ES2934138T3

ES2934138T3 - Uso de un polipéptido para efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o modular el estado metabólico

Info

Publication number: ES2934138T3
Application number: ES16724321T
Authority: ES
Inventors: Clara Belzer; Vos Willem Meindert De; Patrice Daniel Cani
Original assignee: Universite Catholique de Louvain UCL; Wageningen Universiteit
Current assignee: Universite Catholique de Louvain UCL; Wageningen Universiteit
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2016-05-04
Publication date: 2023-02-17
Anticipated expiration: 2036-05-04
Also published as: AU2020267210B2; AU2020267210A1; CN107980043A; JP6894382B2; US20210147489A1; KR20180011130A; EP3292135A1; US11466057B2; US10738089B2; MX2017014111A; WO2016177797A1; BR112017023751A2; US20180265554A1; CA2984985A1; HK1252412A1; CN107980043B; EA201700507A1; PL3292135T3; IL255405A0; AU2016257315A1

Abstract

Se ha encontrado que un polipéptido extracelular derivado de Akkermansia municiphila es capaz de modular y/o promover la función del sistema inmunológico de la mucosa intestinal y/o mantener y/o restaurar el estado metabólico y/o aumentar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal en un mamífero. . El polipéptido o las células huésped que comprenden tal polipéptido pueden emplearse para prevenir y/o tratar una variedad de condiciones que se benefician de una mayor integridad física de la barrera de la mucosa intestinal y/o una función mejorada del sistema inmunitario de la mucosa intestinal y el estado metabólico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de un polipéptido para efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o modular el estado metabólico

Campo de la invención

La invención se refiere a los campos del sistema inmunitario de la mucosa intestinal, la barrera de la mucosa intestinal, las composiciones farmacéuticas, alimenticias o de piensos que comprenden polipéptidos y/o células huésped, que son capaces de modular y/o promover la función del sistema inmunitario de la mucosa intestinal y/o mantener y/o o restablecer y/o aumentar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal, y/o mantener, restablecer o mejorar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos en un mamífero (por ejemplo, un ser humano). Más específicamente, la presente invención proporciona composiciones que comprenden el polipéptido Amuc-1100 o variantes del mismo. Se ha encontrado que Amuc-1100 es capaz de interactuar con el receptor 2 tipo toll (TLR2) y/o modular TLR2 y/o la ruta de señalización dependiente de NF ^k -B, y/o promover la liberación de citocinas (por ejemplo, IL-6, IL-8 e IL-10) de células inmunitarias ubicadas en las proximidades de la barrera de la mucosa intestinal de un mamífero (por ejemplo, ser humano), y/o es capaz de mantener, restablecer o aumentar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal y/o de mantener, restablecer o mejorar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos en un mamífero y/o es capaz de mejorar el estado metabólico o inmunitario de un mamífero. El polipéptido Amuc-1100 puede usarse para prevenir o tratar una variedad de enfermedades o afecciones tal como se establece en el presente documento.

Antecedentes de la invención

Se cree que el aumento de la permeabilidad o hiperpermeabilidad de la barrera de la mucosa intestinal desempeña un papel en varios trastornos y afecciones, tales como enfermedades relacionadas con el intestino, enfermedades autoinmunitarias, alergias, cánceres, diabetes tipo 2, obesidad, depresión, ansiedad y muchas otras. Por este motivo, ha habido un mayor interés en comprender el papel de la disfunción de la barrera de la mucosa intestinal en la patogenia de muchas afecciones que atacan el tracto gastrointestinal (GI) en los mamíferos.

En condiciones normales, la barrera de la mucosa intestinal actúa como una barrera selectiva que permite la absorción de nutrientes, electrolitos y agua y evita la exposición a macromoléculas, microorganismos, antígenos dietéticos y microbianos perjudiciales (por ejemplo, alérgenos alimentarios). La barrera de la mucosa intestinal se compone esencialmente de una capa de moco y una capa subyacente de células epiteliales (denominadas en el presente documento “células epiteliales intestinales”). Las células epiteliales intestinales están estrechamente unidas entre sí por las denominadas “uniones estrechas”, que son básicamente “uniones físicas” entre las membranas de dos células epiteliales intestinales. El mantenimiento de la barrera de la mucosa intestinal, en particular el mantenimiento de la integridad física de la capa de células epiteliales intestinales (es decir, mantener las uniones entre las células herméticas), es crucial para la protección del huésped contra la migración de microorganismos patógenos, antígenos y otros organismos indeseables desde el intestino hasta el torrente sanguíneo.

La barrera de la mucosa intestinal también está fuertemente colonizada por aproximadamente 1012 -1014 microorganismos comensales, principalmente bacterias anaerobias o microaerófilas, la mayoría de las cuales viven en simbiosis con su huésped. Estas bacterias son beneficiosas para su huésped de muchas maneras. Brindan protección contra las bacterias patógenas y cumplen una función nutricional en su huésped al sintetizar la vitamina K y algunos de los componentes del complejo de vitamina B. Además, la barrera de la mucosa intestinal ha desarrollado un “sistema inmunitario de la mucosa intestinal” complejo para distinguir entre bacterias comensales (es decir, bacterias beneficiosas) y bacterias patógenas y otros agentes perjudiciales. El sistema inmunitario de la mucosa intestinal es una parte integral de la barrera de la mucosa intestinal y comprende tejidos linfoides y células inmunitarias especializadas (es decir, linfocitos y células plasmáticas), que se encuentran ampliamente dispersas por toda la barrera de la mucosa intestinal. Uno de los microorganismos que coloniza naturalmente la mucosa de sujetos sanos es el degradador de mucina Akkermansia muciniphila, que se ha demostrado que aumenta la función de la barrera intestinal (Everard et al., PNAS 110 (2013) 9066-71; Reunanen et al., Appl Environ Microbiol 20 de marzo de 2015) y, por tanto, afectar las enfermedades asociadas con el deterioro de la función de la barrera intestinal. El genoma de Akkermansia mudniphila fue investigado por Van Passel et al. en 2008 (Plos UNO 6(3):e16876).

En determinadas circunstancias, la barrera de la mucosa intestinal puede ser vulnerable a una amplia variedad de organismos o agentes infecciosos, que normalmente no pueden atravesar la barrera de la mucosa intestinal pero, sin embargo, logran cruzarla (por ejemplo, a través de huecos que resultan de uniones estrechas sueltas entre células del epitelio intestinal). Los organismos u otros agentes que cruzan la barrera de la mucosa intestinal pueden causar enfermedades u otras afecciones indeseables (por ejemplo, alergias) en el huésped. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen obesidad, síndrome metabólico, deficiencia de insulina o trastornos relacionados con la resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome del intestino irritable (SII), intolerancia a la glucosa, metabolismo anómalo de lípidos, aterosclerosis, hipertensión, patología cardiaca, ictus, enfermedad del hígado graso no alcohólico, enfermedad del hígado graso alcohólico, hiperglucemia, esteatosis hepática, dislipidemias, disfunción del sistema inmunitario asociada a la obesidad (aumento de peso), alergia, asma, autismo, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, enfermedades neurodegenerativas, depresión, otras enfermedades relacionadas con la función de barrera comprometida, cicatrización de heridas, trastornos del comportamiento, dependencia del alcohol, enfermedades cardiovasculares, colesterol alto, triglicéridos elevados, aterosclerosis, apnea del sueño, osteoartritis, enfermedad de la vesícula biliar y cáncer. Más particularmente, en relación con la obesidad y la diabetes tipo 2, se ha sugerido la investigación de la microbiota intestinal como diana terapéutica (Everard et al. 2013, Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 27(1):73-83).

Por el contrario, enfermedades tales como las mencionadas anteriormente, así como otras afecciones tales como alergias alimentarias, inmadurez del intestino, por ejemplo, debido al nacimiento prematuro de un bebé, exposición a radiación, quimioterapia y/o toxinas, trastornos autoinmunitarios, desnutrición, septicemia, y similares, pueden alterar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal (es decir, provocar el aflojamiento de las uniones estrechas entre las células epiteliales del intestino), lo que a su vez puede permitir que microorganismos indeseables u otros agentes atraviesen la barrera de la mucosa intestinal del huésped.

A lo largo de los años se han desarrollado varias vacunas y/o anticuerpos dirigidos contra tales microorganismos o agentes. Sin embargo, el éxito de tal enfoque se ve mitigado ya que varios microorganismos o agentes no pueden ser atacados o erradicados de manera efectiva con vacunas o anticuerpos.

También se han explorado otros enfoques, que tienen como objetivo evitar que los microorganismos perjudiciales y otros agentes crucen la barrera de la mucosa intestinal del huésped en primer lugar y/o tienen como objetivo evitar la hiperpermeabilidad de la barrera de la mucosa intestinal. Por ejemplo, se han desarrollado composiciones que comprenden ácido glutámico para prevenir y/o tratar afecciones asociadas con la hiperpermeabilidad de la barrera de la mucosa intestinal (documento WO 01/58283). También se han usado con el mismo fin otras sustancias, incluyendo espermina y espermidina y precursores de las mismas (Dorhout et al. (1997). British J. Nutrition, páginas 639-654). También se han desarrollado preparaciones que comprenden arabinoxilano para promover efectos beneficiosos sobre las bacterias GI que viven en las proximidades de la barrera de la mucosa intestinal, con el fin de modular la barrera de la mucosa intestinal (documento US2012/0230955). El documento WO2006101244 sugiere el tratamiento de trastornos de origen mucoso con compuestos de prostaglandinas que inducen un cambio en la unión estrecha que resulta en la recuperación de la función de barrera de la mucosa. Un objeto de la presente invención es proporcionar agentes y/o composiciones que comprenden dichos agentes, que son adecuados para mantener y/o restablecer y/o aumentar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal y/o prevenir la hiperpermeabilidad de la barrera de la mucosa intestinal en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), y/o para mantener y/o restablecer y/o mejorar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos en un mamífero, y preferiblemente de ese modo prevenir o tratar enfermedades o afecciones que están asociadas con una permeabilidad subóptima de la barrera de la mucosa intestinal y/o desequilibrio de la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos en dicho mamífero. Alternativa o adicionalmente, un objeto de la presente invención es proporcionar agentes y/o composiciones que comprenden tales agentes, que son adecuados para modular y/o promover la función del sistema inmunitario de la mucosa intestinal en un mamífero.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, y un portador farmacéuticamente aceptable o aceptable desde el punto de vista alimentario.

La composición puede ser una composición nutricional o una composición farmacéutica.

La invención también se refiere a una célula huésped genéticamente modificada en la que una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 en toda su longitud que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos; y b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, se introduce en su genoma.

Además, la invención se refiere a dicha célula huésped genéticamente modificada, no siendo dicha célula huésped de la especie Akkermansia muciniphila, que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEQ Id NO: 2 en toda su longitud que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la glucosa y/o homeostasis de colesterol y/o triglicéridos; y b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos.

La invención proporciona además una célula huésped genéticamente modificada, siendo dicha célula huésped de la especie Akkermansia muciniphila, en la que una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 en toda su longitud y que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos; y b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, se introduce en su genoma.

La invención se refiere además a un método para producir un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, que comprende las etapas de: a) cultivar una célula huésped tal como se describió anteriormente en condiciones que permitan la producción de dicho polipéptido; y b) aislar el polipéptido producido en la etapa (a).

La invención proporciona además un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, una célula huésped tal como se enseña en el presente documento, o una composición tal como se enseña en el presente documento, para su uso como medicamento, particularmente para su uso para promover la función del sistema inmunitario de la mucosa intestinal, para mantener, restablecer y/o mejorar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, o para mantener, restablecer y/o aumentar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal en un mamífero.

Dicho polipéptido, composición o célula huésped puede usarse para prevenir y/o tratar un trastorno seleccionado del grupo que consiste en obesidad, síndrome metabólico, trastornos relacionados con la deficiencia de insulina o la resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes gestacional, preeclampsia, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome del intestino irritable (SII), intolerancia a la glucosa, metabolismo anómalo de los lípidos, hiperglucemia, dislipidemias, disfunción del sistema inmunitario asociada con la obesidad (aumento de peso), colesterol alto, triglicéridos elevados y afecciones que alteran la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal, tales como alergias alimentarias, inmadurez del intestino, por ejemplo, debido al nacimiento prematuro de un bebé, exposición a radiación, quimioterapia y/o toxinas, trastornos autoinmunitarios, desnutrición, septicemia en un mamífero.

Alternativa o adicionalmente, dicho polipéptido, célula huésped o composición puede usarse para promover la pérdida de peso en un mamífero.

Definiciones generales

En el contexto de la presente invención, el término “polipéptido” es equivalente al término “proteína”. Un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos particular. Una “variante” del polipéptido de la presente invención tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de la invención se aísla cuando ya no está en su entorno natural, es decir, cuando ya no está presente en el contexto de las fimbrias y/o ya no está presente en el contexto de una célula, tales como una célula de Akkermansia mudniphila.

El término “ identidad de secuencia” o “similitud de secuencia” tal como se usa en el presente documento se refiere a una situación en la que una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos tiene identidad de secuencia o similitud de secuencia con otra secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de referencia. La “identidad de secuencia” o la “similitud de secuencia” pueden determinarse mediante la alineación de dos polipéptidos o dos secuencias de nucleótidos usando algoritmos de alineación globales o locales. Las secuencias pueden entonces denominarse “sustancialmente idénticas” o “esencialmente similares” cuando comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (tal como se define a continuación) (cuando se alinean de manera óptima, por ejemplo, mediante los programas GAP o BESTFIT usando parámetros predeterminados). GAP usa el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizando la cantidad de coincidencias y minimizando la cantidad de espacios. Generalmente, se usan los parámetros predeterminados de GAP, con una penalización por creación de espacio = 50 (nucleótidos)/8 (proteínas) y una penalización por extensión de espacio = 3 (nucleótidos)/2 (proteínas). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación predeterminada usada es nwsgapdna y para las proteínas, la matriz de puntuación predeterminada es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Las alineaciones de secuencias y las puntuaciones para el porcentaje de identidad de secuencia pueden determinarse mediante programas informáticos, como GCG Wisconsin Package, versión 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 EE.UU., o EmbossWin versión 2.10.0 (usando el programa “needle”). Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad puede determinarse buscando en bases de datos, usando algoritmos tales como FASTA, BLAST, etc. Preferiblemente, la identidad de secuencia se refiere a la identidad de secuencia en toda la longitud de la secuencia.

La “resistencia transepitelial” (abreviada como TER) es una medida de la permeabilidad de una capa de células epiteliales in vitro. El aumento de la permeabilidad epitelial se ha relacionado con el debilitamiento de las uniones estrechas y con la disminución de TER.

El término “gen quimérico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier gen que no se produce de manera natural, es decir, un gen que normalmente no se encuentra en la naturaleza en una especie, en particular un gen en el que una o más partes de la secuencia de ácido nucleico no están asociados entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o la totalidad de la región transcrita o con otra región reguladora. Se entiende que el término “gen quimérico” incluye constructos de expresión en los que un promotor heterólogo o una secuencia reguladora de la transcripción se une operativamente a una o más secuencias codificantes y, opcionalmente, a una región 3' no traducida (3'-UTR). Alternativamente, un gen quimérico puede comprender un promotor, una secuencia codificante y, opcionalmente, una secuencia derivada de 3'-UTR de la misma especie, pero que no se producen de manera natural en esta combinación.

El término “célula huésped genéticamente modificada” tal como se usa en el presente documento se refiere a células que han sido genéticamente modificadas, por ejemplo, mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico exógena (por ejemplo, SEQ ID NO:2 tal como se enseña en el presente documento) o mediante la alteración específica de una secuencia génica endógena. Tales células pueden haber sido genéticamente modificadas mediante la introducción de, por ejemplo, una o más mutaciones, inserciones y/o deleciones en el gen endógeno y/o inserción de un constructo genético (por ejemplo, vector o gen quimérico) en el genoma. Las células huésped genéticamente modificadas pueden referirse a células aisladas o en cultivo. Las células genéticamente modificadas pueden ser “células transducidas”, en las que las células se han infectado, por ejemplo, con un virus modificado, por ejemplo, puede usarse un retrovirus, pero también pueden contemplarse otros virus adecuados, tales como lentivirus. También pueden usarse métodos no virales, tales como transfecciones. Las células huésped genéticamente modificadas también pueden ser “células transfectadas de manera estable” o “células transfectadas de manera transitoria”. La transfección se refiere a métodos no virales para transferir ADN (o ARN) a células de modo que se exprese un gen. Los métodos de transfección son ampliamente conocidos en la técnica, tales como la transfección con fosfato de calcio, la transfección con PEG y la transfección con liposomas o lipoplejos de ácidos nucleicos, y similares. Una transfección de este tipo puede ser transitoria, pero también puede ser una transfección estable, en la que pueden seleccionarse células que han integrado el constructo génico en su genoma.

El término “cantidad eficaz” tal como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad necesaria para lograr un efecto tal como se enseña en el presente documento. Por ejemplo, una cantidad eficaz del polipéptido o célula huésped genéticamente modificada tal como se enseña en el presente documento, es una cantidad que es útil de manera efectiva para modular y/o promover la función del sistema inmunitario de la mucosa intestinal y/o mantener y/o restablecer y/o aumentar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal (por ejemplo, promover la formación de uniones más estrechas entre las células del epitelio intestinal), y/o para modular y/o estimular la ruta de señalización del receptor tipo toll (es decir, la ruta de TLR2) en una célula inmunitaria y/o para aumentar la producción de citocinas (por ejemplo, IL-6, IL-8 e IL-10) en una célula inmunitaria y/o para prevenir y/o tratar trastornos o afecciones tales como obesidad, síndrome metabólico, trastornos relacionados con la deficiencia de insulina o resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome del intestino irritable (SII), intolerancia a la glucosa, metabolismo anómalo de los lípidos, aterosclerosis, hipertensión, patología cardiaca, accidente cerebrovascular, enfermedad del hígado graso no alcohólico, enfermedad del hígado graso alcohólico, hiperglucemia, esteatosis hepática, dislipidemias, disfunción del sistema inmunitario asociada a la obesidad (aumento de peso), alergia, asma, autismo, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, enfermedades neurodegenerativas, depresión, otras enfermedades relacionadas con función de barrera, cicatrización de heridas, trastornos del comportamiento, dependencia del alcohol, enfermedades cardiovasculares, colesterol alto, triglicéridos elevados, aterosclerosis, apnea del sueño, osteoartritis, enfermedad de la vesícula biliar, cáncer y afecciones que alteran la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal, tales como alergias alimentarias, inmadurez del intestino, por ejemplo, debido al nacimiento prematuro de un bebé, exposición a radiación, quimioterapia y/o toxinas, trastornos autoinmunitarios, desnutrición, septicemia y similares.

El término “portador fisiológicamente aceptable” o “portador aceptable desde el punto de vista alimentario”, “portador nutricionalmente aceptable” o “portador farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un portador fisiológicamente aceptable o aceptable desde el punto de vista alimentario o un material portador nutricionalmente aceptable o farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, involucrado en proporcionar una forma de administración del polipéptido o célula huésped de la invención. Cada portador debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la composición y no perjudicial para el sujeto, es decir, que sea adecuado para el consumo o nutricionalmente aceptable. El término “adecuado para el consumo” o “nutricionalmente aceptable” se refiere a componentes o sustancias que generalmente se consideran seguras para el consumo humano (así como para otros mamíferos). Los ejemplos no limitativos de materiales que pueden servir como portadores fisiológicamente aceptables o nutricionalmente aceptables o farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) polvo de tragacanto; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones de tampón fosfato; (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas y similares. Además, los términos “nutricionalmente aceptable” y “farmacéuticamente aceptable” tal como se usan en el presente documento se refieren a aquellas composiciones o combinaciones de agentes, materiales o composiciones, y/o sus formas de dosificación, que están dentro del alcance del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

El término “homeostasis” se refiere a la propiedad de un sistema en el que las variables se regulan de modo que las condiciones internas permanezcan estables y relativamente constantes. Todos los animales regulan su concentración de glucosa en sangre. La regulación de la glucosa en el cuerpo es un proceso de mantener el cuerpo en “homeostasis de la glucosa”. Los mamíferos regulan su glucosa en sangre con diferentes hormonas (por ejemplo, insulina, glucagón, péptido similar al glucagón 1, catecolaminas y muchas otras) y diferentes rutas nerviosas (por ejemplo, retransmisión nerviosa, eje intestino a cerebro a órganos periféricos). El cuerpo humano mantiene los niveles de glucosa constantes la mayor parte del día, incluso después de un ayuno de 24 horas. Incluso durante largos periodos de ayuno, los niveles de glucosa se reducen muy poco. La insulina, secretada por las células beta del páncreas, transporta eficazmente la glucosa a las células del cuerpo indicándoles que conserven más glucosa para su propio uso. Si la glucosa dentro de las células es alta, las células la convertirán en glucógeno insoluble para evitar que la glucosa soluble interfiera con el metabolismo celular. En última instancia, esto reduce los niveles de glucosa en sangre y la insulina ayuda a prevenir la hiperglucemia. Cuando la insulina es deficiente o las células se vuelven resistentes a ella, se produce la diabetes. El glucagón, secretado por las células alfa del páncreas, estimula a las células a descomponer el glucógeno almacenado o convertir las fuentes de carbono que no son hidratos de carbono en glucosa a través de la gluconeogénesis, lo que previene la hipoglucemia. Muchos otros factores y hormonas están involucrados en el control del metabolismo de la glucosa (por ejemplo, péptido similar al glucagón 1, catecolamina y muchos otros). Diferentes mecanismos que involucran rutas nerviosas también están contribuyendo a esta compleja regulación.

La “homeostasis del colesterol” es un mecanismo que contribuye al proceso de mantener un estado interno equilibrado del colesterol dentro de un organismo vivo. El colesterol, una molécula biológica esencial en el sistema del cuerpo humano, realiza diversas funciones fisiológicas, tales como actuar como precursor para la producción de ácidos biliares, vitamina D y hormonas esteroides. También funciona como un elemento estructural crítico en la membrana celular de cada célula presente en el cuerpo. A pesar de las funciones beneficiosas y necesarias del colesterol, una alteración en la homeostasis del colesterol puede provocar un mayor riesgo de enfermedad cardíaca, así como alterar otros sistemas de retroalimentación homeostática asociados con el metabolismo del colesterol. El órgano más conspicuo que controla la homeostasis del colesterol es el hígado porque no sólo biosintetiza el colesterol liberado en el sistema circulatorio, sino que descompone el colesterol potencialmente dañino que flota libremente en el torrente sanguíneo. Las HDL son beneficiosas para mantener la homeostasis del colesterol porque recogen y devuelven colesterol potencialmente peligroso directamente al hígado, donde se sintetiza en ácidos biliares inofensivos usados por el sistema digestivo. Las LDL funcionan de manera menos beneficiosa porque tienden a depositar su colesterol en las células del cuerpo y en las paredes arteriales. Se ha demostrado que los niveles excesivos de LDL aumentan el riesgo de enfermedad cardiovascular. En sujetos sanos, la homeostasis del colesterol está estrechamente regulada por circuitos de retroalimentación complejos. En este caso, si el sujeto sano ingiere grandes cantidades de colesterol en la dieta, la biosíntesis en el hígado se reduce considerablemente para mantener el equilibrio. En un sujeto sano que tiene un nivel basal de LDL alto, o bien por años de mala alimentación o bien por otras afecciones genéticas o médicas, el ciclo de retroalimentación y el mecanismo sistémico de afrontamiento pueden verse abrumados por la misma ingesta copiosa, lo que provoca un peligroso desequilibrio homeostático.

La “homeostasis de triglicéridos” es un mecanismo que contribuye al proceso de mantener un estado interno equilibrado de triglicéridos dentro de un organismo vivo. El metabolismo de los triglicéridos tiene una gran relevancia clínica. La hipertrigliceridemia denota niveles altos (hiper) en sangre o suero (-emia) de triglicéridos, las moléculas grasas más abundantes. Los niveles elevados de triglicéridos están asociados con la aterosclerosis, incluso en ausencia de hipercolesterolemia (niveles altos de colesterol), y predisponen a la enfermedad cardiovascular. Los niveles altos de triglicéridos también aumentan el riesgo de pancreatitis aguda. Además, las elevaciones y los aumentos en los niveles de TG con el tiempo aumentan el riesgo de desarrollar diabetes. Se ha demostrado que la resistencia a la insulina está asociada con niveles elevados de triglicéridos (TG).

El término “aproximadamente”, tal como se usa en el presente documento, indica un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. El término “aproximadamente” puede entenderse que abarca valores que se desvían como máximo un 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% o 0,01% del valor indicado.

Los términos “que comprende” o “comprender” y sus conjugaciones, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una situación en la que dichos términos se usan en su sentido no limitativo para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos que no se mencionan específicamente no están excluidos. También abarca el verbo más limitativo “consistir esencialmente en” y “consistir en”.

La referencia a un elemento por el artículo indefinido “un” o “una” no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. El artículo indefinido “un” o “una” generalmente significa “al menos uno”.

Descripción detallada

Los inventores han encontrado que el polipéptido Amuc-1100, o variantes del mismo tal como se enseña en el presente documento, son capaces de modular y/o promover la función del sistema inmunitario intestinal y/o mantener y/o restablecer y/o aumentar la integridad física de la mucosa intestinal. barrera, y/o de mantener y/o restablecer y/o mejorar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos en un mamífero (por ejemplo, un ser humano). Los inventores también encontraron que este polipéptido está presente fuera de las células codificadas por Akkermansia mudniphila apoyando su papel en la señalización.

Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que tales efectos beneficiosos resultan de la capacidad de los polipéptidos de la invención para interactuar con la ruta de señalización de TLR2 presente en la superficie de las células inmunitarias ubicadas en las proximidades de la barrera mucosa intestinal de un mamífero. Más específicamente, los presentes inventores descubrieron que los polipéptidos tal como se enseñan en el presente documento son capaces de interactuar con TLR2 presente en la superficie de una célula inmunitaria y/o de modular y/o estimular la ruta de señalización de TLR2 en una célula inmunitaria situada en vecindad de la barrera de la mucosa intestinal, para estimular la secreción de citocinas (por ejemplo, IL-6, IL-8 e IL-10) de dichas células inmunitarias.

Además, los presentes inventores descubrieron que los polipéptidos, incluyendo sus variantes, tal como se enseña en el presente documento, son capaces de modular y/o aumentar la resistencia transepitelial de la barrera de la mucosa intestinal de un mamífero. Dado que la medición de la resistencia transepitelial aumentada sirve como índice de la disminución de la permeabilidad de la barrera de la mucosa intestinal, se cree que los polipéptidos, incluyendo sus variantes, tal como se enseña en el presente documento, son capaces de modular la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal, particularmente a nivel de las uniones estrechas entre las células epiteliales.

Combinados, se cree que estos efectos dan como resultado una función del sistema inmunitario de la mucosa intestinal mejorada o aumentada (por ejemplo, una mayor liberación de citocinas en la barrera de la mucosa intestinal), así como una integridad física mejorada o aumentada de la barrera de la mucosa intestinal, la conexión entre las células epiteliales intestinales (es decir, a través de uniones más estrechas entre las células).

Además, se encontró que el tratamiento de ratones alimentados con HFD con Amuc-1100 provocó una disminución importante en el peso corporal y aumento de masa grasa sin afectar la ingesta de alimentos. El tratamiento con Amuc-1100 también corrigió la hipercolesterolemia inducida por HFD, con una disminución significativa en el colesterol HDL sérico y una tendencia similar para el colesterol LDL. Además, la administración de Amuc-1100 redujo la intolerancia a la glucosa con la misma potencia que la bacteria Akkermansia muciniphila.

Finalmente, se sabe que la metformina estimula el crecimiento de Akkermansia (Lee H y Ko G, A ppl Environ Microbiol. Octubre de 2014; 80 (19): 5935-43) y, por tanto, es probable que Akkermansia y sus péptidos extracelulares, tales como Amuc-1100, pueden tener un efecto similar al de la metformina en la diabetes gestacional y la preeclampsia (Syngelaki et al. N Engl J Med. 4 de febrero de 2016; 374 (5): 434-43).

Polipéptidos

La presente divulgación enseña un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda la longitud, siendo dicho polipéptido ser capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol. El polipéptido enseñado en el presente documento puede ser capaz de unirse al receptor 2 tipo toll (TLR2).

En una realización, los polipéptidos y variantes de los mismos, tal como se enseña en el presente documento, son capaces de estimular la ruta de señalización de TLR2 en una célula, estimulando la liberación de citocinas de una célula (por ejemplo, IL-6, IL-8, IL-10 y similares) y/o aumentar la resistencia transepitelial (TER) de células de mamífero, por ejemplo, ser humano, y/o mejorar el estado metabólico o inmunitario de un mamífero, por ejemplo, ratón o ser humano.

El polipéptido enseñado en el presente documento también puede denominarse “proteína Amuc-1100” o “polipéptido Amuc-1100”. Debe entenderse que el término “proteína Amuc-1100” o “polipéptido Amuc-1100” o “polipéptido tal como se enseña en el presente documento” también incluye variantes de la proteína Amuc-1100 que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, el secuencias de aminoácidos de dichas variantes que tienen más del 95%, preferiblemente más del 96%, preferiblemente más del 97%, preferiblemente más del 98% y preferiblemente más del 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos. Las variantes del polipéptido Amuc-1100 tal como se define en el presente documento que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 también incluyen polipéptidos que se han derivado, por medio de una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Preferiblemente, dichos polipéptidos comprenden sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en comparación con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

El polipéptido tal como se enseña en el presente documento puede estar precedido por una secuencia señal N-terminal que estimula la secreción del polipéptido de la célula. En una realización, la secuencia señal N-terminal puede ser un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que es la secuencia señal N-terminal prevista que se produce de manera natural del polipéptido Amuc-1100. Sin embargo, también pueden emplearse otras secuencias señal N-terminales capaces de permitir que Amuc-1100 sea secretado por una célula. Por ejemplo, puede emplearse una versión truncada o una versión expandida de la secuencia señal N-terminal que se produce de manera natural predicha del polipéptido Amuc-1100, siempre que dicha secuencia señal N-terminal sea capaz de permitir que Amuc-1100 sea secretado por una célula. Alternativamente, puede emplearse una secuencia de señal N-terminal que no se produzca de manera natural. El experto en la técnica es capaz de identificar secuencias señal N-terminales que son adecuadas para su uso en la presente invención. Por tanto, un polipéptido de la presente invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 N-terminal de su secuencia de aminoácidos.

La identidad de la secuencia de aminoácidos puede determinarse por cualquier medio adecuado disponible en la técnica. Por ejemplo, la identidad de la secuencia de aminoácidos puede determinarse mediante alineación por pares usando el algoritmo de Needleman y Wunsch y los parámetros predeterminados de GAP tal como se definió anteriormente. También se entiende que pueden usarse muchos métodos para identificar, sintetizar o aislar variantes de los polipéptidos tal como se enseña en el presente documento, tal como inmunotransferencia de tipo Western, inmunohistoquímica, ELISA, síntesis de aminoácidos y similares.

También se entiende que cualquier variante de los polipéptidos Amuc-1100 tal como se enseña en el presente documento ejerce la misma función y/o tiene la misma actividad que el polipéptido Amuc-1100 tal como se enseña en el presente documento. La funcionalidad o actividad de cualquier polipéptido Amuc-1100 o variantes del mismo puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, que el experto consideraría adecuado para estos fines.

Polinucleótidos

La presente divulgación también enseña una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante, sintética o aislada, que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo de:

(a) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 en toda su longitud que codifica para un polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la glucosa y/o el colesterol y/o o homeostasis de triglicéridos; y

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido tal como se enseña en el presente documento.

El término “molécula de ácido nucleico aislada” (por ejemplo, ADNc, ADN genómico o ARN) incluye moléculas de ácido nucleico que se producen de manera natural, artificiales o sintéticas. Las moléculas de ácido nucleico pueden codificar para cualquiera de los polipéptidos tal como se enseñan en el presente documento. Dicha molécula de ácido nucleico puede usarse para producir los polipéptidos tal como se enseña en el presente documento. Debido a la degeneración del código genético, diversas moléculas de ácido nucleico pueden codificar para el mismo polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1).

En una realización, las moléculas de ácido nucleico aisladas tal como se enseña en el presente documento incluyen cualquier variante de molécula de ácido nucleico, que abarca cualquier molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene más del 95%, preferiblemente más del 96%, preferiblemente más del 97%, preferiblemente más del 98%, y preferiblemente más del 99% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos. Las variantes también incluyen moléculas de ácido nucleico, que se han derivado, mediante una o más sustituciones, deleciones o inserciones de ácido nucleico, a partir de la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:2. Preferiblemente, tales moléculas de ácido nucleico comprenden sustituciones, deleciones o inserciones de ácido nucleico en comparación con SEQ ID NO:2.

La identidad de la secuencia puede determinarse por cualquier medio adecuado disponible en la técnica. Por ejemplo, la bioinformática puede usarse para realizar la alineación por pares entre secuencias nucleicas para identificar regiones de similitud que pueden deberse a relaciones funcionales, estructurales o evolutivas entre las secuencias. También se entiende que pueden usarse muchos métodos para identificar, sintetizar o aislar variantes del polinucleótido tal como se enseña en el presente documento, tal como la hibridación de ácidos nucleicos, la tecnología PCR, análisis in silico y síntesis de ácidos nucleicos, y similares.

Se entiende además que cualquier molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento puede codificar para un polipéptido tal como se enseña en el presente documento.

En una realización, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico que se establece en SEQ ID NO:2.

La molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento puede abarcar una molécula de ácido nucleico que codifica para una secuencia señal N-terminal que es adecuada para estimular la secreción del polipéptido tal como se enseña en el presente documento a partir de su célula huésped. Dicha secuencia señal N-terminal que codifica para la molécula de ácido nucleico puede comprender la secuencia de ácido nucleico tal como se establece en SEQ ID NO:4.

En una realización, la molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento puede estar comprendida en un gen quimérico, en el que dicha molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor. Por tanto, la presente invención también se refiere a un gen quimérico que comprende la molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento.

Puede usarse cualquier promotor conocido en la técnica, y que sea adecuado para la unión con las moléculas de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de promotores adecuados incluyen promotores que permiten la expresión constitutiva o regulada, la expresión fuerte y débil y similares. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para incluir la molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento en un gen quimérico.

Puede ser ventajoso unir operativamente la molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento a un denominado “promotor constitutivo”.

Alternativamente, puede ser ventajoso unir operativamente los polinucleótidos y variantes de los mismos tal como se enseña en el presente documento a un denominado “promotor inducible”. Un promotor inducible puede ser un promotor que esté regulado fisiológicamente (por ejemplo, mediante la aplicación externa de determinados compuestos).

El gen quimérico tal como se enseña en el presente documento puede estar comprendido en un “vector” o “construcción de ácido nucleico”. Por tanto, la presente invención también se refiere a vectores que comprenden el gen quimérico tal como se enseña en el presente documento o la molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped que ha sido genéticamente modificada para comprender, por ejemplo, en su genoma, una molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento, un gen quimérico tal como se enseña en el presente documento o vectores tal como se enseña en el presente documento.

La célula huésped genéticamente modificada tal como se enseña en el presente documento puede usarse para producir in vitro, ex vivo y/o in vitro, los polipéptidos y variantes de los mismos tal como se enseña en el presente documento dentro del citoplasma de la célula huésped o liberados de las células por cualquier medio. Los polipéptidos tal como se enseñan en el presente documento pueden, en particular, expresarse como una molécula soluble o secretada. Las células huésped genéticamente modificadas, tal como se enseña en el presente documento, pueden ser cualquier célula huésped adecuada para procedimientos de transformación o procedimientos de ingeniería genética. Los ejemplos no limitativos de células huésped adecuadas incluyen células cultivables, tales como cualquier célula procariota o eucariota. En una realización, el polipéptido AMUC-1100 se expresa en bacterias, tales como Escherichia coli.

En una realización, la célula huésped tal como se enseña en el presente documento puede ser cualquier célula que exprese de manera natural el polipéptido o variante del mismo tal como se enseña en el presente documento. En tal caso, la célula huésped puede sobreexpresar el polipéptido o variante del mismo tal como se enseña en el presente documento.

Todavía en una realización, la célula huésped tal como se enseña en el presente documento puede ser cualquier célula que no exprese de manera natural el polipéptido o variantes del mismo tal como se enseña en el presente documento.

En una realización, la célula huésped tal como se enseña en el presente documento no pertenece a la especie Akkermansia mudniphila.

En otra realización, la célula huésped puede pertenecer a la especie Akkermansia muciniphila, y se modifica genéticamente para que comprenda copias adicionales de las moléculas de ácido nucleico tal como se enseñan en el presente documento, o para que comprenda un gen o vector quimérico tal como se enseña en el presente documento. Tal célula de Akkermansia muciniphila puede sobreexpresar el polipéptido Amuc-1100 o una variante del mismo enseñada en el presente documento.

La célula huésped, tal como se enseña en el presente documento, puede modificarse genéticamente usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las células u organismos huésped tal como se enseñan en el presente documento pueden modificarse genéticamente mediante un método que comprende la etapa de

a) transformar la célula huésped con una molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante, sintética o aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo de una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 en toda la longitud; y una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar los polipéptidos y variantes de los mismos tal como se enseña en el presente documento.

b) cultivar dicha célula huésped en condiciones adecuadas para permitir la expresión de la molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento y/o la producción del polipéptido o una variante del mismo tal como se enseña en el presente documento;

c) opcionalmente, detectar células huésped capaces de expresar la molécula de ácido nucleico tal como se enseña en el presente documento y/o producir el polipéptido o una variante del mismo tal como se enseña en el presente documento.

En una realización preferida, las células u organismos huésped tal como se enseña en el presente documento pueden transformarse con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, o una variante de la misma tal como se enseña en el presente documento.

En una realización, la célula huésped genéticamente modificada, tal como se enseña en el presente documento, puede pertenecer a una especie de bacteria que se produce o vive de manera natural en las proximidades o dentro de la barrera de la mucosa intestinal de un mamífero. Dichas especies de bacterias a menudo se denominan “especies de bacterias asociadas a la mucosa intestinal”. Los ejemplos no limitativos de “especies de bacterias asociadas a la mucosa intestinal” incluyen Akkermansia muciniphila (ATTC BAA-835), Faecalibacterium prausnitzii (A2-165), Lactobacillus rhamnosus (ATCC 53103) y Bifidobacterium breve (DSM-20213).

En determinadas realizaciones, puede ser ventajoso modificar genéticamente una bacteria asociada a la mucosa intestinal con cualquiera de los polinucleótidos y variantes de los mismos tal como se enseña en el presente documento, por ejemplo, para expresar o sobreexpresar los polinucleótidos tal como se enseña en el presente documento o para producir o sobreproducir los polipéptidos tal como se enseña en el presente documento, directamente en las proximidades o dentro de la barrera de la mucosa intestinal de un mamífero (por ejemplo, un ser humano). En una realización preferida, las bacterias asociadas a la mucosa intestinal pueden ser cualquier bacteria de la especie Akkermansia muciniphila. Tal sobreproducción puede realizarse mediante herramientas de modificación genética que involucran tecnologías de ADN recombinante, edición del genoma, tal como mediante el uso de herramientas basadas en sistemas similares a CRISPR/cas, o mediante sistemas clásicos de selección de mutaciones.

En una realización, la célula huésped genéticamente modificada puede ser cualquier bacteria, en particular una que no sea de una especie de bacteria que se produzca de manera natural o que viva en las proximidades o dentro de la barrera de la mucosa intestinal de un mamífero. Los ejemplos no limitativos de tales bacterias incluyen cualquier cepa bacteriana intestinal aislada beneficiosa, por ejemplo, pueden usarse bacterias probióticas, particularmente cepas seleccionadas de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, o Bifidobacteria. Además, pueden usarse bacterias intestinales anaerobias estrictas, tales como las que pertenecen a los géneros que se sabe que existen en el tracto intestinal humano (Rajilic-Stojanovic & de Vos, The first 1000 cultured species of the human gastrointestinal microbiota. FEMS Microbiol Rev. 38: 996-1047).

Métodos para producir el polipéptido.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir los polipéptidos, incluyendo las variantes, tal como se enseña en el presente documento, que comprende las etapas de:

(a) cultivar una célula huésped tal como se enseña en el presente documento en condiciones que permitan la producción del polipéptido o una variante del mismo tal como se enseña en el presente documento; y

(b) aislar el polipéptido producido en la etapa (a).

En la etapa (a), la célula huésped tal como se enseña en el presente documento puede cultivarse según cualquier método de cultivo conocido y en cualquier medio de cultivo conocido. El experto en la técnica podrá seleccionar una célula huésped adecuada y podrá establecer las condiciones adecuadas que permitan la producción del polipéptido.

Alternativamente, el polipéptido puede producirse mediante un método que comprende las etapas de:

(a) cultivar bacterias de la especie Akkermansia mudniphila en un medio de cultivo adecuado; y

(b) aislar el polipéptido producido en la etapa (a).

El polipéptido producido en las etapas (a) de los métodos anteriores puede aislarse mediante cualquier método conocido en la técnica. El experto en la técnica será capaz de aislar el polipéptido producido a partir de dicho medio de cultivo.

Los medios de cultivo adecuados los enseñan, por ejemplo, por Derrien et al. (2004, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1469-76). Derrien et al. enseñan que la cepa MucT de A. muciniphila se aisló y se hizo crecer en un medio anaerobio basal que contenía mucina gástrica de cerdo como única fuente de carbono y nitrógeno. Los autores también enseñan que A. muciniphila puede cultivarse en medios ricos, tales como caldo Columbia (CB) y caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) o medio basal con glucosa y altas concentraciones de casitona y extracto de levadura. Del mismo modo, Lukovac et al. (mBio enseña el crecimiento de A. muciniphila en un medio basal que contiene glucosa y fucosa, así como altas cantidades de casitona (2014, mBio 01438-14).

Composiciones

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos tal como se enseñan en el presente documento. En una realización preferida, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

En aún un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende una célula huésped tal como se enseña en el presente documento y un portador. La célula huésped puede estar presente en una cantidad que oscila entre aproximadamente 104 a aproximadamente 1015 unidades formadoras de colonias (UFC). Por ejemplo, una cantidad eficaz de la célula huésped puede ser una cantidad de aproximadamente 105 UFC a aproximadamente 1014 UFC, preferiblemente de aproximadamente 106 UFC a aproximadamente 1013 UFC, preferiblemente de aproximadamente 107 UFC a aproximadamente 1012 UFC, más preferiblemente de aproximadamente 108 UFC a aproximadamente 1012 UFC. La célula huésped puede ser viable o puede estar muerta. La eficacia de la célula huésped se correlaciona con la presencia del polipéptido tal como se enseña en el presente documento.

En una realización, la composición tal como se enseña en el presente documento comprende además un portador, por ejemplo, un portador fisiológicamente aceptable o un portador farmacéuticamente aceptable o un portador aceptable desde el punto de vista alimentario o un portador nutricionalmente aceptable. El portador puede ser cualquier portador inerte. Por ejemplo, los ejemplos no limitativos de portadores fisiológica o farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen cualquiera de los portadores, tampones, diluyentes y excipientes fisiológicos o farmacéuticos bien conocidos. Se apreciará que la elección de un portador fisiológico o farmacéutico adecuado o un portador alimenticio o un portador nutricional dependerá del modo previsto de administración de la composición tal como se enseña en el presente documento (por ejemplo, oral) y la forma prevista de la composición (por ejemplo, bebida, yogur, polvo, cápsulas y similares). El experto sabe cómo seleccionar un portador adecuado, por ejemplo, un portador fisiológicamente aceptable o un portador nutricionalmente aceptable o un portador farmacéuticamente aceptable, que es adecuado o compatible con las composiciones tal como se enseñan en el presente documento.

En una realización, las composiciones tal como se enseñan en el presente documento pueden ser una composición nutricional o alimentaria. Por ejemplo, la composición tal como se enseña en el presente documento puede ser un alimento, un suplemento alimenticio, un pienso o un suplemento de pienso tal como un producto lácteo, por ejemplo, un producto lácteo fermentado, tal como un yogur o una bebida de yogur. En este caso, la composición puede comprender un portador nutricionalmente aceptable o alimentariamente aceptable, que puede ser una base alimentaria adecuada.

En una realización, las composiciones tal como se enseñan en el presente documento pueden ser una composición farmacéutica. La composición farmacéutica también puede usarse como suplemento (por ejemplo, suplemento alimenticio). La composición farmacéutica tal como se enseña en el presente documento puede comprender un portador farmacéutico, nutricional o alimentario o fisiológicamente aceptable, además del polipéptido tal como se enseña en el presente documento y/o células huésped tal como se enseña en el presente documento. La forma preferida dependerá del modo previsto de administración y aplicación (terapéutica). El portador puede ser cualquier sustancia compatible, fisiológicamente aceptable, no tóxica, adecuada para administrar el polipéptido tal como se enseña en el presente documento y/o la célula huésped tal como se enseña en el presente documento al tracto GI de un mamífero (por ejemplo, ser humano), preferiblemente en las proximidades o dentro de la barrera de la mucosa intestinal (más preferiblemente la barrera de la mucosa del colon) en un mamífero. Por ejemplo, puede usarse agua estéril o sólidos inertes como portador, generalmente complementados con un adyuvante farmacéuticamente aceptable, un agente tampón, un agente dispersante y similares.

La composición, tal como se enseña en el presente documento, puede estar en forma líquida, por ejemplo, una suspensión estabilizada del polipéptido tal como se enseña en el presente documento o una célula huésped tal como se enseña en el presente documento, o en forma sólida, por ejemplo, un polvo de células huésped liofilizadastal como se enseña en el presente documento. En el caso de que las células huésped tal como se enseñan en el presente documento se liofilicen, puede emplearse un crioprotector tal como lactosa, trehalosa o glucógeno. Para la administración oral, los polipéptidos tal como se enseñan en el presente documento o las células huésped liofilizadas tal como se enseñan en el presente documento pueden administrarse en formas de dosificación sólidas, tales como cápsulas, comprimidos y polvos, o en formas de dosificación líquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. El polipéptido tal como se enseña en el presente documento o la célula huésped tal como se enseña en el presente documento puede encapsularse en cápsulas tales como cápsulas de gelatina, junto con componentes inactivos y portadores en polvo, tal como, por ejemplo, glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina de sodio, talco, carbonato de magnesio y similares.

En una realización, las composiciones tal como se enseñan en el presente documento pueden comprender uno o más componentes, que son adecuados para promover la supervivencia y/o la viabilidad y/o mantener y/o la integridad del polipéptido tal como se enseña en el presente documento y/o la célula huésped tal como se enseña en el presente documento durante el almacenamiento y/o durante la exposición a la bilis y/o durante el paso por el tracto GI de un mamífero (por ejemplo, un ser humano). Los ejemplos no limitativos de tales componentes incluyen un recubrimiento entérico y agentes de liberación controlada que permiten el paso a través del estómago. El experto en la técnica sabe cómo seleccionar los componentes adecuados para garantizar que el componente activo (ya sea un polipéptido o una célula huésped) reciba su destino previsto, donde ejerce su acción.

En una realización, las composiciones tal como se enseñan en el presente documento pueden comprender además un agente de unión a la mucosa o un polipéptido de unión a la mucosa. El término “agente de unión a la mucosa” o “polipéptido de unión a la mucosa” tal como se usa en el presente documento se refiere a un agente o un polipéptido que es capaz de unirse a las superficies de la mucosa intestinal de la barrera de la mucosa intestinal de un mamífero (por ejemplo, un ser humano).

Alternativamente, puede hacerse uso de sistemas de acoplamiento específicos para unir el polipéptido Amuc-1100 a células productoras de Amuc-1100 o incluso a células no productoras de Amuc-1100 que están vivas o muertas. La unión puede ser en el extremo C- o N-terminal, cualquiera que parezca más eficaz, mientras que también se ha descrito el uso de péptidos espaciadores. Los ejemplos incluyen el uso de sistemas de unión de peptidoglicanos basados en LysM (Visweswaran G^r et al. 2014, Appl Microbiol Biotechnol. 98:4331-45). Además, se han dado a conocer en la técnica una variedad de polipéptidos de unión a la mucosa. Los ejemplos no limitativos de polipéptido de unión a la mucosa incluyen subunidades de unión a la membrana de la toxina bacteriana que incluyen, por ejemplo, la subunidad B de la toxina del cólera, la subunidad B de la E. coli enterotoxina termolábil, subunidades S2, S3, S4 y/o S5 de la toxina de Bordetella pertussis, el fragmento B de la toxina diftérica y las subunidades de unión a membrana de la toxina Shiga o toxinas similares a Shiga. Otros polipéptidos de unión a la mucosa adecuados incluyen proteínas de fimbrias bacterianas tales como fimbrias de E. coli K88, K99, 987P, F41, FAIL, CFAIII ICES1, CS2 y/o Cs 3, CFAIIV ICS4, CS5 y/o CS6), P. fimbraiae, o similares. Otros ejemplos no limitativos de fimbrias incluyen hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis, pilus corregulado de toxina de Vibrio cholerae (TCP), hemaglutinina sensible a manosa (MSHA), hemaglutinina sensible a fucosa (PSHA), y similares. Todavía otros agentes de unión a la mucosa incluyen proteínas de unión viral que incluyen hemaglutininas de virus influenza y sendai y lectinas animales o moléculas similares a lectinas que incluyen moléculas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas, lectinas dependientes de calcio (tipo C), selectinas, colectinas o hemaglutinina de Helix pomatis, lectinas vegetales con subunidades de unión a la mucosa incluyen concanavalina A, aglutinina de germen de trigo, fitohemaglutinina, abrina, ricina y similares. La ventaja de esta administración es que se evita el uso de un organismo recombinante vivo.

Aunque no es esencial, puede ser ventajoso añadir uno o más agentes de unión a la mucosa o polipéptidos de unión a la mucosa a la composición tal como se enseña en el presente documento para dirigir el polipéptido tal como se enseña en el presente documento o la célula huésped tal como se enseña en el presente documento a la barrera de la mucosa intestinal.

Las composiciones tal como se enseñan en el presente documento pueden comprender además componentes seleccionados del grupo que consiste en prebióticos, probióticos, hidratos de carbono, polipéptidos, lípidos, vitaminas, minerales, agentes medicinales, agentes conservantes, antibióticos o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, la composición tal como se enseña en el presente documento puede comprender además uno o más componentes, que mejoran adicionalmente el valor nutricional y/o el valor terapéutico de las composiciones tal como se enseñan en el presente documento. Por ejemplo, puede ser ventajoso añadir uno o más componentes (por ejemplo, componentes nutricionales, agentes veterinarios o medicinales, etc.) seleccionados de proteínas, aminoácidos, enzimas, sales minerales, vitaminas (por ejemplo, tiamina HCl, riboflavina, piridoxina HCl, niacina, inositol, cloruro de colina, pantotenato de calcio, biotina, ácido fólico, ácido ascórbico, vitamina B12, ácido paminobenzoico, acetato de vitamina A, vitamina K, vitamina D, vitamina E y similares), azúcares e hidratos de carbono complejos (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos solubles e insolubles en agua), compuestos medicinales (por ejemplo, antibióticos), antioxidantes, componentes de elementos traza (por ejemplo, compuestos de cobalto, cobre, manganeso, hierro, zinc, estaño, níquel, cromo, molibdeno, yodo, cloro, silicio, vanadio, selenio, calcio, magnesio, sodio y potasio y similares). El experto en la técnica está familiarizado con métodos y componentes que son adecuados para mejorar el valor nutricional y/o terapéutico/medicinal de las composiciones tal como se enseña en el presente documento.

En una realización, la célula huésped puede incorporarse en forma liofilizada o en forma microencapsulada (revisado por, por ejemplo, Solanki et al. BioMed Res. Int. 2013, ID de artículo 620719), o cualquier otra forma que preserve la actividad y/o viabilidad de la célula huésped (por ejemplo, cepa bacteriana).

Usos terapéuticos

En otro aspecto, la presente invención se refiere al polipéptido, la composición o las células huésped tal como se describe en el presente documento para su uso en un método para tratar y/o prevenir un trastorno o afección seleccionada del grupo de obesidad, síndrome metabólico, trastornos relacionados con la deficiencia de insulina o resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes gestacional, preeclampsia, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome del intestino irritable (SII), intolerancia a la glucosa, metabolismo anómalo de los lípidos, hiperglucemia, dislipidemias, disfunción del sistema inmunitario asociada con la obesidad (aumento de peso), colesterol alto, triglicéridos elevados y afecciones que alteran la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal, tales como alergias alimentarias, inmadurez del intestino, por ejemplo, debido al nacimiento prematuro de un bebé, exposición a radiación, quimioterapia y/o toxinas, trastornos autoinmunitarios, desnutrición, septicemia y similares, en un mamífero. La invención proporciona además el polipéptido, la composición o las células huésped tal como se describe en el presente documento para su uso en uno o más métodos para promover la pérdida de peso en un mamífero; métodos para promover la actividad antiinflamatoria en el intestino de un mamífero; métodos para promover la función del sistema inmunitario de la mucosa intestinal en un mamífero; métodos para mantener, restablecer y/o mejorar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos; y métodos para mantener, restablecer y/o aumentar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal en un mamífero. Los métodos pueden comprender la etapa de administrar a un mamífero que lo necesite, una cantidad eficaz de un polipéptido tal como se enseña en el presente documento, una célula huésped tal como se enseña en el presente documento o una composición tal como se enseña en el presente documento.

En una realización, el polipéptido tal como se enseña en el presente documento, una célula huésped tal como se enseña en el presente documento o una composición tal como se enseña en el presente documento puede administrarse mediante cualquier método de administración conocido. Por ejemplo, las composiciones tal como se enseñan en el presente documento pueden administrarse por vía oral, intravenosa, tópica, enteral o parenteral. Se entiende que los modos o vías de administración dependerán del caso en cuestión (por ejemplo, edad del sujeto, ubicación deseada de los efectos, condiciones de la enfermedad y similares), así como de la forma prevista de la composición (por ejemplo, píldora, líquido, polvo, etc.).

En una realización preferida, el polipéptido tal como se enseña en el presente documento, una célula huésped tal como se enseña en el presente documento o una composición tal como se enseña en el presente documento se administran por vía oral.

Usos

En aspecto adicional, la presente invención se refiere al polipéptido tal como se enseña en el presente documento, a las células huésped tal como se enseña en el presente documento o a la composición tal como se enseña en el presente documento para su uso como medicamento; particularmente para su uso en la promoción de la función del sistema inmunitario de la mucosa intestinal o para mantener, restablecer y/o aumentar la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal en un mamífero; para mantener, restablecer y/o mejorar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos en un mamífero; para su uso en la prevención y/o tratamiento de un trastorno o afección seleccionado del grupo que consiste en obesidad, tal como obesidad inducida por dieta, síndrome metabólico, deficiencia de insulina o trastornos relacionados con la resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes gestacional, preeclampsia, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome del intestino irritable (SII), intolerancia a la glucosa, metabolismo anómalo de los lípidos, hiperglucemia, dislipidemias, disfunción del sistema inmunitario asociada con la obesidad (aumento de peso), colesterol alto, triglicéridos elevados, aterosclerosis y afecciones que alteran la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal, tales como alergias alimentarias, inmadurez del intestino, por ejemplo, debido al nacimiento prematuro de un bebé, exposición a radiación, quimioterapia y/o toxinas, trastornos autoinmunitarios, desnutrición, septicemia, y similares, en un mamífero; para su uso en la promoción de la actividad antiinflamatoria en el intestino de un mamífero; o para su uso en la promoción de la pérdida de peso en un mamífero.

En una realización, el mamífero, por ejemplo, un ser humano, puede ser de cualquier grupo de edad (por ejemplo, bebés, adultos, ancianos) y de cualquier género (masculino y femenino). En una realización, el mamífero puede ser un bebé (por ejemplo, recién nacidos, bebés, niños pequeños, etc.), particularmente un bebé que nació prematuramente.

El mamífero puede ser cualquier mamífero, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, roedores, gatos, perros, vacas, caballos y similares. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.

La presente invención se ilustra adicionalmente, pero no se limita, mediante los siguientes ejemplos. A partir de la discusión anterior y estos ejemplos, un experto en la técnica puede determinar las características esenciales de la presente invención y, sin apartarse de la enseñanza y el alcance de la misma, puede realizar diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por tanto, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en el presente documento serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones también están destinadas a situarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de la figura

La figura 1 muestra: A) Aumento de peso corporal total (g) (n = 8-10). B) Aumento de masa grasa total (g) medida por resonancia magnética nuclear en el dominio del tiempo (n = 8-10). C) Ingesta diaria de alimentos. D) Niveles de colesterol VLDL, LDL y HDL en plasma (n = 8-10). E) Glucosa plasmática (mg dl-1) perfil y F) área media bajo la curva (AUC) medida entre -30 y 120 min después de la carga de glucosa (mg.dl'1.min_1; n = 8-10). G) Razón del control y p-IRp estimulada por insulina en el control de carga medido por densitometría (n = 3-5). H e I) Razón del control y p-Aktthr308 y p-Aktser473 estimuladas por insulina en el control de carga medido por densitometría (n = 3-5).

Lista de secuencias

SEQ ID NO: 1: secuencia de aminoácidos del polipéptido Amuc-1100

SEQ ID NO: 2: secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Amuc-1100

SEQ ID NO: 3: secuencia de aminoácidos de la secuencia señal N-terminal predicha del polipéptido Amuc-1100 SEQ ID NO: 4: secuencia de nucleótidos de la secuencia señal N-terminal predicha del polipéptido Amuc-1100 Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de bacterias genéticamente modificadas para producir proteínas Amuc-1100.

Método:

El polinucleótido que codifica para Amuc-1100 maduro (secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2) se clonó en E. coli TOP10 con un His-Tag C-terminal bajo el control del promotor T7 inducible de derivados de pET28 y se introdujo en E. coli BL23(DE3) por sobreproducción. Para este fin, se añadió un codón de inicio ATG a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO;2, de modo que el polipéptido resultante comenzara con la secuencia de aminoácidos MIVNS. Todos los constructos se confirmaron por análisis de secuencia de Sanger. Los constructos que portaban el Amuc-1100 sobreexpresado dieron como resultado una sobreproducción de proteínas Amuc-1100 solubles que se purificaron hasta una aparente homogeneidad mediante cromatografía de afinidad en columna de Ni y se usaron en una concentración de 100-300 ug/ml. El Amuc-1100 purificado se usó para generar anticuerpos en conejos esencialmente tal como se describió anteriormente (ReunanenJ et al. 2012, Appl Environ Microbiol 78:2337-44). Resultados:

Los resultados muestran que E. coli transformada con el polinucleótido de la invención (SEQ ID NO: 2) pudo producir la proteína Amuc-1100 en una forma soluble que pudo aislarse fácilmente usando cromatografía en columna de Ni tal como se describe (Tailford LE et al. 2015, Nat Commun. 6:7624).

Ejemplo 2: Interacción y estimulación de la ruta de señalización de TLR2

Método:

Con el fin de someter a prueba la capacidad de Amuc-1100 para unirse a TLR2 y otros receptores de TLR y, posteriormente, estimular TLR2 y otras rutas de señalización de TLR, se prepararon líneas de células indicadoras que expresan receptores de TLR2 y TLR4. Se sometió a prueba in vitro la capacidad de Amuc-1100 para unirse a líneas celulares que expresan TLR2 o TLR4 y después de eso estimular la ruta de señalización de TLR2 y/o TLR4 en dichas células midiendo la producción de NK- ^k B de las células indicadoras.

Brevemente, se usaron las líneas celulares hTLR2 y hTLR4 (Invivogen, CA, EE.UU.). La estimulación de los receptores con los ligandos correspondientes activa NF- ^k B y AP-1, lo que induce la producción de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP), cuyos niveles pueden medirse mediante espectrofotómetro (Spectramax). Todas las líneas celulares se cultivaron y subcultivaron hasta un 70-80% de confluencia usando como medio de mantenimiento medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 4,5 g/l de D-glucosa, 50 U/ml de penicilina, 50 |ig/ml de estreptomicina, 100 |ig/ml de normocina, L-glutamina 2 mM y suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v) inactivado por calor. Para cada línea celular se realizó un experimento de respuesta inmunitaria añadiendo 20 |il de suspensiones de Amuc-1100. Las células indicadoras se incubaron con Amuc-1100 durante 20-24 horas a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2. Los ligandos del receptor Pam3CSK4 (10 ng/ml para hTLR2) y LPS-EB (50 ng/ml para hTLR4) se usaron como control positivo mientras que el medio de mantenimiento sin antibióticos selectivos se usó como control negativo. La secreción de SEAP se detectó midiendo la DO600 a los 15 min, 1 h, 2 h y 3 h después de la adición de 180 |il de QUANTI-Blue (Invivogen, CA, EE.UU.) a 20 |il de sobrenadante de hTLR2 y hTLR4 inducidos. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Resultados:

Los resultados muestran que Amuc-1100 pudo interactuar con TLR2. Además, los resultados muestran que Amuc-1100 ejerció efectos inmunoestimuladores en las células indicadoras que expresan TLR2, es decir, Amuc-1100 fue capaz de estimular la liberación de NF- ^k B de las células indicadoras.

Ejemplo 3. Estimulación de la liberación de citocinas de las células mononucleares de sangre periférica.

Método:

Se sometió a prueba in vitro la capacidad de Amuc-1100 para estimular la producción o liberación de citocinas de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Brevemente, se recibió sangre periférica de tres donantes sanos del Sanquin Blood Bank, Nijmegen, Países Bajos. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separaron de la sangre de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente Ficoll-Paque Plus según el protocolo del fabricante (Amersham biosciences, Uppsala, Suecia). Después de la centrifugación, las células mononucleares se recogieron, se lavaron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) Glutamax (Invitrogen, Breda, Países Bajos) y se ajustaron a 0,5 * 106 células/ml en IMDM Glutamax suplementado con penicilina (100 U/ml) (Invitrogen), estreptomicina (100 |ig/ml) (Invitrogen) y FBS inactivado por calor al 10% (Lonza, Basilea, Suiza). Se sembraron PBMC (0,5 * 106 células/pocillo) en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos. Para cada donante, se usó un control negativo (sólo medio).

Las PBMC se estimularon con células de A. muciniphila (razón 1:10 con respecto a PBMC) o bien vivas o bien calentadas durante 10 min a 99°C o bien Amuc-1100 durante 1 día y, posteriormente, se midió la producción de citocinas IL-6, IL-8, IL-10, TNF -a, IL-1 p e IL-12p70 en sobrenadantes de cultivo mediante análisis múltiple (kit CBA de inflamación humana, Becton y Dickinson) según el protocolo del fabricante en un FACS Cantoll (Becton Dickinson) y se analizaron usando el software BD FCAP (Becton Dickinson). Los límites de detección según el fabricante fueron los siguientes: 3,6 pg/ml de IL-8, 7,2 pg/ml de IL-1 p, 2,5 pg/ml de IL-6, 3,3 pg/ml de IL-10, 3,7 pg/ml de TNF-a, 1,9 pg/ml de IL-12p70.

Resultados

Los resultados muestran que, en comparación con la situación de control (sólo medio), Amuc-1100 pudo estimular la producción de citocinas, es decir, se observaron niveles elevados de IL-1 p, IL-6, IL-8, IL-10 y TNF-a. El nivel de citocina inducido por 4,5 |ig/ml de Amuc-1100 fue similar al de 5 * 106 células de A. muciniphila o bien vivas o bien en forma inactivada por calor (véase la tabla 1 a continuación).

Tabla 1. Niveles de citocina inducidos por Amuc-1100 y Akkermansia muciniphila o bien vivas o bien en forma inactivada por calor

Ejemplo 4: Modulación de la resistencia transepitelial (TER)

Método:

La capacidad de Amuc-1100 para promover la integridad de la capa de células epiteliales intestinales se evaluó midiendo la capacidad de Amuc-1100 para estimular o aumentar la TER de las células Caco-2 in vitro. Brevemente,

Claims

REIVINDICACIONES

i. Composición que comprende un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, y un portador farmacéuticamente aceptable o aceptable desde el punto de vista alimentario.
2. Composición según la reivindicación 1, que es una composición nutricional o una composición farmacéutica.
3. Célula huésped genéticamente modificada en la que una molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo de:

(a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 en toda su longitud que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud y siendo capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos; y

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, se introduce en su genoma.
4. Célula huésped genéticamente modificada según la reivindicación 3, en la que dicha célula huésped no es de la especie Akkermansia mudniphila.
5. Célula huésped genéticamente modificada según la reivindicación 3, en la que dicha célula huésped es de la especie Akkermansia muciniphila.
6. Método para producir un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de afectar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, que comprende las etapas de:

(a) cultivar una célula huésped según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en condiciones que permitan la producción de dicho polipéptido; y

(b) opcionalmente, aislar el polipéptido producido en la etapa (a).
7. Polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, siendo dicho polipéptido capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/ o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos, célula huésped según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para su uso como medicamento.
8. Polipéptido, célula huésped o composición para su uso según la reivindicación 7, para prevenir y/o tratar un trastorno seleccionado del grupo que consiste en obesidad, síndrome metabólico, trastornos relacionados con la deficiencia de insulina o la resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes gestacional, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome del intestino irritable (SII), intolerancia a la glucosa, metabolismo anómalo de los lípidos, hiperglucemia, dislipidemias, disfunción del sistema inmunitario asociada con la obesidad (aumento de peso), colesterol alto, triglicéridos elevados y afecciones que alteran la integridad física de la barrera de la mucosa intestinal, tales como alergias alimentarias, inmadurez del intestino, por ejemplo, debido al nacimiento prematuro de un bebé, exposición a radiación, quimioterapia y/o toxinas, trastornos autoinmunitarios, desnutrición o septicemia en un mamífero.
9. Polipéptido, célula huésped o composición para su uso según la reivindicación 7, para promover la pérdida de peso en un mamífero.
10. Uso no terapéutico de una composición que comprende un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, para promover la pérdida de peso de un mamífero.
11. Composición que comprende la célula huésped genéticamente modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, y un portador que puede seleccionarse de un portador fisiológicamente aceptable o un portador farmacéuticamente aceptable o un portador aceptable desde el punto de vista alimentario o un portador nutricionalmente aceptable.
12. Molécula de ácido nucleico aislada, sintética o recombinante que es una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 en toda su longitud y que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en toda su longitud y que es capaz de efectuar la señalización inmunitaria y/o afectar la función de la barrera intestinal y/o afectar la homeostasis de glucosa y/o colesterol y/o triglicéridos.