BR112021002917A2 - composições compreendendo cepas bacterianas - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO CEPAS BACTERIANAS. A presente invenção refere-se a uma composição que compreende uma cepa bacteriana para uso na estimulação do sistema imunológico em um sujeito.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSIÇÕES COMPREENDENDO CEPAS BACTERIANAS".

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se ao campo de composições compreendendo cepas bacterianas isoladas do trato digestivo de ma- míferos e o uso de tais composições no tratamento de doenças, em particular na estimulação do sistema imunológico no tratamento de doenças.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O intestino humano é considerado estéril no útero, mas es- tá exposto a uma grande variedade de micróbios maternos e ambien- tais imediatamente após o nascimento. A partir daí, ocorre um período dinâmico de colonização e sucessão microbiana, que é influenciado por fatores como modo de entrega, ambiente, dieta e genótipo do hos- pedeiro, os quais impactam mediante a composição da microbiota in- testinal, particularmente durante o início da vida. Posteriormente, a mi- crobiota se estabiliza e se torna similar a um adulto [1]. A microbiota intestinal humana contém mais de 500-1000 filotipos diferentes per- tencentes essencialmente a duas divisões bacterianas principais, os Bacteroidetes e os Firmicutes [2]. As relações simbióticas bem- sucedidas decorrentes da colonização bacteriana do intestino humano produziram uma ampla variedade de funções metabólicas, estruturais, protetoras e outras funções benéficas. As atividades metabólicas au- mentadas do intestino colonizado garantem que componentes dietéti- cos indigestos de outra forma sejam degradados com a liberação de subprodutos que fornecem uma importante fonte de nutrientes para o hospedeiro. Da mesma forma, a importância imunológica da microbio- ta intestinal é bem reconhecida e exemplificada em animais livres de

[1] Spor et al. (2011) Nat Rev Microbiol. 9(4):279-90.

[2] Eckburg et al. (2005) Science. 10;308(5728):1635-8.

germes que têm um sistema imunológico deficiente que é funcional- mente reconstituído após a introdução de bactérias comensais [3-4].

[003] Mudanças dramáticas na composição da microbiota foram documentadas em distúrbios gastrointestinais, como doença inflamató- ria intestinal (IBD). por exemplo, os níveis da bactéria Clostridium clus- ter XIVa são reduzidos em pacientes com IBD, enquanto o número de E. coli aumenta, sugerindo uma mudança no equilíbrio de simbiontes e patobiontes dentro do intestino [5-6]. Curiosamente, esta disbiose mi- crobiana também está associada ao desequilíbrio nas populações de células T efetoras.

[004] Em reconhecimento do potencial efeito positivo que certas cepas bacterianas podem ter no intestino animal, várias cepas foram propostas para uso no tratamento de várias doenças (ver, por exem- plo, [7-8]). Além disso, certas cepas, incluindo principalmente cepas de Lactobacillus e Bifidobacterium , foram propostas para uso no trata- mento de várias doenças inflamatórias e autoimunes que não estão diretamente ligadas aos intestinos, por exemplo, por meio de meca- nismos anti-inflamatórios (ver [9] e [10] para revisões). Certas cepas Streptococcus e Veillonella e, em um grau menor, cepas Enterococcus e Lactobaccillus têm efeitos imunomoduladores, com efeitos variáveis em diferentes citocinas in vitro. No entanto, a relação entre diferentes

[3] Macpherson et al. (2001) Microbes Infect. 3(12):1021-35

[4] Mazmanian et al. (2005) Cell 15;122(1):107-18.

[5] Frank et al. (2007) PNAS 104(34):13780-5.

[6] Machiels et al. (2013) Gut. 63(8):1275-83.

[7] WO 2013/050792

[8] WO 2014/167338

[9] Goldin and Gorbach (2008) Clin Infect Dis. 46 Suplemento 2:S96-100.

[10] Azad et al. (2013) BMJ. 347:f6471.

doenças e diferentes cepas bacterianas, e os efeitos precisos de de- terminadas cepas bacterianas no intestino e em um nível sistêmico e em quaisquer tipos específicos de doenças, são mal caracterizados.

[005] Recentemente, várias espécies de Bifidobacterium foram investigadas por suas propriedades anti-inflamatórias e várias triagens em humanos demonstraram que as propriedades terapêuticas das bi- fidobactérias podem ser traduzidas com sucesso do laboratório para a clínica, em particular para doenças inflamatórias e autoimunes. por exemplo, B. longum CECT 7347 e B. infantis NLS induziram efeitos protetores em pacientes com doença celíaca [11,12]). Estudos tam- bém demonstraram a capacidade das bifidobactérias de modular do- enças além do intestino. Uma formulação de três cepas composta de B. longum BB536, B. infantis M-63 e B. breve M-16V aliviou os sinto- mas associados à rinite alérgica e asma intermitente leve em crianças

[13]. Além disso, a administração de B. longum 35624 a pacientes com colite ulcerativa, psoríase e síndrome da fadiga crônica resultou na di- minuição dos níveis plasmáticos de proteína C reativa em todos os três distúrbios [14], sugerindo que esta cepa pode ser capaz de modu- lar a imunidade sistêmica.

[006] Organismos da espécie Bifidobacterium breve foram pro- postos para uso na preparação de suplementos imunoestimuladores

[11] Olivares et al., (2014) British Journal of Nutrition 112(1), 30-

40.

[12] Pinto-Sánchez et al., (2017) Journal of Clinical Gastroente- rology 51(9), 814-817.

[13] Miraglia Del Giudice et al., (2017) Italian Journal of Pedia- trics 43(1), 25.

[14] Groeger et al., (2013) Gut Microbes 4(4), 325-339. doi:

10.4161/gmic.25487.

por metabolização do ácido linoleico em, por exemplo, [15] e [16]. No entanto, não há nada nesses documentos que sugira que tais orga- nismos, quando administrados a sujeitos, poderiam induzir uma res- posta imunoestimuladora.

[007] A referência [17] sugere que composições nutricionais compreendendo beta-galacto-oligossacarídeos A e B podem desenca- dear um efeito imunoestimulador. É afirmado que as composições que compreendem esses açúcares podem compreender adicionalmente vários outros componentes, incluindo Bifidobacterium breve, mas não há sugestão de que organismos Bifidobacterium breve contribuiriam para ou aprimorar quaisquer propriedades imunoestimuladoras dos beta-galacto-oligossacarídeos.

[008] O uso terapêutico de organismos da espécie Bifidobacte- rium breve é proposto em [18]. No entanto, não há sugestão de que as cepas bacterianas descritas nesses documentos tenham um efeito imunoestimulador.

[009] Um estudo para investigar o efeito potencial de uma cepa de Bifidobacterium na imunogenicidade de uma vacina oral contra a cólera foi relatado em [19]. No entanto, o resultado desse estudo foi inconclusivo; foi relatado naquele artigo que a cepa testada embora fosse bem tolerada, não exibia um efeito imunoestimulador pós-vacinal evidente.

[0010] Existe um requisito na técnica de novos métodos de trata- mento de doenças. Também é necessário que os efeitos potenciais das bactérias intestinais sejam caracterizados para que novas terapias

[15] KR20100135612

[16] Coakley et al., (2006) Nutrition and Cancer, 56(1):95-102

[17] WO2010/143940

[18] WO2017/209156

[19] Matsuda et al., (2011) Vaccine, 29:1855-1858 com bactérias intestinais possam ser desenvolvidas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Os inventores desenvolveram novas composições compre- endendo uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve que pode ser usada na estimulação do sistema imunológico e no tratamen- to e prevenção de doenças em um sujeito. Os inventores identificaram que as cepas da espécie Bifidobacterium breve podem ativar potente- mente o sistema imunológico.

[0012] A invenção, portanto, fornece uma composição que com- preende uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve, para uso na estimulação do sistema imunológico em um sujeito. Preferenci- almente, a invenção fornece uma composição compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um deriva- do ou biótipo do mesmo, para uso na estimulação do sistema imunoló- gico.

[0013] Além disso, a invenção fornece um método para estimular o sistema imunológico, compreendendo a administração de uma compo- sição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacte- rium breve ao sujeito. Além disso, a invenção fornece o uso de uma composição compreendendo uma cepa bacteriana da espécie Bifido- bacterium breve para a fabricação de um medicamento para estimular o sistema imunológico em um sujeito.

[0014] Em outros aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve, para uso como um adjuvante de vacina. Preferencialmente, a invenção fornece uma composição compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para uso como um adjuvante de vacina.

[0015] Em outros aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve, para uso no tratamento, prevenção ou retardamento da imu- nossenescência. Preferencialmente, a invenção fornece uma composi- ção compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para uso no tratamento, prevenção ou retardamento da imunossenescência.

[0016] Em outros aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve, para uso no aprimoramento de uma terapia celular, tal como CAR-T. Preferencialmente, a invenção fornece uma composição com- preendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para uso no aprimora- mento de uma terapia celular, tal como CAR-T.

[0017] Os inventores também caracterizaram uma cepa de Bifido- bacterium breve que é particularmente potente na estimulação do sis- tema imunológico e identificaram que sua potência pode ser mediada por seu exopolissacarídeo (EPS). A invenção, portanto, preferencial- mente usa uma composição compreendendo uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve que compreende um locus EPS comple- to e/ou expressa EPS em sua superfície, para estimular o sistema imunológico no sujeito.

[0018] Preferencialmente, a bactéria utilizada na invenção é a ce- pa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB.

[0019] Em modalidades preferidas, a invenção fornece uma com- posição, para uso no aumento do nível de expressão e/ou atividade de IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4 e/ou TNF-α no tratamento ou prevenção de doenças, conforme demonstrado nos exemplos. Preferencialmente, a invenção fornece uma composição que compreende a cepa deposi- tada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para uso no aumento do nível de expressão e/ou atividade de IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4 e/ou TNF-α no tratamento ou prevenção de doenças.

[0020] Em modalidades preferidas, a invenção fornece uma com- posição, para uso no aumento do nível de expressão e/ou atividade de IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4, TNF-α e/ou IL-17α no tratamento ou prevenção de doença, conforme demonstrado nos exemplos. Prefe- rencialmente, a invenção fornece uma composição que compreende a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para uso no aumento do nível de ex- pressão e/ou atividade de IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4, TNF-α e/ou IL-17α no tratamento ou prevenção de doenças.

[0021] Em modalidades preferidas, a invenção fornece uma com- posição, para uso na estimulação de TLR2. Preferencialmente, a in- venção fornece uma composição compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para uso na estimulação de TLR2.

[0022] Em modalidades preferidas, a invenção fornece uma com- posição, para uso na estimulação de NFκB. Preferencialmente, a in- venção fornece uma composição compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para uso na estimulação de NFκB.

[0023] Em modalidades preferidas, a cepa bacteriana da invenção expressa pululanase, que é mostrada nos exemplos como sendo alta- mente expressa por cepas de B. breve potentes e pode estar envolvi- da na adesão.

[0024] Em outros aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve para o tratamento ou prevenção de infecções bacterianas em um sujeito. Os exemplos demonstram que B. breve, e particularmente as cepas de B. breve da invenção têm atividade antimicrobiana poten- te. Além disso, a invenção fornece um método de tratamento ou pre-

venção de infecções bacterianas em um sujeito, compreendendo a administração de uma composição de uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve. Além disso, a invenção fornece o uso de uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Bifido- bacterium breve para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir infecções bacterianas em um sujeito.

[0025] Em modalidades preferidas, a infecção é uma infecção gas- trointestinal. Em modalidades preferidas, a infecção é uma infecção bacteriana Gram-negativa. Em modalidades preferidas, a composição da invenção é para uso no tratamento ou prevenção de infecção gas- trointestinal por E. coli. Em modalidades preferidas, a composição da invenção é para uso no tratamento ou prevenção de infecção gastroin- testinal por S. entérica. Em algumas modalidades, a composição da invenção é para uso na redução da viabilidade de uma bactéria no tra- tamento de uma infecção bacteriana. A bactéria da invenção pode ser usada para restaurar o nível de bactérias patogênicas para níveis as- sintomáticos ou para eliminar as bactérias patogênicas inteiramente de um sujeito, tratando assim a infecção bacteriana, além de aliviar os sintomas associados ao nível elevado da bactéria.

[0026] Espera-se que as cepas intimamente relacionadas à cepa B. breve testadas nos exemplos sejam particularmente eficazes na es- timulação do sistema imunológico. Em modalidades preferidas, a in- venção fornece uma composição em que a cepa bacteriana tem uma sequência do gene de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou em que a ce- pa bacteriana tem uma sequência do gene de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 1.

[0027] Em certas modalidades, a composição da invenção é para administração oral. A administração oral das cepas da invenção pode ser eficaz para estimular o sistema imunológico. Além disso, a admi-

nistração oral é conveniente para pacientes e médicos e permite a dis- tribuição e/ou colonização parcial ou total do intestino.

[0028] Em certas modalidades, a composição da invenção com- preende um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente acei- táveis.

[0029] Em certas modalidades, a composição da invenção com- preende uma cepa bacteriana que foi liofilizada. A composição da in- venção também pode compreender uma cepa de bactéria liofilizada da espécie Bifidobacterium breve. A liofilização é uma técnica eficaz e conveniente para a preparação de composições estáveis que permi- tem a entrega de bactérias.

[0030] Em certas modalidades, a invenção fornece um produto alimentício que compreende a composição descrita acima. A invenção também fornece um produto alimentício compreendendo uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve, conforme descrito neste documento.

[0031] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção de vacina compreendendo uma cepa bacteriana conforme descrito acima. A invenção também fornece uma composição de vacina com- preendendo uma composição de acordo com a invenção.

[0032] Além disso, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada com imunoesti- mulação reduzida, compreendendo a administração de uma composi- ção compreendendo uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve a um paciente em necessidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0033] Figura 1: Modelo de camundongo de câncer de mama - volume do tumor.

[0034] Figura 2: Modelo de camundongo de câncer de pulmão - volume do tumoral.

[0035] Figura 3: Modelo de camundongo com câncer de fígado - peso do fígado.

[0036] Figura 4: Perfil rápido ID 32 A de MRX004 sozinho (A) e em comparação com cepas do tipo B. breve (B). Branco = reação ne- gativa (sem mudança de cor), hachurado para baixo = reação positiva intermediária (mudança de cor fraca) e Preto = reação positiva (mu- dança de cor apropriada forte).

[0037] Figura 5: Análise API® 50 CH de MRX004. Hachura as- cendente = reação negativa (sem mudança de cor), hachura descen- dente = reação positiva intermediária (mudança de cor fraca), Preto = reação positiva (mudança de cor apropriada forte) e Branco = reação duvidosa (mudança de cor inesperada).

[0038] Figura 6: Anexo de cepas do tipo MRX004 e B. breve a cé- lulas humanas.

[0039] Figura 7: Estimulação de NFκB e TLR2 por tratamentos MRx0004. Linhas celulares repórter THP-1-NFκB (A) e HEK-TLR2 (B) foram tratadas com tratamentos de MRx0004 vivo (MRx0004LV), sobrenadante de cultura MRx0004 (MRx0004SN) e MRx0004 inativado por calor (MRx0004HK) em MOI 100:1 durante 22 horas. Os dados são representativos de três réplicas biológicas. A análise estatística foi rea- lizada usando ANOVA de uma via comum e Teste de Comparações Múltiplas de Tukey. As diferenças estatisticamente significativas são apresentadas como * p < 0,05, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001.

[0040] Figura 8: Resposta transcricional de MRx0004 in vitro e em resposta a IECs. A expressão de dez genes MRx0004 foi analisa- da e comparada entre culturas em crescimento de fase log tardia e após contato (3 horas) com IECs. Os dados são apresentados como o valor da alteração dobrada (2-ΔΔCt) calculado entre as condições no- meadas e normalizadas para groEL, e são representativas de três re- petições biológicas independentes. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via comum e Teste de Comparações Múltiplas de Tukey. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

[0041] Figura 9: Diversidade de sequência dentro de loci EPS de MRx0004 e cepas relacionadas

[0042] Figura 10: Propriedades fenotípicas de uma cepa deri- vada EPS negativa de MRx0004. A microscopia eletrônica de trans- missão (TEM) foi realizada no MRx0004 (A)e sua cepa EPS negativa (EPSneg) (B). (C) A adesão bacteriana para IECs foi analisada após a coincubação de células HT29-MTX e cepas bacterianas em MOI 100:1 durante 3 horas. Os dados apresentados são a média de três réplicas biológicas da porcentagem de CFU aderentes do inóculo inicial. A aná- lise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via comum e Tes- te de Comparações Múltiplas de Tukey. * p <0,05, ** p <0,01.

[0043] Figura 11: Impacto da depleção de EPS na detecção da proteína de superfície MRx0004. Diagrama de Venn mostrando o número de proteínas identificadas em (A) frações de proteínas raspa- das e descartada MRx0004, (B) frações de proteínas raspadas e des- cartadas EPSneg (C) frações de proteínas raspadasMRx0004 e EPSneg.

[0044] Figura 12. Elucidando o papel do EPS na imunomodu- lação por MRx0004. Tratamentos vivos (LV) e sobrenadantes de cultu- ra (SN) foram adicionados às células repórter HEK-TLR2 (A) e células repórter THP-1-NFκB (B) em um MOI de 100:1 e incubados durante 22 horas. Os dados apresentados para MRx0004LV e MRx0004SN foram apresentados precedentemente na Figura 7. Os dados são representa- tivos de três réplicas independentes. (C) Células HT29-MTX foram co- incubadas com bactérias vivas durante 3 horas, após o qual foi intro- duzido TNFα em uma concentração de 10 ng/ml durante 24 horas. Os níveis de IL-8 foram analisados em sobrenadantes de cocultura usan- do ELISA. Os dados são representativos de cinco réplicas biológicas. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via comum e

Teste de Comparações Múltiplas de Tukey. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

[0045] Figura 13: Identificação de subconjuntos de células imunológicas por citometria de fluxo. PBMCs de seis doadores saudáveis foram incubados durante 72 horas com um dos seguintes tratamentos; somente meio RPMI, MRx0004HK, ou EPSnegHK. Os gráfi- cos de caixa e bigode são mostrados com seus mínimos e máximos representados por bigodes verticais. A expressão do marcador de ati- vação celular CD25 é mostrada como uma porcentagem de células CD8+ e CD4+(A-B). Tregs (CD25+ (alto)/ CD127- (baixo)) são mostra- dos como uma porcentagem de células CD4+(C). As razões Treg/CD8+ independentes foram calculadas a partir de cada doador (D) e células B (CD19+) como uma porcentagem de células CD3- (E)E a análise es- tatística foi realizada usando ANOVA de uma via comum seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01***p < 0,001****p < 0,0001.

[0046] Figura 14: Perfis de citocinas produzidos por células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). As células foram incubadas durante 72 horas com um dos seguintes tratamentos; so- mente meio RPMI, MRx0004HK, ou EPSnegHK. Os gráficos de caixa e bigode são mostrados com seus mínimos e máximos representados por bigodes verticais. PBMCs foram obtidos de 6 doadores saudáveis e as concentrações de citocinas foram determinadas usando um en- saio multiplex (A-G). As razões independentes de IL-12p70/IL-4, IL- 10/IL1p70 e IL-1β/IL12p70 foram calculadas de cada doador (H-J) e a análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via comum se- guida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01***p < 0,001****p < 0,0001.

[0047] Figura 15: Diagrama de Venn, gerado com InteractiVenn, mostrando o número de proteínas identificadas nas frações de proteí-

nas raspadas e descartadas MRx0004 (listadas na Tabela 2).

[0048] Figura 16: (A) Geração de uma cepa EPS negativa de MRx0004 por mutagênese por inserção. (B) Autoagregação de MRx0004 e suas cepas derivadas EPSneg, EPSvec e EPScomp.

[0049] Figura 17: Diagrama de Venn comparando o número de proteínas identificadas em MRx0004SN e EPSnegSN.

[0050] Figura 18: Estratégia de passagem usada para experi- mento de citometria de fluxo em painel de sete cores. Um limiar de aquisição foi definido usando a população de células vivas em 1 x 105 eventos. São mostrados gráficos de pseudocolor representativos de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) de uma amostra não tratada. As portas foram definidas usando controles de isotipos e FMOs em FloJo. A dispersão frontal e lateral foi usada para identificar os linfócitos antes de eliminar a população de dupleto e utili- zar um corante de viabilidade para excluir células mortas. As células CD3- foram sub-bloqueadas com CD19 para identificar células B, en- quanto a população de células CD3+ foi usada para distinguir adicio- nalmente mais as células CD4+ eCD8+. O CD25 foi então usado para observar a porcentagem de células ativadas e, no caso da população CD4+, também foi usado em conjunto com o CD127 para identificar as Tregs (CD25+/CD127-).

[0051] Figura 19: Identificação de subconjuntos de células imunológicas por citometria de fluxo. PBMCs de seis doadores saudáveis foram incubados durante 72 horas com um dos seguintes tratamentos; somente meio RPMI, MRx0004HK ou EPSnegHK. Os gráfi- cos de caixa e bigode são mostrados com seus mínimos e máximos representados por bigodes verticais. As células CD8+ e CD4+ são mos- tradas com uma porcentagem de CD3+ (A- B) e células B ativadas co- mo uma porcentagem de CD19+ (C). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via comum seguida pelo teste de compara-

ções múltiplas de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01***p < 0,001****p < 0,0001.

[0052] Figura 20: Identificação de subconjuntos de células imunológicas por citometria de fluxo. PBMCs de seis doadores saudáveis foram incubados durante72 horas com um dos seguintes tratamentos; MRx0004HK, EPSnegHK, EPSvecHK ou EPScompHK. Os gráficos de dispersão são mostrados com seus desvios padrão representados por barras verticais. A expressão de células CD8+ e CD4+ é mostrada como uma porcentagem de CD3+ (A, C). A expressão do marcador de ativação celular CD25 é mostrada como uma porcentagem de células CD4+ e CD8+(B, D). Tregs (CD25+ (alto)/ CD127- (baixo)) são mostra- dos como porcentagem de células CD4+ (E) e células B (CD19+) como porcentagem de CD3-(F) e células B ativadas como uma porcentagem de CD19+ (G). As razões Treg/CD8+ independentes foram calculadas a partir de cada doador (H) e a análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via comum seguida pelo teste de comparações múlti- plas de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01***p < 0,001****p < 0,0001.

[0053] Figura 21: Perfis de citocinas produzidos por células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). As células foram incubadas durante 72 horas com um dos seguintes tratamentos; MRx0004HK, EPSnegHK, EPSvecHK ou EPScompHK. Os gráficos de caixa e bigode são mostrados com seus mínimos e máximos representados por bigodes verticais. PBMCs foram obtidos de 6 doadores saudáveis e as concentrações de citocinas foram determinadas usando um en- saio multiplex (A-G). As razões independentes de IL-12p70/IL-4, IL- 10/IL1p70 e IL-1β/IL12p70 foram calculadas a partir de cada doador (H-J). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via comum seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01***p < 0,001****p < 0,0001.

[0054] Figura 22: Exemplo de um ensaio de placa antimicrobi-

ana de cocultura. São mostradas a cepa indicadora, as cepas de tes- te e a zona de inibição.

[0055] Figura 23: Resultados do teste API 32A para as cepas B. breve de teste e referência. Branco = reação negativa (sem mu- dança de cor), Estrela = reação positiva intermediária (mudança de cor fraca) e Preto = reação positiva (mudança de cor apropriada forte).

[0056] Figura 24: Resumo PFGE SpeI para as cepas B. breve de teste e referência.

[0057] Figura 25: Gel PFGE a 1% digerido com SpeI executado em 0,5% de TBE, 18 horas, 6 V/cm, 1-15 seg ST. Setas pretas indicam padrões de tamanho de DNA. As faixas 1 e 2 foram agrupadas com as faixas 3-7 de diferentes partes do mesmo gel. Faixa 1 = λ, Faixa 2 = MRx0004, Faixa 3 = B.breve REF 7, Faixa 4 = B.breve REF6, Faixa 5 = B.breve REF1, Faixa 6 = B.breve REF2, Faixa 7 = λ

[0058] Figura 26: Dendrograma UPGMA com base nos padrões PFGE de B. breve incluídos neste estudo (A). Uma matriz de similari- dade gerada a partir do padrão de bandas PFGE representado no pai- nel B.

[0059] Figura 27: Indução da diferenciação de células T em uma população de células T auxiliares usando MRx0004 (HK 4) morto por calor, sobrenadante de cultura MRx0004 (SP 4) ou meio RPMI, sem adição de citocinas (sem citocinas). ** = p≤ 0,01.

[0060] Figura 28: Indução da diferenciação de células T em uma população de linfócitos T citotóxicos (CTL) usando MRx0004 morto por calor (HK 4), sobrenadante de cultura MRx0004 (SP 4) ou meio RPMI, sem adição de citocinas (sem citocinas). * = p≤ 0,05; *** = p≤ 0,001; **** = p≤ 0,0001.

[0061] Figura 29: Viabilidade de esplenócitos.

[0062] Figura 30: Perfis de citocinas produzidos por esplenócitos após tratamento com MRx004.

[0063] Figura 31: Frequência de células CD8+IFNγ+ e CD4+IFNγ+ e produção de IFNγ por célula no baço.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Cepas bacterianas

[0064] As composições da invenção compreendem uma cepa da espécie Bifidobacterium breve. Os exemplos demonstram que tais ce- pas bacterianas são úteis para estimular o sistema imunológico. A ce- pa bacteriana preferida da invenção é a bactéria depositada sob o nú- mero de acesso NCIMB 42380.

[0065] A bactéria Bifidobacterium breve depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 foi testada nos Exemplos e também é referi- da neste documento como cepa 751, MRX004 ou MRx0004. Uma se- quência parcial de rRNA 16S para a cepa MRX004 que foi testada é fornecida na SEQ ID NO: 1. A cepa MRX004 de Bifidobacterium breve foi depositada junto à autoridade internacional de depósito NCIMB, Ltd. (Edifício Ferguson, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia) por GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escócia) sob a referência de identifica- ção 751 em 12 de março de 2015 e recebeu o número de acesso NCIMB 42380. Posteriormente, GT Biologics Ltd. mudou seu nome para 4D Pharma Research Limited. Esses depósitos foram publicados em WO2016/203223.

[0066] Uma sequência de genoma para a cepa NCIMB 42380 é fornecida na SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223.

[0067] Também se espera que as cepas bacterianas intimamente relacionadas à cepa testada nos exemplos sejam eficazes para esti- mular o sistema imunológico. Em certas modalidades, a cepa bacteri- ana para uso na invenção tem uma sequência de rRNA 16s que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, a cepa bacteriana tem a sequência de rRNA 16s representada pela SEQ ID NO: 1. Mais preferencialmente, a cepa bacteriana é a cepa Bifidobacterium breve depositada sob o nú- mero de acesso NCIMB 42380.

[0068] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na in- venção tem um genoma com identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223. Em modalidades preferidas, a cepa bacte- riana para uso na invenção tem um genoma com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da sequência identidade) para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) da SEQ ID NO: 2 do WO2016/203223. por exemplo, a cepa bacteriana para uso na invenção pode ter um genoma com pelo me- nos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 de WO2016/203223 em 70% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 90% identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 80% da SEQ ID NO:2 de WO2016/203223, ou pelo menos 90% identidade de sequência para SEQ ID NO:2 de WO2016/203223 em 90% de SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 100% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 70% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 80% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 90% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 100% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 98% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de

WO2016/203223 em 70% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 98% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 80% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 98% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 90% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223, ou pelo menos 98% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223 em 100% da SEQ ID NO: 2 de WO2016/203223.

[0069] Em modalidades preferidas, a composição da invenção compreende bactérias vivas. Em modalidades preferidas, a composi- ção da invenção compreende bactérias vivas em um estado ativo, pre- ferencialmente liofilizadas. Os exemplos demonstram que a adminis- tração de bactérias vivas é mais eficaz do que bactérias mortas pelo calor ou sobrenadantes.

[0070] Em modalidades preferidas, as bactérias da invenção ati- vam TLR2, por exemplo, em um ensaio repórter HEK-TLR2, tal como descrito nos exemplos. Em modalidades adicionais, as bactérias da invenção não ativam TLR4, TLR5 ou TLR9. Em uma modalidade pre- ferencialmente, a composição da invenção compreende uma bactéria que ativa TLR2 e é para uso como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria que ativa TLR2 e é para uso no aumento de uma terapia celu- lar. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção com- preende uma bactéria que ativa TLR2 e é para uso no tratamento, pre- venção ou retardamento da imunossenescência.

[0071] Em modalidades preferidas, as bactérias da invenção ati- vam NFκB, por exemplo, em um ensaio repórter THP-1-NFκB tal como descrito nos exemplos. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria que ativa NFκB e é para uso como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade preferida, a com- posição da invenção compreende uma bactéria que ativa NFκB e é para uso no aumento de uma terapia celular. Em uma modalidade pre- ferida, a composição da invenção compreende uma bactéria que ativa o NFκB e é para uso no tratamento, prevenção ou retardamento da imunossenescência.

[0072] Em certas modalidades, as bactérias da invenção expres- sam um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em: oppA, pululanase, serpina e tadA em um nível superior na fase estacionária em comparação com a fase log tardia, por exemplo, quando cultivada em cultura líquida, conforme mostrado nos exemplos. Os exemplos demonstram que esses genes podem mediar efeitos terapêuticos úteis.

[0073] Em certas modalidades, as bactérias da invenção expres- sam um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em: eftU, enolase e pGTF em um nível mais alto na fase log tardia em compara- ção com a fase estacionária, por exemplo, quando cultivada em cultura líquida, tal como mostrado nos exemplos. Os exemplos demonstram que esses genes podem mediar efeitos terapêuticos úteis.

[0074] Em certas modalidades, as bactérias da invenção expres- sam um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em: eno- lase, pGTF, oppA, serpina e transaldolase em um nível superior após contato com células epiteliais intestinais em comparação com a fase log tardia, por exemplo, quando cultivado em cultura líquida, conforme mostrado nos exemplos. Os exemplos demonstram que esses genes podem mediar efeitos terapêuticos úteis.

[0075] Em certas modalidades, a bactéria da invenção expressa e secreta no interior sobrenadante da cultura uma ou mais de pulula- nase, proteínas da família NlpC/P60, FtsI, transaldolase, GAPDH, DnaK, GroEL e enolase. Em certas modalidades, a bactéria da inven- ção expressa e secreta no sobrenadante da cultura uma ou mais, tais como 2, 3, 5, 10, 15, ou todas as proteínas na Tabela 2. Os exemplos demonstram que essas proteínas podem mediar efeitos terapêuticos úteis.

[0076] Em certas modalidades, a bactéria da invenção expressa em sua superfície celular uma ou mais de pululanase, uma sintase po- licetídeo tipo I, transaldolase, GAPDH, DnaK, GroEL, enolase e EfTu. Em certas modalidades, a bactéria da invenção expressa e secreta no sobrenadante da cultura uma ou mais, tais como 2, 3, 5, 6, 8, ou todas, as proteínas na Tabela 3. Os exemplos demonstram que essas proteí- nas podem mediar efeitos terapêuticos úteis.

[0077] Em certas modalidades, as bactérias da invenção expres- sam pululanase. Em uma modalidade preferida, a composição da in- venção compreende uma bactéria que expressa pululanase e é para uso como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria que expressa pu- lulanase e é para uso no aprimoramento de uma terapia celular. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria que expressa pululanase e é para uso no tratamento, prevenção ou retardamento da imunossenescência.

[0078] Em modalidades preferidas, a bactéria da invenção com- preende um locus EPS completo. Os exemplos demonstram que um locus EPS completo pode contribuir para o aumento da potência tera- pêutica. Em tais modalidades, o locus EPS compreende uma glicosil- transferase de iniciação, uma ou mais glicosiltransferases adicionais, uma proteína de ligação de pirofosfato de tiamina, uma proteína que engloba a membrana, uma flippase e um determinante de comprimen- to de cadeia. Em modalidades preferidas, o locus EPS tem mais de 30 Kb de tamanho (incluindo proteínas hipotéticas flanqueadoras). Os exemplos demonstram que esse locus EPS é adequado para a função imunoestimuladora. Em modalidades preferidas, o locus EPS tem ta- manho de 25-60 Kb, 30-50 Kb, 30-40 Kb, 30-35 Kb ou 30-32 Kb. Numa modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria com um locus EPS completo e é para uso como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria com um locus EPS completo e é para uso no aumento de uma terapia celular. Numa modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria com um locus EPS completo e é para utilização no tratamento, prevenção ou retar- damento da imunosenescência.

[0079] Em modalidades preferidas, a bactéria da invenção tem um locus EPS com um alto nível de identidade de nucleotídeos para o lo- cus EPS da cepa MRX004, tal como pelo menos 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 99,5% de identidade de nucleotídeos, para exemplo conforme de- terminado nos exemplos. Os exemplos demonstram que o locus EPS da cepa MRX004 é geneticamente distinto de outras cepas B. breve e pode contribuir para a potência e utilidade terapêutica.

[0080] Em modalidades preferidas, a bactéria da invenção carrega EPS em sua superfície. Os exemplos demonstram que o EPS modula a exposição de proteínas na superfície celular. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria que carrega EPS em sua superfície e é para uso como um adjuvante de vacina. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria que carrega EPS em sua superfície e é pa- ra uso no aprimoramento de uma terapia celular. Em uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende uma bactéria que carrega EPS na sua superfície e seu uso no tratamento, prevenção ou retardamento da imunosenescência.

[0081] Preferencialmente, a bactéria utilizada na invenção tem ca- pacidade para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana é capaz de fermentar rafinose, por exemplo, quando cultivada em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante

4 horas. Os exemplos sugerem que as cepas de B. breve mais efica- zes são capazes de fermentar a rafinose e está envolvida na produção de EPS. Em outras modalidades preferidas, a bactéria usada na in- venção é capaz de fermentar um ou mais, tais como 2, 3, 4, 5, 6 ou todos os 7 de: α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase e β- glucosidase, α-arabinose, manose e rafinose, por exemplo, quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de sus- pensão API) a 37ºC durante 4 horas. Em outras modalidades preferi- das, a bactéria usada na invenção é capaz de fermentar um ou mais, tais como 2, 3, 4, 5, 6 ou todos os 7 de: arginina, prolina, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina e histidina. Qualquer ensaio adequado conhe- cido na técnica pode ser usado para avaliar a capacidade de uma bac- téria para fermentar uma fonte de carboidrato ou aminoácido. Prefe- rencialmente, a análise Rapid ID 32A é usada (preferencialmente usando o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux).

[0082] Preferencialmente, as bactérias utilizadas na invenção exi- bem fermentação intermediária de β-glucosidase ou fermentação in- termediária de α-arabinose, ou mais preferencialmente fermentação intermediária de β-glucosidase e fermentação intermediária de α- arabinose, por exemplo, quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exemplo, quando submetido à análise Rapid ID 32A. Os exemplos demonstram que ambas as cepas MRX004 de B. breve e Teste 3 têm atividade útil e ambas exibem fermentação intermediária de β- glucosidase e α-arabinose. Em modalidades particularmente preferi- das, as bactérias utilizadas na invenção exibem fermentação interme- diária de β-glucosidase, fermentação intermediária de α-arabinose e fermentação positiva de rabinose.

[0083] Preferencialmente, as bactérias utilizadas na invenção não exibem fermentação positiva de N-acetil-β-glucosaminidase, por exemplo, quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exem- plo, quando submetidas à análise rápida ID 32A. A bactéria pode exibir apenas fermentação intermediária ou nenhuma de N-acetil-β- glucosaminidase. Os exemplos demonstram que ambas as cepas de B. breve MRX004 e Teste 2 têm atividade útil e nenhuma exibe fer- mentação positiva de N-acetil-β-glucosaminidase. Em modalidades particularmente preferidas, as bactérias utilizadas na invenção não exibem fermentação positiva de N-acetil-β-glucosaminidase e exibem fermentação positiva de rabinose.

[0084] Preferencialmente, as bactérias utilizadas na invenção exi- bem fermentação intermediária de α-galactosidase ou fermentação intermediária de α-arabinose, ou mais preferencialmente fermentação intermediária de α-galactosidase e fermentação intermediária de α- arabinose, por exemplo, quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exemplo, quando submetido à análise Rapid ID 32A. Os exemplos demonstram que as cepas de B. breve MRX004 e o Teste 8 têm ativi- dade útil e ambas exibem fermentação intermediária de α- galactosidase e α-arabinose. Em modalidades particularmente preferi- das, as bactérias utilizadas na invenção exibem fermentação interme- diária de α-glucosidase, fermentação intermediária de α-arabinose e fermentação positiva de rabinose.

[0085] Em modalidades alternativas, as bactérias utilizadas na in- venção fermentam serina arilamidase, mas não leucilglicina arilamida- se e não alanina arilamidase, por exemplo, quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exemplo, quando submetidas à análise Rapid ID 32A. Os exemplos demonstram que as cepas de B. breve Teste 11 e Teste 12 têm atividade útil e ambas fermentam serina arilamidase,

mas não leucilglicina arilamidase e não alanina arilamidase. Em moda- lidades particularmente preferidas, a bactéria usada na invenção tam- bém fermenta rabinose.

[0086] Em modalidades alternativas, as bactérias utilizadas na in- venção exibem fermentação intermediária de serina arilamidase, por exemplo, quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exem- plo, quando submetidas à análise Rapid ID 32A. Os exemplos de- monstram que as cepas de B. breve o Teste 3 e Teste 7 têm atividade antimicrobiana potente e ambas exibem fermentação intermediária de serina arilamidase. Em modalidades particularmente preferidas, a bac- téria usada na invenção também fermenta rabinose.

[0087] Qualquer ensaio adequado conhecido na técnica pode ser usado para avaliar a capacidade de uma bactéria para fermentar uma fonte de carboidrato ou aminoácido. Preferencialmente, a análise Ra- pid ID 32A é usada (preferencialmente usando o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux).

[0088] Preferencialmente, as bactérias utilizadas na invenção pro- duzem o padrão mostrado na Figura 24 ou Figura 25 para MRX004 quando submetidas a eletroforese em gel de campo pulsado usando condições padrão, tais como aquelas usadas no Exemplo 10.

[0089] Em modalidades preferidas alternativas, a bactéria usada na invenção é capaz de fermentar um ou mais, tais como 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 ou todos de: amidon (amido), amigdalina, arbutina, celobi- ose, esculina, galactose, gentiobiose, glicose, glicogênio, frutose, fu- cose, lactose, maltose, manose, manitol, melibiose, melezitose, metil α-D-glucopiranosídeo, N-acetilglucosamina, ribose, sacarose (sacaro- se), salicina, sorbitol, trealose, turanose e xilitol. Em tais modalidades, qualquer ensaio adequado conhecido na técnica pode ser usado para avaliar a capacidade de uma bactéria para fermentar uma fonte de carboidrato. Preferencialmente, a análise API 50 CH é usada da bio- Mérieux.

[0090] Em certas modalidades, as composições da invenção com- preendem uma cepa de Bifidobacterium breve que exibe ligação redu- zida a células humanas, em particular quando testada em meio YCFA, em particular sob as condições do Exemplo 5.

[0091] Em certas modalidades, uma composição da invenção compreende um biotipo da bactéria depositada sob o número de aces- so NCIMB 42380. As cepas bacterianas que são biótipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 também devem ser eficazes para estimular o sistema imunológico. Um biótipo terá ativida- de imunomodulatória comparável à cepa NCIMB 42380 original. Um biótipo é uma cepa intimamente relacionada que possui as mesmas ou características muito fisiológicas e bioquímicas.

[0092] Um biótipo irá induzir efeitos comparáveis no sistema imu- nológico aos efeitos mostrados nos exemplos, que podem ser identifi- cados usando os protocolos de cultura e administração descritos nos exemplos. Em particular, um biotipo irá induzir um efeito nas células T e citocinas comparável ao NCIMB 42380.

[0093] As cepas que são biotipos de uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 e que são adequadas para uso na invenção podem ser identificadas por sequenciamento de outras se- quências de nucleotídeos para uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. por exemplo, substancialmente todo o ge- noma pode ser sequenciado e uma cepa de biotipo para uso na inven- ção pode ter pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência em pelo menos 80% de todo o genoma (por exemplo, em pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99%, ou em todo o genoma). Por exemplo, em algumas modalidades, uma cepa de bióti- po tem pelo menos 98% de identidade de sequência em pelo menos

98% de seu genoma ou pelo menos 99% de identidade de sequência em 99% de seu genoma. Outras sequências adequadas para uso na identificação de cepas de biótipo podem incluir hsp60 ou sequências repetitivas, como BOX, ERIC, (GTG)5 ou REP [20].

[0094] As cepas de biótipo podem ter tais sequências com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente de uma bactéria deposi- tada sob o número de acesso NCIMB 42380. Em algumas modalida- des, uma cepa de biótipo pode ter uma sequência de rRNA 16S com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identida- de de sequência com a sequência correspondente de uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. Em algumas mo- dalidades, uma cepa de biótipo pode compreender uma sequência de rRNA 16S que é pelo menos 99% idêntica (por exemplo, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% idêntica) à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, uma cepa de biotipo tem a sequência de rRNA 16S de SEQ ID NO: 1.

[0095] Alternativamente, as cepas que são biótipos de uma bacté- ria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 e que são ade- quadas para uso na invenção podem ser identificadas pela utilização do depósito de número de acesso NCIMB 42380 e análise de fragmen- to de restrição e/ou análise de PCR, por exemplo, usando polimorfis- mo de comprimento de fragmento amplificado fluorescente (FAFLP) e impressão digital de elemento de DNA repetitivo (rep)-PCR ou perfil de proteína ou sequenciamento parcial de 16S ou 23s rDNA. Em modali- dades preferidas, tais técnicas podem ser usadas para identificar ou- tras cepas de Bifidobacterium breve.

[0096] Em certas modalidades, as cepas que são biótipos de uma

[20] Masco et al. (2003) Systematic and Applied Microbiology, 26:557-563.

bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 e que são adequadas para uso na invenção são cepas que fornecem o mesmo padrão que uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, quando analisada por análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA), por exemplo, ao usar a enzima de restrição Sau3AI (para métodos exemplares e orientação, ver, por exemplo

[21]). Alternativamente, as cepas de biótipo são identificadas como ce- pas que têm os mesmos padrões de fermentação de carboidratos que uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380.

[0097] Outras cepas de Bifidobacterium breve que são úteis nas composições e métodos da invenção, tais como biotipos de uma bac- téria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, podem ser identificadas usando qualquer método ou estratégia apropriada, inclu- indo os ensaios descritos nos exemplos. Em particular, as cepas bac- terianas que têm padrões de crescimento, tipo metabólico e/ou antíge- nos de superfície similares a uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380 podem ser úteis na invenção.

[0098] Em certas modalidades, uma composição da invenção compreende um derivado da bactéria depositada sob o número de acessão NCIMB 42380. Um derivado da cepa depositada sob o núme- ro de acesso NCIMB 42380 pode ser uma cepa filha (progênie) ou uma cepa cultivada (subclonada) do original. Um derivado de uma ce- pa da invenção pode ser modificado, por exemplo, no nível genético, sem ablação da atividade biológica. Em particular, uma cepa derivada da invenção é terapeuticamente ativa. Uma cepa derivada terá ativida- de imunomodulatória comparável à cepa NCIMB 42380 original. Uma cepa derivada terá atividade modulatória da microbiota comparável à cepa original NCIMB 42380. Uma cepa derivada será, portanto, eficaz na estimulação do sistema imunológico.

[21] Srůtková et al. (2011) J. Microbiol. Methods, 87(1):10-6.

[0099] Uma cepa derivada provocará modelos de câncer de efei- tos comparáveis aos efeitos mostrados nos exemplos, que podem ser identificados usando os protocolos de cultura e administração descri- tos nos exemplos. Em particular, uma cepa derivada irá induzir um efeito de citocinas e expressão gênica comparável àquelas de uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. Em parti- cular, uma cepa derivada irá induzir um efeito na estimulação imunoló- gica comparável ao de uma bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380. Um derivado da cepa NCIMB 42380 geralmen- te será um biótipo da cepa NCIMB 42380.

[00100] A cepa bacteriana também pode ser uma cepa que tem as mesmas características de segurança e eficácia terapêutica que a ce- pa depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, e tais células são englobadas pela invenção. A composição pode, portanto, compre- ender uma cepa de Bifidobacterium breve que não é a cepa deposita- da sob o número de acesso NCIMB 42380, mas tem as mesmas ca- racterísticas de segurança e eficácia terapêutica que as cepas deposi- tadas sob o número de acesso NCIMB 42380. As características de segurança de uma cepa podem ser estabelecidas, por exemplo, tes- tando a resistência da cepa a antibióticos, por exemplo distinguindo entre resistência intrínseca e transmissível a antibióticos. As caracte- rísticas de segurança de uma cepa também podem ser estabelecidas avaliando as propriedades patogênicas de uma cepa in vitro, por exemplo, os níveis de produção de toxina. Outros testes de segurança incluem testar a toxicidade aguda ou crônica da cepa bacteriana em modelos de ratos e camundongos. A eficácia terapêutica de uma cepa pode ser estabelecida por caracterização funcional da cepa bacteriana in vitro e in vivo usando um modelo relevante.

[00101] Em modalidades preferidas, as cepas bacterianas nas composições da invenção são viáveis e capazes de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[00102] Em uma modalidade preferida, a cepa bacteriana para uso na invenção tem baixa aderência às células epiteliais intestinais hu- manas, em particular células Caco-2, em YCFA em comparação com uma ou mais das cepas B. breve listadas na Figura 9 (tal como ade- rência de menos de 1% da cultura total, como preferencialmente me- nos de 0,5% ou menos de 0,3%) e produz mais exopolissacarídeos de superfície ligados em comparação com uma ou mais das cepas B. breve listadas na Figura 9.

[00103] Em certas modalidades preferidas, a cepa bacteriana para uso na invenção é capaz de fermentar o polissacarídeo rafinose, por exemplo, quando cultivada em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas.

[00104] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na in- venção tem capacidade reduzida para fermentar α-glucosidase e/ou β- glucosidase em comparação com Bifidobactérias, em particular B. bre- ve, por exemplo, quando cultivada em um meio de suspensão apropri- ado (como suspensão de API médio) a 37ºC durante 4 horas.

[00105] Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na in- venção compreende um ou mais dos genes listados na Tabela 1 do documento WO2016/203223, que é incorporado neste documento por referência, como 5, 10, 20, 50 ou todos os genes em Tabela 1 do do- cumento WO2016/203223. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais dos genes listados na Tabela 1 do WO2016/203223 que são destacados com um sublinhado único, como o componente transmembranar BL0694 do módulo de energização do transportador ECF previsto e/ou BL0693 de compo- nente ATPase duplicado do módulo de energização do transportador ECF previsto. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais dos genes listados na Tabela 1 do

WO2016/203223 que estão destacados com um sublinhado duplo e em negrito, como 1, 2, 3, 4 ou 5 genes selecionados de: maltodextrina glucosidase (EC 3.2.1.20), galactosidase putativa, celulose sintase (formadora de UDP) (EC 2.4.1.12), quitinase (EC 3.2.1.14) e caixa sensorial/proteína da família GGDEF. Em certas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais dos genes listados na Tabela 1 de WO2016/203223 que estão destacados em itálico, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 genes selecionados a partir de: subunidade PfaA da sintase de ácidos graxos poliinsaturados ômega- 3, policetídeo sintase do tipo I, glicosil hidrolase putativa de função desconhecida (DUF1680), componente ATPase BioM do módulo de energização do transportador ECF de biotina, família ATPase E1-E2 transportadora de cátions, Ribose ABC sistema de transporte de prote- ína permease RbsC (TC 3.A.1.2.1), Ribose ABC sistema de transporte de proteína de ligação de ATP RbsA (TC 3.A.1.2.1), 3'-a-5 'oligoribo- nuclease (orn), proteína de membrana relacionada com a proteína Ac- tinobacillus (1944168).

[00106] Em modalidades preferidas, a cepa bacteriana para uso na invenção compreende um ou mais (tais como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 ou todos) genes selecionados de: 2-succinil-5-enolpiruvil -6- hidroxi-3-ciclohexeno-1-ácido carboxílico sintase (EC 2.2.1.9); Oligori- bonuclease 3'-a-5'(orn); Alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); Componente ATPase do módulo geral de energização dos transportadores ECF; ATPase componente STY3233 do módulo de energização do transpor- tador ECF regulado por queuosina; DNA helicase recG dependente de ATP (EC 3.6.1.-); Beta-glucosidase (EC 3.2.1.21); Celulose sintase (formadora de UDP) (EC 2.4.1.12); Quitinase (EC 3.2.1.14); COG1309: regulador transcricional; D-alanil-D-alanina carboxipeptidase (EC

3.4.16.4); Componente ATPase duplicado BL0693 do módulo de ener- gização do transportador ECF previsto; Frutoquinase (EC 2.7.1.4); Gli-

cose/manose: H+ simportador GlcP; Glicosiltransferase (EC 2.4.1.-); GMP sintase [hidrólise de glutamina] (EC 6.3.5.2); Açúcar quinase hi- potética em cluster com indigoidina sintase indA, família PfkB de qui- nases; Inosina-uridina preferindo nucleosídeo hidrolase (EC 3.2.2.1); Proteína ribossômica LSU L31p na proteína ribossomal LSU L31p, in- dependente de zinco; Proteína ribossomal LSU L33p na proteína ri- bossomal LSU L33p, independente de zinco; Maltodextrina glucosida- se (EC 3.2.1.20); Proteína de membrana, relacionada com a proteína Actinobacillus (1944168); Precursor da transglicosilase D de mureína lítica ligada à membrana (EC 3.2.1.-); Metiltransferase (EC 2.1.1.-); Butanol desidrogenase A dependente de NADH (EC 1.1.1.-); Fosfogli- colato fosfatase (EC 3.1.3.18); Fosforibosilantranilato isomerase (EC

5.3.1.24); Glicosil-hidrolase putativa de função desconhecida (DUF1680); Permease de translocação de polissacarídeo contendo ramnose; Ribokinase (EC 2.7.1.15); Sistema de transporte de ribose ABC, proteína de ligação de ATP RbsA (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte de ribose ABC, proteína de ligação de ATP RbsA (TC

3.A.1.2.1); Sistema de transporte Ribose ABC, permease de alta afini- dade RbsD (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte de ribose ABC, pro- teína periplasmática de ligação à ribose RbsB (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte de ribose ABC, proteína permease RbsC (TC 3.A.1.2.1); Sistema de transporte de ribose ABC, proteína permease RbsC (TC

3.A.1.2.1); Sorbitol desidrogenase (EC 1.1.1.14); Proteína ribossomal SSU S14p (S29e) na proteína ribossômica SSU S14p (S29e), inde- pendente de zinco; Componente específico do substrato STY3230 do transportador ECF regulado por queuosina; Sacarose-6-fosfato hidro- lase (EC 3.2.1.B3); O ácido teicoico exporta a proteína de ligação ao ATP TagH (EC 3.6.3.40); Componente transmembranar BL0694 do módulo de energização do transportador ECF previsto; Componente transmembranar STY3231 do módulo de energização do transportador

ECF regulado por queuosina; Regulador de resposta de dois compo- nentes colocalizado com o transportador HrtAB; Sistema de restrição- modificação do tipo I, DNA-metiltransferase subunidade M (EC

2.1.1.72); Sistema de restrição-modificação do tipo I, subunidade de restrição R (EC 3.1.21.3); Sistema de restrição-modificação do tipo I, especificidade subunidade S (EC 3.1.21.3); Sistema de restrição- modificação do tipo I, especificidade subunidade S (EC 3.1.21.3); Sis- tema de restrição-modificação do tipo I, especificidade subunidade S (EC 3.1.21.3); Xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9); e transportador ABC de xilose, proteína de ligação a xilose periplasmática XylF. Em modali- dades preferidas, a cepa bacteriana para uso na invenção compreen- de um ou mais (tais como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou todos) genes que estão listados na frase precedente e que não estão destacados na Tabela 1 do documento WO2016/203223. Usos terapêuticos Estimulação do sistema imunológico

[00107] Os exemplos mostram que a administração das composi- ções da invenção pode levar à estimulação imunológica. Uma vez que foi demonstrado que a administração das composições da invenção tem um efeito imunoestimulador, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, em particular doenças caracteri- zadas por ativação imunológica reduzida e doenças tratáveis por uma resposta imunológica aumentada. Em certas modalidades, as compo- sições da invenção são para uso na estimulação do sistema imunoló- gico. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças, estimulando o sistema imunológico. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na promoção de uma resposta imunológica. Preferencialmente, a inven- ção fornece uma composição compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para qualquer uso como um adjuvante de vacina.

[00108] A imunodeficiência é um estado em que o sistema imunoló- gico de um paciente está comprometido ou totalmente ausente. Uma doença de imunodeficiência é um exemplo de doença que se caracte- riza por uma ativação imunológica reduzida e em que seria vantajoso estimular o sistema imunológico do paciente para tratar a doença. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de uma doença de imunodeficiência.

[00109] Existem dois tipos de doenças de imunodeficiência. As do- enças da imunodeficiência primária são distúrbios imunológicos here- ditários resultantes de mutações genéticas que geralmente estão pre- sentes no nascimento e são diagnosticadas na infância. As doenças de imunodeficiência secundária são imunodeficiências adquiridas que são o resultado de uma doença ou de uma fonte ambiental, como um produto químico tóxico. Em algumas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de uma doença de imunodeficiência primária ou uma doença de imunodeficiência secun- dária.

[00110] Exemplos de distúrbios de imunodeficiência primária e exemplos incluem agamaglobulinemia ligada ao X (XLA), doença gra- nulomatosa crônica (CGD), imunodeficiência comum variável (CVID) e imunodeficiência combinada grave (SCID), que também é conhecida como alinfocitose ou doença do "menino da bolha" doença. Os distúr- bios da imunodeficiência secundária podem ser causados por, por exemplo, queimaduras graves, quimioterapia, radiação, diabetes, des- nutrição. Exemplos de distúrbios de imunodeficiência secundária in- cluem AIDS, cânceres do sistema imunológico, como leucemia, doen- ças imunocomplexas, como hepatite viral, mieloma múltiplo [22]. O in-

[22] https://www.immunology.org/policy-and-public- affairs/briefings-and-position-statements/immunodeficiency terferon-γ é uma terapia aprovada para a doença de imunodeficiência CGD [23]. Os exemplos demonstram que as composições da invenção podem aumentar a produção de IFN-γ, portanto, as composições da invenção podem ser particularmente eficazes no tratamento de doen- ças de imunodeficiência, incluindo doenças de imunodeficiência primá- ria e secundária.

[00111] Em modalidades preferidas, a composição da invenção é para uso na estimulação do sistema imunológico por meio da estimu- lação de TLR2. Em certas modalidades, a composição da invenção é para estimular TLR2 no tratamento de doenças. Em certas modalida- des, a composição da invenção é para uso no tratamento de uma do- ença associada à diminuição da atividade de TLR2 ou é para uso no tratamento de um paciente identificado como tendo diminuição da ati- vidade de TLR2. Preferencialmente, a invenção fornece uma composi- ção compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para qual- quer uso como um adjuvante de vacina.

[00112] Em certas modalidades, o tratamento com composições da invenção conduz uma resposta de células Th1. Em certas modalida- des, as composições da invenção são para uso na condução de uma resposta de células Th1 no tratamento de doenças. Em certas modali- dades, a composição da invenção é para uso no tratamento de uma doença associada à diminuição da atividade das células Th1, ou é pa- ra uso no tratamento de um paciente identificado como tendo uma di- minuição da atividade das células Th1. Preferencialmente, a invenção fornece uma composição compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para qualquer uso como um adjuvante de vacina.

[23] Marciano and Holland (2017) Artigo de Revisão, Front. Im- munol., Https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00937

[00113] Em modalidades preferidas, a composição da invenção é para uso na estimulação do sistema imunológico por meio da ativação de NFκB. Em certas modalidades, a composição da invenção é para estimular NFκB no tratamento de doenças. Em certas modalidades, a composição da invenção é para uso no tratamento de uma doença as- sociada à diminuição da atividade de NFκB ou é para uso no tratamen- to de um paciente identificado como tendo diminuição da atividade de NFκB. Preferencialmente, a invenção fornece uma composição com- preendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para qualquer uso como um adjuvante de vacina.

[00114] As composições da invenção podem ser úteis no tratamen- to de doenças caracterizadas por níveis diminuídos de células CD8+ ativadas. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imunológica, aumentando a atividade ou os níveis de células CD8+. Em uma modalidade, a composição da invenção é para uso no tratamento de doenças, aumentando a ativida- de ou os níveis de células CD8+. Em uma modalidade, as composi- ções da invenção são para uso na estimulação da resposta imunológi- ca pela ativação de células CD8+.

[00115] As composições da invenção podem ser úteis no tratamen- to de doenças caracterizadas por níveis diminuídos de células B. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na esti- mulação da resposta imunológica, aumentando a atividade ou os ní- veis de células B. Em uma modalidade, a composição da invenção é para uso no tratamento de doenças, aumentando a atividade ou os níveis de células B. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imunológica pela ativação de células B.

[00116] As composições da invenção podem ser úteis no tratamen-

to de doenças caracterizadas por níveis diminuídos de células CD8+CD25+ ativadas. Em uma modalidade, as composições da inven- ção são para uso na estimulação da resposta imunológica, aumentan- do a atividade ou os níveis de células CD8+CD25+. Em uma modalida- de, a composição da invenção é para uso no tratamento de doenças, aumentando a atividade ou os níveis de células CD8+CD25+. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimula- ção da resposta imunológica pela ativação de células CD8+CD25+.

[00117] As composições da invenção podem ser úteis no tratamen- to de doenças caracterizadas por uma diminuição no número ou por- centagem de células B. Em uma modalidade, as composições da in- venção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracte- rizadas pela diminuição no número ou porcentagem de células B. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no trata- mento ou prevenção de doenças, aumentando o número ou porcenta- gem de células B em populações de células, em que o aumento no número ou porcentagem de células B resulta em estimulação imunoló- gica. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na estimulação da resposta imunológica, aumentando o número ou porcentagem de células B.

[00118] Os exemplos mostram que a administração das composi- ções da invenção pode levar a um aumento na expressão de molécu- las pró-inflamatórias, tais como citocinas pró-inflamatórias. Exemplos de moléculas pró-inflamatórias que mostraram um aumento nos níveis de expressão mediante a administração de composições da invenção incluem IL-12p70, TNF-α, IL-4, IFNγ e IL-17α. Uma vez que a adminis- tração das composições da invenção mostrou aumentar a expressão de moléculas pró-inflamatórias, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de moléculas pró-inflamatórias, tais como citocinas pró-

inflamatórias. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de moléculas pró- inflamatórias, em particular doenças caracterizadas por uma diminui- ção na expressão e/ou atividade de citocinas pro-inflamatórias. Em uma modalidade particular, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma dimi- nuição na expressão e/ou atividade de IL-12p70, TNF-α, IL-4 e/ou IFNγ. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-12p70, TNF-α, IL-4 e/ou IFNγ. Em uma modalida- de, as composições da invenção são para uso na promoção da res- posta imunológica aumentando a expressão e/ou atividade de IL- 12p70, TNF-α, IL-4 e/ou IFNγ. Em uma modalidade particular, as com- posições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou ativi- dade de IL-17α IL-12p70, TNF-α, IL-4, IFNγ e/ou IL -17α. Em uma mo- dalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL- 12p70, TNF-α, IL-4 IFNγ e/ou IL-17α. Em uma modalidade, as compo- sições da invenção são para uso na promoção da resposta imunológi- ca, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-12p70, TNF-α, IL-4 IFNγ e/ou IL-17α.

[00119] Os exemplos também mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de IL-1. IL-1 é uma citocina pró-inflamatória [24]. A produção e secre- ção de IL-1 são reguladas pelo inflamassoma, um complexo proteico que está associado à ativação da resposta inflamatória [25]. Uma vez

[24] Ren e Torres (2009) Brain Res Rev.;60(1):57-64

[25] Martinon et al. (2002) Mol Cell.;10(2):417-26.

que foi demonstrado que a administração das composições da inven- ção aumenta a expressão de IL-1, as composições da invenção po- dem ser úteis no tratamento de doenças caracterizadas por uma dimi- nuição na expressão de IL-1. Em uma modalidade particular, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou ati- vidade de IL-1. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-1.

[00120] Os exemplos mostram que a administração das composi- ções da invenção pode levar a um aumento na expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória conhecida por estar envolvida em várias vias de sinalização para pro- mover a morte celular. O TNF-α inicia a apoptose ligando-se ao seu receptor cognato, TNFR-1, que leva a uma cascata de eventos de cli- vagem na via apoptótica [26]. O TNF-α também pode desencadear a necrose por meio de um mecanismo dependente da RIP quinase [27]. Uma vez que a administração das composições da invenção mostra um aumento na expressão de TNF-α, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, em particular para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminui- ção na expressão de TNF-α. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças caracterizadas por expressão diminuída de TNF-α. Em uma modalidade particular, as composições da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou ati- vidade de TNF-α. Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser úteis para o tratamento ou prevenção de doenças, aumen-

[26] Gaur e Aggarwal (2003).Biochem Pharmacol.;66(8):1403-8.

[27] Wang e Lin (2008) Acta Pharmacol Sin.; 29(11): 1275–1288.

tando a expressão e/ou atividade de TNF-α. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na promoção da resposta imunológica aumentando a expressão e/ou atividade de TNF-α.

[00121] Uma vez que a administração das composições da inven- ção mostra um aumento na expressão de IL-4, as composições da in- venção podem ser úteis no tratamento de doenças, em particular para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de IL-4. Em uma modalidade, as composi- ções da invenção são para uso no tratamento de doenças caracteriza- das por diminuição da expressão de IL-4. Em uma modalidade particu- lar, as composições da invenção são para uso no tratamento ou pre- venção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de IL-4. Em uma modalidade, as composições da in- venção podem ser úteis para o tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-4. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na promoção da resposta imunológica aumentando a expressão e/ou atividade de IL-4.

[00122] Uma vez que a administração das composições da inven- ção mostra um aumento na expressão deIL-17α, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, em particular pa- ra uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de IL-17α. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças ca- racterizadas por diminuição da expressão de IL-17α. Em uma modali- dade particular, as composições da invenção são para uso no trata- mento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de IL-17α. Em uma modalidade, as com- posições da invenção podem ser úteis para o tratamento ou prevenção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL-17α. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na pro-

moção da resposta imunológica aumentando a expressão e/ou ativi- dade de IL-17α.

[00123] Uma vez que a administração das composições da inven- ção mostra um aumento na expressão de IL-12p70, as composições da invenção podem ser úteis no tratamento de doenças, em particular para uso no tratamento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão de IL-12p70. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de doenças ca- racterizadas por diminuição da expressão de IL-12p70. Em uma moda- lidade particular, as composições da invenção são para uso no trata- mento ou prevenção de doenças caracterizadas por uma diminuição na expressão e/ou atividade de IL-12p70. Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser úteis para o tratamento ou pre- venção de doenças, aumentando a expressão e/ou atividade de IL- 12p70. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na promoção da resposta imunológica aumentando a expressão e/ou atividade de IL-12p70.

[00124] Em certas modalidades, a doença a ser tratada pelas com- posições da invenção não é câncer.

[00125] Em certas modalidades, a doença a ser tratada pela com- posição da invenção não é mediada por IL-17 ou a via Th17. Em cer- tas modalidades, as composições da invenção aumentam a expressão ou atividade de IL-17 e/ou a via Th17.

[00126] Em modalidades preferidas da invenção, o sujeito a quem a composição da invenção é administrada não está tomando suplemen- tos de ácido linoleico e/ou não tem uma dieta rica em ácido linoleico. Adicionalmente ou alternativamente, a composição da invenção não compreende ácido linoleico.

[00127] Nas modalidades, a composição da invenção não compre- ende beta-galacto-oligossacarídeos A e/ou B.

[00128] Os pacientes que precisam de estimulação imunológica po- dem correr o risco de infecções bacterianas. Os exemplos demons- tram que as composições da invenção têm atividade antimicrobiana. Portanto, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na estimulação do sistema imunológico e no tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de uma infec- ção bacteriana, estimulando o sistema imunológico e inibindo o cres- cimento da infecção bacteriana. Em certas modalidades, as composi- ções da invenção são para uso na promoção de uma resposta imuno- lógica contra uma bactéria patogênica e na inibição do crescimento da bactéria. Preferencialmente, a infecção bacteriana é do trato gastroin- testinal. Preferencialmente, a infecção bacteriana é de bactérias Gram- negativas.

[00129] Os exemplos também demonstram que as composições da invenção promovem a diferenciação de células T helper e linfócitos T citotóxicos. Portanto, em certas modalidades, as composições da in- venção são para uso na estimulação da diferenciação de células T helper e/ou linfócitos T citotóxicos. Uso como um adjuvante de vacina

[00130] Os exemplos mostram que a administração das composi- ções da invenção estimula o sistema imunológico e pode levar a um aumento na expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e ati- vação de TLR2. O TNF-α é conhecido por ser importante para as res- postas às vacinas. por exemplo, o TNF-α demonstrou ser necessário para uma resposta vacinal eficiente na vacinação contra a gripe da população idosa [28]. Da mesma forma, TLR2 é um alvo importante para adjuvantes de vacinas para melhorar as respostas [29]. Uma vez

[28] Bloch et al. (2016) Eur Cytokine Netw.;27(3):63-67

[29] Dowling and Mansell (2016) Clin Transl Immunology. Maio que a administração das composições da invenção mostrou aumentar a expressão de TNF-α e a atividade de TLR2, as composições da in- venção podem ser úteis como um adjuvante de vacina. Em uma moda- lidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de TNF-α. Em uma mo- dalidade, as composições da invenção são para uso como um adju- vante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de TLR2. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um ad- juvante de vacina. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina na terapia contra gripe. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no aumento de uma resposta imunológico contra um antígeno. Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição a ser administrada em combinação com um antígeno. Em certas modalidades, as compo- sições da invenção são para administração a um paciente logo antes ou após a vacinação. Preferencialmente, a invenção fornece uma composição compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para qualquer uso como um adjuvante de vacina.

[00131] Os exemplos demonstram que as bactérias da invenção ativam TLR2. Os agonistas de TLR estão em desenvolvimento como adjuvantes de vacina em uma faixa de tipos de antígenos, particular- mente na população idosa [30]. Portanto, as composições da invenção podem ser úteis como adjuvantes de vacina, em particular para vacina administrada a pacientes idosos (por exemplo, mais de 40, 50, 60, 70 ou 80 anos de idade), que podem ter atividade do sistema imunológico reduzida. A sinalização de TLR2 também desempenha um papel fun- damental nas respostas imunológicas inatas associadas à idade de 2016; 5(5): e85.

[30] Weinberger (2018) Curr Opin Pharmacol, 41, 34-41.

[31].Em certas modalidades, as composições são para uso no aumen- to de uma resposta imunológica inata. Embora os agonistas de TLR2 estejam em desenvolvimento como adjuvantes de vacinas, todos são de patógenos conhecidos e/ou sintéticos. Em contraste, as composi- ções da invenção compreendem bactérias comensais.

[00132] Os exemplos também mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão de IL-1. Li et al. [32] mostraram que o hidróxido de alumínio adjuvante ativou a secreção de IL-1e sugeriram que a própria IL- pode atuar como adjuvante. Uma vez que a administração das composições da invenção mostrou aumentar a expressão de IL-1, as composições da invenção podem ser úteis como um adjuvante de vacina.

[00133] Os exemplos demonstram que as composições da inven- ção podem aumentar os níveis de IFNγ e promover uma resposta de células Th1, ambas as quais estão associadas a respostas aumenta- das de anticorpos contra antígenos [33]. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na promoção de um anticorpo resposta contra um antígeno, em particular um antígeno patogênico ou de câncer. Além disso, é uma medida de IFN-γ de respostas de célu- las T induzidas por vacina em voluntários que receberam vacinas con- tra malária investigadas [34]. Em certas modalidades, as composições da invenção são para uso na promoção de uma resposta de células T contra um antígeno, em particular um antígeno patogênico ou de cân- cer. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de IFN-γ. Em certas modalidades, as composições são para uso na pro-

[31] Lim (2015)Aging Cell 14, 907–915

[32] Li et al, (2007) J Immunol, 178(8), 5271–5276

[33] Park et al., (2002) J Immunol, 169(3), 1433-1443

[34] Berthoud et al. (2009) J Immunol Methods 340(1) 33-41 teção contra a malária.

[00134] Os exemplos também mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na expressão ou nos níveis de IL-12p70. Este efeito foi associado à eficácia do adjuvan- te da vacina e a própria IL-12 foi proposta como um adjuvante [35], o que sugere que as composições da invenção serão eficazes como ad- juvantes. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, aumentando o nível e/ou atividade de IL-12p70.

[00135] Em algumas modalidades, quando usadas como um adju- vante de vacina, as composições da invenção serão administradas por conta própria para fornecer um efeito adjuvante a um antígeno que foi administrado separadamente ao paciente. Em certas modalidades, a composição da invenção é administrada por via oral, enquanto o antí- geno é injetado por via parenteral.

[00136] As composições da invenção podem ser usadas para au- mentar uma resposta imunológica a qualquer antígeno útil. Antígenos exemplares para uso com a invenção incluem: antígenos virais, tais como proteínas de superfície viral; antígenos bacterianos, tais como antígenos de proteína e/ou sacarídeo; antígenos fúngicos; antígenos parasitas; e antígenos tumorais. A invenção é particularmente útil para vacinas contra o vírus influenza, HIV, ancilostomíase, vírus da hepatite B, vírus herpes simplex, raiva, vírus sincicial respiratório, citomegaloví- rus, Staphylococcus aureus, clamídia, coronavírus SARS, vírus varice- la zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, tubercu- lose, Bacillus anthracis, vírus de Epstein Barr, papilomavírus humano, etc. Antígenos adicionais para uso com a invenção incluem antígenos de glicoproteína e lipoglicano, antígenos de archaea, antígeno de me- lanoma E (MAGE), antígeno carcinoembrionário (CEA), MUC-1, HER2,

[35] Mori et al. (2012), Eur J Immunol 42, 2709-2719 sialil-Tn (STn), transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT), gene do tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno específico da prós- tata (PSA), antígenos do vírus Epstein-Barr, neoantígenos, oncoprote- ínas, beta-amiloide, Tau, PCSK9 e substâncias formadoras de hábitos, por exemplo, nicotina, álcool ou opiáceos.

[00137] Os antígenos preferidos para uso com a invenção incluem antígenos de patógenos e antígenos tumorais. Um antígeno induzirá uma resposta imunológica específica para o antígeno que será eficaz para proteger contra a infecção com o patógeno ou atacar o tumor. Os antígenos podem ser, por exemplo, peptídeos ou polissacarídeos.

[00138] A invenção também fornece o uso de: (i) uma preparação aquosa de um antígeno; e (ii) uma composição compreendendo uma cepa bacteriana da espécie B. breve, na fabricação de um medica- mento para aumentar uma resposta imunológica em um paciente. Pre- ferencialmente, a cepa bacteriana é a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo da mesma.

[00139] A resposta imunológica gerada por esses métodos e usos geralmente incluirá uma resposta de anticorpo, preferencialmente, uma resposta de anticorpo protetora.

[00140] Em algumas modalidades, uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve é manipulada para apresentar um antígeno. A apresentação de um antígeno na cepa bacteriana da invenção pode maximizar as atividades imunoestimulatórias e aumentar adicional- mente mais a resposta imunológica protetora gerada contra o antíge- no. Além disso, a fabricação e distribuição de produtos terapêuticos compreendendo um antígeno e uma bactéria da invenção pode ser mais eficiente e eficaz desta forma do que quando cada um dos antí- genos e a composição que compreende a cepa bacteriana são fabri- cados e administrados separadamente. Portanto, em algumas modali- dades, a invenção fornece uma composição que compreende uma ce-

pa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve que apresenta um an- tígeno, por exemplo, na sua superfície celular. Em algumas modalida- des, a composição que compreende a cepa bacteriana que apresenta um antígeno é para uso como um antígeno de vacina. Em algumas modalidades, o antígeno é derivado de HIV, ancilostomíase, vírus da hepatite B, vírus herpes simplex, raiva, vírus sincicial respiratório, ci- tomegalovírus, Staphylococcus aureus, clamídia, SARS coronavírus, vírus varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningiti- dis, Mycobacterium meningitidis, Mycobacterium Bacillus anthracis, vírus Epstein Barr ou vírus do papiloma humano. Em algumas modali- dades, o antígeno é um antígeno de glicoproteína, antígeno de lipogli- cano, antígeno de archaea, antígeno de melanoma E (MAGE), antíge- no carcinoembrionário (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), transcrip- tase reversa de telomerase humana (hTERT), Gene do tumor de Wilms (WT1), CA-125, antígeno específico da próstata (PSA), antíge- nos do vírus Epstein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, beta- amiloide, Tau, PCSK9 ou uma substância formadora de hábito, como álcool, opiáceos e similares.

[00141] Em algumas modalidades, a bactéria da invenção expressa um ou mais antígenos. Geralmente, o antígeno será expresso de for- ma recombinante e será heterólogo para as bactérias da invenção. Portanto, a invenção fornece uma cepa bacteriana da espécie Bifido- bacterium breve que expressa um antígeno heterólogo. O antígeno pode ser parte de um polipeptídeo de fusão expresso com um ou mais polipeptídeos homólogos à bactéria. Em algumas modalidades, a bac- téria expressa o antígeno como um polipeptídeo de não fusão. Em al- gumas modalidades, a invenção fornece uma composição que com- preende uma célula de uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacte- rium breve, em que a célula expressa um antígeno heterólogo. Em al- gumas modalidades, a composição é para uso como vacina. Em al-

gumas modalidades, a invenção fornece uma célula de uma cepa bac- teriana da espécie Bifidobacterium breve, em que a célula expressa um antígeno heterólogo. Em algumas modalidades, a célula é para uso como vacina.

[00142] Antígenos exemplares para uso com a invenção incluem: antígenos virais, tais como proteínas de superfície viral; antígenos bac- terianos, tais como antígenos de proteína e/ou sacarídeo; antígenos fúngicos; antígenos parasitas; e antígenos tumorais. Outros antígenos para expressão em uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve incluem antígenos de glicoproteína e lipoglicano, antígenos de archaea, antígeno de melanoma E (MAGE), antígeno carcinoembrio- nário (CEA), MUC-1, HER2, sialil-Tn (STn), transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT), gene do tumor de Wilms (WT1), CA- 125, antígeno específico da próstata (PSA), antígenos do vírus Eps- tein-Barr, neoantígenos, oncoproteínas, beta-amiloide, Tau, PCSK9 e substâncias formadoras de hábito, por exemplo, nicotina, álcool, opiá- ceos ou similares.

[00143] A invenção também pode ser útil para aumentar a resposta a vacinas contra doenças não transmissíveis, como a doença de Al- zheimer e outras doenças neurodegenerativas, em que caso antígeno seja para uso com a invenção pode ser beta-amiloide ou Tau. Outros antígenos para doenças não transmissíveis incluem PCSK9 (para o tratamento de colesterol elevado).

[00144] A invenção também pode ser útil para aumentar a resposta a vacinas contra substâncias que formam hábito, por exemplo, nicoti- na, álcool ou opiáceos.

[00145] Os exemplos também demonstram que as composições da invenção têm atividade antimicrobiana. Portanto, as composições da invenção podem ser particularmente eficazes para uso em vacinas contra infecções bacterianas, em particular infecções bacterianas

Gram-negativas. As composições da invenção podem exercer um efei- to antimicrobiano contra a infecção bacteriana, ao mesmo tempo que estimulam o sistema imunológico a combater a infecção. Portanto, em certas modalidades, as composições da invenção tratam uma infecção bacteriana e evitam futuras infecções bacterianas. Terapias celulares Terapia de célula T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T)

[00146] Os exemplos também mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na ativação de TLR2. A estimulação de TLR2 potencializa a eficácia da terapia CAR-T

[36]. Portanto, as composições da invenção podem ser úteis na terapia celular, em particular na terapia com células CAR-T. Em uma modali- dade, as composições da invenção são para uso em terapia celular. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na terapia com células CAR-T. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no tratamento de leucemia linfocitária crônica. Preferencialmente, a invenção fornece uma composição compreen- dendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para qualquer uso como um ad- juvante de vacina.

[00147] Os exemplos também mostram que a administração das composições da invenção pode levar a um aumento na ativação de NFκB. A ativação de NFκB melhora a potência da terapia CAR-T [37]. Portanto, as composições da invenção podem ser úteis na terapia ce- lular, em particular na terapia com células CAR-T.

[00148] Em certas modalidades, as composições da invenção são administradas a um paciente antes da transferência adotiva de células T durante a terapia CAR-T.

[36] Lai et al. (2018) Leukemia, 32(3):801-808.

[37] Barnes et al. (2015) J Immunother Cancer. 2015; 3: 1..

[00149] Em certas modalidades, as composições da invenção são administradas a um paciente após a transferência adotiva de células T durante a terapia CAR-T.

[00150] Portanto, as composições da invenção podem ser úteis em terapia celular, em particular no aumento da resposta a uma terapia celular. Terapia com células-tronco mesenquimais (MSC)

[00151] Foi relatado que a terapia com células-tronco mesenqui- mais (MSC) tem propriedades imunoestimulatórias. Quando as MSCs são tratadas com LPS, elas regulam positivamente as citocinas pró- inflamatórias IL-8, que causam aumento da proliferação de células B

[38]. Portanto, uma vez que as composições da invenção mostraram aumentar a expressão da proliferação de células B, elas podem ser úteis em combinação com terapia com células MSC. Terapia de transplante de células-tronco

[00152] Foi relatado que, em vez de usar células-tronco indiferenci- adas na terapia de transplante de células-tronco, pode ser benéfico diferenciar as células-tronco até certo ponto antes do transplante. por exemplo, Heng et al. [39] relataram que a diferenciação cardiomiogê- nica de células-tronco pode ser benéfica por ter uma maior eficiência de enxerto, regeneração aprimorada de miócitos e restauração au- mentada da função cardíaca. Além disso, estudos demonstraram que a colonização GI com certas cepas comensais de bactérias pode me- lhorar a sobrevivência após transplante de células hematopoéticas alogênicas [40]. Uma vez que a administração das composições da

[38] Glenn e Whartenby (2014) World J Stem Cells.; 6(5): 526–

539.

[39] Heng et al. (2004) Cardiovasc Res. 1 de abril de 2004;62(1):34-42.

[40] Rashidi et al. (2018) Biology of Blood and Marrow Trans-

invenção estimula células, as composições da invenção podem ser úteis para a diferenciação de células-tronco na terapia de transplante de células-tronco. Imunosenescência

[00153] Fulop et al. [41] identificaram que um aumento no número de células Treg e uma diminuição no número de células B estão asso- ciados ao envelhecimento no sistema imunológico adaptativo. Portan- to, as composições da invenção podem ser usadas para prevenir ou retardar a imunosenescência. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso na prevenção da imunosenescência. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso no retar- do da imunosenescência caracterizada por um aumento no número de células Treg. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo da imunosenescência caracterizada por uma dimi- nuição no número de células B. Em outra modalidade, as composições da invenção são para uso no retardo da imunosenescência caracteri- zada por um aumento no número de células Treg e uma diminuição no número de células B. Em uma modalidade, as composições da inven- ção são para uso no retardo da imunosenescência pela diminuição do número de células Treg. Em uma modalidade, as composições da in- venção são para uso no retardo da imunosenescência pelo aumento do número de células B. Em outra modalidade, as composições da in- venção são para uso no retardo da imunosenescência, diminuindo o número de células Treg e aumentando o número de células B. Em uma modalidade, as composições da invenção são para uso no trata- mento de doenças causadas por imunosenescência. Em uma modali- dade, as composições da invenção são para uso no tratamento de do- enças relacionadas ao envelhecimento, retardando e/ou prevenindo a plantation 24, Issue 6, Páginas 1260–1263

[41] Fulop et al (2013) Crit Rev Oncog. 2013;18(6):489-513.

imunosenescência. Preferencialmente, a invenção fornece uma com- posição compreendendo a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB, ou um derivado ou biótipo do mesmo, para qual- quer uso como um adjuvante de vacina.

[00154] Além disso, foi proposto que os adjuvantes da vacina po- dem superar a imunosenescência [42]. Uma vez que as composições da invenção são adequadas para uso como um adjuvante de vacina, as composições da invenção podem ser úteis para prevenir ou retardar a imunosenescência. Em outra modalidade, as composições da inven- ção são para uso no retardamento e/ou prevenção da imunosenes- cência como um adjuvante de vacina. Em outra modalidade, as com- posições da invenção são para uso como um adjuvante de vacina, em que as composições retardam e/ou evitam a imunosenescência.

[00155] As doenças que estão associadas à imunosenescência in- cluem doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer e doença de Parkinson, câncer, diabetes mellitus tipo 2 [43] e distúrbios autoimunes [44].

[00156] Os sujeitos que sofrem de imunosenescência podem ser suscetíveis a infecções bacterianas. Os exemplos mostram que as composições da invenção têm atividade antimicrobiana. Portanto, em certas modalidades, as composições da invenção são para uso no tra- tamento ou prevenção de uma infecção bacteriana em um paciente exibindo imunosenescência, como um paciente idoso, ou um paciente com mais de 50, 55, 60, 65, 70 ou 75 anos de era. Tratamento e prevenção de infecções bacterianas

[00157] Os exemplos demonstram que B. breve e particularmente as cepas de B. breve da invenção têm uma potente atividade antimi-

[42] Bektas et al. (2017) J Leukoc Biol.;102(4):977-988.

[43] Fulop et al (2016) Rev Invest Clin.;68(2):84-91.

[44] Fulop et al. (2018) Front Immunol.;8:1960.

crobiana. Portanto, em certas modalidades, as composições da inven- ção são para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana.

[00158] Em modalidades preferidas, a infecção é uma infecção gas- trointestinal. As cepas de B. breve e, em particular, as cepas B. breve da invenção mostraram ter efeitos potentes quando administradas ao trato gastrointestinal (ver os exemplos e WO2016/2032). Em modali- dades preferidas, a infecção é uma infecção bacteriana Gram- negativa. Em modalidades especialmente preferidas, a infecção é uma infecção gastrointestinal Gram-negativa, como uma infecção por Heli- cobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi ou E. coli. Ge- ralmente, a infecção bacteriana é uma infecção bacteriana patogênica. Em modalidades preferidas, a composição da invenção é para uso no tratamento ou prevenção de infecção gastrointestinal por E. coli. Em modalidades preferencialmente adicionais, a composição da invenção é para uso no tratamento ou prevenção de infecção gastrointestinal por S. entérica.

[00159] Em algumas modalidades, a infecção bacteriana é de um gênero selecionado da lista que consiste em: Escherichia, Klebsiella, Salmonella e Bacillus. Em algumas modalidades, a infecção bacteria- na para tratamento ou prevenção é a infecção por E. coli. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Klebsiella pneumoniae. Em algumas modalidades, a in- fecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por S. Typhimurium. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por B. subtilis. As composições da invenção demonstraram ter uma potente atividade antimicrobiana con- tra essas bactérias.

[00160] Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tra- tamento ou prevenção é infecção por Pseudomonas aeruginosa. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou pre-

venção é infecção por Neisseria gonorrhoeae. Em algumas modalida- des, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Chlamydia trachomatis. Em algumas modalidades, a infecção bac- teriana para tratamento ou prevenção é infecção por Yersinia pestis. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Neisseria meningitidis. Em algumas modali- dades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Moraxella catarrhalis. Em algumas modalidades, a infecção bacte- riana para tratamento ou prevenção é infecção por Haemophilus influ- enzae. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para trata- mento ou prevenção é infecção por Legionella pneumophila. Em algu- mas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Pseudomonas aeruginosa. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Pro- teus mirabilis. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Enterobacter cloacae. Em al- gumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou preven- ção é infecção por Serratia marcescens. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é a infecção por Helicobacter pylori. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Salmonella Enteritidis. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Salmonella Typhi. Em algumas modalidades, a infecção bacteriana para tratamento ou prevenção é infecção por Salmonella Paratyphi. Estas bactérias são Gram-negativas, pelo que podem ser susceptíveis às composições da invenção, conforme ilus- trado nos exemplos.

[00161] Em algumas modalidades, a composição da invenção é pa- ra uso na redução da viabilidade de uma bactéria no tratamento de uma infecção bacteriana. As bactérias da invenção podem ser utiliza-

das para restaurar o nível de bactérias patogênicas a níveis assinto- máticos ou para eliminar as bactérias patogênicas inteiramente de um sujeito, tratando assim a infecção bacteriana, além de aliviar os sinto- mas associados ao nível elevado da bactéria. Em algumas modalida- des, a composição da invenção é para uso na inibição do crescimento de uma bactéria no tratamento de prevenção de uma infecção bacteri- ana. Em outras palavras, a composição pode ter atividade citostática em relação a bactérias que causam uma infecção.

[00162] Em certas modalidades, a composição retarda o início de uma infecção recorrente ou impede uma infecção recorrente. Em cer- tas modalidades, o sujeito a ser tratado corre o risco de desenvolver uma infecção bacteriana, como um veículo assintomático da bactéria. Em outras modalidades, as composições da invenção são para uso no tratamento de um paciente que exibe sintomas de uma infecção bacte- riana.

[00163] Preferencialmente, a bactéria utilizada na invenção para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana é capaz de fermentar rafi- nose, por exemplo, quando cultivada em um meio de suspensão apro- priado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas.

[00164] Preferencialmente, as bactérias utilizadas na invenção para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana exibem fermentação inter- mediária de β-glucosidase ou fermentação intermediária de α- arabinose, ou mais preferencialmente fermentação intermediária de β- glucosidase e fermentação intermediária de α-arabinose, por exemplo quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exemplo, quando submetidas à análise Rapid ID 32A. Os exemplos demonstram que ambas as cepas de B. breve MRX004 e Teste 3 têm atividade útil e ambas exibem fermentação intermediária de β-glucosidase e α- arabinose.

[00165] Preferencialmente, as bactérias utilizadas na invenção para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana não exibem fermentação positiva de N-acetil-β-glucosaminidase, por exemplo, quando cultiva- das em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exemplo, quando sujeitas à análise Rapid ID 32A. A bactéria pode exibir apenas fermentação intermediá- ria ou nenhuma de N-acetil-β-glucosaminidase. Os exemplos demons- tram que ambas as cepas de B. breve MRX004 e Teste 2 têm ativida- de útil e nenhuma exibe fermentação positiva de N-acetil-β- glucosaminidase.

[00166] Preferencialmente, as bactérias utilizadas na invenção para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana exibem fermentação inter- mediária de α-galactosidase ou fermentação intermediária de α- arabinose, ou mais preferencialmente fermentação intermediária de α- galactosidase e fermentação intermediária de α-arabinose, por exem- plo quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exemplo, quando submetidas à análise Rapid ID 32A. Os exemplos demonstram que as cepas de B. breve MRX004 e Teste 8 têm atividade útil e am- bas exibem fermentação intermediária de α-galactosidase e α- arabinose.

[00167] Em modalidades alternativas, a bactéria usada na invenção para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana fermenta serina arila- midase, mas não leucil glicina arilamidase e não alanina arilamidase, por exemplo, quando cultivada em um meio de suspensão apropriado (tal como meio de suspensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exemplo, quando submetidas à análise Rapid ID 32A. Os exemplos demonstram que as cepas de B. breve Teste 11 e Teste 12 têm ativi- dade útil e fermentam serina arilamidase, mas não leucilglicina arila- midase e não alanina arilamidase.

[00168] Em modalidades alternativas, as bactérias utilizadas na in- venção para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana exibem fer- mentação intermediária de serina arilamidase, por exemplo, quando cultivadas em um meio de suspensão apropriado (como meio de sus- pensão API) a 37ºC durante 4 horas e, por exemplo, quando submeti- das à análise Rapid ID 32A. Os exemplos demonstram que as cepas de B. breve Teste 3 e Teste 7 têm atividade antimicrobiana potente e ambas exibem fermentação intermediária de serina arilamidase.

[00169] Qualquer ensaio adequado conhecido na técnica pode ser usado para avaliar a capacidade de uma bactéria para fermentar uma fonte de carboidrato ou aminoácido. Preferencialmente, a análise Ra- pid ID 32A é usada (preferencialmente usando o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux). Modos de administração

[00170] Preferencialmente, as composições da invenção são formu- ladas para serem administradas ao trato gastrointestinal a fim de per- mitir a entrega e/ou colonização parcial ou total do intestino com a ce- pa bacteriana da invenção. Em algumas modalidades, o termo "coloni- zação total do intestino" significa que as bactérias colonizaram todas as partes do intestino (ou seja, o intestino delgado, intestino grosso e reto). Em outras modalidades da invenção, o termo "colonização total" ou "colonização parcial" significa que as bactérias são retidas perma- nentemente ou temporariamente no intestino, respectivamente. Ge- ralmente, as composições da invenção são administradas por via oral, mas podem ser administradas por via retal, intranasal ou por via bucal ou sublingual.

[00171] Em certas modalidades, as composições da invenção po- dem ser administradas como uma espuma, um spray ou um gel.

[00172] Em certas modalidades, as composições da invenção po- dem ser administradas como um supositório, tal como um supositório retal, por exemplo na forma de um óleo de teobroma (manteiga de ca- cau), gordura dura sintética (por exemplo, suppocire, witepsol), glicero- gelatina, polietilenoglicol, ou composição de sabão de glicerina.

[00173] Em certas modalidades, a composição da invenção é admi- nistrada ao trato gastrointestinal por meio de um tubo, como um tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de jejunostomia (tu- bo J), gastrostomia endoscópica percutânea (PEG) ou uma porta, tal como uma porta da parede torácica que fornece acesso ao estômago, jejuno e outras portas de acesso adequadas.

[00174] As composições da invenção podem ser administradas uma vez ou podem ser administradas sequencialmente como parte de um regime de tratamento. Em certas modalidades, as composições da in- venção devem ser administradas diariamente (uma ou várias vezes).

[00175] Em certas modalidades da invenção, o tratamento de acor- do com a invenção é acompanhado pela avaliação da microbiota intes- tinal do paciente. O tratamento pode ser repetido se a entrega e/ou colonização parcial ou total com a cepa da invenção não for alcança- da, de modo que a eficácia não seja observada, ou o tratamento pode ser interrompido se a entrega e/ou colonização parcial ou total for bem-sucedida e a eficácia for observada.

[00176] Em certas modalidades, a composição da invenção pode ser administrada a um animal em gestação, por exemplo, um mamífe- ro, como um ser humano, a fim de reduzir a probabilidade de desen- volvimento de doença em seu filho no útero e/ou após o nascimento.

[00177] As composições da invenção podem ser administradas a um paciente que foi diagnosticado com uma atividade imunológica re- duzida mediada por doença ou condição, ou que foi identificado como estando em risco de uma doença ou condição mediada por atividade imunológica reduzida. As composições também podem ser adminis- tradas como uma medida profilática para prevenir o desenvolvimento de doenças ou condições mediadas pela redução da atividade imuno- lógica em um paciente saudável.

[00178] As composições da invenção podem ser administradas a um paciente que foi diagnosticado com atividade imunológica deficien- te ou que foi identificado como estando em risco de atividade imunoló- gica deficiente. Por exemplo, o paciente pode ter colonização reduzida ou ausente por B. breve.

[00179] As composições da invenção podem ser administradas co- mo um produto alimentício, como um suplemento nutricional.

[00180] Geralmente, as composições da invenção são para o tra- tamento de humanos, embora possam ser usadas para tratar animais, incluindo mamíferos monogástricos, tais como aves, porcos, gatos, cães, cavalos ou coelhos. As composições da invenção podem ser úteis para aumentar o crescimento e o desempenho dos animais. Se administrado a animais, pode-se usar gavagem oral. Composições

[00181] Geralmente, a composição da invenção compreende bacté- rias. Em modalidades preferidas da invenção, a composição é formu- lada na forma liofilizada. Por exemplo, a composição da invenção pode compreender grânulos ou cápsulas de gelatina, por exemplo cápsulas de gelatina dura, compreendendo uma cepa bacteriana da invenção.

[00182] Preferencialmente, a composição da invenção compreende bactérias liofilizadas. A liofilização de bactérias é um procedimento bem consolidado e orientações relevantes estão disponíveis, por exemplo, nas referências [45,52]. Os exemplos demonstram que as composições liofilizadas são particularmente eficazes.

[45] Miyamoto-Shinohara et al. (2008) J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9–24.

[51] Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, ed. de Day and MCLellan, Humana Press.

[00183] Alternativamente, a composição da invenção pode compre- ender uma cultura bacteriana ativa, viva.

[00184] Em modalidades preferidas, a composição da invenção é encapsulada para permitir a entrega da cepa bacteriana ao intestino. O encapsulamento protege a composição da degradação até a entrega no local alvo por meio, por exemplo, da ruptura com estímulos quími- cos ou físicos, como pressão, atividade enzimática ou desintegração física, que pode ser desencadeada por alterações no pH. Qualquer método de encapsulamento apropriado pode ser usado. Técnicas de encapsulamento exemplares incluem aprisionamento dentro de uma matriz porosa, fixação ou adsorção em superfícies veículoas sólidas, autoagregação por floculação ou com agentes de reticulação e con- tenção mecânica atrás de uma membrana microporosa ou microcáp- sula. Orientações sobre o encapsulamento que podem ser úteis para preparar composições da invenção estão disponíveis, por exemplo, nas referências [53] e [54]

[00185] A composição pode ser administrada por via oral e pode estar na forma de um comprimido, cápsula ou pó. Produtos encapsu- lados são preferidos porque B. breve são anaeróbios. Outros ingredi- entes (como vitamina C, por exemplo) podem ser incluídos como eli- minadores de oxigênio e substratos prebióticos para melhorar a entre- ga e/ou colonização parcial ou total e sobrevivência in vivo. Alternati- vamente, a composição probiótica da invenção pode ser administrada por via oral como um produto alimentício ou nutricional, como leite ou produto lácteo fermentado à base de soro de leite, ou como um produ- to farmacêutico.

[00186] Em algumas modalidades, a composição não compreende soro de leite de vaca hidrolisado.

[00187] Uma composição da invenção inclui uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma cepa bacteriana da invenção. Uma quan-

tidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana é suficiente para exercer um efeito benéfico sobre um paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana pode ser suficiente para resultar na entrega e/ou colonização parcial ou total do intestino do paciente.

[00188] Uma dose diária adequada da bactéria, por exemplo para um humano adulto, pode ser de cerca de 1 x 103 a cerca de 1 x 1011 unidades formadoras de colônia (CFU); por exemplo de cerca de 1 x 107 a de cerca de 1 x 1010 CFU; em outro exemplo de cerca de 1 x 106 a de cerca de 1 x 1010 CFU; em outro exemplo de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 1011 CFU; em outro exemplo de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1010 CFU; em outro exemplo de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1011 CFU.

[00189] Em certas modalidades, a dose da bactéria é de pelo 109 células por dia, como pelo menos 1010, pelo menos 1011 ou pelo me- nos 1012 células por dia.

[00190] Em certas modalidades, a composição contém a cepa bac- teriana em uma quantidade de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 1011 CFU/g, em relação ao peso da composição; por exemplo, de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1010 CFU/g. A dose pode ser, por exemplo, 1 g, 3g, 5g e 10g.

[00191] Uma dose da composição pode compreender a cepa bacte- riana de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 1011 unidades formadoras de colônia (CFU) /g, em relação peso da composição. A dose pode ser adequada para um ser humano adulto. Por exemplo, a composição pode compreender a cepa bacteriana de cerca de 1 x 103 a cerca de 1 x 1011 CFU/g; por exemplo, de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 1010 CFU/g; em outro exemplo de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 1010 CFU/g; em outro exemplo de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 1011 CFU/g; em outro exemplo de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1010

CFU/g; em outro exemplo de cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 1011 CFU/g, a dose pode ser, por exemplo, 1 g, 3g, 5g e 10g.

[00192] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a quantidade da cepa bacteriana é de cerca de 1 × 103 a cerca de 1 × 1011 unidades formadoras de colônia por grama em relação ao peso da composição.

[00193] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada em uma dose de entre 500 mg e 1000 mg, entre 600 mg e 900 mg, entre 700 mg e 800 mg, entre 500 mg e 750 mg ou entre 750 mg e 1000 mg. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a bactéria liofilizada na composição farmacêutica é administrada em uma dose entre 500 mg e 1000 mg, entre 600 mg e 900 mg, entre 700 mg e 800 mg, entre 500 mg e 750 mg ou entre 750 mg e 1000 mg.

[00194] A composição pode ser formulada como um probiótico. Um probiótico é definido pela FAO/WHO como um microrganismo vivo que, quando administrado em quantidades adequadas, confere um benefício à saúde do hospedeiro.

[00195] Normalmente, um probiótico, tal como a composição da in- venção, é opcionalmente combinado com pelo menos um composto prebiótico adequado. Um composto prebiótico é geralmente um car- boidrato não digerível, como um oligo ou polissacarídeo, ou um álcool de açúcar, que não é degradado ou absorvido no trato digestivo supe- rior. Os prebióticos conhecidos incluem produtos comerciais como a inulina e transgalacto-oligossacarídeos.

[00196] Em certas modalidades, a composição probiótica da pre- sente invenção inclui um composto prebiótico em uma quantidade de cerca de 1 a cerca de 30% em peso, em relação ao peso total da composição (por exemplo, de 5 a 20% em peso). Os carboidratos po-

dem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: fruto- oligossacarídeos (ou FOS), fruto-oligossacarídeos de cadeia curta, inulina, isomalte-oligossacarídeos, pectinas, xilo-oligossacarídeos (ou XOS), quitosana-oligossacarídeos (ou COS), beta-glucanos, gomas aráveis modificadas e amidos resistentes, polidextrose, D-tagatose, fibras de acácia, alfarroba, aveia e fibras cítricas. Em um aspecto, os prebióticos são os fruto-oligossacarídeos de cadeia curta (para simpli- cidade, mostrado abaixo neste documento como FOSs-cc); os referi- dos FOSs-cc não são carboidratos digeríveis, geralmente obtidos pela conversão do açúcar de beterraba e incluindo uma molécula de saca- rose à qual três moléculas de glicose estão ligadas.

[00197] As composições da invenção podem compreender excipi- entes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais ex- cipientes adequados podem ser encontrados na referência [55]. Os veículos ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhe- cidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, na refe- rência [56]. Exemplos de veículos adequados incluem lactose, amido, glicose, metil celulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e simi- lares. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, glicerol e água. A escolha do veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada em relação à via de administração pretendida e à prá- tica farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem com- preender como, ou além do veículo, excipiente ou diluente, qualquer ligante(s), lubrificante(s), agente(s) de suspensão, agente(s) de reves- timento, agente(s) solubilizante(s) adequado(s). Exemplos de agluti- nantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, ado- çantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tais como acácia, traga- canto ou alginato de sódio, carboximetilcelulose e polietilenoglicol. Exemplos de lubrificantes adequados incluem oleato de sódio, estea-

rato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e similares. Conservantes, estabilizantes, co- rantes e até agentes aromatizantes podem ser fornecidos na composi- ção farmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoato de só- dio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Também po- dem ser usados antioxidantes e agentes de suspensão.

[00198] As composições da invenção podem ser formuladas como um produto alimentar. por exemplo, um produto alimentar pode forne- cer benefício nutricional além do efeito terapêutico da invenção, como em um suplemento nutricional. Da mesma forma, um produto alimentar pode ser formulado para aumentar o sabor da composição da inven- ção ou para tornar a composição mais atraente para consumir por ser mais similar a um item alimentar comum, em vez de a uma composi- ção farmacêutica. Em certas modalidades, a composição da invenção é formulada como um produto à base de leite. O termo "produto à base de leite" significa qualquer produto à base de leite ou soro de leite lí- quido ou semissólido com um teor de gordura variável. O produto à base de leite pode ser, por exemplo, leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite desnatado, leite integral, leite recombinado de leite em pó e soro de leite sem qualquer processamento, ou um produto pro- cessado, como iogurte, leite coalhado, coalhada, leite azedo, leite azedo integral, leite com manteiga e outros produtos lácteos azedos. Outro grupo importante inclui as bebidas lácteas, como bebidas à base de soro de leite, leites fermentados, leites condensados, leites de cri- anças ou bebês; leites aromatizados, sorvetes; alimentos que conte- nham leite, como doces.

[00199] Em certas modalidades, as composições da invenção con- têm uma única cepa ou espécie bacteriana e não contêm nenhuma outra cepa ou espécie bacteriana. Em certas modalidades, as compo- sições da invenção contêm uma única espécie bacteriana e não con-

têm nenhuma outra espécie bacteriana. Em certas modalidades, as composições da invenção contêm uma única cepa bacteriana e não contêm nenhuma outra cepa bacteriana. Por exemplo, as composições da invenção podem compreender bactérias apenas da espécie Bifido- bacterium breve. Essas composições podem compreender apenas de minimis ou quantidades biologicamente irrelevantes de outras cepas ou espécies bacterianas. Essas composições podem ser uma cultura substancialmente isenta de outras espécies de organismos. Em algu- mas modalidades, tais composições podem ser um liofilizado que é substancialmente isento de outras espécies de organismos.

[00200] Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem mais de uma cepa ou espécie bacteriana. Por exemplo, em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem mais de uma cepa de dentro da mesma espécie (por exemplo, mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 cepas) e, opcio- nalmente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. Em algu- mas modalidades, as composições da invenção compreendem menos de 50 cepas de dentro da mesma espécie (por exemplo, menos de45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 cepas) e, opcional- mente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 ou 31-50 cepas de dentro da mesma espécie e, opcionalmente, não contêm bactérias de qualquer outra espécie. Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem mais de uma espécie dentro do mesmo gêne- ro (por exemplo, mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 ou 40 espécies) e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhum outro genus. Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem menos de 50 espécies dentro do mesmo ge-

nus (por exemplo, menos de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5 , 4 ou 3 espécies) e, opcionalmente, não contêm bactérias de ne- nhum outro genus. Em algumas modalidades, as composições da in- venção compreendem 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6- 15, 16-25, ou 31-50 espécies do mesmo genus, opcionalmente, não contêm bactérias de qualquer outro genus. A invenção compreende qualquer combinação das precedentes.

[00201] Em algumas modalidades, a composição compreende um consórcio microbiano. Por exemplo, em algumas modalidades, a com- posição compreende a cepa bacteriana Bifidobacterium breve como parte de um consórcio microbiano. Por exemplo, em algumas modali- dades, a cepa bacteriana de Bifidobacterium breve está presente em combinação com uma ou mais (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 15 ou 20) outras cepas bacterianas do gênero Blautia e/ou outros gê- neros com o qual pode viver simbioticamente in vivo no intestino. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição compreende uma cepa bacteriana de Bifidobacterium breve em combinação com uma cepa bacteriana de um genus diferente. Em outro exemplo, a compo- sição compreende uma cepa bacteriana de Bifidobacterium breve em combinação com uma cepa bacteriana do genus Bifidobacterium ou a composição compreende uma cepa bacteriana de Bifidobacterium bre- ve em combinação com uma cepa bacteriana do genus Bifidobacte- rium e uma cepa bacteriana de um genus diferente. Em algumas mo- dalidades, o consórcio microbiano compreende duas ou mais cepas bacterianas obtidas de uma amostra de fezes de um único organismo, por exemplo, um humano. Em algumas modalidades, o consórcio mi- crobiano não é encontrado junto na natureza. Por exemplo, em algu- mas modalidades, o consórcio microbiano compreende cepas bacteri- anas obtidas de amostras de fezes de pelo menos dois organismos diferentes. Em algumas modalidades, os dois organismos diferentes são da mesma espécie, por exemplo, dois humanos diferentes. Em algumas modalidades, os dois organismos diferentes são um ser hu- mano criança e um ser humano adulto. Em algumas modalidades, os dois organismos diferentes são um mamífero humano e um mamífero não humano.

[00202] Em algumas modalidades, a composição da invenção com- preende adicionalmente uma cepa bacteriana que tem as mesmas ca- racterísticas de segurança e eficácia terapêutica que a cepa Bifidobac- terium breve depositada sob o número de acesso NCIMB 42380, mas que não é a cepa Bifidobacterium breve depositada sob o número de acesso NCIMB 42380.

[00203] Em algumas modalidades nas quais a composição da in- venção compreende mais de uma cepa, espécie ou gênero bacteriano, as cepas, espécies ou gêneros bacterianos individuais podem ser para administração separada, simultânea ou sequencial. Por exemplo, a composição pode compreender todas as mais de uma cepa, espécie ou gênero bacteriano, ou as cepas, espécies ou gêneros bacterianos podem ser armazenados separadamente e administrados separada- mente, simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas modalida- des, as mais de uma cepa, espécie ou gênero bacteriano são armaze- nados separadamente, mas são misturados antes do uso.

[00204] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana para uso na invenção é obtida a partir de fezes humanas adultas. Em algumas mo- dalidades em que a composição da invenção compreende mais de uma cepa bacteriana, todas as cepas bacterianas são obtidas a partir de fezes humanas adultas ou se outras cepas bacterianas estiverem presentes, elas estão presentes apenas em quantidades mínimas. A bactéria pode ter sido cultivada após ser obtida a partir de fezes hu- manas adultas e ser usada em uma composição da invenção.

[00205] Em algumas modalidades, uma ou mais cepas bacterianas de Bifidobacterium breve é/são o (s) único (s) agente (s) terapeutica- mente ativo (s) em uma composição da invenção. Em algumas moda- lidades, a (s) cepa (s) bacteriana (s) na composição é/são os únicos agentes terapeuticamente ativos em uma composição da invenção.

[00206] As composições para uso de acordo com a invenção po- dem ou não exigir aprovação de comercialização.

[00207] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a referida cepa bacteriana é liofilizada. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêuti- ca acima, em que a referida cepa bacteriana é seca por pulverização. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêuti- ca acima, em que a cepa bacteriana é liofilizada ou seca por pulveri- zação e em que está viva. Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a cepa bacteriana é liofili- zada ou seca por pulverização e em que é viável. Em certas modali- dades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a cepa bacteriana é liofilizada ou seca por pulverização e em que é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Em certas modali- dades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a cepa bacteriana é liofilizada ou seca por pulverização e em que é viável e capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[00208] Em alguns casos, a cepa bacteriana liofilizada ou seca por pulverização é reconstituída antes da administração. Em alguns casos, a reconstituição é feita pelo uso de um diluente descrito neste docu- mento.

[00209] As composições da invenção podem compreender excipi- entes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[00210] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção;

e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrada a um sujeito em necessidade.

[00211] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição.

[00212] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição.

[00213] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição.

[00214] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; em que a cepa bacteriana está em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir uma doença ou condição mediou uma resposta imunológi- ca reduzida.

[00215] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a quantidade da cepa bacteriana é de cerca de 1 × 103 a cerca de 1 × 1011 unidades formadoras de colônia por grama em relação a um peso da composição.

[00216] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada em uma dose de 1 g, 3 g, 5 g ou 10 g.

[00217] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a composição é administrada por um mé- todo selecionado a partir do grupo que consiste em oral, retal, subcu- tânea, nasal, bucal e sublingual.

[00218] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um veículo selecionado do grupo que consiste em lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol e sorbitol.

[00219] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um diluente selecionado do gru- po que consiste em etanol, glicerol e água.

[00220] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um excipiente selecionado do grupo que consiste em amido, gelatina, glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, adoçante de milho, acácia, tragacanto, al- ginato de sódio, carboximetil celulose, polietilenoglicol, oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio e cloreto de sódio.

[00221] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo ainda pelo menos um de um conservante, um antioxidante e um estabilizador.

[00222] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, compreendendo um conservante selecionado do grupo que consiste em benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico.

[00223] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que a referida cepa bacteriana é liofilizada.

[00224] Em certas modalidades, a invenção fornece a composição farmacêutica acima, em que quando a composição é armazenada em um recipiente selado a cerca de 4°C ou cerca de 25°C e o recipiente é colocado em uma atmosfera com 50% de umidade relativa, pelo me- nos 80% da cepa bacteriana medida em unidades formadoras de co- lônias, permanece após um período de pelo menos cerca de: 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos.

[00225] Em algumas modalidades, a composição da invenção é fornecida em um recipiente selado que compreende uma composição conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o reci- piente selado é um sachê ou garrafa. Em algumas modalidades, a composição da invenção é fornecida em uma seringa que compreende uma composição conforme descrito neste documento.

[00226] A composição da presente invenção pode, em algumas modalidades, ser fornecida como uma formulação farmacêutica. Por exemplo, a composição pode ser fornecida como um comprimido ou cápsula. Em algumas modalidades, a cápsula é uma cápsula de gela- tina ("cápsula de gel"). A cápsula pode ser uma cápsula dura ou uma cápsula mole. Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsula mole. As cápsulas moles são cápsulas que podem, devido à adição de amaciadores, tais como, por exemplo, glicerol, sorbitol, maltitol e polie- tilenoglicóis, presentes no invólucro da cápsula, ter uma certa elastici- dade e suavidade. As cápsulas moles podem ser produzidas, por exemplo, com base em gelatina ou amido. As cápsulas moles à base de gelatina estão comercialmente disponíveis em vários fornecedores. Dependendo do método de administração, tal como, por exemplo, oral ou retal, as cápsulas moles podem ter várias formas, podem ser, por exemplo, redondas, ovais, oblongas ou em forma de torpedo. As cáp- sulas moles podem ser produzidas por processos convencionais, co- mo, por exemplo, pelo processo Scherer, o processo Accogel ou o processo de gota ou sopro.

[00227] Em algumas modalidades, as composições da invenção são administradas por via oral, intraperitoneal ou intravenosa. A admi- nistração oral pode envolver a deglutição de forma que o composto entre no trato gastrointestinal.

[00228] As formulações farmacêuticas adequadas para administra- ção oral incluem tampões sólidos, micropartículas sólidas, semissóli- das e líquidas (incluindo fases múltiplas ou sistemas dispersos), tais como comprimidos; cápsulas moles ou duras contendo multipartículas ou nanopartículas, líquidos (por exemplo, soluções aquosas), emul- sões ou pós; losangos (incluindo cheios de líquido); mastiga; géis; formas de dosagem de dispersão rápida; películas; óvulos; sprays; e adesivos bucais/mucoadesivos.

[00229] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação entérica, ou seja, uma formulação gastrorresistente (por exemplo, resistente ao pH gástrico) que é adequada para a distri- buição da composição da invenção ao intestino por administração oral. As formulações entéricas podem ser particularmente úteis quando a bactéria ou outro componente da composição é sensível ao ácido, por exemplo, sujeito à degradação em condições gástricas.

[00230] Em algumas modalidades, a formulação entérica compre- ende um revestimento entérico. Em algumas modalidades, a formula- ção é uma forma de dosagem com revestimento entérico. Por exem- plo, a formulação pode ser um comprimido com revestimento entérico ou uma cápsula com revestimento entérico, ou similares. O revesti- mento entérico pode ser um revestimento entérico convencional, por exemplo, um revestimento convencional para um comprimido, cápsula ou similar para administração oral. A formulação pode compreender um revestimento de película, por exemplo, uma camada de película fina de um polímero entérico, por exemplo, um polímero insolúvel em ácido.

[00231] Em algumas modalidades, a formulação entérica é intrinse-

camente entérica, por exemplo, gastrorresistente sem a necessidade de um revestimento entérico. Assim, em algumas modalidades, a for- mulação é uma formulação entérica que não compreende um revesti- mento entérico. Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsu- la feita de um material termogelável. Em algumas modalidades, o ma- terial termogelificante é um material celulósico, como metilcelulose, hidroximetilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Em algumas modalidades, a cápsula compreende um invólucro que não contém nenhum polímero formador de película. Em algumas modalidades, a cápsula compreende um invólucro e o invólucro compreende hidroxi- propilmetilcelulose e não compreende qualquer polímero formador de película (por exemplo, ver [57]). Em algumas modalidades, a formula- ção é uma cápsula intrinsecamente entérica (por exemplo, Vcaps® da Capsugel). Métodos de cultivo

[00232] As cepas bacterianas para uso na presente invenção po- dem ser cultivadas usando técnicas de microbiologia padrão conforme detalhado em, por exemplo, referências [58-60].

[00233] O meio sólido ou líquido utilizado para a cultura pode ser ágar YCFA ou meio YCFA. O meio YCFA pode incluir (por 100ml, va- lores aproximados): Casitone (1,0 g), extrato de levedura (0,25 g), NaHCO3 (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCl (0,09 g), (NH4)2SO4 (0,09 g), MgSO4 · 7H2O (0,009 g), CaCl2 (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 μg), cobala- mina (1 μg), p-ácido aminobenzoico (3 μg), ácido fólico (5 μg) e pirido- xamina (15 μg). Cepas bacterianas para uso em composições de vacina

[00234] Os inventores identificaram que as cepas bacterianas da invenção são úteis para o tratamento ou prevenção de doenças ou condições associadas à redução da atividade imunológica. É provável que seja o resultado do efeito que as cepas bacterianas da invenção têm sobre o sistema imunológico do hospedeiro. Portanto, as compo- sições da invenção também podem ser úteis para prevenir doenças ou condições, quando administradas como composições de vacina. Em certas modalidades, as cepas bacterianas da invenção podem ser mortas, inativadas ou atenuadas. Em certas modalidades, as composi- ções podem compreender um adjuvante de vacina. Em certas modali- dades, as composições são para administração via injeção, como via injeção subcutânea. Geral

[00235] A prática da presente invenção irá usar, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia mo- lecular, imunologia e farmacologia, dentro da perícia na técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Veja, por exemplo, referências [61] e [62,68], etc.

[00236] O termo "compreendendo" abrange "incluindo", bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[00237] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x é op- cional e significa, por exemplo, x+10%.

[00238] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y po- de ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "subs- tancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

[00239] As referências a uma percentagem de identidade de se- quência entre duas sequências de nucleotídeos significam que, quan- do alinhadas, essa percentagem de nucleotídeos é a mesma na com- paração das duas sequências. Este alinhamento e a homologia per- centual ou identidade de sequência podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo aqueles descritos na seção 7.7.18 da ref. [69]. Um alinhamento preferido é de- terminado pelo algoritmo de busca de homologia Smith-Waterman usando uma pesquisa de gap afim com uma penalidade de abertura de lacuna de 12 e uma penalidade de extensão de lacuna de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia Smith- Waterman é descrito na ref. [70].

[00240] A menos que especificamente indicado, um processo ou método compreendendo várias etapas pode compreender etapas adi- cionais no início ou no final do método, ou pode compreender etapas adicionais de intervenção. Além disso, as etapas podem ser combina- das, omitidas ou realizadas em uma ordem alternativa, se apropriado.

[00241] Várias modalidades da invenção são descritas neste docu- mento. Será apreciado que os recursos especificados em cada moda- lidade podem ser combinados com outros recursos especificados, para fornecer outras modalidades. Em particular, modalidades destacadas neste documento como sendo adequadas, típicas ou preferidas podem ser combinadas entre si (exceto quando são mutuamente exclusivas).

[00242] Todas as referências de patentes e literatura citadas no presente relatório descritivo são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[00243] Qualquer referência a um método para tratamento compre- endendo a administração de um agente a um paciente, também cobre esse agente para uso no referido método para tratamento, bem como o uso do agente no referido método para tratamento e o uso do agente na fabricação de um medicamento.

[00244] Os exemplos a seguir são apresentados tão somente para fins ilustrativos, não sendo destinados a impor limitações sobre o es- copo da presente invenção, em qualquer hipótese.

MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Exemplo 1 Sumário

[00245] O objetivo deste estudo foi caracterizar as propriedades imunomoduladoras in vitro do MRx0004. Além disso, uma combinação de genômica, transcriptômica e proteômica foi usada para identificar potenciais efetores-chave que poderiam ser responsáveis por mediar a resposta do hospedeiro ao MRx0004. Materiais e Métodos Cepas bacterianas, plasmídeos e primers

[00246] Todas as cepas bacterianas, plasmídeos e primers usados para gerar cepas neste estudo estão listados na Tabela 1. Cepas de B. breve foram rotineiramente cultivadas em caldo de ácidos graxos de hidrolisado de caseína de extrato de levedura (YCFA) (E&O Labs, Bonnybridge, Reino Unido) em 37°C em uma estação de trabalho anaeróbica (Don Whitley Scientific, Shipley, Reino Unido), a menos que seja indicado o contrário. As cepas de E. coli foram rotineiramente cultivadas em caldo Luria Bertani (LB) [71] a 37°C com agitação. Quando apropriado, o meio de crescimento foi suplementado com te- traciclina (10 µg/ml), cloranfenicol (10 µg/ml para E. coli ou 3 µg/ml pa- ra B. breve), eritromicina (100 µg/ml para E. coli ou 1 µg/ml para B. breve), espectinomicina (100-300 µg/ml) ou canamicina (50 µg/ml) (to- dos os antibióticos da Sigma-Aldrich, Gillingham, Reino Unido). Célu- las de E. coli recombinantes contendo pORI19 ou pWSK29 foram se- lecionadas em ágar LB suplementado com 40 µg/ml X-gal (5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo) e 0,1 M IPTG (isopropil-β -D- galactopiranosídeo) (ambos fornecidos pela Sigma-Aldrich). Cultura de rotina de células imortalizadas

[00247] Células HT29-MTX-E12 (Public Health England, Salisbury, UK) foram rotineiramente cultivadas em Dulbecco's Minimal Eagle's Medium (DMEM) com alta modificação de glicose, suplementado com

10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 4 mM L-glutamina, 1 solução de aminoácidos não essenciais e 1 solução antibiótica antimicótica. As células foram semeadas em vasos de ensaio e cultivadas por nove dias, após os quais foram lavadas duas vezes com solução salina ba- lanceada de Hank e colocadas em meio de cocultura (DMEM suple- mentado com 4 mM de L-glutamina, 1 X solução de aminoácidos não essenciais, 5 μg/ml apo-transferrina e 200 ng/ml selenito de sódio) an- tes do início dos tratamentos. Preparação de tratamentos bacterianos para ensaios de cocultura

[00248] Para os experimentos de cocultura, as bactérias foram cul- tivadas até atingirem a fase log. As células bacterianas vivas e o so- brenadante foram separados por centrifugação, após o que as bacté- rias vivas (designadas LV) foram lavadas uma vez com PBS (Sigma- Aldrich) e ressuspensas no meio de cultura de células apropriado para uso a jusante. Os sobrenadantes (designados SN) foram passados através de um filtro de 0,22 µm e diluídos apropriadamente em meio de cocultura. As bactérias inativadas por calor (designadas HK) foram preparadas por incubação a 80°C durante 30 minutos, seguida de la- vagem com PBS e ressuspensão em meio de cultura de células apro- priado. As contagens viáveis foram confirmadas por galvanização. Ensaios de repórter

[00249] As células HEK-Blue™ -hTLR2 e THP1-Blue™ NF-κB fo- ram cultivadas até 90% de densidade, lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em meio de cultura sem antibiótico a uma densidade de

280.000 e 500.000 células/ml, respectivamente. Tratamentos bacteria- nos (vivos, mortos por calor e sobrenadantes) foram adicionados às células em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100:1. Controles de ensaio positivo, PamCS3K4 (Invivogen) e L. monocytogenes (HKLM) (Invivogen) mortos por calor foram usados em concentrações de 10 ng/ml e MOI de 200: 1, respectivamente. Controles negativos,

meios e veículos, foram preparados para fornecer equivalentes para cada tratamento. As células foram então incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante 22 h. O meio de coculturas foi diluído dez vezes em QUANTI-Blue™ (Invivogen) e incubado durante 1 hora (NFκB) ou 2 horas (TLR2) e a densidade óptica a 655 nm foi registada. Coculturas em grande escala com células HT29-MTX

[00250] As células HT29-MTX foram cultivadas conforme descrito precedentemente, na câmara superior de Transwells® de 10 cm de diâmetro (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). As bactérias foram cultivadas até a fase log tardia, lavadas e ressuspensas confor- me descrito precedentemente. As bactérias foram adicionadas às célu- las a um MOI de 100: 1, e as coculturas foram incubadas durante 3 horas em condições anaeróbicas a 37°C. O meio contendo bactérias foi coletado da câmara superior do transwell e centrifugado a 5000 xg por 5-10 minutos para coletar células bacterianas para aplicações a jusante. Análise de qPCR bacteriana

[00251] As bactérias foram coletadas para isolamento de RNA de cultura in vitro nas fases logarítmica e estacionária tardia e cocultura pós-grande escala com HT29-MTX. As bactérias foram coletadas e armazenadas usando RNAProtect Bacteria Reagent de acordo com as instruções do fabricante (QIAGEN, Hilden, Alemanha). As células bac- terianas foram lisadas por incubação com lisozima (15 mg/ml) (Sigma- Aldrich) e proteinase K (6 mAU) (QIAGEN) a 37°C por 30 minutos e, subsequentemente, homogeneizadas usando um instrumento Fas- tPrep 24 (2 x ciclos de 6 m/s por 20 s) e Lysing Matrix B (ambos da MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EUA). O RNA total foi isolado usando um RNeasy Mini Kit (QIAGEN), e o DNA genômico foi removido usando RNase-Free DNase em uma digestão em coluna (QIAGEN), ambos de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi sintetizado usan-

do um kit Superscript IV (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Os primers foram projetados usando o sof- tware Primer3Plus [72]. As reações qPCR foram configuradas Power SYBR™ Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as recomendações do fabricante, e os ensaios foram realizados em um 7500 Fast Real-time PCR System (Thermo Fisher Scientific), usando o seguinte ciclo: 95°C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 95°C por 15 s, 60°C por 1 min. Os dados foram analisados por meio de análise de duplo delta Ct e a expressão dos genes de teste foi nor- malizada para o groEL de governanta.

[00252] Depilação de células bacterianas

[00253] As células bacterianas foram colhidas por centrifugação na fase de crescimento logarítmica tardia ou após contato com HT29- MTX (consulte a seção de cocultura acima para obter detalhes), con- forme apropriado. As células foram então lavadas e ressuspensas em tampão TEAB 50 mM pH 8,5 (Sigma-Aldrich) a uma diluição de 1/20. As frações de proteína rapadas foram geradas incubando células com tripsina modificada de grau de sequenciamento (Promega, Madison, WI, EUA) durante 30 min a 37°C em tampão TEAB 50 mM suplemen- tado com DTT 1 mM (Sigma-Aldrich). Para cada amostra, um tubo sem tripsina foi incubado em paralelo, como um controle para proteí- nas descartadas (fração de proteína descartada). As frações de prote- ína raspadas e descartadas foram colhidas por centrifugação por 15 min a 4000 xg a 4°C e filtradas por seringa através de uma membrana Millex-GV 0,22 μm de baixa ligação a proteínas (Millipore). As concen- trações de proteína total foram medidas usando Pierce™ BCA Protein Assay Kit de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Fisher Scientific) e a qualidade da amostra foi avaliada por SDS-PAGE (Bio- Rad, Hercules, CA, EUA). As contagens de células viáveis foram reali- zadas antes e após o tratamento com tripsina por plaqueamento em ágar YCFA. Para cada ensaio, as amostras de três réplicas biológicas foram então analisadas por nano-LC-MS/MS. Identificação de proteínas por LC-MS/MS

[00254] Resumidamente, os sobrenadantes da cultura foram con- centrados até 0,5 ml e lavados com água ultrapura, as proteínas foram precipitadas usando um kit de limpeza ReadyPrep 2-D (Bio-Rad) e ressuspensas em 100 µl de bicarbonato de amônio 50 mM. As amos- tras foram então incubadas com tripsina suína (Promega) durante 16 h a 37°C e os sobrenadantes resultantes foram secos por centrifugação a vácuo e dissolvidos em ácido trifluoroacético a 0,1%. Os peptídeos foram adicionalmente dessalinizados usando µ-C18 ZipTips (Merck, Keniloworth, NJ, EUA) e eluídos em uma placa de microtitulação de 96 poços, secos por centrifugação a vácuo e dissolvidos em 10 µl de sol- vente de carregamento LC-MS (2% acetonitrila, 0,1% fórmico ácido). Os peptídeos foram separados e identificados por nanoLC-MS/MS (sistema Q Exactive híbrido quadrupolo-Orbitrap MS) (Thermo Fisher Scientific) usando uma coluna PepMap de 15 cm, método de aquisição LC-MS de 60 minutos e um volume de injeção de 5 µl. Para as frações de proteína raspada e descartada, 70 µl de bicarbonato de amônio 50 mM foram adicionados diretamente a 30 µl de amostra. As amostras foram então incubadas com tripsina porcina (Promega) durante a noite a 37°C e os sobrenadantes resultantes foram congelados a -70°C, se- cos por centrifugação a vácuo e dissolvidos em 20 µL de solvente de carregamento LC-MS. Os peptídeos foram separados e identificados por nanoLC-MS/MS (Q Sistema híbrido quadrupolo-Orbitrap MS Exati- vo, Thermo Scientific) usando uma coluna PepMap de 25 cm, método de aquisição LC-MS de 60 minutos e um volume de injeção de 2 µL. A análise de dados foi realizada com Proteome Discoverer (Thermo Fis- her Scientific). O Mascot Server foi usado como mecanismo de busca com os seguintes parâmetros: enzima = tripsina, sítios de clivagem mista máxima = 2, tolerância de massa do precursor = 10 ppm, modifi- cações dinâmicas = oxidação (M), modificações estáticas = carbami- dometil (C). Os peptídeos identificados foram comparados com um banco de dados de sequência de proteína específica de cepa, que foi construído com base no genoma sequenciado de B. breve MRx0004 (2.047 sequências). Uma identificação de proteína foi considerada vá- lida quando pelo menos cinco peptídeos foram identificados em todas as três réplicas biológicas. Complementação de B. breve MRx0004-EPSneg

[00255] Um fragmento de DNA abrangendo o gene pGTF codifica- dor da glicosil transferase primária e seu promotor assumido foi gerado por amplificação por PCR de B. breve MRx0004 DNA cromossômico usando Q5 High-Fidelity Polymerase (New England BioLabs, Herefor- dshire, Reino Unido) e pares de primer: pGTFcompF e pGTFcompR. O fragmento resultante foi digerido com HinDIII e XbaI (ambos de New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) e ligado ao pBC1.2 digerido de forma similar. A mistura de ligação foi introduzida em E. coli EC101 por eletrotransformação e os transformantes foram então selecionados com base na resistência de Cm. O conteúdo de plasmídeo de vários transformantes resistentes a Cm foi rastreado por análise de restrição. A integridade da inserção clonada em vários plasmídeos recombinan- tes foi confirmada por sequenciação antes da sua introdução em E. coli EC101 pWSK29-MRX-M+S para facilitar a metilação. O pBC1.2 metilado ou pBC1.2-pGTF foi transformado em MRx0004-EPSneg por eletroporação com seleção em Agar Clostridial Reforçado (RCA; Thermo Fisher Scientific) suplementado com Tet e Cm. Os transfor- mantes foram verificados quanto ao conteúdo de plasmídeo usando PCR de colônia, análise de restrição de DNA de plasmídeo e verifica- dos por sequenciamento. As cepas resultantes foram designadas B. breveMRx0004-EPS-pBC1.2 e MRx0004-EPS-pBC1.2-pGTF.

Análise de citocinas de células HT29-MTX

[00256] Bactérias vivas (preparadas conforme descrito preceden- temente) foram coincubadas com células HT29-MTX em placas de 24 poços a um MOI de 100:1 por 3 horas a 37°C e 5% de CO2. TNFα hu- mano recombinante (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA) foi então adici- onado às células a 10 ng/ml, após o que as coculturas foram incuba- das por mais 24 horas e, subsequentemente, os sobrenadantes foram coletados e centrifugados a 12000 xg por 3 min a 4°C para remover os resíduos celulares. Os níveis de IL-8 nos sobrenadantes foram anali- sados usando um kit de desenvolvimento padrão ABTS ELISA de IL-8 humano (CXCL8) (PeproTech) de acordo com as recomendações do fabricante. Cocultura com PBMCs

[00257] Células mononucleares de sangue periférico humano con- geladas saudáveis (PBMCs) foram adquiridas na STEMCELL Techno- logies (Cambridge, UK). As células foram descongeladas e deixadas em repouso durante a noite em meio de crescimento completo; RPMI 1640 com 10% de FBS, 2 mM de L. Glutamina e 100 U/ml de penicili- na, 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C e 5% de CO2 (todos os rea- gentes da Sigma-Aldrich). Os tratamentos bacterianos foram prepara- dos conforme descrito precedentemente. Para coincubações, as célu- las foram semeadas a uma densidade de 750.000 células/poços em placas de 48 poços e coincubadas com bactérias inativadas por calor e sobrenadantes bacterianos em um MOI de 10:1, com veículos apro- priados e 5ug/ml de PHA (Sigma-Aldrich) como um controle. As cocul- turas foram incubadas por 72 h a 37°C e 5% de CO2, após o que as células foram coletadas e centrifugadas a 10.000 xg por 3 minutos a 4°C. Os sobrenadantes livres de células foram coletados e armazena- dos a -80°C para análise de citocinas. Os péletes celulares foram la- vados uma vez e, em seguida, ressuspensos em PBS em gelo.

Citometria de fluxo 6

[00258] Os poços de tratamento foram reunidos para dar 1,5 x 10 PBMCs por grupo, ressuspensos em 150 µL de PBS e transferidos pa- ra uma placa de fundo em V de 96 pronto para coloração. As células foram primeiro coradas com o corante Viobility 405/520 Fixable (Mil- tenyi Biotec Ltd. Bergisch Gladbach, Alemanha) para discriminar entre células vivas e mortas por 10 min no escuro em temperatura ambiente. Eles foram então corados com um coquetel de anticorpos para CD3, CD4, CD8, CD25, CD127 e CD19 para determinar o fenótipo celular (anticorpos Miltenyi REA) e incubados por mais 10 min em temperatu- ra ambiente. As células foram então lavadas e ressuspensas em PBS e imediatamente analisadas por meio de análise de citometria de fluxo. Os isotipos foram usados para todos os anticorpos durante o primeiro experimento para ajudar a definir as portas e os controles FMO foram incluídos em todos os experimentos. Todos os experimentos foram realizados usando um BD FACS Aria II com a porta de parada para aquisição definida em 100.000 células na porta "Live" usando o sof- tware FACSDiva (BD Biosciences, Reading, UK). A análise foi condu- zida usando o software Flowjo versão 10.4.2 (FlowJo LLC, Oregon, EUA) e foi baseada em células vivas identificadas com o corante de viabilidade. Análise de Citocinas

[00259] A quantificação de citocinas em sobrenadantes livres de células de coculturas de PBMC foi realizada usando imunoensaios multiplex ProcartaPlex personalizados (Thermo Fisher Scientific) se- guindo as recomendações do fabricante. Resumidamente, 50 µl de sobrenadantes foram processados usando um sistema MAGPIX® MILLIPLEX® (Merck) com o software xPONENT (Luminex, Austin, TX, EUA). Os dados foram analisados usando o software analista MILLI- PLEX® (Merck) usando uma curva logística de 5 parâmetros e subtra-

ção de fundo para converter a intensidade média de fluorescência (MFI) para valores pg/ml. Análise de dados

[00260] As análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism versão 7.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla CA USA. Os dados foram analisados usando ANOVA de um fator e Teste de Comparações Múltiplas de Tukey. Os diagramas de Venn foram gerados usando Interactivenn [73]. Resultados

[00261] MRx0004 estimula células repórter NFκB e TLR2

[00262] Uma linhagem celular repórter THP-1-NFκB foi usada para examinar o impacto de MRx0004 na ativação do fator de transcrição pró-inflamatório NFκB, devido ao seu papel integral na regulação da imunidade inata. Listeria monocytogenes morta por calor (HKLM) (Invi- voGen) foi usada como um controle positivo para este ensaio. A fim de identificar a (s) fração (ões) efetiva (s) desta cepa, células THP-1- NFκB foram coincubadas com tratamentos de bactérias vivas (MRx0004LV), sobrenadante de cultura bacteriana (MRx0004SN) e bac- térias inativadas por calor (MRx0004HK). Todos os três tratamentos bacterianos ativaram significativamente o NFκB em comparação com os controles negativos de células não tratadas e meio de crescimento bacteriano (YCFA) (p <0,0001 para todas as comparações) (Figura 7A). MRx0004LV foi o tratamento mais eficaz e foi significativamente mais estimulante do que MRx0004SN e MRx0004HK (p < 0,0001 para ambas as comparações). MRx0004HK por sua vez foi significativamen- te mais ativo do que MRx0004SN (p = 0,006).

[00263] Como MRx0004 demonstrou ativar NFκB, a capacidade de MRx0004 de estimular os receptores a montante TLR2, TLR4, TLR5 e TLR9 foi investigada. Os dados preliminares sugeriram que MRx0004 não ativou TLR4, TLR5 e TLR9 (dados não mostrados). Um ensaio repórter HEK-TLR2 foi tratado com o controle positivo Pam3CSK4 e os mesmos tratamentos MRx0004 e controles negativos conforme des- crito acima (Figura 7B). Todos os tratamentos MRx0004 estimularam TLR2 em comparação com controles negativos (p <0,0001 para todas as comparações). MRx0004LV foi o tratamento mais estimulante em comparação com MRx0004SN (p < 0,0001) e MRx0004HK(p 0,0001), o último dos quais foi o tratamento menos eficaz. Com base nesses da- dos, MRx0004 é capaz de estimular potentemente a resposta imune inata de uma maneira associada a TLR2. Perfis transcricionais e proteômicos de MRx0004 revelam potenciais efetores de resposta do hospedeiro

[00264] A fim de identificar potenciais efetores da resposta do hos- pedeiro em MRx0004, três abordagens foram usadas. Um ensaio de transcrição direcionado foi usado para analisar dez genes MRx0004 com identidades previstas como efetores conhecidos da interação bifi- dobacteriana-hospedeiro (dados não mostrados). Estes incluíram ge- nes que codificam para adesinas previstas e proteínas clandestinas (oppA, enolase, transaldolase, tadA, eftU, pullulanase (revisado exten- sivamente em [74]) e genes com papéis putativos na colonização e modulação imunológica (a glicosiltransferase primária (pGTF) do MRx0004 Locus EPS [75], luxS [76] e serpina [77]) e efeitos terapêuti- cos putativos (pks [78]). A expressão desses genes foi analisada em RNA isolado de MRx0004 cultivado em fase logarítmica tardia e fase estacionária em cultura líquida, e após 3 h de contato com células HT29-MTX cultivadas em transwell de grande escala. A análise de qPCR (Figura 8) demonstrou que eftU, enolase e pGTF foram signifi- cativamente regulados positivamente na fase log tardia em compara- ção com a fase estacionária, enquanto a expressão de oppA, pulula- nase, serpina e tadA foi significativamente maior na fase estacionária do que na fase log tardia. Seis dos genes (eftU, enolase, pGTF, oppA,

serpin and transaldolase) foram significativamente regulados positiva- mente em resposta às células epiteliais intestinais (IECs) em relação à fase log tardia. Ficou evidente a partir desta análise que a expressão gênica de MRx0004 foi alterada pelo contato com IECs, inferindo um papel potencial para os genes regulados positivamente nas interações MRx0004-hospedeiro. A maioria dos genes significativamente regula- dos positivamente nesta análise de qPCR previram papéis na adesão a IECs, o que sugere que esta pode ser uma propriedade funcional importante do MRx0004.

[00265] A expressão de efetores de resposta do hospedeiro adicio- nais por MRx0004 foi ainda caracterizada pela identificação de proteí- nas presentes no sobrenadante de cultura e na superfície celular. A análise de Nano-LC-MS/MS identificou 64 proteínas em MRx0004SN (Tabela 2). As proteínas identificadas com o maior número de peptí- deos combinados (PSM) foram pululanase ((351,33 ± 33,62), duas proteínas da família NlpC/P60 (82 ± 15,62 e 71,67 ± 13,61), uma pro- teína de ligação de soluto do sistema transportador ABC (56 ± 7) e a proteína de divisão celular FtsI (56 ± 4,36). Várias proteínas do moon- lighting envolvidas na interação do hospedeiro em B. breve e outras espécies bacterianas foram identificadas, que incluíam transaldolase (32,67 ± 3,79), GAPDH (30 ± 3,61), DnaK (17,67 ± 3,21), GroEL (12,67 ± 0,58) e enolase (5,67 ± 0,58) [74, 79-84].

[00266] A identificação de proteínas presentes na superfície das células MRx0004 foi realizada usando uma abordagem enzimática de redução de células. As células bacterianas foram raspadas usando tripsina e as proteínas associadas à superfície clivadas foram identifi- cadas usando LC-MS/MS (fração de proteína raspada). Proteínas de controles sem tripsina também foram colhidas e analisadas por LC- MS/MS, permitindo a identificação de proteínas fracamente ligadas à superfície (fração de proteína descartada). Um total de 106 proteínas raspadas foram identificadas, 44 das quais estavam previstas para se- rem ancoradas na parede celular (ou seja, presentes na fração de pro- teína raspada e ausentes da fração de proteína descartada) (Tabela 3, Figura 15). Conforme observado para MRx0004SN, a proteína raspada mais abundante identificada foi a pululanase (136,67 ± 17,47), que também foi detectada nas frações de proteínas descartadas (79 ± 10,54). Curiosamente, uma policetídeo sintase do tipo I também foi identificada em ambas as frações de depuração celular, embora mais peptídeos correspondentes tenham sido identificados na fração de pro- teína raspada do que na fração de proteína descartada (54,67 ± 10,69 e 11,67 ± 6,43 respectivamente). Todas as proteínas do moonlighting presentes em MRx0004SN e listadas acima também foram detectadas em frações de barbear de células MRx0004 (Tabela 3). Além disso, EfTu foi identificado em ambas as frações proteicas depiladas e des- cartada (PSM = 32 ± 5 e 24,33 ± 8,39 respectivamente). Cinco dos ge- nes analisados por qPCR (eftU, enolase, luxS, pululanase e transaldo- lase) também foram detectados em um ou em ambos os conjuntos de dados de raspagem celular e sobrenadante, confirmando a tradução desses genes. Os dados de conjuntos de dados transcricionais e pro- teômicos coletivamente nos permitiram identificar novos efetores po- tenciais de interesse em MRx0004.

[00267] Curiosamente, a enzima amilolítica pululanase, a proteína mais abundante no conjunto de dados de redução de células, é uma proteína clandestina que foi relatada como envolvida na adesão de Streptococcus pyogenes a glicoproteínas e células hospedeiras in vitro [85,86]. Além disso, DnaK e enolase de B. animalis subsp. lactis [82,83] e EfTu from B. longum [87] foram relatados como aderindo ao plasminogênio in vitro. Além disso, a expressão recombinante da en- zima glicolítica transaldolase de B. bifidum A8 em L. lactis aumentou a aderência desta cepa à mucina [84]. A produção dessas proteínas clandestinas por MRx0004 sugere que elas podem desempenhar um papel na capacidade adesiva de MRx0004 e, assim, facilitar a intera- ção com a superfície da célula hospedeira. Os efeitos das proteínas bifidobacterianas do moonlighting em receptores específicos da célula hospedeira e vias de sinalização ainda não foram descritos, e podem representar novas vias regulatórias para MRx0004 através das quais MRx0004 interage com o hospedeiro. Investigando as características de modulação da resposta imune inata por MRx0004

[00268] Outros experimentos foram realizados para caracterizar a resposta do hospedeiro ao MRx0004.

[00269] Para auxiliar neste estudo, uma cepa (EPSneg) foi construí- da por meio da qual o gene pGTF do locus EPS foi inativado por meio de mutagênese de inserção (Figura 16A). Esta cepa foi construída uti- lizando a metodologia descrita em [88], mas ao invés de manipular um sistema de modificação de restrição (RM) Tipo II, a metilase e as su- bunidades de especificidade do sistema MRx0004 Tipo I RM foram expressas e usadas para metilar o DNA de plasmídeo antes de trans- formação. Uma cepa EPSneg complementada (EPScomp) e uma cepa de vetor vazio EPSneg (EPSvec) também foram geradas como controles.

[00270] O impacto de EPS na ativação de TLR2 e NFκB foi avaliado pela coincubação de células repórter HEK-TLR2 e THP-1-NFκB com tratamentos vivos e sobrenadantes de MRx0004, EPSneg, EPSvec e EPScomp. Todos os tratamentos com bactérias vivas ativaram o TLR2 em uma extensão comparável (Figura 12A). Em contraste, a ativação de NFκB por MRx0004LV foi significativamente menor do queEPSnegLV (p = 0,003) e EPSvecLV (p = 0,009), mas não EPScompLV (Figura 12B). Não houve diferença na ativação de TLR2 e NFκB entre MRx0004SN e EPScompSN, demonstrando que, neste caso, o tipo selvagem e o com- plemento exibiram um fenótipo similar. EPSnegSN e EPSvecSN foram sig-

nificativamente mais estimulantes para TLR2 (p <0,0001 para ambos) e NFκB (p = 0,002 e 0,0013 respectivamente) do que MRx0004SN. Es- ses dados sugerem que a ativação de TLR2 por MRx0004 não é me- diada diretamente por seu EPS. Em contraste, a ativação de NFκB é aumentada em resposta à exposição da superfície celular MRx0004 na ausência de EPS. Estes dados sugerem que a imunomodulação eficaz por MRx0004 é melhor alcançada usando a célula intacta inteira, e que o ligante MRx0004 para TLR2 está principalmente associado à super- fície celular, mas também pode ser descartado ou secretado.

[00271] O impacto de MRx0004 e suas cepas derivadas em um modelo in vitro de inflamação IEC também foi investigado. As células HT29-MTX foram preparadas com MRx0004 e seus derivados por 3 horas, após o que TNFα foi adicionado aos poços como um estimulan- te inflamatório por mais 24 horas. Usando este modelo, MRx0004 não reduziu a secreção de IL-8 mediada por TNFα em comparação com um controle sem bactérias (Figura 12C). No entanto, a secreção de IL- 8 em células não estimuladas com TNFα foi diminuída pelo tratamento com MRx0004 em comparação com um controle de linha de base. O tratamento com EPSneg resultou em uma redução significativa da se- creção de IL-8 induzida por TNFα em comparação com MRx0004 (p <0,0001). A secreção de IL-8 em células tratadas com EPSvec-e EPS- comp - também foi significativamente menor do que em resposta a MRx0004 (p < 0,0001 para ambas as comparações). Curiosamente, parecia que o não blindagem de antígenos associados à superfície ti- nha um efeito anti-inflamatório nas IECs, em contraste com os efeitos demonstrados por EPSneg em ensaios repórter.

[00272] Impacto do MRx0004 na resposta imune adaptativa

[00273] Para examinar o efeito de MRx0004 no sistema imune adaptativo, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de doadores humanos saudáveis foram usadas para caracterizar popula-

ções de células e perfis de secreção de citocinas. O PHA foi usado como um controle positivo neste ensaio (dados não mostrados). PBMCs foram coincubados com células bacterianas inativadas por ca- lor e sobrenadantes de cultura livre de células de MRx0004 e suas ce- pas derivadas por 72 horas. A expressão de marcadores de superfície de células T (CD3+CD4+ e CD3+CD8+), Treg (CD3+CD4+CD25+CD127-) e células B (CD3-CD19+) foram analisados (juntamente com o marca- dor de ativação CD25) por citometria de fluxo (consulte a Figura 18 para estratégia de gating). Bactérias inativadas por calor, em vez de bactérias vivas, foram usadas como tratamentos neste modelo devido à probabilidade de que bactérias vivas crescessem e superassem as células humanas por nutrientes durante o período de incubação de 72 horas. A expressão de ambos os marcadores de superfície celular e citocinas em resposta aos sobrenadantes bacterianos de todas as ce- pas testadas não foi significativamente diferente em comparação com a observada em resposta ao veículo (YCFA) (dados não mostrados). Os dados para EPSvec e EPScomp são ilustrados nas Figuras 20 e 21.

[00274] O tratamento com MRx0004HK resultou em um aumento significativo nos subconjuntos CD8+CD25+ ativados em comparação com o controle não tratado (p = 0,0038, Figura 13A), enquanto EPSne- g HK não aumentou significativamente a percentagem de células CD8+CD25+ ativadas em comparação com os controles. Nem MRx0004HK nem EPSnegHK aumentaram significativamente a percenta- gem de populações de células T CD8+, CD4+ ou CD4+CD25+ em com- paração com os controles (Figura 19A e B, Figura 13B). A população de células B foi aumentada em uma extensão estatisticamente signifi- cativa similar por MRx0004HKe EPSneg HK em comparação com células não tratadas (p = 0,001 e 0,0013 respectivamente, Figura 13E). A ati- vação de células B (CD19+CD25+) não foi significativamente afetada por nenhum dos tratamentos aplicados (Figura 19-C). Dentro da popu-

lação de células CD4+, a proporção de células Treg foi analisada usando os marcadores de superfície CD25+CD127-. Um aumento na percentagem relativa de Tregs foi observado nos PBMCs tratados com EPSnegHK, mas não nos MRx0004HK PBMCs (p = 0,0014, Figura 13C) quando comparados com células não tratadas. EPSnegHK aumentou Tregs em relação a MRx0004HK (p = 0,0196). Uma distorção na razão Treg/CD8+ em direção a uma resposta de células T regulatórias foi ob- servada no tratamento com MRx0004HK em comparação com células não tratadas (p = 0,0008, Figura 13D. Além disso, a inclinação positiva de CD8+ aumentada em resposta a MRx0004HK foi significativamente maior do que para EPSnegHK (p = 0,0272, Figura 13D). Tomados em conjunto, esses dados confirmam o efeito imunoestimulador de MRx0004 e sugerem que a perda de EPS pode resultar em um au- mento da estimulação de Tregs e da razão Treg/CD8+ e um efeito imunoestimulador reduzido. Embora EPS possa desempenhar um pa- pel na ativação de células CD8+, não parece estar envolvido na modu- lação significativa da população de células B.

[00275] A assinatura de citocinas secretadas de PBMCs tratadas com MRx0004HK e EPSnegHK também foi determinada, quantificando citocinas principalmente associadas a Th1 (IL-12p70, IFNγ, TNFα), Th2 (IL-4), Th17 (IL-17α, IL-1β), e populações Treg (IL-10). TNFα, IL- 12p70, IFNγ, IL-4 e IL-17α foram significativamente aumentados pelo tratamento MRx0004HK em comparação com células não tratadas (p = 0,0038, 0,0025, 0,0036, 0,027 e 0,0316 respectivamente, Figura 14A- D). O tratamento com EPSnegHK induziu uma resposta significativa em TNFα, IFNγ, IL-1β, IL-10 e IL-17α (p = 0,0001, 0,0267, < 0,0001, 0,0004 e 0,0103 respectivamente, Figura 14A, C, EG). Em contraste com MRx0004HK, EPSnegHK não aumentou significativamente a secre- ção de IL-12p70 ou IL-4 em comparação com células não tratadas. MRx0004HK também aumentou significativamente IL-12p70 em compa-

ração com EPSnegHK (p = 0,0118, Figura 14B), enquanto inversamente o tratamento com EPSnegHK produziu uma concentração mais alta de IL-1β e IL-10 do que MRx0004HK (p = 0,0008 e 0,014, respectivamen- te, Figura 14E-F).

[00276] As razões de citocinas foram analisadas a fim de inferir se os tratamentos bacterianos desviaram a resposta da célula T helper para um subtipo particular usando citocinas produzidas por cada subti- po de célula T helper individual como indicadores (Th1 ou Th2; IL- 12p70/IL-4, Treg; IL-10/IL1p70, Th17; IL-1β/IL12p70, Figura 14H-J). O tratamento com MRx0004HK pareceu distorcer significativamente a resposta imune em direção a um fenótipo Th1 em comparação com células não tratadas (p =0,0172, Figura 14H), enquanto o tratamento com EPSnegHK pareceu induzir uma distorção em direção a uma res- posta Treg e Th17 em comparação com células não tratadas (p = 0,0312 e 0,0005, Figura 14I-J). A inclinação EPSnegHK Treg e Th17 também foi significativamente aumentada em comparação com MRx0004HK (p = 0,0423 e 0,0008, Figura 14J). Uma clara distinção foi observada entre os tratamentos MRx0004HK e EPSnegHK em sua capa- cidade de conduzir diferentes subconjuntos da resposta das células T.

[00277] Em conjunto, as observações neste estudo demonstram que o MRx0004 regula os braços pró-inflamatórios da resposta imune inata e adaptativa. Portanto, MRx0004 e outras cepas de B. breve po- dem ser úteis para estimular o sistema imunológico e tratar doenças associadas à diminuição da atividade imunológica. Exemplo 2 - caracterizando o efeito do locus MRx0004 eps na po- tência Sumário

[00278] O objetivo deste estudo foi caracterizar o papel do exopo- lissacarídeo (EPS) MRx0004 nas propriedades imunoestimulatórias e terapêuticas do MRx0004.

Materiais e Métodos

[00279] As experiências foram realizadas conforme descrito no Exemplo 1, com os procedimentos adicionais descritos abaixo. Cultura de rotina de células imortalizadas

[00280] Células HEK-Blue™ -hTLR2 (InvivoGen, San Diego, CA, EUA) foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS 10% (v/v), L-glutamina 4 mM, glicose 4,5 mg/ml, penicilina 100 U/ml, Estreptomi- cina 100 μg/ml, Normocin™ 100 μg/ml (InvivoGen), blastocidina 30 μg/ml e zeocina 100 μg/ml para densidade de 90%. As células THP1- Blue™ NF-kB (InvivoGen) foram cultivadas em RPMI 1640 suplemen- tado com 10% (v/v) de FBS inativado pelo calor, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 25 mM HEPES, 100 μg/ml Normocin™, 10 μg/ml de blastocidina (cRPMI). As linhagens celulares foram cultivadas a 37°C e 5% de CO2. Todos os reagentes foram fornecidos pela Sigma-Aldrich, salvo indicação em contrário. Análise comparativa do locus MRx0004 EPS e cepas relacionadas de B. breve

[00281] Genomas de cepas de Bifidobacterium disponíveis no ban- co de dados GenBank usado para a análise in silico de agrupamentos EPS e mapas físicos dos agrupamentos de genes de exopolissacarí- deos putativos de cepas de Bifidobacterium. Análise de expressão diferencial do locus MRx0004 EPS

[00282] O RNA total foi extraído de culturas de fase log tardia da cepa MRx0004 com RNAprotect (Qiagen) e o kit RNeasy Mini (Qia- gen), de acordo com o protocolo do fabricante com pequenas modifi- cações. A lise mecânica das células foi realizada usando Lysing Matrix B e um tecido MP Fast-Prep-24 e homogeneizador de células (MP Bi- omedicals, Santa Ana, CA, EUA) com oscilações fixadas em 6 m/s. As células foram interrompidas por dois ciclos de 20 s com um descanso de 1 minuto no gelo entre os ciclos. A qualidade do RNA foi verificada em um Tapestation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) com o Agilent RNA Screentape (Agilent Technologies). A ausência de de- gradação de RNA foi verificada e todas as amostras tinham um núme- ro mínimo de integridade de RNA ≥ 9. O kit MICROBExpress (Thermo Fisher Scientific) foi usado para esgotar as espécies de rRNA. A au- sência de espécies de rRNA 16S e 23S foi avaliada e verificada em um Agilent Bioanalyzer com o Agilent RNA Screentape (Agilent Technologies). Amostras de RNA esgotadas em rRNA foram enviadas para GATC Biotech para preparação de biblioteca específica de fita e sequenciadas em um sequenciamento Illumina para produzir leituras de extremidade única de 150 bp. Uma média de 22.3878,08 (amostras de log tardio) e 18627178,6 (amostras de fase estacionária) leituras brutas por biblioteca de RNA-Seq foram obtidas, totalizando mais de 10,07 Gbp.e 8,38 Gbp, respectivamente. Leituras brutas foram corta- das usando Trimmomatic (1) e qualidade filtrada (98,36% das amos- tras de log atrasadas e 98,26% (amostras de fase estacionária) leitu- ras aprovadas no QC e foram alinhadas 99,11% (LL) e 98,72% (SP) das leituras limpas mapeadas) para Genoma MRx0004 usando Bowtie (2). Os níveis de expressão das amostras replicadas de cada fase de crescimento foram calculados para cada gene no locus MRx0004 EPS usando XX e DeSeq2 v X (Love et al, 2014) e posteriormente visuali- zados usando Geneious R11 (Biomatters, Auckland, Nova Zelândia). A expressão diferencial entre as duas fases de crescimento é represen- tada. O logaritmo de base 2 da razão dos valores normalizados entre as duas amostras e quando uma amostra tem nenhuma ou muito bai- xa expressão, a razão log2 é limitada a +/- 1.000.000. Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

[00283] As bactérias foram diluídas 1:5 em solução fixadora (0,5 M de sacarose em 0,1 M de tampão de fosfato de Na, 2% de paraformal- deído e 0,16% de glutaraldeído) e fixadas por 2 horas em temperatura ambiente. Depois disso, as grades de cobre revestidas com carbono de Formvar foram flutuadas em gotículas de 100 µL das suspensões B. breve durante 1 hora, lavadas três vezes com 0,02 M de glicina em PBS. As células foram coradas negativamente com molibdato de amô- nio a 1,0%. As grades foram examinadas, e micrografias visualizadas, usando um microscópio eletrônico de transmissão JEM-1400 (JEOL Ltd., Tóquio, Japão). Ensaios de adesão bacteriana

[00284] Bactérias vivas (preparadas e ressuspensas em meio de cocultura como descrito precedentemente) foram aplicadas a células HT29-MTX em placas de 24 poços em um MOI de 100:1 e coincuba- das por 3 horas a 37°C em condições anaeróbias. As células foram lavadas duas vezes com PBS para remover bactérias não ligadas e lisadas com 0,1% (v/v) de Triton X-100 (Sigma-Aldrich). O lisado foi semeado e o número de unidades formadoras de colônias (CFU) re- cuperadas foi usado para determinar a percentagem de adesão. Resultados

[00285] O locus eps de MRx0004 é geneticamente distinto de ou- tras cepas de B. breve e é altamente expresso durante o crescimento logarítmico tardio.

[00286] O sequenciamento do genoma da cepa MRx0004 indicou que ela abrigava um locus EPS de 28 Kb que codificava para 27 ge- nes, representando o complemento total de funções previstas como necessárias para a biossíntese de EPS em B. breve. Esta região inclui: uma glicosiltransferase de iniciação, quatro glicosiltransferases adicio- nais, uma proteína de ligação de pirofosfato de tiamina que é codifica- da a jusante de uma proteína que abrange a membrana, uma flippase e um determinante de comprimento de cadeia (Fig. 9). A maioria dos loci B. breve EPS, incluindo aquele da cepa MRx0004 são flanqueados por proteínas hipotéticas (estendendo a região MRx0004 para 31,5

Kb), que foram excluídos da representação dos loci B. breve EPS re- presentados na Figura 9. A maioria (16/19) das cepas ilustradas na Figura 9 são isolados infantis, cujos genomas estão super- representados em bancos de dados públicos. As regiões de EPS B. breve que excedem 50 Kb representam loci completos que codificam todas as funções necessárias para produzir fenótipos EPS positivos

[89]. Em contraste, quando essas regiões são <30 Kb, acredita-se que representem loci incompletos ou remanescentes [89].

[00287] As análises comparativas identificaram o locus EPS como uma região principal de divergência genética entre o genoma da cepa MRx0004 (dados não mostrados) e outras cepas de B. breve. O locus MRx0004 EPS foi comparado com aqueles dos genomas B. breve dis- poníveis publicamente. As cepas de B. breve cujos loci EPS exibiram altos níveis de identidade de sequência (ID) e sintenidade gênica com a da cepa MRx0004 são ilustradas na Figura 9 e são ordenadas de acordo com sua similaridade (% nt ID média ao longo do comprimento do operon) para a cepa MRx0004. B. breve NRBB51, um isolado infan- til (amamentado) compartilhou o nível mais alto de identidade de nu- cleotídeos (ID), 91,5%, com a cepa MRx0004 ao longo do comprimen- to completo dos dois loci. Uma região central de 1,3 Kb, que codifica as transposases previstas em ambas as cepas, representa a região primária de diversidade entre as cepas MRx0004 e NRBB51. Os ge- nes codificados no início e no final do locus MRx0004 exibiram o nível mais alto de conservação de sequência com outros isolados de B. bre- ve (Fig. 9). O pGTF de MRx0004, que é essencial para a etapa primá- ria da biossíntese de EPS, compartilhou 92,2% de ID (aa) em pares com homólogos nas cepas de comparação. Uma região de 4 Kb que engloba um regulador de comprimento de cadeia e genes que codifi- cam uma proteína hipotética e uma proteína que abrange a membrana compartilham 98,3% de ID nt entre as cepas examinadas. Os genes que codificam proteínas e transposases hipotéticas foram responsá- veis pelas principais regiões de diversidade de sequência entre a cepa MRx0004 e os dez loci EPS mais intimamente relacionados (Fig. 9). Em contraste, os loci de EPS B. breve que foram considerados mais diferentes dos da cepa MRx0004 (as nove cepas inferiores na Figura 9) apresentam variação no número e na ordem dos genes que são de importância central para a produção de EPS, incluindo genes gtf, poli- merase e acetiltransferase (Fig. 9).

[00288] A fim de determinar se o locus EPS de MRx0004 foi mais altamente transcrito durante o log tardio ou crescimento em fase esta- cionária, a análise de expressão diferencial foi realizada em monocul- turas da cepa MRx0004 cultivadas em YCFA. (Fig. 9. B). A maioria dos genes que se prevê serem os principais responsáveis pela síntese de MRx0004 EPS (descritos acima) foram regulados positivamente duran- te o crescimento da fase log tardia. O locus MRx0004 EPS codifica dez proteínas hipotéticas e cinco transposases, que representaram as únicas categorias de genes que foram regulados positivamente duran- te o crescimento em fase estacionária de MRx0004 (Fig. 9). O papel das proteínas hipotéticas na síntese de MRx0004 EPS ainda é desco- nhecido. Geração de uma cepa negativa EPS de MRx0004

[00289] O papel de MRx004 EPS nas interações hospedeiro- micróbio e imunomodulação foi investigado e uma cepa (EPSneg) foi construída, como discutido acima, em que o gene pGTF do locus EPS foi inativado por meio de mutagênese de inserção (Figura 16A). Esta cepa foi construída utilizando a metodologia descrita em [88], mas ao invés de manipular um sistema de modificação de restrição (RM) Tipo II, a metilase e as subunidades de especificidade do sistema MRx0004 Tipo I RM foram expressas e usadas para metilar o DNA de plasmídeo antes de transformação. Uma cepa EPSneg complementada (EPScomp)

e uma cepa de vetor vazio EPSneg (EPSvec) também foram geradas como controles. EPSneg e EPSvec exibiram um fenótipo autoagregativo aumentado em comparação com MRx0004 (Figura 16B). EPScomp foi menos agregativo do que EPSneg e EPSvec, mas sua autoagregação pareceu ser aumentada em comparação com MRx0004, sugerindo que esta cepa pode não estar revertendo totalmente para um fenótipo EPS de tipo selvagem.

[00290] O fenótipo EPS de MRx0004 e EPSneg foi investigado usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A ausência de EPS na cepa EPSneg em comparação com MRx0004 é ilustrada na Fi- gura 10A e 10B. As capacidades adesivas do MRx0004 de tipo selva- gem e suas cepas derivadas foram analisadas usando um modelo IEC in vitro. EPSneg foi duas vezes mais aderente aos IECs do que MRx0004 (47,5% de adesão vs 18,7% respectivamente, p = 0,006) (Figura 10C), sugerindo que a ausência de EPS aumentou a capaci- dade adesiva de EPSneg. O fenótipo de adesão aumentado visto em EPSneg foi mantido com EPSvec (40,1% de adesão, p = 0,03 vs MRx0004), mas a adesão de EPScomp (34,1%) não foi significativamen- te diferente quando comparada a qualquer outra cepa, implicando ain- da que a reversão de EPScomp a um fenótipo de tipo selvagem estava incompleto. Depleção de EPS em MRx0004 expõe proteínas de superfície envolvi- das na estimulação do hospedeiro

[00291] O aumento da adesão de EPSneg a IECs sugeriu que o es- gotamento de EPS pode ter resultado no aumento da exposição de proteínas associadas à superfície, ou "não blindagem". A composição das proteínas associadas à superfície MRx0004 e EPSneg foi analisada após o contato com IECs. Após 3 h de contato com células HT29- MTX, as células bacterianas foram raspadas com tripsina, conforme descrito precedentemente, e as frações de proteína raspadas e des-

cartadas resultantes foram analisadas por LC-MS/MS. A raspagem de células MRx0004 após o contato com IECs rendeu 55 proteínas ras- padas (34 das quais foram previstas para serem ancoradas na super- fície) e 24 proteínas descartadas (Figura 11A). A raspagem das célu- las EPSneg após o contato com IECs continha consideravelmente mais proteínas do que o de MRx0004, com 101 proteínas na fração de pro- teína raspada e 45 na fração de proteína descartada (Figura 11B). Com exceção de três proteínas identificadas na fração de proteína descartada MRx0004 (enzimas envolvidas no metabolismo de carboi- dratos, lipídios e proteínas), todas as proteínas identificadas estavam presentes na fração de proteína raspada para ambas as cepas.

[00292] A comparação das frações de proteína raspada MRx0004 e EPSneg identificou 54 proteínas que estavam presentes em ambas as amostras e 47 proteínas que eram específicas para a cepa EPSneg (Fi- gura 11C). A única proteína que foi identificada exclusivamente no conjunto de dados de proteína raspada MRx0004 foi uma proteína da família NlpC/P60. O número de proteínas colhidas por raspagem de células foi maior para a cepa EPSneg do que para MRx0004, inferindo que a depleção de EPS facilitou um melhor acesso às proteínas de superfície para clivagem por tripsina. Além disso, as proteínas conhe- cidas por estarem envolvidas na interação do hospedeiro em bifido- bactérias e outros gêneros foram mais abundantes (conforme avaliado pelo número de peptídeos identificados/μg de proteína total) na fração de proteína rapada EPSneg do que na de MRx0004 (Tabela 4). Esses resultados adicionam mais credibilidade à hipótese de que a depleção de EPS resultou em um efeito não blindado, expondo proteínas de su- perfície e imunógenos MRx0004 potenciais que seriam mascarados por EPS MRx0004.

[00293] O conteúdo de proteína do sobrenadante da cultura EPSneg também foi analisado por LC-MS/MS e confirmou que a falta de EPS resultou em um aumento no número de proteínas potencialmente des- cartadas e secretadas no meio extracelular pela cepa EPSneg (Figura 17). Um total de 146 proteínas foram identificadas em EPSnegSN em contraste com apenas 64 em MRx0004SN, das quais 87 foram detecta- das apenas em EPSnegSN e 59 em ambas as amostras. As proteínas do moonlighting identificadas em MRx0004SN e discutidas acima foram todas detectadas em maior abundância em EPSnegSN, com exceção de GAPDH que foi comparável entre as duas amostras (30 ± 3,61 e 28,33 ± 0,58 em MRx0004SN e EPSnegSN). Curiosamente, coloilglicina hidro- lase (hidrolase de sal biliar) e EfTu, que demonstrou desempenhar um papel na ligação do plasminogênio humano em B. lactis and B. lon- gum, foram detectados exclusivamente em EPSnegSN [80,87]. A hidro- lase do sal biliar também pode proteger as espécies comensais de es- tresses ambientais no intestino [90]. O aumento da detecção de prote- ínas em EPSnegSN em comparação com MRx0004SNsugere que o não blindagem na ausência de EPS pode resultar no aumento da liberação ou secreção de proteínas associadas à superfície MRx0004. Conclusões

[00294] As análises genômicas comparativas demonstraram que o locus responsável pela síntese de EPS em MRx0004 é geneticamente distinto de outras cepas de B. breve. A variação genética observada nesta região pode contribuir para o aumento da potência e utilidade terapêutica de MRx0004 e cepas relacionadas.

[00295] A importância potencial de EPS como um mediador de MRx0004: interações do hospedeiro e como um efetor de respostas imunes foi suportada pelo aumento relativo na expressão de seu pGTF após o contato com IECs. Além de pGTF, a maioria dos outros genes significativamente regulados positivamente na análise de qPCR previu papéis na adesão a IECs, o que implica que esta pode ser uma propri- edade funcional importante de MRx0004. O gene tadA associado ao pilus Tipo IV de MRx0004 foi expresso em cultura in vitro , o que foi interessante devido à observação precedente de que o pilus Tad de B. breve UCC2003 não foi produzido em condições in vitro [91]. A ex- pressão da serpina também aumentou significativamente em resposta aos IECs. Recentemente, foi relatado que uma serpina de B. longum NCC2705 reduz a infiltração de linfócitos intraepiteliais no intestino delgado de um modelo de doença celíaca in vivo [92], induzindo assim um efeito imunoestimulador e protetor, o que sugere que a serpina de B. breve, e MRx0004 em particular, pode ter efeitos imunomodulado- res similares.

[00296] A análise proteômica de sobrenadantes e aparas celulares detectou um grande número de proteínas com papéis previstos no me- tabolismo de carboidratos. Curiosamente, a enzima amilolítica pulula- nase, a proteína mais abundante no conjunto de dados de depuração celular, é uma proteína clandestina que foi relatada como envolvida na adesão de Streptococcus pyogenes a glicoproteínas e células hospe- deiras in vitro [85,86]. Além disso, DnaK e enolase de B. animalis subsp. lactis [82,83] and EfTu from B. longum [87] foram relatados co- mo aderindo ao plasminogênio in vitro. Além disso, a expressão re- combinante da enzima glicolítica transaldolase de B. bifidum A8 em L. lactis aumentou a aderência desta cepa à mucina [84]. A produção dessas proteínas clandestinas por MRx0004 sugere que elas podem desempenhar um papel na capacidade adesiva de MRx0004 e, assim, facilitar a interação com a superfície da célula hospedeira. Essas pro- teínas moonlighting bifidobacterianas podem ter efeitos específicos em receptores específicos da célula hospedeira e vias de sinalização que medeiam os efeitos intensificados de MRx0004 no sistema imunológi- co.

[00297] MRx0004 induziu um aumento significativo nos subconjun- tos de CD8+ ativados, que parecia estar parcialmente associado à pre-

sença de EPS.

[00298] O tratamento com EPSneg aumentou significativamente as Tregs em comparação com MRx0004. Isso sugere que a remoção de EPS expõe outro componente da superfície bacteriana capaz de inte- ragir com as células hospedeiras e promover uma resposta Treg. As flutuações foram evidentes nas populações CD8+ e Treg. EPSneg indu- ziu uma inclinação significativa em direção a uma resposta Treg, con- forme ilustrado pela razão Treg/CD8 significativamente aumentada em comparação com a linha de base. Isso implica que a falta de proteção da superfície celular em EPSneg resulta em um efeito anti-inflamatório, e a presença de EPS em MRx0004 suporta sua potência imunoestimu- ladora.

[00299] O EPS de MRx0004 foi encontrado para estar diretamente envolvido na secreção de IL-12p70. Além disso, a secreção de todas as três citocinas Th1 testadas (IL-12p70, IFNγ, TNFα) foi significativa- mente regulada positivamente por MRx0004HK, sugerindo que esta ce- pa induz uma distorção em direção a uma resposta Th1 que é parcial- mente mediada por seu EPS. MRx0004HKtambém induziu significati- vamente a citocina Th2 IL-4 e regulou positivamente IL-10, IL-1β e IL- 17α, embora não significativamente, inferindo assim que esta cepa po- de induzir mudanças no microambiente da célula T helper. A indução de um Th1 pode melhorar a estabilidade da barreira intestinal in vivo e ser benéfica para a manutenção da homeostase imunológica.

[00300] O EPS de MRx0004 pode ter efeitos imunorreguladores es- pecíficos, ou seja, regulação das respostas CD8+, Treg e Th1, e esses efeitos podem fornecer potência aumentada e eficácia terapêutica. Exemplo 3 - Eficácia de inóculos bacterianos em modelos de cân- cer de camundongo Sumário

[00301] Conforme estabelecido nos exemplos precedentes, os in-

ventores identificaram um novo efeito imunoestimulador de B. breve e, em particular, a cepa MRX004. À luz dos novos dados apresentados acima, as composições que compreendem B. breve e, em particular, a cepa MRX004, devem ser eficazes para estimular o sistema imunoló- gico e tratar doenças que estão associadas com a diminuição da ativi- dade do sistema imunológico ou que se beneficiam do aumento da ati- vidade do sistema imunológico.

[00302] O câncer é uma doença que pode se beneficiar do aumento da atividade do sistema imunológico que ataca os tumores. Consisten- te com os novos dados apresentados acima e o novo efeito imunoes- timulador de MRX004, MRX004 é mostrado no estudo abaixo para re- duzir potentemente o volume do tumor em modelos de tumor de ca- mundongo, o que demonstra que a administração de MRX004 é eficaz para tratar a doença.

[00303] Este estudo testou a eficácia de composições compreen- dendo cepas bacterianas de acordo com a invenção em quatro mode- los de tumor, e comparou a eficácia a um anticorpo anti-CTLA. Materiais

[00304] Substância de teste - Cepa bacteriana #MRX004, Bifido- bacterium breve.

[00305] Substância de referência - Anticorpo anti-CTLA-4 (clone: 9H10, catálogo: BE0131, isotipo: Hamster Sírio IgG1, Bioxcell).

[00306] Veículos de substâncias de teste e referência - Meio de cultura bacteriana (extrato de levedura, Casitone, meio de ácido graxo (YCFA)). Cada dia de injeção em camundongos, o anticorpo foi diluído com PBS (ref: BE14-516F, Lonza, França).

[00307] Doses de tratamento - Bactéria:2x108 em 200 µL. O a- CTLA-4 foi injetado a 10 mg/kg/inj. O anti-CTLA-4 foi administrado em um volume de dose de 10 mL/kg/adm (ou seja, para um camundongo pesando 20 g, 200 µL da substância de teste serão administrados) de acordo com o peso corporal mais recente dos camundongos.

[00308] Vias de administração - O inóculo bacteriano foi adminis- trado por gavagem oral (per os, PO) por meio de uma cânula. As cânu- las foram descontaminadas todos os dias. Anti-CTLA-4 foi injetado na cavidade peritoneal de camundongos (intraperitonealmente, IP).

[00309] Condições de cultura da cepa bacteriana - As condições de cultura para a cepa bacteriana foram as seguintes:  Pipete 10 mL de YCFA (a partir dos frascos de laboratório de E&O de 10 mL) para tubos Hungate  Selar os tubos e enxaguar com CO2 usando uma entrada de seringa e sistema de exaustão  Autoclave os tubos Hungate  Quando resfriado, inocule os tubos Hungate com 1 mL dos estoques de glicerol  Coloque os tubos em uma incubadora estática a 37°C por cerca de 16 horas.  No dia seguinte, pegue 1 mL desta subcultura e inocule 10 mL de YCFA (tubos Hungate pré-aquecidos novamente, todos em duplicata)  Coloque-os em uma incubadora estática a 37°C por 5 a 6h Linhagem de células cancerosas e condições de cultura

[00310] As linhagens celulares que foram utilizadas são detalhadas na tabela abaixo: Linhagem Celu- Tipo Cepa do ca- Origem lar mundongo EMT-6 Carcinoma de BALB/c ATCC mama LL/2 (LLC1) Carcinoma de C57BL/6 ATCC CRL1642 pulmão Hepa1-6 Carcinoma Hepa- C57BL/6 IPSEN INNOVA- tocelular TION

[00311] A linhagem celular EMT-6 foi estabelecida a partir de um carcinoma mamário murino transplantável que surgiu em um camun- dongo BALB/cCRGL após o implante de um nódulo alveolar mamário hiperplásico [93].

[00312] A linhagem celular LL/2 (LLC1) foi estabelecida a partir do pulmão de um camundongo C57BL com um tumor resultante de uma implantação de carcinoma pulmonar de Lewis primário [94].

[00313] A linhagem celular Hepa 1-6 é um derivado do hepatoma de camundongo BW7756 que surgiu em um camundongo C57/L [95].

[00314] Condições de cultura de células - Todas as linhagens de células foram cultivadas como monocamada a 37°C em uma atmosfe- ra umidificada (5% CO2, 95% ar). O meio de cultura e o suplemento são indicados na tabela abaixo: Linhagem Meio de cultura Suplemento Celular EMT6 RPMI 1640 contendo L- 10% de soro fetal bovino (ref: glutamina 2mM (ref: BE12- #3302, Lonza) 702F, Lonza) LL/2 RPMI 1640 contendo L- 10% de soro fetal bovino (ref: (LLC1) glutamina 2mM (ref: BE12- #3302, Lonza) 702F, Lonza) Hepa1-6 DMEM (ref: 11960-044, Gib- 10% de soro fetal bovino (ref: co) #3302, Lonza) 2mM de L-Glutamina penicilina-estreptomicina (Sigma G-6784)

[00315] Para uso experimental, células tumorais aderentes foram destacadas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (ref: BE17-161E, Lonza), em meio de Hanks sem cál- cio ou magnésio (ref: BE10-543F, Lonza) e neutralizado pela adição de meio de cultura completo. As células foram contadas em hemoci- tômetro e sua viabilidade será avaliada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano 0,25%.

Uso de animais

[00316] Camundongos Balb/C (BALB/cByJ) fêmeas saudáveis, de peso e idade correspondentes, foram obtidas de CHARLES RIVER (L'Arbresles) para os experimentos do modelo EMT6.

[00317] Camundongos fêmeas saudáveis C57BL/6 (C57BLl6J), de peso e idade correspondentes, foram obtidos de CHARLES RIVER (L'Arbresles) para os experimentos modelo LL/2 (LLC1) e Hepa1-6.

[00318] Os animais foram mantidos em estado de saúde SPF de acordo com as diretrizes da FELASA, e os procedimentos experimen- tais e de alojamento dos animais de acordo com os regulamentos franceses e europeus e o Guia do NRC para o cuidado e uso de ani- mais de laboratório foram seguidos [96,97]. Os animais foram manti- dos em alojamentos em condições ambientais controladas: Tempera- tura: 22 ± 2°C, Umidade 55 ± 10%, Fotoperíodo (12h claro/12h escu- ro), Ar filtrado HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Os recintos dos animais foram fornecidos com espaço estéril e adequado com material de cama, comida e água, enriquecimento ambiental e social (alojamento coletivo) conforme descrito: gaiolas de 900 cm2 (ref: verde, Tecniplast) em racks ventilados, cama Epicea (SAFE), 10 kGy Dieta irradiada (A04-10, SAFE), Alimento completo para roedores imu- nocompetentes - Extrudado R/M-H, água de garrafas de água. Desenho experimental e tratamentos Atividade antitumoral, modelo EMT6

[00319] Esquema de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 9/8 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, França). No D0, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxerta- dos com células tumorais EMT-6 conforme descrito abaixo. No D24, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpos anti-CTLA-4.

[00320] O esquema de tratamento está resumido na tabela abaixo: Grupo Nº de Tratamento Dose Via Cronograma Animais de Tratamento 1 8 Não-tratadas - - - 2 8 Veículo (mídia) - PO Q1Dx42 3 9 Cepa bacteriana 2x108 bac- PO Q1Dx42 #1 (MRX004) térias 4 8 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TWx2

[00321] O monitoramento dos animais foi realizado conforme des- crito a seguir.

[00322] Indução de tumores EMT6 em animais - No D14, os tumo- res foram induzidos por injeção subcutânea de 1x106 células EMT-6 em 200 µL de RPMI 1640 no flanco direito dos camundongos.

[00323] Eutanásia - Cada camundongo foi sacrificado quando atin- giu um desfecho humano, conforme descrito abaixo, ou após um má- ximo de 6 semanas após o início da dosagem. Atividade antitumoral, modelo LL/2 (LLC1)

[00324] Esquema de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 gru- pos de 9/8 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Couter- non, França). No D0, os camundongos receberão veículo (meio de cul- tura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram en- xertados com células tumorais LL/2 conforme descrito abaixo. No D27, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpos anti-CTLA-4.

[00325] O esquema de tratamento está resumido na tabela abaixo: Grupo Nº de Tratamento Dose Via Cronograma Animais de Tratamento

1 8 Não-tratadas - - - 2 9 Veículo (mídia) - PO Q1Dx42 8 3 9Cepa bacteriana 2x10 bacté- PO Q1Dx42 #1 (MRX004) rias 4 8 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TWx2

[00326] O monitoramento dos animais foi realizado conforme des- crito a seguir.

[00327] Indução de tumores LL/2 (LLC1) em animais - No D14, os tumores foram induzidos por injeção subcutânea de células 1x106 LL/2 (LLC1) em 200 µL RPMI 1640 no flanco direito dos camundongos.

[00328] Eutanásia - Cada camundongo foi sacrificado quando atin- giu um desfecho humano, conforme descrito abaixo, ou após um má- ximo de 6 semanas após o início da dosagem. Atividade antitumoral, modelo Hepa1-6

[00329] Esquema de tratamento - O início da primeira dosagem foi considerado como D0. Em D0, camundongos não enxertados foram randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 gru- pos de 9 usando o software Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, França). No D0, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxerta- dos com células tumorais Hepa 1-6 conforme descrito abaixo. No D16, os camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpos anti-CTLA-4.

[00330] O esquema de tratamento está resumido na tabela abaixo: Grupo Nº de Tratamento Dose Via Cronograma Animais de Tratamento 1 9 Não-tratadas - - - 2 9 Veículo (mídia) - PO Q1Dx42 4 9 Cepa bacteriana 2x108 bacté- PO Q1Dx42 #2 (MRX004) rias 7 9 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TWx2

[00331] O monitoramento dos animais foi realizado conforme des- crito a seguir.

[00332] Indução ortotópica de células tumorais Hepa 1-6 em ani- mais por injeção intraesplênica - Em D14, um milhão (1x106) de célu- las tumorais Hepa 1-6 em 50 µL de meio RPMI 1640 foram transplan- tadas por meio de injeção intraesplênica em camundongos. Resumi- damente, uma pequena incisão no flanco subcostal esquerdo foi feita e o baço foi exteriorizado. O baço foi exposto em gaze estéril e injetado sob controle visual com a suspensão de células com agulha de calibre

27. Após a inoculação das células, o baço foi excisado.

[00333] Eutanásia - Cada camundongo foi sacrificado quando atin- giu um desfecho humano, conforme descrito na seção abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o início da dosagem.

[00334] Avaliação da carga tumoral na eutanásia - No momento do término, os fígados foram coletados e pesados. Monitoramento animal

[00335] Monitoramento clínico - O comprimento e a largura do tu- mor foram medidos duas vezes por semana com compassos de cali- bre e o volume do tumor foi estimado por esta fórmula [98]: largura2 x2comprimento width  length Tumor volu me  2

[00336] Desfechos humanos [99]: Sinais de dor, sofrimento ou an- gústia: dor de postura, dor da máscara facial, comportamento; Tumor superior a 10% do peso corporal normal, mas não superior a 2.000 mm3; Tumores que interferem na deambulação ou nutrição; Tumor ul- cerado ou erosão do tecido; 20% de perda de peso corporal remanes- Volume do tumor cente por 3 dias consecutivos; Má condição corporal, emagrecimento, caquexia, desidratação; Ausência prolongada de respostas voluntárias a estímulos externos; Respiração difícil rápida, anemia, sangramento significativo; Sinais neurológicos: girando, convulsão, paralisia; Dimi- nuição sustentada da temperatura corporal; Distensão abdominal.

[00337] Anestesia - A anestesia com gás isoflurano foi usada para todos os procedimentos: cirurgia ou inoculação do tumor, injeções i.v., coleta de sangue. Anestesia com cetamina e xilazina foram utilizadas para procedimento cirúrgico de estereotaxia.

[00338] Analgesia - O protocolo de analgesia com carprofeno ou carprofeno/buprenorfina multimodal foi adaptado à gravidade do pro- cedimento cirúrgico. Cuidado não farmacológico foi fornecido para to- dos os procedimentos dolorosos. Além disso, os cuidados farmacoló- gicos que não interferiram nos estudos (tratamento tópico) foram for- necidos por recomendação do veterinário responsável.

[00339] Eutanásia - A eutanásia dos animais foi realizada por so- bredosagem de anestesia gasosa (Isoflurano) seguida de luxação cer- vical ou exsanguinação. Resultados Atividade antitumoral, modelo EMT6

[00340] Os resultados são mostrados na Figura 1. O tratamento com a cepa bacteriana da invenção levou a uma redução clara no vo- lume do tumor em relação a ambos os controles negativos. O controle positivo, conhecido por ativar o sistema imunológico, também levou à redução do volume do tumor, como seria de se esperar. Atividade antitumoral, modelo LL/2 (LLC1)

[00341] Os resultados são mostrados na Figura 2. Os controles ne- gativo e positivo não aparecem como seria de se esperar, porque o volume do tumor foi maior nos camundongos tratados com o controle positivo do que nos grupos de controle negativo. No entanto, o volume do tumor nos camundongos tratados com a cepa bacteriana da inven- ção era comparável ao grupo de controle positivo, o que é consistente com um efeito terapêutico e imunoestimulador útil. Atividade antitumoral, modelo Hepa1-6

[00342] Os resultados são mostrados na Figura 3. O controle nega- tivo não tratado não aparece como seria de se esperar, porque o peso do fígado foi menor neste grupo do que nos outros grupos. No entanto, o controle negativo do veículo e os grupos de controle positivo apare- cem como seria de se esperar, porque os camundongos tratados com veículo sozinho tinham fígados maiores do que os camundongos tra- tados com anticorpos anti-CTLA4, refletindo uma carga tumoral maior no grupo de controle negativo com veículo. O tratamento com a cepa bacteriana da invenção levou a uma redução clara no peso do fígado (e, portanto, carga do tumor) em relação aos camundongos no grupo de controle negativo do veículo.

[00343] Estes dados demonstram que MRX004 é eficaz para o tra- tamento de câncer e, à luz dos dados nos Exemplos 1 e 2, esses da- dos apoiam que a cepa MRX004 pode ser útil para tratar ou prevenir outras doenças associadas à redução da atividade do sistema imuno- lógico. Exemplo 4 - Caracterização da atividade enzimática

[00344] O sistema de teste Analytical Profile Index (API®) consiste em tiras que contêm testes bioquímicos miniaturizados que testam a atividade enzimática em espécies bacterianas. MRX004 (a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42380) foi caracterizada usando dois sistemas de teste API: Rapid ID 32A - Este sistema é pro- jetado especificamente para espécies anaeróbias e abrange testes pa- ra metabolismo de carboidratos, aminoácidos e nitrato, bem como ati- vidade de fosfatase alcalina; e API® 50 CH - Este sistema testa a fer- mentação de 49 fontes de carboidratos e pode ser utilizado em conjun- to com o meio API® CHL para análise de espécies anaeróbias.

[00345] O teste rápido ID 32A foi realizado em colônias bacterianas de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as bacté- rias foram cultivadas em ágar YCFA por 24 horas a 37°C em uma es- tação de trabalho anaeróbica. As colônias foram removidas das placas usando uma alça de inoculação estéril de 5 μl e ressuspensas em uma ampola de 2 ml de meio de suspensão API® até que uma densidade aproximadamente equivalente à do padrão McFarland nº 4 fosse al- cançada. Cinquenta e cinco microlitros de suspensão bacteriana foram adicionados a cada cúpula em uma tira Rapid ID 32A, e o teste de urease foi coberto com duas gotas de óleo mineral. As tiras foram co- bertas com uma tampa de plástico e incubadas aerobicamente a 37°C por 4 horas, após o que a fileira inferior de cúpulas foi revelada usando os seguintes reagentes: NIT: 1 gota de NIT1 e NIT2; IND: 1 gota de reagente de James; todas as cúpulas restantes: 1 gota de reagente FastBlue. As tiras foram incubadas em temperatura ambiente por 5 minutos, após o que a cor de cada cúpula foi registrada e atribuída um valor de negativo, intermediário positivo ou positivo.

[00346] Os resultados da análise Rapid ID 32A são mostrados na Figura 4. MRX004 testou positivo para fermentação de várias fontes de carboidratos, nomeadamente α-galactosidase e β-galactosidase, α- glucosidase e β-glucosidase, α-arabinose, manose e rafinose, como bem como os aminoácidos arginina, prolina, fenilalanina, leucina, tiro- sina, glicina e histidina.

[00347] A análise comparativa rápida ID 32A foi realizada entre MRX004 e quatro cepas do tipo B. breve, que são anotadas na Figura 4B como Bif Ref 1 (DSM 20091), Bif Ref 2 (DSM 20213), Bif Ref 6 (JCM 7017) e Bif Ref 7 (UCC2003). Esta análise demonstrou que MRX004 foi a única cepa testada para fermentar o polissacarídeo rafi- nose, o que pode ser significativo, porque a rafinose está envolvida na produção de componentes bacterianos, como exopolissacarídeos, e a fermentação de rafinose também pode supostamente conferir efeitos no hospedeiro, como aumento cecal butirato, aumento da proliferação gastrointestinal e perda de peso.

[00348] O teste API® 50 CH foi realizado para examinar mais deta- lhadamente o metabolismo de carboidratos no MRX004. De acordo com as instruções do fabricante, as bactérias foram cultivadas em 10 ml de caldo YCFA por 16-18 horas a 37°C em uma estação de traba- lho anaeróbica. Esta cultura foi diluída em 10 ml de meio API® CHL de modo a atingir uma densidade aproximadamente equivalente ao pa- drão McFarland nº 2, e 110 μl desta mistura foram usados para inocu- lar cada cúpula em um conjunto de tiras de teste API® 50 CH. As tiras de teste foram incubadas em uma caixa de incubação umidificada a 37°C em uma estação de trabalho anaeróbica por 48 horas, após o que a cor de cada cúpula foi registrada e atribuída um valor de negati- vo, intermediário positivo, positivo ou duvidoso.

[00349] Usando API® 50, MRX004 testou positivo para a utilização das seguintes fontes de carboidratos: amidon (amido), amigdalina, ar- butina, celobiose, esculina, galactose, gentiobiose, glicose, glicogênio, frutose, fucose, lactose, maltose, manose, manitol, melibiose, melezi- tose, metil α-D-glucopiranosídeo, N-acetilglucosamina, ribose, sacaro- se (sacarose), salicina, sorbitol, trealose, turanose e xilitol (Figura 5). Esses resultados se correlacionaram com aqueles obtidos para o teste Rapid ID 32A em que MRX004 demonstrou fermentação de galactose, glicose, manose e rafinose em ambos os sistemas de teste. Exemplo 5 - Anexo a células humanas em meio YCFA Sumário

[00350] O nível de ligação da cepa MRX004 e uma série de outras cepas de Bifidobacterium breve às células humanas foi determinado em 3 pontos de tempo distintos em meio YCFA. As bactérias aderidas às células humanas foram ressuspensas em meio e a densidade ópti- ca do meio foi então analisada - quanto maior a densidade óptica, maior o número de células bacterianas e, portanto, maior o nível de ligação das células bacterianas às humanas células. A cepa MRX004 foi encontrada para exibir ligação reduzida a células humanas em comparação com as cepas de referência Bifidobacterium breve.

Resultados e análises

[00351] Os resultados do experimento são mostrados na figura 6.

[00352] Conforme mostrado na Figura 6, as cepas de Bifidobacte- rium breve de referência mostram um alto nível de ligação a células humanas em todos os pontos de tempo. Por outro lado, a cepa MRX004 tem um nível drasticamente reduzido de ligação às células humanas. Portanto, a baixa aderência às células humanas da cepa MRX004 pode aumentar o efeito benéfico das composições da inven- ção no sistema imunológico. Exemplo 6 - Teste de estabilidade

[00353] Uma composição descrita neste documento contendo pelo menos uma cepa bacteriana descrita neste documento é armazenada em um recipiente selado a 25°C ou 4°C e o recipiente é colocado em uma atmosfera com 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% de umidade relativa. Após 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da cepa bacteriana deve permanecer medida em unidades formadoras de colônias determinadas por protocolos padrão. Exemplo 7 - atividade antimicrobiana Introdução

[00354] O objetivo deste experimento foi testar o potencial de ativi- dade antimicrobiana de várias cepas de B. breve derivadas de bebês humanos contra várias cepas indicadoras e avaliar se elas produzem bacteriocinas in vitro. Métodos

[00355] Um painel de cepas foi escolhido como cepas indicadoras (Tabela 5), que incluíam bactérias Gram-positivas, outras Gram- positivas e Gram-negativas intimamente relacionadas que foram previ- amente mostradas como inibidas por espécies de Bifidobacterium [Erro! Indicador não definido.].

Ensaio de cocultura

[00356] As cepas foram cultivadas por 16 h a 37°C (30°C para B. subtilis) sob condições anaeróbicas (condições aeróbicas para E. coli, B. subtilis e S. aureus) do Research Cell Bank (para B. breve teste e referência cepas) ou de estoques de grânulos (para as cepas indicado- ras). Um gramado de cepa indicadora foi feito em uma placa YCFA (E&O Labs, Reino Unido), deixado para secar e 10 μl da cultura de cepa de teste foram manchados no superior do gramado. As placas foram incubadas por 48 h a 37°C em condições anaeróbias (24 h a 37°C em condições anaeróbias seguidas por 24 h a 37°C em condi- ções aeróbias para E. coli, B. subtilis e S. aureus). Cada ensaio foi realizado em triplicado (exceto em duplicado para Bacillus subtilis NCIMB8045 com MRx0004, Teste 1, Teste 2, Teste 3, Teste 4, Teste 5, Teste 6, Teste 7 e Teste 8, e para Bifidobacterium breve DSM20213, Lactobacillus plantarum NCIMB8826, Clostridium sporo- genes ATCC3584 e Staphylococcus aureus NCIMB9518 com todas as cepas de B. breve).

[00357] A atividade antimicrobiana foi avaliada medindo a largura da zona de inibição observada, uma zona clara em torno do local da cepa de teste (Figura 22). Um escore entre 0 e 3 foi dada a cada cepa para cada réplica biológica. Sobrenadante de cultura

[00358] O método de difusão em ágar foi utilizado para testar o po- tencial antimicrobiano dos sobrenadantes de cultura. Em resumo, 100 μl de sobrenadante filtrado livre de células foram colocados em ágar YCFA, pré-inoculado com um gramado de uma cepa indicadora (como descrito acima), em um poço perfurado no ágar. A placa foi deixada em repouso por 1 h para permitir a difusão e foi então incubada por 48 h a 37°C em condições anaeróbias (condições aeróbias para E. coli, B. subtilis e S. aureus). Três réplicas biológicas foram executadas.

Resultados Cocultura

[00359] A maioria das cepas de B. breve testadas exibiu atividade de antagonismo contra E. coli, K. pneumoniae, S. Typhimurium e B. subtilis (Tabela 6). B. breve DSM 20091 foi a única cepa testada que inibiu o crescimento de B. breve DSM20213. MRx0004 e outras cepas de B. breve de teste exibiram atividade antimicrobiana contra E. coli, K. pneumoniae, S. Typhimurium e B. subtilis (Tabela 6), com inibição geral mais alta observada do que com as manchas de referência de B. breve. MRx0004, Teste 1, Teste 2, Teste 3, Teste 7, Teste 8, Teste 11 e Teste 12 exibiram atividade antimicrobiana particularmente potente. Nenhuma atividade antagonista foi detectada contra S. aureus, C. spo- rogenes e L. plantarum nas condições testadas.

[00360] Esses dados indicam que MRX0004 e as cepas de teste relacionadas podem ser úteis para o tratamento de infecções bacteria- nas. Sobrenadante de cultura

[00361] A atividade antimicrobiana de sobrenadantes livres de célu- las foi testada contra o mesmo painel de cepas indicadoras. Nenhuma inibição foi observada para todas as cepas de B. breve testadas contra qualquer uma das cepas indicadoras (dados não mostrados, n = 3). Isso sugere que a inibição observada nos ensaios de cocultura não foi devido à secreção de moléculas antimicrobianas. Exemplo 8 - Caracterização adicional da atividade enzimática

[00362] O sistema de teste API 32A descrito no Exemplo 4 foi usa- do para caracterizar as cepas B. breve testadas no Exemplo 7. O teste rápido ID 32A foi realizado em colônias bacterianas de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as bactérias foram cultiva- das em ágar YCFA por 24 horas a 37°C em uma estação de trabalho anaeróbica. As colônias foram removidas das placas usando uma alça de inoculação estéril de 5 μl e ressuspensas em uma ampola de 2 ml de meio de suspensão API® até que uma densidade aproximadamen- te equivalente à do padrão McFarland nº 4 fosse alcançada. Cinquenta e cinco microlitros de suspensão bacteriana foram adicionados a cada cúpula em uma tira Rapid ID 32A, e o teste de urease foi coberto com duas gotas de óleo mineral. As tiras foram cobertas com uma tampa de plástico e incubadas aerobicamente a 37°C por 4 horas, após o que a fileira inferior de cúpulas foi revelada usando os seguintes reagentes: NIT: 1 gota de NIT1 e NIT2; IND: 1 gota de reagente de James; todas as cúpulas restantes: 1 gota de reagente FastBlue. As tiras foram in- cubadas em temperatura ambiente por 5 minutos, após o que a cor de cada cúpula foi registrada e atribuída um valor de negativo, intermediá- rio positivo ou positivo.

[00363] Os resultados da análise Rapid ID 32A são mostrados na Figura 23. Como encontrado no Exemplo 4, MRX004 testou positivo para fermentação de várias fontes de carboidratos, nomeadamente α- galactosidase e β-galactosidase, α-glucosidase e β-glucosidase, α- arabinose, manose e rafinose, bem como os aminoácidos arginina, prolina, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina e histidina.

[00364] A análise rápida ID 32A também foi realizada nas outras cepas de teste B. breve (Teste 1 - Teste 12) e nas cepas de referência B. breve (DSM 20091, DSM 20213, JCM 7017 e NCIMB 8807/UCC2003) que foram estudadas no Exemplo 7. As cepas de tes- te geralmente mostraram maior atividade antimicrobiana do que as ce- pas de referência e mostraram padrões de metabolismo similares a MRX004.

[00365] Curiosamente, MRX004 e as cepas de teste fermentam o polissacarídeo rafinose, enquanto as quatro cepas de referência não. Como observado acima, a rafinose está envolvida na produção de componentes bacterianos, como exopolissacarídeos.

[00366] Além disso, MRX004 e Teste 3 têm atividade antimicrobia- na potente e ambos exibem fermentação intermediária de β- glucosidase e α-arabinose.

[00367] MRX004 e Teste 2 têm atividade antimicrobiana potente e nenhum exibe fermentação positiva de N-acetil-β-glucosaminidase.

[00368] O MRX004 e o Teste 8 têm atividade antimicrobiana poten- te e ambos exibem fermentação intermediária de α-galactosidase e α- arabinose.

[00369] O Teste 11 e o Teste 12 têm atividade antimicrobiana po- tente e ambos fermentam a serina arilamidase, mas não a leucilglicina arilamidase e nem a alanina arilamidase.

[00370] O Teste 3 e o Teste 7 têm atividade antimicrobiana potente e ambos exibem fermentação intermediária de serina arilamidase. Exemplo 9 - Eletroforese em Gel de Campo Pulsado

[00371] Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) foi usada para caracterizar as cepas de B. breve testadas no Exemplo 7. Os re- sultados são mostrados na Figura 24. As cepas B. breve de teste, que exibiram maior atividade antimicrobiana do que as cepas B. breve de referência, foram agrupadas com padrões similares e podem ser dis- tinguidas das cepas de referência. Exemplo 10 - Eletroforese em Gel de Campo Pulsado

[00372] Um outro estudo de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) foi realizado em MRx004 e as cepas de B.breve de referência. O PFGE é rotineiramente aplicado como "padrão ouro" para tipagem de cepas em laboratórios clínicos [100] e foi relatado como um método eficaz para discriminar isolados de Bifidobacterium fecais humanos

[101]. De fato, muitos estudos exploraram as relações de isolados de Bifidobacterium usando análise de impressão digital de fragmentos de DNA genômico resolvidos por PFGE, digeridos com enzimas de restri- ção XbaI ou SpeI [102,103]. SpeI provou ser particularmente útil no perfil de plasmídeo e na genotipagem intraespecífica de Bifidobacte- rium breve [104,105]. Preparações de tampões PFGE

[00373] Os tampões de gel de agarose de DNA de alto peso mole- cular para PFGE foram preparados de acordo com um protocolo publi- cado [106]. Restrição de tampões PFGE

[00374] Fatias individuais (2 mm x 2 mm) foram lavadas três vezes durante 15 min em 1 ml de Tris.Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM (pH 8,0) à temperatura ambiente. Cada fatia foi pré-incubada com 250 μl de tam- pão de restrição recomendado para a enzima por 30 min a 4°C e então substituída por 250 μl de tampão fresco contendo 20 unidades da en- zima de restrição SmaI. As digestões de restrição foram realizadas du- rante a noite a 25oC, conforme recomendado pelo fornecedor (New England Biolabs (UK) Ltd).

PFGE

[00375] Os tampões tratados (enzima de restrição) e não tratados de DNA genômico (gDNA) foram examinados nas seguintes condi- ções. A escada λ foi aquecida a 45C antes de carregá-la no gel. As condições de operação foram 6,0 V/cm a 14°C por 20 h com tempos de pulso aumentados de 1 a 20 s em 0,5 × tampão TBE. Uma escada de DNA lambda (Bio-Rad) foi usada como marcador de tamanho. Os tampões foram colocados em poços de géis de agarose 1,0% (Bio- Rad) feitos com 0,5xTBE (Tris-borato 1 M, EDTA 0,5 M, pH 8,5), sela- dos com a mesma agarose. Fragmentos de DNA foram resolvidos em 0,5 × tampão de corrida TBE mantido a 14°C usando um sistema de campo pulsado CHEF-DR III (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a 6 V/cm por 18 h. Foram selecionados tempos de pulso com rampa line- ar. Um tempo de pulso linear em rampa de 1s-15s foi usado para a separação dos fragmentos. Os géis foram corados em água destilada contendo 0,5 μg/ml de brometo de etídio por 120 min em condições de luz limitada. Análise de padrão de bandas PFGE

[00376] Os padrões de bandas foram avaliados manualmente usando as diretrizes descritas por [107]. A imagem PFGE foi proces- sada em BioNumerics 7.6 (Applied Maths) para gerar uma impressão digital de banda para cada cepa. A análise de agrupamento nas im- pressões digitais foi realizada usando o coeficiente de similaridade de Jaccard (recomendado para análise do tipo de impressão digital) e o método de grupo de pares não ponderados com média aritmética (UPGMA). Resultados

[00377] A digestão do DNA e as condições eletroforéticas usadas neste estudo demonstraram ser eficazes para subtipagem de espécies de B. breve [104] e foram encontrados para fornecer resolução sufici- ente (mais de 10 bandas observáveis) para distinguir cepas de B. bre- ve em um nível de subespécie. Os fragmentos de restrição de 4/5 ce- pas eram distintos e bem resolvidos (Figura 25). A análise de agrupa- mento (Figura 26) sugere que o genótipo da cepa MRx0004 está mais intimamente relacionado ao de B. breve REF7 do que as outras cepas de B. breve analisadas neste estudo. Exemplo 11 - Diferenciação de células T

[00378] A capacidade de MRx0004 para induzir a diferenciação de células T foi explorada in vitro em células mononucleares de sangue periférico (PBMCs, Stemcell, Cat: 70025). Resumidamente, PBMCs foram plaqueados em placas de 96 poços com anti-CD3 (Ebioscience, anticorpo monoclonal CD3 (clone OKT3), grau funcional, cat. N°. 16- 0037-81) a 400.000/poço em 50 µl de meio cRPMI por poço (cRPMI contém RPMI 1640 (+L-Glut, 21875-034) 2mM conc. final Estoque 200mM.; 10% HI FBS (Gibco life technologies, 10082-147); 50 µm de mercaptoetanol (Gibco life technologies, 21985-023); e 1% cane- ta/estreptococo (P4333, 10 mg/ml). MRx0004 morto por calor (prepa- rado por incubação a 80°C por 30 minutos, após o que as culturas fo- ram lavadas com PBS e ressuspensas em meio de cultura de células apropriado e contagens viáveis foram confirmadas por plaqueamento) foi então adicionado a cada poço, 4.000.000 em 100 µl/poço. Após 3 dias em uma incubadora a 37°C, as células foram removidas e res- suspensas em um meio contendo PMA- (Sigma, Cat nº. P8139), Iono- micina (Sigma, Cat nº. I3909) e GolgiSTOP (BD, Cat nº. 554724) por 5 horas. O estoque de PMA foi de 1 mg/ml em DMSO que foi posterior- mente diluído em 100 ug/ml (cada amostra exigiu 50 ng/ml em cRPMI), o estoque de ionomicina foi de 1 mM em DMSO (foi usado 1 µM em cRPMI) e a concentração de GolgiStop foi usada a 4 µl/6 ml. Os so- brenadantes foram passados através de um filtro de 0,22 µm e diluídos apropriadamente em meio de cocultura.

[00379] As células foram então submetidas a uma coloração de ci- tometria de fluxo:

[00380] Após a lavagem, as células foram incubadas com corante de viabilidade (Corante Fixável Viobility 405/520 de Miltenyi biotec, 1 µl/amostra) + bloco Fc humano, cat. 564219 (1 µl/amostra) em PBS por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. Os anticorpos de superfície (2 µl de cada) foram então adicionados diretamente aos po- ços por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente - CD3-APC-Vio 770 (Miltenyi, cat. Nº. 130-113-136), CD4-VioBlue (Miltenyi, cat. Nº. 130-114-534) e CD25-VioBright FITC (Miltenyi, cat. Nº. 130-113-283). As células foram então lavadas duas vezes em PBS e centrifugadas a 300g/5min/TA.

[00381] O tampão de coloração do fator de transcrição eBioscience FoxP3 foi então usado para fixar e permeabilizar as células (cat. Nº. 00-5523). Seguindo o protocolo da eBioscience, um tampão de perm/fix foi preparado usando 1x concentrado e 3 diluente. As células foram fixadas por 1h à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas 2x em 1x lavagem Perm e centrifugadas a 300g/5min/TA. A seguinte coloração intracelular ou anticorpos de fator de transcrição foram adi- cionados às amostras em lavagem permanente (1x) por 45mis/escuro/RT ou na geladeira durante a noite (até 18h), seguido de lavagem dos anticorpos 2x usando lavagem Perm (300 µl) e ressus- pensão em PBS (250 µl) para adquirir no citômetro: Marcadores intracelulares Fatores de transcrição 2ul IL10-PE 5,5ul FoxP3-PE-Cy7 2ul IFNy-PE Vio770 9ul Tbet-APC 10ul IL17a-APC 9ul RoRyt-PE  Anticorpos humanos anti IFNy-PE Vio770 (Miltenyi, cat. Nº. 130-114- 025)  Anticorpos humanos anti IL10-PE (Miltenyi, cat. Nº. 130-112-728)  Anticorpos humanos anti IL17a-APC (Miltenyi, cat. Nº. 130-099-202)  Anticorpos humanos anti RoRyt-PE (Miltenyi, cat. Nº. 130-103-837)  Anticorpos humanos anti Tbet-APC (Miltenyi, cat. Nº. 130-098-655  Anticorpo monoclonal Foxp3 (236A / E7), Pe cy7 (ebiosciência) cat. Nº. 25-4777-41

[00382] Como pode ser visto nas Figuras 27 e 28, tanto o sobrena- dante de MRx0004 (SP 4) e MRx0004 morto por calor (HK 4) foram capazes de induzir a diferenciação de células T helper e células T cito- tóxicas, respectivamente, mesmo na ausência de citocinas para induzir diferenciação (sem cito).

Tabelas Tabela 1. Cepas, plasmídeos e primers usados para geração de cepas neste estudo Cepa Descrição Referência Cepas B. bre- ve MRx0004 B. breve isolado humano Este estudo MRx0004 MRx0004 pGTF mutante de in- Este estudo pGTF:: pORI19 serção MRx0004 MRx0004 pGTF mutante de in- Este estudo pGTF ::pORI19 serção abrigando o vetor pBC1.2 pBC1.2 vazio MRx0004 MRx0004 pGTF mutante de in- Este estudo pGTF::pORI19 serção complementado pGTF-pBC1.2

Cepas de E. coli X11 Blue Hospedeiro de clonagem, tetr Stratgene, La Jol- la, CA, EUA EC101 Host de clonagem, repA +kmr [108] EC101 Cepa de E. coli para metilação in Este estudo pWSK29-MRx- vitro por metilase MRx0004 Tipo M+S I

Plasmídeos pORI19 Vetor de expressão Lactocócica [108] ORI+ RepA- pWSK29 Ampr, plasmídeo de clonagem de [109] E.colicom número de cópias bai- xo pNZ8048 Cmr, fator de fusão translacional [110] induzível por nisina pAM5 pBC1-pUC19-Tcr [111]

Cepa Descrição Referência pPKCM pblueCm abrigando rep pCI- [112] BA089 pSKEM pblueEm abrigando rep pCI- [112] BA089 pNZEM Emr, nisina induzível Margolles, não publicado pDM1 Derivado de pAM5 contendo [113] cassete de resistência à especti- nomicina pDM2 Derivado de pDG7 contendo [113] cassete de resistência à especti- nomicina Primers Nome do Pri- Sequência (5'-3') Referência mer PWSK_MRxM CGTCCGTCTAGAATAAGGA- Este estudo +SFxbaI GGCACTCACCATGAATAAG- CAGCAGCTTGC (SEQ ID NO:2) PWSK_MRxM GCTCTACTCGAGGCGATA- Este estudo +SFxhoI TGAGGCGAGCTTCACG (SEQ ID NO:3) TetWconfirm CAGGCATTGAAGGAATCG Este estudo F2 (SEQ ID NO:4) TetWconfirm CTGGCTAAGCTTGTG- Este estudo F2 +MRx- CATGGGCTCAGTCCTTC (SEQ pGTF-comp ID NO:5) Tabela 2. Lista das 20 proteínas com os valores de correspondência de espectro de peptídeo mais alto (PSM) identificados em sobrenadan- tes de cultura de log MRx0004 tardio conforme identificado por na- noLC-MS/MS.

[00383] Esta tabela lista todas as proteínas com um valor de PSM ≥ 5 identificadas em três réplicas biológicas.

Anotação Valor PSM Catego- Localização MW pId normalizado a ria fun- prevista (kDa)d b (escore) c Média SD cional Pululanase 351,33 33,62 Carboi- E (9,98) 181,9 4,77 dratos Proteína da família 82,00 15,62 n.a. E (9,72) 33,5 8,18 NlpC/P60 Proteína da família 71,67 13.61 n.a. nd (3,33) 24,9 6,18 NlpC/P60 Provável proteína de 56,00 7,00 n.a. nd (3,33) 32,8 4,69 ligação de soluto do sistema transporta- dor ABC Proteína de divisão 56,00 4,36 Divisão CM (9,68) 63,4 5,39 celular FtsI celular e ciclo ce- lular Transportador ABC 54,67 4,16 Carboi- nd (3,33) 49,3 5,01 de açúcar múltiplo, dratos proteína de ligação ao substrato Xilulose-5-fosfato 45,33 7,02 n.a. nd (2,5) 92,3 5,26 fosfocetolase Proteína de ligação 38,67 2,08 Aminoá- CM (9,51) 35,2 5,17 ao substrato trans- cidos e portador ABC de deriva- metionina dos Proteína hipotética 35,67 8,33 n.a. nd (2,5) 34,6 7,47 Transaldolase 32,67 3,79 Carboi- C (7,5) 39,7 4,97 dratos Transportador ABC 30,00 6,08 Carboi- nd (3,33) 43.9 4,48 de malto- dratos se/maltodextrina Gliceraldeído-3- 30,00 3,61 Carboi- C (9,97) 37,8 5,44 fosfato desidroge- dratos nase dependente de

NAD Proteína hipotética 29,67 4.93 n.a. CW (9.21) 47,1 5,48

Anotação Valor PSM Catego- Localização MW pId normalizado a ria fun- prevista (kDa)d b (escore) c Média SD cional Proteína de ligação 26,67 1,15 n.a.

CW (9,2) 58,7 5,45 de soluto do sistema transportador ABC para peptídeos Transportador ABC 24,00 4,58 Trans- nd (5.13) 59.1 5.31 de ligação a dipeptí- porte de deo, componente de Mem- ligação a substrato brana periplasmático Proteína da família 21,00 1,00 n.a.

E (9,73) 24,5 6,30 NlpC/P60 Precursor FkpA de 20,00 2,65 Metabo- nd (5,15) 33,4 5,83 peptidil-prolil cis- lismo de trans isomerase do potássio tipo FKBP glicose-6-fosfato 18,67 3,21 Carboi- C (9,97) 62,9 4,97 isomerase dratos Transpeptidase- 18,00 2,65 Parede CM (10) 81,9 5,72 transglicosilase mul- Celular e timodular Cápsula Proteína Chaperona 17,67 3,21 Metabo- C (9,97) 66,9 4,87 DnaK lismo de proteí- nas a Valores de correspondência de espectro de peptídeo médio de 3 ré- plicas biológicas normalizadas para 1x 109 cfu e valores de desvio pa- drão correspondentes. b Distribuição da categoria do subsistema conforme anotado por RAST [114,115]. n.a. não atribuído. c Cellular localization as predicted using PSORTb v3.0 (Yu et al., 2010a). C: citoplasmático, CM: membrana citoplasmática, CW: parede celular, E: extracelular, nd: não determinado. d Parâmetros calculados pelo Proteome Discoverer (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). MW: peso molecular, pI: ponto isoelétrico.

Tabela 3. Lista das 20 principais proteínas com o valor de correspon- dência de espectro de peptídeo mais alto (PSM) identificado em apa- ras de células MRx0004 conforme identificado por nanoLC-MS/MS.

[00384] Esta tabela lista as 62 proteínas identificadas nas frações de proteína raspada e descartada MRx0004 e as 44 proteínas identifi- cadas exclusivamente na fração de proteína raspada MRx0004. As proteínas listadas foram detectadas em valor de PSM ≥ 5 e em três repetições biológicas. Anotação Proteínas depi- Proteínas des- Catego- Localização ladas cartadas ria fun- prevista (es- b core) c PSM SD PSM SD cional médio a médio a Pululanase 136,67 17,47 79,00 10,54 Carboi- E (9,98) dratos Policetídeo sin- 54,67 10,69 11,67 6,43 Não CM (9,78) tase do tipo I atribuído Xilulose-5-fosfato 49,67 2,89 52,00 9,17 Não n.a. (2,5) fosfocetolase atribuído Proteína de divi- 34,33 9,24 33,00 10,00 Divisão CM (9,68) são celular FtsI celular e ciclo ce- lular glicose-6-fosfato 32,33 2,31 30,33 5,86 Carboi- C (9,97) isomerase dratos Fator de alonga- 32,00 5,00 24,33 8,39 Metabo- C (9,97) mento de transla- lismo de ção Tu proteí- nas Transportador 32,00 7,94 18,67 5,13 Carboi- n.a. (3,33) ABC de malto- dratos se/maltodextrina, proteína peri- plasmática de li- gação ao substra- to MalE Glicogênio fosfo- 31,00 3,00 34,33 5,69 Carboi- C (7,5) rilase dratos

Anotação Proteínas depi- Proteínas des- Catego- Localização ladas cartadas ria fun- prevista (es- b core) c PSM SD PSM SD cional médio a médio a Transaldolase 31,00 2,65 33,33 2,08 Carboi- C (7,5) dratos Transportador 30,00 6,93 36,00 11,79 Carboi- n.a. (3,33) ABC de açúcar dratos múltiplo, proteína de ligação ao substrato Piruvato formato- 26,67 8,33 21,67 7,77 Carboi- C (9,97) liase dratos Proteína de liga- 26,00 0,00 12,67 2,89 Não CW (9,2) ção de soluto do atribuído sistema transpor- tador ABC para peptídeos Transcetolase 24,00 6,08 23,67 3,79 Carboi- C (7,5) dratos Proteína de liga- 23,33 2,52 22,33 4,04 Aminoá- CM (9,51) ção ao substrato cidos e transportador deriva- ABC de metionina dos Fator de alonga- 23,00 13,89 15,67 8,02 Metabo- C (9,97) mento de transla- lismo de ção G proteí- nas Polirribonucleotí- 22,67 5,03 12,33 5,69 Não C (9,97) deo nucleotidil- atribuído transferase Sistema PTS, 21,67 4,62 6,67 2,89 Não CM (10) componente IIB atribuído específico de be- ta-glicosídeo Precursor FkpA 21,33 5,86 7,67 3,06 Metabo- n.a. (5,15) de peptidil-prolil lismo de cis-trans isomera- potássio se do tipo FKBP

Anotação Proteínas depi- Proteínas des- Catego- Localização ladas cartadas ria fun- prevista (es- b core) c PSM SD PSM SD cional médio a médio a Proteína Chape- 21,00 6,24 10,00 3,61 Metabo- C (9,97) rona DnaK lismo de proteí- nas Provável proteína 20,33 4,04 19,67 2,08 Não n.a. (3,33) de ligação de so- atribuído luto do sistema transportador

ABC a O espectro médio do peptídeo corresponde aos valores de 3 réplicas biológicas e aos valores de desvio padrão correspondentes. n.d.: não detectado. b Distribuição da categoria do subsistema conforme anotado por RAST [116,114]. n.a. não atribuído. c Localização celular conforme previsto usando PSORTb v3.0 [117]. C: citoplasmático, CM: membrana citoplasmática, CW: parede celular, E: extracelular, n.a.: não atribuído. Tabela 4. Comparação das proteínas de interação do hospedeiro iden- tificadas nas frações proteicas raspadas das cepas MRx0004 e EPS- neg .

[00385] Esta tabela lista as proteínas selecionadas, identificadas por nanoLC-MS/MS nas frações da proteína rapada, em três repeti- ções biológicas e com um valor de PSM ≥ 5. Descrição MRx0004a EPSneg a Categoria Normalizado SD PSM norma- SD funcional b médio lizado médio

PSM Policetídeo sin- 28,04 4,47 57,06 2,17 n.a. tase do tipo I

Descrição MRx0004a EPSneg a Categoria Normalizado SD PSM norma- SD funcional b médio lizado médio

PSM Transaldolase 17,33 1,44 24,70 0,60 Carboidra- tos Transcetolase 14,18 2,50 25,40 0,60 Carboidra- tos Fator de alon- 13,23 1,64 26,10 4,55 Metabo- gamento de lismo de translação Tu proteínas Proteína Chape- 12,29 4,33 21,92 2,09 Metabo- rona DnaK lismo de proteínas Gliceraldeído-3- 11,97 3,32 16,35 1,59 Carboidra- fosfato desidro- tos genase depen- dente de NAD Proteína de cho- 11,66 6,29 13,92 2,17 Metabo- que térmico 60 lismo de acompanhante proteínas da família GroEL Enolase 5,04 3,04 8,70 1,59 Carboidra- tos Fosfoglicerato n.d. n.d. 5,22 1,04 Carboidra- mutase tos a Valores de correspondência de espectro de peptídeo médio, normali- zados por μg de proteína total, de 3 réplicas biológicas e valores de desvio padrão correspondentes (SD). n.d.: nenhum peptídeo detecta- do. b Distribuição da categoria do subsistema conforme anotado por RAST [116,114]. n.a. nenhuma subcategoria atribuída.

Tabela 5. Lista de cepas indicadoras usadas no Exemplo 7 Nome de cepa Coloração de Descrição Gram Escherichia coli ATCC Negativo Comensal do intestino 11775 humano Klebsiella pneumoniae Negativo Comensal do intestino NCIMB 10197 humano, patógeno pul- monar Salmonella Typhimuri- Negativo Comensal do intestino um NCIMB 10248 humano, patógeno opor- tunista Lactobacillus planta- Positivo Bactéria comensal do in- rum NCIMB 8826 testino humano intima- mente relacionada Clostridium sporoge- Positivo Onipresente comensal do nes ATCC 3584 intestino humano Bacillus subtilis NCIMB Positivo Comensal do intestino 8045 humano Staphylococcus aureus Positivo Comensal humano, pa- NCIMB 9518 tógeno oportunista Bifidobacterium breve Positivo Cepa do tipo B. breve DSM20213 Tabela 6. Atividade antimicrobiana de cepas B. breve de teste e refe- rência contra um painel de cepas indicadoras (n = 3) Cepa E. coli K.

S.

B. subti- B. breve S. au- C. spo- L. plan- ATCC pneu- Typhim lis DSM reus rogenes tarum * 11775 moniae urium NCIMB 20213 NCIBM ATCC NCIMB NCIMB NCIMB 8045 9518* 3584* 8826* 10197 10248 MRx0004 3 2 2 2* 0 0 0 0 * Teste 1 1 2 1 2 0 0 0 0 Teste 2 2 2 2 2* 0 0 0 0 * Teste 3 2 2 2 2 0 0 0 0 Teste 4 1 2 0 1* 0 0 0 0 * Teste 5 1 1 1 1 0 0 0 0 * Teste 6 1 1 1 1 0 0 0 0

Cepa E. coli K. S. B. subti- B. breve S. au- C. spo- L. plan- ATCC pneu- Typhim lis DSM reus rogenes tarum * 11775 moniae urium NCIMB 20213 NCIBM ATCC NCIMB NCIMB NCIMB 8045 9518* 3584* 8826* 10197 10248 Teste 7 2 2 2 1* 0 0 0 0 Teste 8 2 1 1 2* 0 0 0 0 Teste 9 1 1 1 1 0 0 0 0 Teste 10 1 1 1 1 0 0 0 0 Teste 11 2 2 2 2 0 0 0 0 Teste 12 2 2 2 2 0 0 0 0 B. breve 1 1 1 1 1 0 0 0 REF1 (DSM 20091) B. breve 1 1 0 1 0 0 0 0 REF2 (DSM 20213) B. breve 1 1 1 2 0 0 0 0 REF6 (JCM 7017) B. breve 0 0 0 2 0 0 0 0 REF7 (NCIMB 8807/ UCC2003) Exemplo 12 - MRx004 tem um efeito imunoestimulador no baço. Sumário

[00386] O objetivo deste estudo foi caracterizar as propriedades imunoestimulatórias in vitro do MRx0004 no baço. Materiais e métodos

[00387] Tratamentos: Não tratado, 10% YCFA e 10% Bifidobacte- rium breve cepa MRx0004. Preparação de esplenócitos

[00388] Os esplenócitos foram preparados de fresco do baço isola- do de camundongos fêmeas C57BL/6 entre 6 e 8 semanas de idade. Resumidamente, os esplenócitos foram semeados a 900.000 célu- las/poço em placas de 96 poços em RPMI 1640 com FBS a 10%, L- Glutamina 2 mM e penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml, 55 µM de β-mercaptoetanol, repouso ou estimula com 10 % de meio bac- teriano YCFA+ (mídia em branco) ou com 10% de sobrenadante bac- teriano livre de células de cultura MRx0518 estacionária e, em segui- da, incubado por 72h em uma incubadora de CO2 a 37°C. Em segui- da, os sobrenadantes livres de células foram coletados, centrifugados por 5 minutos a 500g a 4°C. As amostras foram então coletadas e ar- mazenadas a -80°C para análise de citocinas. Ensaio MTT

[00389] O kit de ensaio MTT foi adquirido na Merck Millipore (Cat n. CT01). Após 72h de incubação, 10µl de solução de MTT foram adicio- nados a cada poço, as células foram incubadas em incubadora de CO2 por 4h. Depois disso, 100 µl de solução de isopropanol/HCL 0,04 M foram adicionados a cada poço e a absorbância foi medida no com- primento de onda de 560 nm e um comprimento de onda de referência de 655 nm. Análise de Citocinas

[00390] A quantificação de citocinas foi conduzida usando um imu- noensaio multiplex ProcartaPlex de camundongo 26-plex seguindo as recomendações do fabricante (Thermo Fischer Scientific). Resumida- mente, 50 µl de sobrenadantes de cocultura livres de células foram usados para quantificação de citocinas usando um sistema MAGPIX® MILLIPLEX® (Merck) com o software xPONENT (Luminex, Austin, TX, EUA). Os dados foram analisados usando o software analista MILLI- PLEX® (Merck) usando uma curva logística de 5 parâmetros e subtra- ção de fundo para converter a intensidade média de fluorescência para valores pg/ml. Citometria de fluxo

[00391] As células foram primeiro coradas com o corante Viobility 405/520 Fixable (Miltenyi Biotec Ltd. Bergisch Gladbach, Alemanha) para discriminar entre células vivas e mortas por 10 min no escuro em temperatura ambiente. Eles foram então corados com um coquetel de anticorpos para CD3, CD4, CD8, e IFN-γ para determinar o fenótipo celular (anticorpos Miltenyi REA) e incubados por mais 10 min em temperatura ambiente. As células foram então lavadas e ressuspensas em PBS e imediatamente analisadas por meio de análise de citometria de fluxo. Os isotipos foram usados para todos os anticorpos durante o primeiro experimento para ajudar a definir as portas e os controles FMO foram incluídos em todos os experimentos. Todos os experimen- tos foram realizados usando um BD FACS Aria II com a porta de para- da para aquisição definida em 100.000 células na porta "Live" usando o software FACSDiva (BD Biosciences, Reading, UK). A análise foi conduzida usando o software Flowjo versão 10.4.2 (FlowJo LLC, Ore- gon, EUA) e foi baseada em células vivas identificadas com o corante de viabilidade. Resultados

[00392] A viabilidade dos esplenócitos após o tratamento foi avalia- da por meio do ensaio MTT, que mediu sua atividade metabólica. A Figura 29 mostra que os esplenócitos eram viáveis após o tratamento com MRx0004.

[00393] A Figura 30 mostra que o tratamento com MRx0004 levou a um aumento em uma variedade de citocinas pró-inflamatórias no baço, incluindo IL-6, IL-17a IL-22, TNF-α, RANTES, IFN-γ, CCL3, CCL4 e CXCL2. Esses dados indicam que o Bifidobacterium breve vivo tem um efeito estimulador no sistema imunológico. A capacidade de MRx0004 para ativar células T CD8+ e CD4+ para produzir IFNγ é mostrada na Figura 31.

[00394] Em combinação com os dados de PBMC discutidos nos Exemplos 2 e 11, estes dados suportam a capacidade de cepas bacte- rianas da espécie Bifidobacterium breve para estimular o sistema imu- nológico, ativando células T e aumentando o nível de citocinas pró-

inflamatórias, em vários tecidos. Sequências SEQ ID NO: 1 (sequência consenso de 16S rRNA para a cepa Bifido- bacterium breve depositada sob o número de acesso NCIMB 42380)

GGGACAGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGCGTGCTTAACACATGC AAGTCGAACGGGATCCATCGGGCTTTGCCTGGTGGTGAGAGTGG CGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATGCACCGGA ATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCATCACACC GCATGGTGTGTTGGGAAAGCCTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGC GTCCTATCAGCTTGATGGCGGGGTAACGGCCCACCATGGCTTCG ACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTG AGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT GCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAT GGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTGTTAGGGAGCAAGGCAC TTTGTGTTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGC CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTA TTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGA AAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGC TTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGA ATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCT GGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAAC AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTG GATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGT TAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAA AGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTA ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCC GACGATCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGG TGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATT GTGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGA AGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGC TTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACAGCGC GAGCTGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCA GTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCG AATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACAC CGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGC

CTAACCCCTGCGGGAGGGAGCCKC SEQ ID NO: 2-5 - consulte a Tabela 1

Claims (30)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve, para uso na estimulação do sistema imunológico em um sujeito.

2. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso no tratamento de uma doença de imunodeficiência em um sujeito.

3. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença de imunodeficiência é uma doença de imunodeficiência primária ou uma doença de imunodefici- ência secundária.

4. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a doença de imunodeficiência primária é selecionada entre

5. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a doença de imunodeficiência secundá- ria é selecionada entre AIDS, cânceres do sistema imunológico, como leucemia, doenças do complexo imunológico, como hepatite viral, mi- eloma múltiplo.

6. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso como um ad- juvante de vacina.

7. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso no tratamen- to, prevenção ou retardo da imunossenescência.

8. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso no aumento de uma terapia celular, tal como CAR-T.

9. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a composi-

ção é para uso no aumento do nível de expressão e/ou atividade de IL- 12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4, TNF-α e/ou IL-17α.

10. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a com- posição é para uso na estimulação de TLR2.

11. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a com- posição é para uso na estimulação de NFκB.

12. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana compreende um locus de exopolissacarídeo completo.

13. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana expressa pululanase.

14. Composição caracterizada pelo fato de que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium breve, em que é utilizada no tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana.

15. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso no trata- mento ou prevenção de uma infecção bacteriana gastrointestinal.

16. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a composição é para uso no tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana Gram-negativa.

17. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana tem uma sequência do gene de 16s rRNA que é pelo me- nos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou em que a cepa bacteriana tem uma sequência do gene de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO:1.

18. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana é capaz de fermentar rafinose.

19. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana é capaz de fermentar um ou mais, tais como 2, 3, 4, 5, 6 ou todas as 7 entre: α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase e β- glucosidase, α-arabinose, manose e rafinose.

20. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana é a cepa depositada sob o número de acesso 42380 em NCIMB.

21. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a com- posição é para administração oral.

22. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a com- posição compreende um ou mais excipientes ou veículos farmaceuti- camente aceitáveis.

23. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana é liofilizada.

24. Método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada com imunoestimulação reduzida, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição compreendendo uma cepa bacteriana da espécie Bifidobacterium bre- ve a um paciente em necessidade.

25. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de uma célula da cepa bacteriana como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, em que a célula expressa um ou mais antígenos heterólogos.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25, carac- terizada pelo fato de que a célula apresenta um ou mais antígenos he- terólogos.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizada pelo fato de que é utilizada como vacina.

28. Célula da cepa bacteriana, como definida em qualquer das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que a célula ex- pressa um ou mais antígenos heterólogos.

29. Célula, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a célula apresenta um ou mais antígenos heterólogos.

30. Célula, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, carac- terizada pelo fato de que é para uso como vacina.