法以及用途。以解决现有技术中，尚无中华眼镜蛇咬伤大型动物模型的问题。该动物模型有助于动态分析眼镜蛇咬伤的发生发展进程，更贴近人类被眼镜蛇咬伤的病理生理的动态过程，为研究眼镜蛇咬伤的临床表征、病理生理机制、精准化治疗、抗毒蛇咬伤药物的筛选及抗蛇毒血清疗效的评价等研究提供创新技术方法支撑。
本申请提供一种眼镜蛇咬伤动物模型的制作方法以及用途。技术方案具体分为两个步骤：（1）探索猪肌肉注射眼镜蛇蛇毒的LD50；（2）制备眼镜蛇咬伤的猪模型。
所述猪肌肉注射眼镜蛇蛇毒的LD50为5-7mg/kg，优选剂量为6mg/kg。
所述制备眼镜蛇咬伤的猪模型的蛇毒剂量为0.56～3.5mg/kg，优选剂量为2mg/kg。
优选的，注射眼镜蛇蛇毒溶液的体积按猪体重的0.2ml/kg计。
优选的，配制蛇毒时避免剧烈摇晃，4℃冰箱过夜充分溶解后使用，但长久放置后毒性会降低。
优选的，所述制备眼镜蛇咬伤的猪模型是将眼镜蛇蛇毒冻干粉溶解后注射入猪腿部肌肉，72h不间断观察猪的运动状态、呼吸表现、眼耳口鼻分泌状况等生物学行为状态；并结合血液检测指标的白细胞计数（WBC）、超敏C反应蛋白（hs—CRP）、乳酸脱氢酶（LDH）、AST/ALT、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等，再根据猪的心脏、肌肉组织等HE染色病理检查结果制备眼镜蛇咬伤的猪模型。
本发明的突出优点：1.本发明首次建立中华眼镜蛇咬伤猪的动物模型，该模型具有成功率高、重复性强、病理改变稳定等优势，且构建周期短，实现难度小，适用性高。2.该模型为眼镜蛇咬伤后的生理病理动态过程研究提供可靠模型，并能够较好地符合临床实际，利用该模型，可为研究眼镜蛇毒的毒性机制、探讨致肌肉坏死机理等奠定基础，在鉴定蛇伤种类、咬伤后临床表现、精准化治疗等方面具有很大的应用价值。
附图说明
图1：本发明实施例中注射蛇毒6h后对照组（Z1、Z2、Z3）与蛇毒组（E1、E2、E3）猪的生物学变化。
图2：本发明实施例中注射蛇毒6h后对照组（Z1、Z2、Z3）与蛇毒组（E1、E2、E3）猪的注射部位伤口变化情况。
图3：本发明实施例中对照组（Z1、Z2、Z3）与蛇毒组（E1、E2、E3）猪的肌肉HE染色病理图。
图4：本发明实施例中对照组（Z1、Z2、Z3）与蛇毒组（E1、E2、E3）猪的心肌HE染色病理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但并不局限于此。
实施例1：中华眼镜蛇咬伤猪模型的制备。
1.材料及试剂：健康小型猪31只，雌雄不限，每头体重约为15kg，来源广西大学广西小型猪繁育中心，实验动物经过学校动物伦理学委员会批准，实验动物生产许可证：SCXK桂2018-0003。饲养于广西医科大学实验动物中心，许可证号SYXK桂2014-0003，温度20℃-25℃，相核对湿度50%-65%。中华眼镜蛇毒冻干粉来源于广西医科大学蛇毒研究所。
2.方法
2.1探索猪肌肉注射眼镜蛇蛇毒的半数致死量：选取25头体型均匀的猪，雌雄不限，分为5组不同浓度的眼镜蛇毒组，蛇毒浓度根据理论半数致死量数值设计，按照1.2倍间距设置眼镜蛇蛇毒浓度梯度，由高到低分别为8.64、7.2、6、5、4.17mg/kg，每组5头注射相同浓度的蛇毒，根据猪体重0.2ml/kg注射眼镜蛇蛇毒。持续观察猪一周内的存活状况，根据每组猪的死亡情况采用bliss法计算出猪肌肉注射眼镜蛇蛇毒的半数致死量。
2.2眼镜蛇咬伤猪模型的制备
称取90mg眼镜蛇毒冻干粉，溶解于9ml的1:1生理盐水甘油中，浓度为10mg/ml，4℃冰箱存放过夜后使用。将6头猪随机分为两组，正常对照组（Z1、Z2、Z3）；蛇毒组（E1、E2、E3）。蛇毒组3头猪分别于腿部肌肉处注射蛇毒溶液（浓度10mg/ml，体积3ml），对照组在猪的相同部位注射等体积的生理盐水。建模期间时刻观察猪的生物学行为状态如精神状态、运动状态、呼吸表现、眼耳口鼻腔分泌物等，在注射蛇毒前、注射蛇毒后的3h、6h、12h、24h时间段采集每头猪的血液，血液学检测指标主要包括白细胞计数（WBC）、超敏C反应蛋白（hs—CRP）、乳酸脱氢酶（LDH）、AST/ALT、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等；病理检查主要为注射部位、心肌组织的HE染色情况。通过观察蛇毒组和对照组小猪的行为学变化、血液指标变化及组织病理改变，综合评估模型制作的成功与否。
3.数据处理
数据采用均值±标准差表示，运用SPSS22.0进行单因素方差分析（ANOVA）和T检验分析，P值小于0.05或小于0.01认为有显著性差异。
4.实验结果
4.1注射眼镜蛇蛇毒后，一周内根据各组猪的死亡情况计算以bliss法probit模型计算出经肌肉注射眼镜蛇蛇毒对猪的LD50为6mg/kg，见表1，根据药理毒理学相关文献拟采用1/3LD50进行眼镜蛇咬伤猪模型的制备。
表1.猪肌肉注射眼镜蛇蛇毒的死亡情况及LD50
注：回归方程y(Probit)=5.3493+13.181Log(D)， LD50(Feiller校正)95%的可信区间=5.2—7.1mg/kg。
4.2行为学观察：蛇毒组的猪在注射蛇毒30min后左右开始出现嗜睡、懒动、全身无力、刺激反应减弱、眼睑下垂和瞳孔散大等中毒症状；3h后，可明显观察到腿部肌肉颤抖、躯体抽搐、行动困难、口腔和眼角膜均有不明分泌物，注射处开始红肿，出现细胞毒素中毒现象；6h后小猪出现卧地不起并抽搐，伤口明显红肿并扩散，为明显中毒症状。对照组的猪在注射部位无红肿，也没有中毒症状。蛇毒组与对照组有明显差异，见图1、图2。
4.3血液学分析表明，注射蛇毒前，蛇毒组和对照组小猪的血液指标无统计学差异。与对照组相比，蛇毒组猪的白细胞计（WBC）数在注射蛇毒后12h内显著升高，说明蛇毒组猪受到了蛇毒的侵袭；蛇毒组猪的超敏C反应蛋白（hs—CRP）在注射蛇毒12h内显著升高，说明受到了急性感染，体内有炎症存在；乳酸脱氢酶（LDH）在注射蛇毒后6h内显著升高，表明蛇毒组猪肝脏受到损伤。AST与ALT的比值在12h内急剧上升，且比值大于1，说明肝脏损害较重。肌酸激酶同工酶（CK-MB）12h内显著升高，差异极为显著，表明猪的心肌受到了眼镜蛇蛇毒的侵扰，结果见表2。
表2.对照组与蛇毒组在注射眼镜蛇毒后猪血液各项生理生化指标的变化情况。(x±s，n=3)
注：与对照组比较，* P＜0.05，** P＜0.01。
4.4HE染色结果：通过观察肌肉的HE染色结果，对照组可清楚看到细胞核，细胞质呈现规则排列，蛇毒组中细胞核溶解，细胞质呈现不规则排布，是肌肉坏死现象，详见图3；对照组的心肌细胞排列整齐，细胞核明显且均匀，而蛇毒组的心肌细胞多呈浑浊肿胀，有不同程度的变形、坏死和凋亡，细胞核明显变大，部分发生点状坏死并有溶解趋势，详见图4。
在实验中发现，按上述操作于猪腿部肌肉处注射一定剂量的眼镜蛇蛇毒，剂量为0.56～3.5mg/kg，6h后即可获得目标动物模型，且符合临床实际要求。本实施例中，生物学行为状态作为评价模型成功与否的主要指标。此外，为更好的评估建立的动物模型，本实施例中还利用相关血液学指标和病理检测，作为评定模型的辅助指标，以便获得更准确的动物模型。
实施例2：眼镜蛇咬伤猪模型的应用
用本发明建立的眼镜蛇咬伤猪模型，以解决现有技术中，尚无眼镜蛇咬伤动物模型的问题。该模型具有成功率高、重复性强、病理改变稳定等优势。且眼镜蛇咬伤病情较长，此制作方法获得的动物模型有助于动态分析眼镜蛇咬伤的发展进程，更贴近人类被眼镜蛇咬伤的生理病理动态过程，能够很好的符合临床实际，为临床诊断提供依据，为研究眼镜蛇蛇毒的在人体代谢变化以及蛇毒致肌肉坏死的机理提供良好的动物模型，在鉴定蛇伤种类、咬伤后临床表现、精准化治疗等方面具有很大的应用价值，并可最终评价抗蛇毒血清和抗毒蛇咬伤药物的疗效。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则以内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应该包含本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种中华眼镜蛇咬伤猪模型的制作方法及用途，其特征在于，包括：选择健康的猪，将眼镜蛇蛇毒冻干粉溶解后注射入猪腿部肌肉处，6h后可获得目标动物模型，此模型克服了以往在动物实验时容易在短时间内中毒死亡的缺点，该模型模拟人类被眼镜蛇咬伤中毒的过程，可用来研究其发病的临床表征、病理生理机制和精准化治疗等，具体包括以下两个步骤：（1）探索猪肌肉注射眼镜蛇蛇毒的LD50；（2）建立眼镜蛇咬伤的猪模型。
2.根据权利要求1所述，探索猪肌肉注射眼镜蛇蛇毒的LD50，其特征在于将眼镜蛇蛇毒冻干粉溶解于生理盐水后肌肉注射，其LD50可信区间为5-7mg/kg。
3.根据权利要求2所述，其特征在于猪腿部肌肉注射眼镜蛇蛇毒的LD50为6mg/kg。
4.根据权利要求1制备眼镜蛇咬伤的猪模型，所述其特征在于：注射眼镜蛇蛇毒的剂量根据猪的体重，以0.56～3.5mg/kg剂量配制蛇毒。
5.根据权利要求4所述，其特征在于：注射眼镜蛇蛇毒制作猪模型的最佳剂量为2mg/kg。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于蛇毒的体积按猪体重的0.2ml/kg进行注射。
7.根据权利要求1所述制备眼镜蛇咬伤的猪模型，特征在于：注射眼镜蛇毒后，观察猪的生物学行为状态包括精神运动状态、呼吸情况、眼耳口鼻分泌状况等；并结合血液检测指标的白细胞计数（WBC）、超敏C反应蛋白（hs—CRP）、乳酸脱氢酶（LDH）、AST/ALT、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等，再根据猪的心肌、肌肉组织等HE染色病理检查结果，制备眼镜蛇咬伤的猪模型。
8.根据权利要求1眼镜蛇咬伤的猪模型的用途，其特征在于：所制作的猪模型模拟眼镜蛇咬伤人类后的病理生理过程，有助于动态分析眼镜蛇咬伤后的发病临床表现和机制，该模型可为研究中华眼镜蛇蛇毒的在人体代谢变化以及肌肉坏死机理提供良好的动物模型，可用于研究在鉴定蛇伤种类、咬伤后临床表现、精准化治疗，抗毒蛇咬伤药物的筛选及抗蛇毒血清疗效的评价等方面的研究。
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