CN104971343B

CN104971343B - 防御素在制备治疗代谢综合征药物方面的应用

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Publication number: CN104971343B
Application number: CN201510409050.XA
Authority: CN
Inventors: 韩源平; 宿丹梅
Original assignee: Individual
Current assignee: Chengdu Shiguihang Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2035-07-13
Also published as: CN104971343A

Abstract

本发明主要涉及防御素在制备治疗代谢综合征药物方面的应用。发明的新颖性以及可实施性体现在应用口服补充人源alpha防御素5、6以平衡肠道菌群生态，从而降低系统炎症，缓减胰岛素抵抗，消融脂肪肝、降低血脂、降低血糖。本发明也提供了制备alpha防御素5、6的方法以及在相关疾病的药物中的应用。

Description

防御素在制备治疗代谢综合征药物方面的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种防御素在制备治疗代谢综合征药物方面的应用。

背景技术

1.代谢综合征的发病率和发病的机理

代谢综合症(metabolic syndrome,X-syndrome)，表现为高血脂，高胆固醇，高血压，脂肪肝，肥胖及糖尿病，已经在全世界广泛流行。随着社会经济的发展，饮食结构及生活方式的改变，代谢综合症在中国急剧增加。在美国，三分之一的成年人口肥胖或者超重，呈现为前糖尿病状态，在世界范围内也有这个趋势[1]。2004年，大概有一亿七千八百万人患有糖尿病，预计在2030年达三亿六千六百万人。据报道，我国成人群中代谢综合症的患病率大约为14-18％[5]。因肥胖，2型糖尿病降低生产力，对社会发展构成巨大的威胁。虽然代谢综合症本身不会致命，但它可以诱发心血管疾病，脑中风，2型糖尿病，减短寿命。代谢综合征主要是由于摄入热量过多，而运动过少造成的[2]。它包括一系列亚健康及病理状，例如肥胖，低度持续炎症，高血压，血脂异常，脂肪肝。代谢综合征还包括血糖调节异常，比如葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗[3][4]。代谢综合征被认为是心血管疾病以及动脉粥样硬化的主要诱发因素，与此同时，也增加了癌症，关节炎，糖尿病发生的风险。

除少数由于遗传的原因，大多数的患者是由于不平衡的饮食习惯以及不健康的生活方式所致。虽然高脂肪/高糖饮食是代谢综合症的主要原因，但并非所有高脂/高糖饮食的人都罹患代谢综合症，表明还需要其他额外的致病因素与高脂肪饮食协同作用才能产生代谢综合症。

2.代谢综合征的诊断

代谢综合征的诊断标准尚未在全球完全统一。1999年世界卫生组织(WHO)首次对代谢综合征进行工作定义[9]，美国国家胆固醇教育计划成人治疗指南(NCEP ATP)[9]、欧洲胰岛素抵抗工作组(EGIR)和美国临床内分泌医师学会(AACE)等基于不同的出发点和适用目的，对代谢综合症的定义各有不同。各诊断标准在许多方面是一致的，但组成成分的项目、各成分排列次序及代谢异常成分的切割点并不一致。大多认为，诊断标准为具备以下5项组成成分中的3项或全部者，即定义为代谢综合症：(1)超重和(或)肥胖BMI≥25kG/M2；(2)高空腹血糖FPG≥6.1mmol/L(110mg/dl)和(或)进食后(2h)血糖，2hPG≥7.8mmol/L(140mg/dl)，和(或)已确诊糖尿病并治疗者；(3)高血压，收缩压≥140mmHg和(或)舒张压≥90mmHg，和(或)已确诊高血压并治疗者；(4)空腹血浆甘油三脂，TG≥1.7mmol/L(110mg/dl)：(5)高密度脂蛋白胆固醇降低，HDL-C<0.9mmol/L(35mg/dl)(男)，HDL-C<1.0mmol/L(39mg/dl)(女)。

3.代谢综合征的治疗

由于代谢综合征中的每一种成分都是心血管病的危险因素，它们的联合作用更强。其表现为向心性肥胖、高血糖、高甘油三酯血症和高血压。因此代谢综合征是一组高风险因素，可以导致2型糖尿病及并发症。因此为避免及缓减代谢综合症，要求进行生活方式的干预(如减轻体重、增加体育锻炼和精神协调)，降血糖、调脂和抗高血压治疗。对于生活方式干预效果不佳或有发生心血管疾病的高危人群，必须加用药物治疗进行二级预防。目前对脂肪肝，代谢综合症的治疗大多是治标不治本，对症下药。治疗药物主要包括胰岛素增敏剂(如二甲双胍和格列酮类药物等)、降低脂、降低血糖、降低血压、减肥药物等。目的是纠正各种代谢异常症状(治标)，降低心血管疾病及糖尿病的发病风险。所有的治疗都应围绕降低各种危险因素。包括有效减轻体重，减轻胰岛素抵抗，良好控制血糖，改善脂代谢紊乱，控制血压等。

4.脂肪肝在代谢综合症生物发生中的关键作用

肝脏作为机体主要的代谢器官，在代谢综合症的生物发生中起关键作用。代谢综合症中的主要指标，高血糖(hyperglycemia)，高血脂(hyperlipidemia)，高血压(hypertension)，都与肝脏损伤及肝功能的失调有关。而高血糖产生的主要原因是胰岛素抵抗(insulin resistance)。大量的研究表明，胰岛素抵抗在很大程度上是由于系统炎症(systemic inflammation)所致[6]。在正常生理状态，进食后上升的血糖，促进胰岛素分泌，而后者再通过一系列的生物化学通路使血糖快速进入胰岛素的靶器官。例如，胰岛素促进血糖进入肌肉及肝脏，合成糖原，进入皮下脂肪组织以合成甘油三酯。肝脏在保持空腹血糖的稳定性方面发挥重要作用。例如，胰岛素可以抑制糖异生(gluconeogenesis),以降低血糖。与之相反，当血糖低下时，胰腺的alpha细胞分泌胰高血糖素(glucagon)，后者促进肝糖原的分解，促进肝脏的糖异生，以升高血糖。肝脏也是各种脂肪合成及分解，以及溶血/凝血因子合成的主要器官。多种原因，例如感染/毒物，可以导致胰岛素的功能失效，即胰岛素抵抗(insulin resistance)。胰岛素抵抗的实质是胰岛素的靶器官(包括肝脏，脂肪组织，及肌肉组织)，对胰岛素的刺激不反应,因而导致血糖升高。这时，肝脏作为解毒代偿(compensation)，将过高的血糖转化为脂肪酸及甘油三酯，加以存储。而大量的甘油三酯在肝脏内的存储将产生脂肪肝(hepatic steatosis)以及脂肪变性(fat degeneration)。同时，更多的甘油三酯以LDL的形式外输至外周脂肪组织，造成内脏脂肪组织的增加。另一方面，在持续高血糖的刺激下胰腺分泌更多的胰岛素，产生高胰岛素血症(hyerinsulinmeia)。而持续的高胰岛素可以促进外周纤维细胞转化为脂肪细胞。在肝脏输出的以及原位脂肪细胞产生的甘油三酯的大量积累会产生中央肥胖(central obese)。而腹内脂肪组织不同于皮下脂肪组织，前者包含有大量巨噬细胞(macrophages)，会产生更多的炎症因子，可进一步扩大胰岛素抵抗及糖不耐受(glucose intolerance)。肝损伤也降低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，升高低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，造成心血管疾病。而肝损伤产生的凝血系统的紊乱将导致血栓及脑溢血(stroke)，直接威胁生命。

“普通脂肪肝”(simple steatosis)在很大程度上是良性的。但在经受“第二次打击”(second hits)后，可能会转化为“非酒精脂肪性肝炎”(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)[7]。其重要的差别在于后者表现为肝脏炎症(inflammation)，而普通脂肪肝没有明显的炎症。在持续炎症的作用下星状细胞(hepatic stellate cells)可能被激活，产生肝脏纤维化。而所谓的“第二次打击”可来自肝脏感染。例如，丙型肝炎病毒感染经常伴随有NASH出现。近来，我们的研究证明“维生素D缺乏”作为一种新型的“第二次打击”能够促进“普通脂肪肝”转化为“非酒精脂肪性肝炎”[8]。如上所述，非酒精脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD)，包括“普通脂肪肝”及“非酒精脂肪性肝炎”，在代谢综合症的生物发生中扮演重要角色。有鉴于此，我们的工作从NASH扩大到代谢综合症发生的系统生物学。

5.维生素D缺乏与代谢综合症的相关性

随着城市化进程及户外活动时间日趋减少,维生素D缺乏(VDD)已经成为各国普遍面临的全球性健康问题。美国营养研究所的调查表明大约30-60％的人口处于维生素D缺乏(血液25OH-VD₃低于25ng/ml)或者维生素D低下(血液25OH-VD₃在25－35ng/ml)，而缺乏的程度随着皮肤颜色的增深而增加[10]。中国在过去几十年间，因空气污染及雾霾的加剧，能见度的下降，大多数中国人处于维生素D缺乏或者不足的状态[11][12]。与传统的维生素不同，维生素D在很大程度上类似于其它甾体激素：

第一，它能够在体内合成，并需要身体的三个器官(皮肤－肝脏－肾脏)联合完成；

第二，它在体内经过血液循环调控生理功能；

第三，它通过细胞核受体(VDR)及靶基因启动子(promoter)中的结合位点(VDRE)来调控很多靶基因的表达，包括肠道的防御素的表达。

除了传统的钙磷调节功能以外，近年来大量的工作发现了维生素D在免疫生理调控中起重要作用。例如，维生素D通过VDR上调FoxP3以维持调节性T细胞(Regulatory Tcells，Tregs)并抑制Th17炎症[13,14]。反之，维生素D缺失(vitamin D deficiency,VDD)与多种慢性疾病的发生及持续有关[15]。

大量的流行病调查(包括National Health and Nutrition ExaminationSurvey)表明维生素D缺失与代谢综合症有密切关系[16-19]。有研究表明病人血液中维生素D含量高低程度与代谢综合症的指标有半定量的相关性[20]。但是，能否应用补充维生素D₃来治疗代谢综合症还不清楚。

6.肠道微生物菌群与代谢综合症的关系

人体共生微生物的数量是我们人体细胞数目的10倍(100trillion)，大多为厌氧菌，不能在体外培养[21]。近年来通过细菌16SrRNA测序以及宏基因组(metagenomics)分析方法，能够对肠道微生物的生态进行定量测定及描述。肠道微生物对我们的健康极为重要，表现为以下：

第一，肠道菌群，如双歧杆菌，乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必须的维生素，如B族维生素、维生素K、烟酸、泛酸等，还能利用蛋白质残渣合成必须氨基酸。

第二，肠道菌群对机体的免疫系统的建立，激活及成熟至为重要。而肠道是重要的免疫组织，大约60％的淋巴细胞聚集在小肠，它们直接接触食物抗原(food antigen)，产生免疫耐受(immune tolerance)，免疫记忆及免疫应答。

近年来有关肠道菌群的生态与健康的关系已成为科学研究的热点。有报道表明肠道菌群的生态失调与2型糖尿病和肥胖的关系[22,23]。在肥胖及2型糖尿病患者的肠道菌群表现为厚壁菌门(phylum Firmicutes)增加，而拟杆菌门(phylum Bacteroidetes)降低。通过无菌小鼠(gnotobiotic mice)及其粪便移植(fecal transplant)等方法进一步证明了肠道菌群在代谢综合症生物发生中的关键作用[24][25]。据此暗示，肥胖是可以通过肠道细菌传染的疾病。另一方面，肠道菌群的组成也依赖于宿主基因型，机体免疫系统，营养状态，以及生活方式[26-28]。

肠道菌群结构的失调可以导致宿主循环系统血浆中内毒素(endotoxin)增加，诱发持续低度炎症，阻断胰岛素的细胞内的信号传递系统，导致胰岛素抵抗[21][25]。而胰岛素抵抗是产生脂肪肝，肥胖，代谢综合症的重要原因。此外，肠道共生菌群通过多种机制参与宿主的生长发育，包括在肠道水平对病原体的防御作用、通过分子机制以及代谢产物进行免疫调节，促进肠道微绒毛的生长。肠道微生物，也能够进一步转化膳食纤维，肽类或蛋白质，以及结合胆汁酸的生物转化，草酸盐复合物的降解。因此，肠道菌群参与宿主的能量平衡，能量的采收。研究表明，高脂高糖饮食诱导代谢综合征的产生很可能就是通过改变肠道内的菌群(dysbiosis)，打破其平衡结构来实现的[29]。

通过动物模型，研究表明，高脂饮食可以改变肠道菌群生态结构。瘦型的模型动物比较肥胖模型动物而言，有更高丰度的拟杆菌(Bacteroidetes)含量，而肥胖型小鼠肠道所含的厚壁菌门(Firmicutes)的丰度增加[30]。宏基因组分析发现肥胖小鼠肠道菌中编码分解多糖的基因包括糖原水解酶的基因增加，导致肠道能量吸收的增加。另外，通过将肥胖小鼠与无菌正常小鼠之间，以及瘦老鼠与无菌正常老鼠之间的菌群移植实验(fecaltransplant)表明了肠道菌群可以调节肥胖。同时，大量的临床研究也表明，肥胖病人肠道发生类似的变化，即拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度降低，而厚壁菌门(Firmicutes)的丰度增加[21]。同时肥胖也会引起肠道菌群多样性的降低。

Akkermansia muciniphila属于疣微杆菌门(Verrucomicrobia)，是肠道中的共生菌(synbiotics)，它在肠道菌中的含量十分丰富，在正常小鼠中它占大便总菌的3-4％左右[31]。有报道称Akkermansia muciniphila的含量与小鼠的体重呈负相关关系。而在肥胖小鼠和2型糖尿病小鼠中，Akkermansia muciniphila的含量降低的[32][33]。在高脂诱导的肥胖小鼠中，喂食Akkermansia muciniphila(作为益生菌)可以缓解这些小鼠的病症，降低小鼠体重，减少脂肪重量，降低内毒素入血症，减少中心脂肪炎症反应，减轻胰岛素耐受。

相反，肝脏螺旋杆菌(Helicobacter Hepaticus，H.hepaticus)作为一种已知的肝脏致病菌，位于消化道下段，它在易感动物中可以引起慢性炎症和肿瘤的形成[34]。例如，在小鼠模型中已经发现，H.hepaticus可以引起慢性肝炎，炎症性肠病(inflammatory bowldiseases,IBD)，结肠炎，结直肠癌[35]。H.hepaticus现在也在胆囊疾病的病人胆汁中检测到，而且也与肝癌有一定相关性[36-38]。在一些免疫缺陷的小鼠，如IL-10基因敲除小鼠，重症联合免疫缺陷(Scid)小鼠，Rag基因缺陷小鼠中可以检测到H.hepaticus的大量增生。表明宿主的免疫系统的缺乏对于感染H.hepaticus是一个先决条件[38-41]。虽然H.hepaticus在代谢综合症中的作用还不知道，而同一属中的H.pylori与代谢综合症的关系已有报道[42][43]。

一个未解决的关键问题是：肠道菌群的异常是通过什么机理导致代谢综合症发生的？一般认为肠道菌群的异常将对肠道的免疫系统造成过度的激活，产生持续而低度的炎症，而后者将抑制胰岛素的信号传导，产生胰岛素抵抗，进而产生高血糖。为了降低高血糖，肝脏将血糖转化为甘油三脂，而过度的甘油三脂，及其积累会产生脂变(fatdegeneration),形成脂肪肝，即普通脂肪肝(simple steatosis)。如前所述，在第二次打击(second hit)例如肝脏病毒感染的条件下，普通脂肪肝将有可能进一步转化为非酒精性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)。而后者的特点是持续的肝脏炎症，肝脏实质细胞(hepatocytes)的损伤，气球样脂肪变(ballooning fat degeneration)。肝脏实质细胞的损伤将会产生多重代谢紊乱，例如肝脏分解胆固醇的能力降低，导致LDL-C升高，HDL-C降低，从而造成心血管疾病,动脉粥样硬化(Atherosclerosis),溶血系统的紊乱，如脑血栓，中风。

7.肠道防御素与肠道菌群的平衡。

小肠表皮细胞能够分泌多种抗菌多肽(anti-microbe peptides,AMPs)进入肠道粘液层中，行使宿主的自主免疫功能。在哺乳动物中，抗菌多肽大致可以分为两类防御素，cathelicidins和defensins[44]。而防御素(defensins)又包括α，β和θ三种类型[45]。防御素主要由两类细胞产生，第一类是骨髓细胞来源的吞噬性白细胞和中性粒细胞，第二类是小肠末端的潘氏细胞(Panethes cells)特有的alpha防御素5(alpha-defensin 5,DEFA5)以及alpha防御素6(alpha-defensin 6,DEFA6)。在生理状况下，潘氏细胞在肠道共生菌(symbionts)的作用下能够表达一定量的抗菌肽，并分泌到肠腔黏膜中。肠腔中抗菌肽与肠道菌群的相互制约，决定了肠道菌群的生态(Microbiome)平衡[46]。

小肠潘氏细胞分泌的alpha防御素具有广谱的抗菌活性。alpha防御素占了潘氏细胞分泌的防御素的含量的70％左右。与大多数的分泌蛋白质一样，细胞内新合成的alpha防御素需要经过特异蛋白酶的剪切加工。基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)是加工alpha防御素的关键蛋白酶，也是小肠潘氏细胞的特异标记[47]。因为alpha防御素的双极性及表面活性剂特征，它们行使抗菌作用可能是依靠破坏细菌细胞膜的机制。维持宿主和其肠道菌群之间的平衡是一个极其复杂事情，在这期间，需要肠道表面的免疫系统起作用，其中表皮细胞发挥了巨大了作用，特别是处于肠道表皮中的潘氏细胞，由于可以分泌多种防御素，所以在维持宿主和肠道菌群的平衡方面就起到了重要的作用[48-49]。有研究表明,肥胖病人的肠道潘氏细胞的防御素表达降低，这也我们的发明应用提供了病理基础[50]。

综上所述，作为该方面的理论基础，我们推测高脂肪饮食本身并不能诱导典型的代谢综合症，而维生素D的缺失，作为第二次打击，将与高脂肪饮食一同才能产生形成代谢综合症。据此，通过大量的动物试验，我们发现在高脂肪饮食及维生素D缺乏(high fatfeeding plus vitamin D deficiency,HFD+VDD)长期喂养条件下，小鼠获得了与人类代谢综合症以及非酒精脂肪肝炎(NASH)类似的性状[8]。更进一步，我们近来发现，在代谢综合症动物模型中，肠道菌群的失衡(dysbiosis)，肠道通透性的增加，内毒素入血，系统炎症，胰岛素耐受都与肠道多种外分泌抗菌肽的下调密切相关。于是，我们应用人工合成的人alpha防御素对代谢综合症小鼠进行治疗，取得了以下发现：(1)口服alpha防御素5(alpha-defensin 5，DEFA5)可以有效地再平衡肠道菌群(eubiosis)；(2)口服alpha防御素5可以减缓代谢综合症的多种症状，包括降低空腹血糖，降低系统炎症，降低胰岛素抵抗，消融脂肪肝；(3)口服alpha防御素5可以降低肠道肝脏螺旋杆菌(H.hepaticus),回升肠道共生菌Akkermanicia；(4)体外试验表明alpha防御素5可以直接杀灭肝脏螺旋杆菌。在以上新发现的基础上，我们设计了以下发明，包括制备alpha防御素5，以及以alpha防御素5作为治疗代谢综合症，2型糖尿病及其并发症的应用。因为alpha防御素6与alpha防御素5有着结构与功能的类似性，同时基于我们的试验结果，我们的发明也包括alpha防御素6的制备以及应用。

发明内容

本发明首先涉及alpha防御素5、6及其衍生物的如下方面的应用：

(1)制备治疗代谢综合征药物，所述代谢综合征包括但不限于，向心性肥胖、高血糖、高甘油三酯血症、高血压以及以葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗为症状的血糖调节异常；

(2)制备调节肠道菌群(gut microbiota)或调节肠道菌群平衡的药物，所述的肠道菌群包括，Helicobacter Hepaticus(HH)菌属，和Akkermansia muciniphila(AKK)菌属，

所述的调节具体为：上调AKK类的共生菌丰度、下调HH类的有害菌菌的丰度，或在上调AKK类益生菌的同时下调HH类有害菌；

所述的调节肠道菌群平衡指调节肠道菌群生态，包括增加肠道菌群的多样性以及丰度，以及由此而产生的治疗效果。

(3)制备改善脂肪肝，降低血浆中甘油三醋、降低血液低密度脂蛋白胆固醇的的药物；该药物也可以提升高密度脂蛋白胆固醇含量。

(4)制备治疗高血糖相关疾病的药物，所述的高血糖相关疾病可以是高血糖导致的感染、心血管病变、肾功能衰竭、以及糖尿病的其他并发症包括双目失明、下肢坏植。

本发明还涉及一种治疗代谢综合征的药物，所述的药物包括，治疗有效量的防御素5、6及其衍生物，以及适用于口服给药制剂的常用的辅料：包括稀释剂，粘合剂，稳定剂，抗氧化剂等。

所述的防御素5和防御素6的氨基酸序列结构为：

Alpha防御素5(hDEFA5):ATCYC RHGRC ATRESL SGVCE ISGRL YRLCC R，3位和31位，5位和20位，10位和30位半肮氨酸之间有三个二硫键，

Alpha防御素6(hDEFA6):AFTCH CRRSC YSTEY SYGTC TVMGI NHRFC CL，4位和31位，6位和20位，10位和30位半肮氨酸之间有三个二硫键。

所述的alpha防御素5或alpha防御素6的衍生物为，对防御素5或防御素6的一级结构进行多个(优选为1～3个)氨基酸缺失、增加；或多个(优选为1～3个)结构或性质类似的氨基酸的替换；或alpha防御素5或alpha防御素6的一级结构进行糖基化，乙酰化，磷酸化，羧基化等修饰。其排他性之要点是这些衍生物应该保持或提高以上所讲述的生理以及平衡肠道菌群的功能，并且具有极低毒理及生理副作用。

本发明还涉及维生素D₃的如下方面的应用：

(1)制备用于上调肠道中alpha防御素5、6的表达量的制剂；

(2)制备治疗代谢综合征药物，所述代谢综合征包括但不限于，向心性肥胖、高血糖、高甘油三酯血症、高血压以及以葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗为症状的血糖调节异常；

(3)制备调节肠道菌群平衡的药物，所述的肠道菌群包括，Akkermansiamuciniphila(AKK)菌属和Helicobacter Hepaticus(HH)菌属，所述的调节具体为：上调AKK类的益生菌菌落数量、下调HH类的有害菌菌落数量，或在上调AKK类益生菌菌落数量的同时下调HH类有害菌在肠道中的含量；该药物的制备及应用也包括平衡肠道中的其他变形杆菌(Proteobacteria)，包括多种条件性致病菌。

(4)制备降低血浆中甘油三醋、低密度脂蛋白胆固醇的含量的药物；

(5)制备治疗高血糖相关疾病的药物，所述的高血糖相关疾病可以是高血糖导致的感染、心血管病变、糖尿病的并发症包括肾功能衰竭、双目失明、下肢坏植。

本发明还涉及一种治疗代谢综合征的药物，所述的药物包括，治疗有效量的维生素D₃，以及适用于口服给药制剂的常用的辅料：包括稀释剂，粘合剂，稳定剂，抗氧化剂等。

本发明还涉及alpha防御素5、6的制备方法，所述方法包括如下步骤：

第一阶段，应用固相合成树脂将Fmoc(9-fluorenylmethyloxy-carbonyl)保护的氨基酸通过C末端进行连接；

第二阶段，形成三个特异的二硫键。

所述的第一阶段的具体步骤为：

(1)列依照人源序列设计掺入氨基酸残基的序，

DEFA5的序列为：ATCYCRHGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR；

DEFA6的序列为：AFTCHCRRSCYS TEYSYGTCTV MGINHRFCCL；

(2)侧链残基(side chains)的保护方法：

对于谷氨酸，苏氨酸和酪氨酸，色氨酸，应用o-tbutyl，tBoc(叔丁氧羰基)；

对于精氨酸，应用n-2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulphonyl；

对于N和C端的半胱氨酸，应用三苯甲基；

对于形成二硫键的半胱氨酸的保护方法：

DEFA5,其cys-3,cys-30,以及DEFA6,其cys-4,cys-31的半胱氨酸,应用三苯甲基作为保护基团；

DEFA5,其cys-5，cys-20,以及DEFA6,其cys-6,cys-20的半胱氨酸，应用s-tbutyl作为保护基团；

DEFA5,cys-10和cys-30,以及DEFA6,其cys-10，cys-30的半胱氨酸,应用乙酰氨基(ACM)作为保护基团；

(3)受保护的肽基树脂，经过TFA含有二氯甲烷，硫醚和二硫化物处理；

(4)按照alpha防御素5/6的序列依次连接当氨基酸，并将合成完毕的肽段从树脂上裂解，获得线性肽粗品，经过TFA处理，N-和C-末端的半胱氨酸残基的S-三苯甲基保护组保护在同时被剪除，而肽链从树脂上裂解下来，而ACM和s-tbutyl保护的cys-3、cys-20、cys-10及cys-30的保护不变；

(5)用反相高效液相色谱法，对初线性肽进行分离，用含TFA的乙腈水进行线性梯度洗脱，将高峰汇集，冻干并进行氨基酸序列分析，确定合成完毕的肽序列。

所述的第二阶段的具体步骤为：

(1)Cys3与Cys31半胱氨酸残基之间的二硫键形成：

上述含游离巯基的Cys3和Cys31的线性DEFA5悬浮于在水中；

加入乙酸铵溶液调整pH至6.8，滴加铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])以确保氧化；

将溶液浓缩至小体积，然后用活化的硫醇-琼脂糖4B树脂柱除去含有游离硫醇基的肽段；

用乙酸铵缓冲液(pH6.8)对柱中的肽进行洗脱，将肽水溶液合并，冻干。

将干燥的物质应用通过反相HPLC纯化，将主峰合并，冷冻干燥，进行氨基酸和序列分析，通过测序，质谱分析证实正确的序列。

(2)Cys-3与Cys-20半胱氨酸残基之间的二硫键：

将上述纯化的线性DEFA5溶于三氟乙醇(trifluoroethanol)，通过还原反应，以三丁基膦(tri-butylphosphine)脱去S-叔丁基团上Cys3以及Cys20残基上的保护基团(方案如图6)；

反应混合物浓缩至小体积，通过加入乙醚使产物沉淀；

将分离的固体过滤并用乙醚洗涤，并干燥；

将干燥的制备物悬浮于水中，然后使用铁氰化钾，在pH6.8进行氧化，经过分离，干燥后，对所得的材料以反相HPLC进行分离；

对主要峰的级分合并，分析氨基酸的组成及序列，用质谱分析鉴定。

(3)Cys10与Cys30半胱氨酸残基之间的二硫键：

以上述肽溶于水/甲醇的混合物(5:1)中，然后滴加碘/甲醇中的溶液，进行氧化反应；

用硫代硫酸钠中和，将甲醇通过旋转蒸发除去，然后将获得的材料冻干；

将粗物质溶解在水中，并通过硫醇-琼脂糖柱进行分离：将柱用0.1M乙酸铵缓冲液，pH6.5洗涤，将水溶液冷冻干燥，将干燥的物质用反相HPLC纯化，所有馏分被汇集，并冻干。

通过测定序列，光谱和氨基酸分析。合成肽的质量可以通过比较其HPLC保留时间，CD谱和质谱进行评估。

具体描述：

(1)本发明涉及以alpha服防御素5/6实施对代谢综合征的治疗应用。

该专利设计的“新颖性/非显而易见性”以及其“实用性”是基于在“技术背景”以及下面描述的工作原理，以及我们的动物试验结果和新发现，同时包括合理的推测以及可实施方案的设计。

Alpha防御素5/6(DEFA5/6)是小肠潘氏细胞(Paneth cell)所外分泌的抗菌多肽，通过协调/控制肠道菌群，使人体处于正常的生理状态。近来通过动物实验，我们发现在维生素D缺乏/低下的状态，DEFA5下降，导致肠道菌群的异常(dysbiosis),肠道致病菌增加，内毒素入血增加，产生系统炎症，导致胰岛素抵抗，产生脂肪肝，生理代谢紊乱。作为该发明的基础，我们应用可服低剂量的人源DEFA5，能够有效地再平衡肠道菌群，降低内毒素入血及系统炎症，恢复胰岛素的敏感性，消融脂肪肝，拮抗代谢综合症。因此，我们发明的核心是应用口服人源的DEFA5来治疗代谢综合症。因DEFA6与DEFA5高度同源，并具有类似的生物功效，也在该发明保护范围。并且所述代谢综合征包括但不限于，中心性肥胖、高血糖、高甘油三酯血症、高血压，葡萄糖不耐受，以及胰岛素抵抗为症状的血糖调节异常。同时，治疗的应用也包括2型糖尿病，以及其并发症，包括心血管病变，冠心病，心力衰竭、心律失常、心绞痛、心肌梗塞；眼部病变，如虹膜炎、青光眼、白内障等；糖尿病足，下肢供血不足及细菌感染足部疼痛、溃疡、肢端坏疽等病变。

Alpha防御素5/6具有3个二硫键，使其具有极强的抗酸稳定性。在动物试验中我们发现极低剂量的DEFA5(5-10微克，microgram)可以有效地拮抗高脂肪饮食所引起的代谢综合症。因防御素5/6是健康人肠道分泌的抗菌肽，为生理物质，应该有良好的安全性，以及实用性。作为本发明的具体实施方案以及在病人中的应用，我们提议其剂量可以在一定范围内，例如10毫克(10mg),以及更高的剂量，包括20毫克，40毫克，80毫克，160毫克，200毫克，600毫克，1000毫克。在病人中使用的剂量，用药周期的长短将通过临床试验来确定。使用的疗效可以通过通过常规的临床化验，以及物理测验来评估。其使用的作为其剂型，口服固体制剂常用辅料，稳定剂，抗氧化剂，稀释剂，润湿剂粘合剂，崩解剂，胶囊剂，包薄膜衣，胶囊填充物，等辅助成分将用于药物的制备。

(2)本发明还涉及alpha防御素5/6(DEFA5/6)在调节肠道菌群平衡的药物方面的应用。

该专利设计的“非显而易见性”以及其“商业实用”也基于我们的动物试验结果。我们发现脂肪肝以及代谢综合症的发生与小肠alpha防御素5/6的降低，以及由此而产生的肠道菌群的失衡(dysbiosis)有关。例如，我们发现在回肠区段，益生菌Akkermansiamuciniphila(AKK)菌属明显降低，而致病菌Helicobacter Hepaticus(H.H.)明显上升。同时，变形杆菌门(Proteobacteria)所属的-螺旋杆菌纲(Epsilon-proteobacteria)也在增加。而螺旋杆菌作为Gram-阴性菌(Gram-negative bacteria)所产生的内毒素(endotoxin)可以引发系统炎症，进而导致胰岛素抵抗，脂肪肝，糖尿病。作为该发明的主体，应用口服alpha防御素5/6可以调节肠道菌群。我们可以通过qPCR以及其他方法来测定大便中AKK与H.H.的比值来判定防御素5/6对肠道菌群调控的程度。同样，我们也可以通过qPCR以及其他方法来测定大便中AKK与变形杆菌(PROTEOBACTEIRA)的比值确定药物对肠道菌群平衡的疗效。口服防御素5/6对肠道宏基因组(meta-genomics)的调控效果，可以通过16S RNA基因的高通量测序来确定。作为具体实施方法，作为调节肠道菌群方面的应用，其剂量可以在一定范围内，例如10毫克(10mg),以及更高的剂量，包括20毫克，40毫克，80毫克，160毫克，200毫克，600毫克。在病人中使用的剂量，用药周期的长短将通过临床试验来确定。

肠道菌群的生态异常与多种疾病有关。除了代谢综合症以外，肠道菌群的失常(dysbiosis)与多种肠道疾病，例如炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),包括克隆恩病(Crohn's disease)，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)密切相关[51][52]。因此，通过口服防御素5/6也可以用于拮抗，治疗炎症性肠病,包括克隆恩病(Crohn'sdisease)，以及溃疡性结肠炎。

(3)本发明还涉及应用维生素D来上调肠道特异的防御素(例如DEFA5/6)，后者以拮抗代谢综合征，以及2型糖尿病以及其并发症。

小肠末端含有大量的维生素D受体(VDR)。我们发现在饲料中添加一定剂量的维生素D可以调节肠道多种防御素的表达。已经知道，维生素D缺乏可导致免疫能力的下降。在此，我们发现维生素D缺乏可导致防御素的低表达，从而加重代谢综合症的发生。同样，我们发现通过基因工程剔除VDR的小鼠，其回肠中DEFA5的表达也下降。基于此发现，我们的专利也包括应用维生素D来上调肠道特异的防御素，用以抵抗代谢综合症，治疗代谢综合征及2型糖尿病以及其并发症。其应用方法包括给予维生素D₃(VD₃)，后者在体内经过肝脏以及肾脏的两步羟基化，可以转化为和性成分的骨化三醇(calcitriol,1α,25-二羟基维生素D₃),后者通过小肠细胞中的特异受体(VDR)进而上调多种防御素包括DEFA5/6。经过潘氏细胞的分泌，DEFA/6进入肠腔与肠道微生物发生相互作用，以平衡菌群生态。根据我们的动物试验结果，作为具体实施方法，我们提出对于成人的使用剂量可以在600IU至10,0000IU/天，或者更高剂量。作为非处方药物，口服VD₃的应用剂量，疗程的长短可以通过测定血液中25-(OH)VD₃的含量来确定。根据美国国家医学会(IOM)的推荐，健康人群的血液25-(OH)VD₃含量为20-50ng/ml[53]。该设计的关键之一是通过维生素D，以调节人体肠道分泌的抗菌肽，进而平衡肠道菌群，降低内毒素入血，从而降低系统炎症，降低胰岛素抵抗，拮抗代谢综合症，脂肪肝，2型糖尿病。作为具体实施另一种方案，维生素D的生物活性成分，包括calcitriol(alpha1，25-(OH)₂VD₃),也可以用于治疗。我们可以采用FDA推荐的剂量，即0.25微克/ROCALTROL。该设计的关键之二，是通过测定血液中25(OH)VD₃的水平，使之达到20-50ng/ml，用以评价给药的剂量，给药时间来确定对代谢综合症，脂肪肝，2型糖尿病的治疗效果。

(4)本发明还涉及以维生素D通过调节肠道防御素来平衡肠道菌群生态及与之相关的应用。

如前所述，我们的发现表明维生素D通过肠道(回肠段)的维生素D受体能够上调防御素5(DEFA5)，而后者能够调节肠道菌群，平衡菌群生态(eubiosis)。而肠道菌群的失调与多种疾病有关，包括多种肠炎，肥胖，2型糖尿病，代谢紊乱。因此，我们可以应用维生素D，包括VD₃以及骨化三醇来调节肠道菌群生态，从而缓减，治疗与之相关的疾病。作为具体实施，一定剂量的VD3，例如600IU至10,0000IU/天，或者更高剂量口服，可以调节肠道菌群。作为具体实施，维生素D对肠道菌群的调节可以通过对大便中细菌的测定来评估。例如，应用qPCR方法以及特异的引物，可以测定各种肠道菌的相对比例。比如，通道qPCR或者其他方法来测定HH/AKK的比值，用以判别VD对肠道菌群生态的调控。另外，通过细菌16S RNA基因的测定也可以用来评估维生素D对肠道菌群的调控效果。

(5)本发明还涉及应用维生素D与防御素5/6的联合应用。

该专利设计的“非显而易见性”以及其“商业实用”也表现为将维生素D与防御素的联合应用。联合用药的实用性以及优越性可以体现为药效的协同作用。例如降低单一成分的计量，降低可能的副作用，增强疗效。其应用方法包括给予维生素D₃(VD₃)，其剂量可以在600IU至10,0000IU/天。口服防御素5/6对肠道宏基因组(meta-genomics)的调控效果，可以通过16S RNA基因的高通量测序来确定。在病人中的应用，其剂量可以在一定范围内，例如5毫克(5mg),以及更高的剂量，包括10毫克，20毫克，40毫克，80毫克，100毫克，300毫克。在病人中联合使用的剂量，用药周期的长短将通过实验动物以及临床试验来确定。联合用药的效果可以通过以上描述的方法包括对肠道菌群，H.hepaticus以及Akk的测定。

(6)本发明涉及alpha防御素5/6的化学合方法成及制备。

所述的防御素5和防御素6的氨基酸序列结构为：

Alpha防御素5(hDEFA5):ATCYCRHGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR，其3位和31位，5位和20位，10位和30位半肮氨酸之间有3个二硫键。

Human alpha defensin 5

Alpha防御素6(hDEFA6):AFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL，其4位和31位，6位和20位，10位和30位半肮氨酸之间有3个二硫键。

所述的alpha防御素5或alpha防御素6的衍生物为，对alpha防御素5或alpha防御素6的一级结构进行性质类似的氨基酸的替换；或alpha防御素5或防御素6的一级结构进行糖基化，乙酰化，磷酸化，羧基化等修饰。在此，设计及合成防御素5/6衍生物的原则是其衍生物具有以下特征：(1)alpha防御素5/6衍生物应该具有更强或者更专一的抗菌活性，(2)alpha防御素5/6衍生物应该具有更好的口服效果，在消化道环境中应该具有更好的耐受性，更长的半衰期，(3)alpha防御素5/6衍生物应该有更强的抑制内毒素入血的功能，以及抑制脂肪肝，拮抗代谢综合症的能力。

Alpha防御素5/6可以通过类似的方法合成。其合成分为两个阶段。第一步，通过固相合成形成氨基酸保护的线性肽链。第二步，通过特异的逐步氧化以形成位点特异的3个二硫键。全合成防御素5的关键反应步骤及技术路线总结于如图－6，合成的关键步骤表述在具“体实施部分”。标准的固相合成程序[54]用于该多肽的全合成。本发现也包括防御素的制备，以及适用于口服给药制剂的常用的辅料：包括稀释剂，粘合剂，稳定剂，抗氧化剂等。

附图说明

图1.维生素D₃抑制脂肪肝的发生。

图2.维生素D₃缓减胰岛素抵抗。

图3.维生素D₃可降低血脂。

图4.摄入加维生素D3可以抵御高脂肪饮食导致的肠道菌群的异常。

图5.口服alpha防御素5可以缓解脂肪肝。

图6.口服alpha防御素5可以降低代谢综合症小鼠的血糖，甘油三酯，以及低密度脂蛋白/胆固醇。

图7.口服alpha防御素5可以平衡代谢综合症小鼠的肠道菌群。

图8.Alpha防御素5/6可直接抑制小鼠回肠的肝脏螺旋杆菌的生长。

图9.防御素5/6的合成路线。

具体实施方式

以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。

实施例1。新型代谢综合症模型的建立及维生素D治疗效果评估。

SPF级实验用小鼠，包括Babl/C或者C57/B6以及其他品系，体重20-25g。在室温下，给予实验动物自由进食及饮水。以四种食料喂养18周(每条件，n＝20)。

C:对照，食物中热卡的12％来自于动物脂肪，维生素D3含量1000IU/kg。

VDD:维生素D缺乏的普通食料，12％的热卡来自于动物脂肪，无添加维生素D。

HFD:高脂肪饲料，60％的热卡来源于动物脂肪，含维生素D3含量1000IU/kg。

HFD+VDD:高脂肪饲料缺乏维生素D。

对于维生素D缺乏的两个条件，VDD+HFD以及VDD小鼠，在饲养过程中尽量避免光照(饲养笼可隔绝UV光)。其余小鼠接受自然昼夜更替光照。动物模型诱导4-6个月。在饲养期间，我们测定进食热卡，体重，血糖，以及肠道菌群的跟踪测定。在小鼠处死后，我们对以下指标进行测定，以确定药物的疗效，并探测治疗的原理，可能的药效/药理机理。

(1)脂肪肝是代谢综合症发生的关键器官，防御素的疗效体现在消融脂肪肝的能力。对动物肝脏组织病理切片，H&E染色，油红染色，以测定脂肪肝的程度；结果如图1所示，高脂肪饲养本身并不能有效地诱导大规模的脂肪肝，而“高脂肪+缺乏维生素D”的双重打击，才能出现下的典型的脂肪肝。另外，在Babl/C或者C57/B6两个品系，我们发现摄入一定量的维生素D3(3-4IU/天)，可以有效地抵御高脂肪饮食所致的脂肪肝。

结论：1)摄入VD₃(3-5IU/天)可以抑制高脂饮食所致的脂肪肝；2)在高脂肪饮食+VD缺乏的双重打击下，产生明晰的脂肪肝。

(2)胰岛素抵抗是代谢综合症发生的重要推动力，防御素的疗效体现在恢复肌体的胰岛素敏感性。对动物血糖、胰岛素耐受、血糖不耐受程度进行测定，结果如图2所示，“高脂肪+缺乏维生素D”双重打击下的小鼠模型出现典型血糖耐受(IPTGG)。血糖耐受的程度可以通过AUC/IPTGG来描述。胰岛素耐受的程度可以用AUC/IPITT以及HOMA-IR(Homeostaticmodel assessment)来描述。HOMA-IR＝(血糖浓度x胰岛素浓度/22.5)。而胰岛素浓度可以通过ELISA方法测定。高脂肪饲养本身并不能有效地诱导胰岛素抵抗，而“高脂肪+缺乏维生素D”的双重打击，才能出现明显的胰岛素抵抗。另外，在Babl/C或者C57/B6两个品系，我们发现摄入一定量的维生素D3(3-4IU/天)，可以有效地缓减高脂肪饮食所致的胰岛素抵抗。

对模型小鼠禁食12小时，再给予腹腔注射葡萄糖，然后测定血糖。图2左上图为糖耐受测定，图2右上图为糖耐受的定量数值。图2左下图为胰岛素耐受测定：给予胰岛素注射后，测定血糖。图2右下图HOMA-IR为胰岛素抵抗常数。

结论：1)摄入VD₃(3-5IU/天)可以抑制高脂饮食所致的高血糖；2)在高脂肪饮食+VD缺乏的双重打击下，产生明晰，持续的高血糖以及胰岛素抵抗。

(3)高血脂是代谢综合症的主要表现，防御素的疗效体现在降低血脂的能力。对动物血脂情况进行检测，结果如图3所示，“高脂肪+缺乏维生素D”双重打击下的小鼠模型出现典型明显的高血脂，高甘油三酯，高LDL血症。在Babl/C或者C57/B6两个品系，我们发现摄入一定量的维生素D3(3-4IU/天)，可以有效地缓减高脂肪饮食所致的高血脂肪症。

对模型小鼠饲养3-4月后，测定血液总胆固醇(图3左图)，以及低密度脂蛋白/胆固醇(图3右图)。

结论：摄入VD₃(3-5IU/天)可以抑制高脂饮食所致的高血脂，包括血浆的总胆固醇含量，以及低密度胆固醇(LDL/C)。

(4)肠道菌群的失衡(dysbiosis)是代谢综合症的重要起因，防御素的疗效体现在平衡肠道菌群生态的能力。对动物肠道菌群异常进行检测，应用qPCR以及16SRNA基因测序技术检测，除了传统的肠道菌群外，可以通过测定大便中肝脏螺旋杆菌(Helicobacterhepaticus)以及共生菌Akkermanisia muciniphila(AKK)占总菌群的含量丰度。结果如图4所示，“高脂肪+缺乏维生素D”双重打击下的小鼠模型回肠肠道中，肝脏螺旋杆菌(Helicobacter，hepaticus)在肠道中的丰度上升，同时促进共生菌AKK在肠道中的丰度降低。另一方面，我们发现摄入一定量的维生素D3(3-4IU/天)，可以有效地缓减高脂肪饮食所致的菌群失衡。我们发现VD3可以有效地阻止肠道中H.H.上升以及AKK下降。作为一种新的评估检查方法，我们也可以通过测定(HH/AKK)的比值来确定对代谢综合症的治疗效果。

对模型小鼠饲养3-4月后，测定小肠末端(回肠)中肝脏螺旋杆菌(Helicobacterhepaticus),以及Akkermanisia的丰度。

结论：摄入VD₃(3-5IU/天)可有效抑制肠道中条件致病菌，例如肝脏螺旋杆菌，而同时增加共生菌(AKK)的含量；反之，维生素D缺乏可以加重肠道菌群的失调。

实施例2:口服alpha防御素5以治疗代谢综合症。

为证明防御素5对代谢综合症的疗效，我们首先建立“高脂肪+缺乏维生素D”动物模型，然后给予小鼠口服灌胃DEFA5处理治理。其剂量在5-10微克/次(n＝6)，每周两次，共四次。作为对照，同等体积的水给予代谢综合症小鼠。在试验中我们也应用了一种alpha防御素的突变体，其一级结构为mut-Defa5:ATSYARTGESATAESLSGVAEISGSLYSLSAE(该突变体不含防御素5结构关键的二硫键以及关键的精氨酸残基)。

在治疗过程中，监测体重，血糖，以及大便中菌群生态的平衡。经过治疗后，小鼠体重降低，恢复正常。在治疗后10天，将小鼠处死后测定一下指标。

(1)口服alpha防御素5可以有效地缓减脂肪肝。Blab/C小鼠给予高脂肪并且VD缺乏饲料喂养4-5个月，形成脂肪肝。然后给予治疗(n＝6)，口服灌胃，剂量在5-10微克/次，每周两次，共四次。同样体积的水，作为对照。治疗10天后，处死小鼠，进行分析。通过H&E染色，结果显示口服防御素5可以有效地缓减脂肪肝(图5)，肝细胞中大泡油滴消失，脂肪肝消融，而作为对照，同等体积的水或者位点突变不含二硫键的DEFA5没有明显的效果。由此我们得出结论：口服alpha防御素5可以有效地缓减脂肪肝

(2)口服alpha防御素5降低血糖，甘油三脂，及低密度脂蛋白胆固醇。

Blab/C小鼠给予高脂肪并且VD缺乏饲料喂养4-5个月，形成脂肪肝。然后给予治疗(n＝6)，口服灌胃，剂量在5-10微克/次，每周两次，共四次。同样体积的水，作为对照。治疗10天后，处死小鼠，进行分析。血液检查表明，alpha防御素可明显改善代谢综合症小鼠的空腹血糖，血甘油三酯，以及低密度脂蛋白/胆固醇。

对治疗后动物的血液参数进行检测，结果显示(图6)，小鼠空腹血糖降低，血浆甘油三脂降低，低密度脂蛋白胆固醇降低。作为对照，同等体积的水(mock)没有作用。由此我们得出结论：口服alpha防御素5降低血糖，甘油三脂，及低密度脂蛋白胆固醇。

(3)口服alpha防御素5可以有效地抑制肠道致病菌，提升肠道益生菌。

Blab/C小鼠给予高脂肪并且VD缺乏饲料喂养4-5个月，形成脂肪肝。然后给予治疗(n＝6)，口服灌胃，剂量在5-10微克/次，每周两次，共四次。同样体积的水，作为对照。在治疗过程中监测大便的菌群改变。

在口服灌胃处理过程中，通过qPCR分析，对治疗后动物的回肠肠道菌群进行检测，结果显示(图7)，小鼠大便中益生菌Akkermansia muciniphila(AKK)逐步增加。在治理结束后，在回肠区段的菌群中，AKK也是逐步上升，而致病菌肝脏螺旋杆菌(Helicobacterhepaticus)下降。

同时，体外实验结果显示，随着防御素5给药剂量的增加，小鼠回肠中的致病菌肝脏螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus)的生长受到相同趋势的抑制。

标准菌株肝脏螺旋杆菌(H.H.)ATCC 51449用于体外抗菌测定。以brain-heartinfusion培养基在微量好氧培养(microaerophilically culture)5天。在细菌计数后，加入防御素5或防御素6。浓度如图中所示,培养处理24h，然后再对细菌计数。重复3次，以计算抗菌抑制率。结果如图8所示，防御素5、6都有很好的抑菌活性。

实施例3:以口服防御素5或者防御素6，或者维生素D作为治疗代谢综合症药物的应用。

防御素是人源通过肠道潘氏细胞外分泌型抗菌肽，包括DEFA5及DEFA6。本申请的核心之一是通过口服alpha防御素5/6来平衡肠道菌群，从而改善/治疗代谢综合症，2型糖尿病及其并发症。

通过动物试验我们的工作表明，口服人源DEFA5可以重新平衡肠道菌群，降低内毒素入血，降低系统炎症，改善膜岛素耐受，从而治疗代谢综合症。在小鼠模型中我们发现给予5-10微克(5-10μg)/次的人源DEFA5可以有明显的效果，包括平衡肠道菌群，改善血糖等。

因此，对人的剂量可以低至10毫克(10mg)。而其上限的剂量需要通过临床试验来确定。其应用的范围可以在10毫克/次至500毫克/次。临床给药的剂量，频率，疗程的长短，需要通过进一步试验来确定。

同时，在本发明的动物模型诱导工作中，我们的发现，维生素D可以调节肠道潘氏细胞产生抗菌肽，而后者可以平衡肠道菌群，降低内毒素入血，降低炎症及膜岛素抵抗。如图1－3所示，在饲料中添加一定剂量的维生素D3(VD3，2-3IU/天)可以抵御高脂肪饮食导致的脂肪肝，高血糖，高低密度胆固醇，以及其他代谢综合症的指标。

以该剂量来推测对人的治疗剂量因该为4,000-10,000IU VD3/天。根据美国国家医学学会(Institute of Medicine)的推荐，的对成人每天的饮食摄入剂量(DietaryReference Intake)为600-800IU。同时IOM公告书说摄入的安全的上限(tolerable upperintake levels)为4000IU/天，或者0.1mg/天。因此，作为应用，我们提出对代谢综合症病人的用维生素D₃作为治疗，其剂量可以在1,000IU/天至20,000IU/天。给药的剂量也依赖于病人维生素D缺乏的程度以及其他因素有关，包括肥胖的程度，日照的程度，含维生素D饮食(深海渔油，奶制品)的摄入量。因此维生素D给药剂量可以据此来给予调整。作为选项，骨化三醇(Calcitriol)也可以同样或者更好的结果。作为口服,骨化三醇0.25-2.5微克/次，每天1-2次，疗程2-24月。作为治疗应用，维生素D₃，每天500-20000IU,口服,2-10个月。应用效果可根据以下检测指标及相关检查结果进行评判。检测指标包括血液检查生化指标、谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、血糖等。肝脏影像学检查包括B超、CT和MRI等。血液维生素D的水平(通常为25-OH VD3)也可作为效果的评判指标之一。

实施例4:合成alpha防御素5/6(DEFA5/6)的方法

作为合成的方法步骤如下，

第一阶段，应用固相合成树脂将Fmoc(9-fluorenylmethyloxy-carbonyl)保护的氨基酸通过C末端进行连接，

(1)掺入氨基酸残基的序列依照人源序列设计，

DEFA5的序列为：ATCYCRHGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR；

DEFA6的序列为：AFTCHCRRSCYS TEYSYGTCTV MGINHRFCCL。

(2)侧链残基(side chains)的保护方法：

对于精氨酸，应用n-2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulphonyl；

对于N和C端的半胱氨酸，应用三苯甲基；

对于cys-3和cys-20，我们应用s-tbutyl；

对于cys-10和cys-30，我们应用乙酰氨基(ACM)。

(3)受保护的肽基树脂，经过90％TFA含有二氯甲烷(5％)，硫醚(2.5％)和二硫化物(2.5％)处理。

(4)按照防御素5/6的序列依次连接当氨基酸，并将合成完毕的肽段从树脂上裂解，获得线性肽粗品(93–95％)。经过TFA处理，N-和C-末端的半胱氨酸残基的S-三苯甲基保护组保护在同时被剪除，而肽链从树脂上裂解下来。而ACM和s-tbutyl保护的cys-3、cys-20、cys-10及cys-30组分别是完整的。

(5)用反相高效液相色谱法，经过C18拄对初线性肽进行分离。用含TFA的乙腈水进行线性梯度洗脱。将高峰汇集，冻干并进行氨基酸序列分析，确定合成完毕的肽序列。

第二阶段，形成三个特异的二硫键。

(1)形成Cys3或Cys4与Cys31半胱氨酸残基之间的二硫键：

上述含游离巯基的Cys3和Cys31的线性DEFA5悬浮于在水中，至肽的浓度为0.05mM；

加入0.1M乙酸铵溶液调整pH至6.8，滴加铁氰化钾甲0.2M的溶液，直至黄色；

然后加入过量的铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])以确保氧化，将溶液的pH通过0.2M的乙酸铵和25％乙酸保持在6.8-7.0；

用0.1M乙酸铵缓冲液(pH6.8)对柱中的肽进行洗脱，将肽水溶液合并，冻干。

将干燥的物质应用半制备性C18柱通过反相HPLC纯化。将主峰合并，冷冻干燥，进行氨基酸和序列分析，通过测序，质谱分析证实正确的序列。

(2)形成Cys-5或Cys-6与Cys-20半胱氨酸残基之间的二硫键：

将上述纯化的线性DEFA5溶于三氟乙醇(trifluoroethanol)，通过还原反应，以三丁基膦(tri-butylphosphine)脱去S-叔丁基团上Cys3以及Cys20残基上的保护基团(方案如图9)；

反应混合物浓缩至小体积，通过加入乙醚使产物沉淀；

将分离的固体过滤并用乙醚洗涤，并干燥；

将干燥的制备物悬浮于水中，然后使用铁氰化钾，在pH6.8进行氧化反应，经过分离，干燥后，对所得的材料以反相HPLC进行分离。

(3)形成Cys10与Cys30半胱氨酸残基之间的二硫键：

以上述肽溶于水/甲醇的混合物(5:1)中，然后滴加碘/甲醇中的溶液，至红色溶液产生，并冷却至0℃；

用1M硫代硫酸钠进行氧化处理，直到红色消失，将甲醇通过旋转蒸发除去，然后将获得的材料冻干；

其口服制剂，除了活性成分防御素以外，也包括常用的辅料组成，包括稀释剂，粘合剂，稳定剂，抗氧化剂等。

同时，防御素也包括DEFA5/6的衍生物。所描述的衍生物包括但不限于由DEFA5/6一级结构上的氨基酸取代或者修饰的肤链。我们发现DEAFA5与DEAF6具有类似的抑制细菌的能力。

实施例5:测定，评估用于抗代谢综合症的先导药物的方法。

作为具体实施方案，我们通过测定以下指标来评估新药的疗效及潜在副作用。

(a)喂养期间体重的变化；腹围的变化。

(b)喂养期间空腹血糖，血脂的变化。；

(c)喂养期间胰岛素耐受的形成，喂养期间血糖不耐受的程度形成，包括Homeostatic model assessment(HOMA-IR)；

(d)喂养期间大便菌群的变化；应用qPCR以及16SRNA基因测序技术。除了传统的肠道菌群外。我们可以通过测定大便中Helicobacter hepaticus以及Akkermansiamuciniphila的含量。通过(HH/AKK)的比值，我们可以判定肠道菌群的失衡，以及药物对肠道菌群恢复的疗效。

(e)试验终点(4-6个月喂养)后肝脏组织病理切片，H&E染色，油红染色，以测定脂肪肝的程度。

(f)试验终点(4-6个月喂养)后回肠区段组织染色，PAS染色，以确定肠道界面，包括肠道表面粘多糖(mucine)的完整成度。通过测定回肠DEFA5以及MMP7染色，以确定肠道防御素的程度。

(g)测定血液中25-OH维生素D₃的含量。

(h)在试验中我们也应用了一种alpha防御素的突变体，其一级结构为mut-Defa5:ATSYARTGESATAESLSGVAEISGSLYSLSAE。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作本发明保护范围的限定。

引述的文献

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Claims

1.alpha防御素5、6的如下方面的应用：

(1)制备治疗代谢综合征药物；

(2)制备降低血浆中甘油三酯、低密度脂蛋白的含量的药物；

(3)制备治疗脂肪肝及高血糖相关疾病的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述代谢综合征包括：脂肪肝，向心性肥胖、高血糖、高甘油三酯血症、高血压以及以葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗为症状的血糖调节异常；

所述的高血糖相关疾病是：高血糖导致的感染、心血管病变、肾功能衰竭、以及糖尿病的其他并发症包括双目失明、下肢坏疽。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，

所述的alpha防御素5序列结构为：

alpha防御素5:ATCYC RHGRC ATRESL SGVCE ISGRL YRLCC R，3位和31位，5位和20位，10位和30位半胱氨酸之间有3个二硫键；

所述的alpha防御素6序列结构为：

alpha防御素6:AFTCH CRRSC YSTEY SYGTC TVMGI NHRFC CL，4位和31位，6位和20位，10位和30位半胱氨酸之间有3个二硫键。

4.维生素D₃的如下方面的应用：

(1)制备上调肠道中alpha防御素5、6的表达量的制剂；

(2)制备调节肠道菌群平衡的药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，

所述的肠道菌群包括，Akkermansia muciniphila菌属和Helicobacter Hepaticus菌属及肠道中的其他变形杆菌；

所述的调节具体为：上调AKK类的共生菌丰度、下调HH类、其他变形杆菌的丰度；或在上调AKK类益生菌的同时下调HH类或其他变形杆菌类有害菌。