CN104721824A - 用于治疗与masp-2依赖的补体活化相关的疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗与MASP-2依赖的补体活化相关的疾病的方法。一方面,本发明提供了抑制活的受试者中MASP-2依赖的补体活化效应的方法。该方法包括给予有此需要的受试者一定量的MASP-2抑制剂的步骤,其量可有效抑制MASP-2依赖的补体活化。在一些实施方案中,MASP-2抑制剂抑制了与MASP-2介导的替代补体途径活化相关的细胞损伤,同时保持了免疫系统的经典(C1q依赖的)途径成分的完整。在另一方面,本发明提供了用于抑制凝集素依赖的补体活化效应的组合物,包括治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学可接受的载体。
Description
本申请是申请日为2005年6月9日的中国专利申请200580026986.9“用于治疗与MASP-2依赖的补体活化相关的疾病的方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及抑制MASP-2依赖的补体活化的不利效应的方法。
背景技术
补体系统提供早期作用机制来起始并增强对微生物感染和其它急性损伤的炎性应答(Liszewski,M.K.和J.P.Atkinson,1993,于Fundamental Immunology,第三版,由W.E.Paul编辑,Raven Press,Ltd.,New York)。尽管补体活化提供了针对潜在病原体的重要的第一线防御,然而促进保护性炎性应答的补体活性也可能对宿主表现出潜在的威胁(Kalli,K.R.,et al.,Springer Semin.Immunopathol.15:417-431,1994;Morgan,B.P.,Eur.J.Clinical Investig.24:219-228,1994)。例如,C3和C5蛋白水解产物征募并活化了嗜中性粒细胞。这些活化细胞不加选择地释放破坏性酶,可能造成器官损伤。此外,补体活化可能导致溶解的补体成分沉积在附近的宿主细胞以及微生物靶上,导致宿主细胞的溶解。
已经表明补体系统是许多急性和慢性疾病状况发病机理的原因,包括:心肌梗死、中风之后的血管重建、ARDS、再灌注损伤、脓毒症性休克、热烧伤之后的毛细管渗漏、心肺转流术后炎症、移植排斥、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、以及阿尔茨海默病病。在几乎所有的这些疾病中,补体都不是原因,而是发病机理中涉及到的几种因素之一。尽管如此,补体活化可能是主要的病理机制,并在许多这些疾病状况的临床控制中表现出有效之处。随着逐渐认识到各种疾病状况中补体介导的组织损伤的重要性,就增强了对于有效的补体抑制药物的需求。还没有药物被认可用于人体用途来特异性靶向并抑制补体活化。
当前,被广泛接受的是补体系统可通过三种截然不同的途径被活化:经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径通常是由结合到外源颗粒(即抗原)上的抗体引起的,因此需要预先暴露给那种抗原来产生特异性抗体。因为经典途径的活化是与免疫应答的发生相关的,所以经典途径是获得性免疫系统的一部分。相反,凝集素途径和替代途径两者不依赖于克隆性免疫,是先天性免疫系统的一部分。
经典途径活化的第一步是特异性识别分子C1q结合到结合了抗原的IgG和IgM上。补体系统的活化导致了丝氨酸蛋白酶原的连续活化。C1q与C1r和C1s丝氨酸蛋白酶酶原结合成为叫作C1的复合物,当C1q结合到免疫复合物上时,伴随C1r的Arg-Ile位点的自体水解裂解的是Clr活化了Cls,从而获得了裂解C4和C2的能力。C4裂解成称为C4a和C4b的两个片段,这使得C4b片段能够与邻近的羟基或氨基形成共价键,并随后通过与活化C2的C2b片段的非共价相互作用而产生C3转化酶(C4b2b)。C3转化酶(C4b2b)激活C3而导致C5转化酶(C4b2b3b)的产生以及能够引起微生物溶解的膜攻击复合物(C5b-9)的形成。C3和C4的活化形式(C3b和C4b)共价沉积在外源靶表面上,它们被多个吞噬细胞上的补体受体所识别。
独立地,由凝集素途径活化补体系统的第一步也是特异性识别分子的结合,接着是所结合的丝氨酸蛋白酶的活化。然而,不是由C1q结合免疫复合物,凝集素途径中的识别分子是糖类结合蛋白质(甘露聚糖结合的凝集素(MBL)、H-ficolin、M-ficolin和L-ficolin)(Lu,J.,et al.,Biochim.Biophys.Acta 1572:387-400,2002;Holmskov etal.,Annu.Rev.Immunol.21:547-578(2003);Teh et al.,Immunology 101:225-232(2000))。Ikeda et al.首先证明了MBL和C1q类似,能够以C4依赖的方式在结合到酵母甘露聚糖包被的红细胞上时活化补体系统(Ikeda,K.,et al.,J.Biol.Chem.262:7451-7454,1987)。MBL是胶原凝集素蛋白家族的成员,是钙依赖的凝集素,它以3-和4-羟基定向到吡喃糖环的赤道平面来结合糖类。因此MBL的重要配体是D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺,而不适合这种空间需求的糖类则没有可检测到的对MBL的亲和性(Weis,W.I.,et al.,Nature 360:127-134,1992)。MBL和单价糖之间的相互作用是相当微弱的,解离常数典型地在2mM的范围。MBL通过同时与多个单糖残基相互作用来达到对多糖配体紧密的、特异性的结合(Lee,R.T.,et al.,Archiv.Biochem.Biophys.299:129-136,1992)。MBL识别的糖类模式通常点缀微生物诸如细菌、酵母、寄生虫和某些病毒。相反,MBL不识别D-半乳糖和唾液酸,后两种糖通常点缀哺乳动物血浆和细胞表面糖蛋白上所存在的“成熟”复合物糖缀合物。据认为这种结合特异性有助于保护其免于自身活化。然而,MBL确实以高亲和力结合到高含量甘露糖的“前体”多糖簇上,这些簇位于哺乳动物细胞的内质网和高尔基体中所隔离的N-连接糖蛋白和糖脂上(Maynard,Y.,et al.,J.Biol.Chem.257:3788-3794,1982)。因此,损伤的细胞是经MBL结合的凝集素途径活化的潜在目标。
ficolin具有不同于MBL的不同类型的凝集素结构域,称为血纤蛋白原样结构域。ficolin以不依赖Ca++的方式结合糖残基。在人体中,已经鉴定了三种类型的ficolin,即L-ficolin、M-ficolin和H-ficolin。两种血清ficolin即L-ficolin和H-ficolin共有对N-乙酰-D-葡糖胺的特异性;然而,H-ficolin还结合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-ficolin、H-ficolin和MBL的糖特异性差异意味着不同的凝集素可能是互补的,尽管有重叠,但是可能靶向不同的糖缀合物。这个观点得到了最近报道的支持,在已知的凝集素途径的凝集素中,只有L-ficolin特异性结合到脂磷壁酸上,那是一种发现于所有革兰氏阳性菌上的细胞壁糖缀合物(Lynch,N.J.,et al.,J.Immunol.172:1198-1202,2004)。胶原凝集素(即MBL)和ficolin在氨基酸序列上不具有显著的相似性。然而,两组蛋白质具有类似的结构域组织,和C1q一样,装配成寡聚结构,这样就最大化了多位点结合的可能性。MBL的血清浓度在健康人群中是高度可变的,这是由MBL基因的启动子和编码区二者的多形性/突变所遗传控制的。作为急性期蛋白质,MBL的表达在炎症期间进一步被上调。L-ficolin在血清中以与MBL类似的浓度存在。因此,凝集素途径的L-ficolin途径在力量上与MBL途径是潜在可比的。MBL和ficolin也可能作为调理素起作用,这需要这些蛋白质与吞噬细胞受体的相互作用(Kuhlman,M.,et al.,J.Exp.Med.169:1733,1989;Matsushita,M.,etal.,J.Biol.Chem.271:2448-54,1996)。然而,还没有确定受体吞噬细胞的身份。
人MBL通过其胶原样结构域形成了与独特的Clr/Cls样丝氨酸蛋白酶之间的特异性的、高亲和力的相互作用,称为MBL结合的丝氨酸蛋白酶(MASP)。至今已经描述了三种MASP。首先,鉴别到了单酶“MASP”,其特征是作为负责起始补体级联(即裂解C2和C4)的酶(Ji,Y.H.,et al.,J.Immunol.150:571-578,1993)。随后,证明了MASP事实上是两种蛋白酶的混合物:MASP-1和MASP-2(Thiel,S.,et al.,Nature 386:506-510,1997)。然而,证实了对于补体活化来说,MBL-MASP-2复合物单独就足够了(Vorup-Jensen,T.,et al.,J.Immunol.165:2093-2100,2000)。而且,只有MASP-2快速裂解C2和C4(Ambrus,G.,et al.,J.Immunol.170:1374-1382,2003)。因此,MASP-2是负责活化C4和C2来产生C3转化酶C4b2b的蛋白酶。这是与C1复合物显著的差异,在后者中是两种特异性丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)的协同作用导致了补体系统的活化。最近,已经分离到了第三种新的蛋白酶MASP-3(Dahl,M.R.,et al.,Immunity15:127-35,2001)。MASP-1和MASP-3是同一基因的选择性剪接产物。MASP-1和MASP-3的生物学功能仍然留待解决。
MASP与C1复合物的酶成分C1r和C1s共有相同的结构域组织(Sim,R.B.,et al.,Biochem.Soc.Trans.28:545,2000)。这些结构域包括N末端Clr/Cls/海胆Vegf/骨形成蛋白(CUB)结构域,表皮生长因子样结构域,第二CUB结构域,串联的补体调控蛋白结构域,丝氨酸蛋白酶结构域。与在C1蛋白酶中一样,MASP-2的活化是通过丝氨酸蛋白酶结构域邻近的Arg-Ile键的裂解而发生的,这将酶分裂成了二硫键连接的A链和B链,后者包括了丝氨酸蛋白酶结构域。最近,描述了MASP-2的遗传决定缺陷(Stengaard-Pedersen,K.,et al.,New Eng.J.Med.349:554-560,2003)。单个核苷酸的突变导致了CUB 1结构域的Asp-Gly交换,使得MASP-2不能结合到MBL上。
MBL也与称为MBL结合蛋白的19kDa的非酶蛋白(MApl9)(Stover,C.M.,J.Immunol.162:3481-90,1999)或者小MBL结合蛋白(sMAP)(Takahashi,M.,et al.,Int.Immunol.11:859-863,1999)相结合。Map19是通过MASP 2基因产物的选择性剪接而形成的,包括MASP-2的头两个结构域,接着四个独特氨基酸的额外序列。MASP 1和MASP 2基因分别位于染色体3和1上(Schwaeble,W.,etal.,Immunobiology 205:455-466,2002)。
几条证据表明存在不同的MBL-MASP复合物,血清中的总MASP的大部分不与MBL复合(Thiel,S.,et al.,J.Immunol.165:878-887,2000)。H-和L-ficolin两者与MASP结合,活化了凝集素补体途径,MBL也是这样(Dahl,M.R.,et al.,Immunity 15:127-35,2001;Matsushita,M.,et al.,J.Immunol.168:3502-3506,2002)。凝集素途径和经典途径两者形成了共同的C3转化酶(C4b2b),两条途径在这一步会合了。
人们广泛认为凝集素途径在宿主防御感染中具有主要作用。MBL参与宿主防御的有力证据来自于对患者功能性MBL血清水平降低的分析(Kilpatrick,D.C.,Biochim.Biophys.Acta 1572:401-413,2002)。这些患者显示出对复发性细菌和真菌感染的易感性。这些症状通常在年轻时是明显的,这是在由于源自母体的抗体滴度减少的明显危险期,但是又在抗体应答发展完全之前。这种症状经常是由于MBL成胶部分的几个位点的突变引起的,其妨碍了MBL寡聚体的正确形成。然而,由于MBL可以作为不依赖于补体的调理素起作用,所以还不知道对感染的易感性增加在多大程度上是由于受损的补体活化。
尽管有广泛的证据暗示了在非感染性人体疾病的发病机理中存在经典补体途径和替代补体途径两者,然而凝集素途径的作用才刚刚开始评估。最近的研究提供了这样的证据,凝集素途径可能负责缺血/再灌注损伤中的补体活化和相关炎症。Collard et al.(2000)报道,将培养的内皮细胞进行氧化应激结合MBL,显示了暴露于人血清时的C3沉积(Collard,C.D.,et al.,Am.J.Pathol.156:1549-1556,2000)。此外,用封闭性抗-MBL单克隆抗体的人血清的治疗抑制了MBL结合和补体活化。将这些发现延伸到心肌缺血/再灌注鼠模型上,其中用针对大鼠MBL的封闭抗体处理的大鼠与用对照抗体处理的大鼠相比,当冠状动脉阻塞时,前者显示了显著更少的心肌损伤(Jordan,J.E.,et al.,Circulation 104:1413-1418,2001)。氧化应激后MBL结合到血管内皮上的分子机制是不清楚的;最近的研究表明,氧化应激后凝集素途径的活化可能是可能是通过MBL结合到血管内皮细胞角蛋白上来介导的,而不是结合到糖缀合物上(Collard,C.D.,et al.,Am.J.Pathol.159:1045-1054,2001)。其它研究已经暗示,缺血/再灌注损伤的发病机理中的经典途径和替代途径与凝集素途径在这种疾病中的作用仍然是有争议的(Riedermann,N.C.,et al.,Am.J.Pathol.162:363-367,2003)。
与经典途径和凝集素途径相反,没有发现替代途径中完成识别功能的引发剂,在其它两种途径中是C1q和凝集素来完成的。目前广泛接受的是,替代途径是由外源的或其它异常表面(细菌、酵母、病毒感染细胞或者损伤组织)所自然引起的。有四种血浆蛋白直接参与替代途径:C3、因子B和D、以及备解素。天然C3水解形成C3b需要替代途径来进行。由于替代途径C3转化酶(C3bBb)包含C3b作为必需亚基,关于经替代途径的第一个C3b的来源问题出现了令人迷惑的问题,已经激发了相当多的研究。
C3属于含有很少的称为硫酯键的翻译后修饰的这样一族蛋白质(还有C4和α-2巨球蛋白)。硫酯基团由谷氨酰胺的末端羰基结合到三个氨基酸距离的半胱氨酸的巯基上所组成。这个键是不稳定的,谷氨酰胺的亲电羰基可以与其它分子通过羟基或氨基形成共价键。当被隔离在完整C3的疏水袋内部时,硫酯键是相当稳定的。然而,C3水解裂解成C3a和C3b导致了C3b上高反应性的硫酯键的暴露,通过该机制C3b共价结合到靶上。除了C3b共价结合到补体靶上的公知作用外,有人也认为C3硫酯具有引起替代途径的关键作用。根据广泛接受的“空转理论”,替代途径是由液相转化酶iC3Bb的形成所起始的,iC3Bb是由C3与水解硫酯(iC3;C3(H2O))和因子B形成的(Lachmann,P.J.,et al.,Springer Semin.Immunopathol.7:143-162,1984)。C3b类似的iC3是由天然C3经蛋白质中内部硫酯的缓慢自发水解所产生的(Pangburn,M.K.,et al.,J.Exp.Med.154:856-867,1981)。通过iC3Bb转化酶的活性,C3b分子被沉积在靶表面,从而起始替代途径。
关于替代途径活化的引发剂知道得很少。人们认为活化剂包括酵母细胞壁(酵母聚糖)、许多纯的多糖、兔红细胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫以及受损细胞。这些活化剂所共有的唯一特征就是糖类的存在,但是糖类结构的复杂性和多样性使得很难确定共有的分子决定子,这是公认的。
替代途径也可能提供对于凝集素/经典途径C3转化酶(C4b2b)强力的放大循环,因为产生的任何C3b都能与因子B一起参与形成另外的替代途径C3转化酶(C3bBb)。替代途径C3转化酶是通过备解素的结合而稳定的。备解素延长了替代途径C3转化酶的半衰期六到十倍。添加C3b给C3转化酶将引起替代途径C5转化酶的形成。
所有三种途径(即经典、凝集素和替代)都被认为会合于C5,它被裂解以形成带有多种促炎效应的产物。会合途径已经被称为终端补体途径。C5a是最强的过敏毒素,诱导平滑肌和血管紧张度以及血管通透性的改变。它也是嗜中性粒细胞和单核细胞两者的强力化学趋化剂和活化剂。C5a介导的细胞活化能够通过诱导多种另外的炎性介质包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢物和活性氧物质的释放来显著放大炎性应答。C5裂解导致了C5b-9的形成,它也被称为膜攻击复合物(MAC)。现在有强有力的证据表明,亚溶解的MAC沉积除了作为溶解性孔形成复合物的作用外,可能还在炎症中发挥重要作用。
发明内容
在一方面,本发明提供了抑制活的受试者中MASP-2依赖的补体活化不利效应的方法。该方法包括给予有此需要的受试者一定量的MASP-2抑制剂的步骤,该量可有效抑制MASP-2依赖的补体活化。在这方面,短语“MASP-2依赖的补体活化”是指经凝集素依赖的MASP-2系统发生的替代途径补体活化。在发明的另一方面,MASP-2抑制剂经凝集素依赖的MASP-2系统抑制了补体活化,基本没有抑制经经典或C1q依赖的系统的补体活化,这样C1q依赖的系统保持了功能性。
在本发明这些方面的一些实施方案中,MSAP-2抑制剂是抗MASP-2抗体或其片段。在更多的实施方案中,抗MASP-2抗体具有降低的效应物功能。在一些实施方案中,MASP-2抑制剂是MASP-2抑制肽或非肽的MASP-2抑制剂。
在另一方面,本发明提供了用于抑制MASP-2依赖的补体活化的不利效应的组合物,包括治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学可接受的载体。也提供了用于制造药物的方法,该药物用于抑制有此需要的活的受试者中MASP-2依赖的补体活化的不利效应的用途,包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂。也提供了用于制造药物的方法,该药物用于抑制MASP-2依赖的补体活化用途中,用于本文下面描述的每种状况、疾病和失调的治疗。
本发明的方法、组合物和药物对于体内抑制哺乳动物受试者中的MASP-2依赖的补体活化的不利效应是有用的,包括患有如本文进一步描述的急性或慢性病理状况或损伤的人。这样的疾病和损伤包括但不限于在相关的自身免疫失调和/或炎症状况中的MASP-2介导的补体活化。
在发明的一方面,提供了用于治疗缺血再灌注损伤的方法,其通过用存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂来治疗患有缺血再灌注的受试者,所述缺血再灌注包括但不限于主动脉瘤修复之后、心肺转流术、与例如器官移植(如心、肺、肝、肾)和/或四肢/指趾再植相关的血管吻合术、中风、心肌梗死、休克和/或外科手术之后的血液动力学复苏。
在发明的一方面,提供了用于抑制动脉粥样硬化的方法,其通过用存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂来治疗患有或易患动脉粥样硬化的受试者。
在发明的一方面,提供了用于抑制患有血管病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述血管病包括但不限于心血管病、脑血管病、外周(如肌骨骼)血管病、肾血管病、肠系膜/肠血管、以及移植和/再植的血管重建,其通过用治疗有效量的MASP-2抑制剂来治疗这些患者。这些病包括但不限于:血管炎,包括Henoch-Schonlein紫癜肾炎、系统性红斑狼疮相关的血管炎、类风湿性关节炎相关的血管炎(也称为恶性类风湿性关节炎)、免疫复合物血管炎、以及无脉症(Takayasu's disease);扩张型心肌病;糖尿病性血管病;川崎病(动脉炎);静脉气栓(VGE);和/或支架安置之后的再狭窄、动脉粥样斑块旋切术和/或经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有炎性肠胃失调的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述失调包括但不限于胰腺炎、憩室炎和包括Crohn氏病的肠失调、溃疡性结肠炎、以及肠易激综合征。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有肺疾病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述肺疾病包括但不限于急性呼吸窘迫综合征、输液相关的急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基底膜病(古德帕斯彻病)、胎粪吸入综合征、闭塞性细支气管炎综合征、特发性肺纤维化、烧伤继发的急性肺损伤、非心原性肺水肿、输液相关的呼吸抑制以及肺气肿。
在发明的另一方面,提供了用于抑制曾经进行、正在进行或者将要进行体外再灌注程序的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述手术包括但不限于血液透析、血浆置换、白细胞置换、体外循环膜加氧器(ECMO)、肝素诱导的体外膜式氧合LDL沉淀(HELP)以及心肺转流术(CPB)。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有肌肉骨骼病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述肌肉骨骼病包括但不限于骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风、神经病性关节病、银屑病关节炎、强直性脊椎炎、或者其它脊柱关节病和结晶体关节病、或者系统性红斑狼疮(SLE)。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有肾病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述肾病包括但不限于肾小球膜增生性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎(肾小球膜毛细管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎、狼疮肾炎、过敏性紫癜肾炎或者IgA肾病。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有皮肤病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述皮肤病包括但不限于银屑病、自身免疫性大疱性皮肤病、嗜酸性海绵样水肿、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症和妊娠疱疹以及其它皮肤病、或者涉及毛细管渗漏的热烧伤或化学烧伤所引起的皮肤病。
在发明的另一方面,提供了用于抑制进行过器官或其它组织移植的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述移植包括但不限于整体器官(如肾、心、肝、胰、肺、角膜等)或移植物(如瓣膜、腱、骨髓等)的同种异体移植或异种移植。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有中枢神经系统紊乱或损伤或者周围神经系统紊乱或损伤的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述失常或损伤包括但不限于多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、格-巴综合征、中风之后的再灌注、退行性椎间盘、脑外伤、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、Miller-Fisher综合征、脑外伤和/或出血、脱髓鞘以及脑膜炎。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有血液病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述血液病包括但不限于严重脓毒症、脓毒症性休克、脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征、以及全身性炎性应答综合征。提供了用于治疗其它血液病的相关方法,包括但不限于失血性休克、溶血性贫血、自身免疫性血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)、溶血性尿毒症综合征(HUS)或者其它骨髓/血液破坏性疾病。
在发明的另一方面,提供了抑制患有泌尿生殖疾病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述泌尿生殖疾病包括但不限于疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎和间质性膀胱炎、男性和女性不育、胎盘功能障碍以及流产和先兆子痫。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有非肥胖性糖尿病(1型糖尿病或胰岛素依赖的糖尿病)或者1型或2型(成人起病)糖尿病的血管病、神经病或视网膜病变并发症的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法。
在发明的另一方面,提供了用于抑制正在化疗治疗和/或放射治疗的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,包括但不限于癌症的治疗,其通过在化疗治疗前后或放射治疗前后给予这样的患者MASP-2抑制剂,即在化疗治疗和/或放射治疗进行之前和/或期间和/或之后给予。MASP-2抑制剂的化疗治疗前后或放射治疗前后的给予可能对于降低化疗治疗或放射治疗的副作用是有用的。在发明更进一步的方面,提供了用于治疗恶性肿瘤的方法,其通过将存在于药学可接受载体中的MASP-2抑制剂给予患有恶性肿瘤的患者。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有内分泌失调的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,其通过给予存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂给这样的受试者。根据本发明进行治疗的疾病,作为非限制性的例子可包括桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、应激、焦虑以及涉及来自垂体的促乳素、生长因子或胰岛素样生长因子和促肾上腺皮质激素受调节释放的其它潜在激素失调。
在发明的另一方面,提供了用于抑制患有衰老相关黄斑变性或者其它补体介导的眼病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,其通过给予存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂给患有这样疾病的受试者。
附图说明
通过参考下面的详细描述连同附图,本发明前述的方面以及许多附带的优点将更容易领会,同样也更好理解,其中:
通过参考下面的详细描述连同附图,本发明前述的方面以及许多附带的优点将更容易领会,同样也更好理解,其中:
图1是图解替代补体途径的补体活化需要凝集素途径依赖的MASP-2活化这一新发现的流程图;
图2是图解人MASP-2基因组结构的图;
图3A是图解人MASP-2蛋白的结构域结构的示意图;
图3B是图解人Map19蛋白的结构域结构的示意图;
图4是图解鼠MASP-2敲除策略的图;
图5是图解人MASP-2微基因构建体的图;
图6A提供了证明MASP-2缺乏导致凝集素途径介导的C4活化丧失的结果,如通过甘露聚糖上沉积的C4b缺乏所测定的;
图6B提供了证明MASP-2缺乏导致凝集素途径介导的C4活化丧失的结果,如通过酵母聚糖上沉积的C4b缺乏所测定的;
图6C提供了证明获自MASP-2+/-;MASP-2-/-和野生型品系的血清样品的相对C4活化水平的结果,如通过甘露聚糖和酵母聚糖上的C4b沉积所测定的;
图7A提供了证明MASP-2缺乏导致凝集素途径介导的以及替代途径介导的C3活化丧失的结果,如通过甘露聚糖上沉积的C3b缺乏所测定的;
图7B提供了证明MASP-2缺乏导致凝集素途径介导的以及替代途径介导的C3活化丧失的结果,如通过酵母聚糖上沉积的C3b缺乏所测定的;
图8提供了证明加入鼠重组MASP-2到MASP-2-/-血清样品中,就以蛋白浓度依赖的方式恢复了凝集素途径介导的C4活化的结果,如通过甘露聚糖上的C4b沉积所测定的;
图9提供了证明MASP-2-/-品系中经典途径是有功能的;以及
图10提供了证明MASP-2依赖的补体活化系统在缺血/再灌注阶段中是在腹主动脉瘤修复之后被活化的这一结果。
序列表描述
SEQ ID NO:1 人MAp 19cDNA
SEQ ID NO:2 人Map l9蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO:3 人MApl9蛋白(成熟的)
SEQ ID NO:4 人MASP-2cDNA
SEQ IDNO:5 人MASP-2蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO:6 人MASP-2蛋白(成熟的)
SEQ ID NO:7 人MASP-2gDNA(外显子1-6)
抗原:(根据MASP-2成熟蛋白)
SEQ ID NO:8 CUBI序列(aa 1-121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF序列(aa 1-166)
SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII(aa 1-293)
SEQ IDNO:11 EGF区域(aa 122-166)
SEQ ID NO:12 丝氨酸蛋白酶结构域(aa 429-671)
SEQ ID NO:13 失活的丝氨酸蛋白酶结构域(aa 610-625,带有Ser618到Ala的突变)
SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL(CUB 1肽)
SEQ ID NO:15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ(CUBI肽)
SEQ ID NO:16 TFRSDYSN(MBL结合区核心)
SEQ ID NO:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF(MBL结合区)
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG(EGF肽)
SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV(丝氨酸蛋白酶结合核心)
肽抑制剂:
SEQ ID NO:20 MBL全长cDNA
SEQ ID NO:21 MBL全长蛋白
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP(结合共有序列)
SEQ ID NO:23 OGKLG
SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G
SEQ ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPOGPO
SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG
SEQ ID NO:27GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEO GDO(人h-ficolin)
SEQ ID NO:28GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPN GAOGEO(人ficolin p35)
SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI(C4裂解位点)
表达抑制剂:
SEQ ID NO:30 CUBI-EGF结构域的cDNA(SEQ ID NO:4的核苷酸22-680)
SEQ ID NO:31 5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCC TGGGC 3'SEQ ID NO:4的核苷酸12-45,包括MASP-2翻译起始位点(有义链)
SEQ ID NO:325'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAG AAG 3'SEQ ID NO:4的核苷酸361-396,编码包括MSAP-2MBL结合位点的区域(有义链)
SEQID NO:335'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCC AAA 3'SEQ ID NO:4的核苷酸610-642,编码包括CUBII结构域的区域
克隆引物:
SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC(用于CUB的5'PCR)
SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA(用于CUB的3'PCR)
SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT(用于CUBIEGF的3'PCR)
SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT(用于CUBIEGFCUBII的3'PCR)
SEQ ID NO:38-47 是用于人源化抗体的克隆引物
SEQ ID NO:48 是9个氨基酸的肽键
表达载体:
SEQ ID NO:49 是MASP-2微基因插入序列
SEQ ID NO:50 是鼠MASP-2cDNA
SEQ ID NO:51 是鼠MASP-2蛋白(w/前导序列)
SEQ ID NO:52 是成熟鼠MASP-2蛋白
SEQ ID NO:53 是大鼠MASP-2cDNA
SEQ ID NO:54 是大鼠MASP-2蛋白(w/前导序列)
SEQ ID NO:55 是成熟大鼠MASP-2蛋白
SEQ ID NO:56-59 是用于人MASP-2的定点诱变的寡核苷酸,所述人MSAP-2用来产生人MASP-2A
SEQ ID NO:60-63 是用于鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸,所述鼠MSAP-2用来产生鼠MASP-2A
SEQ ID NO:64-65 是用于大鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸,所述大鼠MSAP-2用来产生大鼠MASP-2A
具体实施方式
本发明是基于本发明人的惊人发现,即需要MASP-2来起始替代补体途径的活化。通过使用敲除小鼠模型MSAP-2-/-,本发明人已经证明了经凝集素介导的MASP-2途径抑制替代补体途径的活化而同时保持经典途径的完整是可能的,从而确定了凝集素依赖的MASP-2活化是缺少经典途径的替代补体活化所需要的。本发明也描述了MASP-2作为治疗靶的用途,用于抑制凝集素介导的替代补体途径活化相关的细胞损伤而同时保持免疫系统经典(C1q依赖的)途径成分的完整。
I.定义
除非本文明确定义,本文使用的所有术语都具有如本发明的领域中那些普通技术人员所理解的同样的意义。下面提供的定义是为了提供它们在用于说明书和权利要求书中描述本发明时关于这些术语的明确意义。
如本文使用的,术语“MASP-2依赖的补体活化”是指经凝集素依赖的MASP-2活化而发生的替代途径补体活化。
如本文使用的,术语“替代途径”是指由例如酵母聚糖引起的补体活化,所述酵母聚糖来自真菌和酵母细胞壁、革兰氏阴性外膜的脂多糖(LPS)、兔红细胞,也来自许多纯的多糖、兔红细胞、病毒、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞,在传统上一直认为是由来自补体因子C3的C3b的自发水解形成而引起的。
如本文使用的,术语“凝集素途径”是指经血清和非血清糖类结合蛋白包括甘露聚糖结合的凝集素(MBL)和ficolin的特异性结合而发生的补体活化。
如本文使用的,术语“经典途径”是指由结合到外源颗粒上的抗体引起的补体活化,其需要识别分子C1q的结合。
如本文使用的,术语“MSAP-2抑制剂”是指任何结合MASP-2或与MASP-2相互作用并有效抑制MASP-2依赖的补体活化的试剂,包括抗MASP-2抗体及其MASP-2结合片段、天然和合成肽、小分子、可溶的MASP-2受体、表达抑制剂和分离的天然抑制剂。在本发明的方法中有用的MASP-2抑制剂可能降低了MASP-2依赖的补体活化超过20%,诸如超过50%,诸如超过90%。在一个实施方案中,MASP-2抑制剂降低了MASP-2依赖的补体活化超过90%(即导致了仅仅10%或更少的MASP-2活化)。
如本文使用的,术语“抗体”包括源自任何产生抗体的哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔和包括人在内的灵长动物)的抗体及其抗体片段,其特异性结合到MASP-2多肽或其部分。典型的抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体;多特异性抗体(如双特异性抗体);人源化抗体;鼠抗体;嵌合的小鼠-人、小鼠-灵长动物、灵长动物-人单克隆抗体;和抗独特型抗体,以及可以是任何完整分子或其片段。
如本文使用的,术语“抗体片段”是指源自或涉及全长抗MASP-2抗体的部分,一般包括抗原结合或其可变区。抗体片段的例证性例子包括由抗体片段形成的Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、二体、线性抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。
如本文使用的,“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于单个多肽链上。一般地,Fv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽接头,这使得scFv能够形成期望的抗原结合结构。
如本文使用的,术语“嵌合抗体”是含有源自非人物种(如啮齿动物)抗体的可变结构域和互补决定区的重组抗体,而抗体分子的剩余部分是源自人抗体。
如本文使用的,术语“人源化抗体”是包括与源自非人免疫球蛋白的、植入人抗体框架中的特异性互补决定区相一致的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体典型地是这样的重组蛋白,其中只有抗体互补决定区是非人来源的。
如本文使用的,术语“甘露聚糖结合的凝集素”(“MBL”)等同于结合甘露聚糖的蛋白质(“MBP”)。
如本文使用的,“膜攻击复合物”(“MAC”)是指插入并破坏膜的五种终端补体成分(C5-C9)的复合物。也称为C5b-9。
如本文使用的,“受试者”包括所有哺乳动物,包括但不限于人、非人灵长动物、狗、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿动物。
如本文使用的,氨基酸残基如下缩写:丙氨酸(Ala;A),天冬酰胺(Asn;N),天冬氨酸(Asp;D),精氨酸(Arg;R),半胱氨酸(Cys;C),谷氨酸(Glu;E),谷胺酰胺(Gln;Q),甘氨酸(Gly;G),组氨酸(His;H),异亮氨酸(Ile;I),亮氨酸(Leu;L),赖氨酸(Lys;K),甲硫氨酸(Met;M),苯丙氨酸(Phe;F),脯氨酸(Pro;P),丝氨酸(Ser;S),苏氨酸(Thr;T),色氨酸(Trp;W),酪氨酸(Tyr;Y)以及丙氨酸(Val;V)。
在最广的意义上,天然产生的氨基酸可根据相应氨基酸侧链的化学特性而分组。“疏水”氨基酸意指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或者Pro。“亲水”氨基酸意指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或者His。该组氨基酸可进一步如下再细分类。“中性亲水”氨基酸意指Ser、Thr、Asn或者Gln。“酸性”氨基酸意指Glu或Asp。“碱性”氨基酸意指Lys、Arg或者His。
如本文使用的,术语“保守的氨基酸取代”通过下面每组中的氨基酸之间的取代来例证说明:(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;(3)丝氨酸和苏氨酸;(4)天冬氨酸和谷氨酸;(5)谷胺酰胺和天冬酰胺;(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
本文使用的术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物的寡聚体或多聚体。这个术语也包括那些由天然产生的核苷酸、糖和共价核苷酸间(主链)键合以及具有非天然产生的修饰的寡核苷酸所组成的寡核碱基。
II.替代途径:新的理解
补体的替代途径首先是由Louis Pillemer和他的同事在1950年代早期描述的,是基于酵母细胞壁制备的酵母聚糖用于活化补体这一研究(Pillemer,L.et al.,J.Exp.Med.103:1-13,1956;Lepow,I.H.,J.Immunol.125:471-478,1980)。从那时起到现在,酵母聚糖一直被认为是人和啮齿动物血清中替代途径的特异性活化剂的标准例子(Lachmann,P.J.,et al.,Springer Semin.Immunopathol.7:143-162,1984;Van Dijk,H.,et al.,J.Immunol.Methods 85:233-243,1985;Pangburn,M.K.,Methods in Enzymol.162:639-653,1988)。用于替代途径活化的方便而广泛使用的分析方法是用包被酵母聚糖的塑料孔温育血清并确定温育之后沉积在固相上的C3b的量。正如所料,用正常小鼠血清温育之后,在酵母聚糖包被的孔上出现了大量的C3b沉积(图7B)。然而,用酵母聚糖包被的孔温育来自纯合MASP-2缺乏小鼠的血清产生了与正常血清相比C3b沉积实质性的减少。此外,在该分析中使用MASP 2基因缺乏的杂合小鼠的血清产生的C3b沉积水平在以纯合MASP-2缺乏小鼠的血清和正常小鼠血清得到的C3b沉积水平的中间。使用另一种已知的活化替代途径的多糖甘露聚糖包被的孔也获得了同样的结果(图7A)。由于除了MASP 2基因之外正常小鼠和MASP-2缺乏小鼠共有相同的遗传背景,因此这些意外的结果证明了MASP-2在替代途径活化方面起着基本作用。
这些结果提供了有力的证据,证明替代途径并非象基本上所有有关补体的流行的医学教科书和最近的评论文章中所述的那样是不受限制的、独立的补体活化途径。流行的并广泛被支持的科学观点是,替代途径是在某些微粒靶(微生物、酵母聚糖、兔红细胞)表面上通过自发的“空转”C3活化的扩大而被活化的。然而,在MASP-2敲除小鼠血清中通过两种公知的补体途径“活化剂”没有产生显著的替代途径活化,这使得“空转理论”描述补体活化的重要生理机制是不太可能的。
由于已知MASP-2蛋白酶作为负责凝集素补体级联起始的酶具有特异的和明确的作用,因此这些结果暗示了由酵母聚糖和甘露聚糖导致的凝集素途径的活化是随后的替代途径活化关键性的第一步。C4b是由凝集素途径产生的活化产物,而不是由替代途径产生的。与这个观点相一致,用酵母聚糖或甘露聚糖包被的孔来温育正常小鼠血清导致了C4b沉积在孔上,当用MASP-2缺乏小鼠的血清来温育包被孔时,这种C4b沉积实质性减少了(图6A、6B和6C)。
除了作为补体激活的独立途径这一被广泛接受的作用之外,替代途径也能提供经经典途径和凝集素途径初始引起的补体活化的放大循环(Liszewski,M.K.和J.P.Atkinson,1993,于FundamentalImmunology,第三版,由W.E.Paul编辑,Raven Press,Ltd.,NewYork;Schweinie,J.E.,et al.,J.Clin.Invest.84:1821-1829,1989)。在这种替代途径介导的放大机制中,通过经典或凝集素补体级联活化而产生的C3转化酶(C4b2b)裂解C3成为C3a和C3b,从而提供了能够参与形成C3bBb的C3b,C3bBb是替代途径C3转化酶。在MASP-2敲除血清中替代途径活化缺乏的可能解释是,由酵母聚糖、甘露聚糖以及其它推定的替代途径“活化剂”产生的初始补体活化需要凝集素途径,而替代途径对于放大补体活化起到了关键性作用。换句话说,替代途径是依赖凝集素和经典补体途径来活化的前馈放大循环,而不是独立的线性级联。
补体级联并不是如以前预想那样是通过三条截然不同的途径(经典、替代和凝集素途径)被活化的,我们的结果表明,将补体看成由两种主要系统组成是更准确的,大致上相当于补体免疫防御系统的先天性(凝集素)和获得性(经典)部分。凝集素(MBP、M-ficolin、H-ficolin和L-ficolin)是引起先天性补体系统的特异性识别分子,该系统包括凝集素途径和相关的替代途径放大循环。C1q是引起获得性补体系统的特异性识别分子,该系统包括经典途径和相关的替代途径放大循环。我们将这两个主要的补体活化系统分别称为凝集素依赖的补体系统和C1q依赖的补体系统。
除了在免疫防御中的基本作用,补体系统是许多临床疾病中组织损伤的原因。因此,有迫切的需要来发展治疗有效的补体抑制剂以抑制这些不利效应。当识别了补体是由两个主要的补体活化系统组成时,就认识到了只特异性抑制引起特定病理的补体活化系统而不完全停止补体的免疫防御能力将是非常值得期待的。例如,在补体活化主要是由凝集素依赖的补体系统介导的疾病中,只特异性抑制这个系统将是有利的。这将保持C1q依赖的补体活化系统的完整以处理免疫复合物加工以及帮助宿主防御感染。
在研发治疗剂中为特异性抑制凝集素依赖的补体系统而靶向的优选蛋白成分是MASP-2。在凝集素依赖的补体系统的所有蛋白成分(MBL、H-ficolin、M-ficolin、L-ficolin、MASP-2、C2-C9、因子B、因子D和备解素)中,只有MASP-2是凝集素依赖的补体系统所独有的并且是这个系统起作用所需要的。凝集素(MBL、H-ficolin、M-ficolin和L-ficolin)也是凝集素依赖的补体系统中独有的成分。然而,这些凝集素成分任何之一的丧失并不必然抑制系统活化,这是由于凝集素冗余。为了保证抑制凝集素依赖的补体活化系统,抑制所有四种凝集素将是必要的。此外,由于MBL和ficolin也是已知的具有不依赖于补体的调理素活性,凝集素功能的抑制将导致这种有利的宿主防御感染的机制的丧失。相反,如果MASP-2是抑制靶的话,这种不依赖于补体的凝集素调理素活性会保持完整。MASP-2作为治疗靶抑制凝集素依赖的补体活化系统的另外好处是,MASP-2的血浆浓度是所有补体蛋白中最低的(约500ng/ml);因此,相对地,为得到完全抑制可能只需要低浓度的高亲和性MASP-2抑制剂(Moller-Kristensen,M.,et al.,J.Immunol Methods 282:159-167,2003)。
III.MASP-2在各种疾病和状况中的作用以及使用MASP-2抑制剂的治疗方法
缺血再灌注损伤
当血流在缺血延长期之后恢复时就会发生缺血再灌注损伤(I/R)。它是大量疾病的发病和死亡的共同原因。外科手术患者在主动脉瘤修复、心肺转流术、与例如器官移植(如心、肺、肝、肾)和/或四肢/指趾再植相关的血管吻合术、中风、心肌梗死、休克和/或外科手术之后的血液动力学复苏之后是脆弱的。有动脉粥样硬化疾病的患者易于心肌梗死、中风、以及血栓诱导的肠和下肢缺血。有创伤的患者常常遭受四肢的临时缺血。此外,大量血液损失的任何原因都导致全身I/R反应。
I/R损伤的病理生理学是复杂的,至少有两个主要因素参与这个过程:补体活化和嗜中性粒细胞刺激,伴随着氧自由基介导的损伤。在I/R损伤中,补体活化是超过30年之前在心肌梗死期间首先被描述的,已经产生了关于补体系统对I/R组织损伤的贡献方面的许多研究(Hill,J.H.,et al.,J.Exp.Med.133:885-900,1971)。积累的证据现在表明补体是I/R损伤中的关键介质。补体抑制已经在几种I/R动物模型中限制损伤方面成功了。在早期的研究中,注入眼镜蛇毒因子之后实现了C3的缺失,据报道在肾和心的I/R期间是有利的(Maroko,P.R.,et al.,1978,J.Clin Invest.61:661-670,1978;Stein,S.H.,et al.,Miner Electrolyte Metab.11:256-61,1985)。然而,补体受体(sCR1)的可溶形式是利用来预防心肌I/R损伤的第一个补体特异性抑制剂(Weisman,H.F.,et al.,Science 249:146-51,1990)。心肌I/R期间的sCR1治疗减少了梗死形成,所述梗死形成是与沿冠状内皮的C5b-9复合物的沉积减少和再灌注之后的淋巴细胞浸润减少相关的。
在实验性心肌I/R中,在再灌注之前给予C1酯酶抑制剂(C1 INH)预防了C1q的沉积并显著减少了心肌坏死的区域(Buerke,M.,et al.,1995,Circulation 91:393-402,1995)。C3遗传缺陷的动物在骨骼肌或肠缺血之后具有更少的局部组织坏死(Weiser,M.R.,et al.,J.Exp.Med.183:2343-48,1996)。
膜攻击复合物是补体介导损伤的最终手段,C5缺乏动物的研究已经表明了I/R损伤模型中局部和间接损伤的减少(Austen,W.G.Jr.,et al.,Surgery 126:343-48,1999)。当在鼠的肠再灌注开始之前和之后都给予补体活化抑制剂即可溶的Crry(补体受体相关基因Y),已经显示出对于防止损伤是有效的(Rehrig,S.,et al.,J.Immunol.167:5921-27,2001)。在骨骼肌缺血模型中,当在再灌注开始之后给予时,可溶的补体受体1(sCR1)的使用也减少了肌肉损伤(Kyriakides,C.,et al.,Am.J.Physiol.Cell Physiol.281:C244-30,2001)。在心肌I/R的猪模型中,在再灌注之前用针对过敏毒素C5a的单克隆抗体(“MoAb”)处理的动物显示了减少的梗死形成(Amsterdam,E.A.,et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.268:H448-57,1995)。用C5MoAb处理的大鼠证明了心肌膜中梗死面积、嗜中性粒细胞浸润和凋亡的减少(Vakeva,A.,et al.,Circulation 97:2259-67,1998)。这些实验结果突出了I/R损伤的发病机理中补体活化的重要性。
还不清楚主要是哪种补体途径(经典、凝集素或替代)参与了I/R损伤中的补体活化。Weiser et al.证明了凝集素和/或经典途径在骨骼I/R期间的重要作用,根据血管渗透性的显著降低而显示出保护了C3和C4敲除小鼠的I/R损伤(Weiser,M.R.,et al.,J.Exp.Med.183:2343-48,1996)。相反,用C4敲除小鼠进行的肾I/R实验证明没有显著的组织保护,而C3、C5和C6敲除小鼠则被保护了免受损伤,这表明肾I/R损伤期间的补体活化是经由替代途径的(Zhou,W.,et al.,J.Clin.Invest.105:1363-71,2000)。使用因子D缺乏小鼠,Stahl et al.最近提供了关于替代途径在小鼠的肠I/R中的重要作用的证据(Stahl,G.,et al.,Am.J.Pathol.162:449-55,2003)。相反,Williams et al.表明了经典途径对于小鼠的肠I/R损伤起始的主要作用,显示了在C4和IgM(Rag1-/-)缺乏小鼠中C3的器官染色的减少并防止了损伤(Williams,J.P.,et al.,J.Appl.Physiol.86:938-42,1999)。
用抗大鼠甘露聚糖结合的凝集素(MBL)的单克隆抗体在心肌I/R模型中处理大鼠导致了缺血后再灌注损伤的减少(Jordan,J.E.,et al.,Circulation 104:1413-18,2001)。MBL抗体也在氧化应激之后减少了内皮细胞上的体外补体沉积,表明凝集素途径在心肌I/R损伤中的作用(Collard,C.D.,et al.,Am.J.Pathol.156:1549-56,2000)。也有证据表明一些器官中的I/R损伤可能由称为天然抗体的IgM特定类别以及经典途径的活化所介导(Fleming,S.D.,et al.,J.Immunol.169:2126-33,2002;Reid,R.R.,et al.,J.Immunol.169:5433-40,2002)。
补体活化的几种抑制剂已经被研发成为预防由心肌I/R并发症引起的发病和死亡的潜在治疗剂。这些抑制剂中的两种sCR1(TP10)和人源化抗C5 scFv(Pexelizumab)已经完成了第II阶段临床试验。Pexelizumab已经又完成了第III阶段临床试验。尽管TP10在早期第I/II阶段试验中具有良好耐受性并对患者有好处,导致2002年2月结束的第II阶段试验并没有达到基本目的。然而来自正进行心内直视手术的高危人群中的男性患者的数据分组分析证明了死亡率和梗死面积的显著降低。在COMA和COMPLY第II阶段试验中给予人源化抗C5scFv降低了与急性心肌梗死相关的患者总死亡率,但是未能达到基本目的(Mahaffey,K.W.,et al.,Circulation 108:1176-83,2003)。最近发布了来自最近的第III阶段抗C5scFv临床试验(PRIMO-CABG)的结果,其用于改善在冠状动脉转流术后手术诱导的结果。尽管没有达到此项研究的基本目的,但是此研究证明了术后患者的发病率和死亡率的整体下降。
因此本发明的一个方面涉及通过用存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂来治疗患有缺血再灌注的受试者而治疗缺血再灌注损伤。MASP-2抑制剂可通过动脉内、静脉内、颅内、肌肉内、皮下、或者其它非肠道给药而给予给受试者,以及可能的口服用于非肽能抑制剂,最适合经动脉内或静脉内给药。本发明的MASP-2抑制组合物的给予适合在缺血再灌注结果后立即或尽可能快开始。在受控环境下发生再灌注的情况下(例如在主动脉瘤修复后,在器官移植或者严重的或受伤的四肢或指趾的再附着后),MASP-2抑制剂可以先于再灌注和/或在其期间和/或在其之后给予。为了最佳治疗效果,要按照医师确定的那样定期重复给药。
动脉粥样硬化
有相当多的证据表明补体活化涉及人体中的动脉粥样硬化形成。许多研究信服地表明,尽管没有显著的补体活化在正常动脉中发生,但是补体在动脉粥样硬化斑块中被广泛活化,在易碎和破裂的血小板中特别强。终端补体途径的成分在人粥样斑中经常被发现(Niculescu,F.,et al.,Mol.Immunol.36:949-55.10-12,1999;Rus,H.G.,et al.,Immunol.Lett.20:305-310,1989;Torzewski,M.,et al.,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18:369-378,1998)。动脉损伤中的C3和C4沉积也已经被证明(Hansson,G.K.,et al.,Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.(A)92:429-35,1984)。C5b-9的沉积程度被发现与损伤的严重性有关(Vlaicu,R.,et al.,Atherosclerosis 57:163-77,1985)。补体iC3b的沉积而不是C5b-9的沉积在破裂和易碎的血小板中特别强,表明补体活化可能是急性冠状动脉综合征的因素(Taskinen S.,et al.,Biochem.J.367:403-12,2002)。在兔中的实验性粥样斑中发现了补体活化先于损伤的发生(Seifer,P.S.,et al.,LabInvest.60:747-54,1989)。
在动脉粥样硬化斑块中,补体是通过经典和替代途径活化的,但是至今还很少有证据表明补体活化是通过凝集素途径的。动脉壁的几个成分可能引起补体活化。补体的经典途径可能通过结合到酶降解LDL上的C-反应蛋白质(CRP)活化(Bhakdi,S.,et al.,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19:2348-54,1999)。与此观点一致的发现是,终端补体蛋白质与早期人体损伤内膜中的CRP共定位(Torzewski,J.,etal.,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18:1386-92,1998)。同样地,特异于损伤内的氧化LDL的免疫球蛋白M或IgG抗体可能活化经典途径(Witztum,J.L.,Lancet 344:793-95,1994)。从人动脉粥样硬化斑块分离的脂具有高含量的未酯化的胆固醇,并且能够活化替代途径(Seifert P.S.,et al.,J.Exp.Med.172:547-57,1990)。常常与动脉粥样硬化斑块相关的革兰氏阴性菌肺炎衣原体也可能活化补体替代途径(Campbell L.A.,et al.,J.Infect.Dis.172:585-8,1995)。存在于动脉粥样硬化斑块中的其它可能的补体活化剂包括胆固醇结晶和细胞碎片,这二者都能活化补体途径(Seifert,P.S.,et al.,Mol.Immunol.24:1303-08,1987)。
已知补体活化的副产物具有许多能够影响动脉粥样硬化斑块发展的生物学性质。局部补体活化可能诱导细胞溶解并且产生至少一些在晚期斑块的坏死核心中发现的细胞碎片(Niculescu,F.et al.,Mol.Immunol.36:949-55.10-12,1999)。再溶解的补体活化可能是导致平滑肌细胞增殖并导致单核细胞浸润到动脉粥样硬化形成期间的动脉内膜上的重要因素(Torzewski J.,et al.,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18:673-77,1996)。补体的持续活化可能是有害的,因为它可能引起并持续炎症。除了来自血浆的补体成分的浸润外,动脉细胞表达了补体蛋白质的信使RNA,各种补体成分的表达在动脉粥样硬化斑块中被上调(Yasojima,K.,et al.,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.21:1214-19,2001)。
已经报道了有限数量的关于补体蛋白质缺乏对动脉粥样硬化形成的影响的研究。实验动物模型中的结果是相冲突的。在小鼠中,通过有毒剂量的维生素D诱导的动脉粥样硬化样斑块形成在补体缺乏的动物体内减少了(Geertinger P.,et al.,Acta.Pathol.Microbiol.Scand.(A)78:284-88,1970)。此外,在胆固醇喂养的兔中,通过遗传的C6缺乏(Geertinger,P.,et al.,Artery 1:177-84,1977;Schmiedt,W.,et al.,Arterioscl.Thromb.Vasc.Biol.18:1790-1795,1998)或通过抗补体试剂K-76COONa(Saito,E.,et al.,J.Drug Dev.3:147-54,1990)引起的补体抑制中在不影响血清胆固醇水平的情况下抑制了动脉粥样硬化的发展。相反,最近的研究报道了载脂蛋白E(ApoE)缺乏的小鼠中的C5缺乏并不减少动脉粥样硬化斑块的发展(Patel,S.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.286:164-70,2001)。然而在另一研究中,评估了有或没有C3缺乏的LDLR缺乏(ldlr-)小鼠中动脉粥样硬化斑块的发展(Buono,C.,et al.,Circulation 105:3025-31,2002)。他们发现粥样斑到动脉粥样硬化样斑块的成熟部分地取决于完整补体系统的存在。
因此本发明的一个方面涉及通过给予存在于药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂来治疗患有或易患动脉粥样硬化的受试者来治疗或预防动脉粥样硬化。MASP-2抑制剂可以通过动脉内、静脉内、膜内、颅内、肌肉内、皮下或其它非肠道给药而给予受试者,以及可能的口服用于非肽能抑制剂。MASP-2抑制组合物可以在受试者动脉粥样硬化诊断后开始给予或者在发生这种病的高危受试者中进行预防而给予。为了最佳治疗效果,可以按照医师确定的那样定期重复给药。
其它血管病和状况
内皮很大程度上暴露于免疫系统,特别容易受到存在于血浆中的补体蛋白质的攻击。已经表明补体介导的血管损伤是心血管系统中几种疾病的病理生理学原因,包括动脉粥样硬化(Seifert,P.S.,et al.,Atherosclerosis 73:91-104,1988)、缺血再灌注损伤(Weisman,H.F.,Science 249:146-51,1990)以及心肌梗死(Tada,T.,et al.,VirchowsArch 430:327-332,1997)。有证据表明补体活化可能扩展到其它血管病。
例如,有证据表明补体活化导致了许多形式血管炎的发病机理,包括过敏性紫癜肾炎、系统性红斑狼疮相关的血管炎、类风湿性关节炎相关的血管炎(也称为恶性类风湿性关节炎)、免疫复合物血管炎、以及无脉症。过敏性紫癜肾炎是具有免疫发病机理的小血管的系统性血管炎形式,其中补体通过凝集素途径的活化导致了C5b-9诱导的内皮损伤,这被认为是重要的机制(Kawana,S.,et al.,Arch.Dermatol.Res.282:183-7,1990;Endo,M.,et al.,AmJ.Kidney Dis.35:401-7,2000)。系统性红斑狼疮(SLE)是影响多个器官的全身性自身免疫疾病的例子,包括皮肤、肾、关节、浆膜表面和中枢神经系统,常常与严重的血管炎有关。IgG抗内皮抗体和能够结合到内皮细胞上的IgG复合物存在于具有活性SLE的患者血清中,在具有SLE血管炎的患者的血管壁上发现了IgG免疫复合物和补体的沉积(Cines,D.B.,et al.,J.Clin.Invest.73:611-25,1984)。与血管炎有关的类风湿性关节炎也叫做恶性类风湿性关节炎(Tomooka,K.,Fukuoka Igaku Zasshi80:456-66,1989),免疫复合物血管炎,与甲型肝炎有关的血管炎,白细胞解体的血管炎,以及被称为无脉症的动脉炎,形成了人类疾病的另一多形态组,其中补体依赖的对内皮细胞和其它细胞类型的细胞毒性起着公知的作用(Tripathy,N.K.,et al.,J.Rheumatol.28:805-8,2001)。
也有证据表明补体活化在扩张型心肌病中起作用。扩张型心肌病是以心脏扩大和心脏收缩功能受损为特点的综合征。最近的数据表明在心肌中正在发生的炎症可能是疾病发生的原因。已知补体的终端膜攻击复合物C5b-9与免疫球蛋白沉积和TNF-α的心肌表达显著相关。28位患有扩张型心肌病的患者的心肌活组织检查中,C5b-9的心肌积累已被证明,表明在心肌中的慢性免疫球蛋白介导的补体活化可能部分地是扩张型心肌病进展的原因(Zwaka,T.P.,et al.,Am.J.Pathol.161(2):449-57,2002)。
因此本发明的一方面涉及血管病的治疗,包括心血管病、脑血管病、外周(如肌骨骼的)血管病、肾血管病、以及肠系膜/肠血管病,其通过给予包括存在于药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物。相信本发明适合的疾病包括但不限于:血管炎、过敏性紫癜肾炎、系统性红斑狼疮相关的血管炎、类风湿性关节炎相关的血管炎(也称为恶性类风湿性关节炎)、免疫复合物血管炎、无脉症、扩张型心肌病、糖尿病性血管病、川崎病(动脉炎)、静脉气栓(VGE)。同样,假定补体活化的发生是作为与心血管介入手术相关的内腔创伤和异物炎症反应的结果,相信本发明的MASP-2抑制组合物也可以用于抑制支架安置之后的再狭窄、动脉粥样斑块旋切术和/或经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA),要么单独给药,要么与其它诸如在授予Demopulos的美国专利No.6,492,332中公开的再狭窄抑制剂结合。
MASP-2可以通过动脉内、静脉内、肌肉内、鞘内、颅内、皮下或其它非肠道给药而给予受试者,以及可能的口服用于非肽能抑制剂。为了最佳治疗效果,可以按照医师确定的那样定期重复给药。对于再狭窄的抑制来说,MASP-2抑制组合物可以在安置支架或者动脉粥样斑块切除或者血管成形手术之前和/或期间和/或之后给药。或者,MASP-2抑制组合物可以被包被在支架上或者结合到支架中。
肠胃失调
溃疡性结肠炎和Crohn氏病是归在炎性肠病(IBD)名义下的慢性炎性失调。IBD的特征在于它是未知起因的自发发生的、慢性的、复发性炎症。尽管在人体和实验动物两者中都进行了广泛研究,然而确切的病理学机制仍然有待于阐明。然而,相信补体系统在IBD患者中被活化了,并被认为在疾病的发病机理中起着作用(Kolios,G.,etal.,Hepato-Gastroenterology 45:1601-9,1998;Elmgreen,J.,Dan.Med.Bull.33:222,1986)。
已经表明在IBD患者的表面上皮细胞的内腔面上以及肌肉包鞘粘膜和粘膜下层血管中发现了C3b和其它活化的补体产物(Halstensen,T.S.,et al.,Immunol.Res.10:485-92,1991;Halstensen,T.S.,et al.,Gastroenterology 98:1264,1990)。此外,在炎性肠病中特征性地发现了多形核细胞浸润,这通常是C5a产生的结果(Kohl,J.,Mol.Immunol.38:175,2001)。也已经报道了在小型临床研究中(Kitano,A.,et al.,Dis.Colon Rectum 35:560,1992)以及在兔中由角叉菜胶诱导的结肠炎模型中(Kitano,A.,et al.,Clin.Exp.Immunol.94:348-53,1993),多功能补体抑制剂K-76产生了溃疡性结肠炎的症状改善。
已经表明一种新的人C5a受体拮抗剂防止了大鼠IBD模型中的疾病病理学(Woodruff,T.M.,et al.,J.Immunol.171:5514-20,2003)。衰变加速因子(DAF),一种膜补体调节蛋白的遗传缺陷的小鼠被用于IBD模型中,以证明DAF缺乏导致了显著更多的组织损伤和增加的促炎细胞因子产生(Lin,F.,et al.,J.Immunol.172:3836-41,2004)。因此,补体调控在调节肠的体内平衡方面是重要的,可能是涉及IBD发生的主要发病机理。
因此本发明提供了用于抑制患有炎性肠胃失调的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,所述肠胃失调包括但不限于胰腺炎、憩室炎以及包括Crohn氏病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征在内的肠病,其通过将包括存在于药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有这些失调的患者。MASP-2抑制剂可通过动脉内、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、颅内给药或其它非肠道给药给受试者,以及可能的口服用于非肽能抑制剂。合适地可按照医师确定的那样定期重复给药以控制受治失调的症状。
肺疾病
许多肺部炎性失调的发病机理中涉及补体,所述失调包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(Ware,I.,et al.,N.Engl.J.Med.342:1334-49,2000);输液相关的急性肺损伤(TRALI)(Seeger,W.,et al.,Blood76:1438-44,1990);缺血/再灌注急性肺损伤(Xiao,F.,et al.,J.Appl.Physiol.82:1459-65,1997);慢性阻塞性肺疾病(COPD)(Marc,M.M.,et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.(印刷前的电子公开),2004年3月23日);哮喘(Krug,N.,et al.,Am.J.Respir.Crit.Care Med.164:1841-43,2001);韦格纳肉芽肿病(Kalluri,R.,et al.,J.Am.Soc.Nephrol.8:1795-800,1997);以及抗肾小球基底膜病(古德帕斯彻病)(Kondo,C.,et al.,Clin.Exp.Immunol.124:323-9,2001)。
现在被广泛接受的是,许多ARDS的病理生理学涉及失控的炎性级联,这种炎性级联开始是作为对感染或其它刺激性事件的正常应答,但是最终引起了对宿主显著的自体损伤(Stanley,T.P.,EmergingTherapeutic Targets 2:1-16,1998)。患有ARDS的患者几乎普遍显示了大范围补体活化的证据(补体成分C3a和C5a的血浆水平增加),补体活化的程度是与ARDS的发生和结果相关的(Hammerschmidt,D.F.,et al.,Lancet 1:947-49,1980;olomkin,J.S.,et al.,J.Surgery97:668-78,1985)。
各种实验性和临床数据表明了补体活化在ARDS病理生理学中的作用。在动物模型中,补体的系统活化导致了急性肺损伤,其组织病理学与人ARDS中所发现的类似(Till,G.O.,et al.,Am.J.Pathol.129:44-53,1987;Ward,P.A.,Am.J.Pathol.149:1081-86,1996)。通过一般性补体缺失或者通过特异性C5a抑制而抑制补体级联,这在动物模型中对急性肺损伤提供了保护(Mulligan,M.S.,et al.,J.Clin.Invest.98:503-512,1996)。在大鼠模型中,sCR1在补体介导的和嗜中性粒细胞介导的肺损伤中具有保护效应(Mulligan,M.S.,Yeh,et al.,J.Immunol.148:1479-85,1992)。此外,实际上所有补体成分都可在肺中通过II型肺泡细胞、肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞而局部产生(Hetland,G.,et al.,Scand.J.Immunol.24:603-8,1986;Rothman,B.I.,et al.,J.Immunol.145:592-98,1990)。这样,补体级联被良好定位以显著地引起肺部炎症,从而导致ARDS中的肺损伤。
哮喘本质上是炎性疾病。过敏性哮喘的主要特征包括对于各种特异性和非特异性刺激的气道超敏应答、过多的气道粘液产生、肺部嗜曙红细胞增多、以及血清IgE浓度的增加。尽管哮喘在起因上是多因子的,不过一般被接受的是,它是作为对遗传易感个体中的普通环境抗原的不适当免疫应答结果而产生的。在人哮喘性肺中补体被高度活化这一事实是公知的(Humbles,A.A.,et al.,Nature 406:998-01,2002;van de Graf,E.A.,et al.,J.Immunol.Methods 147:241-50,1992)。此外,最近的动物模型和人体数据提供了证据,证明补体活化是导致疾病发病机理的重要机制(Karp,C.L.,et al.,Nat.Immunol.1:221-26,2000;Bautsch,W.,et al.,J.Immunol.165:5401-5,2000;Drouin,S.M.,et al.,J.Immunol.169:5926-33,2002;Walters,D.M.,et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.27:413-18,2002)。凝集素途径在哮喘中的作用得到了使用慢性真菌性哮喘的鼠模型的研究的支持。具有甘露聚糖结合的凝集素遗传缺陷的小鼠与该哮喘模型中的正常动物相比,产生了改变的气道超敏应答(Hogaboam,C.M.,et al.,J.Leukoc.Biol.75:805-14,2004)。
在哮喘中,补体可通过几种途径被活化:(a)通过经典途径作为过敏原-抗体复合物形成的结果而活化;(b)在过敏原表面上的替代途径;(c)通过糖类结构结合到过敏原上的凝集素途径活化;以及(d)通过炎性细胞释放的蛋白酶裂解C3和C5。尽管关于哮喘中的补体所起的复合物作用还有很多东西有待研究,然而过敏性哮喘发生中涉及的补体活化途径的鉴别可以提供用于开发这种日益重要的疾病的新治疗策略的焦点。
因此发明的一方面提供了用于治疗肺部失调的方法,通过将包括存在于药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有肺部失调的受试者,所述失调包括但不限于急性呼吸窘迫综合征、输液相关的急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基底膜病(古德帕斯彻病)、胎粪吸入综合征、闭塞性细支气管炎综合征、特发性肺纤维化、烧伤继发的急性肺损伤、非心原性肺水肿、输液相关的呼吸抑制以及肺气肿。MASP-2抑制剂可全身性给予受试者,诸如通过动脉内、静脉内、肌肉内、吸入、鼻、皮下或者其它非肠道给药,或者可能通过口服给药用于非肽能试剂。MASP-2抑制剂组合物可以与一种或多种另外的治疗剂混合,包括抗炎剂、抗组胺剂、皮质甾类或者抗菌剂。可按照医师确定的那样重复给药直到疾病消退。
体外循环
有许多医学手术期间要从患者循环系统转移血液(体外循环系统或ECC)。这些手术包括血液透析、血浆置换、白细胞置换、体外循环膜加氧器(ECMO)、肝素诱导的体外膜式氧合LDL沉淀(HELP)以及心肺转流术(CPB)。这些手术将血液或血液产物暴露给可能改变正常细胞功能和止血的外源表面。在开拓性研究中,Craddock et al.确定了补体活化是血液透析期间的粒细胞减少的可能原因(Craddock,P.R.,et al.,N.Engl.J.Med.296:769-74,1977)。1977年到现在之间的许多研究的结果表明,进行血液透析或CPB的患者所经受的许多不利结果是由补体系统的活化引起的(Chenoweth,D.E.,Ann.N.Y.Acad.Sci.516:306-313,1987;Hugli,TE,Complement 3:111-127,1986;Cheung,A.K.,J.Am.Soc.Nephrol.1:150-161,1990;Johnson,R.J.,Nephrol.Dial.Transplant 9:36-451994)。例如,已经表明补体活化潜力是确定血液透析器在有关肾功能恢复、感染易感性、肺功能障碍、肾衰竭患者的发病率和生存率方面的生物相容性的重要标准(Hakim,R.M.,Kidney Int.44:484-4946,1993)。
人们已经在很大程度上相信,血液透析膜的补体活化是通过替代途径机制而发生的,这是由于较差的C4a产生(Kirklin,J.K.,et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.86:845-57,1983;Vallhonrat,H.,et al.,ASAIO J.45:113-4,1999),但是最近的工作表明经典途径可能也参与了(Wachtfogel,Y.T.,et al.,Blood 73:468-471,1989)。然而,对起始和控制人工表面包括生物药用聚合物上的补体活化的因素仍然了解不够。例如,用于血液透析中的铜铵膜已经被归类为非常有效的补体活化剂。尽管不希望被理论所限制,本发明人还是推理认为这也许部分地可通过它的多糖本质来解释。在本专利中鉴别到的MASP-2依赖的补体活化系统提供了一种机制,通过这种机制,凝集素途径的活化引起了替代途径的活化。
CPB期间经受ECC的患者遭受了全身性炎性反应,这部分地是由于血液暴露给了体外循环的人工表面而引起的,但是也可能是由于不依赖于表面的因素象外伤和缺血再灌注损伤(Butler,J.,et al.,Ann.Thorac.Surg.55:552-9,1993;Edmunds,L.H.,Ann.Thorac.Surg.66(Suppl):S12-6,1998;Asimakopoulos,G.,Perfusion 14:269-77,1999)。CPB引起的炎性反应可能导致术后并发症,一般称为“灌注后综合征”。在这些术后结果中有认知缺陷(Fitch,J.,et al.,Circulation 100(25):2499-2506,1999)、呼吸衰竭、出血失调、肾功能障碍以及在最严重情况下的多种器官衰竭(Wan,S.,et al.,Chest112:676-692,1997)。与没有CPB但是有相应程度外伤的手术相比,有CPB的冠状旁路手术导致了更多的补体活化(E.Fosse,1987)。因此,这些CPB相关问题的可疑主因是旁路手术期间不适当的补体活化(Chenoweth,K.,et al.,N.Engl.J.Med.304:497-503,1981;P.Haslam,et al.,Anaesthesia 25:22-26,1980;J.K.Kirklin,et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.86:845-857,1983;Moore,F.D.,et al.,Ann.Surg 208:95-103,1988;J.Steinberg,et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg 106:1901-1918,1993)。在CPB循环中,替代补体途径在补体活化中发挥了主要作用,这是血液与CPB循环的人工表面之间的相互作用的结果(Kirklin,J.K.,et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,86:845-57,1983;Kirklin,J.K.,et al.,Ann.Thorac.Surg.41:193-199,1986;Vallhonrat H.,et al.,ASAIO J.45:113-4,1999)。然而,也有证据表明CPB期间经典补体途径的活化(Wachtfogel,Y.T.,et al.,Blood 73:468-471,1989)。
基本炎症物质是在补体系统活化后产生的,包括过敏毒素C3a和C5a、调理素C3b、以及膜攻击复合物C5b-9。C3a和C5a是嗜中性粒细胞、单核细胞和血小板的有效刺激物(Haeffner-Cavaillon,N.,et al.,J.Immunol.,139:794-9,1987;Fletcher,M.P.,et al.,Am.J.Physiol.265:H1750-61,1993;Rinder,C.S.,et al.,J.Clin.Invest.96:1564-72,1995;Rinder,C.S.,et al.,Circulation 100:553-8,1999)。这些细胞的活化导致促炎细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNFα)、氧自由基和蛋白酶的释放(Schindler,R.,et al.,Blood 76:1631-8,1990;Cruickshank,A.M.,et al.,Clin Sci.(Lond)79:161-5,1990;Kawamura,T.,et al.,Can.J.Anaesth.40:1016-21,1993;Steinberg,J.B.,et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.106:1008-1,1993;Finn,A.,et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.105:234-41,1993;Ashraf,S.S.,et al.,J.Cardiothorac.Vasc.Anesth.11:718-22,1997)。已经表明C5a上调了多形核细胞(PMN)中Mac-1的粘连分子CD11b和CD18,并诱导了PMN的脱粒以释放促炎(Rinder,C.,et al.,CardiovascPharmacol.27(Suppl 1):S6-12,1996;Evangelista,V.,et al.,Blood93:876-85,1999;Kinkade,J.M.,Jr.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.114:296-303,1983;Lamb,N.J.,et al.,Crit.Care Med.27:1738-44,1999;Fujie,K.,et al.,Eur.J.Pharmacol.374:117-25,1999)。C5b-9诱导了血小板上的粘连分子P-选择蛋白(CD62P)的表达(Rinder,C.S.,et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.118:460-6,1999),而C5a和C5b-9都诱导了内皮细胞上的P-选择蛋白的表面表达(Foreman,K.E.,et al.,J.Clin.Invest.94:1147-55,1994)。这些粘连分子涉及白细胞、血小板和内皮细胞之间的相互作用。粘连分子在活化内皮细胞上的表达是活化白细胞分离的原因,然后介导了组织炎症和损伤(Evangelista,V.,Blood 1999;Foreman,K.E.,J.Clin.Invest.1994;Lentsch,A.B.,et al.,J.Pathol.190:343-8,2000)。正是这些补体活化产物在嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板和其它循环细胞上的作用才可能导致了CPB后引起的各种问题。
正在研究几种补体抑制剂在CPB中的潜在应用。它们包括可溶的重组补体受体1(sCR1)(Chai,P.J.,et al.,Circulation 101:541-6,2000)、人源化单链抗C5抗体(h5G1.1-scFv或Pexelizumab)(Fitch,J.C.K.,et al.,Circulation 100:3499-506,1999)、重组的人膜辅因子蛋白和人衰变加速因子的融合杂合体(CAB-2)(Rinder,C.S.,et al.,Circulation 100:553-8,1999)、13个残基的C3结合环肽(Compstatin)(Nilsson,B.,et al.,Blood 92:1661-7,1998)以及抗因子D MoAb(Fung,M.,et al.,J.Thoracic Cardiovasc.Surg.122:113-22,2001)。SCR1和CAB-2在C3和C5活化步骤抑制了经典和替代补体途径。Compstatin在C3活化步骤抑制了两种补体途径,而h5G1.1-scFv仅在C5活化步骤抑制两种补体途径。抗因子D MoAb在C3和C5活化步骤抑制替代途径。然而,这些补体抑制剂都不会特异性抑制本专利中鉴别到的MASP-2依赖的补体活化系统。
已经报道了研究人源化单链抗C5抗体(h5G1.1-scFv,pexelizumab)在降低牙周炎MI和冠状动脉旁路移植(CABG)手术中的死亡率方面的功效和安全性的大量预期的第3阶段临床研究的结果(Verrier,E.D.,et al.,JAMA 291:2319-27,2004)。与安慰剂相比,pexelizu mab与进行CABG手术的2746位患者中的总体死亡风险或MI的显著降低没有关联。然而,在进行有或没有瓣膜手术的CABG手术的所有3099位患者中,术后30天有统计学上的显著降低。由于pexelizu mab在C5活化步骤抑制,它就抑制C5a和sC5b-9的产生,但是对其它两种有效补体炎性物质C3a和调理素C3b的产生没有影响,C3a和C3b也是已知的CPB所引起的炎性反应的原因。
因此本发明的一方面涉及预防或治疗体外暴露所引起的炎性反应,其通过用包括存在于药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物来治疗进行体外循环手术的受试者,包括进行血液透析、血浆置换、白细胞置换、体外循环膜加氧器(ECMO)、肝素诱导的体外膜式氧合LDL沉淀(HELP)以及心肺转流术(CPB)的患者。相信根据本发明的方法进行的MASP-2抑制剂治疗在降低或预防往往由CPB手术引起的认知功能障碍方面是有用的。MASP-2抑制剂可在手术之前和/或手术之中和/或手术之后给予受试者,诸如通过动脉内、静脉内、肌肉内、皮下或其它非肠道给药。或者,可在体外循环期间将MASP-2抑制剂引入到受试者血流中,诸如通过将MASP-2抑制剂注射到血液循环的管道或膜中,或者通过将血液与包被了MASP-2抑制剂的表面相接触,诸如管道、膜或者诸如CPB设备的其它表面的内壁。
炎性和非炎性关节炎以及其它肌肉骨骼病
大量的各种风湿病的发病机理中涉及到补体系统的活化;包括类风湿性关节炎(Linton,S.M.,et al.,Molec.Immunol.36:905-14,1999),青少年类风湿性关节炎(Mollnes,T.E.,et al.,Arthritis Rheum.29:1359-64,1986),骨关节炎(Kemp,P.A.,et al.,J.Clin.Lab.Immunol.37:147-62,1992),系统性红斑狼疮(SLE)(Molina,H.,Current Opinion in Rheumatol.14:492-497,2002),Behcet氏综合征(Rumfeld,W.R.,et al.,Br.J.Rheumatol.25:266-70,1986)以及Sjogren氏综合征(Sanders,M.E.,et al.,J.Immunol.138:2095-9,1987)。
很有说服力的证据表明,免疫复合物引起的补体活化是导致类风湿性关节炎(RA)中组织损伤的主要病理机制。许多出版物证明RA患者血浆中补体活化产物的增加(Morgan,B.P.,et al.,Clin.Exp.Immunol,73:473-478,1988;Auda,G.,et al.,Rheumatol.Int.10:185-189,1990;Rumfeld,W.R.,et al.,Br.J.Rheumatol.25:266-270,1986)。也已经在炎性风湿性关节炎中发现了补体活化产物,诸如C3a、C5a和sC5b-9,已经确定了补体活化程度和RA严重性之间的正相关(Makinde,V.A.,et al.,Ann.Rheum.Dis.48:302-306,1989;Brodeur,J.P.,et al.,Arthritis Rheumatism 34:1531-1537,1991)。在成人和青少年类风湿性关节炎中,替代途径补体活化产物Bb的血清和滑液水平与C4d(经典途径活化的标记)相比增加了,表明补体活化主要是由替代途径介导的(El-Ghobarey,A.F.et al.,J.Rheumatology 7:453-460,1980;Agarwal,A.,et al.,Rheumatology39:189-192,2000)。补体活化产物可直接损伤组织(通过C5b-9)或者通过过敏毒素C3a和C5a募集炎性细胞而间接介导炎症。
已经广泛使用实验性关节炎的动物模型来研究补体在RA发病机理中的作用。由眼镜蛇毒因子导致的RA动物模型中补体缺失预防了关节炎的发生(Morgan,K.,et al.,Arthritis Rheumat.24:1356-1362,1981;Van Lent,P.L.,et al.,Am.J.Pathol.140:1451-1461,1992)。将补体抑制剂补体受体1(sCR1)的可溶形式注射到关节内,抑制了RA大鼠模型中的炎症(Goodfellow,R.M.,et al.,Clin.Exp.Immunol.110:45-52,1997)。此外,sCR1抑制了大鼠胶原诱导的关节炎的发生和进展(Goodfellow,R.M.,et al.,Clin Exp.Immunol.119:210-216,2000)。可溶CR1在替代途径和经典途径的C3和C5步骤都抑制经典和替代补体途径,从而抑制了C3a、C5a和sC5b-9的产生。
在1970年代后期,认识到了用异种II型胶原(CII;人关节软骨的主要胶原成分)免疫啮齿动物导致了显著类似于人RA的自身免疫性关节炎(胶原诱导的关节炎,或者CIA)的发生(Courtenay,J.S.,etal.,Nature 283:666-68,1980;Banda et al.,J.of Immunol.171:2109-2115(2003))。易感动物中的自身免疫应答涉及这些因素的混合式结合,包括特异性主要组织相容性复合物(MHC)分子、细胞因子和CII特异性的B细胞和T细胞应答(评论于Myers,L.K.,et al.,LifeSciences 61:1861-78,1997)。观察到了几乎40%的小鼠纯系品系具有补体成分C5的完全缺失(Cinader,B.,et al.,J.Exp.Med.120:897-902,1964),这一结果提供了间接可能来探索补体在这种关节炎模型中的作用,其通过比较C5缺失和充足的品系之间的CIA。这些研究的结果表明,C5的充足是CIA发生的绝对要求(Watson et al.,1987;Wang,Y.,et al.,J.Immunol.164:4340-4347,2000)。通过使用抗C5单克隆抗体(MoAb)已经提供了RA中C5和补体重要性的进一步证据。在鼠CIA模型中预防性腹膜内给予抗C5MoAb几乎完全预防了疾病发生,而在活跃性关节炎期间的治疗产生了显著的临床好处和更轻微的组织疾病(Wang,Y.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8955-59,1995)。
通过使用最近发展的一种炎性关节炎模型K/BxN T细胞受体转基因小鼠的研究,已经提供了关于补体活化在疾病发病机理中的潜在作用的更多认识(Korganow,A.S.,et al.,Immunity 10:451-461,1999)。所有K/BxN动物都自发产生了自身免疫病,具有人RA的大多数(尽管不是全部)临床、组织学和免疫学特征。此外,将患关节炎的K/BxN小鼠的血清转移到健康动物中,经由关节炎产生的免疫球蛋白而在几天之内引起了关节炎。为鉴别疾病发生所需要的特定补体活化步骤,将患关节炎的K/BxN小鼠的血清转移到各种遗传缺陷特定补体途径产物的小鼠中(Ji,H.,et al.,Immunity 16:157-68,2002)。有趣的是,研究结果证明替代途径活化是关键的,而经典途径活化是可有可无的。此外,C5a的形成是关键的,因为C5缺乏小鼠和C5aR缺乏小鼠都防止了疾病发生。与这些结果相一致的是,以前的研究报道了C5a受体表达的遗传缺失保护了小鼠不患关节炎(Grant,E.P.,et al.,J.Exp.Med.196:1461-1471,2002)。
预防人补体成分C5裂解成它的促炎成分的人源化抗C5 MoAb(5G1.1)正由Alexion Pharmaceuticals,Inc.,New Haven,Connecticut开发,作为RA的可能的治疗方法。
系统性红斑狼疮(SLE)是一种不明病因的自身免疫病,它导致自身抗体产生,循环免疫复合物的产生,以及补体系统短暂的、不受控的活化。尽管SLE中的自身免疫性的起因仍然令人困惑,不过现在有相当多的信息暗示了补体活化是导致该疾病中血管损伤的重要机制(Abramson,S.B.,et al.,Hospital Practice 33:107-122,1998)。该疾病中涉及补体的经典和替代途径两者的活化,C4d和Bb都是缓和到严重的狼疮疾病活性的敏感标志(Manzi,S.,et al.,Arthrit.Rheumat.39:1178-1188,1996)。替代补体途径的活化伴随着妊娠期间系统性红斑狼疮的疾病爆发(Buyon,J.P.,et al.,Arthritis Rheum.35:55-61,1992)。此外,凝集素途径可能也是引起疾病发生的原因,因为最近在SLE患者的血清中鉴别到了抗MBL的自身抗体(Seelen,M.A.,etal.,Clin Exp.Immunol.134:335-343,2003)。
相信通过经典途径的免疫复合物介导的补体活化是SLE患者中发生组织损伤的一种机制。然而,经典途径补体成分的遗传缺陷增加了患狼疮和狼疮样疾病的风险(Pickering,M.C.,et al.,Adv.Immunol.76:227-324,2000)。在完全缺乏C1q、C1r/C1s、C4或C3的人中,超过80%发生了SLE或相关症状。这体现了狼疮中补体的有害效应与保护性效应相一致方面的明显矛盾。
经典途径的重要活性似乎是促进免疫复合物经由单核吞噬系统而从循环和组织中去除(Kohler,P.F.,et al.,Am.J.Med.56:406-11,1974)。此外,最近已经发现补体在凋亡小体的去除和处理中具有重要作用(Mevorarch,D.,et al.,J.Exp.Med.188:2313-2320,1998)。经典途径功能的缺失可能通过使得发生一种循环而使受试者容易发生SLE,在这种循环中,免疫复合物或凋亡细胞在组织中累积,引起炎症并释放自身抗原,又刺激了自身抗体和更多免疫复合物的产生,从而引起自身免疫应答(Botto,M.,et al.,Nat.Genet.19:56-59,1998;Botto,M.,Arthritis Res.3:201-10,2001)。然而,这些经典途径成分的“完全”缺乏状态只存在于大约百分之一的SLE患者中。因此,在大多数的SLE患者中,经典途径成分的完全缺乏并不对疾病病因作出贡献,补体活化可能是导致SLE发病机理的重要机制。很少有永久遗传缺陷经典途径成分的个体经常在他们生命中的某个时间发生SLE,这一事实证明机制的冗余能够引起疾病。
SLE动物模型的结果支持了补体活化在疾病发病机理中的重要作用。使用封闭性抗C5 MoAb减少了LSE小鼠模型NZB/NZW F1小鼠中的蛋白尿和肾病(Wang Y.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8563-8,1996)。此外,用患有严重联合免疫缺陷病的小鼠的抗C5MoAb的处理导致了蛋白尿和肾组织学图象的改善,与未处理的对照相比具有生存率方面的相关好处,所述小鼠是植入了分泌抗DNA抗体的细胞的(Ravirajan,C.T.,et al.,Rheumatology 43:442-7,2004)。替代途径也在SLE的自身免疫病表现形式中具有重要作用,因为将因子B缺乏小鼠回交到SLE的MRL/lpr模型上时,显示了因子B的缺乏降低了这种模型中典型发现过的血管炎、肾小球病、C3肺疾病和IgG3 RF的水平,而没有改变其它抗体的水平(Watanabe,H.,et al.,J.Immunol.164:786-794,2000)。正在研究人源化抗C5 MoAb作为SLE可能的治疗手段。这种抗体防止了C5裂解成C5a和C5b。在第I阶段临床试验中,没有发现严重不利效应,正在进行更多的人体试验来确定其在SLE中的功效(Strand,V.,lupus 10:216-221,2001)。
因此本发明的一方面涉及预防或治疗炎性和非炎性关节炎以及其它肌骨骼失调,包括但不限于骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风、神经病性关节病、银屑病关节炎、强直性脊椎炎或其它脊柱关节病以及结晶体关节病或系统性红斑狼疮(SLE),其通过将包括存在于药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有这些失调的受试者。MASP-2抑制剂可全身性给予受试者,诸如通过动脉内、静脉内、肌肉内、皮下或其它非肠道给药,或者可能经口服给药用于非肽能试剂。或者,可通过局部送递给药,诸如通过关节内注射。为治疗或控制慢性病可以在持续的时间段中周期性给予MASP-2抑制剂,或者可以在包括于关节上进行的外科手术在内的急性创伤或损伤之前、期间和/或之后的一段时间经单次或重复给药。
肾病
大量的各种肾病的发病机理中涉及补体系统的活化,包括肾小球膜增生性肾小球肾炎(IgA肾病、Berger氏病)(Endo,M.,et al.,Clin.Nephrology 55:185-191,2001)、膜性肾小球肾炎(Kerjashki,D.,ArchB Cell Pathol.58:253-71,1990;Brenchley,P.E.,et al.,Kidney Int.,41:933-7,1992;Salant,D.J.,et al.,Kidney Int.35:976-84,1989)、膜性增生性肾小球肾炎(肾小球膜毛细管性肾小球肾炎)(Bartlow,B.G.,et al.,Kidney Int.15:294-300,1979;Meri,S.,et al.,J.Exp.Med.175:939-50,1992)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎(Ohsawa,I.,et al.,Clin Immunol.101:59-66,2001)、狼疮肾炎(Gatenby,P.A.,Autoimmunity 11:61-6,1991)、过敏性紫癜肾炎(Endo,M.,et al.,Am.J.Kidney Dis.35:401-407,2000)。肾病中涉及补体已经被认识到几十年了,但是仍然存在关于它在肾病的发病、进展和消退阶段中的确切作用的主要讨论。在正常条件下,补体的作用对宿主是有利的,但是补体不适当的活化和沉积可能引起组织损伤。
有充分的证据表明肾小球的炎症即肾小球肾炎的起始经常是由于免疫复合物沉积到肾小球或肾小管结构上,然后引起补体活化、发炎和组织损伤。Kahn和Sinniah证明C5b-9在取自患有各种形式肾小球肾炎的患者的生物活组织的肾小管基底膜上的沉积增加了(Kahn,T.N.,et al.,Histopath.26:351-6,1995)。在患有IgA肾病的患者的研究中(Alexopoulos,A.,et al.,Nephrol.Dial.Transplant 10:1166-1172,1995),C5b-9在肾小管上皮/基底膜结构上的沉积与血浆肌酸酐水平相关联。另一项膜性肾病的研究证明了临床结果与尿sC5b-9水平之间的关系(Kon,S.P.,et al.,Kidney Int.48:1953-58,1995)。增加的sC5b-9水平与不良预后确实相关联。Lehto et al.测定了患有膜性肾小球肾炎的患者尿中的CD59以及C5b-9的增加水平(Lehto,T.,etal.,Kidney Int.47:1403-11,1995),CD59是一种抑制质膜中的膜攻击复合物的补体调节因子。取自这些同样患者的生物活组织检查样品的组织病理学分析证明了C3和C9蛋白在肾小球中的沉积,而C59在这些组织中的表达与正常肾组织相比减少了。这些不同研究表明正发生的补体介导的肾小球肾炎导致了补体蛋白质的尿分泌,这是与组织损伤程度和疾病预后相关联的。
肾小球肾炎的各种动物模型中的补体活化的抑制也证明了疾病病因中补体活化的重要性。在膜增生性肾小球肾炎(MPGN)模型中,C6缺乏大鼠(不能形成C5b-9)中抗Thy1抗血清的注入导致了肾小球细胞增殖减少90%,降低80%的血小板和巨噬细胞浸润,减少的IV型胶原合成(肾小球基质扩展的标志),以及比C6+正常大鼠少50%的蛋白尿(Brandt,J.,et al.,Kidney Int.49:335-343,1996)。这些结果表明C5b-9是这种大鼠抗胸腺细胞血清模型中补体导致的组织损伤的主要介质。在另一种肾小球肾炎模型中,分级剂量的兔抗大鼠肾小球基底膜的注入产生了多形核白细胞(PMN)的剂量依赖性流入,该多形核白细胞是通过先前的眼镜蛇毒因子处理(消耗补体)而减少了的(Scandrett,A.L.,et al.,Am.J.Physiol.268:F256-F265,1995)。眼镜蛇毒因子处理的大鼠也显示减少了组织病理、减少了长期的蛋白尿以及比对照大鼠更低的肌酸酐水平。采用三种GN大鼠模型(抗胸腺细胞血清、Con A抗Con A、以及钝态Heymann肾炎),Couser et al.证明了使用重组sCR1蛋白抑制补体这一方法的潜在治疗效能(Couser,W.G.,et al.,J.Am.Soc.Nephrol.5:1888-94,1995)。用sCR1处理的大鼠显示了显著减少的PMN、血小板和巨噬细胞流入,减少的肾小球溶解以及相对于对照大鼠的蛋白尿。通过在NZB/WF1小鼠模型中使用抗C5 MoAb已经提供了补体活化在肾小球肾炎中的重要性的进一步证据。抗C5 MoAb抑制了C5的裂解,从而封闭了C5a和C5b-9的产生。用抗C5 MoAb连续治疗6个月,导致了肾小球肾炎疗程的显著改善。Alexion Pharmaceuticals,Inc.,NewHaven,Connecticut正在开发一种防止人补体成分C5裂解成它的促炎成分的人源化抗C5 MoAb单克隆抗体(5G1.1),作为肾小球肾炎可能的治疗手段。
通过对患有特定补体成分遗传缺陷患者的研究,提供了补体在肾脏损伤中的病理学作用的直接证据。许多报道已经证明肾病与补体调节因子H的缺乏相关(Ault,B.H.,Nephrol.14:1045-1053,2000;Levy,M.,et al.,Kidney Int.30:949-56,1986;Pickering,M.C.,et al.,Nat.Genet.31:424-8,2002)。因子H的缺乏导致了因子B和C3的低血浆水平以及C5b-9的消耗。非典型性膜增生性肾小球肾炎(MPGN)和先天性溶血性尿毒症综合征(HUS)都与因子H的缺乏相关。因子H缺乏的猪(Jansen,J.H.,et al.,Kidney Int.53:331-49,1998)和因子H敲除的小鼠(Pickering,M.C.,2002)显示了MPGN样症状,证实了因子H在补体调节中的重要性。其它补体成分的缺乏与肾病相关,对系统性红斑狼疮(SLE)的发生是次要的(Walport,M.J.,Davies,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.815:267-81,1997)。C1q、C4和C2缺乏使得非常容易通过缺陷性清除免疫复合物和凋亡物质相关的机制而发生SLE。在许多的这些SLE患者中发生了狼疮肾炎,其特征在于遍及肾小球的免疫复合物沉积。
通过对针对补体成分的自身抗体患者的鉴别,已经提供了联系补体活化与肾病的进一步证据,所述补体成分的一些与肾病直接相关(Trouw,L.A.,et al.,Mol.Immunol.38:199-206,2001)。许多这样的自身抗体显示了与肾病的这种高度关联,引入术语肾炎因子(NeF)来表示这种活性。在临床研究中,大约50%的肾炎因子阳性的患者发生了MPGN(Spitzer,R.E.,et al.,Clin.Immunol.Immunopathol.64:177-83,1992)。C3NeF是针对替代途径C3转化酶(C3bBb)的自身抗体,它稳定了这种转化酶,从而促进了替代途径活化(Daha,M.R.,etal.,J.Immunol.116:1-7,1976)。同样地,特异于经典途径C3转化酶(C4b2a)的自身抗体,称为C4NeF,稳定了这种转化酶,从而促进了经典途径活化(Daha,M.R.et al.,J.Immunol.125:2051-2054,1980;Halbwachs,L.,et al.,J.Clin.Invest.65:1249-56,1980)。已经描述了抗C1q自身抗体与SLE患者的肾炎相关(Hovath,L.,et al.,Clin.Exp.Rheumatol.19:667-72,2001;Siegert,C.,et al.,J.Rheumatol.18:230-34,1991;Siegert,C.,et al.,Clin.Exp.Rheumatol.10:19-23,1992),报道了这些抗C1q自身抗体的滴度升高来预测肾炎的爆发(Coremans,I.E.,et al.,Am.J.Kidney Dis.26:595-601,1995)。来自SLE患者死后解剖的肾洗脱的免疫沉积物显示了这些抗C1q自身抗体的累积(Mannick,M.,et al.,ArthritisRheumatol.40:1504-11,1997)。所有这些事实指向了这些自身抗体的病理学作用。然而,并不是所有带有抗C1q自身抗体的患者都发生了肾病,一些健康个体也具有低滴度的抗C1q自身抗体(Siegert,C.E.,et al.,Clin.Immunol.Immunopathol.67:204-9,1993)。
除了补体活化的替代途径和经典途径,凝集素途径在肾病中也有重要的病理学作用。已经通过免疫组织化学技术在获自诊断为患有几种不同肾病的患者的肾活组织检查材料上检测到了升高水平的MBL、MBL相关的丝氨酸蛋白酶以及补体活化产物,这些肾病包括过敏性紫癜肾炎(Endo,M.,et al.,Am.J.Kidney Dis.35:401-407,2000)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎(Ohsawa,I.,et al.,Clin.Immunol.101:59-66,2001)以及IgA肾病(Endo,M.,et al.,Clin.Nephrology55:185-191,2001)。因此,尽管补体与肾病之间的关联这一事实已经已知几十年了,然而关于补体如何确切影响这些肾病的数据还远不完整。
因此本发明的一方面涉及治疗肾病,包括但不限于肾小球膜增生性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎(肾小球膜毛细管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎、狼疮肾炎、过敏性紫癜肾炎或者IgA肾病,其通过将包括存在于药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有这些失调的受试者。MASP-2抑制剂可全身性给予受试者,诸如通过动脉内、静脉内、肌肉内、皮下或其它非肠道给药,或者可能经口服给药用于非肽能试剂。为治疗或控制慢性病可以在持续的时间段中周期性给予MASP-2抑制剂,或者可以在急性创伤或损伤之前、期间或之后的一段时间经单次或重复给药。
皮肤病
银屑病是慢性的、让人虚弱的皮肤病,影响着成千上万的人,是遗传和环境因素两者的结果。一般认为局部试剂以及UVB和PUVA光疗是银屑病最好的治疗方法。然而,对于普遍的或者更广泛的疾病来说,显示必须作全身治疗来作为初步治疗,或者在一些情况下增强了UVB和PUVA治疗的效果。
诸如银屑病的各种皮肤病的潜在病因支持了免疫和促炎过程的作用,包括补体系统的参与。而且,已经确定了补体系统作为重要的非特异性皮肤防御机制的作用。它的活化导致了一些产物的形成,这些产物不仅有助于维持正常的宿主防御,而且还介导了炎症和组织损伤。补体的促炎产物包括具有调理素和细胞刺激活性的C3大片段(C3b和C3bi)、低分子量的过敏毒素(C3a、C4a和C5a)以及膜攻击复合物。在它们之中,C5a或其降解产物脱Arg的C5a似乎是最重要的介质,因为它发挥了对炎性细胞的有效趋化效应。皮内给予C5a过敏毒素诱导的皮肤变化与皮肤超敏血管炎中所观察到的是相当类似的,后者是通过免疫复合物介导的补体活化而发生的。补体活化参与了自身免疫大疱皮肤病中炎性变化的发病机理。由表皮天疱疮抗体引起的补体活化似乎是称为嗜酸性海绵样水肿这一特征性炎性变化发生的原因。在大疱性类天疱疮(BP)中,基底膜区抗原与BP抗体之间的相互作用导致了补体活化,似乎与分界真皮表皮结合部的白细胞相关。产生的过敏毒素不仅活化了浸润的白细胞,而且诱导了肥大细胞的脱粒,这促进了真皮表皮的分离以及嗜曙红细胞浸润。同样地,补体活化似乎在真皮表皮分离中发挥了更直接的作用,这在获得性大疱性表皮松解症和妊娠疱疹中发现了。
补体参与银屑病的证据来自于最近在涉及银屑病和相关疾病中的炎性变化的病理生理学机制的文献中所述的实验发现。越来越多的证据已经表明T细胞介导的免疫在银屑病病变的发生和维持中的重要作用。已经显示了由银屑病病变中的活化T细胞所产生的淋巴因子对表皮的增殖具有强力影响。能够在银屑病病变的高度发炎区域中观察到角质层下的特征性嗜中性粒细胞累积。通过受激的角质形成细胞释放的细胞因子、IL-8和Gro-α的协同作用在这里化学趋化吸引并活化嗜中性粒细胞,特别是通过替代补体途径活化所产生的C5a/脱arg的C5a(Terui,T.,Tahoku J.Exp.Med.190:239-248,2000;Terui,T.,Exp.Dermatol.9:1-10,2000)。
银屑病鳞片提取物包含独特的趋化性肽组分,它可能参与间歇性跨表皮的白细胞趋化反应。最近的研究已经鉴别到这种组分中两种不相关的趋化性肽的存在,即C5a/脱Arg的C5a和白介素8(IL-8)及其相关细胞因子。为研究它们对于跨表皮的白细胞游出的相对贡献以及它们在银屑病病变中的相互关系,定量了银屑病病变鳞片提取物和相关的无菌胧疱皮肤病中的免疫活性C5a/脱Arg的C5a和IL-8的浓度。发现病变皮肤的角质组织提取物中的C5a/脱Arg的C5a和IL-8的浓度比非炎性的原角质皮肤中的显著增加了。C5a/脱Arg的C5a浓度的增加是病变鳞片提取物特异性的。根据这些结果,似乎C5a/脱Arg的C5a是仅在优先有助于补体活化的特定情况下的炎性病变皮肤中产生的。这提供了补体活化抑制剂用于改善银屑病病变的理论基础。
尽管已经显示补体系统的经典途径在银屑病中被活化了,然而关于替代途径参与银屑病炎性反应的报道更少。在补体活化途径的传统观点范围内,补体片段C4d和Bb分别是在经典和替代途径活化时被释放的。因此C4d或Bb片段的存在标志着通过经典和/或替代途径进行的补体活化。一项研究使用酶免疫分析法测定了银屑病鳞片提取物中C4d和Bb的水平。这些皮肤病的鳞片比非炎性皮肤的角质层含有更高水平的酶免疫分析法可检测到的C4d和Bb(Takematsu,H.,etal.,Dermatologica 181:289-292,1990)。这些结果表明在银屑病病变皮肤中除了经典途径补体之外,替代途径也被活化了。
通过在缓和阶段到中间阶段测定患有特应性皮炎(AD)的35个患者和患有银屑病的24个患者的外周血中的正常补体成分和活化产物,已经获得了补体参与银屑病和特应性皮炎的额外证据。通过放射免疫扩散确定了血清中C3、C4和C1失活剂(C1 INA)的水平,而通过放射免疫分析确定了C3a和C5a水平。与健康的非特应性对照相比,发现C3、C4和C1 INA的水平在两种疾病中都显著增加了。在AD中,存在增加C3a水平的倾向,而在银屑病中,C3a水平显著增加了。这些结果表明,在AD和银屑病中,补体系统都参与了炎性过程(Ohkonohchi,K.,et al.,Dermatologica 179:30-34,1989)。
银屑病病变皮肤中的补体活化也导致了表皮中终端补体复合物的沉积,如通过测定银屑病患者的血浆和角质组织中的SC5b-9水平所确定的。已经发现银屑病血浆中的SC5b-9水平显著高于对照或者患有特应性皮炎患者中的水平。来自病变皮肤的总蛋白提取物的研究显示,尽管在非炎性角质组织中不能检测到SC5b-9,然而在银屑病的病变角质组织中有高水平的SC5b-9。通过使用抗C5b-9新生抗原的单克隆抗体的免疫荧光法,仅仅在银屑病皮肤的角质层中观察到了C5b-9的沉积。总起来说,在银屑病病变皮肤中,补体系统被活化了,补体活化一直进行到终端步骤,产生了膜攻击复合物。
最近已经可得到治疗银屑病的选择性靶向免疫系统的新的生物药剂。目前FDA批准的或者处于第3阶段研究的四种生物药剂是:alefacept()和efalizuMoAb(),它们是T细胞调节剂;etanercept(),它是可溶性TNF受体;以及inflixiMoAb(),它是抗TNF单克隆抗体。Raptiva是免疫应答调节剂,其中作用的靶向机制是封闭淋巴细胞上的LFA-1与抗原呈递细胞和血管内皮细胞上的ICAM-1之间的相互作用。通过Raptiva结合CD11a导致了淋巴细胞上提供的CD11a结合位点的饱和,下调了淋巴细胞上细胞表面CD11a的表达。这种作用机制抑制了T细胞活化、到真皮和表皮的细胞迁移以及T细胞再活化。因此,许多科学证据表明了补体在皮肤的炎性疾病状态中的作用,最近的药学方法已经靶向了免疫系统或特异性炎性过程。然而,还没有鉴别到MASP-2作为靶向手段。根据本发明人关于MASP-2在补体活化中的作用的新认识,本发明人相信MASP-2是治疗银屑病和其它皮肤失调的有效目标。
因此,本发明的一方面涉及治疗银屑病、自身免疫性大疱性皮肤病、嗜酸性海绵样水肿、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、特应性皮炎、妊娠疱疹和其它皮肤失调,以及用于治疗热烧伤和化学烧伤,包括由此引起的毛细管渗漏,其通过将包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有这些皮肤失调的受试者。MASP-2抑制剂可被局部给予受试者,通过应用含有MASP-2抑制剂的喷雾、洗剂、凝胶、糊剂、软膏或者冲洗溶液,或者全身性给药,诸如通过动脉内、静脉内、肌肉内、皮下或其它非肠道给药,以及可能通过口服用于非肽能抑制剂。治疗可能涉及对急性病的单次给药或重复的给予或给予剂量,或者对控制慢性病的周期性给予或给予剂量。
移植
补体系统的活化显著地促使了实质器官移植后的炎性反应。在同种异体移植中,补体系统可能是通过缺血/再灌注以及可能是由针对移植物的抗体而被活化的(Baldwin,W.M.,et al.,Springer SeminolImmunopathol.25:181-197,2003)。在非灵长类动物到灵长类动物的异种移植中,补体的主要活化剂是预存抗体。动物模型中的研究已经表明补体抑制剂的使用可显著延长移植物的存活(见下面)。因此,补体系统在器官移植后的器官损伤中有着确定的作用,从而本发明人相信针对MASP-2的补体抑制剂的使用可预防同种异体移植或异种移植后对移植物的损伤。
先天免疫机制特别是补体在针对移植物的炎性和免疫应答中起着比以前所认识到的更大作用。例如,替代补体途径活化似乎介导了肾缺血/再灌注损伤,邻近的肾小管细胞可能是这种环境中补体成分的来源兼攻击部位。肾中局部产生的补体也在针对移植物的细胞兼抗体介导的免疫应答的发生中起作用。
C4d是活化补体因子C4的降解产物,C4是经典和凝集素依赖途径的成分。C4d染色已经作为急性和慢性病环境中体液排斥的有用标志而出现,导致对于抗供体的抗体形成的重要性重新产生了兴趣。C4d和急性细胞排斥的形态学标志之间的关联是统计显著的。在24-43%的I型发作、45%的II型排斥和50%的III型排斥中发现了C4d(Nickeleit,V.,et al.,J.Am.Soc.Nephrol.13:242-251,2002;Nickeleit,V.,et al.,Nephrol.Dial.Transplant 18:2232-2239,2003)。正在开发许多治疗方法来抑制补体或降低局部合成,作为获得移植后改善的临床结果的手段。
补体级联活化是由于移植期间的许多过程而发生的。尽管在限制细胞排斥方面是有效的,目前的治疗方法并不能完全应付所有面临的障碍。这些障碍包括体液排斥和慢性同种异体移植肾病或功能障碍。尽管对移植器官的总体应答是就宿主而言的许多效应物机制的结果,不过补体可能在其中一些方面起着关键作用。在肾移植环境下,邻近的肾小管细胞产生的局部补体合成似乎特别重要。
补体特异性抑制剂的可用性可能提供了器官移植后改善的临床结果的可能性。通过阻滞补体攻击的机制起作用的抑制剂可能是特别有用的,因为它们保持着增加的功效,并避免了已经免疫暴露的受体中的系统性补体缺失。
补体也在异种移植排斥中起着关键作用。因此,作为可能治疗剂的有效补体抑制剂是非常值得令人关注的。在猪到灵长类动物的器官移植中,超急性排斥(HAR)是由抗体沉积和补体活化引起的。已经试验了多种策略和目标来预防猪到灵长类动物的组合中的超急性异种移植排斥。已经通过天然抗体去除、用眼镜蛇毒因子缺失补体、或者用可溶性补体抑制剂sCR1防止C3活化而实现了这些方法。此外,补体活化阻断剂(CAB-2),一种源自人衰变加速因子(DAF)和膜辅因子蛋白的重组可溶性嵌合蛋白,抑制了经典和替代途径的C3和C5转化酶。CAB-2减少了用人血液体外灌注过的猪心中补体介导的组织损伤。将猪心异位移植到未接受任何免疫抑制的恒河猴中,对CAB-2的功效研究表明,移植物存活在接受CAB-2的猴中被显著延长了(Salerno,C.T.,et al.,Xenotransplantation 9:125-134,2002)。CAB-2减少了用人血液体外灌注过的猪心中补体介导的组织损伤。将猪心异位移植到未接受任何免疫抑制的恒河猴中,对CAB-2的功效研究表明,移植物存活在接受CAB-2的猴中被显著延长了(Salerno,C.T.,et al.,Xenotransplantation 9:125-134,2002)。CAB-2显著抑制了补体活化,如通过C3a和SC5b-9产生的大大减少所显示的。在移植排斥时,iC3b、C4和C9的组织沉积与对照类似或者略微减少,IgG、IgM、C1q和纤维蛋白沉积没有变化。因此,这种补体抑制方法消除了植入恒河猴中的猪心的超急性排斥。这些研究证明了补体抑制对存活率的有利效果,本发明人相信MASP-2抑制剂在异种移植中也是有用的。
另一种方法集中于确定抗补体5的单克隆抗体能否预防大鼠到预敏化小鼠的心脏移植模型中的超急性排斥(HAR),以及这些MoAb于环孢毒素环磷酰胺一起能否获得长期的移植物存活。发现抗C5MoAb预防了HAR(Wang,H.,et al.,Transplantation 68:1643-1651,1999)。因此本发明人相信补体级联中的其它靶诸如MASP-2对于预防将来的临床异种移植中的HAR和急性血管排斥也可能是有价值的。
尽管补体在异种移植中发现的超急性排斥中的关键作用是非常确定的了,但是在同种异体移植中的深奥作用还在研究中。补体和获得性免疫应答之间的联系很久前就知道了,发现了补体缺失的动物在抗原刺激后产生了低于正常的抗体应答。已经显示了补体裂解产物C3d与抗原的调理作用极大增加了抗原呈递到B细胞的有效性,并且显示出是通过2型补体受体在某些B细胞上的结合而起作用的。这项工作已经延展到小鼠皮肤移植模型中的移植环境,在那里C3和C4缺乏的小鼠在同种抗体的产生方面显著缺乏,这是由于不能将类型转变成高亲和性IgG。由于抗供体抗体和体液排斥的重要性而增加了这些机制在肾移植中的重要性。
以前的工作已经证明,肾脏移植之后的同种异体移植物排斥期间,邻近的肾小管细胞上调了C3合成。已经在小鼠肾脏移植模型中检查了局部合成补体的作用。植入C3充分的受体中的C3阴性供体的移植物证明了与C3阳性供体的对照移植物相比,生存延长了(>100天),后者在14天之内就被排斥了。此外,与对照相比,C3阴性的移植物受体中的抗供体T细胞增值应答显著降低了,这表明了局部合成的C3在T细胞启动上的效应。
这些观察结果表明了这样的可能性,供体抗原暴露给T细胞首先是在移植物中发生的,以及局部合成的补体增强了抗原呈递,这是通过供体抗原的调理作用或者通过提供另外的信号给抗原呈递细胞或T细胞。在肾脏移植环境下,产生补体的肾小管细胞也证明了补体在它们的细胞表面上的沉积。
因此本发明的一方面涉及预防或治疗组织或实质器官移植所引起的炎性反应,其通过将包括存在于药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予移植受体,包括接受了完整器官(例如肾、心、肝、胰腺、肺、角膜等)或移植物(如瓣膜、腱、骨髓等)的同种异体移植或异种移植的受试者。MASP-2抑制剂可以通过动脉内、静脉内、肌肉内、皮下或其它非肠道给药而给予受试者,以及可能通过口服而用于非肽能抑制剂。给药可发生在移植后的急性期和/或作为长期的移植后治疗。另外地或者代替移植后给药,可在移植之前和/或移植手术期间用MASP-2抑制剂治疗受试者,和/或通过用MASP-2抑制剂来预处理待移植的器官或组织。器官或组织的预处理可能需要将含有MASP-2抑制剂的溶液、凝胶或糊剂经喷雾或冲洗表面而施加到器官或组织表面,或者可将器官或组织浸泡在含有MASP-2抑制剂的溶液中。
中枢和周围神经系统紊乱和损伤
各种中枢神经系统(CNS)或周围神经系统(PNS)疾病或损伤中涉及了补体系统的活化,包括但不限于多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、格-巴综合征、中风之后的再灌注、退行性椎间盘、脑外伤、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病(AD)。初步确定了补体蛋白在CNS细胞包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中被合成,以及认识到补体活化之后在CNS中产生的过敏毒素能改变神经元功能,这样就揭示了补体在CNS失调中的潜在作用(Morgan,B.P.,et al.,Immunology Today 17:10:461-466,1996)。现在已经表明,在神经元上发现了C3a受体和C5a受体,并表明它们广泛分布在感官、运动和边缘脑系统的各个不同部分(Barum,S.R.,Immunologic Research 26:7-13,2002)。而且,已经显示过敏毒素C5a和C3a改变了啮齿动物的饮食习惯,并能诱导小胶质细胞和神经元的钙信号。这些发现增加了有关抑制性补体活化在各种CNS炎性疾病中的治疗效用的可能性,这些疾病包括脑外伤、脱髓鞘、脑膜炎、中风以及阿尔茨海默病。
脑外伤或出血是普通的临床问题,可能发生了补体活化,并加重了所产生的炎症和水肿。已经在大鼠脑外伤模型中研究了补体抑制效应(Kaczorowski et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.15:860-864,1995)。在脑损伤之前立即给予sCR1显著地抑制了嗜中性粒细胞浸润到受伤区域,表明了补体对于吞噬细胞的募集是重要的。同样地,血浆和脑脊液(CSF)中高水平的多种补体活化产物的存在清楚表明了脑出血之后患者中的补体活化。在隔离的腰椎间盘组织中已经证实了补体活化和C5b-9复合物的增加染色,可能表明了在椎间盘突出组织诱导的坐骨神经痛中的作用(Gronblad,M.,et al.,Spine 28(2):114-118,2003)。
MS的特征在于CNS中髓磷脂包鞘并绝缘的轴突的逐渐丧失。尽管最初的原因还不知道,不过有大量证据表明涉及到免疫系统(Prineas,J.W.,et al.,Lab Invest.38:409-421,1978;Ryberg,B.,J.Neurol.Sci.54:239-261,1982)。也有清楚的证据表明,补体在CNS或PNS脱髓鞘疾病的病理生理学中发挥着突出作用,这些疾病包括MS、Guillain-Barre综合征和Miller-Fisher综合征(Gasque,P.,etal.,Immunopharmacology 49:171-186,2000;Barnum,S.R.in BondyS.et al.(eds.)Inflammatory events in neurodegeneration,ProminentPress 139-156,2001)。补体导致了组织破坏、发炎、髓磷脂碎片的清除以及甚至是轴突的髓鞘再形成。尽管有补体参与的清楚证据,补体治疗性靶的鉴别现在只是在实验性变应性脑脊髓炎(EAE)中进行评估,这是一种多发性硬化的动物模型。研究已经确定了缺乏C3或因子B的EAE小鼠显示了与EAE对照小鼠相比的减弱的脱髓鞘作用(Barnum,Immunologic Research 26:7-13,2002)。使用称为“sCrry”的可溶形式补体抑制剂和C3-/-以及因子B-/-的EAE小鼠研究证明,补体是几种水平的疾病模型的发生和进展的原因。此外,因子B-/-小鼠中的EAE严重性的显著降低提供了补体替代途径在EAE中作用的进一步证据(Nataf et al.,J.Immunology 165:5867-5873,2000)。
MG是具有乙酰胆碱受体丧失和终板破坏的神经肌肉接头疾病。sCR1在MG动物模型中非常有效,进一步表明了补体在疾病中的作用(Piddelesden et al.,J.Neuroimmunol.1997)。
神经退行性疾病AD的组织学标志是老年斑和神经纤维缠结(McGeer et al.,Res.Immunol.143:621-630,1992)。这些组织学标志对于补体系统成分也是强烈着色的。证据指向了导致神经元死亡和认知功能障碍的局部神经炎症状态。老年斑含有一场的淀粉样β肽(Aβ,这是一种源自淀粉样前体蛋白的肽。已经显示Aβ结合Cι并能引起补体活化(Rogers et al.,Res.Immunol.143:624-630,1992)。此外,AD的显著特征是与C1q到C5b-9的经典补体途径活化蛋白的关联,已经发现它们高度定位于神经炎斑块中(Shen,Y.,et al.,Brain Research769:391-395,1997;Shen,Y.,et al.,Neurosci.Letters 305(3):165-168,2001)。因此,Aβ不但起始了经典途径,而且所产生的连续炎症状态可能是神经元细胞死亡的原因。而且,AD中补体活化已经进行到终端C5b-9阶段的这一事实表明,补体系统的调节机制还不能终止补体活化过程。
已经推荐了几种补体途径抑制剂作为潜在的AD治疗手段,包括作为C1Q结合抑制剂的蛋白聚糖、作为C3转化酶抑制剂的Nafamstat、以及C5活化阻断剂或C5a受体抑制剂(Shen,Y.,et al.,Progress in Neurobiology,70:463-472,2003)。MASP-2作为先天补体途径初始步骤的作用,以及用于替代途径活化的作用提供了可能的新治疗手段,这得到了表明AD中涉及补体途径的大量数据的支持。
如同其它CNS退行性疾病中的一样,在PD患者的大脑受损区域存在炎症的证据,所述炎症的特征在于神经胶质反应(特别是小胶质细胞),以及HLA-DR抗原、细胞因子和补体成分的增加表达。这些观察结果表明免疫系统机制参与了PD中的神经元损伤的发病机理。然而还没有阐明PD中的原发性损伤的细胞机制,但有可能是线粒体突变、氧化应激和凋亡所起的作用。此外,PD纹状体和实体黑质中的神经元损伤引起的炎症可能加重了疾病过程。这些观察结果表明,补体抑制药物的治疗可能起了作用而减缓了PD的进展(Czlonkowska,A.,et al.,Med.Sci.Monit.8:165-177,2002)。
因此本发明的一方面涉及治疗周围神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)失常或损伤,通过用包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物来治疗患有这些失常或损伤的受试者。相信可根据本发明进行治疗的CNS和PNS失调和损伤包括但不限于多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、格-巴综合征、中风之后的再灌注、退行性椎间盘、脑外伤、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病(AD)、Miller-Fisher综合征、脑外伤和/或出血、脱髓鞘以及可能的脑膜炎。
对于治疗CNS病和脑外伤来说,MASP-2抑制剂可以通过动脉内、静脉内、肌肉内、皮下或其它非肠道给药而给予受试者,以及可能通过口服而用于非肽能抑制剂。可通过全身途径给药或者通过局部给药到功能障碍或创伤部位来治疗PNS病和脑外伤。可按照医师确定的那样周期性重复给药本发明的MASP-2抑制剂组合物,直到实现症状的有效缓解或控制。
血液病
脓毒症是由于患者对侵入微生物的过度反应而引起的。补体系统的主要功能是协调对侵入细菌和其它病原体的炎性应答。与这种生理作用相一致,许多研究中已经显示了补体活化在脓毒症的发病机理中具有主要作用(Bone,R.C.,Annals.Internal.Med.115:457-469,1991)。脓毒症的临床表现的定义是不断发展的。通常将脓毒症定义为对感染的系统性宿主应答。然而,在许多情况下,有脓毒症症状的患者中没有发现感染的临床证据(如阳性的细菌性血液培养)。这个矛盾首先是在1992年的集体会议上确定术语“全身炎症反应综合征”(SIRS)时被注意到的,SIRS不需要细菌感染的可确定性存在(Bone,R.C.,et al.,Crit.Care Med.20:724-726,1992)。现在一般同意,脓毒症和SIRS伴随着不能调控炎性应答。为了该暂时的回顾,我们将把脓毒症的临床定义考虑为也包括严重脓毒症、脓毒症性休克和SIRS。
在1980年代晚期之前,脓毒症患者的主要感染源是革兰氏阴性细菌。已经知道,革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分脂多糖(LPS)刺激了炎性介质从各种细胞类型的释放,当注射到动物中时诱导了急性感染症状(Haeney,M.R.,et al.,Antimicrobial Chemotherapy41(Suppl.A):41-6,1998)。有趣的是,作为病源的微生物的范围似乎从1970年代晚期和1980年代主要是革兰氏阴性细菌变成了现今主要是革兰氏阳性细菌,目前还不清楚是因为什么原因(Martin,G.S.,etal.,N.Eng.J.Med.348:1546-54,2003)。
许多研究已经显示了补体活化在介导炎症中的重要性,导致了休克特别是脓毒症性和失血性休克的特征。革兰氏阴性和革兰氏阳性生物一般都促成脓毒症性休克。LPS是有效的补体活化剂,主要经由替代途径,尽管也发生抗体介导的经典途径活化(Fearon,D.T.,et al.,N.Engl.J.Med.292:937-400,1975)。革兰氏阳性细胞壁的主要成分是肽聚糖和脂磷壁酸,两种成分都是替代补体途径的有效活化剂,尽管在特异性抗体存在时,它们也能活化经典补体途径(Joiner,K.A.,et al.,Ann.Rev.Immunol.2:461-2,1984)。
当研究人员注意到过敏毒素C3a和C5a介导了脓毒症期间也可能发生的各种炎性反应时,才开始知道脓毒症发病机理中涉及补体系统。这些过敏毒素引起了血管舒张和微血管通透性的增加,这些是在脓毒症性休克中起着中枢作用的事件(Schumacher,W.A.,et al.,Agents Actions 34:345-349,1991)。此外,过敏毒素诱导了支气管痉挛、组胺从肥大细胞的释放以及血小板的聚集。而且,它们对粒细胞发挥了许多作用,诸如趋化、聚集、粘附、溶酶体酶的释放、毒性超氧化物阴离子的产生和白三烯的形成(Shin,H.S.,et al.,Science162:361-363,1968;Vogt,W.,Complement 3:177-86,1986)。据认为这些生物性作用在脓毒症并发症的发生中起着作用,诸如休克或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(Hammerschmidt,D.E.,et al.,Lancet 1:947-949,1980;Slotman,G.T.,et al.,Surgery 99:744-50,1986)。此外,过敏毒素C3a水平的增加与脓毒症的致命结果是相关联的(Hack,C.E.,et al.,Am.J.Med.86:20-26,1989)。在一些休克的动物模型中,某些补体缺乏品系(如C5缺乏的品系)对LPS的浸入效应具有更高的抗性(Hseuh,W.,et al.,Immunol.70:309-14,1990)。
在啮齿动物脓毒症发生期间,用抗体阻断C5a的形成,表明极大的改善了存活率(Czermak,B.J.,et al.,Nat.Med.5:788-792,1999)。当用抗体或小分子抑制剂阻断C5a受体(C5aR)时,有着类似的发现(Huber-Lang,M.S.,et al.,FASEB J.16:1567-74,2002;Riedemann,N.C.,et al.,J.Clin.Invest.110:101-8,2002)。在猴子中的早期实验研究已经表明,将C5a用抗体阻断减少了大肠杆菌诱导的脓毒症性休克和成人呼吸窘迫综合征(Hangen,D.H.,et al.,J.Surg.Res.46:195-9,1989;Stevens,J.H.,et al.,J.Clin.Invest.77:1812-16,1986)。与较不严重的脓毒症性患者和幸存者相比,患有脓毒症的人中C5a增加了,这是与显著降低的存活率以及多器官衰竭相关联的(Nakae,H.,etal.,Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.84:189-95,1994;Nakae,et al.,Surg.Today 26:225-29,1996;Bengtson,A.,et al.,Arch.Surg.123:645-649,1988)。C5a在脓毒症期间发挥其有害作用的机制还有待更详细的研究,但是最近的数据表明,脓毒症期间C5a的产生极大损害了血液嗜中性粒细胞的先天免疫功能(Huber-Lang,M.S.,et al.,J.Immunol.169:3223-31,2002)、它们表达呼吸爆发的能力以及它们产生细胞因子的能力(Riedemann,N.C.,et al.,Immunity19:193-202,2003)。此外,脓毒症期间的C5a产生似乎具有促凝血效应(Laudes,I.J.,et al.,Am.J.Pathol.160:1867-75,2002)。也已经显示了补体调节蛋白CI INH在脓毒症和ARDS动物模型中的功效(Dickneite,G.,Behring Ins.Mitt.93:299-305,1993)。
凝集素途径在脓毒症的发病机理中也可能有作用。已经显示MBL结合到临床上重要的微生物上,包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,并活化了凝集素途径(Neth,O.,et al.,Infect.Immun.68:688,2000)。人们日益认为脂磷壁酸(LTA)是LPS的革兰氏阳性对应物。它是诱导细胞因子从单核吞噬细胞和全血中释放的有效免疫刺激剂(Morath,S.et al.,J.Exp.Med.195:1635,2002;Morath,S.et al.,Infect.Immun.70:938,2002)。最近证明了L-ficolin特异性结合到分离自许多革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌的LTA上,并活化了凝集素途径(Lynch,N.J.,et al.,J.Immunol.172:1198-02,2004)。也已经显示MBL结合到来自肠球菌属的多聚甘油磷酸链被糖基取代的LTA上,但是不结合到来自九种其它菌种包括金黄色葡萄球菌的LTA上(Polotsky,V.Y.,et al.,Infect.Immun.64:380,1996)。
因此本发明的一方面提供了治疗脓毒症或脓毒症引起的疾病的方法,通过将包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有脓毒症或脓毒症引起的疾病的受试者,包括但不限于严重脓毒症、脓毒症性休克、脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征、以及全身性炎性应答综合征。提供了治疗其它血液病的有关方法,这些血液病包括但不限于失血性休克、溶血性贫血、自身免疫性血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)、溶血性尿毒症综合征(HUS)或其它骨髓/血液破坏性疾病,通过将包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有这些疾病的受试者。MASP-2抑制剂可以通过诸如动脉内、静脉内、肌肉内、吸入(特别是在ARDS的情况下)、皮下或其它非肠道给药而全身性给予受试者,以及可能通过口服而用于非肽能抑制剂。MASP-2抑制剂组合物可与一种或多种另外的治疗剂组合以对付脓毒症和/或休克的后遗症。对于晚期脓毒症或休克或者由此引起的窘迫性疾病来说,MSAP-2抑制剂合适地能以快速作用剂量形式进行给药,诸如通过静脉内或动脉内送递含有MASP-2抑制剂组合物的一剂溶液。可按照医师确定的那样进行重复给药,直到疾病消退。
泌尿生殖疾病
已经表明补体系统参与了几种截然不同的泌尿生殖器失调,包括疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎和间质性膀胱炎(Holm-Bentzen,M.,et al.,J.Urol.138:503-507,1987)、不育(Cruz,et al.,Biol.Reprod.54:1217-1228,1996)、妊娠(Xu,C.,et al.,Science287:498-507,2000)、胎儿母体耐受(Xu,C.,et al.,Science 287:498-507,2000)以及先兆子痫(Haeger,M.,Int.J.Gynecol.Obstet.43:113-127,1993)。
疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎和间质性膀胱炎是未知病因和发病机理的不明疾病,因此它们没有任何合理的治疗方法。涉及膀胱的上皮和/或粘膜表面层缺陷的发病理论,以及涉及免疫紊乱的理论是占主流的(Holm-Bentzen,M.,et al.,J.Urol.138:503-507,1987)。据报道已经测试了患间质性膀胱炎的患者的免疫球蛋白(IgA、G、M)、补体成分(C1q、C3、C4)和C1酯酶抑制剂。补体成分C4的血清水平有非常显著的减少(p小于0.001),免疫球蛋白G显著增加(p小于0.001)。该研究表明了补体系统经典途径的活化,支持了疾病的发病机理涉及慢性局部免疫学过程这种可能性(Mattila,J.,et al.,Eur.Urol.9:350-352,1983)。而且,在自身抗体结合到膀胱粘膜抗原上之后,补体活化可能参与了组织损伤的产生以及这种疾病典型的自我保持性炎症的产生(Helin,H.,et al.,Clin.Immunol.Immunopathol.43:88-96,1987)。
除了补体在泌尿生殖器炎性疾病中的作用之外,生殖功能也可能受到补体途径的局部调控的影响。天然产生的补体抑制剂已经发展到了提供宿主细胞所需的保护以控制体内的补体系统。已经研究了Crry来描述胚胎发育中的补体调控,Crry是天然产生的啮齿动物补体抑制剂,在结构上类似于人补体抑制剂MCP和DAF。有趣的是,产生Crry-/-小鼠的努力没有成功。相反,发现纯合的Crry-/-小鼠死在子宫中了。Crry-/-胚胎存活到交配后大约10天,存活者随着发育停止导致的死亡而迅速减少了。炎性细胞也显著侵入了Crry-/-胚胎的胎盘组织中。相比之下,Crry+/+胚胎似乎具有沉积在胎盘上的C3。这表明补体活化在胎盘水平上发生了,在缺少补体调控时,胚胎就死掉了。确证性研究探索了将Crry突变引入到C3缺乏背景中。该补救性策略是成功的。总起来,这些数据说明了必须调控胎儿母体的补体界面。胎盘中补体调控的微妙变化可能是胎盘功能障碍和流产的原因(Xu,C.,et al.,Science 287:498-507,2000)。
先兆子痫是妊娠引起的高血压性失调,其中涉及到补体系统活化,不过仍然是有争议的(Haeger,M.,Int.J.Gynecol.Obstet.43:113-127,1993)。体循环的补体活化与先兆子痫中确定的疾病紧密相关,但是在临床症状存在之前没有发现增加,因此不能将补体成分用作先兆子痫的预测因子(Haeger,et al.,Obstet.Gynecol.78:46,1991)。然而,在胎盘床局部环境中增加的补体活化可能克制了局部调控机制,导致了过敏毒素和C5b-9水平的增加(Haeger,et al.,Obstet.Gynecol.73:551,1989)。
与抗精子抗体(ASA)相关的不育的一种所主张的机制是通过生殖道中补体活化的作用。C3b和iC3b调理素的产生是与不育减少所相关的可能原因,它们能通过吞噬细胞经补体受体而增强精子的结合以及终端C5b-9复合物在精子表面上的形成,从而降低了精子的活动力。在不孕妇女的卵巢卵泡液中也证实了C5b-9水平的增加(D'Cruz,O.J.,et al.,J.Immunol.144:3841-3848,1990)。其它研究已经显示了精子移动的削弱以及精子/卵子相互作用的减少,这些可能是补体相关联的(D'Cruz,O.J.,et al.,J.Immunol.146:611-620,1991;Alexander,N.J.,Fertil.Steril.41:433-439,1984)。最后,用sCR1进行的研究证实了对ASA-和补体介导的人精子损伤的保护性作用(D'Cruz,O.J.,et al.,Biol.Reprod.54:1217-1228,1996)。这些数据为补体抑制剂在治疗泌尿生殖器疾病和失调中的用途提供了几条证据。
因此本发明的一方面提供了抑制患有泌尿生殖疾病的患者中MASP-2依赖的补体活化的方法,通过将包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有这些病的受试者。相信可用本发明的方法和组合物进行治疗性处理的泌尿生殖器失调以非限制性例子的方式包括疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎和间质性膀胱炎、男女不育、胎盘功能障碍以及流产和先兆子痫。MASP-2抑制剂可以通过诸如动脉内、静脉内、肌肉内、吸入、皮下或其它非肠道给药而全身性给予受试者,或者可能通过口服而用于非肽能抑制剂。或者,MASP-2抑制剂组合物可局部给药到泌尿生殖道,诸如通过用液体溶液或凝胶组合物进行膀胱内冲洗或滴注。可按照医师确定的那样进行重复给药以控制或消除疾病。
糖尿病和糖尿病性疾病
糖尿病性视网膜微血管病变的特征是增加的通透性、白细胞淤滞、微血栓形成以及微血管细胞的凋亡,所有这些都可能是由补体活化所引起或促进的。糖尿病患者的肾小球结构和神经内微血管都显示了补体活化的迹象。糖尿病中补体抑制剂的利用度或有效性降低了,这是通过高含量葡萄糖在体外选择性地降低了两种抑制剂CD55和CD59在内皮细胞表面的表达这一发现所表明的,CD55和CD59是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白,CD59经历了非酶的糖基化作用,这阻碍了它的补体抑制功能。
Zhang et al.的研究(Diabetes 51:3499–3504,2002)探索了作为人非增殖性糖尿病性视网膜病变特征的补体活化以及它与抑制分子变化的关联。发现补体活化终端产物C5b-9的沉积在患2型糖尿病的人眼供体的视网膜血管壁上发生了,但在衰老相关的非糖尿病性供体血管中没有发生。经典途径独特的补体成分C1q和C4在糖尿病性视网膜中没有检测到,这表明C5b-9是经替代途径产生的。糖尿病性供体显示了CD55和CD59的视网膜水平的显著降低,这是两种由GPI锚连接到质膜上的补体抑制剂。在链脲霉素引起的糖尿病持续10周的大鼠中观察到了视网膜血管中类似的补体活化以及视网膜CD55和CD59水平的选择性降低。因此,糖尿病似乎引起了补体抑制剂的缺陷性调节以及补体活化,它们先于糖尿病性视网膜性微血管病变的大多数表现。
Gerl et al.(Investigative Ophthalmology and Visual Science43:1104-08,2000)确定了受糖尿病性视网膜病变影响的眼中活化补体成分的存在。免疫组织化学研究发现了补体C5b-9复合物的大量沉积,所有50个糖尿病性视网膜病变样品都在紧邻Bruch膜之下并紧包毛细管的脉络膜血管层中检测到了。C3d的染色与C5b-9染色正相关,表明了补体活化在原位发生的事实。此外,发现了vitronectin的阳性染色,它与胞外C5b-9形成了稳定的复合物。相反,没有C反应性蛋白(CRP)、甘露聚糖结合的凝集素(MBL)、C1q或C4的阳性染色,表明补体活化不是通过C4依赖的途径发生的。因此,C3d、C5b-9和vitronectin的存在表明补体活化发生完全了,可能是通过受糖尿病性视网膜病变影响的眼脉络膜血管层中的替代途径发生的。补体活化可能是导致眼组织疾病和视觉缺陷的病理性后遗症的病因因素。因此,补体抑制剂的使用可能是减少或阻断糖尿病中发生的微血管损伤的有效治疗方法。
胰岛素依赖型糖尿病(IDDM,也称为I型糖尿病)是与不同类型自身抗体的存在相关联的自身免疫疾病(Nicoloff et al.,Clin.Dev.Immunol.11:61-66,2004)。这些抗体和相应抗原在循环中的存在导致了循环免疫复合物(CIC)的形成,已知CIC是在血液中长期持续存在的。CIC在小血管中的沉积有可能导致有衰弱性临床结果的微血管病。糖尿病儿童中CIC和微血管并发症的发生存在关联。这些发现表明CIC IgG水平的上升是与早期糖尿病性视网膜病变的发生相关联的,补体途径抑制剂可能对于阻断糖尿病性视网膜病变是有效的(Kotnik,et al.,Croat.Med.J.44:707-11,2003)。此外,下游补体蛋白的形成和替代途径的参与可能是岛细胞在IDDM中总体功能的影响因素,使用补体抑制剂来减少可能的损伤或限制细胞死亡是令人期待的(Caraher,et al.,J.Endocrinol.162:143-53,1999)。
在发明的另一方面,提供了抑制患有非肥胖性糖尿病(IDDM)或血管病、神经病或IDDM视网膜病变并发症或成人发病的(2型)糖尿病的受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,通过将包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予受试者。MASP-2抑制剂可以通过诸如动脉内、静脉内、肌肉内、皮下或其它非肠道给药而全身性给予受试者,或者可能通过口服而用于非肽能抑制剂。或者,给药可通过局部送递到血管病症状、神经病症状或视网膜病变症状的部位。为治疗或控制慢性病,MASP-2抑制剂可在延长的时间段中周期性给药,或者通过单次或系列给药来治疗急性病。
化学治疗前后的给药和恶性肿瘤的治疗
补体系统的活化也可能参与恶性肿瘤的发病机理。最近,使用多克隆或单克隆抗体以及抗生物素蛋白链菌素-生物素-过氧化物酶技术定位了17个乳腺癌样品和6个良性乳腺肿瘤样品上的C5b-9补体复合物新生抗原、IgG、C3、C4、S蛋白/vitronectin、纤连蛋白和巨噬细胞。所有的癌组织样品在每个TNM阶段都出现了肿瘤细胞膜上的C5b-9沉积,细胞残留物上的细颗粒,以及坏死区域的弥散沉积(Niculescu,F.,et al.,Am.J.Pathol.140:1039-1043,1992)。
此外,补体活化可能是化学治疗或放射治疗的结果,因此补体活化的抑制作为恶性肿瘤治疗的辅助剂减少医源性炎症将是有用的。当手术之前进行化学治疗和放射治疗时,C5b-9沉积更强烈和长期。C5b-9沉积在所有良性病变中都不存在。S蛋白/vitronectin是作为结缔组织基质中的纤维状沉积以及肿瘤细胞周围的弥散沉积而存在的,不如纤连蛋白强烈和长期。IgG、C3和C4沉积只在癌样品中存在。乳腺癌中C5b-9沉积的存在是补体活化和它随后的致病效应的征兆(Niculescu,F.,et al.,Am.J.Pathol.140:1039-1043,1992)。
脉冲式可调谐染料激光器(577nm)(PTDL)治疗诱导了血红蛋白凝固和组织坏死,这主要限于血管中。在PTDL照射的正常皮肤研究中,主要发现如下:1)C3片段、C8、C9和MAC沉积在血管壁上;2)这些沉积不是由于蛋白变性,因为它们仅仅在照射7分钟后就就很明显了,相比之下转铁蛋白立即沉积在红细胞凝固部位上;3)显示C3沉积通过替代途径放大了补体活化,这是特异性的反应,因为组织坏死本身并不导致这种放大作用;以及4)这些反应是在多形核白细胞局部累积之前发生的。组织坏死在血管瘤中更显著。坏死中心更大的血管瘤血管并不显著固定补体。相反,位于外周血管中的补体沉积类似于正常皮肤中所观察到的,除了一个例外:在激光器治疗后立即在一些血管中检测到了C8、C9和MAC,这个发现与没有C5转化酶形成而直接发生MAC装配相一致的。这些结果表明补体是在PTDL诱导的血管坏死中被活化的,可能是随后的炎性应答的原因。
肿瘤的光动力学治疗术(PDT)引起了强烈的宿主免疫应答,其表现之一就是显著的嗜中性粒细胞增多。除了由于PDT诱导的补体活化结果而释放的补体片段(直接介质),还有至少一打由于补体活化结果而引起的间接介质。后者包括细胞因子IL-1beta、TNF-α、IL-6、L-10、G-CSF和KC、血栓素、前列腺素、白三烯、组胺、以及凝血因子(Cecic,I.,et al.,Cancer Lett.183:43-51,2002)。
最后,可以展望将MASP-2依赖的补体活化的抑制剂用来与癌症治疗的标准治疗方案结合。例如,用rituximab、嵌合抗CD20单克隆抗体的治疗可能与缓和到严重的首剂副作用相关联,特别是在有着大量循环肿瘤细胞的患者中。最近在首次注入rituximab的研究中测定了五个复发的轻度非何杰金淋巴瘤患者中的补体活化产物(C3b/c和C4b/c)和细胞因子(肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和IL-8)。rituximab的注入诱导了迅速的补体活化,其先于TNF-α、IL-6和IL-8的释放。尽管研究组很小,补体活化水平似乎是与注入前的循环B细胞数量(r=0.85;P=0.07)以及副作用的严重性相关联。这些结果表明补体在rituximab治疗副作用的发生机制中起着关键作用。因为补体活化不能皮质甾类预防,所以它可能是与补体抑制剂在rituximab的首次给药期间的可能作用的研究相关的(vander Kolk,L.E.,et al.,Br.J.Haematol.115:807-811,2001)。
在本发明的另一方面,提供了抑制受试者中MASP-2依赖的补体活化的方法,该受试者在用化学治疗和/或放射治疗进行治疗,包括但不限于癌症的治疗。该方法包括将包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予化学治疗前后的患者,即在给予化学治疗和/或放射治疗之前和/或期间和/或之后。例如,本发明的MASP-2抑制剂组合物的给予可以在施加化学治疗或放射治疗之前开始或者同时开始,在整个治疗过程期间持续,以降低化学治疗和/或放射治疗在非预定目标的健康组织中的有害影响。此外,MASP-2抑制剂组合物可以在化学治疗和/或放射治疗之后给予。可以理解的是,化学治疗和放射治疗方案经常需要重复治疗,因此MASP-2抑制剂组合物的给予也可能是重复性的,并与化学治疗和放射治疗相对一致。也相信MASP-2抑制剂可用作化学治疗剂,单独或与其它化学治疗剂和/或放射治疗相结合,以治疗患有恶性肿瘤的患者。给药可以合适地通过口服(用于非肽能的)、静脉内、肌肉内或其它非肠道途径。
内分泌失调
最近也发现补体系统参与了一些内分泌疾病或失调,包括桥本甲状腺炎(Blanchin,S.,et al.,Exp.Eye Res.73(6):887-96,2001)、应激、焦虑以及其它可能的涉及来自垂体的促乳素、生长因子或胰岛素样生长因子和促肾上腺皮质激素受调节释放的激素失调(Francis,K.,et al.,FASEB J.17:2266-2268,2003;Hansen,T.K.,Endocrinology144(12):5422-9,2003)。
使用诸如激素和细胞因子这样的分子在内分泌系统和免疫系统之间形成了双向联系。最近,阐明了一种新途径,通过该途径,补体衍生的细胞因子C3a刺激了垂体前叶激素的释放并活化了下丘脑-垂体-肾上腺轴,以及对应激反应和炎症控制的重要反射作用。C3a受体在分泌垂体激素和不分泌垂体激素(卵泡星形细胞)的细胞中被表达了。C3a和脱Arg的C3a(非炎性代谢物)刺激了垂体细胞培养物释放促乳素、生长因子和促肾上腺皮质激素。这些激素以及肾上腺皮质酮的血清水平增加了,其依赖于重组C3a和脱Arg的C3a的体内给药剂量。这表明补体途径通过与内分泌腺垂体的联系而调节组织特异性和全身性炎性应答(Francis,K.,et al.,FASEB J.17:2266-2268,2003)。
越来越多的动物和人体研究表明生长激素(GH)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)调节了免疫功能。GH治疗增加了垂危患者的死亡率。过量的死亡几乎完全是由于脓毒症性休克或者多器官衰竭,这可能表明涉及了GH诱导的免疫和补体功能的调节。甘露聚糖结合的凝集素(MBL)是在先天免疫中起着重要作用的血浆蛋白,它通过结合到糖结构上后补体级联的活化和炎症而起作用的。有证据支持生长激素对MBL水平的重要影响,因此可能是对凝集素依赖的补体活化的影响(Hansen,T.K.,Endocrinology 144(12):5422-9,2003)。
甲状腺过氧化物酶(TPO)是自身免疫甲状腺病中涉及的主要自身抗原之一。TPO由大的N末端髓过氧化物酶样结构域继之以补体调节蛋白(CCP)样结构域和表皮生长因子样结构域组成。CCP结构域是C4补体成分活化中涉及到的分子组成部分,进行了研究来探索C4可否结合到TPO上并活化自身免疫病中的补体途径。TPO通过它的CCP结构域直接活化了补体,没有通过Ig的任何介导。而且,在桥本甲状腺炎患者中,甲状腺过量表达C4和所有的补体途径下游组分。这些结果表明,TPO以及补体途径活化相关的其它机制一起,可能是桥本甲状腺炎中观察到的大量细胞破坏的原因(Blanchin,S.,et al.,2001)。
因此本发明的一方面提供了用于抑制MASP-2依赖的补体活化以治疗内分泌失调的方法,通过将包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有内分泌失调的受试者。根据本发明进行治疗的疾病以非限制性例子的方式包括桥本甲状腺炎、应激、焦虑以及其它可能的涉及来自垂体的促乳素、生长因子或胰岛素样生长因子和促肾上腺皮质激素受调节释放的激素失调。MASP-2抑制剂可通过诸如动脉内、静脉内、肌肉内、吸入、鼻、皮下或其它非肠道给药而全身性给予受试者,或者可能通过口服用于非肽能试剂。MASP-2抑制剂组合物可以与一种或多种另外治疗剂结合。可按照医师确定的那样重复给药直到疾病消退。
眼病
衰老相关的黄斑变性(AMD)是折磨数百万成人的失明疾病,然而导致AMD发生的生物化学、细胞和/或分子事件后遗症还不是很了解。AMD导致了黄斑的渐进性破坏,这是与位于黄斑中或其周围、视网膜之后以及视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜之间的称为玻璃疣的胞外沉积的形成相关联的。最近的研究显示,与炎症和免疫介导过程相关的蛋白质在玻璃疣相关成分中是普遍的。编码许多这些分子的转录本已经在视网膜、RPE和脉络膜细胞中被检测到了。这些数据也证明,作为有效抗原呈递细胞的树突细胞与玻璃疣的发生密切关联,补体活化是玻璃疣内部以及沿着RPE-脉络膜界面的关键途径(Hageman,G.S.,et al.,Prog.Retin.Eye Res.,20:705-732,2001)。
几个独立研究已经显示了AMD与补体因子(CFH)基因的遗传多形性之间有很强的关联性,其中AMD的可能性在危险等位基因纯合的个体中增加了7.4倍(Klein,R.J.et al.,Science,308:362-364,2005;Haineset al.,Science 308:362-364.2005;Edwards et al.,Science 308:263-264,2005)。CFH基因已经被定位在染色体1q31上的区域,该区域已经通过六个独立连锁扫描确定在AMD中涉及(see,e.g.,D.W.Schultz et al.,Hum.Mol.Genet.12:3315,2003)。已知CFH是补体系统的关键调节剂。已经显示在细胞上和循环中的CFH通过抑制C3活化成C3a和C3b以及通过失活现有C3b而调节补体活性。已经在AMD患者的Brusch膜、毛细管间支柱中以及玻璃疣内部观察到了C5b-9的沉积(Klein et al.)。免疫荧光实验表明在AMD中,CFH的多形性可能引起了脉络膜毛细管和脉络膜血管中的补体沉积(Klein et al.)。
膜结合的补体抑制剂——补体受体1也定位在玻璃疣中,但是在RPE细胞中经免疫组织化学法没有检测到它。相比之下,第二种膜结合补体抑制剂膜——辅因子蛋白存在于玻璃疣相关的RPE细胞中以及玻璃疣内部的小的、球形的亚结构元件中。这些以前未识别的元件也显示出了对特征性沉积在补体活化部位的补体成分C3蛋白水解片段的很强免疫反应性。有人提出这些结构代表来自作为补体攻击目标的退行性RPE细胞的残余碎片(Johnson,L.V.,et al.,Exp.Eye Res.73:887-896,2001)。
因此本发明的一方面提供了用于抑制MASP-2依赖的补体活化的方法,以治疗衰老相关的黄斑变性或其它补体介导的眼病,其通过将包括存在于药学载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂的组合物给予患有这些疾病或其它补体介导的眼病的受试者。MASP-2抑制剂可通过诸如凝胶、软膏或滴剂形式的组合物的冲洗或敷贴而局部给予眼部。或者,MASP-2抑制剂可通过诸如动脉内、静脉内、肌肉内、吸入、鼻、皮下或其它非肠道给药而全身性给予受试者,或可能通过口服用于非肽能试剂。MASP-2抑制剂组合物可与一种或多种另外治疗剂组合,诸如美国专利申请公开号No.2004-0072809-A1中所披露的。可按照医师所确定的那样重复给药直到疾病消退或得到控制。
IV.MASP-2抑制剂
一方面,本发明提供了用于抑制MASP-2依赖的补体活化的不利效应的方法。MASP-2抑制剂是以有效抑制活的受试者中MASP-2依赖的补体活化的量给予的。在本发明这个方面的实施中,代表性的MASP-2抑制剂包括:抑制MASP-2生物活性的分子(诸如小分子抑制剂、与MASP-2相互作用或妨碍蛋白-蛋白相互作用的抗MASP-2抗体或封闭性肽),以及减少MASP-2表达的分子(诸如MASP-2反义核酸分子、MASP-2特异的RNAi分子和MASP-2核酶),从而阻止MASP-2活化替代补体途径。MASP-2抑制剂可单独使用作为基本治疗,或者与其它治疗剂协同作为辅助治疗以增强其它药物治疗的治疗好处。
MASP-2依赖的补体活化的抑制是以补体系统成分的至少一种下面的变化为特征的,所述变化是由于给予根据本发明的方法的MASP-2抑制剂而发生的:MASP-2依赖的补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9(MAC)生成或产生的抑制(例如通过实施例2描述的那样进行测定),使用未敏化的兔或豚鼠红细胞在溶血分析中评估的替代补体活化的减少,C4裂解和C4b沉积的减少(例如通过实施例2描述的那样进行测定),或者C3裂解和C3b沉积的减少(例如通过实施例2描述的那样进行测定)。
根据本发明,利用了有效抑制MASP-2依赖的补体活化系统的MASP-2抑制剂。在本发明这个方面的实施中有用的MASP-2抑制剂包括例如抗MASP-2抗体及其片段,MASP-2抑制性肽,小分子,MASP-2可溶性受体和表达抑制剂。MASP-2抑制剂可能通过阻断MASP-2的生物学功能而抑制MASP-2依赖的补体活化系统。例如,抑制剂可有效阻断MASP-2蛋白-蛋白相互作用,阻碍MASP-2的二聚化或装配,阻断Ca2+结合,阻碍MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点,或者可减少MASP-2蛋白表达。
在一些实施方案中,MASP-2抑制剂选择性抑制MASP-2补体活化,而保持C1q依赖的补体活化系统的功能性完整。
在一个实施方案中,在本发明的方法中有用的MASP-2抑制剂是特异性的MASP-2抑制剂,其特异性结合到包括SEQ ID NO:6的多肽上的亲和力比结合到补体系统的其它抗原上的亲和力至少高10倍。在另一个实施方案中,MASP-2抑制剂特异性结合到包括SEQ ID NO:6的多肽上的结合亲和力比结合到补体系统的其它抗原上的结合亲和力至少高100倍。MSAP-2抑制剂的结合亲和力可使用合适的结合分析法进行确定。
MASP-2多肽显示了类似于C1补体系统的蛋白酶MASP-1、MASP-3以及C1r和C1s的分子结构。SEQ ID NO:4所示的cDNA分子编码MASP-2的代表性例子(由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成),提供了带有分泌后要被裂解的前导序列(aa 1-15)的人MASP-2,产生了人MASP-2的成熟形式(SEQ ID NO:6)。如图2中所示,人MASP 2基因包含十二个外显子。人MASP-2cDNA由外显子B、C、D、F、G、H、I、J、K和L编码。选择性剪接产生了称为MBL结合的蛋白质19(“MAp19”)(SEQ ID NO:2)的20kDa蛋白,由图2显示的外显子B、C、D和E形成的(SEQ ID NO:1)所编码。SEQ ID NO:50所示的cDNA分子编码鼠MASP-2(由SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列组成),提供了带有分泌后要被裂解的前导序列的鼠MASP-2多肽,产生了鼠MASP-2的成熟形式(SEQ ID NO:52)。SEQ ID NO:53所示的cDNA分子编码大鼠MASP-2(由SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列组成),提供了带有分泌后要被裂解的前导序列的大鼠MASP-2多肽,产生了大鼠MASP-2的成熟形式(SEQ ID NO:55)。
本领域技术人员将认识到,SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQID NO:53中公开的序列分别代表人、鼠和大鼠MASP-2的单个等位基因,发生等位基因变异和选择性剪接是预料之中的。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53所示核苷酸序列的等位基因变异体都在本发明的范围内,包括那些含有沉默突变的变异体以及那些其中含有导致氨基酸序列改变的突变的变异体。可根据标准程序经探针分析cDNA或基因组文库而从不同个体中克隆MASP-2序列的等位基因变异体。
人MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)的结构域示于图3A中,包括N末端Clr/Cls/海胆Vegf/骨形成蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO:6的aa 1-121),表皮生长因子样结构域(aa 122-166),第二CUBI结构域(aa 167-293),以及串联的补体调控蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。MASP 2基因的选择性剪接产生了图3B所示的MAp19。MAp19是含有MASP-2的N末端CUB1-EGF区域的非酶蛋白,带有源自图2所示的外显子E的四个额外残基(EQSL)。
已经显示几种蛋白通过蛋白-蛋白相互作用结合到MASP-2上或者与MASP-2相互作用。例如,已知MASP-2结合到凝集素蛋白MBL、H-ficolin和L-ficolin上,并与其形成Ca2+依赖的复合物。已经显示每种MASP-2/凝集素复合物通过蛋白C4和C2的MASP-2依赖的裂解而活化补体(Ikeda,K.,et al.,J.Biol.Chem.262:7451-7454,1987;Matsushita,M.,et al.,J.Exp.Med.176:1497-2284,2000;Matsushita,M.,et al.,J.Immunol.168:3502-3506,2002)。研究表明,MASP-2的CUB1-EGF结构域对于MASP-2与MBL的结合是必不可少的(Thielens,N.M.,et al.,J.Immunol.166:5068,2001)。也已经显示CUB1EGFCUBII结构域介导MASP-2的二聚化,这是形成活性MBL复合物所需要的(Wallis,R.,et al.,J.Biol.Chem.275:30962-30969,2000)。因此,可对结合到已知对MASP-2依赖的补体活化重要的MASP-2靶区域上或者阻碍该区域的MASP-2抑制剂进行鉴别。
抗MASP-2抗体
在本发明这个方面的一些实施方案中,MASP-2抑制剂包括抑制MASP-2依赖的补体活化系统的抗MASP-2抗体。在本发明这个方面有用的抗MASP-2抗体包括源自任何产生抗体的哺乳动物的多克隆、单克隆或重组抗体,可以是多特异性的、嵌合的、人源化的、抗独特型的、以及抗体片段。抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv片段、scFv片段和单链抗体,如本文进一步描述的。
文献中已经描述了几种抗MASP-2抗体,其中一些列在下面的表1中。可使用本文描述的分析法筛选其抑制MASP-2依赖的补体活化系统的能力而筛选到这些以前描述过的抗MASP-2抗体。一旦鉴别到起MASP-2抑制剂作用的抗MASP-2抗体,就可将它用于产生抗独特型抗体以及用于鉴别其它MASP-2结合分子,如下面进一步描述的。
表1:文献记载的MASP-2特异性抗体
具有降低的效应物功能的抗MASP-2抗体
在本发明这个方面的一些实施方案中,为了减少经典补体途径活化所可能产生的炎症,抗MASP-2抗体具有降低的效应物功能。已经显示IgG分子引发经典补体途径的能力存在于分子的Fc部分(Duncan,A.R.,et al.,Nature 332:738-7401988)。已经通过酶学裂解去除分子Fc部分的IgG分子就缺少了这个效应物功能(见Harlow,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988)。因此,可由于缺少分子的Fc部分而产生降低了效应物功能的抗体,所述缺失是通过带有使效应物功能最小化的遗传工程化Fc序列,或者具有人IgG2或IgG4同种型。
可通过如实施例9中描述的那样对IgG重链的Fc部分进行标准分子生物学操作来产生具有降低的效应物功能的抗体,这也描述于Jolliffe,et al.,Int'l Rev.Immunol.10:241-250,11993以及Rodrigues,et al.,J.Immunol.151:6954-6961,1998。具有降低的效应物功能的抗体也包括具有降低的活化补体和/或与Fc受体相互作用的能力的人IgG2和IgG4同种型(Ravetch,J.V.,et al.,Annu.Rev.Immunol.9:457-492,1991;Isaacs,J.D.,et al.,J.Immunol.148:3062-3071,1992;van de Winkel,J.G.,et al.,Immunol.Today 14:215-221,1993)。可通过本领域普通技术人员已知的几种方法之一来产生包括IgG2或IgG4同种型的特异于人MASP-2的人源化或完全的人抗体,如Vaughan,T.J.,et al.,Nature Biotechnical 16:535-539,1998中所述的。
抗MASP-2抗体的产生
可使用MASP-2多肽(例如全长MASP-2)或使用具有抗原性MASP-2表位的肽(如MASP-2多肽的部分)来产生抗MASP-2抗体。免疫原性肽可以少至五个氨基酸残基。例如,可以使用包括SEQ ID NO:6全部氨基酸序列的MASP-2多肽来诱导在本发明的方法中有用的抗MASP-2多肽。可以将已知的涉及蛋白-蛋白相互作用的特定MASP-2结构域诸如CUBI和CUBIEGF结构域以及包括丝氨酸蛋白酶活性部位的区域表达为实施例5中所述的重组多肽并用作抗原。此外,包括MASP-2多肽(SEQ ID NO:6)至少6个氨基酸的部分的肽也对诱导MASP-2抗体是有用的。对诱导MASP-2抗体有用的MASP-2衍生抗原的更多例子提供在下面的表2中。用于产生抗体的MASP-2肽和多肽可作为天然多肽、或者重组肽或合成肽以及催化失活的重组多肽诸如MASP-2A而被分离,如实施例5-7中进一步描述的。在本发明这个方面的一些实施方案中,使用如实施例8和9中描述的转基因小鼠品系获得抗MASP-2抗体,如下面进一步描述的。
对产生抗MASP-2抗体有用的抗原也包括融合多肽,诸如MASP-2或其部分与免疫球蛋白多肽或者与麦芽糖结合蛋白的融合。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是半抗原样的,有利地可以将这种部分结合或连接到大分子载体(诸如钥孔血蓝素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)上用于免疫。
表2:MASP-2衍生的抗原
多克隆抗体
可通过使用本领域普通技术人员公知的方法,用MASP-2多肽或其免疫原性部分免疫动物来制备抗MASP-2的多克隆抗体。参见例如Green,et al.,"Production of Polyclonal Antisera,"inImmunochemical Protocols(Manson,ed.),105页,如实施例6中进一步描述的。可通过使用佐剂来增加MASP-2多肽的免疫原性,所述佐剂包括无机凝胶诸如氢氧化铝或弗氏佐剂(完全的或不完全的),表面活性剂诸如溶血卵磷脂,复合多元醇,聚阴离子,油乳剂,钥孔血蓝素和二硝基苯酚。多克隆抗体典型地是在动物诸如马、奶牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊中产生的。或者,在本发明中有用的抗MASP-2抗体也可源自非人灵长类。在狒狒中产生诊断上和治疗上有用的抗体的一般技术可在例如Goldenberg等人的国际专利公开No.WO 91/11465以及Losman,M.J.,et al.,Int.J.Cancer46:310,1990中找到。然后使用本领域公知的标准程序从这些被免疫过的动物的血液中产生含有免疫活性抗体的血清。
单克隆抗体
在一些实施方案中,MASP-2抑制剂是抗MASP-2单克隆抗体。抗MASP-2抗体是高度特异性的,针对单个MASP-2表位。如本文使用的,修饰语“单克隆”表示抗体的特征在于获自基本上同源的抗体群,并不理解成需要通过任何特定方法来产生抗体。可使用任何提供来产生抗体分子的技术获得单克隆抗体,其经由培养物中的连续细胞系诸如Kohler,G.,et al.,Nature 256:495,1975所述的杂交瘤方法,或者可以通过重组DNA方法制备它们(参见例如授予Cabilly的美国专利No.4,816,567)。也可以使用Clackson,T.,et al.,Nature352:624-628,1991和Marks,J.D.,et al.,J.Mol.Biol.222:581-597,1991所述的技术从噬菌体抗体库中分离单克隆抗体。这些抗体可以是任何免疫球蛋白类型,包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。
例如,可通过将包括MASP-2多肽或其部分的组合物注射给合适的哺乳动物(例如BALB/c小鼠)而获得单克隆抗体。在预定时间段之后,从小鼠中取出脾细胞,并悬浮在细胞培养基中。然后将脾细胞与永生细胞系融合形成杂交瘤。将形成的杂交瘤培养在细胞培养基中,对它们产生抗MASP-2单克隆抗体的能力进行筛选。进一步描述抗MASP-2单克隆抗体产生的例子提供在实施例7中。(也参见Current Protocols in Immunology,Vol.1.,John Wiley & Sons,pages2.5.1-2.6.7,1991。)
可通过使用转基因小鼠来获得人单克隆抗体,所述转基因小鼠已经被工程化以对抗原攻击产生特异性人抗体。在这种技术中,将人免疫球蛋白重链和轻链基因座元件引入到源自胚胎干细胞系的小鼠品系中,所述胚胎干细胞系含有内源免疫球蛋白重链和轻链基因座的定向破坏。该转基因小鼠可合成特异于人抗原比如本文描述的MASP-2抗原的人抗体,可使用该小鼠来产生分泌人MASP-2抗体的杂交瘤,其通过使用如实施例7中进一步描述的常规Kohler-Milstein技术将来自这些动物的B细胞融合到合适的骨髓瘤细胞系中而产生。带有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠是商业上可获得的(例如来自Abgenix,Inc.,Fremont,CA,and Medarex,Inc.,Annandale,N.J.)。用于重转基因小鼠中获得人抗体的方法描述于例如Green,L.L.,et al.,Nature Genet.7:13,1994;Lonberg,N.,et al.,Nature 368:856,1994以及Taylor,L.D.,et al.,Int.Immun.6:579,1994。
可通过各种公知技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括用蛋白A琼脂糖的亲和层析,大小排阻层析,以及离子交换层析(参见例如Coligan的2.7.1-2.7.12页和2.9.1-2.9.3页;Baines et al.,"Purification of Immunoglobulin G(IgG),"inMethods in Molecular Biology,The Humana Press,Inc.,Vol.10,pages 79-104,1992)。
一旦被产生,首先就测试多克隆抗体、单克隆抗体或源自噬菌体的抗体的特异性MASP-2结合。可以利用本领域技术人员已知的各种分析法来检测特异性结合MASP-2的抗体。例证性的分析法包括通过标准方法进行的Western印迹或免疫沉淀分析(例如如Ausubelet al.所述的),免疫电泳酶联免疫吸收分析法,斑点印迹法,抑制或竞争分析法以及夹心分析法(如Harlow和Land,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988所述的)。一旦识别到特异结合MASP-2的抗体,就通过几种分析法之一对抗MASP-2抗体作为MASP-2抑制剂起作用的能力进行测试,这些分析法是例如凝集素特异性的C4裂解分析(实施例2中描述)、C3b沉积分析(实施例2中描述)或者C4b沉积分析(实施例2中描述)。
本领域普通技术人员可以很容易地确定抗MASP-2单克隆抗体的亲和力(参见例如Scatchard,A.,NY Acad.Sci.51:660-672,1949)。在一个实施方案中,对于本发明的方法有用的抗MASP-2单克隆抗体以<100nM的结合亲和力结合到MASP-2上,优选<10nM以及最优选<2nM。
嵌合/人源化抗体
在本发明的方法中有用的单克隆抗体包括嵌合抗体以及这些抗体的片段,其中重链和/或轻链部分与源自特定物种的抗体相应的序列相同或同源,或者属于特定抗体类型或亚类,而链的剩余部分与源自另一物种的抗体相应的序列相同或同源,或者属于另一抗体类型或亚类(授予Cabilly的美国专利No.4,816,567,以及Morrison,S.L.,etal.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 81:6851-6855,1984)。
在本发明中有用的嵌合抗体形式之一是人源化单克隆抗MASP-2抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合抗体,含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通过将非人(例如小鼠)互补决定区(CDR)从小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链转移到人可变结构域中而产生人源化单克隆抗体。典型地,然后将人抗体的剩余部分代入非人对应抗体的框架区。此外,人源化抗体可包括受体抗体或供体抗体中没有的剩余部分。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言,人源化抗体将包括基本上至少一种、典型地两种可变结构域的全部,其中所有的或基本上所有的超变环都对应于非人免疫球蛋白的超变环,所有的或基本上所有的Fv框架区都是人免疫球蛋白序列的Fv框架区。人源化抗体任选地也将包括至少免疫球蛋白的恒定区(Fc)部分,典型地是人免疫球蛋白的恒定区。为了解更多详情,可参见Jones,P.T.,et al.,Nature 321:522-525,1986;Reichmann,L.,et al.,Nature332:323-329,1988;以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992。
在本发明中有用的人源化抗体包括人单克隆抗体,其至少包括MASP-2结合的CDR3。此外,可以替换Fc部分以便产生IgA或IgM以及人IgG抗体。这些人源化抗体将具有特定的临床效用,因为它们将特异性识别人MASP-2但是将不会引起人体对抗体本身的免疫应答。因此它们更适合用于人体的体内给药,特别是必须重复或长期给药的时候。
在本文的实施例10中提供了从鼠抗MASP-2单克隆抗体产生人源化抗MASP-2抗体的例子。产生人源化单克隆抗体的技术也描述于例如Jones,P.T.,et al.,Nature 321:522,1986;Carter,P.,et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:4285,1992;Sandhu,J.S.,Crit.Rev.Biotech.12:437,1992;Singer,I.I.,et al.,J.Immun.150:2844,1993;Sudhir(ed.),Antibody Engineering Protocols,Humana Press,Inc.,1995;Kelley,"Engineering Therapeutic Antibodies,"in ProteinEngineering:Principles and Practice,Cleland et al.(eds.),John Wiley& Sons,Inc.,pages 399-434,1996;以及1997年授予Queen的美国专利No.5,693,762。此外,还有从特定鼠抗体区域合成人源化抗体的商业结构,例如Protein Design Labs(Mountain View,CA)。
重组抗体
也可使用重组方法制备抗MASP-2抗体。例如,人抗体可使用人免疫球蛋白表达库(从例如Stratagene,Corp.,La Jolla,CA获得)产生人抗体片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或F(ab')2)来制备人抗体。然后使用类似于产生嵌合抗体的技术将这些片段用来构建完整的人抗体。
抗独特型抗体
一旦识别到具有期望的抑制活性的抗MASP-2抗体,就可使用本领域公知的技术将这些抗体用来产生类似MASP-2部分的抗独特型抗体,参见例如Greenspan,N.S.,et al.,FASEB J.7:437,1993。例如,结合MASP-2并竞争性抑制补体活化所需的MASP-2蛋白相互作用的抗体可用来产生类似MASP-2蛋白上的MBL结合位点的抗独特型抗体,从而结合并中和MASP-2的结合配体诸如MBL。
免疫球蛋白片段
在本发明的方法中有用的MASP-2抑制剂不仅包括完整的免疫球蛋白分子而且包括公知的片段,这些片段包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、二体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
现有技术中所公知的是,抗体分子只有很小部分即互补位涉及抗体与其表位的结合(参见例如Clark,W.R.,The ExperimentalFoundations of Modern Immunology,Wiley & Sons,Inc.,NY,1986)。抗体的pFc'和Fc区是经典补体途径的效应物,但是不涉及抗原结合。pFc'区已经被酶学裂解的抗体或者所产生的没有pFc'区的抗体被称为F(ab')2片段,它保留了完整抗体的抗原结合部位。分离的F(ab')2片段由于它的两个抗原结合部位而被称为二价单克隆抗体。类似地,Fc区已经被酶学裂解的抗体或者所产生的没有Fc区的抗体被称为Fab片段,它保留了完整抗体分子的一个抗原结合部位。
抗体片段可通过蛋白水解而获得,诸如通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶经常规方法消化完整抗体。例如,抗体片段可通过用胃蛋白酶酶学裂解抗体而产生以提供称为F(ab')2的55S片段。该片段可进一步使用巯基还原试剂裂解以产生3.5S Fab'单价片段。任选地,可使用对二硫键裂解产生的巯基有保护作用的基团来进行裂解反应。作为备选,使用胃蛋白酶的酶学裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如授予Goldenberg的美国专利No.4,331,647;Nisonoff,A.,et al.,Arch.Biochem.Biophys.89:230,1960;Porter,R.R.,Biochem.J.73:119,1959;Edelman,et al.,in Methods inEnzymology,1:422,Academic Press,1967;以及Coligan的2.8.1-2.8.10页和2.10.-2.10.4页。
在一些实施方案中,优选使用缺少Fc区的抗体片段以避免Fc结合到Fcγ受体上时引起经典补体途径的活化。有几种方法可产生避免了Fcγ受体相互作用的MoAb。例如,单克隆抗体的Fc区可通过使用蛋白水解酶的部分消化(诸如无花果蛋白酶消化)而化学去除,从而产生例如抗原结合的抗体片段,诸如Fab或F(ab)2片段(Mariani,M.,et al.,Mol.Immunol.28:69-71,1991)。或者,可以在构建本文所述的人源化抗体期间使用不结合Fcγ受体的人γ4 IgG同种型。也可使用本文描述的重组技术来设计缺少Fc结构域的抗体、单链抗体和抗原结合的结构域。
单链抗体片段
或者,人们可以产生特异于MASP-2的单个肽链结合分子,其中重链和轻链Fv区相连。Fv片段可通过肽接头相连以形成单链抗原结合蛋白(scFv)。这些单链抗原结合蛋白是通过构建包括编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因而制备的,结构域之间通过寡核苷酸连接。将这些结构基因插入表达载体中,随后将其引入宿主细胞诸如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成了单个的多肽链,由接头肽桥接两个V结构域。产生scFv的方法描述于例如Whitlow,et al.,"Methods:A Companion to Methods in Enzymology"2:97,1991;Bird,et al.,Science 242:423,1988;授予Ladner的美国专利No.4,946,778;Pack,P.,et al.,Bio/Technology 11:1271,1993。
作为说明性的例子,MASP-2特异性scFv的获得可通过将淋巴细胞体外暴露于MASP-2多肽并在噬菌体或类似载体中选择抗体展示文库(例如通过使用固定化的或标记的MASP-2蛋白或肽)。可通过对噬菌体或细菌如大肠杆菌上展示的随机肽文库进行筛选而获得编码具有可能的MASP-2多肽结合结构域的多肽的基因。这些随机肽展示文库可用于筛选与MASP-2相互作用的肽。创建和筛选这些随机肽展示文库的技术是现有技术中已知的(授予Lardner的美国专利No.5,223,409;授予Lardner的美国专利No.4,946,778;授予Lardner的美国专利No.5,403,484;授予Lardner的美国专利No.5,571,698;以及Kay et al.,Phage Display of Peptides and ProteinsAcademic Press,Inc.,1996),随机肽展示文库和用于筛选这些文库的试剂盒可以经商业获得,例如来自CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,Calif.)、Invitrogen Inc.(San Diego,Calif.)、New EnglandBiolabs,Inc.(Beverly,Mass.)以及Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway,N.J.)。
在本发明的这个方面有用的另一种形式的抗MASP-2抗体片段是编码单个互补决定区(CDR)的肽,其结合到MASP-2抗原的表位上并抑制MASP-2依赖的补体活化。可通过构建编码所感兴趣的抗体的CDR的基因而获得CDR肽(“最小识别单元”)。这些基因的制备可通过例如使用聚合酶链式反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区(参见例如Larrick et al.,Methods:A Companion toMethods in Enzymology 2:106,1991;Courtenay-Luck,"GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies,"in Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application,Ritter et al.(eds.),page 166,Cambridge University Press,1995;以及Ward et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,"in MonoclonalAntibodies:Principles and Applications,Birch et al.(eds.),page 137,Wiley-Liss,Inc.,1995)。
将本文描述的MASP-2抗体给予有此需要的受试者以抑制MASP-2依赖的补体活化。在一些实施方案中,MASP-2抑制剂是具有降低的效应物功能的高亲和力的人或人源化单克隆抗MASP-2抗体。
肽抑制剂
在本发明这个方面的一些实施方案中,MASP-2抑制剂包括分离的MASP-2肽抑制剂,其包括抑制MASP-2依赖的补体活化系统的分离的天然肽抑制剂和合成肽抑制剂。如本文使用的,术语“分离的MASP-2肽抑制剂”是指结合MASP-2或与MASP-2相互作用并抑制MASP-2依赖的补体活化的肽,它是基本上纯的,基本上没有其它在自然界发现的与其一起的物质,纯的程度对它们的预期用途来说达到了实用和适合。
已经使用肽抑制剂成功地在体内阻碍了蛋白-蛋白相互作用和催化位点。例如,最近已经批准了针对结构上与LFA-1相关的粘连分子的肽抑制剂在凝血病中的临床用途(Ohman,E.M.,et al.,European Heart J.16:50-55,1995)。已经描述了短线性肽(<30个氨基酸)防止或阻碍整联蛋白依赖的粘连(Murayama,O.,et al.,J.Biochem.120:445-51,1996)。也已经使用了更长的长度在25到200个氨基酸残基范围的肽来成功地阻断整联蛋白依赖的粘连(Zhang,L.,et al.,J.Biol.Chem.271(47):29953-57,1996)。一般而言,更长的肽抑制剂具有比短肽更高的亲和力和/或更慢的解离速度,因此是更有效的抑制剂。也已经显示了环肽抑制剂是有效的整联蛋白体内抑制剂,用于治疗人炎性疾病(Jackson,D.Y.,et al.,J.Med.Chem.40:3359-68,1997)。产生环肽的一种方法涉及肽的末端氨基酸是半胱氨酸的肽的合成,从而使得肽能够通过末端氨基酸之间的二硫键以环状形式存在,已经显示其用于治疗造血新生物时改善了亲和力和体内半衰期(例如授予Larson的美国专利No.6,649,592)。
合成的MASP-2肽抑制剂
在本发明这个方面的方法中有用的MASP-2抑制肽是通过模拟对MASP-2功能来说重要的靶区域的氨基酸序列进行例证性说明的。在本发明方法的实施中有用的抑制肽的大小在大约5个氨基酸到大约300个氨基酸的范围。表3提供了在本发明这个方面的实施中可能有用的例证性抑制肽的列表。可通过几种分析法之一对候选MASP-2抑制肽作为MASP-2抑制剂起作用的能力进行测试,这些分析法包括例如凝集素特异性的C4裂解分析(实施例2中描述)以及C3b沉积分析(实施例2中描述)。
在一些实施方案中,MASP-2抑制肽源自MASP-2多肽,其选自全长的成熟MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6),或者源自MASP-2蛋白的特定结构域,例如CUBI结构域(SEQ ID NO:8)、CUBIEGF结构域(SEQ ID N O:9)、EGF结构域(SEQ ID NO:11)以及丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:12)。如前所述,已经显示CUBEGFCUBII区域是二聚化和结合MBL所需的(Thielens et al.,同上)。特别是,已经显示了对MBL的结合涉及MASP-2的CUBI结构域中的肽序列TFRSDYN(SEQ ID NO:16),这是在鉴别带有Asp105到Gly105的纯合突变的人体的研究中发现的,该突变导致了MASP-2从MBL复合物上丧失失(Stengaard-Pedersen,K.,et al.,New England J.Med.349:554-560,2003)。MASP-2抑制肽也可源自MAp19(SEQ IDNO:3)。
在一些实施方案中,MASP-2抑制肽源自结合MASP-2并参与凝集素补体途径的凝集素蛋白。已经鉴别了参与该途径的几种不同凝集素,包括甘露聚糖结合的凝集素(MBL)、L-ficolin、M-ficolin和H-ficolin(Ikeda,K.,et al.,J.Biol.Chem.262:7451-7454,1987;Matsushita,M.,et al.,J.Exp.Med.176:1497-2284,2000;Matsushita,M.,et al.,J.Immunol.168:3502-3506,2002)。这些凝集素作为同型三聚亚基的寡聚体而存在于血清中,每个亚基具有带糖识别结构域的N末端胶原样纤维。已经显示这些不同的凝集素结合MASP-2,凝集素/MASP-2复合物通过蛋白C4和C2的裂解而活化补体。H-ficolin具有24个氨基酸的氨基末端区,带11个Gly-Xaa-Yaa重复的胶原样结构域,12个氨基酸的颈部结构域以及207个氨基酸的纤维蛋白原样结构域(Matsushita,M.,et al.,J.Immunol.168:3502-3506,2002)。H-ficolin结合GlcNAc并凝集包被了源自S.typhimurium、S.minnesota和大肠杆菌的LPS的人红细胞。已经显示H-ficolin结合MASP-2和MAp19并活化凝集素途径。同样,L-ficolin/P35也结合GlcNAc,也已经显示其结合人血清中的MASP-2和MAp19,也已经显示该复合物活化了凝集素途径(Matsushita,M.,et al.,J.Immunol.164:2281,2000)。因此,在本发明中有用的MASP-2抑制肽可包括选自MBL蛋白(SEQ ID NO:21)、H-ficolin蛋白(Genbank登录号NM_173452)、M-ficolin蛋白(Genbank登录号O00602)以及L-ficolin蛋白(Genbank登录号NM_015838)的至少5个氨基酸的区域。
更特别地,科学家已经鉴别了MBL上的MASP-2结合部位是在12个Gly-X-Y三联体“GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRGLQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS”(SEQ IDNO:26)中,其位于MBP胶原样结构域的C末端部分的铰链部和颈部之间(Wallis,R.,et al.,J.Biol.Chem.279:14065,2004)。该MASP-2结合部位区域在人H-ficolin和人L-ficolin中也是高度保守的。已经描述了所有三种凝集素蛋白中存在的共有结合部位,包括氨基酸序列“OGK-X-GP”(SEQ ID NO:22),其中字母“O”表示羟脯氨酸,字母“X”表示疏水残基(Wallis et al.,2004,同上)。因此,在一些实施方案中,在本发明这个方面中有用的MASP-2抑制肽为至少6个氨基酸长度,包括SEQ ID NO:22。已经显示包括氨基酸序列“GLRGLQ GPO GKL GPO G”(SEQ ID NO:24)在内的源自MBL的肽体外结合MASP-2(Wallis et al.,2004,同上)。为增强对MASP-2的结合,可合成在每个末端有两个GPO三联体位于两侧的肽(“GPO GPOGLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O”SEQ ID NO:25)以增强天然MBL蛋白中所发现的三螺旋的形成(如Wallis,R.,et al.,J.Biol.Chem.279:14065,2004中进一步描述的)。
MASP-2抑制肽也可源自人H-ficolin,其包括来自H-ficolin的共有MASP-2结合区的序列“GAO GSO GEK GAO GPQ GPOGPO GKM GPK GEO GDO”(SEQ ID NO:27)。也包括源自L-ficolin的肽,其包括来自L-ficolin的共有MASP-2结合区的序列“GCOGLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPNGAO GEO”(SEQ ID NO:28)。
MASP-2抑制肽也可源自诸如“LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI”(SEQ ID NO:29)的C4裂解部位,它是连接到抗凝血酶III的C末端部分的C4裂解部位(Glover,G.I.,et al.,Mol.Immunol.25:1261(1988))。
表3:例证性的MASP-2抑制肽
注:字母“O”表示羟脯氨酸。字母“X”是疏水残基。
源自C4裂解部位的肽以及抑制MASP-2丝氨酸蛋白酶部位的其它肽可被化学修饰,以使其成为不可逆的蛋白酶抑制剂。例如,合适的修饰可包括但是不必限于C末端、Asp或Glu、或者添加到功能性侧链上的卤甲基酮(Br、Cl、I、F);在氨基或其它功能性侧链上的卤乙酰(或其它α-卤乙酰)基团;在氨基末端或羧基末端或者功能性侧链上的环氧化物或含亚胺的基团;或者在氨基末端或羧基末端或者其它功能性侧链上的酰胺酯。这些修饰将提供经共价结合到肽上而永久抑制酶这一优点。这可能导致更低的有效剂量和/或更少次数给予肽抑制剂的需要。
除了上面描述的抑制肽,在本发明的方法中有用的MASP-2抑制肽包括含有结合MASP-2的如本文所述而获得的抗MASP-2MoAb的CDR3区的肽。用于合成肽的CDR区的序列可以通过现有技术中已知的方法来确定。重链可变区是通常长度在80到130个氨基酸范围的肽。在重链和轻链可变区内部的CDR序列包括仅仅大约3-25个氨基酸序列,很容易被本领域普通技术人员测序。
本领域技术人员将认识到,上面描述的MASP-2抑制肽的基本上同源的变异也将显示MASP-2抑制活性。例证性的变异包括但不必限于在受试者肽的羧基末端或氨基末端具有插入、缺失、取代和/或额外氨基酸的肽以及它们的混合物。因此,具有MASP-2抑制活性的那些同源肽被认为在本发明的方法中是有用的。所述的肽也可包括复制模式和具有保守取代的其它修饰。本文所述的保守变异包括氨基酸替换为类似电荷、大小或疏水性等等的另一个氨基酸。
MASP-2抑制肽可被修饰以增加可溶性和/或最大化正电荷或负电荷,以便更接近地模拟完整蛋白的区段。衍生物可以有或没有本文所公开肽的确切的一级氨基酸结构,只要衍生物在功能上保留了期望的MASP-2抑制特性。修饰可包括用通常已知的二十个氨基酸之一或另一个氨基酸进行的氨基酸取代,用衍生的或取代的带有附加的期望特征诸如酶降解抗性的氨基酸或者D-氨基酸进行的氨基酸取代,或者用另一种分子或化合物诸如糖类进行的取代,它们模拟了氨基酸或肽的天然构象和功能;或者用另一种分子或化合物诸如糖类或核酸单体进行的取代,它们模拟了原始肽的天然构象、电荷分布和功能。肽也可通过乙酰化或酰胺化进行修饰。
衍生性抑制肽的合成可依靠肽生物合成、糖生物合成等等已知技术。作为起点,技术人员可依靠合适的计算机程序来确定感兴趣肽的构象。一旦知道了本文公开的肽的构象,技术人员然后就能以推理设计方式来确定能够在一个或多个位点进行什么类别的取代,以便形成的衍生物保留原始肽的基本构象和电荷分布,但是它们可以拥有原始肽中不存在的特征或者增强了原始肽中发现的那些特征。一旦鉴别到候选衍生分子,就可使用本文所述的分析法来测试衍生物以确定它们是否作为MASP-2抑制剂起作用。
筛选MASP-2抑制肽
人们也可使用分子建模和推理分子设计来产生和筛选模拟了MASP-2关键结合区的分子结构并抑制了MASP-2的补体活化的肽。用于建模的分子结构包括抗MASP-2单克隆抗体的CDR区,以及已知的对MASP-2功能来说重要的靶区域,这些区域包括如前所述的二聚化所需要的区域、涉及结合MBL的区域以及丝氨酸蛋白酶活性部位。用于鉴别结合特定靶的肽的方法是现有技术中公知的。例如,可使用分子印痕来从头构建大分子结构,诸如结合特定分子的肽。参见例如Shea,K.J.,"Molecular Imprinting of Synthetic NetworkPolymers:The De Novo synthesis of Macromolecular Binding andCatalytic Sties,"TRIP 2(5),1994。
作为说明性例子,制备MASP-2结合肽类似物的一种方法如下。将显示出MASP-2抑制的抗MASP-2抗体的已知MASP-2结合肽或者结合区的功能性单体(模板)进行聚合。然后去除模板,接着在模板留下的空隙中聚合第二类单体,以提供一种新分子,其显示出一种或多种类似于模板的期望性质。除了以这种方式制备肽,也可制备其它为MASP-2抑制剂的MASP-2结合分子,诸如多糖、核苷、药物、核蛋白、脂蛋白、糖类、糖蛋白、类固醇、脂以及其它生物活性材料。该方法适用于设计大量不同的生物学类似物,它们比其天然对应物更稳定,因为它们典型地是通过功能单体的自由基聚合而制备的,产生了具有不可生物降解的骨架的化合物。
肽合成
可使用现有技术中公知的技术制备MASP-2抑制肽,诸如最初由Merrifield在J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2154,1963中描述的固相合成技术。可使用例如Applied Biosystems 431A PeptideSynthesizer(Foster City,Calif.)根据厂商提供的使用说明来实现自动合成。其它技术可在例如Bodanszky,M.,et al.,Peptide Synthesis,第二版,John Wiley & Sons,1976中以及本领域技术人员已知的其它参考著作中找到。
也可使用本领域技术人员已知的标准遗传工程技术来制备肽。例如,肽的酶学生产可通过将编码肽的核酸插入表达载体中、表达DNA、以及在必需氨基酸存在下将DNA翻译成肽。然后使用层析或电泳技术纯化肽,或者借助于载体蛋白可将肽融合到载体蛋白上,随后将肽从载体蛋白上裂解下来,其通过将编码肽的序列与编码载体蛋白的核酸序列同步插入表达载体中。可使用层析、电泳或免疫学技术(例如经载体蛋白的抗体而结合到树脂上)分离融合蛋白-肽。可使用化学方法或酶学方法例如提通过水解酶而裂解肽。
也可按照常规技术在重组宿主细胞中生产在本发明的方法中有用的MASP-2抑制肽。为表达编码MASP-2抑制肽的序列,必须将编码肽的核酸分子可操作地连接到控制表达载体转录表达的调控序列上,然后引入到宿主细胞中。除了转录调控序列诸如启动子和增强子之外,表达载体可包括翻译调控序列和标记基因,标记基因适合于选择带有表达载体的细胞。
可用“基因仪”使用诸如氨基膦酸酯方法来合成编码MASP-2抑制肽的核酸分子。如果诸如基因或基因片段合成的应用中需要化学合成的双链DNA,那么就分别制备每条互补链。短基因(60到80个碱基对)的生产在技术上是简单的,可通过合成互补链然后将它们退火而完成。对于较长基因的生产来说,要由20到100个核苷酸长度的单链片段以组合形式装配成合成基因(双链)。关于多核苷酸合成的评论参见例如Glick and Pasternak,"Molecular Biotechnology,Principles and Applications of Recombinant DNA",ASM Press,1994;Itakura,K.,et al.,Annu.Rev.Biochem.53:323,1984;以及Climie,S.,et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 87:633,1990。
小分子抑制剂
在一些实施方案中,MASP-2抑制剂是小分子抑制剂,包括具有低分子量的天然和合成物质,例如肽、肽类似物和非肽抑制剂(包括寡核苷酸和有机化合物)。MASP-2的小分子抑制剂可根据抗MASP-2抗体的可变区分子结构而产生。
小分子抑制剂也可根据MASP-2的晶体结构使用计算机药物设计来设计和产生(Kuntz I.D.,et al.,Science 257:1078,1992)。已经描述了大鼠MASP-2的晶体结构(Feinberg,H.,et al.,EMBO J.22:2348-2359,2003)。使用Kuntz et al.描述的方法,将MASP-2晶体结构坐标用作计算机程序诸如DOCK的输入值,它将输出一列预期结合MASP-2的小分子结构。这些计算机程序的使用是本领域技术人员公知的。例如,使用HIV-1蛋白酶抑制剂的晶体结构鉴别到了作为HIV-1蛋白酶抑制剂的非肽配体,其通过使用程序DOCK来评估剑桥晶体学数据库中发现的化合物对酶结合部位的匹配性(Kuntz,I.D.,et al.,J.Mol.Biol.161:269-288,1982;DesJarlais,R.L.,et al.,PNAS87:6644-6648,1990)。
使用诸如实施例7所述的MASP-2结合分析法来筛选由计算机方法鉴别为可能的MASP-2抑制剂的小分子结构列表。然后在诸如实施例2所述的功能分析法中对发现为结合MASP-2的小分子进行分析,以确定它们是否抑制MASP-2依赖的补体活化。
MASP-2可溶受体
相信其它合适的MASP-2抑制剂包括MASP-2可溶受体,可以使用本领域普通技术人员已知的技术来生产它们。
MASP-2的表达抑制剂
在本发明这个方面的另一实施方案中,MASP-2抑制剂是能够抑制MASP-2依赖的补体活化的MASP-2表达抑制剂。在本发明这个方面的实施中,代表性的MASP-2表达抑制剂包括MASP-2反义核酸分子(诸如反义mRNA、反义DNA或反义寡核苷酸)、MASP-2核酶以及MASP-2 RNAi分子。
反义RNA和DNA分子通过杂交到MASP-2 mRNA并阻止MASP-2蛋白的翻译而起到直接阻断MASP-2 mRNA翻译的作用。反义核酸分子能以许多不同方式来构建,只要它能够阻碍MASP-2的表达。例如,反义核酸分子可通过相对于其正常转录方向而对MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)的编码区(或其部分)进行反转,以使得其互补序列能够转录。
反义核酸分子通常是与靶基因或基因的至少一部分基本相同。然而,核酸不需要完全相同来抑制表达。一般地,更高的同源性可用来平衡更短的反义核酸分子。最小百分比同一性典型地大于大约65%,但是更高的百分比同一性可对内源序列的表达发挥更有效的阻抑作用。优选的是基本上比大约80%的典型百分比同一性更高的百分比同一性,尽管大约95%的绝对同一性是典型地最优选的。
反义核酸分子不需要具有与靶基因相同的内含子或外显子模式,靶基因的非编码区段可能在获得靶基因表达的反义抑制方面与编码区段是等效的。至少大约8个左右核苷酸的DNA序列可用作反义核酸分子,尽管更长的序列是优选的。在本发明中,有用的MASP-2抑制剂的代表性例子是包括SEQ ID NO:4所示核酸序列的MASP-2cDNA的互补序列至少90%同一性的反义MASP-2核酸分子。SEQID NO:4所示核酸序列编码由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列构成的MASP-2蛋白。
反义寡核苷酸靶向结合MASP-2 mRNA是可用于降低MASP-2蛋白合成水平的另一种机制。例如,多聚半乳糖醛酸酶和蕈毒碱2型乙酰胆碱受体的合成被针对它们相应mRNA的反义寡核苷酸所抑制(授予Cheng的美国专利No.5,739,119和授予Shewmaker的美国专利No.5,759,829)。此外,反义抑制的例子已经用核内蛋白细胞周期蛋白、多药抗药性基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择蛋白、STK-1、纹状体GABAA受体和人EGF证实了(参见例如授予Baracchini的美国专利No.5,801,154;授予Baker的美国专利No.5,789,573;授予Considine的美国专利No.5,718,709;以及授予Reubenstein的美国专利No.5,610,288。
已经描述了一种系统,使得普通技术人员能够确定哪些核苷酸在本发明中是有用的,其涉及使用Rnase H裂解作为转录本中序列的可接近性的标志来探查靶mRNA中的合适部位。Scherr,M.,et al.,Nucleic Acids Res.26:5079-5085,1998;Lloyd,et al.,Nucleic AcidsRes.29:3665-3673,2001。将互补于MASP-2转录本某些区域的反义寡核苷酸混合物加入到表达MASP-2的细胞提取物中,诸如肝细胞,杂交,以便产生易受RNAseH攻击的部位。该方法可以与计算机辅助的序列选择相结合,所述计算机辅助的序列选择能够根据其形成二聚体、发夹结构或其它二级结构的相对能力来预测用于反义组合物的最佳序列选择,所述的这些结构将降低或抑制对宿主细胞中靶mRNA的特异性结合。这些二级结构分析和靶部位选择的考虑事项可使用OLIGO引物分析软件(Rychlik,I.,1997)和BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul,S.F.,et al.,Nucl.Acids Res.25:3389-3402,1997)来进行。针对靶序列的反义化合物优选包括大约8个到大约50个核苷酸的长度。包括大约9个到大约35个左右核苷酸的反义寡核苷酸是特别优选的。本发明人预期9到35个核苷酸范围的(即那些9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个碱基长度的)寡核苷酸组合物是实施本发明的反义寡核苷酸为基础的方法所极为优选的。极为优选的MASP-2 mRNA靶区域是位于或接近AUG翻译起始密码的那些区域,以及那些与mRNA的5’区基本互补的序列,例如MASP 2基因核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的–10和+10区域之间。例证性的MASP-2表达抑制剂提供在表4中。
表4例证性的MASP-2表达抑制剂
如上所述,本文使用的术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物的寡聚体或多聚体。该术语也包括由天然产生的核苷酸、糖和共价核苷酸间(主链)连接所组成的那些寡聚核碱基以及具有非天然发生的修饰的寡核苷酸。这些修饰使得人们能够引入某些不能通过天然产生的寡核苷酸提供的期望性质,诸如降低的毒性、增加的抗核酸酶降解的稳定性以及增强的细胞吸收。在例证性实施方案中,本发明的反义化合物不同于天然DNA,其通过磷酸二酯主链的修饰来延长反义寡核苷酸的生存,其中由硫代磷酸酯取代了磷酸酯取代基。同样地,寡核苷酸的一端或两端可被一个或多个插入在核酸链内部的相邻碱基之间的吖啶衍生物取代。
另一备选反义方案是使用“RNA干涉”(RNAi)。双链RNA(dsRNA)可在哺乳动物体内引起基因沉默。RNAi和辅助抑制剂的天然功能似乎是通过可移动的遗传元件诸如反转录转座子以及当其活化时在宿主细胞中产生异常RNA或dsRNA的病毒来保护基因组对抗入侵(参见例如Jensen,J.,et al.,Nat.Genet.21:209-12,1999)。双链RNA分子可通过合成两条能够形成双链RNA分子的RNA链来制备,每条链具有大约19到25(例如19-23个核苷酸)的长度。例如,在本发明的方法中有用的dsRNA分子可包括相应于表4中所列序列及其互补序列的RNA。优选地,至少一条RNA链具有1-5个核苷酸的3’突出。合成的RNA链是在形成双链分子的条件下进行混合的。RNA序列可包括SEQ ID NO:4的至少8个核苷酸的部分,总长度为25个核苷酸或更少。设计给定靶的siRNA序列是在本领域普通技术人员能力范围之内的。设计siRNA序列并保证至少70%表达降低是可以商业获得的(Qiagen,Valencia,CA)。
dsRNA可作为药学组合物给予并由已知方法进行,其中核酸被引入期望的靶细胞中。通常使用的基因转移方法包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射以及病毒方法。这些方法在Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1993中被教导了。
也可利用核酶来降低MASP-2的量和/或生物活性,诸如靶向MASP-2 mRNA的核酶。核酶是能够裂解具有与核酶序列完全或部分同源的序列的核酸分子的催化性RNA分子。设计编码与靶RNA特异性配对并在特定位置裂解磷酸二酯主链的RNA核酶的核酶转基因从而功能性失活靶RNA是可能的。在进行这种裂解时,核酶本身并无改变,因此能够再循环并裂解其它分子。在反义RNA中包括核酶序列赋予了它们裂解RNA的活性,从而增加了反义构建体的活性。
在本发明的实施中有用的核酶典型地包括至少大约九个核苷酸的杂交区域,该区域在核苷酸序列上与靶MASP-2 mRNA的至少部分相互补,以及适合裂解靶MASP-2mRNA的催化区域(通常参见于EPA No.0 321 201;WO88/04300;Haseloff,J.,et al.,Nature334:585-591,1988;Fedor,M.J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1668-1672,1990;Cech,T.R.,et al.,Ann.Rev.Biochem.55:599-629,1986)。
核酶能以RNA寡核苷酸插入核酶序列的形式直接靶向细胞,或者作为编码期望的核酶RNA的表达载体而被引入细胞中。核酶能以和用于反义多核苷酸所述大致相同的方式使用和应用。
在本发明的方法中有用的反义RNA和DNA、核酶以及RNAi分子可通过现有技术中用于DNA和RNA分子合成的任何已知方法来制备。这些方法包括现有技术中公知的用于化学合成寡聚脱氧核糖核苷酸和寡聚核糖核苷酸的技术,诸如固相氨基膦酸酯化学合成。或者,RNA分子可通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录而产生。这些DNA序列可被插入大量的各种载体中,其中插入了合适的RNA聚合酶启动子诸如T7或SP6聚合酶启动子。或者,可将依赖于所使用的启动子而组成型地或诱导型地合成反义RNA的反义cDNA构建体稳定引入细胞系中。
可将各种公知的DNA分子修饰作为增加稳定性和半衰期的手段而引入。有用的修饰包括但不限于将核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸侧翼序列加入到分子的5’和/或3’末端,或者在寡聚脱氧核糖核苷酸主链内使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯键。
V.药学组合物和送递方法
剂量
另一方面,本发明提供了用于抑制MASP-2依赖的补体活化的不利效应的组合物,包括治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学可接受的载体。MASP-2抑制剂能以治疗有效剂量给予有此需要的受试者,以治疗或改善与MASP-2依赖的补体活化相关联的病症。治疗有效剂量是指MASP-2抑制剂的量足以导致病症症状的改善。
MASP-2抑制剂的毒性和治疗效能可通过标准药学程序来确定,其采用实验动物模型诸如实施例3中所述的表达人MASP-2转基因的MASP-2-/-小鼠模型。使用这些动物模型,可使用标准方法来确定NOAEL(未观察到不利效应的水平)和MED(最小有效剂量)。NOAEL/MED效应之间的剂量比是治疗比率,表达为比值NOAEL/MED。显示大的治疗比率或指数的MASP-2抑制剂是最优选的。从细胞培养物分析和动物研究中获得的数据可用来配制用于人体的剂量范围。MASP-2抑制剂的剂量优选在包括了很少的或没有毒性的MED的循环浓度的范围之内。剂量可根据采用的剂量形式和利用的给药途径而在这个范围内变化。
对任何配方设计来说,治疗有效剂量可使用动物模型来估计。例如,可在动物中配制剂量来获得包括MED的循环血浆浓度范围。血浆中MASP-2抑制剂的定量水平也可通过例如高效液相层析来测定。
除了毒性研究之外,有效剂量也可根据活的受试者中存在的MASP-2蛋白的量以及MASP-2抑制剂的结合亲和力来估计。已经显示正常的人受试者血清中存在的MASP-2水平在低水平是500ng/ml的范围,特定受试者中的MASP-2水平可使用Moller-Kristensen M.,et al.,J.of Immunol.Methods 282:159-167,2003中描述的MASP-2定量分析法来确定。
一般地,包括MASP-2抑制剂的组合物给药剂量根据这些因素而变化,诸如受试者年龄、重量、身高、性别、一般内科情况以及先前的病史。作为例证,诸如抗MASP-2抗体的MASP-2抑制剂可在大约0.010到10.0mg/kg、优选0.010到1.0mg/kg、更优选0.010到0.1mg/kg受试者体重的剂量范围内给药。
在特定受试者中的本发明MASP-2抑制组合物和方法的治疗效能以及适当剂量可根据本领域技术人员公知的补体分析法来确定。在刚过去的十年间,已经开发了灵敏的和特异性的分析法,这些活化产物的大多数都是商业可获得的,包括小的活化片段C3a、C4a和C5a以及大的活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b-9。大多数的这些分析法都利用了与暴露在片段上、但是不暴露在形成它们的天然蛋白上的新抗原(新生抗原)起反应的单克隆抗体,这使得这些分析法非常简单并且是特异性的。大多数都依赖ELISA技术,尽管有时候还将放射免疫分析用于C3a和C5a。后者的这些分析法测定未被加工的片段和它们的“脱Arg”片段两者,它是循环中发现的主要形式。未被加工的片段和C5adesarg通过结合到细胞表面受体上迅速被清除,因而以极低浓度存在,而C3adesArg则不结合细胞和在血浆中累积。测定C3a提供了补体活化灵敏的、不依赖途径的标志。替代途径活化可通过测定Bb片段来评估。检测膜攻击途径活化的液相产物sC5b-9提供了证据表明补体被活化完全了。因为凝集素途径和经典途径都产生同样的活化产物C4a和C4d,测定这两种片段并不提供任何关于这两种途径产生活化产物的信息。
另外的试剂
包括MASP-2抑制剂的组合物和方法可任选包括一种或多种另外的治疗剂,它们可能增加MASP-2抑制剂的活性或者以另外的或协同的方式来提供相关治疗功能。例如,一种或多种MASP-2抑制剂可与一种或多种抗炎剂和/或镇痛剂结合给药。确定另外试剂的包含和选择以获得期望的治疗结果。合适的抗炎剂和/或镇痛剂包括:5-羟色胺受体拮抗剂;5-羟色胺受体激动剂;组胺受体拮抗剂;缓激肽受体拮抗剂;激肽释放酶抑制剂;速激肽受体拮抗剂,包括神经激肽1和神经激肽2受体亚型拮抗剂;降钙素基因相关肽(CGRP)受体拮抗剂;白介素受体拮抗剂;花生四烯酸代谢物合成途径中有活性的酶的抑制剂,包括磷脂酶抑制剂,包括PLA2同种型抑制剂和PLCγ同种型抑制剂,环加氧酶(COX)抑制剂(它可以是COX-1、COX-2的抑制剂或非选择性COX-1和-2抑制剂),脂加氧酶抑制剂;前列腺素受体拮抗剂,包括类二十烷酸EP-1和EP-4受体亚型拮抗剂以及血栓素受体亚型拮抗剂;白三烯受体拮抗剂,包括白三烯B4受体亚型拮抗剂和白三烯D4受体亚型拮抗剂;阿片样物质受体拮抗剂,包括μ-阿片样物质、δ-阿片样物质和κ-阿片样物质受体亚型拮抗剂;嘌呤受体激动剂和拮抗剂,包括P2X受体拮抗剂和P2Y受体激动剂;腺苷三磷酸(ATP)敏感的钾通道开放剂;MAP激酶抑制剂;烟酸乙酰胆碱抑制剂;以及α肾上腺素能受体激动剂(包括α-1、α-2拮抗剂和非选择性的α-1和2激动剂)。
当用于抑制或治疗再狭窄时,本发明的MASP-2抑制剂可与一种或多种抗再狭窄剂结合用于伴随给药。合适的抗再狭窄剂包括:抗血小板剂,包括凝血酶抑制剂和受体拮抗剂,腺苷二磷酸(ADP)受体拮抗剂(也被称为嘌呤受体1受体拮抗剂),血栓素抑制剂和受体拮抗剂以及血小板膜糖蛋白受体拮抗剂;细胞粘连分子的抑制剂,包括选择蛋白抑制剂和整联蛋白自由基;抗趋化剂;白介素受体拮抗剂;以及胞内信号抑制剂,包括蛋白激酶(PKC)抑制剂和蛋白酪氨酸磷酸酶,胞内蛋白酪氨酸激酶抑制剂的调节剂,src同源2(SH2)结构域,钙通道拮抗剂。
本发明的MASP-2抑制剂也可与一种或多种其它补体抑制剂结合给药。目前还没有批准用于人体的补体抑制剂,然而一些药学试剂已经显示了体内阻断补体。许多这些试剂也是有毒的或者只是部分抑制剂(Asghar,S.S.,Pharmacol.Rev.36:223-44,1984),这些使用限于用作研究工具。K76COOH和nafamstat mesilate是两种在移植动物模型中显示一些效能的试剂(Miyagawa,S.,et al.,Transplant Proc.24:483-484,1992)。低分子量肝素也显示出调节补体活性的有效(Edens,R.E.,et al.,Complement Today pp.96-120,Basel:Karger,1993)。相信这些小分子抑制剂可用作与本发明的MASP-2抑制剂结合使用的试剂。
其它天然产生的补体抑制剂可用于与本发明的MASP-2抑制剂组合。补体的生物学抑制剂包括可溶性补体因子1(sCR1)。这是一种可在人细胞的外膜上发现的天然产生的抑制剂。其它膜抑制剂包括DAF、MCP和CD59。已经对重组形式测试了它们的体外和体内抗补体活性。已经显示sCR1在异种移植中是有效的,其中补体系统(替代和经典两者)在通过新移植器官灌注血液的几分钟之内就引起了超反应性排斥综合征(Platt J.L.,et al.,Immunol.Today 11:450-6,1990;Marino I.R.,et al.,Transplant Proc.1071-6,1990;Johnstone,P.S.,et al.,Transplantation 54:573-6,1992)。sCR1的使用保护并延长了移植器官的存活时间,暗示了器官存活机理中的补体途径(Leventhal,J.R.et al.,Transplantation 55:857-66,1993;Pruitt,S.K.,et al.,Transplantation 57:363-70,1994)。
适合用于与本发明的组合物相组合的另外的补体抑制剂也包括,举例来说,诸如那些由Alexion Pharmaceuticals,Inc.,New Haven,Connecticut正在开发的MoAb,以及抗备解素MoAb。
当用于治疗关节炎(例如骨关节炎和类风湿性关节炎)时,本发明的MASP-2抑制剂可与一种或多种软骨保护剂相组合,软骨保护剂可包括一种或多种软骨合成代谢的助催化剂和/或一种或多种软骨分解代谢的抑制剂,合适地包括合成代谢试剂和分解代谢抑制剂两者,用于伴随给药。合适的促合成代谢的软骨保护剂包括白介素(IL)受体激动剂,包括IL-4、IL-10、IL-13、rhIL-4、rhIL-10和rhIL-13、以及嵌合IL-4、IL-10或IL-13;转化生长因子-β超家族激动剂包括TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,骨形成蛋白包括BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7(OP-1)和OP-2/BMP-8,生长分化因子包括GDF-5、GDF-6和GDF-7,重组TGF-β和BMPs,以及嵌合TGF-β和BMP;胰岛素样生长因子包括IGF-1;以及成纤维细胞生长因子包括bFGF。合适的抑制分解代谢的软骨保护剂包括白介素-1(IL-1)受体拮抗剂(IL-1ra),包括可溶性人IL-1受体(shuIL-1R)、rshuIL-1R、rhIL-1ra、抗IL1抗体、AF11567和AF12198;肿瘤坏死因子(TNF)受体拮抗剂(TNF-α),包括sTNFR1和sTNFRII在内的可溶性受体,重组TNF可溶性受体,以及嵌合TNF可溶性受体,包括嵌合rhTNFR:Fc,Fc融合可溶性受体和抗TNF抗体;环加氧酶-2(COX-2特异性)抑制剂;包括DuP 697、SC-58451、celecoxib、rofecoxib、nimesulide、diclofenac、meloxicam、piroxicam、NS-398、RS-57067、SC-57666、SC-58125、flosulide、etodolac、L-745,337和DFU-T-614;有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)抑制剂,包括ERK1、ERK2、SAPK1、SAPK2a、SAPK2b、SAPK2d、SAPK3的抑制剂,包括SB 203580、SB 203580碘、SB202190、SB 242235、SB 220025、RWJ 67657、RWJ 68354、FR 133605、L-167307、PD 98059、PD169316;核因子kappa B(NFκB),包括咖啡酸苯乙酯(CAPE)、DM-CAPE、SN-50肽、hymenialdisine和吡咯烷酮二硫代氨基甲酸酯;一氧化氮合酶(NOS)抑制剂,包括NG-一甲基-L-精氨酸、1400W、二苯撑碘、S-甲基异硫脲、S-(氨乙基)异硫脲、L-N6-(1-亚胺乙基)赖氨酸、1,3-PBITU、2-乙基-2-硫代假脲、氨基胍、Nω-硝基-L-精氨酸、Nω-硝基-L-精氨酸甲基酯,基质金属蛋白酶(MMP)的抑制剂,包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14和MMP-15的抑制剂,包括U-24522、二甲胺四环素、4-Abz-Gly-Pro-D-Leu-D-Ala-NHOH、Ac-Arg-Cys-Gly-Val-Pro-Asp-NH2、重组人TIMP1、重组人TIMP2以及磷酸美沙酮;细胞粘连分子,包括整联蛋白激动剂和拮抗剂,包括αVβ3 MoAb LM 609和echistatin;抗趋化剂,包括F-Met-Leu-Phe受体、IL-8受体、MCP-1受体和MIP1-I/RANTES受体;胞内信号抑制剂,包括(a)蛋白激酶抑制剂,其包括(i)蛋白激酶C(PKC)抑制剂(同工酶)包括calphostin C、G-6203和GF 109203X以及(ii)蛋白质酪氨酸激酶抑制剂,趋化剂还包括(b)胞内蛋白质激酶磷酸酶(PTPase)调节剂和(c)SH2结构域抑制剂(src同源2结构域)。
对于一些应用来说,将本发明的MASP-2抑制剂与痉挛抑制剂组合给药可能是有利的。例如,对泌尿生殖器应用来说,包括至少一种平滑肌痉挛抑制剂和/或至少一种抗炎剂可能是有利的,对血管手术来说,包括至少一种血管痉挛抑制剂和/或至少一种抗炎剂和/或至少一种抗再狭窄剂可能是有用的。痉挛抑制剂的合适例子包括:5-羟基色氨2受体亚型拮抗剂;速激肽受体拮抗剂;一氧化氮供体;ATP-敏感的钾通道开放剂;钙通道拮抗剂;以及内皮缩血管肽受体拮抗剂。
药学载体和送递载体
一般而言,本发明的MASP-2抑制剂组合物,与任何其它所选治疗剂组合,适合包含在药学可接受的载体中。载体是无毒的、生物相容的,对它进行选择以便不会不利地影响MASP-2抑制剂(以及与其组合的任何其它治疗剂)的生物活性。用于肽的例证性药学可接受的载体描述于授予Yamada的美国专利No.5,211,657中。在本发明中有用的抗MASP-2抗体和抑制肽能以固体、半固体、凝胶、液体或气体形式配制到制剂中,诸如允许口服、非肠道或外科手术给药的片剂、胶囊、粉剂、粒剂、软膏、溶液、储存剂、吸入剂和注射剂。本发明也预期通过涂敷医学设备等进行的局部给药。
适用于经注射剂的非肠道送递、注入或冲洗以及局部送递的载体包括蒸馏水、磷酸缓冲的生理盐水、标准或乳酸盐Ringe氏溶液、葡萄糖溶液、Hank氏溶液或者丙二醇。此外,可采用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为这个目的,可采用生物相容的油,包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外,诸如油酸的脂肪酸在注射剂的制备中是有用的。载体和试剂可混合作为液体、悬浮液、可聚合的或不可聚合的凝胶、糊剂或药膏。
载体也可包括送递载体以持续(即延长、延迟或调节)试剂的送递或者增强治疗剂的送递、吸收、稳定性或药物代谢动力学。这样的送递载体可通过非限制性的例子包括由蛋白质、脂质体、糖类、合成有机化合物、无机化合物、聚合的或共聚的水凝胶以及聚合微团组成的微粒、微米球、纳米球、纳米粒子。合适的水凝胶和微团送递系统包括WO 2004/009664 A2中披露的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物以及US 2002/0019369 A1中披露的PEO和PEO/环糊精复合物。这些水凝胶可局部注射到预期作用部位,或者皮下或肌肉内注射形成持续释放库。
对于关节内送递来说,MASP-2抑制剂可被包含在上述可注射的液体或凝胶载体中,上述可注射的持续释放的送递载体中,或者透明质酸或透明质酸衍生物中。
对于非肽能试剂的口服来说,MASP-2抑制剂可被包含在惰性填料或稀释剂中,诸如蔗糖、玉米淀粉或纤维素。
对于局部给药来说,MASP-2抑制剂可被包含在软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体或粉剂中,或者经皮肤贴膏包含在凝胶或微胶囊送递系统中。
正在开发各种经鼻和肺的送递系统,包括气雾剂、定量吸入器、干粉吸入器以及喷雾器,可分别适合用来在气雾剂、吸入剂、或喷雾送递载体中进行本发明的送递。
对鞘内(IT)或脑室内(ICV)送递来说,适当的无菌送递系统(例如液体;凝胶,悬浮液等)可用来进行本发明。
本发明的组合物也可包括生物相容的赋形剂,诸如分散剂或润湿剂、悬浮剂、稀释剂、缓冲剂、渗透增强剂、乳化剂、粘合剂、稠化剂、调味剂(用于口服)。
用于抗体和肽的药学载体
与抗MASP-2抗体和抑制肽更特别相关的是,例证性制剂可作为可注射剂非肠道给药,这些制剂是带有药学载体的化合物在生理学可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液,稀释剂可以是无菌液体诸如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外,诸如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等辅助物质可存在于包括抗MASP-2抗体和抑制肽的组合物中。药学组合物的额外组分包括石油(诸如动物、植物或合成来源的),例如大豆油和矿物油。一般而言,二元醇诸如丙二醇或聚乙二醇是优选用于可注射溶液的液体载体。
抗MASP-2抗体和抑制肽也能以储存注射剂或可植入制剂的形式给药,它们能以允许活性试剂持续或脉动释放的形式配制。
用于表达抑制剂的药学可接受载体
与本发明中有用的表达抑制剂更特别相关的是,提供了包括上述表达抑制剂和药学可接受载体或稀释剂的组合物。组合物可进一步包括胶体分散体系。
包括表达抑制剂在内的药学组合物可包括但不限于溶液、乳剂、以及含有脂质体的制剂。这些组合物可由各种组分形成,包括但不限于预成形液体、自乳化固体以及自乳化半固体。这些组合物的制备典型地涉及将表达抑制剂与一种或多种下面的成分相混合:缓冲剂,抗氧化剂,低分子量多肽,蛋白质,氨基酸,包括葡萄糖、蔗糖或糊精在内的糖类,诸如EDTA的螯合剂,谷胱甘肽以及其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或者与非特异性血清白蛋白混合的盐水是合适稀释剂的例子。
在一些实施方案中,组合物可被制备并配制成乳剂,它们典型地地一种液体以微滴形式分散到另一种液体中的非均相系统(参见Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Vol.1,Rieger and Banker(eds.),Marcek Dekker,Inc.,N.Y.,1988)。用于乳剂配方的天然产生乳剂的例子包括阿拉伯树胶、蜂蜡、羊毛脂、卵磷脂和磷脂。
在一个实施方案中,包括核酸的组合物可配制成微乳。如本文使用的微乳是指水、油和两亲性系统,它是单一光学各向同性和热力学稳定的液态溶液(参见Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms,Vol.1)。本发明的方法也可使用脂质体来转移和送递反义寡核苷酸到期望的部位。
用于局部给药的表达抑制剂的药学组合物和制剂可包括皮肤贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。可以使用常规药学载体以及水性的、粉末的或油性基质和稠化剂等等。
给药模式
包括MASP-2抑制剂的药学组合物可用许多方式给药,取决于是局部还是全身性给药模式最适合于所治疗的疾病。此外,如上关于体外再灌注程序的描述,MASP-2抑制剂可通过将本发明的组合物引入到再循环血液或血浆中来给药。而且,本发明的组合物可通过将组合物涂布或混合在可植入的医疗设备上面或内部。
全身性送递
如本文使用的,术语“全身性送递”和“全身性给药”预期包括但不限于口服和非肠道途径,包括肌肉内(IM)、皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、含服、局部给药、经皮肤、鼻、直肠、阴道以及其它给药途径,它们将所送递的试剂有效分散到预期治疗作用的单个或多个部位。用于本发明的全身性送递的优选途径包括静脉内、肌肉内、皮下和吸入。将认识到的是,用于本发明的特定组合物中所利用的所选试剂的具体全身性给药途径将部分地考虑试剂对特定给药途径相关的代谢转化途径的敏感性而确定。例如,肽能试剂最合适地可通过口服以外的途径给药。
MASP-2抑制抗体和多肽可通过任何合适的手段而被送递到有此需要的受试者中。送递MASP-2抗体和多肽的方法包括经口服、肺部、非肠道(例如肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)或者皮下注射)、吸入(诸如经由细粉剂型)、皮肤、鼻、阴道、直肠或者舌下给药途径,可将其配制成适于每种给药途径的剂量形式。
作为代表性例子,MASP-2抑制抗体和肽可被引入到活体中,是通过将其应用到能够吸收多肽的身体膜上,例如鼻膜、胃肠膜和直肠膜。典型地将多肽和渗透增强剂一起应用到吸收性膜上。(参见例如Lee,V.H.L.,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Sys.5:69,1988;Lee,V.H.L.,J.Controlled Release 13:213,1990;Lee,V.H.L.,Ed.,Peptideand Protein Drug Delivery,Marcel Dekker,New York(1991);DeBoer,A.G.,et al.,J.Controlled Release,13:241,1990。)例如,STDHF是梭链孢酸的合成衍生物,是结构上类似于胆汁盐的甾族表面活性剂,已经将其用作鼻送递的渗透增强剂(Lee,W.A.,Biopharm.22,Nov./Dec.1990)。
MASP-2抑制抗体和多肽可被引入与另一分子诸如脂相结合以保护多肽不被酶降解。例如,已经使用了聚合物特别是聚乙二醇(PEG)的共价结合来保护某些蛋白质不被体内的酶水解,从而延长半衰期(Fuertges,F.,et al.,J.Controlled Release 11:139,1990)。已经报道了许多聚合物系统用于蛋白质送递(Bae,Y.H.,et al.,J.ControlledRelease 9:271,1989;Hori,R.,et al.,Pharm.Res.6:813,1989;Yamakawa,I.,et al.,J.Pharm.Sci.79:505,1990;Yoshihiro,I.,et al.,J.Controlled Release 10:195,1989;Asano,M.,et al.,J.ControlledRelease 9:111,1989;Rosenblatt,J.,et al.,J.Controlled Release 9:195,1989;Makino,K.,J.Controlled Release 12:235,1990;Takakura,Y.,et al.,J.Pharm.Sci.78:117,1989;Takakura,Y.,et al.,J.Pharm.Sci.78:219,1989)。
最近,已经开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(参见例如授予Webb的美国专利No.5,741,516)。而且,已经评论了脂质体和脂质体样制剂作为可能的药物载体的各种方法(参见例如授予Szoka的美国专利No.5,567,434;授予Yagi的美国专利No.5,552,157;授予Nakamori的美国专利No.5,565,213;授予Shinkarenko的美国专利No.5,738,868以及授予Gao的美国专利No.5,795,587)。
对通过皮肤的应用来说,MASP-2抑制抗体和多肽可与其它合适的成分相混合,诸如载体和/或佐剂。对于这些其它成分的性质没有限制,除了它们对于其预期应用来说必须是药学可接受的,以及不能降低组合物中活性成分的活性。合适载体的例子包括软膏、乳膏、凝胶或悬浮液,带有或不带有纯化胶原。MASP-2抑制抗体和多肽也可被浸渍到皮肤贴剂、膏药、和绷带中,优选液体或半液体形式。
本发明的组合物可在确定间隔时间的基础上周期性全身给药,以维持期望水平的治疗效果。例如,组合物可每两到四周或者以更长的时间间隔给药,诸如通过皮下注射。给药方案将由医师考虑可能影响试剂混合的作用的各种因素来确定。这些因素将包括所治疗疾病的进展程度、患者年龄、性别和重量、以及其它临床因素。每种单独试剂的剂量将随组合物中所包括的MASP-2抑制剂、以及任何药物送递载体(例如持续释放送递载体)的存在和性质而变化。此外,可以调节剂量以考虑所送递试剂的给药频率和药物代谢动力学特征的变化。
局部送递
如本文使用的,术语“局部”包括药物在预期的局部作用部位中或其附近的应用,可包括例如局部送递到皮肤或其它染病组织,眼送递,鞘内(IT)、脑室内(ICV)、关节内、腔内、颅内或肺泡内给药、安置或冲洗。可优选局部给药以使得能够低剂量给药,避免全身性副作用,以及更精确控制送递时间和局部送递部位的活性试剂浓度。局部给药提供了目标部位的已知浓度,无论患者之间在新陈代谢、血流等方面的变化。通过送递的直接模式也提供了改善的剂量控制。
MASP-2抑制剂的局部送递可在用于治疗疾病或病症的外科手术方法中实现,例如诸如动脉旁路术、动脉粥样斑块切除、激光手术、超声波手术、气囊式血管成形术以及支架安置这些手术期间。例如,MASP-2抑制剂可与血管成形手术一起给予受试者。气囊式血管成形手术涉及将带有抽过气的气囊的导管插入动脉中。抽过气的气囊位于动脉粥样硬化斑块的附近,气囊被充气以便将斑块向血管壁压缩。结果,气囊表面与血管表面上的血管内皮细胞接触。MASP-2抑制剂能以一种允许试剂在动脉粥样硬化斑块部位释放的方式被附着到气囊式血管成形导管上。可根据现有技术已知的标准程序将试剂附着在尼朗导管上。例如,可将试剂保存在气囊导管的隔室中,直到气囊被充气,在那个时候试剂被释放到了局部环境中。或者,可将试剂浸渍在气囊表面上,这样当气囊被充气时,试剂就接触了动脉壁的细胞。也可将试剂在多孔气囊导管中送递,诸如Flugelman,M.Y.,et al.,Circulation 85:1110-1117,1992中披露的。也参见公开的PCT申请WO 95/23161对于将治疗蛋白附着到气囊式血管成形导管上的说明性程序。同样地,也可将MASP-2抑制剂包括在凝胶或应用于支架的多聚涂层上,或者可将MASP-2抑制剂混合到支架材料中,这样在血管安置之后支架就将MASP-2抑制剂洗脱了。
用于治疗关节炎和其它肌骨骼失调的MASP-2抑制组合物可通过关节内注射而局部送递。这些组合物合适地可包括持续释放送递载体。作为需要局部送递情况下的进一步例子,用于治疗泌尿生殖器疾病的MASP-2抑制组合物合适地可在膀胱内或者其它泌尿生殖结构中进行滴入。
医疗设备上的包被
诸如抗体和抑制肽这样的MASP-2抑制剂可被固定在可植入的可附着的医疗设备上(或内部)。典型地,在植入动物体中之后,修饰过的表面将与活组织接触。通过“可植入的或可附着的医疗设备”来意指在设备(例如支架和可植入的药物送递设备)的正常操作中被植入到或附着到动物体组织中的任何设备。这些可植入的或可附着的医疗设备可由例如硝酸纤维素、重氮纤维素、玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、琼脂糖、琼脂、淀粉、尼龙、不锈钢、钛以及可生物降解的和/或生物相容的聚合物制成。蛋白质与设备的连接可通过不破坏被连接蛋白生物活性的任何技术来完成,例如通过将蛋白质的N-C-末端残基之一或两者附着到设备上。也可在蛋白质的一个或多个内部位点进行附着。也可以使用多重附着(既在蛋白质内部也在蛋白质末端)。可将可植入的或可附着的医疗设备的表面修饰成包括官能团(例如羧基、酰胺、氨基、醚、羟基、氰基、次氮基、磺胺基、乙炔基、环氧化物、硅烷、酐、琥珀酰亚胺基、叠氮基),用于将蛋白质固定在其上。耦联化学包括但不限于与MASP-2抗体或抑制肽上可利用的官能团形成酯键、醚键、酰胺键、叠氮和磺胺衍生物、氰酸酯以及其它连接。也可通过加入亲和标签序列到蛋白质上而将MASP-2抗体或抑制片段非共价附着,这些标签诸如GST(D.B.Smith and K.S.Johnson,Gene 67:31,1988)、多聚组氨酸(E.Hochuli et al.,J.Chromatog.411:77,1987)或者生物素。这些亲和标签也可用于蛋白质与设备的可逆附着。
也可将蛋白质共价附着到设备体表面上,例如通过医疗设备表面的共价活化。作为代表性的例子,可通过下面任意的一对反应基团(配对基团的一个成员存在于设备体表面,配对基团的另一个成员存在于基质细胞蛋白质上)将基质细胞蛋白质附着到设备体上:羟基/羧酸,产生酯键;羟基/酸酐,产生酯键;羟基/异氰酸酯,产生聚氨酯键。可用射频放电等离子体(RFGD)蚀刻处理不带有用反应基团的设备体来产生反应基团,以便允许基质细胞蛋白质的沉积(例如,用氧等离子体处理以引入含氧基团;用丙基氨基等离子体处理以引入氨基)。
包括核酸分子诸如反义核酸、RNAi-或DNA-编码肽抑制剂的MASP-2抑制剂可嵌入到附着于设备体的多孔基质中。可用于制造表面层的代表性多孔基质是由腱或真皮胶原制备的那些,如可从各种商业来源获得的(例如Sigma和Collagen Corporation),或者按照授予Jefferies的美国专利No.4,394,370和授予Koezuka的4,975,527的描述而制备的胶原基质。一种胶原材料称为UltraFiberTM,可从Norian Corp.(Mountain View,Calif.)获得。
如果需要,也可采用某些聚合基质,包括丙烯酸酯聚合物和乳酸聚合物,如例如授予Urist的美国专利No.4,526,909和授予Urist的No.4,563,489中所披露的。有用的聚合物的特定例子是原酸酯、酸酐、丙烯-共延胡索酸酯的聚合物,或者一种或多种α-羟基羧酸单体的聚合物(例如α-羟基乙酸(乙醇酸)和/或α-羟基丙酸(乳酸))。
治疗方案
在预防性应用中,将药学组合物给予易患或者有危险患与MASP-2依赖的补体活化相关联疾病的受试者,给予的量足以消除或降低疾病发展症状的危险。在治疗性应用中,将药物组合物给予疑似患有或者已经患有与MASP-2依赖的补体活化相关联疾病的受试者,给予的治疗有效量足以缓和或者至少部分减少疾病症状。在既预防又治疗的方案中,包括MASP-2抑制剂的组合物可给予若干剂,直到在受试者中获得足够的治疗结果。本发明的MASP-2抑制组合物的应用可通过组合物的单次给予或者有限的连续给予来进行,用于治疗急性病诸如再灌注损伤或其它外伤。或者,组合物可每过一段延长时间进行周期性间歇给药,用于治疗慢性病,例如关节炎或银屑病。
本发明的方法和组合物可用来抑制典型地由诊断性和治疗性内科和外科手术引起的炎症和相关过程。为抑制这些过程,可以在手术前后应用本发明的MASP-2抑制剂组合物。如本文使用的“手术前后”是指在术前和/或术间和/或术后给予抑制组合物,即手术之前,手术之前和期间,手术之前和之后,手术之前、期间和之后,手术期间,手术期间和之后,或者手术之后。手术前后的应用可通过将组合物局部给予到手术部位来进行,诸如通过注射或者连续或间歇冲洗部位,或者通过全身给药。用于手术前后局部送递MASP-2抑制剂溶液的合适方法披露于授予Demopulos的美国专利No.6,420,432和授予Demopulos的美国专利No.6,645,168中。用于局部送递包括MASP-2抑制剂的软骨保护组合物的合适方法披露于国际PCT专利申请WO 01/07067 A2中。用于定向全身送递包括MASP-2抑制剂的软骨保护组合物的合适方法披露于国际PCT专利申请WO 03/063799 A2中。
VI.实施例
下面的实施例仅仅例证性说明现在预期用于实施发明的最佳方式,但是不应被解释为限制发明。本文所有的文献引证都通过引用而清楚地引入。
实施例1
这个实施例描述了缺乏MASP-2(MASP-2-/-)但MAp19充足(MAp19+/+)的小鼠品系的产生。
材料和方法:设计靶载体pKO-NTKV 1901来破坏编码鼠MASP-2的C末端三个外显子,包括编码丝氨酸蛋白酶结构域的外显子,如图4所示。使用PKO-NTKV 1901来转染鼠ES细胞系E14.1a(SV129 Ola)。选择新霉素抗性和胸苷激酶敏感的克隆。筛选到600个ES克隆,在其中鉴别到了四个不同克隆,经southern印迹证实含有预期的选择性靶向和重组结果,如图4所示。通过胚胎转移从这四个阳性克隆产生嵌合体。然后将嵌合体在遗传背景C57/BL6中回交以产生转基因雄性。将转基因雄性与雌性杂交以产生F1,50%的后代显示了被破坏MASP 2基因的杂合性。将杂合小鼠互交以产生纯合的MASP-2缺陷后代,以1:2:1的比例分别产生杂合小鼠和野生型小鼠。
结果和表型:发现所产生的纯合MASP-2-/-缺陷小鼠是能存活和能生育的,并证实了是缺乏MASP-2的,经southern印迹证实正确的靶向结果,经Northern印迹证实缺乏MASP-2 mRNA,经Western印迹证实缺乏MASP-2蛋白(数据未显示)。使用时间分辨RT-PCR在LightCycler机器上进一步证实了MAp19 mRNA的存在和MASP-2 mRNA的缺乏。MASP-2-/-小鼠确实如预期那样继续表达MAp19、MASP-1和MASP-3 mRNA以及蛋白质(数据未显示)。通过LightCycler分析估计了MASP-2-/-小鼠中备解素、因子B、因子D、C4、C2和C3的mRNA的存在和丰度,发现与野生型同窝对照中的相同(数据未显示)。来自纯合MASP-2-/-小鼠的血浆完全缺少凝集素途径介导的补体活化和替代途径补体活化,如实施例2中进一步描述的。
在纯C57BL6背景上产生MASP-2-/-品系:将MASP-2-/-小鼠与纯C57BL6品系回交连续九代,然后将MASP-2-/-品系用作实验动物模型。
实施例2
这个实施例证明MASP-2是经替代途径和凝集素途径的补体活化所需要的。
方法和材料:
凝集素途径特异的C4裂解分析:已经由Petersen,et al.,J.Immunol.Methods 257:107(2001)描述了C4裂解分析,它测定由来自金黄色葡萄球菌的、结合L-ficolin的脂磷壁酸(LTA)所产生的凝集素途径活化。修改实施例11中描述的分析法来测定由MBL引起的凝集素途径活化,其通过用LPS和甘露聚糖或酵母聚糖包被板子,然后加入来自MASP-2-/-小鼠的血清,如下所述。也修改了分析法以消除由于经典途径引起的C4裂解的可能性。这可以通过使用含1M NaCl的样品稀释缓冲液来实现,它允许凝集素途径识别组分高亲和性结合到它们的配体上,但是阻止内源C4的活化,从而通过解离C1复合物而排除了经典途径的参与。简要描述的话,在修改的分析法中,将血清样品(在高盐(1M NaCl)缓冲液中)加入到包被配体的板子上,接着加入定量的生理盐浓度的缓冲液中的纯化C4。含有MASP-2的被结合的识别复合物裂解C4而产生C4b沉积。
分析方法:
1)用稀释于包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH9.6)中的1μg/ml甘露聚糖(M7504 Sigma)或任何其它配体(例如下面所列举的那些)包被Nunc Maxisorb微量滴定板(Maxisorb,Nunc,cat.No.442404,Fisher Scientific)。
在分析中使用下面的试剂:
a.甘露聚糖(1μg/孔甘露聚糖(M7504Sigma),于100μl包被缓冲液中);
b.酵母聚糖(1μg/孔酵母聚糖(Sigma),于100μl包被缓冲液中);
c.LTA(1μg/孔于100μl包被缓冲液中或者2μg/孔于20μl甲醇中);
d.1μg的H-ficolin特异性Mab 4H5,于包被缓冲液中;
e.来自浅绿气球菌的PSA(2μg/孔,于100μl包被缓冲液);
f.100μl/孔的福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233(OD550=0.5),于包被缓冲液中。
2)将板子在4℃温育过夜。
3)在过夜温育后,通过用0.1% HSA-TBS封闭缓冲液(0.1%(w/v)HAS于10mM Tris-HCl,140mM NaCl,1.5mM NaN3,pH 7.4中)温育板子1-3小时,然后用TBS/tween/Ca2+(TBS,带有0.05%Tween 20和5mM CaCl2,1mM MgCl2,pH 7.4)漂洗板子3次,将剩余的蛋白结合位点饱和。
4)将待测试的血清样品在MBL结合缓冲液(1M NaCl)中稀释,将稀释的样品加入到板子上,4℃温育过夜。将只加入缓冲液的孔用作阴性对照。
5)在4℃温育过夜之后,用TBS/tween/Ca2+漂洗板子3次。然后将人C4(100μl/孔,在BBS(4mM巴比妥,145mM NaCl,2mMCaCl2,1mM MgCl2,pH 7.4)中稀释到1μg/ml)加入到板子上,在37℃温育90分钟。用TBS/tween/Ca2+再漂洗3次。
6)用缀合了碱性磷酸酶的鸡抗人C4c(在TBS/tween/Ca2+中1:1000稀释)来检测C4b沉积,将其加入到板子上室温温育90分钟。然后用TBS/tween/Ca2+漂洗板子3次。
7)通过加入100μl的磷酸对-硝基苯底物溶液来检测碱性磷酸酶,室温温育20分钟,在微量滴定板读数器上读取OD405。
结果:图6A-B显示了来自MASP-2+/+(十字)、MASP-2+/-(封闭圆圈)和MASP-2-/-(封闭三角)的血清稀释物在甘露聚糖(图6A)和酵母聚糖(图6B)上的C4b沉积。图6C显示了用酵母聚糖(白色条柱)或甘露聚糖(阴影条柱)包被的板子上的相对C4转化酶活性,来自MASP-2-/+小鼠(n=5)和MASP-2-/-小鼠(n=4)相对于野生型小鼠(n=5)的,其基于测定C4b沉积的量对野生型血清标准化。误差条代表标准偏差。如图6A-C所示,来自MASP-2-/-小鼠的血浆在甘露聚糖和酵母聚糖包被的板子上完全缺少了凝集素途径介导的补体活化。这些结果清楚地证明,是MASP-2但不是MASP-1或MASP-3是凝集素途径的效应物成分。
C3b沉积分析:
1)用稀释于包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,H 9.6)中的1μg/ml甘露聚糖(M7504 Sigma)或任何其它配体包被NuncMaxisorb微量滴定板(Maxisorb,Nunc,cat.No.442404,FisherScientific),4℃温育过夜。
2)通过用0.1% HSA-TBS封闭缓冲液(0.1%(w/v)HAS于10mM Tris-HCl,140mM NaCl,1.5mM NaN3,pH 7.4中)温育板子1-3小时,将剩余的蛋白结合位点饱和。
3)在TBS/tw/Ca++(TBS,带有0.05% Tween 20和5mM CaCl2)中漂洗板子,将稀释的BBS加入到血清样品中(4mM巴比妥,145mMNaCl,2mM CaCl2,1mM MgCl2,pH 7.4)。将只加入缓冲液的孔用作阴性对照。在分析中使用之前,将获自野生型或MASP-2-/-小鼠的一组对照血清样品的C1q去除。根据供应商的使用说明书,使用包被了兔抗人C1q IgG(Dako,Glostrup,Denmark)的耦联蛋白A的Dynabeads(Dynal Biotech,Oslo,Norway)来制备去除C1q的小鼠血清。
4)在4℃温育过夜之后,用TBS/tw/Ca++再漂洗一次,用在TBS/tw/Ca++中以1:1000稀释的多克隆抗人C3c抗体(Dako A 062)来检测被转化和被结合的C3。第二抗体是缀合到碱性磷酸酶上的山羊抗兔IgG(完整分子)(Sigma Immunochemicals A-3812),在TBS/tw/Ca++中稀释1:10000。通过加入100μl底物溶液(Sigma快速磷酸对-硝基苯片剂组,Sigma)并在室温温育来确定替代补体途径(AP)的存在。通过在微量滴定板读数器中测定405nm的吸收来定量监测水解。使用血浆/血清样品的系列稀释物为每个分析准备标准曲线。
结果:图7A和7B所示的结果来自几只小鼠的混合血清。十字代表MASP-2+/+血清,实心圆圈代表去除C1q的MASP-2+/+血清,空心方块代表MASP-2-/-血清,空闲三角代表去除C1q的MASP-2-/-血清。如图7A-B所示,在C3b沉积分析中测试的MASP-2-/-血清在甘露聚糖(图7A)和酵母聚糖(图7B)包被的板子上产生了极低水平的C3活化。这个结果清楚地证明,需要MASP-2来推动C3到C3b的初始产生,以起始替代补体途径。考虑到被广泛接受的观点,这是惊人的结果,原来的观点认为,补体因子C3、因子B、因子D和备解素形成了独立的功能性替代途径,其中C3能够经历自发构象变化成为“C3b样”形式,然后它产生液相转化酶iC3Bb并将C3b分子沉积在活化表面诸如酵母聚糖上。
重组MASP-2重构了MASP-2-/-小鼠血清中的凝集素途径
依赖的C4活化
为确定MASP-2缺乏是MASP-2-/-小鼠中凝集素途径依赖的C4活化丧失的直接原因,在上述C4裂解分析法中检查了将重组MASP-2蛋白加入到血清样品的效应。如下面实施例5中所述生产并纯化功能活性的鼠MASP-2和催化失活的鼠MASP-2A(其中丝氨酸蛋白酶结构域中的活性部位丝氨酸残基被丙氨酸残基取代)。将4只MASP-2-/-小鼠的混合血清与递增蛋白浓度的重组鼠MASP-2或失活的重组鼠MASP-2A预温育,如上所述分析C4转化酶活性。
结果:如图8所示,功能活性鼠重组MASP-2蛋白(显示为空心三角)加入到获自MASP-2-/-小鼠的血清中就以蛋白浓度依赖的方式恢复了凝集素途径依赖的C4活化,而催化失活的鼠MASP-2A蛋白(显示为星形)没有恢复C4活化。将图8显示的结果对用混合野生型小鼠血清所观察到的C4活化(显示为点线)进行标准化。
实施例3
这个实施例描述了转基因小鼠品系的产生,它是鼠MASP-2-/-、MAp19+/+,并表达人MASP-2转基因(鼠MASP-2敲除,人MASP-2敲入)。
材料和方法:构建图5所示的称为“微型hMASP-2”的编码人MASP-2的微型基因(SEQ ID NO:49),它包括人MASP 2基因的启动子区,包括头3个外显子(外显子1到外显子3)接着是代表后面8个外显子的编码序列的cDNA序列,从而编码由其内源启动子驱动的全长MASP-2蛋白。将微型hMASP-2构建体插入到MASP-2-/-的受精卵中以便通过转基因表达人MASP-2来代替缺少的鼠MASP 2基因。
实施例4
这个实施例描述了从人血清中以酶原形式分离人MASP-2蛋白。
人MASP-2的分离方法:用于从人血清分离MASP-2的方法已经描述于Matsushita et al.,J.Immunol.165:2637-2642,2000。简要地说,,将人血清通过酵母甘露聚糖-琼脂糖柱,使用含有0.2MNaCl、20mM CaCl2、0.2mM NPGB、20μM p-APMSF和2%甘露醇的10mM咪唑缓冲液(pH 6.0)。用MBL结合MASP-1和MASP-2酶原,用含有0.3M甘露糖的上述缓冲液洗脱。为将酶原MASP-2和MASP-2与MBL分开,将含有复合物的制剂加到抗MBL-琼脂糖上,然后用含有20mM EDTA和1M NaCl的咪唑缓冲液洗脱MASP。最后,将其通过抗MASP-1-琼脂糖而将酶原MASP-1和MASP-2分开,缓冲液与抗MBL-琼脂糖中所使用的缓冲液相同。在洗脱液中回收MASP-2,而用0.1M甘氨酸(pH 2.2)洗脱MASP-1。
实施例5
这个实施例描述了重组全长人、大鼠和鼠MASP-2,MASP-2衍生多肽,以及催化失活的MASP-2突变形式的重组表达和蛋白生产。
全长人、鼠和大鼠MASP-2的表达:
将人MASP-2全长cDNA序列(SEQ ID NO:4)也亚克隆到哺乳动物表达载体pCI-Neo(Promega)中,在CMV增强子/启动子区控制下驱动真核表达(描述于Kaufman R.J.et al.,Nucleic AcidsResearch 19:4485-90,1991;Kaufman,Methods in Enzymology,185:537-66(1991))。将全长小鼠cDNA(SEQ ID NO:50)和大鼠MASP-2cDNA(SEQ ID NO:53)各自亚克隆到pED表达载体中。然后将MASP-2表达载体转染到贴壁的中国仓鼠卵巢细胞系DXB1中,使用Maniatis et al.,1989中描述的标准磷酸钙转染程序。用这些构建体转染的细胞生长非常缓慢,表明所编码的蛋白酶是细胞毒性的。
在另一种方法中,将含有由其内源启动子驱动的人MASP-2cDNA的微型基因构建体(SEQ ID NO:49)瞬时转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。人MASP-2蛋白被分泌进培养基中,如下面所述进行分离。
全长的催化失活MASP-2的表达:
基本原理:在识别亚成分MBL或ficolin(L-ficolin、H-ficolin或M-ficolin)结合到它们各自的糖类模式上之后,MASP-2就被自催化裂解活化了。引起MASP-2活化的自催化裂解经常发生在从血清分离MASP-2的过程期间,或者重组表达后的纯化期间。为获得更稳定的蛋白制剂来用作抗原,通过用丙氨酸残基取代蛋白酶结构域的催化三联体中存在的丝氨酸残基,产生称为MASP-2A的催化失活形式的MASP-2,在大鼠中(SEQ ID NO:55Ser617变成Ala617);在小鼠中(SEQ ID NO:52Ser617变成Ala617);或者在人中(SEQ IDNO:3 Ser618变成Ala618)。
为产生催化失活的人和鼠MASP-2A蛋白,使用表5所示寡核苷酸进行定点诱变。表5中的寡核苷酸被设计来退火到编码酶学活性丝氨酸的人和鼠cDNA区,寡核苷酸含有错配以便将丝氨酸密码变成丙氨酸密码。例如,使用PCR寡核苷酸SEQ ID NO:56-59与人MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)一起来扩增起始密码到酶学活性丝氨酸的区域以及丝氨酸到终止密码的区域,以从含有Ser618到Ala618突变的突变MASP-2A产生完整开放读码框。在琼脂糖凝胶电泳和条带制备之后纯化PCR产物,使用标准拖尾程序产生单个的腺苷重叠。然后将腺苷拖尾的MASP-2A克隆到pGEM-T easy载体中,转化到大肠杆菌中。
通过激酶化以及退火SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65来产生催化失活的大鼠MASP-2A蛋白,所述退火是通过将这两种寡核苷酸等摩尔的量混合,在100℃加热2分钟,缓慢冷却到室温。所得到的退火片段具有Pst1和Xba1配合末端,将其插入来代替野生型大鼠MASP-2 cDNA(SEQ ID NO:53)的PstI-XbaI片段以产生大鼠MASP-2A。
5'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3'(SEQ IDNO:64)
5'CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA3'(SEQ ID NO:65)
进一步将人、小鼠和大鼠MASP-2A各自亚克隆到哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo中并转染到中国仓鼠卵巢细胞系DXB1中,如下面所述。
在另一种方法中,使用Chen et al.,J.Biol.Chem.,276(28):25894-25902,2001中描述的方法构建MASP-2的催化失活形式。简要地说,将含有全长人MASP-2cDNA的质粒(描述于Thiel et al.,Nature386:506,1997)用Xho1和EcoR1消化,将MASP-2cDNA(如本文的SEQ ID NO:4所描述的)克隆到pFastBac1杆状病毒转移载体(Life Technologies,NY)相应的限制性位点中。然后通过用天然区域氨基酸610到625取代编码肽区域氨基酸610-625(SEQ ID NO:13)的双链寡核苷酸而将MASP-2丝氨酸蛋白酶活性部位变成Ala618,以产生带有失活蛋白酶结构域的MASP-2全长多肽。含有源自人Masp-2的多肽区域的表达质粒的构建
使用MASP-2信号肽(SEQ ID NO:5的残基1-15)来产生下面的构建体以分泌MASP-2的各种结构域。通过PCR扩增编码MASP-2(SEQ ID NO:6)残基1-121区域(相当于N末端CUB1结构域)来制备表达人MASP-2CUBI结构域(SEQ ID NO:8)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2(SEQ ID NO:6)残基1-166区域(相当于N末端CUBIEGF结构域)来制备表达人MASP-2 CUBIEGF结构域(SEQ ID NO:9)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2(SEQID NO:6)残基1-293区域(相当于N末端CUBIEGFCUBII结构域)来制备表达人MASP-2 CUBIEGFCUBII结构域(SEQ ID NO:10)的构建体。使用VentR聚合酶和pBS-MASP-2作为模板根据公知的PCR方法经PCR扩增上述结构域。有义引物(5'-CGGGATCCATGAGGCTG CTGACCCTC-3'SEQ ID NO:34)的5’引物序列在PCR产物的5’端引入了BamHI限制性位点(下划线)。下面的表5中所显示的用于每种MASP-2结构域的反义引物被设计来在每种PCR产物末端的EcoRI位点(下划线)之后引入终止密码(黑体)。一被扩增,就用BamHI和EcoRI消化DNA片段,将其克隆到pFastBac1载体的相应位点中。通过限制图谱来表征并通过dsDNA测序来确认所得到的构建体。
表5:MASP-2 PCR引物
MASP-2的重组真核表达以及酶学失活的小鼠、大鼠和人MASP
-2A的蛋白质生产
使用标准磷酸钙转染程序(Maniatis et al.,1989)将上述MASP-2和MASP-2A表达构建体转染到DXB1细胞中。在无血清培养基中生产MASP-2A以确保制备物不被其它血清蛋白污染。每隔一天从汇合细胞收获培养基(一共四次)。所有三个物种的重组MASP-2A水平平均在大约1.5mg/升培养基。
MASP-2A蛋白纯化:通过MBP-A-琼脂糖柱上的亲和层析来纯化MASP-2A(上述Ser-Ala突变体)。这种策略使得能够快速纯化而不需使用外部标签。将MASP-2A(100-200ml培养基用等体积的加样缓冲液(50mM Tris-Cl,pH 7.5,含150mM NaCl和25mM CaCl2)稀释)加样到用10ml加样缓冲液预平衡的MBP-琼脂糖亲和柱(4ml)上。进一步用10ml加样缓冲液漂洗后,在含1.25M NaCl和10mM EDTA的50mM Tris-Cl、pH 7.5的1ml级份中洗脱蛋白质。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来鉴别含有MASP-2A的级份。必要时,进一步通过离子交换层析在MonoQ柱(HR 5/5)上纯化MASP-2A。用含50M NaCl的50mM Tris-Cl、pH 7.5透析蛋白质,加样到同样缓冲液平衡的柱上。漂洗后,用10ml的0.05-1M NaCl梯度洗脱结合的MASP-2A。
结果:从200ml培养基获得了0.25-0.5mg的MASP-2A蛋白质产量。经MALDI-MS确定的77.5kDa分子量比未修饰多肽(73.5kDa)的计算值大,这是由于糖基化。聚糖在每个N-糖基化部位的附着解释了所观察到的分子量。MASP-2A作为单一条带在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上迁移,证明它在生物合成期间没有被蛋白水解加工。经平衡超速离心确定的加权平均分子量是与糖基化多肽同型二聚体的计算值一致的。
重组人MASP-2多肽的生产
生产重组MASP-2和MASP-2A衍生多肽的另一种方法描述于Thielens,N.M.,et al.,J.Immunol.166:5068-5077,2001。简要地说,在补充了50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素(Life Technologies)的Sf900II无血清培养基(Life Technologies)中生长并维持草地夜蛾昆虫细胞(获自Novagen,Madison,WI的现成空斑Sf9细胞)。在含有10%FCS(Dominique Dutscher,Brumath,France)并补充了50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素的TC100培养基(Life Technologies)中生长并维持Trichoplusia ni(High Five)昆虫细胞(由Jadwiga Chroboczek,Institut de Biologie Structurale,Grenoble,France提供)。使用Bac-to-Bac系统(Life Technologies)来产生重组杆状病毒。使用Qiagen中量制备纯化系统(Qiagen)来纯化bacmid DNA并用来转染Sf9昆虫细胞,按厂商使用说明书所描述的那样使用cellfectin在Sf900II SFM培养基(Life Technologies)中进行。4天后收集重组病毒粒子,经病毒斑分析法滴定,按照King和Possee在The Baculovirus ExpressionSystem:A Laboratory Guide,Chapman and Hall Ltd.,London,pp.111-114,1992中所描述的那样进行扩增。
用含有MASP-2多肽的重组病毒以感染复数2在Sf900 II SFM培养基中于28℃感染High Five细胞(1.75x107个细胞/175-cm2组织培养皿)96小时。经离心收集上清液,加入二异丙基氟磷酸酯到终浓度1mM。
MASP-2多肽被分泌到培养基中。将培养上清液对50mM NaCl,1mM CaCl2,50mM盐酸三乙醇胺,pH 8.1透析,以1.5ml/min的速度加样到同样缓冲液平衡的Q-琼脂糖高流动性柱(AmershamPharmacia Biotech)(2.8x12cm)上。通过将1.2升线性梯度加入到同样缓冲液中的350mM NaCl中进行洗脱。通过Western印迹分析来鉴别含有重组MASP-2多肽的级份,通过加入(NH4)2SO4到60%(w/v)进行沉淀,在4℃放置过夜。将沉淀悬浮于145mM NaCl,1mM CaCl2,50mM盐酸三乙醇胺,pH 7.4中,加到同样缓冲液平衡的TSK G3000SWG柱(7.5x600mm)(Tosohaas,Montgomeryville,PA)上。然后将纯化的多肽在Microsep微型浓缩器(截留分子量=10,000)(Filtron,Karlstein,Germany)中经超速离心浓缩到0.3mg/ml。
实施例6
这个实施例描述了生产抗MASP-2多肽的多克隆抗体的方法。
材料和方法:
MASP-2抗原:通过用下面的分离MASP-2多肽免疫兔来生产多克隆抗人MASP-2抗血清:如实施例4描述的分离自血清的人MASP-2(SEQ ID NO:6);如实施例4-5描述的重组人MASP-2(SEQ ID NO:6),含有失活蛋白酶结构域(SEQ ID NO:13)的MASP-2A;表达的重组CUBI(SEQ ID NO:8),CUBEGFI(SEQ ID NO:9),以及CUBEGFCUBII(SEQ ID NO:10),如上面实施例5描述的。
多克隆抗体:通过注射在100μg/ml无菌盐水溶液中的100μgMASP-2多肽来免疫经BCG(杆菌Calmette-Guerin疫苗)初次免疫的六周龄兔。每4周进行注射,如实施例7所述经ELISA监测抗体滴度。搜集培养物上清液,用于经蛋白A亲和层析的抗体纯化。
实施例7
这个实施例描述了用于生产抗大鼠或人MASP-2多肽的鼠单克隆抗体的方法。
材料和方法:
用200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4的完全弗氏佐剂(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)中的100μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A(按实施例4或实施例5描述的制备)皮下注射8-12周龄的雄性A/J小鼠(Harlan,Houston,Tex.)。用不完全弗氏佐剂中的50μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽以两周的时间间隔皮下折射小鼠两次。在第四周用PBS中的50μg人或大鼠rMASP-2或rMASP-2A多肽注射小鼠,4天后进行融合。
对于每次融合来说,从免疫过的小鼠脾脏制备单细胞悬浮液,用于与Sp2/0骨髓瘤细胞的融合。将5x108个Sp2/0和5x108个脾细胞在含有50%聚乙二醇(分子量1450)(Kodak,Rochester,N.Y.)和5%二甲亚砜(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)的培养基中融合。然后将细胞调节到每200μl的Iscove培养基(Gibco,Grand Island,N.Y.)悬浮液1.5x105脾细胞的浓度,补充10%胎牛血清、100单位/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素、0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷。将两百微升的细胞悬浮液加入到大约二十个96孔微量培养板的每个孔中。在大约十天后,将培养物上清液取出,用于在ELISA分析中筛选与纯化因子MASP-2的反应性。
ELISA分析:通过加入50μl纯化的50ng/ml的hMASP-2或大鼠rMASP-2(或rMASP-2A)来包被Immulon 2(DynatechLaboratories,Chantilly,Va.)微量培养板的孔,室温过夜。包被MASP-2的低浓度使得能够选择高亲和力抗体。通过轻弹板子去除包被溶液之后,加入200μl的PBS中的BLOTTO(脱脂奶粉)到每个孔中一小时以封闭非特异性位点。一小时之后,然后用缓冲液PBST(含0.05%Tween 20的PBS)漂洗孔。从每个融合孔中收集五十微升培养物上清液,与50μl的BLOTTO混合,然后加入到微量培养板的各个孔中。温育一小时之后,用PBST漂洗孔。然后通过与缀合了辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG(Fc特异性的)(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,Pa.)反应来检测结合的鼠抗体,在BLOTTO中以1:2,000稀释。将含有0.1%的3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma,St.Louis,Mo.)和0.0003%的过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液加入到孔中,显色30分钟。通过每孔加入50μl的2M H2SO4来终止反应。用BioTek ELISA读数器(BioTekInstruments,Winooski,Vt.)读取反应混合物在450nm的光密度。
MASP-2结合分析:
在上述MASP-2 ELISA分析中测试为阳性的培养物上清液可在结合分析中进行测试,以确定MASP-2抑制剂具有的对MASP-2的结合亲和力。也可使用类似分析来确定抑制剂是否结合补体系统中的其它抗原。
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中的MASP-2(20ng/100μl/孔,Advanced Research Technology,San Diego,CA)来包被聚苯乙烯微量滴定板的孔(96孔培养基结合板子,Corning Costar,Cambridge,MA),4℃过夜。吸出MASP-2溶液后,用含有1%牛血清白蛋白(BSA;Sigma Chemical)的PBS室温封闭2小时。没有MASP-2包被的孔作为背景对照。将在封闭溶液中各种浓度的杂交瘤上清液或纯化的抗MASP-2 MoAb试样加入到孔中。室温温育2小时之后,用PBS大量冲洗孔。通过在封闭溶液中加入缀合了过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Sigma Chemical)来检测结合MASP-2的抗MASP-2 MoAb,使其在室温温育1小时。用PBS再次彻底冲洗板子,加入100μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)。通过加入100μl的1M磷酸来淬灭TMB的反应,将板子在微量板读数器(SPECTRA MAX 250,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中于450nm进行读数。
然后对来自阳性孔的培养物上清液测试其在功能性分析诸如实施例2描述的C4裂解分析中抑制补体活化的能力。然后经有限稀释克隆阳性孔中的细胞。再在上述ELISA分析中测试MoAb与hMASP-2的反应性。在旋转瓶中生长所选杂交瘤,收集耗尽的培养物上清液,经蛋白A亲和层析纯化抗体。
实施例8
这个实施例描述了表达人MASP-2的MASP-2-/-敲除小鼠的产生,用作筛选MASP-2抑制剂的模型。
材料和方法:将实施例1中描述的MASP-2-/-小鼠与实施例3中描述的表达人MASP-2转基因构建体(人MASP-2敲入)的MASP-2-/-小鼠进行杂交,后代为鼠MASP-2-/-、鼠MAp19+、人MASP-2+,使用该后代来鉴别人MASP-2抑制剂。
这些动物模型可用作测试底物,用于MASP-2抑制剂诸如人抗MASP-2抗体、MASP-2抑制肽和非肽、以及包括MASP-2抑制剂的组合物的鉴别和功效测试。例如,将动物模型暴露于已知引起MASP-2依赖的补体活化的化合物或试剂,将MASP-2抑制剂以足够引起所暴露动物中的疾病症状减少的时间和浓度给予动物模型。
此外,鼠MASP-2-/-、MAp19+、人MASP-2+小鼠可用来产生含有一种或多种涉及MASP-2所关联疾病的细胞类型的细胞系,它可用作那种失调的细胞培养模型。由转基因动物产生传代细胞系是现有技术中公知的,例如参见Small,J.A.,et al.,Mol.Cell Biol.,5:642-48,1985。
实施例9
这个实施例描述了在表达人MASP-2和人免疫球蛋白的MASP-2敲除小鼠中生产抗人MASP-2的人抗体的方法。
材料和方法:
如实施例1所述产生MASP-2-/-小鼠。然后如实施例3所述构建表达人MASP-2的小鼠。将纯合MASP-2-/-和表达人MASP-2的MASP-2-/-小鼠各自与源自胚胎干细胞系的小鼠杂交,该胚胎干细胞系被设计成含有内源免疫球蛋白重链和轻链基因座的靶向破坏并表达至少一个区段的人免疫球蛋白基因座。优选地,人免疫球蛋白基因座的区段包括重链和轻链组分的非重排序列。内源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的引入都可通过靶向同源重组来实现。由这种方法产生的转基因哺乳动物能够功能性重排免疫球蛋白组分序列,表达由人免疫球蛋白基因编码的各种同种型的抗体集合,不表达内源免疫球蛋白基因。具有这些性质的哺乳动物的生产和性质被描述了,例如参见Thomson,A.D.,Nature 148:1547-1553,1994,以及Sloane,B.F.,Nature Biotechnology 14:826,1996。小鼠抗体基因被失活并用人抗体基因功能性取代的小鼠遗传工程化品系是商业上可获得的(例如由Abgenix,Fremont CA提供的)。所得到的子代小鼠能够产生抗人MASP-2的人MoAb,它们适合于在人体治疗中使用。
实施例10
这个实施例描述了人源化的鼠抗MASP-2抗体和抗体片段的产生和生产。
如实施例7所述着雄性A/J小鼠中产生鼠抗MASP-2单克隆抗体。然后如下所述人源化鼠抗体以降低它的免疫原性,其通过用它们的人对应抗体恒定区来取代鼠恒定区以产生嵌合IgG和抗体的Fab片段,它对于根据本发明的抑制人受试者中MASP-2依赖的补体活化的不利效应是有用的。
1.由鼠杂交瘤细胞克隆抗MASP-2可变区基因。使用RNAzol按照厂商的使用说明书(Biotech,Houston,Tex.)由分泌抗MASP-2MoAb的杂交瘤细胞(按照实施例7中的描述获得)分离总RNA。使用oligo dT作为引物由总RNA合成第一链cDNA。使用源自免疫球蛋白恒定C区的3’引物以及源自前导肽或鼠VH或VK基因的第一框架区的简并引物组作为5’引物来进行PCR。为克隆VK基因,使用Not1-MAK1引物(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3'SEQ ID NO:38)来制备双链cDNA。将退火接头AD1(5'-GGAATTCACTCGTT ATTCTCGGA-3'SEQ ID NO:39)和AD2(5'-TCCGAGAATAAC GAGTG-3'SEQ ID NO:40)连接到双链cDNA的5’和3’末端。经Notl消化去除3’末端的接头。然后将消化的产物用作PCR模板,以AD1寡核苷酸作为5’引物,MAK2(5'-CATTGAAAGCTTTGGGGT AGAAGTTGTTC-3'SEQ ID NO:41)作为3’引物。将大约500bp的DNA片段克隆到pUC19中。选择几个克隆进行序列分析以验证克隆的序列包含预期的鼠免疫球蛋白恒定区。Not1-MAK1和MAK2寡核苷酸源自VK区,分别为C kappa基因第一碱基对下游的182和84bp。选择包括完整VK和前导肽的克隆。
为克隆VH基因,使用Not1-MAG1引物(5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3'SEQ ID NO:42)来制备双链cDNA。将退火接头AD1和AD2连接到双链cDNA的5’和3’末端。经Notl消化去除3’末端的接头。将消化的产物用作PCR模板,以AD1寡核苷酸和MAG2(5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3'SEQ ID NO:43)作为引物。将500到600bp长度的DNA片段克隆到pUC19中。Not1-MAG1和MAG2寡核苷酸源自鼠Cγ.7.1区,分别为鼠Cγ.7.1基因第一bp下游的180和93bp。选择包括完整VH和前导肽的克隆。
2.用于嵌合MASP-2IgG和Fab的表达载体的构建。将上述克隆的VH和VK基因用作PCR反应的模板,以将Kozak共有序列加到5’末端并将剪接供体加到核苷酸序列的3’末端。在分析序列确认没有PCR误差后,将VH和VK基因分别插入到含有人C.γ1和C.kappa的表达载体中,产生pSV2neoVH-huCγ1和pSV2neoV-huCγ。使用CsCl梯度纯化的重链和轻链载体的质粒DNA经电穿孔转染COS细胞。48小时后,经ELISA测试培养物上清液以确认大约200ng/ml的嵌合IgG的存在。收获细胞,制备总RNA。使用oligo dT作为引物从总RNA合成第一链cDNA。将该cDNA用作PCR模板以产生Fd和kappa DNA片段。对于Fd基因来说,使用5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATG GATTGGCTGTGGAACT-3'(SEQ ID NO:44)作为5’引物以及源自CH1的3’引物(5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3'SEQ IDNO:45)进行PCR。确认DNA序列含有完整的人IgG1的VH和CH1结构域。在用合适的酶消化后,将Fd DNA片段插入表达载体盒pSV2dhfr-TUS的HindIII和BamHI限制位点,产生pSV2dhfrFd。pSV2质粒是商业可获得的,由各种来源的DNA区段组成:含有pBR322 DNA复制起始位点(pBR ori)的pBR322 DNA(细线)以及内酰胺酶氨苄青霉素抗性基因(Amp);SV40 DNA,由较粗的阴影线表示并标记,含有SV40 DNA复制起始位点(SV40 ori),早期启动子(dhfr和neo基因的5’)以及聚腺苷信号(dhfr和neo基因的3’)。源自SV40的聚腺苷信号(pA)也位于Fd基因的3’末端。
对于kappa基因来说,使用5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3'(SEQ ID NO:46)作为5’引物以及源自CK的3’引物(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3'SEQID NO:47)进行PCR。确认DNA序列含有完整的VK和人CK区域。在用合适的限制酶消化后,将kappa DNA片段插入表达载体盒pSV2neo-TUS的HindIII和BamHI限制位点,产生pSV2neoK。Fd和kappa基因的表达都是由源自HCMV的增强子和启动子元件驱动的。由于Fd基因不包括涉及到链间二硫键的半胱氨酸氨基酸残基,该重组的嵌合Fab就含有非共价连接的重链和轻链。该嵌合Fab被命名为cFab。
为获得带有重链和轻链之间的二硫键的重组Fab,可以将上述Fd基因由人IgG1的铰链区延长为包括额外9个氨基酸(EPKSCDKTHSEQ ID NO:48)的编码序列。在Fd基因3’末端的编码30个氨基酸的BstEII-BamHI DNA区段可被编码延长Fd的DNA区段取代,产生pSV2dhfrFd/9aa。
3.嵌合的抗MASP-2 IgG的表达和纯化
为产生分泌嵌合的抗MASP-2 IgG的细胞系,用纯化的pSV2neoVH-huC.γ1和pSV2neoV-huC kappa质粒DNA经电穿孔转染NSO细胞。在0.7mg/ml G418存在下选择被转染的细胞。使用含血清的培养基在250ml旋转瓶中生长细胞。
将100ml旋转培养物的培养上清液加样到10-ml PROSEP-A柱(Bioprocessing,Inc.,Princeton,N.J.)上。用10倍柱体积的PBS漂洗柱。用50mM柠檬酸盐缓冲液pH 3.0洗脱结合的抗体。将等体积的1M Hepes pH 8.0加入到含有纯化抗体的级份中,调节pH到7.0。通过Millipore膜超滤(截留分子量:3,000)用PBS进行缓冲液交换来去除残留的盐。纯化抗体的蛋白浓度通过BCA方法(Pierce)确定。
4.嵌合的抗MASP-2 Fab的表达和纯化
为产生分泌嵌合的抗MASP-2 Fab的细胞系,用pSV2dhfrFd(活pSV2dhfrFd/9aa)和pSV2neokappa的纯化质粒DNA经电穿孔转染CHO细胞。在G418和氨甲喋呤存在下选择被转染的细胞。以递增浓度的氨甲喋呤对选择的细胞系进行扩增。经有限稀释对细胞进行单细胞亚克隆。然后使用无血清培养基在100ml旋转培养基中生长高产的单细胞亚克隆细胞系。
使用抗MASP-2 MoAb的小鼠抗独特型MoAb经亲和层析纯化嵌合的抗MASP-2 Fab。抗独特型MASP-2 MoAb可通过这样来制备,用缀合了钥孔血蓝素(KLH)的鼠抗MASP-2 MoAb免疫小鼠,筛选能够用人MASP-2竞争的特异性MoAb结合。对于纯化来说,将来自产生cFab或cFab/9aa的CHO细胞的旋转培养物的100ml上清液加样到结合了抗独特型MASP-2 MoAb的亲和柱上。然后用PBS彻底漂洗柱,接着用50mM二乙胺pH 11.5洗脱结合的Fab。如上所述经缓冲液交换来去除残留的盐。纯化Fab的蛋白浓度通过BCA方法(Pierce)确定。
嵌合MASP-2 IgG、cFab和cFAb/9aa抑制MASP-2依赖的补体途径的能力可通过使用实施例2中描述的抑制分析法来确定。
实施例11
这个实施例描述了用作功能性筛选的体外C4裂解分析法,来鉴别能够阻断经L-ficolin/P35、H-ficolin、M-ficolin或甘露聚糖引起的MASP-2依赖的补体活化的MASP-2抑制剂。
C4裂解分析法:已经由Petersen,S.V.,et al.,J.Immunol.Methods 257:107,2001描述了C4裂解分析法,其测定由结合L-ficolin的金黄色葡萄球菌的脂磷壁酸(LTA)产生的凝集素途径活化。
试剂:福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(DSM20233)如下制备:将细菌在胰蛋白酶大豆血液培养基中37℃培养过夜,用PBS漂洗三次,然后在PBS/0.5%福尔马林中室温固定1小时,再用PBS漂洗三次,然后悬浮于包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.6)中。
分析:Nunc MaxiSorb微量滴定板(Nalgene Nunc International,Rochester,NY)的孔包被了:100μl的于包被缓冲液中的福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233(OD550=0.5),包被缓冲液中有1ug的L-ficolin。温育过夜之后,用TBS(10mM Tris-HCl,140mMNaCl,pH 7.4)中的0.1%人血清白蛋白(HSA)封闭孔,然后用含有0.05% Tween 20和5mM CaCl2的TBS(漂洗缓冲液)漂洗。将人血清样品在20mM Tris-HCl,1M NaCl,10mM CaCl2,0.05% TritonX-100,0.1% HSA,pH 7.4中稀释,防止了内源C4的活化并解离了C1复合物(由C1q、C1r和C1s组成)。将MASP-2抑制剂包括抗MASP-2 MoAb和抑制肽以变化的浓度加入到血清样品中。将稀释的样品加入到板子中,4℃温育过夜。24小时后,用漂洗缓冲液彻底漂洗板子,然后将于100μl的4mM巴比妥,145mM NaCl,2mMCaCl2,1mM MgCl2,pH 7.4中的0.1μg的纯化人C4(按照Dodds,A.W.,Methods Enzymol.223:46,1993中描述的获得)加入到每个孔中。37℃1.5小时后,再次漂洗板子,使用缀合了碱性磷酸酶的鸡抗人C4c(获自Immunsystem,Uppsala,Sweden)来检测C4b沉积,使用比色底物磷酸对-硝基苯进行测定。
甘露聚糖上的C4分析:上述分析法适合于经MBL测定凝集素途径活化,其通过在加入混合了各种MASP-2抑制剂的血清之前,用LSP和甘露聚糖包被板子。
H-ficolin(Hakata Ag)上的C4分析:上述分析法适合于经H-ficolin测定凝集素途径活化,其通过在加入混合了各种MASP-2抑制剂的血清之前,用LSP和H-ficolin包被板子。
实施例12
下面的分析证明了野生型和MASP-2-/-小鼠中经典途径活化的存在。
方法:免疫复合物通过这样在原位产生,用在10mM Tris,140mMNaCl,pH 7.4中的0.1%人血清白蛋白室温包被微量滴定板(Maxisorb,Nunc,cat.No.442404,Fisher Scientific)1小时,然后用在TBS/tween/Ca2+中1:1000稀释的绵羊抗全血清的抗血清(ScottishAntibody Production Unit,Carluke,Scottland)于4℃温育过夜。从野生型和MASP-2-/-小鼠中获得血清样品,加入到包被的板子中。制备对照样品,其中从野生型和MASP-2-/-血清样品中去除了C1q。根据厂商的使用说明书,使用包被了兔抗人C1q IgG(Dako,Glostrup,Denmark)的偶联了蛋白A的Dynabead(Dynal Biotech,Oslo,Norway)来制备去除C1q的小鼠血清。将板子在37℃温育90分钟。用在TBS/tw/Ca++中1:1000稀释的多克隆抗人C3c抗体(DakoA 062)来检测结合的C3b。第二抗体是山羊抗兔IgG。
结果:图9显示了用野生型血清、MASP-2-/-血清、C1q去除的野生型以及C1q去除的MASP-2-/-血清包被的板子上C3b的相对沉积水平。这些结果证明,经典途径在MASP-2-/-小鼠品系中是完整的。
实施例13
下面的分析用来测试MASP-2抑制剂是否阻断了经典途径,其通过在经典途径被免疫复合物起始的情况下分析MASP-2抑制剂的效果。
方法:为测试MASP-2抑制剂在经典途径被免疫复合物起始时对补体活化情况的影响,将含有90%NHS的三份50μl样品在10μg/ml免疫复合物(IC)或PBS存在下于37℃温育,也包括37℃温育期间的含有200nM抗备解素单克隆抗体的三份平行样品(+/-IC)。37℃温育两小时后,将13mM EDTA加入到所有样品中以终止进一步的补体活化,立即将样品冷却到5℃。然后将样品存储于-70℃,随后使用ELISA试剂盒(Quidel,Catalog Nos.A015and A009)根据厂商的使用说明书来分析补体活化产物(C3a和sC5b-9)。
实施例14
这个实施例证明,凝集素依赖的MASP-2补体活化系统是在腹主动脉瘤修复之后的缺血/再灌注阶段中被活化的。
实验基本原理和设计:进行腹主动脉瘤(AAA)修复的患者遭受了缺血-再灌注损伤,这主要是由补体活化介导的。我们研究了MASP-2依赖的补体活化凝集素途径在进行AAA修复的患者的缺血-再灌注损伤中的作用。使用血清中甘露聚糖-结合的凝集素(MBL)的消耗来测定再灌注期间发生的MASP-2依赖的凝集素途径活化的量。
患者血清样品分离:在本研究中包括总共23个进行选择性肾下AAA修复的患者以及8个进行腹部大外科手术的对照患者。
对于正进行AAA修复的患者来说,在手术期间的四个确定的时间点从每个患者的桡动脉(经动脉管线)取全身血样:时间点1:麻醉诱导;时间点2:刚好在主动脉夹紧之前;时间点3:刚好在主动脉夹具去除之前;时间点4:再灌注期间。
对于进行腹部大外科手术的对照患者来说,在麻醉诱导时以及手术开始之后两小时取全血样。
MBL水平分析:使用ELISA技术来分析每个患者血浆样品的甘露聚糖结合的凝集素(MBL)的水平。
结果:该研究的结果显示于图10中,它提供的图表显示了MBL水平(y轴)在每个不同时间点(x轴)的平均百分比变化。MBL的起始值是100%,此后显示了相对降低。如图10所示,AAA患者(n=23)显示了血浆MBL水平的显著降低,在AAA之后的缺血/再灌注时平均降低了大约41%。相反,在进行腹部大外科手术的对照患者(n=8)中只观察到了血浆样品中MBL的较少消耗。
给出的数据提供了强烈的暗示,表明MASP-2依赖的补体系统凝集素途径是在AAA修复之后的缺血/再灌注阶段中被活化的。MBL水平的降低似乎与缺血-再灌注损伤相关联,因为在手术结束之后对被夹紧的大血管进行再灌注时,MBL水平显著而迅速地降低了。相反,进行腹部大外科手术而没有重大缺血-再灌注损伤的患者的对照血清只显示了MBL血浆水平的轻微降低。考虑到补体活化在再灌注损伤中的公知作用,我们推断,缺血内皮细胞上的MASP-2依赖的凝集素途径的活化是缺血/再灌注损伤病理学的主要因素。因此,MASP-2依赖的补体活化凝集素途径的特异性暂时阻断或减少将预期具有显著有益的治疗影响来改善临床手术和疾病的结果,所述临床手术和疾病涉及暂时的缺血损伤,例如心肌梗死、肠梗死、烧伤、移植和中风。
实施例15
这个实施例描述了MASP-2-/-品系用作动物模型,测试对治疗类风湿性关节炎有用的MASP-2抑制剂。
背景和基本原理:鼠关节炎模型:K/BxN T细胞受体(TCR)转基因(tg)小鼠是最近发展的炎性关节炎模型(Kouskoff,V.,et al.,Cell87:811-822,1996;Korganow,A.S.,et al.,Immunity 10:451-461,1999;Matsumoto,I.,et al.,Science 286:1732-1735,1999;MaccioniM.et al.,J.Exp.Med.195(8):1071-1077,2002)。K/BxN小鼠自发产生了自身免疫疾病,有着人RA的大多数临床的、组织学以及免疫学特征(Ji,H.,et al.,Immunity 16:157-168,2002)。鼠失调是关节特异性的,但是被T细胞然后被B细胞对泛表达抗原葡糖-6-磷酸异构酶("GPI")的自反应性所起始然后保持。进一步地,将关节炎K/BxN小鼠的血清(或者纯化的抗GPI Ig)转移到健康动物中,在几天之内就引起了关节炎。也已经显示,当多克隆抗GPI抗体或者IgG1同种型的抗GPI单克隆抗体的混合物被注射到健康受体中时诱导了关节炎(Maccioni et al.,2002)。该鼠模型与人RA有关,因为也已经发现RA患者的血清含有抗GPI抗体,在正常个体中未发现。在这个系统中测试了C5-缺陷的小鼠,发现它阻断了关节炎的产生(Ji,H.,et al.,2002,同上)。在没有C3的小鼠中也存在对关节炎的强烈抑制,暗示了替代途径,然而没有MBP-A的小鼠则产生了关节炎。然而在小鼠中,MBP-C的存在可能弥补了MBP-A的损失。
根据这里描述的观察结果,MASP-2在凝集素途径和替代途径两者的起始中起着基本作用,K/BxN关节炎模型对于筛选MASP-2抑制剂是有用的,这些抑制剂用作治疗RA的治疗剂是有效的。
方法:在60天大小时获得关节炎K/BxN小鼠的血清,混合,注射(150-200μl i.p.)到MASP-2-/-小鼠(按照实施例1描述的获得)中;用或不用MASP-2抑制剂(本文描述的MoAb、抑制肽等)在第0和2天进行同窝对照。一组正常小鼠在接受血清注射之前也用MASP-2抑制剂预处理两天。又一组小鼠在第0天接受血清注射,接着在第6天接受MASP-2抑制剂注射。随时间评估临床指标,对每只染病的爪评分为一点,对只有轻微肿胀的爪平分为1/2点。也通过卡尺测定踝关节厚度(厚度定义为与第0天测定值的差)。
实施例16
这个实施例描述了对用人血浆灌注的兔心体外模型中补体介导的组织损伤抑制进行的分析。
背景和基本原理:补体系统的活化是异种移植的超急性排斥的原因。以前的研究已经显示超急性排斥的发生可能是通过替代途径的活化而缺少了抗供体抗体(Johnston,P.S.,et al.,Transplant Proc.23:877-879,1991)。
方法:为确定按照实施例7所述而获得的分离的抗MASP-2抑制剂诸如抗MASP-2抗体是否能够抑制组织损伤中的补体途径,可以使用体外模型来测试抗MASP-2 MoAb和抗体片段,该模型中用稀释的人血浆来灌注分离的兔心。以前这个模型显示出由于替代补体途径的活化而引起的对兔心肌的损伤(Gralinski,M.R.,et al.,Immunopharmacology 34:79-88,1996)。
实施例17
这个实施例描述了测定嗜中性粒细胞活化的分析法,它作为测定MASP-2抑制剂有效剂量来说是有用的,该抑制剂用于与根据本发明的方法的凝集素依赖的途径相关联的疾病的治疗。
方法:用于测定嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的方法已经描述于Gupta-Bansal,R.,et al.,Molecular Immunol.37:191-201,2000中。简要地说,用双位夹心分析法测定弹性蛋白酶和血清α1-抗胰蛋白酶的复合物,其利用抗弹性蛋白酶和α1-抗胰蛋白酶的抗体。用PBS中的抗人弹性蛋白酶抗体(The Binding Site,Birmingham,UK)的1:500稀释物包被聚苯乙烯微量滴定板,4℃过夜。在吸入抗体溶液后,用含有0.4% HAS的PBS室温封闭孔2小时。将用或不用MASP-2抑制剂处理的血浆样品试样(100μl)加入到孔中。室温温育2小时之后,用PBS大量冲洗孔。通过加入封闭溶液中的缀合了过氧化物酶的α1-抗胰蛋白酶抗体的1:500稀释物,让其在室温温育1小时,来检测结合的弹性蛋白酶-α1抗胰蛋白酶复合物。用PBS漂洗板子后,加入100μl的TMB底物试样。通过加入100μl磷酸来淬灭TMB反应,将板子在微量板读数器中读取450nm值。
实施例18
这个实施例描述了用于测试对治疗心肌缺血/再灌注有用的MASP-2抑制剂的动物模型。
方法:已经由Vakeva et al.,Circulation 97:2259-2267,1998和Jordan et al.,Circulation 104(12):1413-1418,2001描述了心肌缺血-再灌注模型。所述模型可被修改用于如下的MASP-2-/-和MASP-2+/+小鼠中。简要地说,将成年雄性小鼠麻醉。在颈静脉和气管中安装插管,用100%氧气保持供氧,调节啮齿动物通气机来保持呼出的CO2在3.5%和5%之间。进行左胸廓切开,在左冠状动脉起点的3到4mm处进行缝合。缺血前五分钟,给予动物MASP-2抑制剂,诸如抗MASP-2抗体(例如以.01到10mg/kg的剂量范围)。然后通过拉紧冠状动脉附近的缝合线开始缺血,保持30分钟,接着进行四小时再灌注。同样制备假手术动物,但不拉紧缝合线。
补体C3沉积的分析:再灌注之后,从左心室获取免疫组织化学样品,固定并在-80℃冷冻待处理。用缀合了HRP的山羊抗大鼠C3抗体温育组织切片。对组织切片在抗MASP-2抑制剂存在下进行C3染色存在的分析,并与假手术的对照动物以及MASP-2-/-动物相比较,以鉴别减少了体内C3沉积的MASP-2抑制剂。
实施例19
这个实施例描述了MASP-2-/-品系作为动物模型的用途,用于测试MASP-2抑制剂保护移植组织不受缺血/再灌注损伤的能力。
背景/基本原理:已知缺血/再灌注损伤发生在移植期间的供体器官中。组织损伤的程度与缺血时间长短有关,是由补体介导的,如在各种缺血模型中以及通过使用补体抑制剂诸如可溶性受体1型(CR1)所证明的(Weisman et al.,Science 249:146-151,1990;Mulligan et al.,J.Immunol.148:1479-1486,1992;Pratt et al.,Am.J.Path.163(4):1457-1465,2003)。已经由Pratt et al.,Am.J.Path.163(4):1457-1465描述了用于移植的动物模型,可将其修改用于MASP-2-/-小鼠模型和/或用作MASP-2+/+模型系统,在其中对MASP-2抑制剂保护移植组织不受缺血/再灌注损伤的能力进行筛选。在移植之前用灌注液冲洗供体肾脏,这提供了机会将抗MASP-2抑制剂引入到供体肾脏中。
方法:将MASP-2-/-和/或MASP-2+/+小鼠麻醉。剖开供体左肾,将主动脉连接到肾动脉的头尾部。将portex管状导管(PortexLtd,Hythe,UK)插入结扎线之间,用含有MASP-2抑制剂诸如抗MASP-2单克隆抗体(以.01到10mg/kg的剂量范围)的5ml Soltran肾灌注溶液(Baxter Health Care,UK)灌注肾脏至少5分钟的时间段。然后进行肾移植,随时间监测小鼠。
移植受体分析:在不同时间间隔收获肾脏移植体,使用抗C3来分析组织切片以确定C3沉积的程度。
实施例20
这个实施例描述了胶原诱导的关节炎(CIA)动物模型的用途,用于测试对治疗类风湿性关节炎(RA)有用的MASP-2抑制剂。
背景和基本原理:胶原诱导的关节炎代表用天然II型胶原免疫之后,在啮齿动物和灵长动物感性品系中可诱导的自身免疫多关节炎,它被认为是人类风湿性关节炎(RA)的相关模型(参见Courtney etal.,Nature 283:666(1980);Trenthan et al.,J.Exp.Med.146:857(1977))。RA和CIA都是以关节发炎、血管翳形成以及软骨和骨糜烂为特征的。CIA易感的鼠品系DBA/1LacJ是CIA的已开发模型,其中的小鼠在用牛II型胶原免疫之后就产生了临床上的严重关节炎(Wang et al.,J.Immunol.164:4340-4347(2000)。将C5缺陷小鼠品系与DBA/1LacJ杂交,发现所得到的品系对CIA关节炎的发生是有抗性的(Wang et al.,2000,同上)。
根据这里描述的观察结果,MASP-2在凝集素途径和替代途径的起始中都起着基本作用,CIA关节炎模型对于筛选有效用作治疗RA的治疗剂的MASP-2抑制剂来说是有用的。
方法:按照实施例1的描述产生MASP-2-/-小鼠。然后将MASP-2-/-小鼠与源自DBA/1LacJ品系(The Jackson Laboratory)的小鼠杂交。将F1和后来的后代互交以产生DBA/lLacJ系中的纯合MASP-2-/-。
按照同上的Wang et al.,2000中的描述进行胶原免疫。简要地说,用牛II型胶原(BCII)或小鼠II型胶原(MCII)(获自Elastin Products,Owensville,MO)免疫野生型DBA/1LacJ和MASP-2-/-DBA/1LacJ小鼠,以4mg/ml溶于0.01M乙酸。用200ug CII和100ug分枝杆菌在尾基处经皮内注射每只小鼠。在21天后再次免疫小鼠,每天检查关节炎的外观。随时间评估每只染病爪的关节炎严重性有关的关节炎指数。
通过在胶原免疫时全身性注射或者在一个或多个关节处局部注射MASP-2抑制剂诸如抗MASP-2单克隆抗体(以.01mg/kg到10mg/kg的剂量范围)而在野生型DBA/1LacJ CIA小鼠中筛选MASP-2抑制剂,如上所述随时间评估关节炎指数。可在MASP-2-/-、hMASP-+/+敲入DBA/1LacJ CIA小鼠模型中容易地评估作为治疗剂的抗MASP-2单克隆抗体。
实施例21
这个实施例描述了(NZB/W)F1动物模型的用途,用于测试对于治疗免疫复合物介导的肾小球肾炎有用的MASP-2抑制剂。
背景和基本原理:新西兰黑×新西兰白(NZB/W)的F1小鼠自发产生了自身免疫综合征,与人免疫复合物介导的肾小球肾炎有着显著相似性。NZB/W F1小鼠总是在不迟于12个月大小时死于肾小球肾炎。如上面的讨论,已经证明补体活化在免疫复合物介导的肾小球肾炎的发病机理中起着重要作用。已经进一步显示的是,在NZB/W F1小鼠模型中给予抗C5 MoAb引起了肾小球肾炎过程的显著改善(Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.93:8563-8568(1996))。根据这里描述的观察结果,MASP-2在凝集素途径和替代途径的起始中都起着基本作用,NZB/W F1动物模型对于筛选有效用作治疗肾小球肾炎的治疗剂的MASP-2抑制剂来说是有用的。
方法:按照实施例1的描述产生MASP-2-/-小鼠。然后将MASP-2-/-小鼠分别与源自NZB和NZW品系(The JacksonLaboratory)的小鼠杂交。将F1和后来的后代互交以在NZB和NZW遗传背景中产生纯合的MASP-2-/-。为确定MASP-2在这个模型中的肾小球肾炎发病机理中的作用,比较了野生型NZB×NZW小鼠或MASP-2-/-NZB×MASP-2-/-NZW小鼠的杂交所产生的F1个体中这种疾病的产生。每隔一周将从MASP-2+/+和MASP-2-/-F1小鼠中收集尿样,监测尿蛋白水平来确定抗DNA抗体的存在(按照同上的Wang et al.,1996中所描述的)。也进行肾脏的组织病理学分析来监测肾小球膜基质沉积的量以及肾小球肾炎的产生。
NZB/W F1动物模型对于筛选有效用作治疗肾小球肾炎的治疗剂的MASP-2抑制剂来说是有用的。在18周龄时,用抗MASP-2抑制剂诸如抗MASP-2单克隆抗体(以.01mg/kg到10mg/kg的剂量范围)以每周一次或两周一次的频率经腹膜内注射野生型NZB/WF1。使用上述肾小球肾炎的组织病理学和生物化学标志来评估小鼠中的疾病产生并鉴别对这种疾病的治疗有用的MASP-2抑制剂。
实施例22
这个实施例描述了管状循环作为测试MASP-2抑制剂模型的用途,所述抑制剂对于预防体外循环(ECC)诸如心肺转流术(CPB)循环所产生的组织损伤是有用的。
背景和基本原理:如上面所讨论的,在CPB期间经历ECC的患者遭受了全身性炎性反应,它部分地是由血液暴露给体外循环的人工表面所引起的,但是也由不依赖于表面的因素所引起,象外伤和缺血-再灌注损伤(Butler,J.,et al.,Ann.Thorac.Surg.55:552-9,1993;Edmunds,L.H.,Ann.Thorac.Surg.66(Suppl):S12-6,1998;Asimakopoulos,G.,Perfusion 14:269-77,1999)。已经进一步显示的是,替代补体途径在CPB循环的补体活化中起着主要作用,是由血液与CPB循环的人工表面的相互作用所引起的(参见同上的Kirklinet al.,1983,1986所讨论的)。因此,根据这里描述的观察结果,MASP-2在凝集素和替代途径的起始中都起着基本作用,管状循环模型对于筛选有效用作预防或治疗体外暴露所引起的炎性反应的治疗剂的MASP-2抑制剂来说是有用的。
方法:采用以前描述的用于心肺转流术循环的管状循环模型(参见Gong et al.,J.Clinical Immunol.16(4):222-229(1996))的修改,如Gupta-Bansal et al.,Molecular Immunol.37:191-201(2000)中所描述的。简要地说,从健康受试者新鲜收集血液到7ml真空管(每ml全血含有7单位肝素)中。在类似于CPB手术期间所使用的(例如I.D.2.92mm;O.D.3.73mm,长度:45cm)相类似的聚乙烯管中充满了1ml血液,用短的硅胶管片封闭成环。在研究中包括含有带10mM EDTA的肝素化血液的对照管作为背景对照。将样品和对照管在水浴中于37℃垂直旋转1小时。温育之后,将血液样品转移到含有EDTA的1.7ml微型离心管中,产生20mM EDTA的终浓度。将样品离心,收集血浆。将MASP-2抑制剂诸如抗MASP-2抗体在旋转前立即加入到肝素化血液中。然后对血浆样品进行分析以测定C3a和可溶性C5b-9的浓度,按照同上的Gupta-Bansal et al.,2000的描述。
实施例23
这个实施例描述了啮齿动物盲肠结扎和穿刺(CLP)模型系统的用途,用于测试对治疗脓毒症或者脓毒症引起的疾病有用的MASP-2抑制剂,所述疾病包括严重脓毒症、脓毒症性休克、脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征以及全身性炎性应答综合征。
背景和基本原理:如上所述,已经在许多研究中显示补体活化在脓毒症发病机理中有着主要作用(参见Bone,R.C.,Annals.Internal.Med.115:457-469,1991)。CLP啮齿动物模型是模拟人体中脓毒症的临床病程的公认模型,被认为是用于人体中脓毒症的合理替代模型(参见Ward,P.,Nature Review Immunology Vol 4:133-142(2004))。最近的研究已经显示用抗C5a抗体治疗CLP动物导致了减少的菌血症,极大改善了存活率(Huber-Lang et al.,J.ofImmunol.169:3223-3231(2002))。因此,根据这里描述的观察结果,MASP-2在凝集素和替代途径的起始中都起着基本作用,CLP啮齿动物模型对于筛选有效用作预防或治疗脓毒症或脓毒症引起的疾病的治疗剂的MASP-2抑制剂来说是有用的。
方法:CLP模型是由同上的Huber-Lang et al.,2004中描述的模型如下修改的。将MASP-2-/-和MASP-2+/+动物麻醉。造成2cm的中线腹腔切开,将盲肠紧紧连接到回盲瓣下面,避免肠梗阻。然后将盲肠用21规格针反复穿刺。然后用丝线和皮肤夹将腹腔切口封闭成层状(Ethicon,Summerville,NJ)。在CLP之后,动物立即接受MASP-2抑制剂诸如抗MASP-2单克隆抗体(以.01mg/kg到10mg/kg剂量范围)的注射。作为治疗剂的抗hMASP-2单克隆抗体可容易地在MASP-2-/-、hMASP-+/+敲入小鼠模型中进行评估。然后使用同上的Huber-Lang et al.,2004中描述的分析法来分析小鼠血浆中源自补体的过敏毒素和呼吸爆发的水平。
尽管已经例证性说明和描述了本发明的优选实施方案,将可以理解的是,可以在其中进行各种不背离本发明的精神和范围的改变。
Claims (35)
1. 包括MASP-2抑制剂的组合物在制造用于抑制MASP-2依赖的补体活化的药物中的用途。
2. 权利要求1的用途,其中组合物包括有效地选择性抑制MASP-2依赖的补体活化而基本上不抑制C1q依赖的补体活化的量的MASP-2抑制剂。
3. 任何前述权利要求的用途,其中MASP-2抑制剂特异性结合到包括SEQ ID NO:6的多肽上。
4. 任何前述权利要求的用途,其中MASP-2抑制剂特异性结合到包括SEQ ID NO:6的多肽上,该结合的亲和力比MASP-2抑制剂结合到补体系统另外的抗原上的亲和力至少高10倍。
5. 任何前述权利要求的用途,其中MASP-2抑制剂结合到多肽上位于SEQ ID NO:6的氨基酸残基1-176之间的位置上。
6. 任何前述权利要求的用途,其中MASP-2抑制剂是特异性结合到SEQ ID NO:6的一部分上的抗MASP-2抗体或其片段。
7. 权利要求6的用途,其中抗MASP-2抗体或其片段是单克隆的。
8. 权利要求6的用途,其中抗MASP-2抗体或其片段是多克隆的。
9. 权利要求6的用途,其中抗MASP-2抗体或其片段是重组抗体。
10. 权利要求6的用途,其中抗MASP-2抗体具有降低的效应物功能。
11. 权利要求6的用途,其中抗MASP-2抗体是嵌合的、人源化的或者人抗体。
12. 权利要求6的用途,其中抗MASP-2抗体是在缺乏MASP-2的转基因动物中生产的。
13. 权利要求1-5任一项的用途,其中MASP-2抑制剂是源自选自如下组的多肽的肽:人MASP-2、抑制MASP-2的人MBL、抑制MASP-2的人H-ficolin、抑制MASP-2的人L-ficolin、抑制MASP-2的人M-ficolin以及抑制MASP-2的人C4。
14. 权利要求1-5任一项的用途,其中MASP-2抑制剂是特异性结合到包括SEQ ID NO:6的多肽上的非肽试剂。
15. 权利要求14的用途,其中MASP-2抑制剂结合到多肽上位于SEQ ID NO:6的氨基酸残基1-176之间的位置上。
16. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的血管病的受试者,优选地,血管病选自心血管病、脑血管病、外周(例如肌骨骼)血管病、肾血管病、肠系膜/肠血管病、移植物和/或再植物的血管重建、血管炎、过敏性紫癜肾炎、系统性红斑狼疮相关的血管炎、类风湿性关节炎相关的血管炎、免疫复合物血管炎、无脉症、扩张型心肌病、糖尿病性血管病、川崎病(动脉炎)、静脉气栓(VGE)、以及支架安置之后的再狭窄、动脉粥样斑块旋切术和经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)。
17. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的与缺血-再灌注损伤相关的疾病的受试者,所述疾病优选是与主动脉瘤修复相关的缺血-再灌注损伤、心肺转流术、与器官移植和/或四肢/指趾再植相关的血管再吻合、中风、心肌梗死、以及休克和/或外科手术之后的血液动力学复苏。
18. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗和/或预防有需要的受试者中的动脉粥样硬化。
19. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的与炎性肠胃失调相关的疾病的受试者,优选地,炎性肠胃失调选自胰腺炎、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征以及憩室炎。
20. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的肺疾病的受试者,优选地肺疾病选自急性呼吸窘迫综合征、输液相关的急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基底膜病(古德帕斯彻病)、胎粪吸入综合征、闭塞性细支气管炎综合征、特发性肺纤维化、烧伤继发的急性肺损伤、非心原性肺水肿、输液相关的呼吸抑制以及肺气肿。
21. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于抑制曾经进行、正在进行或者将要进行体外再灌注程序的受试者中的MASP-2依赖的补体活化,优选地,体外再灌注程序选自血液透析、血浆置换、白细胞置换、体外循环膜加氧器(ECMO)、肝素诱导的体外膜式氧合LDL沉淀(HELP)以及心肺转流术(CPB)。
22. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的肌肉骨骼病的受试者,优选地,肌肉骨骼病选自骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风、神经病性关节病、银屑病关节炎、脊柱关节病、结晶体关节病以及系统性红斑狼疮(SLE)。
23. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的肾病的受试者,优选地,肾病选自肾小球膜增生性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎(肾小球膜毛细管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎、狼疮肾炎、过敏性紫癜肾炎以及IgA肾病。
24. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的皮肤病的受试者,优选地,皮肤病选自银屑病、自身免疫性大疱性皮肤病、嗜酸性海绵样水肿、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、妊娠疱疹、热烧伤以及化学烧伤。
25. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于抑制曾经进行、正在进行或者将要进行器官或组织移植手术的受试者中的MASP-2依赖的补体活化,优选地,移植手术选自器官同种异体移植、器官异种移植以及组织移植。
26. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的与神经系统紊乱或损伤相关的疾病的受试者,优选地,神经系统紊乱或损伤选自多发性硬化、重症肌无力、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、格-巴综合征、中风之后的再灌注、退行性椎间盘、脑外伤、帕金森病、阿尔茨海默病、Miller-Fisher综合征、脑外伤和/或出血、脱髓鞘以及脑膜炎。
27. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的与血液病相关的疾病的受试者的,优选地,血液病选自脓毒症、严重脓毒症、脓毒症性休克、脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征、全身性炎性应答综合征、失血性休克、溶血性贫血、自身免疫性血栓形成性血小板减少性紫癜以及溶血性尿毒症综合征。
28. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的与泌尿生殖疾病相关的疾病的受试者,优选地,泌尿生殖疾病选自疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎、间质性膀胱炎、不育、胎盘功能障碍以及流产和先兆子痫。
29. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有MASP-2依赖的补体介导的与非肥胖性糖尿病(1型糖尿病或胰岛素依赖的糖尿病)相关的疾病和/或者与1型或2型(成人起病)糖尿病相关的并发症的受试者,优选地,与1型或2型糖尿病相关的并发症选自血管病、神经病以及视网膜病变。
30. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于抑制曾经进行、正在进行或者将要进行化疗治疗和/或放射治疗的受试者中的MASP-2依赖的补体活化。
31. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有恶性肿瘤的受试者。
32. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有内分泌失调的受试者,优选地,内分泌失调选自桥本甲状腺炎、应激、焦虑以及涉及来自垂体的促乳素、生长素或其它胰岛素样生长因子和促肾上腺皮质激素受调节释放的激素失调。
33. 权利要求1-15任一项的用途,其中组合物用于制造药物,该药物用于治疗患有补体介导的眼病的受试者,眼病优选是衰老相关的黄斑变性。
34. 用于抑制MASP-2依赖的补体活化的组合物,包括治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学可接受的载体。
35. 包括MASP-2抑制剂的组合物作为治疗剂的用途。
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