CN107980043A - 多肽用于作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或调节代谢状态的用途 - Google Patents

多肽用于作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或调节代谢状态的用途 Download PDF

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Abstract

已经发现衍生自嗜黏蛋白阿克曼氏菌的细胞外多肽能够在哺乳动物中调节和/或促进肠黏膜免疫系统功能和/或维持和/或恢复代谢状态和/或增加肠黏膜屏障的物理完整性。该多肽或包含这种多肽的宿主细胞可以用于预防和/或治疗多种病况，其得益于增加的肠黏膜屏障物理完整性和/或改善的肠黏膜免疫系统功能和代谢状态。

Description

多肽用于作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或调 节代谢状态的用途
技术领域
本发明涉及肠黏膜免疫系统、肠黏膜屏障、包含多肽和/或宿主细胞的药物、食品或饲料组合物领域，所述多肽和/或宿主细胞能够在哺乳动物(例如人类)中调节和/或促进肠黏膜免疫系统功能和/或维持和/或恢复和/或增加肠黏膜屏障的物理完整性，和/或维持、恢复或改善葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯的体内稳态。更具体地，本发明提供包含Amuc-1100多肽或其变体的组合物。已经发现Amuc-1100能够与toll样受体2(TLR2)相互作用和/或调节TLR2和/或依赖于NFκ-B的信号转导通路和/或促进细胞因子(例如IL-6、IL-8和IL-10)从位于哺乳动物(例如人类)的肠黏膜屏障附近的免疫细胞释放，和/或能够在哺乳动物中维持、恢复或增加肠黏膜屏障的物理完整性和/或维持、恢复或改善葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯的体内稳态和/或能够改善哺乳动物的代谢状态或免疫状态。Amuc-1100多肽可以用于预防或治疗如本文所述的多种疾病或病况。
发明背景
肠黏膜屏障增加的渗透性或渗透性过高被认为在几种病症和病况例如肠相关疾病、自身免疫疾病、过敏症、癌症、2型糖尿病、肥胖症、抑郁症、焦虑症和许多其他病症和病况中起作用。为此，人们越来越有兴趣了解肠黏膜屏障功能失调在哺乳动物靶向胃肠道(GI)的许多病况的发病机理中的作用。
在正常状况下，肠黏膜屏障作为选择性屏障允许吸收营养素、电解质和水，并防止暴露于有害的大分子、微生物、饮食和微生物抗原(例如食品过敏原)。肠黏膜屏障基本上由黏液层和下层上皮细胞(本文中称为“肠上皮细胞”)组成。肠上皮细胞通过所谓的“紧密连接”彼此紧密地相连，该“紧密连接”主要为在两个肠上皮细胞膜之间的“物理连接”。肠黏膜屏障的维持，特别是肠上皮细胞层的物理完整性的维持(即细胞间的连接保持紧密)对于保护宿主对抗病原性微生物、抗原和其他不良药剂从肠向血流的迁移是重要的。
肠黏膜屏障还被约1012至1014的共生微生物大量占据，共生微生物主要为厌氧菌或微需氧菌，其中的大多数与其宿主共生生存。这些细菌在很多方面对其宿主有益。它们提供抗病原菌的保护并通过合成维生素K和维生素B复合物的一些成分在宿主中起到营养作用。进一步地，肠黏膜屏障已经进化了复杂的“肠黏膜免疫系统”用于区分共生菌(即有益菌)与病原菌和其他有害试剂。肠黏膜免疫系统是肠黏膜屏障不可缺少的一部分，包括淋巴组织和特化免疫细胞(即淋巴细胞和浆细胞)，其遍及肠黏膜屏障而广泛分布。天然占据健康对象的黏膜的微生物之一是黏蛋白退化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)，其已经显示出提高肠屏障功能(Everard等人，PNAS 110(2013)9066-71；Reunanen等人,Appl Environ Microbiol 2015年3月20日)，从而影响与受损的肠屏障功能相关的疾病。
在某些情况下，肠黏膜屏障可能易受多种多样的传染性生物或试剂攻击，所述传染性生物或试剂通常不能穿过肠黏膜屏障，然而(例如通过肠上皮细胞之间松散的紧密连接产生的缝隙)能够设法穿过肠黏膜屏障。穿过肠黏膜屏障的生物或其他试剂可能导致宿主中的疾病或其他不期望的病况(例如过敏症)。这些疾病的实例包括肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、2型糖尿病、1型糖尿病、炎症性肠病(IBD)、肠道易激综合症(IBS)、葡萄糖不耐症、脂质代谢异常、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风，非酒精性脂肪肝疾病，酒精性脂肪肝疾病、高血糖症、肝脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能失调、过敏症、哮喘、孤独症、帕金森病、多发性硬化症、神经退行性疾病、抑郁症、与屏障功能受损有关的其他疾病、创伤修复、行为障碍、酒精依赖症、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病和癌症。
相反地，例如以上提及的那些疾病和其他病况例如食物过敏症、例如由于婴儿早产、暴露于辐射、化疗和/或毒素导致的肠发育不全、自身免疫性疾病、营养不良、败血症等可以改变肠黏膜屏障的物理完整性(即导致肠上皮细胞之间的紧密连接变松散)，其转而可能允许不期望的微生物或其他试剂穿过宿主肠黏膜屏障。
多年以来已经开发了针对这种微生物或试剂的几种疫苗和/或抗体。然而，由于几种微生物或试剂不能用疫苗或抗体有效地靶向或根除，这种方法没那么成功。
还探索了首先防止有害的微生物和其他试剂穿过宿主的肠黏膜屏障和/或旨在防止肠黏膜屏障的渗透性过高的其他方法旨在。例如，已经开发了包含谷氨酸的组合物以预防和/或治疗与肠黏膜屏障的渗透性过高相关的病症(WO 01/58283)。包括精胺和亚精胺及其前体的其他物质也被用于相同的目的(Dorhout等人(1997).British J.Nutrition,639-654页)。为了调节肠粘膜屏障(US2012/0230955)，还开发了包含用于促进生活在肠粘膜屏障附近的GI细菌有益效果的阿拉伯糖基木聚糖的制剂。
本发明的目的是提供包含适于在哺乳动物中(例如人类)维持和/或恢复和/或增加肠粘膜屏障的物理完整性和/或防止肠粘膜屏障的渗透性过高，和/或适于维持和/或恢复和/或改善哺乳动物中葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，并且优选地从而在所述哺乳动物中预防或治疗与肠粘膜屏障的非最佳渗透性相关的疾病或病症和/或葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯的内稳态失衡的这些试剂的试剂和/或组合物。或者或另外地，本发明的一个目的是提供包含适用于在哺乳动物中调节和/或促进肠黏膜免疫系统功能的试剂和/或组合物。
发明内容
本发明涉及包含多肽以及药学或营养学上可接受的载体的组合物，该多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
组合物可以是营养组合物或药物组合物。
本发明还涉及经基因修饰的宿主细胞，其中选自以下的核酸分子被引入其基因组：a)包含在整个长度上与SEQ ID NO：2具有至少50％序列同一性的核酸序列的核酸分子；和b)包含编码以下多肽的核酸序列的核酸分子：所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够产生免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
另外，本发明针对经基因修饰的宿主细胞，所述宿主细胞不属于嗜黏蛋白阿克曼氏菌种，其包含选自以下的核酸分子：a)包含在整个长度上与SEQ ID NO：2具有至少50％的序列同一性的核酸序列的核酸分子；和b)包含编码以下多肽的核酸序列的核酸分子：所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
本发明进一步提供了经基因修饰的宿主细胞，所述宿主细胞是嗜黏蛋白阿克曼氏菌种，其中选自以下的核酸分子被引入其基因组中：a)包含与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少50％的序列同一性的核酸序列的核酸分子；和b)包含编码以下多肽的核酸序列的核酸分子：所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
本发明还涉及生产包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽的方法，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，该方法包括以下步骤：a)在允许产生所述多肽的条件下培养根据权利要求3-5中任一项所述的宿主细胞；和b)任选地分离步骤(a)中产生的多肽。
本发明还提供多肽，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，本文教导的宿主细胞或本文教导的组合物用作药剂，特别是在哺乳动物中用于促进肠黏膜免疫系统功能，用于维持、恢复和/或改善葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，或用于维持、恢复和/或提高肠黏膜屏障的物理完整性。
所述多肽、组合物或宿主细胞可以用于预防和/或处理哺乳动物中的选自以下的病症：肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关疾病、2型糖尿病、1型糖尿病、妊娠糖尿病、先兆子痫、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、葡萄糖不耐受、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝疾病、酒精性脂肪肝疾病、高血糖症、肝脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能障碍、过敏症、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化症、神经退行性疾病、抑郁症、与受损屏障功能相关的其他疾病、创伤修复、行为障碍、酒精依赖症、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症和改变肠黏膜屏障的物理完整性的病况例如食物过敏、例如由于婴儿早产、暴露于辐射、化疗和/或毒素导致的肠发育不全、自身免疫疾病、营养不良、败血症等。
或者或另外地，所述多肽、宿主细胞或组合物可以用于促进哺乳动物中肠的抗炎活性和/或用于促进哺乳动物的减重。
本发明还涉及用于处理和/或预防哺乳动物中的选自以下的病症：肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、2型糖尿病、1型糖尿病、妊娠糖尿病、先兆子痫、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、葡萄糖不耐受、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝疾病、酒精性脂肪肝疾病、高血糖症、肝脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能障碍、过敏症、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化症、神经退行性疾病、抑郁症、与受损屏障功能相关的其他疾病、创伤修复、行为障碍、酒精依赖症、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症和改变肠黏膜屏障的物理完整性的病况例如食物过敏、例如由于婴儿早产、暴露于辐射、化疗和/或毒素导致的肠发育不全、自身免疫疾病、营养不良、败血症等，用于促进哺乳动物减重，用于促进哺乳动物的肠的抗炎活性，用于促进哺乳动物肠黏膜免疫系统功能，用于维持、恢复和/或改善哺乳动物中葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，或用于维持、恢复和/或提高哺乳动物的肠黏膜屏障的物理完整性的方法，其包括向有需要的哺乳动物施用有效量的多肽、本文教导的宿主细胞或本文教导的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
本发明还涉及生产包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或在整个长度上与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽的方法，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，该方法包括以下步骤：a)在适当的培养基中培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌种细菌；和b)任选地分离步骤(a)中产生的多肽。
一般定义
在本发明的情况下，术语“多肽”等同于“蛋白质”。多肽具有特定的氨基酸序列。本发明多肽的“变体”优选具有与本发明的多肽具有至少50％序列同一性的氨基酸序列。当本发明的多肽不再处于其天然环境中时其被分离，即当其不再存在于菌毛中的情况下和/或不在存在于细胞例如嗜黏蛋白阿克曼氏菌细胞的情况下。
本文所使用的术语“序列同一性”或“序列相似度”指以下情况：其中氨基酸或核酸序列具有与其他氨基酸或核酸序列的序列同一性或序列相似度。使用整体或局部的比对算法通过比对两个多肽或两个核苷酸可以确定“序列同一性”或“序列相似度”。当序列(当通过例如程序GAP或BESTFIT使用缺省参数最佳地比对时)共享序列同一性的至少某一最低百分比(如下所定义的)时，则序列被称作“大体上一致的”或“基本上相似的”。GAP使用Needleman和Wunsch整体比对算法以在其整个长度上比对两个序列，最大化配对的数量并最小化间隙的数量。通常使用GAP缺省参数，间隙产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和间隙延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，所使用的缺省打分矩阵为nwsgapdna，对于蛋白质，缺省打分矩阵为Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。使用计算机程序例如从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA 92121-3752 USA可获得的GCG Wisconsin Package、Version 10.3，或者EmbossWin version 2.10.0(使用程序“needle”)来确定序列比对和对于序列同一性百分比的分数。或者，通过使用算法例如FASTA、BLAST等检索数据库来确定相似性或同一性百分比。优选地，序列同一性指在序列整个长度上的序列同一性。
“跨膜电阻抗”(缩写为TER)是体外上皮细胞层渗透性的量度。增加的上皮渗透性与紧密连接的弱化和TER的降低有关。
本文所使用的术语“嵌合基因”指任何非天然存在的基因，即通常没有在自然界的物种中发现的基因，特别是在自然界中其中核酸序列的一个或更多个部分彼此不相关的基因。例如，启动子在自然界中与转录区的部分或全部或与其他调控区不相关。术语“嵌合基因”理解为包含表达构建体，其中异种启动子或转录调控序列可操作地连接于一个或更多个编码序列，和任选地3’-未翻译区(3’-UTR)。或者，嵌合基因可以包含启动子、编码序列和任选地衍生自同一物种的3’-UTR，但并不天然存在于该组合中。
本文所用的术语“经基因修饰的宿主细胞”是指经基因修饰的细胞，例如，通过引入外源核酸序列(例如本文教导的SEQ ID NO：2)或通过内源基因序列的特异性改变。通过在内源基因中引入例如一个或更多个突变、插入和/或缺失，和/或在基因组中插入基因构建体(例如载体或嵌合基因)，可以对这些细胞进行基因修饰。经基因修饰的宿主细胞可以指分离的细胞或培养的细胞。经基因修饰的细胞可以是“转导细胞”，其中细胞已经用例如经修饰的病毒感染，例如可以使用逆转录病毒，但也可以考虑其他合适的病毒如慢病毒。还可以使用非病毒方法例如转染。因此经基因修饰的宿主细胞还可以为“稳定转染细胞”或“瞬时转染细胞”。转染指非病毒方法以将DNA(或RNA)转移至细胞以使基因表达。转染方法在本领域是广泛已知的，例如核酸的磷酸钙转染、PEG转染和脂质体或脂质体复合物转染等。这样的转染可以是瞬时的，但也可以是稳定的转染，其中可以选择将基因构建体整合到其基因组中的细胞。
本文所用的术语“有效量”是指实现如本文所教导的效果所需的量。例如，如本文所教导的多肽或基因工程的宿主细胞的有效量是以下量：其有效用于调节和/或促进肠粘膜免疫系统功能和/或维持和/或恢复和/或增加肠黏膜屏障的物理完整性(例如，促进肠上皮细胞之间形成更紧密的连接)和/或用于在免疫细胞中调节和/或刺激toll样受体信号转导通路(即TLR2通路)和/或用于增加免疫细胞中的细胞因子产生(例如IL-6，IL-8和IL-10)和/或用于预防和/或处理以下病症或病况：肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、2型糖尿病、1型糖尿病、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、葡萄糖不耐受、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝疾病、酒精性脂肪肝疾病、高血糖症、肝脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能障碍、过敏症、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化症、神经退行性疾病、抑郁症、与受损屏障功能相关的其他疾病、创伤修复、行为障碍、酒精依赖症、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症和改变肠黏膜屏障的物理完整性的病况例如食物过敏、例如由于婴儿早产、暴露于辐射、化疗和/或毒素导致的肠发育不全、自身免疫疾病、营养不良、败血症等。
如本文所使用的术语“生理学上可接受的载体”或“饮食上可接受的载体”，“营养学上可接受的载体”或“药学上可接受的载体”是指生理学上可接受的或饮食上可接受的载体，或营养学上可接受的或药学上可接受的载体材料，例如提供本发明的多肽或宿主细胞的施用形式涉及液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。每种载体必须是“可接受的”，其意义在于与组合物的其它成分相容，并且不对对象有害，即适合于消耗或营养学上可接受的。术语“适合消耗”或“营养学上可接受的”是指通常被认为对人类(以及其他哺乳动物)消耗的安全的成分或物质。可以用作生理学上可接受的载体或营养学上可接受的或药学上可接受的载体的材料的非限制性实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸缓冲溶液；(21)药物制剂中使用的其他无毒相容物质等。此外，本文所用的术语“营养学上可接受的”和“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内的那些组合物或试剂、材料或组合物和/或其剂型的组合，其适用于与人类和动物的组织接触，没有过多的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“体内稳态”指其中变量被调节以使内部环境保持稳定和相对恒定的系统的特性。所有动物调节其血液葡萄糖浓度。体内的葡萄糖调节是保持身体处于“葡萄糖体内稳态”的过程。哺乳动物用不同激素(例如胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、儿茶酚胺和许多其他激素)和不同神经通路(例如神经中继(nervous relay)、肠至脑至外周器官轴)调节其血液葡萄糖。人体在一天中的大多数时间甚至在禁食24小时后维持葡萄糖水平衡定。即使在长时间禁食期间，葡萄糖水平仅非常略微地降低。由胰腺的β细胞分泌的胰岛素通过指令体细胞保留更多葡萄糖用于其自身使用而有效将葡萄糖递送至那些体细胞。如果细胞内的葡萄糖是高的，细胞会将其转化成不溶的糖原以防止可溶的葡萄糖干扰细胞代谢。最终这降低血液葡萄糖水平，胰岛素有助于预防糖尿病。当胰岛素缺乏或细胞变得抵抗胰岛素，则发生糖尿病。由胰腺的α细胞分泌的胰高血糖素促使细胞分解储存的糖原或将非糖类碳源通过糖原异生作用转化成葡萄糖，从而防止低血糖症。大量的其他因素和激素(例如胰高血糖素样肽1、儿茶酚胺及许多其他素)涉及葡萄糖代谢的控制。涉及神经通路的不同机制也对该复杂调节做出贡献。
“胆固醇体内稳态”是促进维持生物体内胆固醇的平衡内部状态的过程的机制。胆固醇，人体系统中的重要生物分子，其执行多种生物功能例如作为胆汁酸、维生素D和类固醇激素产生的前体。其还用作体内存在的每个细胞的细胞膜的关键结构要素。尽管胆固醇具有有益的和必要的功能，胆固醇体内稳态的紊乱可以导致心脏疾病增加和使与胆固醇代谢有关的其他体内稳态反馈系统紊乱的风险。控制胆固醇体内稳态的最显著的器官是肝脏，由于其不仅生物合成释放到循环系统的胆固醇，其还分解来自血流的潜在有害的、自由漂浮的胆固醇。HDL在维持胆固醇体内稳态中是有益的，因为其摄取或递送潜在危险的胆固醇直接返回肝脏，其在此处合成为由消化系统利用的无害的胆汁酸。LDL不太有益地起作用，这是由于其倾向于在体细胞和在动脉管壁沉积其胆固醇。已经显示LDL水平过高增加心血管疾病风险。在健康对象中，胆固醇体内稳态受到复杂的反馈回路的严格控制。在这种情况下，如果健康对象吃了大量的膳食胆固醇，那么肝脏中的生物合成被大大减少以保持平衡。在具有高基线LDL水平的健康对象中，无论是从历年不良的饮食习惯或其他遗传或医学状况出发，反馈回路和系统性应对机制可能被相同的大量摄入所压倒，造成危险的体内稳态失衡。
“甘油三酯体内稳态”是有助于维持生物体内甘油三酯的平衡内部状态的过程的机制。甘油三酯代谢具有重要的临床意义。高甘油三酯血症表示最丰富的脂肪分子甘油三酯的高(过量)血液或血清水平(血的)。即使没有高胆固醇血症(高胆固醇水平)，甘油三酯水平升高与动脉粥样硬化有关，并易患心血管疾病。高甘油三酯水平也增加了急性胰腺炎的风险。此外，随着时间的推移，TG水平的升高和增加会增加发生糖尿病的风险。已经显示胰岛素抗性与高水平的甘油三酯(TG)有关。
本文所使用的术语“约”表明本领域的正常偏差范围，例如在2平均标准差以内。术语“约”可以理解为包括偏离指示值最多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的值。
本文所使用的术语“包含”指以下情况，其中所述术语以其非限制性含义使用，指包括该词语后的项目，但是并不排除未特别提及的项目。其还包括更限制性的动词“基本上由……组成”和“由……组成”。
要素前没有数量词不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个要素。要素前没有数量词因此通常指“至少一个”。
发明详述
发明人发现了如本文所教导的多肽Amuc-1100或其变体能够在哺乳动物(例如人类)中调节和/或促进肠免疫系统功能和/或维持和/或恢复和/或增加肠黏膜屏障的物理完整性，和/或维持、恢复或提高葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯的体内稳态。发明人还发现该多肽存在于细胞外，所述多肽由嗜黏蛋白阿克曼氏菌编码，支持其在信号转导中作用。
不希望受任何理论约束，认为该有益效果来自于本发明多肽与哺乳动物肠黏膜屏障附近的免疫细胞表面存在的TLR2信号转导通路相互作用的能力。更具体地，本发明人发现如本文所教导的多肽能够与存在于免疫细胞表面的TLR2相互作用和/或调节和/或刺激在肠黏膜屏障附近的免疫细胞中的TLR2信号转导通路，以刺激细胞因子(例如IL-6、IL-8和IL-10)从所述免疫细胞分泌。
进一步，本发明人发现如本文所教导的多肽包括其变体能够调节和/或增加哺乳动物肠黏膜屏障跨膜电阻抗。由于增加的跨膜电阻抗测量值作为降低的肠黏膜屏障渗透性指标，认为如本文所教导的多肽包括其变体能够调节肠黏膜屏障的物理完整性，特别是在上皮细胞之间的紧密连接的水平上。
结合起来，认为这些效果导致改善的或提高的肠黏膜免疫系统功能(例如在肠黏膜屏障处更多的细胞因子释放)以及改善的或提高肠黏膜屏障的物理完整性，特别是在肠上皮细胞之间的连接水平上(即通过细胞间更紧密的紧密连接)。
另外，发现不影响食物摄取的情况下，用Amuc-1100处理HFD喂养的小鼠导致体重的显著降低和脂肪质量增加。用Amuc-1100的处理还修正了HFD诱导的高胆固醇血症，血清HDL胆固醇显著降低，对于LDL胆固醇具有类似趋势。进一步地，Amuc-1100的施用减少了葡萄糖耐受不良，与存活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌具有相同功效。
最终，已知二甲双胍刺激阿克曼氏菌(Akkermansia)的生长(Lee H和Ko G,A pplEnviron Microbiol.2014年十月；80(19):5935-43)，因此阿克曼氏菌及其细胞外肽例如Amuc-1100对于妊娠期糖尿病和先兆子痫可能具有与二甲双胍相似的作用(Syngelaki等人，N Engl J Med.2016Feb 4；374(5):434-43)。
多肽
本公开教导分离的多肽，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇体内稳态。本文所教导的多肽能够与toll样受体2(TLR2)结合。
在一个实施方案中，如本文所教导的多肽及其变体能够刺激细胞中的TLR2信号转导通路，刺激细胞因子(例如IL-6、IL-8、IL-10等)从细胞释放和/或增加哺乳动物细胞如人类细胞的跨膜电阻抗(TER)和/或改善哺乳动物例如小鼠或人的代谢或免疫状态。
本文所教导的多肽还可以被称为“Amuc-1100蛋白质”或“Amuc-1100多肽”。应理解术语“Amuc-1100蛋白质”或“Amuc-1100多肽”还包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Amuc-1100蛋白质的变体，所述变体的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列大于50％、优选大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、优选大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、优选大于96％、优选大于97％、优选大于98％和优选大于99％的序列同一性。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Amuc-1100多肽的变体还包括通过一个或更多个氨基酸替代、缺失或插入的方式衍生自具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的多肽。优选地，与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽相比，这种多肽包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸替代、缺失或插入。
如本文所教导的多肽可以以刺激多肽从细胞分泌的N末端信号序列为先导。在一个实施方案中，N末端信号序列可以为包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽，其为预期的天然存在的Amuc-1100多肽的N末端信号序列。然而，还可以采用能够允许Amuc-1100从细胞分泌的其他N末端信号序列。例如，可以采用预期的天然存在的Amuc-1100多肽的N末端信号序列的截短形式或延长形式，只要该N末端信号序列能够允许Amuc-1100从细胞分泌。或者，可以使用非天然存在的N末端信号序列。技术人员能够识别适用于本发明的N末端信号序列。因此，本发明的多肽可以包括N末端来自于其氨基酸序列的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，。
通过本领域任何适当的可行方法可以确定氨基酸序列同一性。例如，使用如上所定义的Needleman和Wunsch算法和GAP缺省参数通过两两比对来确定氨基酸序列同一性。还理解许多方法可以用于确认、合成或分离如本文所教导的多肽变体，例如western印迹法、免疫组织化学、ELISA、氨基酸合成等。
还理解如本文所教导的Amuc-1100多肽的任意变体发挥与如本文所教导的多肽Amuc-1100相同的功能和/或具有相同活性。可以通过技术人员认为适合于这些目的的本领域任何已知方法确定任意Amuc-1100多肽或其变体的功能或活性。
多核苷酸
本公开还教导核酸分子例如分离的、合成的或重组的核酸分子，其包括选自以下的核酸序列：
(a)在整个长度上与SEQ ID NO:2具有至少50％序列同一性的核酸序列；和
(b)编码如本文所教导的多肽的核酸序列。
术语“分离的核酸分子”(例如cDNA、基因组DNA或RNA)包括天然存在的、人工的或合成的核酸分子。核酸分子可以编码如本文教导的任意多肽。所述核酸分子可以用于产生如本文教导的多肽。由于遗传密码的简并性，多种核酸分子可以编码相同的多肽(例如包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽)。
在实施方案中，如本文教导的分离的核酸分子包括核酸分子的任意变体，其包括包含与SEQ ID NO:2的核酸序列具有大于50％、优选大于55％、优选大于60％、优选大于65％、优选大于70％、优选大于75％、优选大于80％、优选大于85％、优选大于90％、优选大于95％、优选大于96％、优选大于97％、优选大于98％和优选大于99％的序列同一性的核酸序列的任意核酸分子。变体还包括核酸分子，其通过一个或更多个核酸替代、缺失或插入衍生自具有SEQ ID NO:2的核酸序列的核酸分子。优选地，与SEQ ID NO:2相比，这种核酸分子包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸替代、缺失或插入。
通过本领域任何适当的可行方法可以确定序列同一性。例如，生物信息学可以用于进行核酸序列之间的两两比对以识别序列之间可能由于功能、结构或进化关系造成的相似性的区域。还理解许多方法可以用于识别、合成或分离如本文所教导的多核苷酸变体，例如核酸杂交、PCR技术、计算机模拟分析和核酸合成等。
还理解如本文所教导的任意核酸分子可以编码如本文所教导的多肽。
在实施方案中，核酸分子为具有如SEQ ID NO:2中所述的核酸序列的核酸分子。
或者，分离的核酸分子可以为在严格条件下与本文所教导的核酸分子杂交并编码如本文所教导的多肽的核酸分子。例如，该核酸序列可以有利地用于筛选试验，所述筛选试验的目的是检测细胞中或生物体中本发明核酸分子的任何同源物的存在或不存在，或检测在细胞或在生物体中，如本文所教导的核酸分子的表达的降低或增加。
如本文所教导的核酸分子可以包括编码适合于刺激如本文所教导的多肽从其宿主细胞分泌的N末端信号序列的核酸分子。所述N末端信号序列的编码核酸分子可以包含如SEQ ID NO:4中所述的核酸序列。
在实施方案中，如本文所教导的核酸分子可以包含在嵌合基因中，其中所述核酸分子可操作地连接至启动子。因此本发明还涉及包含如本文所教导的核酸分子的嵌合基因。
可以使用适合与如本文所教导的核酸分子连接的本领域已知的任何启动子。合适启动子的非限制性实例包括允许组成型表达或调控型表达、弱表达或强表达等的启动子。可以使用本领域已知的任何方法将如本文所教导的核酸分子包含于嵌合基因。
将如本文所教导的核酸分子可操作地连接至所谓的“组合型启动子”可以是有利的。
或者，将如本文所教导的多核苷酸及其变体可操作地连接至所谓的“诱导型启动子”可以是有利的。诱导型启动子可以为生理学上可调控(例如通过某些化合物的外部施用)的启动子。
如本文所教导的嵌合基因可以包含于“载体”或“核酸构建体”中。因此本发明还涉及包含如本文所教导的嵌合基因或如本文所教导的核酸分子的载体。
在一个方面，本发明涉及经基因修饰以例如在其基因组中包含如本文所教导的核酸分子、如本文所教导的嵌合基因或如本文所教导的载体的宿主细胞。
如本文所教导的经基因修饰的宿主细胞可以用于体外、离体和/或体外在宿主细胞的细胞质内生产如本文所教导的多肽及其变体或将其以任何方式从细胞中释放。特别地，如本文所教导的多肽可以表达为可溶的或分泌的分子。如本文所教导的经基因修饰的宿主细胞可以为适合于转化步骤或基因工程步骤的任何宿主细胞。合适的宿主细胞的非限制性实例包括可培养细胞，例如任何原核细胞或真核细胞。在实施方案中，AMUC-1100多肽在细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。
在实施方式中，如本文所教导的宿主细胞可以为天然表达如本文所教导的多肽或其变体的任意细胞。在该情况下，宿主细胞可以过表达如本文所教导的多肽或其变体。
在另一实施方式中，如本文所教导的宿主细胞可以为非天然表达如本文所教导的多肽或其变体的任意细胞。
在实施方案中，如本文所教导的宿主细胞不属于嗜黏蛋白阿克曼氏菌种。
在另一个实施方式中，宿主细胞可以属于嗜黏蛋白阿克曼氏菌种，并且通常被基因修饰以包含如本文所教导的核酸分子的额外拷贝，或包含如本文所教导的嵌合基因或载体。该嗜黏蛋白阿克曼氏菌细胞可以过表达如本文所教导的Amuc-1100多肽或其变体。
可以使用本领域任何已知的方法对如本文所教导的宿主细胞进行基因修饰。例如，可以通过包括以下步骤的方法对如本文所教导的宿主细胞或生物体进行基因修饰：
a)用如本文所教导的核酸分子转化宿主细胞，核酸分子例如分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含选自以下的核酸序列：在整个长度上与SEQ ID NO:2具有至少50％序列同一性的核酸序列；和能够编码如本文所教导的多肽及其变体的核酸序列；
b)在适合于允许如本文所教导的核酸分子表达和/或产生如本文所教导的多肽及其变体的条件下培养所述宿主细胞；
c)任选地，筛选能够使如本文所教导的核酸分子表达和/或产生如本文所教导的多肽及其变体的宿主细胞。
在优选的实施方案中，如本文所教导的宿主细胞或生物体可以使用如本文所教导的具有SEQ ID NO:2的核酸序列或其变体的核酸分子来转化。
在实施方案中，如本文所教导的经基因修饰的宿主细胞可以属于天然存在或存活于哺乳动物肠黏膜屏障附近或其中的细菌种。所述细菌种通常被称为“肠黏膜相关细菌种”。“肠黏膜相关细菌种”的非限制性实例包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌(ATTC BAA-835)、普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)(A2-165)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)(ATCC 53103)和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)(DSM-20213)。
在一些实施方案中，直接在哺乳动物(例如人类)肠黏膜屏障附近或其中，用如本文所教导的任意多核苷酸及其变体对肠黏膜相关细菌进行基因修饰，例如以表达或过表达如本文所教导的多核苷酸或、以产生或过产生如本文所教导的多肽是有利的。在优选的实施方案中，肠黏膜相关细菌可以为来自于嗜黏蛋白阿克曼氏菌种的任意细菌。可以通过涉及重组DNA技术、基因组编辑的基因修饰工具实现这种过产生，基因组编辑例如通过使用基于CRISPR/cas样系统的工具或通过经典突变选择系统。
在实施方式中，经基因修饰的宿主细胞可以为任何细菌，特别是不来自于天然存在或存活于哺乳动物肠黏膜屏障附近或其中的细菌种的细菌。该细菌的非限制性实例包括任意有益的分离的肠道细菌菌株，例如益生菌，特别地选自乳球菌(Lactococcus)、乳酸菌(Lactobacillus)或双歧杆菌(Bifidobacterium)属的菌株。另外，可以使用严格厌氧的肠道细菌，例如属于已知存在于人类肠道中的属的那些(Rajilic-Stojanovic&de Vos,Thefirst 1000cultured species of the human gastrointestinal microbiota.FEMSMicrobiol Rev.38:996-1047)。
产生多肽的方法
在另一方面，本发明涉及用于产生如本文所教导的多肽、包括变体的方法，其包括以下步骤：
(a)在允许产生如本文所教导的多肽或其变体的条件下培养宿主细胞；和
(b)任选地，分离步骤(a)中所产生的多肽。
在步骤(a)中，本文所教导的宿主细胞可以根据任何已知的培养方法和任何已知培养基进行培养。技术人员将能够选择合适的宿主细胞并能够建立允许多肽产生的合适条件。
或者，可以通过包括以下步骤的方法产生多肽：
(a)在合适的培养基中培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌种的细菌；
(b)任选地，分离步骤(a)中所产生的多肽。
以上方法步骤(a)中所产生的多肽可以通过本领域任何已知方法分离。技术人员将能够从这种培养基中分离产生的多肽。
合适的培养基为例如Derrien等人(2004,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54:1469-76)所教导的。Derrien等人教导嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株MucT被分离并在含有猪胃黏蛋白作为唯一碳源和氮源的基础厌氧培养基上生长。作者还教导嗜黏蛋白阿克曼氏菌可以在富集培养基例如哥伦比亚肉汤(CB)和脑心浸液(BHI)液体培养基上生长，或在具有葡萄糖和高浓度的酪胨和酵母提取物的基础培养基上生长。类似地，Lukovac等人(mBio教导嗜黏蛋白阿克曼氏菌在含有葡萄糖和海藻糖以及大量酪胨的基础培养基中的生长(2014,mBio01438-14)。
筛选细菌的方法
在另一方面，本发明涉及用于检测细菌中存在或不存在如本文所教导的多核苷酸的方法，其包括以下步骤：
(a)提供核酸分子，其在严格条件下能够与具有SEQ ID NO:2的核酸序列或具有在整个长度上与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少50％序列同一性的核酸序列的核酸分子杂交；
(b)检测步骤(a)的核酸分子以识别包含具有SEQ ID NO:2的核酸序列或在整个长度上与核酸序列SEQ ID NO:2具有至少50％序列同一性的核酸序列的细菌。
本公开还涉及用于检测细菌中存在或不存在如本文所教导的多肽或其变体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供抗体，其能够与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽结合；
(b)检测步骤(a)的抗体以识别包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽的细菌。
在实施方案中，步骤(a)的核酸和/或步骤(c)的抗体是被(例如荧光标记、放射性标记等)标记的以便于检测。
组合物
在其他方面，本发明涉及包含如本文所教导的任何多肽的组合物。在优选的实施方式中，多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在其他方面，本发明涉及包含如本文所教导的宿主细胞的组合物。宿主细胞可以以约104至约1015菌落形成单位(CFU)的量存在。例如，宿主细胞的有效量可以为约105CFU至约1014CFU、优选约106CFU至约1013CFU、优选约107CFU至约1012CFU、更优选约108CFU至约1012CFU。宿主细胞可以是可存活的或可以是死的。宿主细胞的效力与如本文所教导的多肽的存在有关。
在实施方案中，如本文所教导的组合物还包含载体例如生理学上可接受的载体或药学上可接受的载体或饮食上可接受的载体或营养学上可接受的载体。载体可以为任意惰性载体。例如合适的生理学上或药学上可接受的载体的非限制性实例包括任何熟知的生理学上或药学上的载体、缓冲剂、稀释剂和赋形剂。应理解的是，合适的生理学上或药学上的载体或饮食载体或营养学上的载体的选择会取决于如本文所教导的组合物的预期施用方式(例如口服)和组合物的预期形式(例如饮料、酸奶、粉末、胶囊等)。本领域技术人员知道如何选择合适的载体，例如生理学上可接受的载体或营养学上可接受的载体或药学上可接受的载体，其适合于本文教导的组合物或与本文教导的组合物相容。
在一个实施方案中，如本文教导的组合物可以是营养或饮食组合物。例如，如本文所教导的组合物可以是食品、食品补充剂、饲料或饲料补充剂，例如乳制品，例如发酵乳制品，如酸奶或酸奶饮料。在这种情况下，组合物可以包含营养学上可接受的或饮食可接受的载体，其可以是合适的食物基质。
在实施方案中，本文教导的组合物可以是药物组合物。药物组合物也可以用作补充剂(例如食品补充剂)。除了本文教导的多肽和/或本文教导的宿主细胞外，本文教导的药物组合物还可以包含药学上、营养学上或饮食或生理学上可接受的载体。优选的形式取决于预期的施用方式和(治疗)应用。载体可以是适合于将如本文所教导的多肽和/或如本文所教导的宿主细胞递送至哺乳动物(例如人类)的胃肠道，优选在哺乳动物的肠黏膜屏障(更优选结肠黏膜屏障)附近或其中的任何相容的、生理学上可接受的无毒物质。例如，可以使用无菌水或惰性固体作为载体，通常补充有药学上可接受的助剂、缓冲剂、分散剂等。
如本文所教导的组合物可以是液体形式，例如，如本文所教导的多肽或如本文所教导的宿主细胞的稳定悬浮液，或固体形式，例如如本文所教导的经冻干的宿主细胞的粉末。在如本文所教导的宿主细胞被冻干的情况下，可以使用冷冻保护剂如乳糖、海藻糖或糖原。对于口服施用，如本文所教导的多肽或如本文所教导的经冻干的宿主细胞可以以固体剂型如胶囊剂、片剂和粉剂或以液体剂型如酏剂、糖浆剂和混悬剂施用。如本文所教导的多肽或如本文所教导的宿主细胞可以与非活性成分和粉末载体如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等一起包封在胶囊例如明胶胶囊中。
在实施方案中，如本文所教导的组合物可以包含一种或更多种成分，其适合于在储存期间和/或在暴露于胆汁期间和/或在通过哺乳动物(例如人)的胃肠道期间，促进如本文所教导的多肽和/或如本文所教导的宿主细胞的存活和/或存活力和/或维持和/或其完整性。这种成分的非限制性实例包括允许通过胃的肠溶包衣和控释剂。本领域技术人员知道如何选择合适的成分以确保活性成分(其是多肽或宿主细胞)到达发挥其作用的预定目的地。
在实施方案中，如本文所教导的组合物可以进一步包含黏膜结合剂或黏膜结合多肽。本文使用的术语“黏膜结合剂”或“黏膜结合多肽”指能够将其自身附着于哺乳动物(例如人类)的肠黏膜屏障的肠黏膜表面的试剂或多肽。
或者，可以使用特定的对接系统将Amuc-1100多肽附着于活的或死的产生Amuc-1100的细胞或者甚至不产生Amuc-1100的细胞。结合可以在C末端或N末端，任何似乎是最有效的，同时还描述了间隔肽的使用。实施例包括使用基于LysM的肽聚糖结合系统(Visweswaran GR等人2014,Appl Microbiol Biotechnol.98:4331-45.)。此外，本领域还公开了多种黏膜结合多肽。黏膜结合多肽的非限制性实例包括细菌毒素膜结合亚单位，其包括例如霍乱病毒的B亚单位、大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素B亚单位、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)毒素B亚单位S2、S3、S4和/或S5、白喉毒素的B片段和志贺毒素或志贺样毒素的膜结合亚单位。其他合适的黏膜结合多肽包括细菌菌毛蛋白，例如包括大肠杆菌(E.coli)菌毛K88、K99、987P、F41、FAIL、CFAIII ICES1，CS2和/或CS3、CFAIIV ICS4、CS5和/或CS6)、P菌毛等。菌毛的非限制性实例包括百日咳博代氏杆菌(Bordetellapertussis)丝状血凝素、霍乱弧菌(vibrio cholerae)毒素共调菌毛(TCP)、甘露糖敏感的血细胞凝集素(MSHA)、海藻糖敏感的血细胞凝集素(PSHA)等。其他黏膜结合试剂包括病毒附着蛋白，其包括流感病毒血细胞凝集素和仙台病毒血细胞凝集素，以及动物外源凝集素或外源凝集素样分子，其包括免疫球蛋白分子或其片段、钙依赖性(C型)外源凝集素、选择蛋白、胶原凝集素或蜗牛血凝素(helix pomatis hemagglutinin)、具有黏膜结合亚单位的植物外源凝集素包括伴刀豆球蛋白A、麦胚凝集素、植物凝集素、相思豆毒素、蓖麻毒蛋白等。这种递送的优点是避免使用活的重组生物体。
虽然不是必需的，但是向如本文所教导的组合物添加一种或更多种黏膜结合剂或黏膜结合多肽可以是有利的，以使如本文所教导的多肽或如本文所教导的宿主细胞靶向肠黏膜屏障。
如本文所教导的组合物可以进一步包含选自益生元、益生菌、碳水化合物、多肽、脂质、维生素、矿物质、药剂、防腐剂、抗生素或其任何组合的成分。
在一个实施方案中，如本文所教导的组合物可以进一步包含一种或更多种成分，其进一步增强如本文所教导的组合物的营养价值和/或治疗价值。例如，加入一种或更多种选自以下的成分(例如营养成分、兽用药剂或药剂等)：蛋白质、氨基酸、酶、矿物盐、维生素(例如盐酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、氯化胆碱、泛酸钙、生物素、叶酸、抗坏血酸、维生素B12、对氨基苯甲酸、维生素A乙酸酯、维生素K、维生素D、维生素E等)、糖类和复合碳水化合物(例如可溶于水和不溶于水的单糖、二糖和多糖)、医药化合物(例如抗生素)、抗氧化剂、微量元素成分(例如钴、铜、锰、铁、锌、锡、镍、铬、钼、碘、氯、硅、钒、硒、钙、镁、钠和钾的化合物等)。技术人员熟悉适合于增强如本文所教导的组合物的营养和/或处理/药用价值的方法和成分。
在实施方案中，宿主细胞可以是冻干形式或微囊化形式(由例如Solanki等人BioMed Res.Int.2013,Article ID 620719综述)或保留宿主细胞(例如细菌菌株)的活性和/或存活力的任何其他形式并入。
治疗方法
在其他方面，本发明还涉及用于治疗和/或预防哺乳动物中的选自以下的病症或病况的方法：肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、2型糖尿病、1型糖尿病、妊娠糖尿病、先兆子痫、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、葡萄糖不耐受、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝疾病、酒精性脂肪肝疾病、高血糖症、肝脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能障碍、过敏症、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化症、神经退行性疾病、抑郁症、与受损屏障功能相关的其他疾病、创伤修复、行为障碍、酒精依赖症、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症和改变肠黏膜屏障的物理完整性的病况例如食物过敏、例如由于婴儿早产、暴露于辐射、化疗和/或毒素导致的肠发育不全、自身免疫疾病、营养不良、败血症等；用于促进哺乳动物减重的方法；用于促进哺乳动物的肠的抗炎活性的方法；用于促进哺乳动物肠黏膜免疫系统功能的方法；用于维持、恢复和/或提高葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态的方法；和用于维持、恢复和/或提高哺乳动物的肠黏膜屏障的物理完整性的方法。该方法包括以下步骤：向有需要的哺乳动物施用有效量的如本文所教导的多肽、如本文所教导的宿主细胞或如本文所教导的组合物。
在一个实施方案中，可以以任何已知施用方法施用如本文所教导的多肽、如本文所教导的宿主细胞或如本文所教导的组合物。例如，如本文所教导的组合物可以口服施用、静脉内施用、局部施用、肠内施用或胃肠外施用。理解施用模式或途径会取决于所处情况(例如对象年龄、期望的作用位置、疾病病况等)以及组合物的预期形式(例如丸剂、液体或粉末等)。
在优选的实施方式中，可以口服施用如本文所教导的多肽、如本文所教导的宿主细胞或如本文所教导的组合物。
用途
在其他方面，本发明涉及如本文所教导的核酸分子、如本文所教导的嵌合基因和/或如本文所教导的载体用于产生如本文所教导的多肽和/或用于产生如本文所教导的宿主细胞的用途。如本文所教导的多肽和/或如本文所教导的宿主细胞可以具有增加的与细胞上TLR2受体相互作用的能力和/或可以具有增加的刺激细胞中TLR2信号转导通路的能力和/或可以具有增加的刺激细胞因子特别是IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α从细胞产生的能力和/或相比于没有用如本文所教导的多核苷酸、嵌合基因或载体进行基因修饰的宿主细胞(例如细菌)，可以具有增加的提高哺乳类动物细胞例如人类细胞的TER的能力。
在其他方面，本发明涉及如本文所教导的多肽、如本文所教导的宿主细胞或如本文所教导的组合物作为药剂的用途；特别用于促进哺乳动物肠黏膜免疫系统功能，或用于维持、恢复和/或提高哺乳动物中肠黏膜屏障的物理完整性；用于维持、恢复和/或提高哺乳动物的葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态；用于预防和/或治疗哺乳动物中的选自以下的病症或病况：肥胖症如饮食诱导的肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、2型糖尿病、1型糖尿病、妊娠糖尿病、先兆子痫、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、葡萄糖不耐受、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝疾病、酒精性脂肪肝疾病、高血糖症、肝脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能障碍、过敏症、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化症、神经退行性疾病、抑郁症、与受损屏障功能相关的其他疾病、创伤修复、行为障碍、酒精依赖症、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症和改变肠黏膜屏障的物理完整性的病况例如食物过敏、例如由于婴儿早产、暴露于辐射、化疗和/或毒素导致的肠发育不全、自身免疫疾病、营养不良、败血症等；用于促进哺乳动物的肠的抗炎活性；或用于促进哺乳动物减重。
在实施方案中，哺乳动物例如人类可以是任何年龄组(婴幼儿、成年或老年)或任何性别(雄性或雌性)。在实施方案中，哺乳动物可以为婴幼儿(例如新生儿、婴儿、儿童等)，特别是早产婴幼儿。
哺乳动物可以为任何哺乳动物，例如人类、非人灵长类、啮齿类、猫、狗、牛、马等。在一个优选的实施方案中，哺乳动物为人类。
通过以下实施例进一步说明但非限制本发明。由上文的叙述和这些实施例，本领域技术人员可以确定该发明的必要特征，并且可以对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用法和条件而不脱离其教导和范围。因此，除了本文所显示和描述的之外，根据前面的描述本发明的各种修改对本领域技术人员会是显而易见的。这种修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
附图说明
图1显示：A)总体重增加(g)(n＝8至10)。B)通过时域-核磁共振测量的总脂肪质量增加(g)(n＝8至10)。C)每日食物摄取。D)血浆VLDL、LDL和HDL胆固醇水平(n＝8至10)。E)血浆葡萄糖(mg·dl-1)曲线和F)在葡萄糖加载后-30至120分钟测量的平均曲线下面积(AUC)(mg.dl-1.min-1；n＝8至10)。G)通过密度计量法测量的对照组和胰岛素刺激的p-IRβ对加载对照的比(n＝3至5)。H和I)通过密度计量法法测量对照组和胰岛素刺激的p-Aktthr308和p-Aktser473对加载对照的比(n＝3至5)。
序列表
SEQ ID NO:1：Amuc-1100多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:2：编码Amuc-1100多肽的核酸序列
SEQ ID NO:3：Amuc-1100多肽的预期N末端信号序列的氨基酸序列
SEQ ID NO:4：Amuc-1100多肽的预期N末端信号序列的核酸序列
实施例
实施例1：经基因修饰以产生Amuc-1100蛋白的细菌的产生。
方法：
将编码成熟Amuc-1100(SEQ ID NO:2的核苷酸序列)的多核苷酸克隆到大肠杆菌(E.coli)TOP10，使C-末端His-Tag在pET28衍生物的可诱导T7启动子的控制下，并引入到大肠杆菌(E.coli)BL23(DE3)用于过产生。为此目的，将ATG起始密码子加入到SEQ ID NO：2的核苷酸序列中，使得所得到的多肽以氨基酸序列MIVNS开始。所有构建体均经Sanger序列分析确认。携带过表达Amuc-1100的构建体导致可溶性Amuc-1100蛋白的过产生，Amuc-1100蛋白通过Ni-柱亲和层析纯化至明显的均一性，并以100至300ug/ml的浓度使用。基本上如前所述，使用纯化的Amuc-1100在兔子中产生抗体(Reunanen J等人2012,Appl EnvironMicrobiol 78:2337-44)。
结果：
结果显示用本发明的多核苷酸(SEQ ID NO:2)转化的大肠杆菌能够产生可溶形式的Amuc-1100蛋白，其能够使用如(Tailford LE等人2015,Nat Commun.6:7624)描述的Ni-柱亲和层析容易地分离。
实施例2：TLR2信号转导通路的相互作用和刺激
方法：
为了测试Amuc-1100结合TLR2和其他TLR受体并随后刺激TLR2和其他TLR信号转导通路的能力，制备了表达TLR2和TLR4受体的报告细胞系。通过测量来自报告细胞的NK-κB的产生，在体外测试了Amuc-1100结合表达TLR2或TLR4的细胞系并随后刺激所述细胞中的TLR2和/或TLR4信号转导通路的能力。
简而言之，使用hTLR2和hTLR4细胞系(Invivogen，CA，USA)。用相应配体刺激受体激活NF-κB和AP-1，其诱导产生分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)，其水平可以通过分光光度计(Spectramax)测量。使所有细胞系在使用补充有4.5g/l D-葡萄糖、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素，100μg/ml Normocin、2mM L-谷氨酰胺和10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS)的维持培养基Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)中生长并传代培养最高至70％至80％融合。对于每种细胞系，通过加入20μl的Amuc-1100悬浮液进行免疫应答实验。将报告细胞与Amuc-1100在37℃、5％的CO2培养箱中孵育20至24小时。受体配体Pam3CSK4(对于hTLR210ng/ml)和LPS-EB(对于hTLR450ng/ml)用作阳性对照，而没有任何选择性抗生素的维持培养基用作阴性对照。通过测量向20μL经诱导的hTLR2和hTLR4上清液中加入180μL的QUANTI-Blue(Invivogen，CA，USA)后15分钟、1小时、2小时和3小时的OD600来检测SEAP分泌。实验进行三次重复。
结果：
结果显示Amuc-1100能够与TLR2相互作用。进一步，结果显示Amuc-1100对于表达TLR2的报告细胞发挥免疫刺激作用，即Amuc-1100能够刺激NF-κB从报告细胞中释放。
实施例3.刺激细胞因子从外周血液单核细胞中释放。
方法：
体外测试了Amuc-1100刺激细胞因子从外周血液单核细胞(PBMC)中产生或释放的能力。简而言之，从荷兰奈梅亨的Sanquin Blood Bank获得三个健康供体的外周血液。根据制造商(Amersham biosciences,乌普萨拉，瑞典)的规程，使用Ficoll-Paque Plus梯度离心法从健康供体血液分离外周血液单核细胞(PBMC)。收集离心的单核细胞之后，在Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)+Glutamax(Invitrogen,布雷达，荷兰)中洗涤，在IMDM+Glutamax，其补充以青霉素(100U/ml)(Invitrogen)、链霉素(100μg/ml)(Invitrogen)和10％加热灭活的FBS(Lonza,巴塞尔,瑞士)中调整至的0.5×106个细胞/ml。将PBMC(0.5×106个细胞/孔)接种于48孔组织培养皿。对每个供体使用阴性对照(仅培养基)。
用(活的或在99℃加热10分钟的)嗜黏蛋白阿克曼氏菌细胞(与PBMC 1:10的比例)或Amuc-1100刺激PBMC 1天，然后使用多重分析(人类炎症CBA试剂盒，Becton和Dickinson)根据制造商的规程在FACS CantoII(Becton Dickinson)上测量培养上清液中的细胞因子IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β和IL-12p70的产生并使用BD FCAP软件(BectonDickinson)分析。根据制造商的检测限度如下：3.6pg/ml IL-8、7.2pg/ml IL-1β、2.5pg/mlIL-6、3.3pg/ml IL-10、3.7pg/ml TNF-α、1.9pg/ml IL-12p70。
结果
结果显示，相比于对照情况(仅培养基)，Amuc-1100能够刺激细胞因子的产生，即观察到增加水平的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α。由4.5μg/ml Amuc-1100诱导的细胞因子水平与活的或加热灭活形式的5×106个细胞的嗜黏蛋白阿克曼氏菌处于相似水平。
表1.由Amuc-1100和活的或加热灭活形式的嗜黏蛋白阿克曼氏菌诱导的细胞因子水平
实施例4：调节跨膜电阻抗(TER)
方法：
通过测量Amuc-1100在体外刺激或增加Caco-2细胞的TER的能力来评估Amuc-1100促进肠上皮细胞层完整性的能力。简言之，将Caco-2细胞(5×104个细胞/插入式培养皿)接种在Millicell插入式细胞培养皿(Millicell cell culture inserts)(3μm孔径；Millipore)中并生长8天。用RPMI 1640将细菌细胞洗涤一次，并在RPMI 1640中以OD600nm为0.25(约108个细胞)应用于插入式培养皿。将纯化的Amuc-1100以0.05μg/ml、0.5μg/ml和5μg/ml的浓度应用于插入式培养皿。加入Amuc-1100后的时间点0小时和24小时，用Millicell ERS-2TER仪(Millipore)从细胞培养物中测定跨膜电阻抗。
结果：
结果显示，在与Caco-2细胞共培养24小时之后，0.05μg/ml的Amuc-1100已经能够以与约108个嗜黏蛋白阿克曼氏菌细胞相似的水平显著增加TER。
实施例5：饮食诱导的代谢功能紊乱的调节
向10-11周龄的C57BL/6J小鼠组(每亚组n＝10)控制饮食(ND)喂养或HF饮食(HFD；60％脂肪和20％碳水化合物(千卡/100g)D12492i,Research Diet,New Brunswick,NJ,USA)，其如之前由Everard等人(2013.PNAS.Vol.110(22):9066-9071)所描述的)喂养。如Lucovac等人(2014,mBio 01438-14)描述的，使嗜黏蛋白阿克曼氏菌MucT在合成培养基(每升去离子水含有0.4g KH2PO4、0.669g Na2HPO4.2H2O、0.3g NH4Cl、0.3g NaCl、0.1gMgCl2.6H2O,10g酪胨、1mM L-苏氨酸、1ml微量矿物质溶液、5mM L-海藻糖和5mM D-葡萄糖)上生长，收集，在含有25％甘油的PBS中配制并在-80℃储存，如Everard等人在先所描述的。接受HFD的小鼠的一个亚组另外每日通过口服灌胃接受悬浮在无菌厌氧PBS中的2×108cfu/0.15ml的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(HFD嗜黏蛋白阿克曼氏菌)——因为其包括10倍稀释的嗜黏蛋白阿克曼氏菌，获得终浓度为2.5％的甘油。如先前Everard等人在先描述的，ND和HFD组每日经口灌胃等体积含有2.5％甘油的无菌厌氧PBS。接受HFD的其他亚组的小鼠另外接受Amuc-1100肽，其通过每日口服灌胃在等体积的含有2.5％甘油的无菌PBS中的3.1μg蛋白质Amuc_1100来递送。当与活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌细菌相比时，用Amuc-1100处理HFD喂养的小鼠，导致相似或更显著的体重降低和脂肪质量增加(图1A和图1B)，不影响进食(图1C)。用嗜黏蛋白阿克曼氏菌或Amuc-1100的处理还修正了HFD诱导的高胆固醇血症，血清HDL胆固醇显著降低，对于LDL胆固醇具有类似趋势(图1D)。
明显地，当与未经处理的HFD喂养的小鼠相比时，用Amuc-1100的处理导致血清甘油三酯的显著降低。此外，Amuc-1100处理还使HFD喂养的小鼠中的脂肪细胞平均直径从38微米降低至29微米，在未经处理的小鼠中发现类似直径(27微米)。
令人感兴趣的是，Amuc-1100的施用减轻葡萄糖耐受不良，与存活的细菌具有相同功效(图1E至图1F)。
为进一步研究葡萄糖代谢，我们通过在门静脉注射胰岛素研究了胰岛素敏感性。我们分析了胰岛素受体(IR)和其在肝脏中的下游介导物Akt在苏氨酸(Aktthr)和丝氨酸(Aktser)位点的胰岛素诱导的磷酸化作用(图1G)。当与喂养对照食物的小鼠相比时，HFD的施用导致所有蛋白质降低的磷酸化作用，在Aktthr情况下达到显著(图1H)。用活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌或Amuc-1100处理抵消了这些作用，与未处理的HFD喂养的小鼠相比时，用Amuc-1100处理的小鼠中的p-IR和p-Aktthr水平显著更高(图1G至图1H)，用活细菌处理的小鼠中p-Aktser水平显著更高(图1I)。

Claims (13)

1.一种组合物，其包含分离的多肽和药学上或饮食上可接受的载体，所述多肽包含SEQID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
2.根据权利要求1所述的组合物，其为营养组合物或药物组合物。
3.一种经基因修饰的宿主细胞，其中其基因组中引入了选自以下的核酸分子：
(a)包含在整个长度上与SEQ ID NO:2具有至少50％序列同一性的核酸序列的核酸分子；和
(b)包含编码以下多肽的核酸序列的核酸分子：所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
4.一种经基因修饰的宿主细胞，所述宿主细胞不是嗜黏蛋白阿克曼氏菌种，其包含选自以下的核酸分子：
(a)包含在整个长度上与SEQ ID NO:2具有至少50％序列同一性的核酸序列的核酸分子；和
(b)包含编码以下多肽的核酸序列的核酸分子：所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
5.一种经基因修饰的宿主细胞，所述宿主细胞是嗜黏蛋白阿克曼氏菌种，其中其基因组中引入了选自以下的核酸分子：
(a)包含在整个长度上与SEQ ID NO:2具有至少50％序列同一性的核酸序列的核酸分子；和
(b)包含编码以下多肽的核酸序列的核酸分子：所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
6.一种产生包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列的多肽的方法，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，所述方法包括以下步骤：
(a)在允许产生所述多肽的条件下，培养根据权利要求3至5中任一项所述的宿主细胞；和
(b)任选地，分离步骤(a)中所产生的多肽。
7.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽、根据权利要求3至5中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其是用作药物的，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
8.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽、根据权利要求3至5中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其是在哺乳动物中用于促进肠黏膜免疫系统功能，用于维持、恢复或提高葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，或用于维持、恢复和/或提高肠黏膜屏障的物理完整性的，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
9.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽、根据权利要求3至5中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其是用于在哺乳动物中预防和/或治疗选自以下的病症的：肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关疾病、2型糖尿病、1型糖尿病、妊娠糖尿病、先兆子痫、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、葡萄糖不耐受、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝疾病、酒精性脂肪肝疾病、高血糖症、肝脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能障碍、过敏症、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化症、神经退行性疾病、抑郁症、与受损屏障功能相关的其他疾病、创伤修复、行为障碍、酒精依赖症、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症和改变肠黏膜屏障的物理完整性的病况例如食物过敏、例如由于婴儿早产、暴露于辐射、化疗和/或毒素导致的肠发育不全、自身免疫疾病、营养不良、败血症等，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
10.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽、根据权利要求3至5中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其是用于促进哺乳动物肠抗炎活性的，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
11.包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的多肽、根据权利要求3至5中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其是用于促进哺乳动物减重的，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态。
12.一种用于在哺乳动物中治疗和/或预防的选自以下的病症：肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抗性相关病症、2型糖尿病、1型糖尿病、妊娠糖尿病、先兆子痫、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、葡萄糖不耐受、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝疾病、酒精性脂肪肝疾病、高血糖症、肝脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能障碍、过敏症、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化症、神经退行性疾病、抑郁症、与受损屏障功能相关的其他疾病、创伤修复、行为障碍、酒精依赖症、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症和改变肠黏膜屏障的物理完整性的病况例如食物过敏、例如由于婴儿早产、暴露于辐射、化疗和/或毒素导致的肠发育不全、自身免疫疾病、营养不良、败血症等，用于促进哺乳动物减重，用于促进哺乳动物的肠的抗炎活性，用于促进哺乳动物肠黏膜免疫系统功能，用于维持、恢复和/或提高葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，或用于维持、恢复和/或提高哺乳动物的肠黏膜屏障的物理完整性的方法，其包括以下步骤：向有需要的哺乳动物施用有效量的多肽、根据权利要求3至5中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能。
13.一种产生包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或在整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列的多肽的方法，所述多肽能够作用于免疫信号转导和/或影响肠屏障功能和/或影响葡萄糖和/或胆固醇和/或甘油三酯体内稳态，所述方法包括以下步骤：
(a)在合适的培养基中培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌种的细菌；和
(b)任选地，分离步骤(a)中所产生的多肽。
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