KR20210046007A - 박테리아 균주를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역계를 자극하고 질환을 치료하고 예방하기 위한 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

박테리아 균주를 포함하는 조성물

본 발명은 포유류 소화관으로부터 단리된 박테리아 균주를 포함하는 조성물 및 질환의 치료에서의, 특히 질환의 치료에서 면역계를 자극하는 데 있어서의 이러한 조성물의 용도 분야에 대한 것이다.

인간 내장은 자궁내에서는 멸균상태인 것으로 여겨지지만, 출생 직후 매우 다양한 모체 및 환경 미생물에 노출된다. 이후, 미생물 집락 및 갱신의 동적 기간이 진행되며, 이는 출산 방식, 환경, 식이 및 숙주 유전형과 같은 요인에 의해 영향받고, 이들 모두가 장 미생물총의 조성에, 특히 초기 수명 동안 영향을 미친다. 이후, 미생물총이 안정화되고 성인과 유사해진다[1]. 인간 장 미생물총은 본질적으로 2개의 주요 박테리아 문에 속하는 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 퍼미쿠테스(Firmicutes)에 속하는 500~1000개를 초과하는 상이한 계통형을 포함한다[2]. 인간 장의 박테리아 집락으로부터 발생하는 성공적인 공생 관계는 매우 다양한 대사, 구조, 보호 및 다른 유익한 기능을 산출하였다. 집락화된 장의 증강된 대사 활성은 다른 경우 소화 불가능한 식이 성분이 부산물을 방출하며 분해되어 숙주에 대해 중요한 영양원을 제공할 것을 보장한다. 유사하게, 장 미생물총의 면역학적 중요성은 잘 인식되어 있으며 공생 박테리아의 도입 후 기능적으로 재구성되는 손상된 면역계를 갖는 무균 동물에서 예시된다[3-5].

염증성 대장 질환(IBD)과 같은 위장관 장애에서 미생물총 조성의 극적인 변화가 보고되었다. 예를 들어, IBD 환자에서는 클로스트리듐(Clostiridium) 클러스터 XIVa 박테리아의 수준이 감소되는 반면, 대장균의 수가 증가되어, 장 내 공생체 및 유해균 균형의 이동을 제시한다[6-9]. 흥미롭게도, 이러한 미생물 세균조성이상은 또한 T 효과기 세포 집단의 불균형과 연관된다.

특정 박테리아 균주가 동물 장에 대해 가질 수 있는 잠재적인 긍정적 효과를 인식하여, 다양한 균주가 다양한 질환의 치료에서의 사용하기 위해 제안되었다(예를 들어, [10~13] 참고). 또한, 대부분 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 균주를 포함하는, 예를 들어 항 염증 메커니즘을 통해 특정 균주가 내장과 직접 연관되지 않은 다양한 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서 사용하기 위해 제안되었다(리뷰를 위해 [14] 및 [15] 참고). 특정 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 베일로넬라(Veillonella) 균주, 그리고 더 적은 정도로, 엔테로코커스 및 박토바실러스 균주가 시험관내에서 상이한 사이토카인에 대해 다양한 효과를 가지며 면역조절 효과를 갖는 것으로 제시되었다[2]. 그러나, 상이한 질환 및 상이한 박테리아 균주 간 상관관계, 및 장에 대한 및 전신 수준에서의 그리고 임의의 특정 유형의 질환에 대한 특정 박테리아 균주의 정확한 효과는 잘 특성규명되어 있지 않다.

최근에, 다양한 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종은 항염증 특성에 대해 조사되었으며 여러 인간 시험은 비피도박테리아의 치료 특성이 특히 염증 및 자가면역 장애에 대해 실험실에서 클리닉으로 성공적으로 이전될 수 있음을 입증하였다. 예를 들어, 비. 롱검(B. longum) CECT 7347 및 비. 인판티스(B. infantis) NLS는 둘 다 셀리악병 환자에서 보호 효과를 도출하였다 [16, 17]). 연구는 또한 비피도박테리아가 장을 넘어 질환을 조절하는 능력을 입증하였다. 비. 롱검　BB536, 비. 인판티스　M-63, 및 비. 브리브(B. breve)　M-16V로 구성된 3-균주 제형은 어린이에서 알레르기성 비염 및 경증 간헐성 천식과 관련된 증상을 완화시켰다 [18]. 또한, 비. 롱검 35624를 궤양성 대장염, 건선, 및 만성 피로 증후군 환자에게 투여하면 3가지 질환 모두에서 C-반응성 단백질의 혈장 수준이 감소되었으며 [19], 이는 이 균주가 전신 면역을 조절할 수 있음을 시사한다.

비피도박테리움 브리브(Bifidobacterium breve) 종으로부터의 유기체는 예를 들어, [20] 및 [21]에서 리놀레산을 대사함으로써 면역 자극 보충제를 제조하는 데 사용하기 위해 제안되었다. 그러나, 이러한 유기체가 대상체에게 투여될 때 면역 자극 반응을 도출할 수 있다는 것을 시사하는 문서는 없다.

참고문헌 [22]는 베타-갈락토-올리고사카라이드 A 및 B를 포함하는 영양 조성물이 면역 자극 효과를 도출할 수 있음을 시사한다. 이러한 당을 포함하는 조성물이 비피도박테리움 브리브를 포함하는 다양한 다른 성분을 추가적으로 포함할 수 있음이 언급되지만, 비피도박테리움 브리브 유기체가 베타-갈락토-올리고사카라이드의 임의의 면역 자극 특성에 기여하거나 향상시킬 수 있음을 시사하지 않는다.

비피도박테리움 브리브 종으로부터의 유기체의 치료 용도는 [23]에 제안되어 있다. 그러나, 본원에 개시된 박테리아 균주가 면역 자극 효과를 가졌음을 시사하지 않는다.

경구 콜레라 백신의 면역원성에 대한 비피도박테리움 균주의 잠재적인 효과를 조사하는 연구는 [24]에 보고되었다. 그러나, 그 연구 결과는 결정적이지 않았으며; 시험된 균주는 잘 견디고 있지만, 명백한 백신접종후 면역 자극 효과를 나타내지 않았다는 것이 해당 논문에 보고되었다.

새로운 질환 치료 방법에 대한 필요성이 당분야에 존재한다. 또한 장 박테리아를 사용하는 새로운 치료법이 개발될 수 있도록 장 박테리아의 잠재적 효과가 특성규명될 필요성이 존재한다.

본 발명자들은 대상체에서 면역계를 자극하고 질환을 치료 및 예방하는 데 사용될 수 있는 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 새로운 조성물을 개발하였다. 본 발명자들은 비피도박테리움 브리브 종의 균주가 면역계를 강력하게 활성화시킬 수 있음을 식별하였다.

따라서 본 발명은 대상체에서 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한, 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명은 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역계를 자극하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 대상체에서 면역계를 자극하기 위한 약제의 제조를 위한 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 백신 보조제로서 사용하기 위한, 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 백신 보조제로서 사용하기 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 면역 노화를 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용하기 위한, 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 면역 노화를 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용하기 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 CAR-T와 같은 세포 요법을 향상시키는 데 사용하기 위한, 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 CAR-T와 같은 세포 요법을 향상시키는 데 사용하기 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 또한 면역계를 자극하는 데 특히 강력한 비피도박테리움 브리브의 균주를 특징으로 하고 이의 효능이 엑소폴리사카라이드(EPS)에 의해 매개될 수 있음을 식별하였다. 따라서 본 발명은 바람직하게는 대상체에서 면역계를 자극하기 위해, 완전한 EPS 유전자좌를 포함하고/하거나 표면에서 EPS를 발현하는 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 사용한다.

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 박테리아는 NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 실시예에 입증된 바와 같이, 질환의 치료 또는 예방에서 IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4 및/또는 TNF-α의 발현 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 질환의 치료 또는 예방에서 IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4 및/또는 TNF-α의 발현 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 사용하기 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 실시예에 입증된 바와 같이, 질환의 치료 또는 예방에서 IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4, TNF-α 및/또는 IL-17α의 발현 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 질환의 치료 또는 예방에서 IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4, TNF-α 및/또는 IL-17α의 발현 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 사용하기 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 TLR2를 자극하는 데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 TLR2를 자극하는 데 사용하기 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 NFκB를 자극하는 데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 NFκB를 자극하는 데 사용하기 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리아 균주는 풀루라나제를 발현하며, 이는 실시예에서 강력한 비.브리브 균주에 의해 고도로 발현되고 부착력에 수반될 수 있는 것으로 제시되어 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 대상체에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시예는 본 발명의 비. 브리브, 특히 비. 브리브 균주가 강력한 항미생물 활성을 가짐을 입증한다. 추가로, 본 발명은 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 대상체에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

바람직한 구현예에서, 감염은 위장관 감염이다. 바람직한 구현예에서, 감염은 그람-음성 박테리아 감염이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 이. 콜라이(E. coli) 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 에스. 엔테리카(S. enterica) 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 박테리아 감염의 치료에서 박테리아의 생존력을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 박테리아는 병원성 박테리아의 수준을 무증상 수준으로 회복시키거나 또는 대상체로부터 병원성 박테리아를 완전히 제거하여, 박테리아의 상승된 수준과 관련된 증상을 완화시키는 데 더하여, 박테리아 감염을 치료하는 데 사용될 수 있다.

실시예에서 시험된 비. 브리브 균주와 밀접하게 관련된 균주는 면역계를 자극하는 데 특히 효과적인 것으로 예상된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 박테리아 균주가 서열번호: 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나 또는 박테리아 균주가 서열번호: 1에 의해 나타낸 16s rRNA 유전자 서열을 갖는 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 본 발명의 균주의 경구 투여는 면역계를 자극하는 데 효과적일 수 있다. 또한, 경구 투여는 환자 및 의사에게 편리하고 장으로 전달 및/또는 장의 부분 또는 총 콜로니화를 허용한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동결건조된 박테리아 균주를 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 비피도박테리움 브리브 종의 동결건조된 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 동결건조는 박테리아의 전달을 허용하는 안정된 조성물을 제조하기 위한 효과적이고 편리한 기술이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 식품을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 식품을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 박테리아 균주를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명은 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 감소된 면역 자극과 관련된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

도 1: 유방암 - 종양 부피의 마우스 모델.
도 2: 폐암 - 종양 부피의 마우스 모델.
도 3: 간암 - 간 중량의 마우스 모델.
도 4: MRX004 단독(A) 및 비. 브리브 유형 균주와 비교(B)한 Rapid ID 32 A 프로파일. 흰색 = 음성 반응(색상 변화 없음), 하향식 사선 = 중간 양성 반응(약한 색상 변화) 및 검정색 = 양성 반응(강한 적절한 색상 변화).
도 5: MRX004의 API® 50 CH 분석. 상향식 사선 = 음성 반응(색상 변화 없음), 하향식 사선 = 중간 양성 반응(약한 색상 변화), 검정색 = 양성 반응(강한 적절한 색상 변화) 및 흰색 = 의심스러운 반응(예기치 않은 색상 변화).
도 6: 인간 세포에 MRX004 및 비. 브리브 유형 균주의 부착.
도 7: MRx0004 처리에 의한 NFκB 및 TLR2의 자극. THP-1-NFκB(A) 및 HEK-TLR2(B) 리포터 세포주를 살아있는 MRx0004(MRx0004_LV), MRx0004 배양 상청액(MRx0004_SN) 및 열-불활성화 MRx0004(MRx0004_HK)의 처리로 MOI 100:1로 22 시간 동안 처리하였다. 데이터는 3 개의 생물학적 반복실험을 나타낸다. 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. 통계적으로 유의한 차이는 * p < 0.05, *** p < 0.001 및 **** p < 0.0001로 제시된다.
도 8: 시험관내 및 IEC와 반응한 MRx0004의 전사 반응. 10 개의 MRx0004 유전자의 발현을 분석하고 후기 대수기 성장에서의 배양 및 IEC와 접촉(3 시간) 후 배양 사이를 비교하였다. 데이터는 명명된 조건 사이에서 계산되고 groEL로 정규화된 배수 변화(2^-ΔΔCt) 값으로 제시되고, 3 개의 독립적인 생물학적 반복실험을 나타낸다. 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
도 9: MRx0004 및 관련된 균주의 EPS 유전자좌 내의 서열 다양성
도 10: MRx0004의 EPS-음성 유도체 균주의 표현형 특성. 투과 전자 현미경(TEM)을 MRx0004(A) 및 이의 EPS-음성 균주(EPS^neg)(B)에 대해 수행하였다. (C) IEC에 대한 박테리아 부착력을 HT29-MTX 세포 및 박테리아 균주를 MOI 100:1로 3 시간 동안 공-배양한 후 분석하였다. 제시된 데이터는 초기 접종물로부터 부착 CFU의 백분율에 대한 3 개의 생물학적 반복실험의 평균이다. 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01.
도 11: MRx0004 표면 단백질 검출에 대한 EPS 고갈의 영향. (A) MRx0004 떼낸(shaved) 및 탈락된(shed) 단백질 분획, (B) EPS^neg 떼낸 및 탈락된 단백질 분획 및 (C) MRx0004 및 EPS^neg 떼낸 단백질 분획에서 식별된 단백질의 수를 나타내는 벤 다이어그램.
도 12. MRx0004에 의한 면역조절에서 EPS의 역할 설명. 살아있는 처리(_LV) 및 배양 상청액(_SN)을 HEK-TLR2 리포터 세포(a) 및 THP-1-NFκB 리포터 세포(b)에 100:1의 MOI로 첨가하고, 22 시간 동안 배양하였다. MRx0004_LV 및 MRx0004_SN에 대해 제시된 데이터는 이전에 도 7에 제시되었다. 데이터는 3 개의 독립적인 반복실험을 나타낸다. (c) HT29-MTX 세포를 살아있는 박테리아와 3 시간 동안 공-배양한 후, TNFα를 10 ng/ml의 농도로 24 시간 동안 도입하였다. IL-8 수준을 ELISA를 사용하여 공-배양 상청액에서 분석하였다. 데이터는 5 개의 생물학적 반복실험을 나타낸다. 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
도 13: 유세포 분석에 의한 면역 세포 아집단의 식별. 6 명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 다음 처리 중 하나로 72 시간 동안 배양하였다; RPMI 배지 단독, MRx0004_HK, 또는 EPS^neg _HK. 상자 및 수염 플롯은 수직 수염에 의해 나타낸 최소 및 최대로 제시되어 있다. 세포 활성화 마커 CD25의 발현은 CD8⁺ 및 CD4⁺ 세포의 백분율로 제시되어 있다(A-B). Treg(CD25⁺(높음)/CD127^-(낮음))는 CD4⁺ 세포의 백분율로 제시된다(C). 독립적인 Treg/CD8⁺ 비를 각각의 공여자(D) 및 CD3^- 세포의 백분율로 B-세포(CD19⁺)(E)로부터 계산하였고 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 이어서 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. *p < 0.05, **p < 0.01***p < 0.001****p < 0.0001.
도 14: 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 의해 생성된 사이토카인 프로파일. 세포를 다음 처리 중 하나로 72 시간 동안 배양하였다; RPMI 배지 단독, MRx0004_HK, 또는 EPS^neg _HK. 상자 및 수염 플롯은 수직 수염에 의해 나타낸 최소 및 최대로 제시되어 있다. PBMC는 6 명의 건강한 공여자로부터 수득하였고 사이토카인 농도는 멀티플렉스 검정을 사용하여 결정하였다(A-G). 독립적인 IL-12p70/IL-4, IL-10/IL1p70 및 IL-1β/IL12p70 비를 각각의 공여자로부터 계산하였고(H-J) 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 이어서 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. *p < 0.05, **p < 0.01***p < 0.001****p < 0.0001.
도 15: MRx0004 떼낸 및 탈락된 단백질 분획(표 2에 나열)에서 식별된 단백질의 수를 나타내는, InteractiVenn으로 생성된 벤 다이어그램.
도 16: (a) 삽입 돌연변이유발에 의한 MRx0004의 EPS 음성 균주 생성. (b) MRx0004 및 이의 유도체 균주 EPS^neg, EPS^vec 및 EPS^comp의 자가응집.
도 17: MRx0004SN 및 EPSnegSN에서 식별된 단백질 수를 비교하는 벤 다이어그램.
도 18: 7 가지 색상 패널 유세포 분석 실험을 위해 사용되는 게이팅 전략. 획득 임계값을 살아있는 세포 집단을 사용하여 1 x 10⁵ 이벤트로 설정하였다. 처리되지 않은 샘플로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 대표적인 유사 색상 플롯이 제시되어 있다. 게이트를 FloJo에서 이소형 대조군 및 FMO를 사용하여 설정하였다. 이중항 집단을 게이팅하고 죽은 세포를 제외하기 위해 생존력 염료를 활용하기 전에 전방 및 측면 산란을 사용하여 림프구를 식별하였다. CD3^- 세포를 CD19로 서브게이팅하여 B-세포를 식별하였지만, CD3⁺ 세포 집단을 사용하여 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포를 둘 다 추가로 구별하였다. 그 다음에 CD25를 사용하여 활성화된 세포의 백분율을 확인하였으며 CD4⁺ 집단의 경우 또한 CD127과 함께 사용하여 Treg(CD25⁺/CD127^-)를 식별하였다.
도 19: 유세포 분석에 의한 면역 세포 아집단의 식별. 6 명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 다음 처리 중 하나로 72 시간 동안 배양하였다; RPMI 배지 단독, MRx0004_HK, 또는 EPS^neg _HK. 상자 및 수염 플롯은 수직 수염에 의해 나타낸 최소 및 최대로 제시되어 있다. CD8⁺ 및 CD4⁺ 세포는 CD3⁺의 백분율(A-B)로 제시되어 있고 활성화된 B-세포는 CD19⁺의 백분율(C)로 제시되어 있다. 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 이어서 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. *p < 0.05, **p < 0.01***p < 0.001****p < 0.0001.
도 20: 유세포 분석에 의한 면역 세포 아집단의 식별. 6 명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 다음 처리 중 하나로 72 시간 동안 배양하였다; MRx0004_HK, EPS^neg _HK, EPS^vec _HK 또는 EPS^comp _HK. 산점도는 수직 막대에 의해 나타낸 표준 편차로 제시되어 있다. CD8⁺ 및 CD4⁺ 세포의 발현은 CD3⁺ 세포의 백분율로 제시되어 있다(A,C). 세포 활성화 마커 CD25의 발현은 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포의 백분율로 제시되어 있다(B,D). Treg(CD25⁺(높음)/CD127^-(낮음))는 CD4⁺ 세포의 백분율(E), B-세포(CD19⁺)는 CD3^- 세포의 백분율(F), 활성화된 B-세포는 CD19⁺의 백분율(G)로 제시되어 있다. 독립적인 Treg/CD8⁺ 비를 각각의 공여자로부터 계산하였고(H) 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 이어서 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. *p < 0.05, **p < 0.01***p < 0.001****p < 0.0001.
도 21: 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 의해 생성된 사이토카인 프로파일. 세포를 다음 처리 중 하나로 72 시간 동안 배양하였다; MRx0004_HK, EPS^neg _HK, EPS^vec _HK 또는 EPS^comp _HK. 상자 및 수염 플롯은 수직 수염에 의해 나타낸 최소 및 최대로 제시되어 있다. PBMC를 6 명의 건강한 공여자로부터 수득하였고 사이토카인 농도를 멀티플렉스 검정을 사용하여 결정하였다(A-G). 독립적인 IL-12p70/IL-4, IL-10/IL1p70 및 IL-1β/IL12p70 비를 각각의 공여자로부터 계산하였다(H-J). 통계 분석은 일반적인 일원 ANOVA 이어서 Tukey 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. *p < 0.05, **p < 0.01***p < 0.001****p < 0.0001.
도 22: 공-배양 항미생물 플레이트 검정의 예. 기준 균주, 시험 균주 및 억제 구역이 제시되어 있다.
도 23: 시험 및 참조 비. 브리브 균주에 대한 API 32A 시험 결과. 흰색 = 음성 반응(색상 변화 없음), 별표 = 중간 양성 반응(약한 색상 변화) 및 검정색 = 양성 반응(강한 적절한 색상 변화).
도 24: 시험 및 참조 비. 브리브 균주에 대한 PFGE SpeI 소화.
도 25: SpeI 소화된 1% PFGE 겔을 0.5% TBE, 18 시간, 6 V/cm, 1-15 초 ST로 실행한다. 검은색 화살표는 DNA 크기 표준을 나타낸다. 레인 1 및 2는 동일한 겔의 상이한 부분에서 나온 레인 3-7로 그룹화되었다. 레인 1 = λ, 레인 2 = MRx0004, 레인 3 = 비. 브리브 REF 7, 레인 4 = 비. 브리브 REF6, 레인 5 = 비. 브리브 REF1, 레인 6 = 비. 브리브 REF2, 레인 7 = λ
도 26: 본 연구에 포함된 비. 브리브의 PFGE 패턴을 기반으로 한 UPGMA 계통도(A). PFGE 밴딩 패턴에서 생성된 유사성 매트릭스는 패널 B에 나타낸다.
도 27: 사이토카인의 첨가 없이(no cyto), 열-사멸된 MRx0004(HK 4), MRx0004 배양물로부터의 상청액(SP 4) 또는 RPMI 배지를 사용하여 T-헬퍼 세포 집단에서 T-세포 분화 유도. **= p≤0.01.
도 28: 사이토카인의 첨가 없이(no cyto), 열-사멸된 MRx0004(HK 4), MRx0004 배양물로부터의 상청액(SP 4) 또는 RPMI 배지를 사용하여 세포독성 T 림프구(CTL)의 집단에서 T-세포 분화 유도. * = p≤ 0.05; ***= p≤ 0.001; ****= p≤ 0.0001.
도 29: 비장세포의 생존력.
도 30: MRx004로 처리 후 비장세포에 의해 생성된 사이토카인 프로파일.
도 31: CD8+IFNγ+ 및 CD4+IFNγ+ 세포의 빈도 및 비장에서 세포 당 IFNγ 생성.

박테리아 균주

본 발명의 조성물은 비피도박테리움 브리브 종의 균주를 포함한다. 실시예는 이러한 박테리아 균주가 면역계를 자극하는 데 유용함을 입증한다. 본 발명의 바람직한 박테리아 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아이다.

수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 비피도박테리움 브리브 박테리아를 실시예에서 시험하였으며 또한 본원에서 균주 751, MRX004 또는 MRx0004로 지칭된다. 시험된 MRX004 균주에 대한 부분적 16S rRNA 서열은 서열번호: 1에 제공되어 있다. 비피도박테리움 브리브 균주 MRX004는 2015년 3월 12일에 식별 참조 751 하에 GT Biologics Ltd.(스코틀랜드 AB25 2ZS 애버딘 라이프 사이언시스 이노베이션 빌딩 소재)에 의해 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd.(스코틀랜드 AB21 9YA 애버든 벅스번 크레입스톤 이스테이트 퍼거슨 빌딩 소재)에 기탁되었으며 수탁 번호 NCIMB 42380으로 할당되었다. GT Biologics Ltd.는 그 뒤에 이름을 4D Pharma Research Limited로 변경하였다. 이러한 기탁은 WO2016/203223에 공개되었다.

균주 NCIMB 42380에 대한 게놈 서열은 WO2016/203223의 서열번호: 2에 제공되어 있다.

실시예에서 시험된 균주와 밀접하게 관련된 박테리아 균주는 또한 면역계를 자극하는 데 효과적인 것으로 예상된다. 특정 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열번호: 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 박테리아 균주는 서열번호: 1에 의해 나타낸 16s rRNA 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 박테리아 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 비피도박테리움 브리브 균주이다.

특정 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2016/203223의 서열번호: 2와 서열 동일성을 갖는 게놈을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 적어도 60%(예를 들어 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 90% 서열 동일성(예를 들어 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 게놈을 갖는다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 70%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 80%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 90%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 100%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 70%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 80%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 90%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 100%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 70%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 80%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 90%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2016/203223의 서열번호: 2의 100%에 걸쳐 WO2016/203223의 서열번호: 2와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 게놈을 가질 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 살아있는 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 활성 상태, 바람직하게는 동결건조된 살아있는 박테리아를 포함한다. 실시예는 살아있는 박테리아의 투여가 열 사멸된 박테리아 또는 상청액보다 더 효과적임을 입증한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 HEK-TLR2 리포터 검정에서 TLR2를 활성화시킨다. 추가 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 TLR4, TLR5 또는 TLR9를 활성화시키지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TLR2를 활성화시키고 백신 보조제로서 사용하기 위한 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TLR2를 활성화시키고 세포 요법을 향상시키는 데 사용하기 위한 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TLR2를 활성화시키고 면역 노화를 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용하기 위한 박테리아를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 THP-1-NFκB 리포터 검정에서 NFκB를 활성화시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NFκB를 활성화시키고 백신 보조제로서 사용하기 위한 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NFκB를 활성화시키고 세포 요법을 향상시키는 데 사용하기 위한 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NFκB를 활성화시키고 면역 노화를 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용하기 위한 박테리아를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 oppA, 풀루라나제(pullulanase), 세르핀(serpin) 및 tadA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 예를 들어 실시예에 제시된 바와 같은 액체 배양물에서 성장시킬 때, 후기 대수기에 비해 정지기에서 더 높은 수준으로 발현한다. 실시예는 이들 유전자가 유용한 치료 효과를 매개할 수 있음을 입증한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 eftU, 에놀라제(enolase) 및 pGTF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 예를 들어 실시예에 제시된 바와 같은 액체 배양물에서 성장시킬 때, 정지기에 비해 후기 대수기에서 더 높은 수준으로 발현한다. 실시예는 이들 유전자가 유용한 치료 효과를 매개할 수 있음을 입증한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 에놀라제, pGTF, oppA, 세르핀 및 트랜스아돌라제(transaldolase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 예를 들어 실시예에 제시된 바와 같은 액체 배양물에서 성장시킬 때, 후기 대수기에 비해 장내 상피 세포와 접촉 후 더 높은 수준으로 발현한다. 실시예는 이들 유전자가 유용한 치료 효과를 매개할 수 있음을 입증한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 풀루라나제, NlpC/P60 패밀리 단백질, FtsI, 트랜스아돌라제, GAPDH, DnaK, GroEL 및 에놀라제 중 하나 이상을 발현하고 배양 상청액으로 분비한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 표 2의 단백질 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 5, 10, 15 개, 또는 전부를 발현하고 배양 상청액으로 분비한다. 실시예는 이들 단백질이 유용한 치료 효과를 매개할 수 있음을 입증한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 풀루라나제, 유형 I 폴리케티드 신타제, 트랜스아돌라제, GAPDH, DnaK, GroEL, 에놀라제 및 EfTu 중 하나 이상을 세포 표면에서 발현한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 표 3의 단백질 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 5, 6, 8 개, 또는 전부를 발현하고 배양 상청액으로 분비한다. 실시예는 이들 단백질이 유용한 치료 효과를 매개할 수 있음을 입증한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 풀루라나제를 발현한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 풀루라나제를 발현하고 백신 보조제로서 사용하기 위한 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 풀루라나제를 발현하고 세포 요법을 향상시키는 데 사용하기 위한 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 풀루라나제를 발현하고 면역 노화를 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용하기 위한 박테리아를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 완전한 EPS 유전자좌를 포함한다. 실시예는 완전한 EPS 유전자좌가 증가된 치료 효능에 기여할 수 있음을 입증한다. 이러한 구현예에서, EPS 유전자좌는 프라이밍 글리코실트랜스퍼라제, 하나 이상의 추가 글리코실트랜스퍼라제, 티아민 피로포스페이트 결합 단백질, 막 스패닝 단백질, 플립파제 및 쇄 길이 결정인자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, EPS 유전자좌는 30 Kb 이상 크기이다(플랭킹된 가설 단백질 포함). 실시예는 이러한 EPS 유전자좌가 면역 자극 기능에 적당함을 입증한다. 바람직한 구현예에서, EPS 유전자좌는 25-60 Kb, 30-50 Kb, 30-40 Kb, 30-35 Kb, 또는 30-32 Kb 크기이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 완전한 EPS 유전자좌를 갖는 박테리아를 포함하고 백신 보조제로서 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 완전한 EPS 유전자좌를 갖는 박테리아를 포함하고 세포 요법을 향상시키는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 완전한 EPS 유전자좌를 갖는 박테리아를 포함하고 면역 노화를 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용하기 위한 것이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 예를 들어 실시예에서 결정된 바와 같이 균주 MRX004의 EPS 유전자좌에 대해 높은 수준의 뉴클레오티드 동일성, 예컨대 적어도 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 99.5% 뉴클레오티드 동일성을 갖는 EPS 유전자좌를 갖는다. 실시예는 균주 MRX004의 EPS 유전자좌가 다른 비. 브리브 균주와 유전적으로 구별되고 효능 및 치료 유용성에 기여할 수 있음을 입증한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 표면에 EPS를 운반한다. 실시예는 EPS가 세포 표면에서 단백질 노출을 조절함을 입증한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 표면에 EPS를 운반하고 백신 보조제로서 사용하기 위한 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 표면에 EPS를 운반하고 세포 요법을 향상시키는 데 사용하기 위한 박테리아를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 표면에 EPS를 운반하고 면역 노화를 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용하기 위한 박테리아를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 박테리아는 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 라피노스를 발효시킬 수 있다. 실시예는 가장 효과적인 비. 브리브 균주가 라피노스를 발효시킬 수 있고, EPS 생산에 수반됨을 시사한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, α-글루코시다제 및 β-글루코시다제, α-아라비노스, 만노스 및 라피노스 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개 모두를 발효시킬 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 아르기닌, 프롤린, 페닐알라닌, 류신, 티로신, 글리신 및 히스티딘 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개 모두를 발효시킬 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 검정을 사용하여 탄수화물 공급원 또는 아미노산을 발효시키는 박테리아의 능력을 평가할 수 있다. 바람직하게는, Rapid ID 32A 분석이 사용된다(바람직하게는 bioMerieux의 Rapid ID 32A 시스템 사용).

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, β-글루코시다제의 중간 발효 또는 α-아라비노스의 중간 발효, 보다 바람직하게는 β-글루코시다제의 중간 발효 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타낸다. 실시예는 비. 브리브 균주 MRX004 및 시험 3이 둘 다 유용한 활성을 가지며 둘 다 β-글루코시다제 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타냄을 입증한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 β-글루코시다제의 중간 발효, α-아라비노스의 중간 발효, 및 라비노스의 양성 발효를 나타낸다.

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, N-아세틸-β-글루코사미니다제의 양성 발효를 나타내지 않는다. 박테리아는 N-아세틸-β-글루코사미니다제의 중간 발효만 나타내거나 또는 발효를 나타내지 않을 수 있다. 실시예는 비. 브리브 균주 MRX004 및 시험 2가 둘 다 유용한 활성을 가지며 N-아세틸-β-글루코사미니다제의 앙성 발현을 나타내지 않음을 입증한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 N-아세틸-β-글루코사미니다제의 양성 발효를 나타내지 않고 라비노스의 양성 발효를 나타낸다.

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, α-갈락토시다제의 중간 발효 또는 α-아라비노스의 중간 발효, 보다 바람직하게는 α-갈락토시다제의 중간 발효 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타낸다. 실시예는 비. 브리브 균주 MRX004 및 시험 8이 둘 다 유용한 활성을 가지며 둘 다 α-갈락토시다제 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타냄을 입증한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 α-갈락토시다제의 중간 발효 및 α-아라비노스의 중간 발효, 및 라비노스의 양성 발효를 나타낸다.

대안적인 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, 세린 아릴아미다제를 발효시키지만 류실 글리신 아릴아미다제를 발효시키지 않고 알라닌 아릴아미다제를 발효시키지 않는다. 실시예는 비. 브리브 균주 시험 11 및 시험 12가 둘 다 유용한 활성을 가지며 둘 다 세린 아릴아미다제를 발효시키지만 류실 글리신 아릴아미다제를 발효시키지 않고 알라닌 아릴아미다제를 발효시키지 않음을 입증한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 또한 라비노스를 발효시킨다.

대안적인 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, 세린 아릴아미다제의 중간 발효를 나타낸다. 실시예는 비. 브리브 균주 시험 3 및 시험 7이 둘 다 강력한 항미생물 활성을 가지며 둘 다 세린 아릴아미다제의 중간 발효를 나타냄을 입증한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 또한 라비노스를 발효시킨다.

당업계에 알려진 임의의 적합한 검정을 사용하여 탄수화물 공급원 또는 아미노산을 발효시키는 박테리아의 능력을 평가할 수 있다. 바람직하게는, Rapid ID 32A 분석이 사용된다(바람직하게는 bioMerieux의 Rapid ID 32A 시스템 사용).

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 박테리아는 실시예 10에 사용된 것들과 같은 표준 조건을 사용하여 펄스장 겔 전기영동에 적용될 때 MRX004에 대해 도 24 또는 도 25에 제시된 패턴을 생성한다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용되는 박테리아는 아미돈(전분), 아미그달린, 아르부틴, 셀로비오스, 에스쿨린, 갈락토스, 겐티오비오스, 글루코스, 글리코겐, 프룩토스, 푸코스, 락토스, 말토스, 만노스, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 메틸 α-D-글루코피라노시드, N-아세틸글루코사민, 리보스, 사카로스(수크로스), 살리신, 소르비톨, 트레할로스, 투라노스 및 크실리톨 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 개 또는 전부를 발효시킬 수 있다. 이러한 구현예에서, 당업계에 알려진 임의의 적합한 검정을 사용하여 탄수화물 공급원을 발효시키는 박테리아의 능력을 평가할 수 있다. 바람직하게는,

의 API 50 CH 분석이 사용된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 특히 실시예 5의 조건 하에 특히 YCFA 배지에서 시험될 때 인간 세포에 대한 감소된 부착을 나타내는 비피도박테리움 브리브의 균주를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 생물형을 포함한다. 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 생물형인 박테리아 균주는 또한 면역계를 자극하는 데 효과적인 것으로 예상된다. 생물형은 원래 NCIMB 42380 균주와 필적할만한 면역 조절 활성을 가질 것이다. 생물형은 동일하거나 또는 매우 생리학적 및 생화학적 특징을 갖는 밀접하게 관련된 균주이다.

생물형은 면역계에 대한 실시예에 제시된 효과와 필적할만한 효과를 도출할 것이며, 이는 실시예에 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용함으로써 식별될 수 있다. 특히, 생물형은 NCIMB 42380과 필적할만한 T 세포 및 사이토카인에 대한 효과를 도출할 것이다.

수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에서 사용하기에 적합한 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아에 대한 다른 뉴클레오티드 서열을 서열분석함으로써 식별될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 전체 게놈이 서열분석될 수 있고 본 발명에 사용하기 위한 생물형 균주는 전체 게놈의 적어도 80%에 걸쳐(예를 들어 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%에 걸쳐, 또는 전체 게놈에 걸쳐) 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물형 균주는 게놈의 적어도 98%에 걸쳐 적어도 98% 서열 동일성 또는 게놈의 99%에 걸쳐 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 생물형 균주를 식별하는 데 사용하기 위한 다른 적합한 서열은 hsp60 또는 BOX, ERIC, (GTG)₅, 또는 REP와 같은 반복 서열을 포함할 수 있다 [25].

생물형 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 이러한 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 서열번호: 1과 적어도 99% 동일한(예를 들어 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한) 16S rRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 서열번호: 1의 16S rRNA 서열을 갖는다.

대안적으로, 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에 사용하기에 적합한 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380 기탁, 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 사용함으로써, 예를 들어 형광 증폭된 단편 길이 다형성(FAFLP) 및 반복 DNA 요소(rep)-PCR 핑거프린팅, 또는 단백질 프로파일링, 또는 부분적 16S 또는 23s rDNA 서열분석을 사용함으로써 식별될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 기술을 사용하여 다른 비피도박테리움 브리브 균주를 식별할 수 있다.

특정 구현예에서, 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에 사용하기에 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석(ARDRA)에 의해 분석될 때, 예를 들어 Sau3AI 제한 효소를 사용할 때 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다(예시적인 방법 및 지침을 위해 예를 들어 [26] 참조). 대안적으로, 생물형 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로 식별된다.

수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 생물형과 같은, 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 다른 비피도박테리움 브리브 균주는 실시예에 기재된 검정을 포함하여 임의의 적절한 방법 또는 전략을 사용하여 식별될 수 있다. 특히, 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아와 유사한 성장 패턴, 대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 박테리아 균주가 본 발명에 유용할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아의 유도체를 포함한다. 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 균주의 유도체는 딸 균주(자손) 또는 원래의 것으로부터 배양된(서브클로닝된) 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 유도체는 생물학적 활성을 제거하지 않고, 예를 들어 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도체 균주는 치료 활성이다. 유도체 균주는 원래 NCIMB 42380 균주와 필적할만한 면역 조절 활성을 가질 것이다. 유도체 균주는 원래 NCIMB 42380 균주와 필적할만한 미생물총 조절 활성을 가질 것이다. 따라서 유도체 균주는 면역계를 자극하는 데 효과적일 것이다.

유도체 균주는 실시예에 제시된 효과와 필적할만한 효과 암 모델을 도출할 것이며, 이는 실시예에 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용함으로써 식별될 수 있다. 특히, 유도체 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아와 필적할만한 효과 사이토카인 및 유전자 발현을 도출할 것이다. 특히, 유도체 균주는 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아와 필적할만한 면역 자극에 대한 효과를 도출할 것이다. NCIMB 42380 균주의 유도체는 일반적으로 NCIMB 42380 균주의 생물형일 것이다.

박테리아 균주는 또한 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료 효능 특징을 갖는 균주일 수 있으며, 이러한 세포는 본 발명에 포함된다. 따라서 조성물은 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 균주는 아니지만 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료 효능 특징을 갖는 비피도박테리움 브리브 균주를 포함할 수 있다. 균주의 안전성 특징은 예를 들어 항생제에 대한 균주의 내성을 시험함으로써, 예를 들어 항생제에 대한 본질적 및 전염성 내성을 구별함으로써 달성될 수 있다. 균주의 안전성 특징은 또한 시험관 내에서 균주의 병원성 특성, 예를 들어 독소 생산 수준을 평가함으로 달성될 수 있다. 다른 안전성 시험은 래트 및 마우스 모델에서 박테리아 균주의 급성 또는 만성 독성을 시험하는 것을 포함한다. 균주의 치료 효능은 관련 모델을 사용하여 시험관내 및 생체내에서 박테리아 균주의 기능적 특징화에 의해 달성될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물에서 박테리아 균주는 생존가능하고 장을 부분적으로 또는 전체적으로 콜로니화할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 둘 다 도 9에 나열된 비. 브리오 균주 중 하나 이상에 비해 YCFA에서 인간 장내 상피 세포, 특히 Caco-2 세포에 대해 낮은 부착성(예컨대 총 배양물의 1% 미만, 예컨대 바람직하게는 0.5% 미만 또는 0.3% 미만의 부착성)을 가지며, 도 9에 나열된 비. 브리브 균주 중 하나 이상에 비해 더 결합된 표면 엑소폴리사카라이드를 생성한다.

특정 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 폴리사카라이드 라피노스를 발효시킬 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 비피도박테리아(Bifidobacteria), 특히 비. 브리브에 비해 α-글루코시다제 및/또는 β-글루코시다제를 발효시키는 능력이 감소된다.

특정 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 본원에 참조로 포함된 WO2016/203223의 표 1에 나열된 유전자 중 하나 이상, 예컨대 WO2016/203223의 표 1의 유전자 중 5, 10, 20, 50 개 또는 전부를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 단일 밑줄로 강조된 WO2016/203223의 표 1에 나열된 유전자 중 하나 이상, 예컨대 예측된 ECF 수송체의 에너지화 모듈의 막횡단 성분 BL0694 및/또는 예측된 ECF 수송체의 에너지화 모듈의 중복된 ATPase 성분 BL0693을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 이중 밑줄로 강조되고 굵게 표시된 WO2016/203223의 표 1에 나열된 유전자 중 하나 이상, 예컨대 말토덱스트린 글루코시다제(EC 3.2.1.20), 추정 갈락토시다제, 셀룰로스 신타제(UDP-형성)(EC 2.4.1.12), 키티나제(EC 3.2.1.14) 및 감각 상자/GGDEF 패밀리 단백질로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 이탤릭체로 강조된 WO2016/203223의 표 1에 나열된 유전자 중 하나 이상, 예컨대 오메가-3 다중불포화 지방산 신타제 서브유닛 PfaA, 유형 I 폴리케티드 신타제, 알려지지 않은 기능의 추정 글리코실 하이드롤라제(DUF1680), 비오틴 ECF 수송체의 에너지화 모듈의 ATPase 성분 BioM, 양이온-수송 ATPase E1-E2 패밀리, 리보스 ABC 수송 시스템 퍼미아제 단백질 RbsC(TC 3.A.1.2.1), 리보스 ABC 수송 시스템 ATP-결합 단백질 RbsA(TC 3.A.1.2.1), 3' 내지 5' 올리고리보뉴클레아제(orn), 악티노바실루스 단백질과 관련된 막 단백질(1944168)로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 유전자를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 하기로부터 선택된 하나 이상(예컨대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 개 또는 전부)의 유전자를 포함한다: 2-숙시닐-5-에놀피루빌-6-하이드록시-3-사이클로헥센-1-카르복실산 신타제(EC 2.2.1.9); 3' 내지 5' 올리고리보뉴클레아제(orn); 알파-갈락토시다제(EC 3.2.1.22); ECF 수송체의 일반적인 에너지화 모듈의 ATPase 성분; 퀴노신-조절된 ECF 수송체의 에너지화 모듈의 ATPase 성분 STY3233; ATP-의존적 DNA 헬리카제 recG(EC 3.6.1.-); 베타-글루코시다제 (EC 3.2.1.21); 셀룰로스 신타제(UDP-형성)(EC 2.4.1.12); 키티나제(EC 3.2.1.14); COG1309: 전사 조절인자; D-알라닐-D-알라닌 카르복시펩티다제(EC 3.4.16.4); 예측된 ECF 수송체의 에너지화 모듈의 중복된 ATPase 성분 BL0693; 프룩토키나제(EC 2.7.1.4); 글루코스/만노스:H+ 동시수송체 GlcP; 글리코실트랜스퍼라제(EC 2.4.1.-); GMP 신타제[글루타민-가수분해화](EC 6.3.5.2); 클러스터에서 키나제의 PfkB 패밀리인 인디고이딘 신타제 indA를 함유하는 가설 당 키나제; 뉴클레오시드 하이드롤라제를 선호하는 이노신-우리딘(EC 3.2.2.1); LSU 리보솜 단백질 L31p @ LSU 리보솜 단백질 L31p, 아연-독립적; LSU 리보솜 단백질 L33p @ LSU 리보솜 단백질 L33p, 아연-독립적; 말토덱스트린 글루코시다제(EC 3.2.1.20); 악티노바실루스 단백질과 관련된 막 단백질(1944168); 막-결합된 용해성 뮤레인 트랜스그리코실라제 D 전구체(EC 3.2.1.-); 메틸트랜스퍼라제(EC 2.1.1.-); NADH-의존적 부탄올 데하이드로게나제 A(EC 1.1.1.-); 포스포글리콜레이트 포스파타제(EC 3.1.3.18); 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라제(EC 5.3.1.24); 알려지지 않은 기능의 추정 글리코실 하이드롤라제(DUF1680); 람노스-함유 폴리사카라이드 전좌 퍼미아제; 리보키나제(EC 2.7.1.15); 리보스 ABC 수송 시스템, ATP-결합 단백질 RbsA(TC 3.A.1.2.1); 리보스 ABC 수송 시스템, ATP-결합 단백질 RbsA(TC 3.A.1.2.1); 리보스 ABC 수송 시스템, 고 친화성 퍼미아제 RbsD(TC 3.A.1.2.1); 리보스 ABC 수송 시스템, 주변 세포질 리보스-결합 단백질 RbsB(TC 3.A.1.2.1); 리보스 ABC 수송 시스템, 퍼미아제 단백질 RbsC(TC 3.A.1.2.1); 리보스 ABC 수송 시스템, 퍼미아제 단백질 RbsC(TC 3.A.1.2.1); 소르비톨 데하이드로게나제(EC 1.1.1.14); SSU 리보솜 단백질 S14p(S29e) @ SSU 리보솜 단백질 S14p(S29e), 아연-독립적; 퀴노신-관련된 ECF 수송체의 기질-특이적 성분 STY3230; 수크로스-6-포스페이트 하이드롤라제(EC 3.2.1.B3); 테이코산 배출 ATP-결합 단백질 TagH(EC 3.6.3.40); 예측된 ECF 수송체의 에너지화 모듈의 막횡단 성분 BL0694; 퀴노신-관련된 ECF 수송체의 에너지화 모듈의 막횡단 성분 STY3231; HrtAB 수송체와 공존화된 2-성분 반응 조절인자; 유형 I 제한-변형 시스템, DNA-메틸트랜스퍼라제 서브유닛 M(EC 2.1.1.72); 유형 I 제한-변형 시스템, 제한 서브유닛 R(EC 3.1.21.3); 유형 I 제한-변형 시스템, 특이성 서브유닛 S(EC 3.1.21.3); 유형 I 제한-변형 시스템, 특이성 서브유닛 S(EC 3.1.21.3); 유형 I 제한-변형 시스템, 특이성 서브유닛 S(EC 3.1.21.3); 크실리톨 데하이드로게나제(EC 1.1.1.9); 및 크실로스 ABC 수송체, 주변 세포질 크실로스-결합 단백질 XylF. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 선행 문장에서 나열되고 WO2016/203223의 표 1에서 강조되지 않은 하나 이상(예컨대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 개 또는 전부)의 유전자를 포함한다.

치료 용도

면역계 자극

실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 면역 자극을 유발할 수 있음을 제시한다. 본 발명의 조성물의 투여가 면역 자극 효과를 갖는 것으로 제시되었으므로, 본 발명의 조성물은 질환, 특히 감소된 면역 활성화를 특징으로 하는 질환 및 증가된 면역 반응에 의해 치료가능한 질환의 치료에 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극함으로써 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 임의의 이러한 용도를 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

면역결핍은 환자의 면역계가 손상되거나 또는 완전히 없는 상태이다. 면역결핍 질환은 감소된 면역 활성화를 특징으로 하고 질환을 치료하기 위해 환자의 면역계를 자극하는 것이 유리한 질환의 예이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역결핍 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

면역결핍 질환에는 2가지 유형이 있다. 1차 면역결핍 질환은 일반적으로 출생 시 존재하고 아동기에 진단되는 유전적 돌연변이로부터 비롯된 선천성 면역 장애이다. 2차 면역결핍 질환은 질환 또는 독성 화학물질과 같은 환경 공급원의 결과인 후천성 면역결핍이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 1차 면역결핍 질환 또는 2차 면역결핍 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

1차 면역결핍 장애의 예 및 실시예는 X-연관성 무감마글로불린혈증(XLA), 만성 육아종병(CGD), 공통 가변성 면역결핍(CVID) 및 중증 복합 면역결핍(SCID)을 포함하며, 이는 또한 무림프구증 또는 "버블 보이" 병으로 알려져 있다. 2차 면역결핍 장애는 예를 들어, 심한 화상, 화학요법, 방사선, 당뇨병, 영양실조에 의해 유발될 수 있다. 2차 면역결핍 장애의 예는 AIDS, 백혈병과 같은 면역계의 암, 바이러스성 간염 다발성 골수종과 같은 면역-복합 질환을 포함한다 [27]. 인터페론-γ는 면역결핍 질환 CGD에 대한 승인된 요법이다 [28]. 실시예는 본 발명의 조성물이 IFN-γ의 생성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 본 발명의 조성물이 1차 및 2차 면역결핍 질환을 포함하는 면역결핍 질환을 치료하는 데 특히 효과적일 수 있음을 입증한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TLR2 자극을 통해 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 질환의 치료에서 TLR2를 자극하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 TLR2 활성과 관련된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이거나, 또는 감소된 TLR2 활성을 갖는 것으로 식별된 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 임의의 이러한 용도를 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물을 사용한 치료는 Th1 세포 반응을 유도한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 질환의 치료에서 Th1 세포 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 Th1 세포 활성과 관련된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이거나, 또는 감소된 Th1 세포 활성을 갖는 것으로 식별된 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 임의의 이러한 용도를 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NFκB 활성화를 통해 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 질환의 치료에서 NFκB를 자극하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 NFκB 활성과 관련된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이거나, 또는 감소된 NFκB 활성을 갖는 것으로 식별된 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 임의의 이러한 용도를 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 활성화된 CD8⁺ 세포의 감소된 수준을 특징으로 하는 질환의 치료에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8⁺ 세포의 활성 또는 수준을 증가시킴으로써 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8⁺ 세포의 활성 또는 수준을 증가시킴으로써 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8⁺ 세포를 활성화함으로써 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 조성물은 B 세포의 감소된 수준을 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 활성 또는 수준을 증가시킴으로써 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 활성 또는 수준을 증가시킴으로써 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포를 활성화함으로써 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 조성물은 활성화된 CD8⁺CD25⁺ 세포의 감소된 수준을 특징으로 하는 질환의 치료에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8⁺CD25⁺ 세포의 활성 또는 수준을 증가시킴으로써 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8⁺CD25⁺ 세포의 활성 또는 수준을 증가시킴으로써 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8⁺CD25⁺ 세포를 활성화함으로써 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 B 세포의 수 또는 백분율을 증가시킴으로서 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서 B 세포의 수 또는 백분율의 증가는 면역 자극을 초래한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율을 증가시킴으로써 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 전염증성 분자, 예컨대 전염증성 사이토카인의 발현 증가를 야기할 수 있음을 보여준다. 본 발명의 조성물의 투여 시 발현 수준의 증가를 나타낸 전염증성 분자의 예에는 IL-12p70, TNF-α, IL-4, IFNγ 및 IL-17α이 포함된다. 본 발명의 조성물의 투여는 전염증성 분자의 발현을 증가를 보여주므로, 본 발명의 조성물은 전염증성 분자, 예컨대 전염증성 사이토카인의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전염증성 분자의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환, 특히 전염증성 사이토카인의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70, TNF-α, IL-4 및/또는 IFNγ의 발현 및/또는 활성의 감소를 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70, TNF-α, IL-4 및/또는 IFNγ의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70, TNF-α, IL-4 및/또는 IFNγ의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 면역 반응을 촉진하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-17α IL-12p70, TNF-α, IL-4, IFNγ 및/또는 IL-17α의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70, TNF-α, IL-4 IFNγ 및/또는 IL-17α의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70, TNF-α, IL-4 IFNγ 및/또는 IL-17α의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β의 발현 증가를 야기할 수 있음을 보여준다. IL-1β는 전염증성 사이토카인이다[29]. IL-1β의 생산 및 분비는 염증성 반응의 활성화와 연관되는 단백질 복합체인 인플라좀에 의해 조절된다[30]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-1β의 발현을 증가시키는 것으로 보이므로, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 발현 증가를 야기할 수 있음을 보여준다. TNF-α는 세포사를 촉진하는 다양한 신호전달 경로에 관여되는 것으로 알려져 있는 전염증성 사이토카인이다. TNF-α는 그 인지체 수용체, TNFR-1에 결합하여 아폽토시스를 개시하고, 이는 아폽토시스 경로에서 절단 이벤트 캐스케이드를 야기한다[31]. TNF-α는 또한 RIP 키나제-의존적 기전을 통해 괴사를 유발할 수 있다[32]. 본 발명의 조성물의 투여는 TNF-α 발현을 증가시키는 것이 보이므로, 본 발명의 조성물은 질환의 치료에서 유용할 수 있고, 특히 TNF-α에 의한 발현 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 TNF-α 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 조성물의 투여는 IL-4 발현의 증가를 제시하므로, 본 발명의 조성물은 질환의 치료, 특히 IL-4에 의한 발현 감소를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 IL-4 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-4의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-4의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 질환을 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-4의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 조성물의 투여는 IL-17α 발현의 증가를 제시하므로, 본 발명의 조성물은 질환의 치료, 특히 IL-17α에 의한 발현 감소를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 IL-17α 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-17α의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-17α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 질환을 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-17α의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 조성물의 투여는 IL-12p70 발현의 증가를 제시하므로, 본 발명의 조성물은 질환의 치료, 특히 IL-12p70에 의한 발현 감소를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 IL-12p70 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 질환을 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70의 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 질환은 암이 아니다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 질환은 IL-17 또는 Th17 경로에 의해 매개되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-17 및/또는 Th17 경로의 발현 또는 활성을 증가시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물이 투여되는 대상체는 리놀레산 보충제를 복용하지 않고/않거나 리놀레산이 풍부한 식단을 갖지 않는다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 조성물은 리놀레산을 포함하지 않는다.

구현예에서, 본 발명의 조성물은 베타-갈락토-올리고사카라이드 A 및/또는 B를 포함하지 않는다.

면역 자극을 필요로 하는 환자는 박테리아 감염 위험이 있을 수 있다. 실시예는 본 발명의 조성물이 항미생물 활성을 가짐을 입증한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극하고 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극하고 박테리아 감염의 성장을 억제함으로써 박테리아 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 병원성 박테리아에 대한 면역 반응을 촉진하고 박테리아의 성장을 억제하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 박테리아 감염은 위장관 감염이다. 바람직하게는 박테리아 감염은 그람-음성 박테리아 감염이다.

실시예는 또한 본 발명의 조성물이 T-헬퍼 세포 및 세포독성 T 림프구의 분화를 촉진함을 실증한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 T-헬퍼 세포 및/또는 세포독성 T 림프구의 분화를 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.

백신 보조제로서의 용도

실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 면역계를 자극하고 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 발현 및 TLR2의 활성화의 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. TNF-α는 백신 반응을 위해 중요한 것으로 알려져 있다. 예를 들어, TNF-α는 고령 집단에서 독감 백신접종에서의 효율적 백신 반응을 위해 요구되는 것으로 나타났다[33]. 유사하게, TLR2는 반응을 개선하기 위한 백신 보조제의 중요한 표적이다[34]. 본 발명의 조성물의 투여가 TNF-α 발현 및 TLR2 활성화를 증가시키는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TLR2의 수준 및/또는 활성을 증가시킴으로써 백신 보조제로서 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 치료법에서 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 항원과 조합되어 투여될 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신접종 직전 또는 직후 환자에게 투여하기 위한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 백신 보조제로서 사용하기 위한 NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생체형을 포함하는 조성물을 제공한다.

실시예는 본 발명의 박테리아가 TLR2를 활성화 한다는 것을 입증한다. TLR 작용제는 다양한 항원 유형에 걸쳐, 특히 고령 집단에서 백신 보조제로 개발 중이다[35]. 따라서, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로서, 특히 감소된 면역계 활성을 가질 수 있는 고령 환자(예로 40, 50, 60, 70 또는 80세 초과)에 투여될 백신을 위해 유용할 수 있다. TLR2 신호전달은 또한 연령-연관 선천성 면역 반응에서 핵심 역할을 담당한다[36]. 특정 구현예에서, 조성물은 선천성 면역 반응을 증강시키는 데 사용하기 위한 것이다. TLR2 작용제는 백신 보조제로 개발 중이지만, 이들은 모두 알려진 병원체 및/또는 합성 유래이다. 대조적으로, 본 발명의 조성물은 공생 박테리아를 포함한다.

실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β의 발현 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. Li 등[37]은 보조제 알루미늄 하이드록사이드가 IL-1β의 분비를 활성화함을 나타내었고, IL-β 자체가 보조제로 작용할 수 있음을 제시하였다. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-1β 발현을 증가시키는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 유용할 수 있다.

실시예는 본 발명의 조성물이 IFNγ 수준을 증가시키고 Th1 세포 반응을 촉진할 수 있음을 입증하며, 둘 모두는 항원에 대한 항체 반응 증가와 관련된다[38].특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원, 특히 병원성 또는 암 항원에 대해 항체 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 또한, 는 연구되는 말라리아 백신을 수여받는 자원자에서 백신 유도된 T-세포 반응의 IFN-γ척도이다[39]. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원, 특히 병원성 또는 암 항원에 대해 T-세포 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IFN-γ의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 조성물은 말라리아에 대해 보호하는 데 사용하기 위한 것이다.

실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-12p70의 발현 또는 수준 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. 상기 효과는 백신 보조제 효율과 연관되었고 IL-12 자체가 보조제로 제안되었으며[40], 이는 본 발명의 조성물이 보조제로 효과적일 것임을 제시한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다.

일부 구현예에서, 백신 보조제로 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 이들 자체가 환자에게 별도 투여된 항원에 대해 보조제 효과를 제공하기 위해 투여될 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여되는 반면, 항원은 비경구 주사된다.

본 발명의 조성물은 임의의 유용한 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 예시적인 항원에는 바이러스 표면 단백질과 같은 바이러스 항원; 단백질 및/또는 당류 항원과 같은 박테리아 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원이 포함된다. 본 발명은 특히 인플루엔자 바이러스, HIV, 십이지장충, B형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 광견병, 호흡기 융합 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 스타필로코커스 아우레우스, 클라미디아, SARS 코로나바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 나이세리아 메닌지티디스, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 바실러스 안트라시스, 엡스타인 바 바이러스, 인간 유두종바이러스 등에 대한 백신을 위해 특히 유용하다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 추가 항원에는 당단백질 및 리포글리칸 항원, 고세균 항원, 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9 및 습관성 성분, 예를 들어 니코틴, 알코올 또는 오피에이트가 포함된다.

본 발명과 함께 사용하기 위한 바람직한 항원에는 병원체 항원 및 종양 항원이 포함된다. 항원은 병원체로의 감염에 대한 보호 또는 종양을 공격하기 위해 효과적일 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 유발할 것이다. 항원은, 예를 들어, 펩타이드 또는 다당류일 수 있다.

본 발명은 또한 환자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조에서 (i) 항원의 수성 제조물; 및 (ii) 비. 브리브(B.breve) 종으로부터의 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 박테리아 균주는 NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생체형이다.

이들 방법 및 용도에 의해 일어난 면역 반응에는 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호 항체 반응이 포함될 것이다.

일부 구현예에서, 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주는 항원을 제시하도록 조작된다. 본 발명의 박테리아 균주 상의 항원 제시는 면역자극 활성을 최대화하고 항원에 대해 생성된 보호 면역 반응을 추가로 증강시킬 수 있다. 또한, 항원 및 본 발명의 박테리아를 포함하는 치료제의 제조 및 전달은 각각의 항원 및 박테리아 균주를 포함하는 조성물이 별도로 제조되고 투여되는 경우보다 이러한 방식으로 더 효율적이고 효과적일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어 그 세포 표면 상에, 항원을 제시하는 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 항원을 제시하는 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 백신 항원으로 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 항원은 HIV, 십이지장충, B형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 광견병, 호흡기 융합 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 스타필로코커스 아우레우스, 클라미디아, SARS 코로나바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 나이세리아 메닌지티디스, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 바실러스 안트라시스, 엡스타인 바 바이러스 또는 인간 유두종바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 항원은 당단백질 항원, 리포글리칸 항원, 고세균 항원, 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9 또는 알코올, 오피에이트 등과 같은 습관성 성분이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 하나 이상의 항원을 발현한다. 일반적으로 항원은 재조합적으로 발현될 것이고 본 발명의 박테리아에 대해 이종성일 것이다. 따라서, 본 발명은 이종성 항원을 발현하는 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 제공한다. 항원은 박테리아와 상동성인 하나 이상의 폴리펩타이드와 함께 발현되는 융합 폴리펩타이드의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아는 비-융합 폴리펩타이드로서 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주 세포를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 세포는 이종성 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백신으로 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 이종성 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 백신으로 사용하기 위한 것이다.

본 발명과 함께 사용하기 위한 예시적인 항원에는 바이러스 표면 단백질과 같은 바이러스 항원; 단백질 및/또는 당류 항원과 같은 박테리아 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원이 포함된다. 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주에서 발현하기 위한 추가 항원에는 당단백질 및 리포글리칸 항원, 고세균 항원, 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9 및 습관성 성분, 예를 들어 니코틴, 알코올, 오피에이트 등이 포함된다.

본 발명은 또한 알츠하이머 병 및 기타 신경 퇴행성 질환과 같은 비-전염성 질환에 대한 백신에 대한 반응을 향상시키는 데 유용할 수 있으며, 이 경우 본 발명과 함께 사용하기 위한 항원은 아밀로이드-베타 또는 타우일 수 있다. 비 전염성 질환에 대한 다른 항원으로는 PCSK9 (콜레스테롤 상승 치료용)를 포함한다.

본 발명은 또한 습관성 성분, 예를 들어 니코틴, 알코올, 또는 오피에이트에 대한 백신에 대해 반응을 증강시키기 위해 유용할 수 있다.

실시예는 또한 본 발명의 조성물이 항미생물 활성을 가짐을 입증한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 박테리아 감염, 특히 그람-음성 박테리아 감염에 대한 백신에 사용하기에 특히 효과적일 수 있다. 본 발명의 조성물은 박테리아 감염에 대한 항미생물 효과를 발휘하면서 또한 감염을 다루기 위해 면역계를 자극할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 박테리아 감염을 치료하고 향후 박테리아 감염을 예방한다.

세포 요법

키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 요법

실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 TLR2의 활성화를 증가시킬 수 있음을 제시한다. TLR2 자극은 CAR-T 요법의 효능을 강력하게 한다[41]. 따라서, 본 발명의 조성물은 세포 요법, 특히 CAR-T 세포 요법에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 요법에 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CAR-T 세포 요법에 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 만성 림프구성 백혈병의 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 임의의 이러한 용도를 위한, NCIMB에 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.

실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 NFκB의 활성화를 증가시킬 수 있음을 제시한다. NFκB 활성화는 CAR-T 요법의 효능을 개선시킨다 [42]. 따라서, 본 발명의 조성물은 세포 요법, 특히 CAR-T 세포 요법에 유용할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CAR-T 요법 동안 T 세포 입양 전달 전에 환자에게 투여된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CAR-T 요법 동안 T 세포 입양 전달 후에 환자에게 투여된다.

따라서, 본 발명의 조성물은 세포 치료법에서, 특히 세포 치료법에 대한 반응을 증강시키는 데 유용할 수 있다.

중간엽 줄기 세포(MSC) 치료법

중간엽 줄기 세포(MSC) 치료법은 면역자극 특성을 갖는 것으로 보고되었다. MSC가 LPS로 처리되는 경우, 이들은 증가된 B 세포 증식을 유도하는 전염증성 사이토카인 IL-8을 상향조절한다[43]. 따라서, 본 발명의 조성물은 B 세포 증식의 발현을 증가시키는 것을 나타냈으므로, 이들은 MSC 세포 치료법과 조합되어 유용할 수 있다.

줄기 세포 이식 치료법

줄기 세포 이식 치료법에서 분화되지 않은 줄기 세포를 사용하는 대신, 이식 전에 어느 정도 줄기 세포를 분화시키는 것이 유익할 수 있음이 보고되었다. 예를 들어, Heng 등[44]은 줄기 세포의 심근 분화가 더 높은 그래프팅 효율, 근육세포의 증강된 재생 및 심장 기능의 증가된 복원을 가져서 유익할 수 있음을 보고하였다. 또한 연구에 따르면 특정 공생 박테리아 균주를 사용한 GI 집락화는 동종 조혈 세포 이식 후 생존율을 향상시킬 수 있다 [45]. 본 발명의 조성물의 투여는 세포를 자극하기 때문에, 본 발명의 조성물은 줄기 세포 이식 치료법에서 줄기 세포 분화를 위해 유용할 수 있다.

면역노화

Fulop 등[46]은 Treg 세포수 증가 및 B 세포수 감소가 적응 면역계에서 노화와 연관됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하거나 지연하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수 증가를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포수 감소를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수 증가 및 B 세포수 감소를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포를 감소시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포수를 증가시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수를 감소시키고 B 세포수를 증가시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화에 의해 유도되는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연하고/하거나 예방하여 노화-관련 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 NCIMB에서 수탁 번호 42380으로 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생체형을 포함하는 조성물을 임의의 이러한 용도로 제공한다.

또한, 백신 아주반트가 면역노화를 극복할 수 있음이 제안되었다[47]. 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 사용하기 위해 적합하므로, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하거나 지연하기 위해 유용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로서 면역노화를 지연하고/하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로서 사용하기 위한 것이며, 여기서 조성물은 면역노화를 지연하고/하거나 예방한다.

면역 노화와 관련된 질환은 심혈관 질환, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환, 암, 2형 진성 당뇨병 [48] 및 자가면역 장애 [49]를 포함한다.

면역 노화를 앓고 있는 대상체는 박테리아 감염에 취약할 수 있다. 실시예는 본 발명의 조성물이 항미생물 활성을 가짐을 제시한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 노인 환자, 또는 50, 55, 60, 65, 70 또는 75세 이상의 환자와 같은 면역 노화를 나타내는 환자에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

박테리아 감염의 치료 및 예방

실시예는 비. 브리브, 특히 본 발명의 비. 브리브 균주가 강력한 항미생물 활성을 가짐을 입증한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한 것이다.

바람직한 구현예에서, 감염은 위장관 감염이다. 비. 브리브 균주, 특히 본 발명의 비. 브리브 균주는 위장관에 투여될 때 강력한 효과를 갖는 것으로 제시되었다(실시예 및 WO2016/2032 참조). 바람직한 구현예에서, 감염은 그람-음성 박테리아 감염이다. 특히 바람직한 구현예에서, 감염은 헬리코박터 파일로리, 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 티피 또는 이. 콜라이 감염과 같은 그람-음성 위장관 감염이다. 일반적으로, 박테리아 감염은 병원성 박테리아 감염이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 이. 콜라이 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 에스. 엔테리카 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

일부 구현예에서, 박테리아 감염은 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 살모넬라(Salmonella), 및 바실루스(Bacillus)로 이루어진 목록으로부터 선택된 속의 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 이. 콜라이 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 에스. 티피뮤리움(S. Typhimurium) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 비. 서브틸리스(B. subtilis) 감염이다. 본 발명의 조성물은 이들 박테리아에 대해 강력한 항미생물 활성을 갖는 것으로 제시되어 있다.

일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 나이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 슈도모나스 아에루기노사, 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 살모넬라 티피(Salmonella Typhi) 감염이다. 일부 구현예에서, 치료 또는 예방을 위한 박테리아 감염은 살모넬라 파라티피(Salmonella Paratyphi) 감염이다. 이들 박테리아는 그람-음성이어서 실시예에 제시된 바와 같이, 본 발명의 조성물에 취약할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 박테리아 감염의 치료에서 박테리아의 생존력을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 박테리아를 사용하여 병원성 박테리아의 수준을 무증상 수준으로 회복시키거나 또는 대상체로부터 병원성 박테리아를 완전히 제거하여, 박테리아의 상승된 수준과 관련된 증상을 완화시키는 데 더하여 박테리아 감염을 치료한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 박테리아 감염의 예방의 치료에서 박테리아 성장을 억제하는 데 사용하기 위한 것이다. 즉, 조성물은 감염을 유발하는 박테리아에 대해 세포증식 억제 활성을 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 조성물은 재발성 감염의 발병을 지연시키거나 또는 재발성 감염을 예방한다. 특정 구현예에서, 치료될 대상체는 박테리아의 무증상 보균자와 같이 박테리아 감염이 발생할 위험이 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 박테리아 감염 증상을 나타내는 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.

바람직하게는, 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 라피노스를 발효시킬 수 있다.

바람직하게는, 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, β-글루코시다제의 중간 발효 또는 α-아라비노스의 중간 발효, 보다 바람직하게는 β-글루코시다제의 중간 발효 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타낸다. 실시예는 비. 브리브 균주 MRX004 및 시험 3이 둘 다 유용한 활성을 가지며 둘 다 β-글루코시다제 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타냄을 입증한다.

바람직하게는, 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, N-아세틸-β-글루코사미니다제의 양성 발효를 나타내지 않는다. 박테리아는 N-아세틸-β-글루코사미니다제의 중간 발효만을 나타내거나 또는 발효를 나타내지 않을 수 있다. 실시예는 비. 브리브 균주 MRX004 및 시험 2가 둘 다 유용한 활성을 가지며 N-아세틸-β-글루코사미니다제의 양성 발효를 나타내지 않음을 입증한다.

바람직하게는, 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, α-갈락토시다제의 중간 발효 또는 α-아라비노스의 중간 발효, 보다 바람직하게는 α-갈락토시다제의 중간 발효 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타낸다. 실시예는 비. 브리브 균주 MRX004 및 시험 8이 둘 다 유용한 활성을 가지며 둘 다 α-갈락토시다제 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타냄을 입증한다.

대안적인 구현예에서, 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, 세린 아릴아미다제를 발효시키지만 류실 글리신 아릴아미다제를 발효시키지 않고 알라닌 아릴아미다제를 발효시키지 않는다. 실시예는 비. 브리브 균주 시험 11 및 시험 12가 둘 다 유용한 활성을 가지며 둘 다 세린 아릴아미다제를 발효시키지만 류실 글리신 아릴아미다제를 발효시키지 않고 알라닌 아릴아미다제를 발효시키지 않음을 입증한다.

대안적인 구현예에서, 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명에 사용되는 박테리아는 예를 들어 적절한 현탁 배지(예컨대 API 현탁 배지)에서 37℃에서 4 시간 동안 배양될 때, 및 예를 들어 Rapid ID 32A 분석에 적용될 때, 세린 아릴아미다제의 중간 발효를 나타낸다. 실시예는 비. 브리브 균주 시험 3 및 시험 7이 둘 다 강력한 항미생물 활성을 가지며 둘 다 세린 아릴아미다제의 중간 발효를 나타냄을 입증한다.

당업계에 알려진 임의의 적합한 검정을 사용하여 탄수화물 공급원 또는 아미노산을 발효시키는 박테리아의 능력을 평가할 수 있다. 바람직하게는, Rapid ID 32A 분석이 사용된다(바람직하게는 bioMerieux의 Rapid ID 32A 시스템 사용).

투여 방식

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 장으로 전달하고/하거나 장의 부분 또는 총 콜로니화를 가능하게 하기 위해 위장관에 투여되도록 제형화된다. 일부 구현예에서, 용어 "장의 총 콜로니화"는 박테리아가 장의 모든 부분(즉, 소장, 대장 및 직장)을 콜로니화하였음을 의미한다. 본 발명의 추가 구현예에서, 용어 "총 콜로니화" 또는 "부분 콜로니화"는 박테리아가 장에서 각각 영구적으로 또는 일시적으로 유지됨을 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 경구로 투여되지만, 직장으로, 비강내로, 또는 협측 또는 설하 경로를 통해 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 폼, 스프레이 또는 겔로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 좌약, 예컨대 직장 좌약으로, 예를 들어 테오브로마 오일(코코아 버터), 합성 경질 지방(예로 서포시르, 휘테폴), 글리세로-젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 비누 글리세린 조성물 형태로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 코위 튜브, 입위 튜브, 위 튜브, 공장조루술 튜브(J 튜브), 경피 내시경 위절개술(PEG)과 같은 튜브, 또는 위, 공장에 대한 접근을 제공하는 흉벽 포트 및 다른 적합한 접근 포트와 같은 포트를 통해 위장관에 투여된다.

본 발명의 조성물은 1회 투여될 수도 있고, 또는 치료 요법의 일환으로 순차적으로 투여될 수도 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 매일 투여되기 위한 것이다(한 번 또는 여러 번).

본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 치료에는 환자의 장 미생물총의 평가가 수반된다. 본 발명의 균주 전달 및/또는 부분적이거나 전체적인 집락이 달성되지 않고 유효성이 관찰되지 않는 경우 치료가 반복될 수 있거나, 전달 및/또는 부분적 또는 전체적 집락이 성공적이고 유효성이 관찰되는 경우 치료가 종료될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자궁내 및/또는 출생 후 자녀에서 질환의 발생 가능성을 감소시키기 위해 임신한 동물, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 감소된 면역 활성으로 매개된 질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단받은, 또는 감소된 면역 활성에 의해 매개되는 질환 또는 병태의 위험에 처한 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 조성물은 또한 건강한 환자에서 감소된 면역 활성에 의해 매개된 질환 또는 병태의 발생을 예방하기 위한 예방적 조치로서 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 결핍 면역 활성을 갖는 것으로 진단받은, 또는 결핍 면역 활성의 위험에 처한 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 비. 브리브에 의한 집락이 감소되었거나 부재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 영양 보충제와 같은 식품으로 투여될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 조성물은 인간의 치료를 위한 것이지만, 이들은 가금, 돼지, 고양이, 개, 말 또는 토끼와 같은 단위 포유류를 포함하는 동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물의 성장 및 수행능력을 증강시키기 위해 유용할 수 있다. 동물에 투여되는 경우, 경구 급식이 사용될 수 있다.

조성물

일반적으로, 본 발명의 조성물은 박테리아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 조성물은 냉동-건조 형태로 제형화된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 포함하는 과립 또는 젤라틴 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 동결건조된 박테리아를 포함한다. 박테리아의 동결건조는 잘 확립된 절차이며 관련 지침은, 예를 들어, 참고문헌[50,52]에서 이용 가능하다. 실시예는 동결건조된 조성물이 특히 효과적임을 입증한다.

대안적으로, 본 발명의 조성물은 살아있는, 활성 박테리아 배양을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 캡슐화되어 박테리아 균주의 내장으로의 전달을 가능하게 한다. 캡슐화는, 예를 들어, 압력, 효소 활성과 같은 화학적 또는 물리적 자극으로의 파열, 또는 pH 변화에 의해 유발될 수 있는 물리적 붕해를 통해, 표적 위치에서의 전달 시까지 조성물을 분해로부터 보호한다. 임의의 적절한 캡슐화 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 캡슐화 기법에는 다공성 매트릭스 내의 포획, 고형 담체 표면 상의 부착 또는 흡착, 응결에 의한 또는 가교제를 이용한 자가-응집, 및 미세다공성 막 또는 마이크로캡슐 내로의 기계적 봉쇄가 포함된다. 본 발명의 조성물을 제조하기 위해 유용할 수 있는 캡슐화에 대한 지침은, 예를 들어, 참고문헌 [53] 및 [54]에서 이용 가능하다.

조성물은 경구 투여될 수 있고 정제, 캡슐 또는 분말의 형태일 수 있다. 비. 브리브는 혐기체이므로 캡슐화된 제품이 바람직하다. 다른 성분(예컨대 비타민 C)이 전달 및/또는 생체내 부분적 또는 전체적 집락 및 생존을 개선하기 위해 프리바이오틱 기질 및 산소 스캐빈저로서 포함될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 우유 또는 유장 기재 발효된 유제품과 같은 음식 또는 영양 제품으로, 또는 약학 제품으로 경구 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물은 가수분해된 젖소의 유청을 포함하지 않는다.

본 발명의 조성물에는 치료 유효량의 본 발명의 박테리아 균주가 포함된다. 치료 유효량의 박테리아 균주는 환자 상에서 유익한 효과를 발휘하는 데 충분하다. 치료 유효량의 박테리아 균주는 환자의 내장으로의 전달 및/또는 이의 부분적 또는 전체적 집락을 일으키는 데 충분할 수 있다.

예를 들어 성인 인간에 대한, 박테리아의 적합한 1일 용량은 약 1 x 10³ 내지 약 1 x 10¹¹ 콜로니 형성 단위(CFU); 예를 들어, 약 1 x 10⁷ 내지 약 1 x 10¹⁰ CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10¹⁰ CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 10⁷ 내지 약 1 x 10¹¹ CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹⁰ CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹¹ CFU일 수 있다.

특정 구현예에서, 박테리아의 용량은 1일 당 적어도 10¹⁰, 적어도 10¹¹, 또는 적어도 10¹² 세포와 같이, 1일 당 적어도 10⁹ 세포이다.

특정 구현예에서, 조성물은 조성물의 중량에 대해 약 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10¹¹ CFU/g의 양으로; 예를 들어, 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹⁰ CFU/g의 양으로 박테리아 균주를 함유한다. 용량은, 예를 들어, 1 g, 3 g, 5 g, 및 10 g일 수 있다.

조성물의 용량은 조성물의 중량에 대해 약 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10¹¹ 콜로니 형성 단위 (CFU)/g의 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 용량은 성인 인간에게 적합할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 1 x 10³ 내지 약 1 x 10¹¹ CFU/g; 예를 들어, 약 1 x 10⁷ 내지 약 1 x 10¹⁰ CFU/g; 다른 예에서 약 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10¹⁰ CFU/g; 다른 예에서 약 1 x 10⁷ 내지 약 1 x 10¹¹ CFU/g; 다른 예에서 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹⁰ CFU/g; 다른 예에서 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹¹ CFU/g, 용량은 예를 들어 1g, 3g, 5g 및 10g 일 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 균주의 양은 조성물의 중량에 대해 그램 당 약 1 x 10³ 내지 약 1 x 10¹¹ 콜로니 형성 단위이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 500 ㎎ 내지 1000 ㎎, 600 ㎎ 내지 900 ㎎, 700 ㎎ 내지 800 ㎎, 500 ㎎ 내지 750 ㎎ 또는 750 ㎎ 내지 1000 mg의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 약학 조성물 중 동결건조된 박테리아는 500 ㎎ 내지 1000 ㎎, 600 ㎎ 내지 900 ㎎, 700 ㎎ 내지 800 ㎎, 500 ㎎ 내지 750 ㎎ 또는 750 ㎎ 내지 1000 mg의 용량으로 투여된다.

조성물은 프로바이오틱으로 제형화 될 수 있다. 프로바이오틱은 FAO/WHO에 의해 적절한 양으로 투여될 경우 숙주에게 건강상의 이점을 제공하는 살아있는 미생물로 정의된다.

전형적으로, 본 발명의 조성물과 같은 프로바이오틱은 선택적으로 적어도 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 조합된다. 프리바이오틱 화합물은 보통 상부 소화관에서 분해되거나 흡수되지 않는, 올리고당류 또는 다당류와 같은 소화-불가능한 탄수화물, 또는 당 알코올이다. 알려진 프리바이오틱에는 이눌린 및 트랜스갈락토-올리고당류와 같은 상업적 제품이 포함된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 프로바이오틱 조성물에는 조성물의 총 중량 대비 약 1 내지 약 30중량%(예로 5 내지 20중량%)의 양으로 프리바이오틱 화합물이 포함된다. 탄수화물은 프룩토-올리고당류(또는 FOS), 단쇄 프룩토-올리고당류, 이눌린, 이소말트-올리고당류, 펙틴, 자일로-올리고당류(또는 XOS), 키토산-올리고당류(또는 COS), 베타-글루칸, 변형된 아라블(arable) 검 및 내성 전분, 폴리덱스트로스, D-타가토스, 아카시아 섬유, 구주콩나무, 귀리, 및 시트러스 섬유로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 양태에서, 프리바이오틱은 단쇄 프룩토-올리고당류이다(단순성을 위해 아래에서 FOSs-c.c로 나타냄); 상기 FOSs-c.c.는 일반적으로 첨채당의 전환에 의해 수득되며 3개의 글루코스 분자가 결합되는 당류 분자를 포함하는, 소화 불가능한 탄수화물이다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 적합한 부형제의 예는 참고문헌[55]에서 확인될 수 있다. 치료 용도를 위해 허용 가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 참고문헌[56]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예에는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 소르비톨 등이 포함된다. 적합한 희석제의 예에는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다. 약학 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도되는 투여 경로 및 표준 약학 관습에 관해 선택될 수 있다. 약학 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이에 부가하여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예에는 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제와 같은 천연당, 아카시아, 트래거캔스 또는 나트륨 알기네이트와 같은 천연 및 합성 검, 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적합한 윤활제의 예에는 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드 등이 포함된다. 보존제, 안정화제, 염료 그리고 심지어 풍미제가 약학 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예에는 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르가 포함된다. 항산화제 및 현탁화제도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 식품은 영양 보충제에서와 같이, 본 발명의 치료 효과에 부가하여 영양적 이점을 제공할 수 있다. 유사하게, 식품은 본 발명의 조성물의 맛을 증강시키거나 조성물을 약학 조성물보다는 일반 음식 품목과 더 유사하게 하여 소비자에게 더 매력적으로 만들도록 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 우유-기재 제품으로 제형화된다. 용어 "우유-기재 제품"은 다양한 지방 함량을 갖는 임의의 액체 또는 반고체 우유- 또는 유장-기재 제품을 의미한다. 우유-기재 제품은, 예로, 우유, 염소유, 양유, 탈지유, 전유, 임의의 가공 없이 분유 및 유장으로부터 재조합된 우유, 또는 요거트, 커들링화 우유, 커드, 사워 밀크, 사워 전유, 버터 밀크 및 다른 사워 밀크 제품과 같이 가공된 제품일 수 있다. 또 다른 중요한 그룹에는 유장 음료, 발효유, 농축유, 영아용 또는 유아용 우유와 같은 우유 음료; 풍미유, 아이스크림; 단 음식(sweets)과 같은 우유-함유 음식이 포함된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 단일 박테리아 균주 또는 종을 함유하고 임의의 다른 박테리아 균주 또는 종을 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 단일 박테리아 종을 함유하고 임의의 다른 박테리아 종을 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 단일 박테리아 균주를 함유하고 임의의 다른 박테리아 균주를 함유하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 비피도박테리움 브리브 종만의 박테리아를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 단지 최소로 또는 생물학적으로 무관한 양의 다른 박테리아 균주 또는 종을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 다른 유기체 종이 실질적으로 없는 배양물일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 다른 유기체 종이 실질적으로 없는 동결건조물일 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 초과의 박테리아 균주 또는 종을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내의 하나 초과의 균주(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45 종 초과의 균주)를 포함하고, 임의적으로, 임의의 다른 종의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내의 50 종 미만의 균주(예를 들어 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3 종 미만의 균주)를 포함하고, 임의적으로, 임의의 다른 종의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내의 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, 또는 31-50 종의 균주를 포함하고, 임의적으로, 임의의 다른 종의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 속 내의 하나 초과의 종(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 또는 40 초과의 종)을 포함하고, 임의적으로, 임의의 다른 속의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 속 내의 50 종 미만(예를 들어 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3 종 미만)의 종을 포함하고, 임의적으로, 임의의 다른 속의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 속 내의 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, 또는 31-50 종을 포함하고, 임의적으로, 임의의 다른 속의 박테리아를 함유하지 않는다. 본 발명은 전술한 것의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물은 미생물 컨소시엄을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물은 미생물 컨소시엄의 일부로 비피도박테리움 브리브 박테리아 균주를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 비피도박테리움 브리브 박테리아 균주는 블라우티아(Blautia) 속 및/또는 장에서 공생적으로 생체내에서 살아있을 수 있는 다른 속으로부터의 하나 이상(예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20 종)의 다른 박테리아 균주와 조합하여 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물은 상이한 속으로부터의 박테리아 균주와 조합하여 비피도박테리움 브리브의 박테리아 균주를 포함한다. 또 다른 예에서, 조성물은 비피도박테리움 속으로부터의 박테리아 균주와 조합하여 비피도박테리움 브리브의 박테리아 균주를 포함하거나 또는 조성물은 비피도박테리움 속으로부터의 박테리아 균주 및 상이한 속으로부터의 박테리아 균주와 조합하여 비피도박테리움 브리브의 박테리아 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 컨소시엄은 단일 유기체, 예를 들어 인간의 배설물 샘플로부터 수득된 2 종 이상의 박테리아 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 컨소시엄은 자연에서 함께 발견되지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 미생물 컨소시엄은 적어도 2 종의 상이한 유기체의 배설물 샘플로부터 수득된 박테리아 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 2 종의 상이한 유기체는 동일한 종, 예를 들어 2 종의 상이한 인간으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 2 종의 상이한 유기체는 유아 인간 및 성인 인간이다. 일부 구현예에서, 2 종의 상이한 유기체는 인간 및 비-인간 포유동물이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 비피도박테리움 브리브 균주와 동일한 안전성 및 치료 효능 특징을 갖지만, 수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 비피도박테리움 브리브 균주가 아닌 박테리아 균주를 추가로 포함한다.

본 발명의 조성물이 하나 초과의 박테리아 균주, 종 또는 속을 포함하는 일부 구현예에서, 개별 박테리아 균주, 종 또는 속은 별개, 동시 또는 순차적 투여를 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하나 초과의 박테리아 균주, 종 또는 속을 모두 포함할 수 있거나, 또는 박테리아 균주, 종 또는 속은 별도로 저장될 수 있고 별도로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 박테리아 균주, 종 또는 속은 별도로 저장되지만 사용 전에 함께 혼합된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 박테리아 균주는 인간 성인 배설물로부터 수득된다. 본 발명의 조성물이 하나 초과의 박테리아 균주를 포함하는 일부 구현예에서, 박테리아 균주는 모두 인간 성인 배설물로부터 수득되거나 또는 다른 박테리아 균주가 존재하는 경우, 최소량으로만 존재한다. 박테리아는 인간 성인 배설물로부터 수득되고 본 발명의 조성물에 사용된 후에 배양되었을 수 있다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 비피도박테리움 브리브 박테리아 균주는 본 발명의 조성물에서 유일한 치료 활성제(들)이다. 일부 구현예에서, 조성물에서 박테리아 균주(들)는 본 발명의 조성물에서 유일한 치료 활성제(들)이다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 마케팅 승인을 요구할 수 있거나 또는 요구하지 않을 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 상기 박테리아 균주는 동결건조된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 상기 박테리아 균주는 분무 건조된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 균주는 동결건조되거나 또는 분무 건조되고 살아있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 균주는 동결건조되거나 또는 분무 건조되고 생존가능하다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 균주는 동결건조되거나 또는 분무 건조되고 장을 부분적으로 또는 전체적으로 콜로니화할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 균주는 동결건조되거나 또는 분무 건조되고 생존가능하며 장을 부분적으로 또는 전체적으로 콜로니화할 수 있다.

일부 경우에서, 동결건조된 또는 분무 건조된 박테리아 균주는 투여 전에 재구성된다. 일부 경우에서, 재구성은 본원에서 기재된 희석제의 사용에 의한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 감소된 면역 반응을 매개하는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 균주의 양은 조성물의 중량에 대해 그램 당 약 1 × 10³ 내지 약 1 × 10¹¹ 콜로니 형성 단위이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 1 g, 3 g, 5 g 또는 10 g의 용량으로 투여된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 경구, 직장, 피하, 비강, 협측, 및 설하로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 투여된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨 및 소르비톨로 구성되는 군으로부터 선택되는 담체를 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 에탄올, 글리세롤 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 희석제를 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래거캔스, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 부형제를 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 보존제, 항산화제 및 안정화제 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르로 구성되는 군으로부터 선택되는 보존제를 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 상기 박테리아 균주는 동결건조된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물이 약 4℃ 또는 약 25℃에서 밀봉 용기에 보관되고 용기가 50% 상대 습도를 갖는 분위기에 배치되는 경우, 적어도 약 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 1.5년, 2년, 2.5년 또는 3년의 기간 후 콜로니 형성 단위로 측정되는 적어도 80%의 박테리아 균주가 유지된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 밀봉된 용기에 제공된다. 일부 구현예에서, 밀봉된 용기는 샤셰(sachet) 또는 병이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 주사기에 제공된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약제학적 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 정제 또는 캡슐로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐은 젤라틴 캡슐("gel-cap")이다. 캡슐은 경질 또는 연질 캡슐일 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 연질 캡슐이다. 연질 캡슐은 예를 들어, 글리세롤, 소르비톨, 말티톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 연화제의 첨가로 인해 캡슐 쉘에 존재하며 특정 탄성 및 연성을 가질 수 있는 캡슐이다. 연질 캡슐은 예를 들어, 젤라틴 또는 전분을 기반으로 생성될 수 있다. 젤라틴-기반 연질 캡슐은 다양한 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 경구 또는 직장과 같은 투여 방법에 따라, 연질 캡슐은 다양한 형상을 가질 수 있으며, 예를 들어, 원형, 타원형, 직사각형 또는 어뢰 형상일 수 있다. 연질 캡슐은 예를 들어, Scherer 공정, Accogel 공정 또는 액적 또는 취입 공정과 같은 통상적인 공정에 의해 생성될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구로 투여된다. 경구 투여는 화합물이 위장관으로 들어가도록 삼키기를 수반할 수 있다.

경구 투여에 적합한 약제학적 제형은 정제와 같은 고체 플러그, 고체 미립자, 반고체 및 액체(다중 상 또는 분산 시스템 포함); 다중- 또는 나노-미립자, 액체(예를 들어 수용액), 에멀젼 또는 분말을 함유하는 연질 또는 경질 캡슐; 로젠지(lozenge)(액체-충전 포함); 츄(chew); 겔; 빠른 분산 투여 형태; 필름; 질좌제(ovule); 스프레이; 및 협측/점막부착 패치를 포함한다.

일부 구현예에서 약제학적 제형은 장용성 제형, 즉, 본 발명의 조성물을 경구 투여에 의해 장에 전달하기에 적합한 위장-내성 제형(예를 들어, 위 pH에 내성)이다. 장용성 제형은 박테리아 또는 조성물의 또 다른 성분이 산-민감한 경우, 예를 들어 위장 조건 하에 분해되기 쉬운 경우 특히 유용할 수 있다.

일부 구현예에서, 장용성 제형은 장용성 코팅을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 장용성-코팅된 투여 형태이다. 예를 들어, 제형은 장용성-코팅된 정제 또는 장용성-코팅된 캡슐 등일 수 있다. 장용성 코팅은 통상적인 장용성 코팅, 예를 들어, 경구 전달을 위한 정제, 캡슐 등에 대한 통상적인 코팅일 수 있다. 제형은 필름 코팅, 예를 들어, 장용성 중합체, 예를 들어 산-불용성 중합체의 박막 층을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 장용성 제형은 본질적으로 장용성, 예를 들어, 장용성 코팅이 필요하지 않은 위장-내성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 제형은 장용성 코팅을 포함하지 않는 장용성 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 열 겔화 물질로 만들어진 캡슐이다. 일부 구현예에서, 열 겔화 물질은 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC)와 같은 셀룰로스성 물질이다. 일부 구현예에서, 캡슐은 임의의 필름 형성 중합체를 함유하지 않는 쉘을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡슐은 쉘을 포함하고 쉘은 하이드록시프로필메틸셀룰로스를 포함하고 임의의 필름 형성 중합체를 포함하지 않는다(예를 들어 [57] 참조). 일부 구현예에서, 제형은 본질적으로 장용성 캡슐(예를 들어, Capsugel의 Vcaps®)이다.

배양 방법

본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는, 예를 들어, 참고문헌[58-60]에 상세히 기재된 바와 같은 표준 미생물학 기법을 사용하여 배양될 수 있다.

배양을 위해 사용되는 고체 또는 액체 배지는 YCFA 한천 또는 YCFA 배지일 수 있다. YCFA 배지에는 (100 ㎖ 당, 근사값): 카시톤(1.0 g), 효모 추출물(0.25 g), NaHCO₃(0.4 g), 시스테인(0.1 g), K₂HPO₄(0.045 g), KH₂PO₄(0.045 g), NaCl(0.09 g), (NH₄)₂SO₄(0.09 g), MgSO₄·7H₂O(0.009 g), CaCl₂(0.009 g), 레사주린(0.1 ㎎), 헤민(1 ㎎), 바이오틴(1 ㎍), 코발라민(1 ㎍), p-아미노벤조산(3 ㎍), 엽산(5 ㎍), 및 피리독사민(15 ㎍)이 포함될 수 있다.

백신 조성물에서 사용하기 위한 박테리아 균주

본 발명자들은 본 발명의 박테리아 균주가 면역 활성의 감소와 연관된 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위해 유용함을 확인하였다. 이는 본 발명의 박테리아 균주가 숙주 면역계 상에서 가지는 효과의 결과일 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 백신 조성물로 투여되는 경우, 질환 또는 병태를 예방하기 위해 유용할 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 균주는 사멸되거나, 불활성화되거나 약독화될 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 조성물은 백신 보조제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 피하 주사를 통해서와 같이, 주사를 통해 투여하기 위한 것이다.

일반사항

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당분야의 기술 수준 내의 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상적 방법을 채택할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예로, 참고문헌[61] 및 [62,68] 등을 참고한다.

용어 "포함하는"은 "포함되는"뿐만 아니라 "구성되는"을 포괄하며, 예로 X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수도 있고 일부 추가부분, 예로 X + Y가 포함될 수도 있다.

수치값 x에 관해 용어 "약"이란 선택적이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.

용어 "실질적으로"에는 "완전히"가 배제되지 않으며, 예로 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.

2개의 뉴클레오타이드 서열 간 서열 동일성 백분율에 대한 언급은, 정렬되는 경우, 해당 백분율의 뉴클레오타이드가 2개 서열의 비교에서 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 상동성% 또는 서열 동일성%는 당분야에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 참고문헌 [69]의 섹션 7.7.18에 기재된 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 갭 개방 페널티 12 및 갭 연장 페널티 2, BLOSUM 매트릭스 62로 아핀(affine) 갭 검색을 사용하여 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 참고문헌[70]에 개시되어 있다.

구체적으로 언급되지 않는 한, 여러 단계를 포함하는 공정 또는 방법은 방법의 시작 또는 종료 시 추가 단계를 포함할 수도 있고, 또는 추가적인 개재 단계를 포함할 수도 있다. 또한, 단계는 적절한 경우 조합되거나, 생략되거나, 대안적인 순서로 수행될 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예가 본원에 기재된다. 각각의 구현예에서 명시되는 특징이 다른 특정된 특징과 조합되어 추가 구현예를 제공할 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 본원에서 적합하거나, 전형적이거나, 바람직한 것으로 강조되는 구현예는 (서로 상호 배타적인 경우를 제외하고) 서로 조합될 수 있다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌 참조는 전문이 본원에 참조로 포함된다.

제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 대한 임의의 언급은 또한 상기 치료 방법에서 사용하기 위한 제제, 뿐만 아니라 상기 치료 방법에서 제제의 용도, 및 약제의 제조에서 제제의 용도를 포괄한다.

하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

본 발명을 수행하기 위한 방식

실시예 1

요약

본 연구의 목적은 MRx0004의 시험관내 면역조절 특성을 특징화하는 것이었다. 또한, 유전체학, 전사체학 및 단백질체학의 조합을 사용하여 MRx0004에 대한 숙주 반응을 매개하는 데 역할을 할 수 있는 잠재적인 주요 이펙터를 식별하였다.

재료 및 방법

박테리아 균주, 플라스미드 및 프라이머

본 연구에서 균주를 생성하는 데 사용되는 모든 박테리아 균주 및 플라스미드 및 프라이머는 표 1에 나열되어 있다. 비. 브리브 균주를 달리 언급되지 않는 한 혐기성 작업장(Don Whitley Scientific, 영국 시플리 소재)에서 37℃에서 효모 추출물-카제인 가수분해물-지방산(YCFA) 브로스(E&O Labs, 영국 보니브릿시 소재)에서 일상적으로 배양하였다. 이. 콜라이 균주를 교반하면서 37℃에서 Luria Bertani(LB) 브로스 [71]에서 일상적으로 배양하였다. 적절한 경우, 성장 배지에 테트라사이클린(10 μg/ml), 클로람페니콜(이. 콜라이의 경우 10 μg/ml 또는 비. 브리브의 경우 3 μg/ml), 에리트로마이신(이. 콜라이의 경우 100 μg/ml 또는 비. 브리브의 경우 1 μg/ml), 스펙티노마이신(100-300 μg/ml), 또는 카나마이신(50 μg/ml)(모든 항생제는 영국 길링엄 소재의 Sigma-Aldrich로부터 입수)을 보충하였다. pORI19 또는 pWSK29를 함유하는 재조합 이. 콜라이 세포를 40 μg/ml X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드) 및 0.1 M IPTG(이소프로필-β-D-갈락토피라노시드)(둘 다 Sigma-Aldrich에서 공급)가 보충된 LB 한천에서 선택하였다.

불멸화된 세포의 일상적 배양

HT29-MTX-E12 세포(Public Health England, 영국 솔즈베리 소재)를 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS), 4 mM L-글루타민, 1 X 비필수 아미노산 용액 및 1 X 항생제 항진균제 용액이 보충된 고 글루코스 변형이 있는 둘베코 최소 이글 배지(DMEM)에서 일상적으로 배양하였다. 세포를 검정 용기에 시딩하고 9 일 동안 배양한 다음, 행크(Hank)의 균형잡힌 식염수로 2 회 세척하고 처리 시작 전에 공-배양 배지(4 mM L-글루타민, 1 X 비필수 아미노산 용액, 5 μg/ml 아포-트랜스페린 및 200 ng/ml 나트륨 셀레나이트가 보충된 DMEM)에 두었다.

공-배양 검정을 위한 박테리아 처리 준비

공-배양 실험을 위해, 박테리아가 대수기에 도달할 때까지 배양하였다. 살아있는 박테리아 세포 및 상청액을 원심분리로 분리한 다음, 살아있는 박테리아(_LV로 지정됨)를 PBS(Sigma-Aldrich)로 1 회 세척하고 후속 사용을 위해 적절한 세포 배양 배지에 재현탁하였다. 상청액(_SN으로 지정됨)을 0.22 μm 필터를 통해 통과시키고 공-배양 배지에서 적절하게 희석하였다. 열-불활성화 박테리아(_HK로 지정됨)를 80℃에서 30 분 동안 배양한 다음, PBS로 세척하고 적절한 세포 배양 배지에 재현탁함으로써 준비하였다. 생존가능한 계수를 플레이팅에 의해 확인하였다.

리포터 검정

HEK-Blue™-hTLR2 및 THP1-Blue™ NF-κB 세포를 90% 밀도로 성장시키고, PBS로 1 회 세척하고 항생제 없는 배양 배지에 각각 280,000 및 500,000 개 세포/ml의 밀도로 재현탁하였다. 박테리아 처리(살아있음, 열-사멸됨 및 상청액)를 100:1의 감염 다중도(MOI)로 세포에 첨가하였다. 양성 검정 대조군, PamCS3K4(Invivogen) 및 열-사멸된 엘. 모노키토게네스(L. monocytogenes)(HKLM)(Invivogen)를 각각 10 ng/ml 농도 및 200:1의 MOI로 사용하였다. 음성 대조군, 배지 및 비히클을 준비하여 각 처리에 대한 등가물을 제공하였다. 그 다음에 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 22 시간 동안 배양하였다. 공-배양물로부터의 배지를 QUANTI-Blue™(Invivogen)에 10 배 희석하고, 1 시간(NFκB) 또는 2 시간(TLR2) 동안 배양하였고 655 nm에서 광학 밀도를 기록하였다.

HT29-MTX 세포를 사용한 대규모 공-배양

HT29-MTX 세포를 10 cm 직경 Transwells®(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)의 상부 챔버에서 이전에 기재된 바와 같이 배양하였다. 박테리아를 후기 대수기까지 배양하고, 이전에 기재된 바와 같이 세척 및 재현탁하였다. 박테리아를 100:1의 MOI로 세포에 첨가하였고, 공-배양물을 37℃에서 혐기성 조건에서 3 시간 동안 배양하였다. 박테리아를 함유하는 배지를 트랜스웰의 상부 챔버로부터 수집하고, 5000 x g로 5-10 분 동안 원심분리하여 후속 적용을 위한 박테리아 세포를 수집하였다.

박테리아 qPCR 분석

후기 대수 및 정지 성장기에서 시험관내 배양물로부터 RNA 단리, 및 HT29-MTX를 사용한 대규모 공배양 후 박테리아를 수집하였다. 박테리아를 제조업체의 설명서에 따라 RNAProtect 박테리아 시약(QIAGEN, 독일 힐덴 소재)을 사용하여 수집 및 저장하였다. 박테리아 세포를 리소자임(15 mg/ml)(Sigma-Aldrich) 및 프로테이나제 K(6 mAU)(QIAGEN)와 함께 37℃에서 30 분 동안 배양하여 용해시킨 다음, FastPrep 24 기기(20 초 동안 6 m/s 2 회 주기), 및 Lysing Matrix B(둘 다 미국 캘리포니아주 샌타애나 소재의 MP Biomedicals로부터 입수)를 사용하여 균질화하였다. 총 RNA를 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 단리하였고, 게놈 DNA를 온-칼럼 소화에서 RNase-Free DNase(QIAGEN)를 사용하여 제거하였으며, 둘 다 제조업체의 설명서에 따랐다. cDNA를 제조업체의 설명서에 따라 Superscript IV 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 합성하였다. 프라이머를 Primer3Plus 소프트웨어를 사용하여 설계하였다 [72]. qPCR 반응을 제조업체의 권장사항에 따라 Power SYBR™ Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)로 설정하였으며, 검정을 다음 주기를 사용하여 7500 Fast Real-time PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 수행하였다: 95℃에서 10 분, 이어서 95℃에서 15 초, 60℃에서 1 분의 40 주기. 데이터는 이중 델타 Ct 분석을 사용하여 수행함으로써 분석하였고 시험 유전자의 발현을 하우스키퍼 groEL에 대해 정규화하였다.

박테리아 세포 떼내기

박테리아 세포를 후기 대수 성장기에서 원심분리하거나 또는 HT29-MTX와의 접촉 후(상세한 내용은 상기 공-배양 섹션 참조) 적절하게 수확하였다. 그 다음에 세포를 세척하고 50 mM TEAB 완충액 pH 8.5(Sigma-Aldrich)에 1/20 희석으로 재현탁하였다. 1 mM DTT(Sigma-Aldrich)가 보충된 50 mM TEAB 완충액에서 37℃에서 30 분 동안 서열분석 등급 변형된 트립신(Promega, 미국 위슨콘신주 매디슨 소재)과 함께 세포를 배양하여 떼낸 단백질 분획을 생성하였다. 각 샘플에 대해, 트립신이 없는 튜브를 탈락된 단백질에 대한 대조군(탈락된 단백질 분획)으로 동시에 배양하였다. 떼낸 및 탈락된 단백질 분획을 4℃에서 4000 x g로 15 분 동안 원심분리하여 수확하고 Millex-GV 0.22 μm 낮은 단백질 결합 막(Millipore)을 통해 주사기-여과하였다. 총 단백질 농도는 제조업체의 설명서에 따라 Pierce™ BCA 단백질 검정 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하였고 샘플 품질은 SDS-PAGE (Bio-Rad, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재, USA)에 의해 평가하였다. 생존가능한 세포 계수는 YCFA 한천에 플레이팅하여 트립신 처리 전 및 후에 수행하였다. 그 다음에 각 검정에 대해, 3 개의 생물학적 반복실험으로부터의 샘플을 나노-LC-MS/MS에 의해 분석하였다.

LC-MS/MS에 의한 단백질 식별

간단히 말해서, 배양 상청액을 0.5 ml로 농축하고 초순수로 세척하였고, 단백질을 ReadyPrep 2-D Cleanup Kit(Bio-Rad)를 사용하여 침전시키고 100 μl 50 mM 암모늄 비카르보네이트에 재현탁하였다. 그 다음에 샘플을 돼지 트립신(Promega)과 함께 16 시간 동안 37℃에서 배양하고 생성된 상청액을 진공 원심분리에 의해 건조시키고 0.1% 트리플루오로아세트산에 용해하였다. 펩티드를 μ-C18 ZipTips(Merck, 미국 뉴저지주 케닐워스 소재)를 사용하여 추가로 탈염하고 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 용출하고, 진공 원심분리에 의해 건조시키고 10 μl LC-MS 로딩 용매(2% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)에 용해하였다. 펩티드를 15-cm PepMap 칼럼, 60-분 LC-MS 획득 방법 및 5 μl의 주입 부피를 사용하여 나노LC-MS/MS(Q Exactive 하이브리드 사중극-Orbitrap MS 시스템)(Thermo Fisher Scientific)에 의해 분리 및 식별하였다. 떼낸 및 탈락된 단백질 분획에 대해, 70 μl 50 mM 암모늄 비카르보네이트를 30 μl의 샘플에 직접 첨가하였다. 그 다음에 샘플을 돼지 트립신(Promega)과 함께 밤새 37℃에서 배양하였고 생성된 상청액을 -70℃에서 동결시키고, 진공 원심분리에 의해 건조시키고 20 μL의 LC-MS 로딩 용매에 용해시켰다. 펩티드를 25-cm PepMap 칼럼, 60-분 LC-MS 획득 방법, 및 2 μL의 주입 부피를 사용하여 나노LC-MS/MS(Q Exactive 하이브리드 사중극-Orbitrap MS 시스템, Thermo Scientific)에 의해 분리 및 식별하였다. 데이터 분석은 Proteome Discoverer(Thermo Fisher Scientific)로 수행하였다. Mascot Server를 다음 매개변수와 함께 검색 엔진으로 사용하였다: 효소 = 트립신, 최대 혼합된 절단 부위 = 2, 전구체 질량 허용오차 = 10 ppm, 동적 변형 = 산화(M), 정적 변형 = 카르바미도메틸(C). 식별된 펩티드는 비. 브리브 MRx0004의 서열분석된 게놈(2,047 개 서열)을 기반으로 하여 구축된 균주-특이적 단백질 서열 데이터베이스와 일치하였다. 단백질 식별은 적어도 5 개의 펩티드가 3 개의 생물학적 반복실험 모두에서 식별되었을 때 유효한 것으로 간주되었다.

비. 브리브 MRx0004-EPS ^neg 의 보완

유전자 pGTF를 암호화하는 1차 글리코실 트랜스퍼라제 및 이의 추정된 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 Q5 High-Fidelity Polymerase(New England BioLabs, 영국 헤리퍼드셔주 소재) 및 프라이머 쌍: pGTFcompF 및 pGTFcompR을 사용하여 비. 브리브 MRx0004 염색체 DNA로부터 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 생성된 단편을 HinDIII 및 XbaI(둘 다 미국 매사추세츠주 입시치 소재의 New England Biolabs에서 입수)로 소화시키고 유사하게 소화된 pBC1.2에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 전기적 형질전환에 의해 이. 콜라이 EC101으로 도입한 다음 형질전환체를 Cm-내성에 기초하여 선택하였다. 다수의 Cm-내성 형질전환체의 플라스미드 함량을 제한 분석에 의해 스크리닝하였다. 다수의 재조합 플라스미드에서 클로닝된 삽입물의 완전성은 이. 콜라이 EC101 pWSK29-MRX-M+S에 도입하기 전에 서열분석하여 메틸화를 용이하게 함으로써 확인하였다. 메틸화된 pBC1.2 또는 pBC1.2-pGTF를 Tet 및 Cm이 보충된 Reinforced Clostridial Agar(RCA; Thermo Fisher Scientific)에서 선택과 함께 전기천공법에 의해 MRx0004-EPS^neg로 형질전환시켰다. 형질전환체를 콜로니 PCR, 플라스미드 DNA의 제한 분석을 사용하여 플라스미드 함량에 대해 확인하고, 서열분석에 의해 검증하였다. 생성된 균주는 비. 브리브 MRx0004-EPS^--pBC1.2 및 MRx0004- EPS^--pBC1.2-pGTF로 지정하였다.

HT29-MTX 세포로부터의 사이토카인 분석

살아있는 박테리아(이전에 기재된 바와 같이 준비됨)를 HT29-MTX 세포와 함께 24 웰 플레이트에서 100:1의 MOI로 3 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 공-배양하였다. 그 다음에 인간 재조합 TNFα(PeproTech, 미국 뉴저지주 로키 힐 소재)를 10 ng/ml로 세포에 첨가한 후, 공-배양물을 추가 24 시간 동안 배양한 다음, 상청액을 수집하고 12000 x g로 3 분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 상청액의 IL-8 수준은 제조업체의 권장 사항에 따라 인간 IL-8(CXCL8) 표준 ABTS ELISA Development Kit(PeproTech)를 사용하여 분석하였다.

PBMC와 함께 공-배양

건강한 동결된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 STEMCELL Technologies(영국 케임브리지 소재)로부터 구입하였다. 세포를 해동시키고 37℃ 및 5% CO₂에서 완전 성장 배지인 10% FBS, 2mM L. 글루타민 및 100 U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640(Sigma-Aldrich로부터의 모든 시약)에 밤새 두었다. 박테리아 처리를 이전에 기재된 바와 같이 준비하였다. 공-배양을 위해, 세포를 48 웰 플레이트에 750,000 개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고 적절한 비히클 및 5ug/ml PHA(Sigma-Aldrich)를 대조군으로 사용하여 열-불활성화 박테리아, 및 MOI 10:1의 박테리아 상청액과 공-배양하였다. 공-배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 72 시간 동안 배양한 후, 세포를 수집하고 4℃에서 3 분 동안 10000 x g로 원심분리하였다. 무세포 상청액을 수집하고 사이토카인 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 세포 펠릿을 1 회 세척한 다음 얼음 상에서 PBS에 재현탁하였다.

유세포 분석

처리 웰을 풀링하여 그룹 당 1.5 x 10⁶ 개 PBMC를 제공하고, 150ul PBS에 재현탁하고 염색 준비가 된 96 V-바닥 플레이트로 옮겼다. 세포를 먼저 Viobility 405/520 Fixable Dye(Miltenyi Biotec Ltd. 독일 베르기슈 글라트바흐 소재)로 염색하여 실온에서 암실에서 10 분 동안 살아있는 세포 및 죽은 세포를 구별하였다. 그 다음에 CD3, CD4, CD8, CD25, CD127 및 CD19에 대한 항체 칵테일로 염색하여 세포 표현형을 결정하고(Miltenyi REA 항체) 실온에서 추가 10 분 동안 배양하였다. 그 다음에 세포를 세척하고 PBS에 재현탁하고 즉시 유세포 분석을 통해 분석하였다. 이소형은 첫번째 실험 동안 모든 항체에 대해 사용되어 게이트 설정을 도왔고 FMO 대조군은 모든 실험 전반에 걸쳐 포함되었다. 모든 실험은 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences, 영국 레딩 소재)를 사용하여 "Live" 게이트에서 100,000 개 세포에 대한 획득 설정에 대한 중지 게이트가 있는 BD FACS Aria II를 사용하여 수행하였다. 분석은 Flowjo 버전 10.4.2 소프트웨어(FlowJo LLC, 미국 오레곤 소재)를 사용하여 수행하였고 생존력 염료로 식별된 살아있는 세포를 기반으로 하였다.

사이토카인 분석

PBMC 공-배양물로부터의 무세포 상청액의 사이토카인 정량화를 제조업체의 권장 사항에 따라 맞춤형 ProcartaPlex 멀티플렉스 면역검정(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해서, 50 μl의 상청액을 xPONENT 소프트웨어(Luminex, 미국 텍사스주 오스틴 소재)와 함께 MAGPIX® MILLIPLEX® 시스템(Merck)을 사용하여 처리하였다. 데이터는 평균 형광 강도(MFI)를 pg/ml 값으로 변환하기 위해 5-매개변수 로지스틱 곡선 및 배경 차감을 사용하여 MILLIPLEX® 분석 소프트웨어(Merck)를 사용하여 분석하였다.

데이터 분석

통계 분석은 미국 캘리포니아주 라호이아 소재의 GraphPad Software의 윈도우용 GraphPad Prism 버전 7.00을 사용하여 수행하였다. 데이터는 일원 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다. 벤 다이어그램은 Interactivenn을 사용하여 생성하였다 [73].

결과

MRx0004는 NFκB 및 TLR2 리포터 세포를 자극한다

THP-1-NFκB 리포터 세포주를 이용하여 선천적 면역의 조절에서 필수적인 역할로 인해 전염증성 전사 인자 NFκB의 활성화에 대한 MRx0004의 영향을 조사하였다. 열-사멸된 리스테리아 모노키토게네스(Listeria monocytogenes)(HKLM)(InvivoGen)를 본 검정을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 이 균주의 효과적인 분획(들)을 식별하기 위해, THP-1-NFκB 세포를 살아있는 박테리아(MRx0004_LV), 박테리아 배양 상청액(MRx0004_SN) 및 열-불활성화 박테리아(MRx0004_HK)의 처리와 함께 공-배양하였다. 3 개의 박테리아 처리는 모두 처리되지 않은 세포 및 박테리아 성장 배지(YCFA)의 음성 대조군과 비교하여 NFκB를 유의하게 활성화시켰다(모든 비교에 대해 p < 0.0001)(도 7A). MRx0004_LV는 가장 효과적인 처리였으며 MRx0004_SN 및 MRx0004_HK보다 유의하게 더 큰 자극이었다(두 비교에 대해 p < 0.0001). 결과적으로 MRx0004_HK는 MRx0004_SN보다 유의하게 더 활성이었다(p = 0.006).

MRx0004는 NFκB를 활성화시키는 것으로 제시되었으므로, 상류 수용체 TLR2, TLR4, TLR5 및 TLR9를 자극하는 MRx0004의 능력을 조사하였다. 예비 데이터는 MRx0004가 TLR4, TLR5 및 TLR9를 활성화시키지 않았음을 시사하였다(데이터는 제시되지 않음). HEK-TLR2 리포터 검정을 양성 대조군 Pam3CSK4 및 동일한 MRx0004 처리 및 상기 기재된 바와 같음 음성 대조군으로 처리하였다(도 7B). 모든 MRx0004 처리는 음성 대조군과 비교하여 TLR2를 자극하였다(모든 비교에 대해 p < 0.0001). MRx0004_LV는 MRx0004_SN(p < 0.0001) 및 MRx0004_HK (p < 0.0001)에 비해 가장 자극적인 치료였으며, 후자는 최소 효과적인 치료였다. 이들 데이터에 기초하여, MRx0004는 TLR2-관련 방식으로 선천적 면역 반응을 강력하게 자극할 수 있다.

MRx0004의 전사 및 단백질체 프로파일링은 잠재적인 숙주 반응 이펙터를 나타낸다

MRx0004에서 숙주 반응의 잠재적인 이펙터를 식별하기 위해, 세 가지 접근법을 이용하였다. 표적화된 전사 검정을 이용하여 비피도박테리아-숙주 상호작용의 알려진 이펙터로서 예측된 동일성을 가진 10 개의 MRx0004 유전자를 분석하였다(데이터는 제시되지 않음). 이들은 예측된 부착소 및 야습 단백질(oppA, 에놀라제, 트랜스아돌라제, tadA, eftU, 풀루라나제를 코딩하는 유전자([74]에서 광범위하게 검토됨), 및 콜로니화 및 면역 조절에서 추정 역할(MRx0004 EPS 유전자좌 [75], luxS [76] 및 세르핀 [77]의 1차 글리코실트랜스퍼라제(pGTF)) 및 추정 치료 효과(pks [78])를 갖는 유전자를 포함하였다. 이들 유전자의 발현은 액체 배양물에서 후기 대수기 및 정지기까지 성장한 MRx0004로부터 단리된 RNA에서 분석하고, 대규모 트랜스웰에서 배양된 HT29-MTX 세포와 3 시간 접촉 후 분석하였다. qPCR 분석(도 8)은 eftU, 에놀라제 및 pGTF가 정지기에 비해 후기 대수기에서 유의하게 상향조절된 반면, oppA, 풀루라나제, 세르핀 및 tadA의 발현은 후기 대수기에서보다 정지기에서 유의하게 더 높았음을 입증하였다. 6 개의 유전자(eftU, 에놀라제, pGTF, oppA, 세르핀 및 트랜스아돌라제)는 후기 대수기에 비해 장내 상피 세포(IEC)에 반응하여 유의하게 상향조절되었다. 이 분석에서 MRx0004의 유전자 발현은 IEC와의 접촉에 의해 변경되어, MRx0004-숙주 상호작용에서 상향조절된 유전자에 대한 잠재적인 역할을 추론하는 것이 분명하였다. 이 qPCR 분석에서 유의하게 상향조절된 유전자 대부분은 IEC에 대한 부착력에서 역할이 예측되었으며, 이는 MRx0004의 중요한 기능적 특성일 수 있음을 시사한다.

MRx0004에 의한 추가 숙주-반응 이펙터의 발현은 배양 상청액 및 세포 표면에 존재하는 단백질을 식별함으로써 추가로 특징화하였다. 나노-LC-MS/MS 분석은 MRx0004_SN에서 64 개의 단백질을 식별하였다(표 2). 가장 높은 수의 펩티드 일치(PSM)로 식별된 단백질은 풀루라나제((351.33 ± 33.62), 2 개의 NlpC/P60 패밀리 단백질(82 ± 15.62 및 71.67 ± 13.61), ABC 수송체 시스템의 용질-결합 단백질(56 ± 7) 및 세포 분열 단백질 FtsI(56 ± 4.36)였다. 비. 브리브 및 다른 박테리아 종에서 숙주-상호작용에 수반되는 여러 야습 단백질이 식별되었으며, 트랜스아돌라제(32.67 ± 3.79), GAPDH(30 ± 3.61), DnaK(17.67 ± 3.21), GroEL(12.67 ± 0.58) 및 에놀라제(5.67 ± 0.58)가 포함된다 [74, 79-84].

MRx0004 세포의 표면에 존재하는 단백질의 식별은 효소 세포-떼내기 접근법을 사용하여 수행하였다. 박테리아 세포를 트립신을 사용하여 떼내고 절단된 표면-관련된 단백질을 LC-MS/MS를 확인하여 식별하였다(떼낸 단백질 분획). 트립신이 없는 대조군으로부터의 단백질을 또한 수확하고 LC-MS/MS에 의해 분석하여, 표면에 느슨하게 결합된 단백질을 식별하였다(탈락된 단백질 분획). 총 106 개의 떼낸 단백질을 식별하였으며, 이 중 44 개는 세포 벽에 고정된 것으로 예측되었다(즉, 떼낸 단백질 분획에 존재하고 탈락된 단백질 분획에는 없음), (표 3, 도 15). MRx0004_SN에 대해 관찰된 바와 같이, 식별된 가장 풍부한 떼낸 단백질은 풀루라나제(136.67 ± 17.47)였으며, 이는 또한 탈락된 단백질 분획에서도 검출되었다(79 ± 10.54). 흥미롭게도, 유형 I 폴리케티드 신타제를 또한 세포 떼낸 분획 둘 다에서 식별하였지만, 탈락된 단백질 분획에서보다 떼낸 단백질 분획에서 더 많은 일치 펩티드를 식별하였다(각각 11.67 ± 6.43 및 54.67 ± 10.69). MRx0004_SN에 존재하고 상기 나열된 모든 야습 단백질은 또한 MRx0004 세포 떼내기 분획에서 검출되었다(표 3). 또한, EfTu는 떼낸 및 탈락된 단백질 분획 둘 다에서 식별되었다(각각 PSM = 32 ± 5 및 24.33 ± 8.39). qPCR에 의해 분석된 5 개의 유전자(eftU, 에놀라제, luxS, 풀루라나제 및 트랜스아돌라제)가 또한 세포 떼내기 및 상청액 데이터세트 중 하나 또는 둘 다에서 검출되었으며, 따라서 이들 유전자의 번역을 확인하였다. 전사 및 단백질체 데이터세트의 데이터는 집합적으로 MRx0004에서 관심있는 잠재적인 신규 이펙터를 식별하게 하였다.

흥미롭게도, 세포 떼내기 데이터세트에서 가장 풍부한 단백질인 녹말 분해성 효소 풀루라나제는 시험관내에서 당단백질 및 숙주 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 부착력에 수반되는 것으로 보고된 야습 단백질이다 [85,86]. 또한, 비. 아니말리스 하위종 락티스(B. animalis subsp. lactis)로부터의 DnaK 및 에놀라제 [82,83] 및 비. 롱검으로부터의 EfTu [87]는 시험관내에서 플라스노미겐에 부착하는 것으로 보고되었다. 또한, 엘. 락티스(L. lactis)에서 비. 비피듐(B. bifidum) A8의 당 분해성 효소 트랜스아돌라제의 재조합 발현은 뮤신에 대한 이 균주의 부착성을 증가시켰다 [84]. MRx0004에 의한 이들 야습 단백질의 생산은 이들이 MRx0004의 부착력에 역할을 할 수 있고, 따라서 숙주 세포 표면과의 상호작용을 용이하게 할 수 있음을 시사한다. 특이적 숙수 세포 수용체 및 신호전달 경로에 대한 비피도박테리아 야습 단백질의 효과는 아직 기재되지 않았으며, 이들은 MRx0004가 숙주와 상호작용하는 것을 통해 MRx0004에 대한 신규 조절 경로를 나타낼 수 있다.

MRx0004에 의한 선천적 면역 반응의 조절 특징 조사

추가 실험을 수행하여 MRx0004에 대한 숙주 반응을 특징화하였다.

이 연구를 지원하기 위해, 균주(EPS^neg)를 구축하여 EPS 유전자좌의 pGTF 유전자를 삽입 돌연변이유발을 통해 불활성화시켰다(도 16a). 이 균주를 [88]에 기재된 방법을 활용하여 구축하였지만, 유형 II 제한-변형(RM) 시스템보다는, MRx0004 유형 I RM 시스템의 메틸라제 및 특이성 서브유닛을 발현하고 사용하여 형질전환 전에 플라스미드 DNA를 메틸화하였다. 보완된 EPS^neg 균주(EPS^comp) 및 EPS^neg 빈 벡터 균주(EPS^vec)를 또한 대조군으로 생성하였다.

TLR2 및 NFκB 활성화에 대한 EPS의 영향은 HEK-TLR2 및 THP-1-NFκB 리포터 세포를 MRx0004, EPS^neg, EPS^vec 및 EPS^comp의 살아있는 처리 및 상청액 처리와 함께 공-배양하여 평가하였다. 모든 살아있는 박테리아 처리는 활성화된 TLR2를 필적할만한 정도로 활성화시켰다(도 12a). 대조적으로, MRx0004_LV에 의한 NFκB의 활성화는 EPS^neg _LV(p = 0.003) 및 EPS^vec _LV(p = 0.009)보다 유의하게 더 낮았지만_, EPS^comp _LV는 그렇지 않았다(도 12b). MRx0004_SN 및 EPS^comp _SN 사이의 TLR2 및 NFκB 활성화에는 차이가 없었으며, 이 경우 야생형 및 보체가 유사한 표현형을 나타냄을 입증한다. EPS^neg _SN 및 EPS^vec _SN은 MRx0004_SN보다 TLR2(둘 다에 대해 p < 0.0001) 및 NFκB(각각 p = 0.002 및 0.0013)에 대해 유의하게 더 많은 자극이 있었다. 이들 데이터는 MRx0004에 의한 TLR2 활성화가 EPS를 통해 직접 매개되지 않음을 시사한다. 대조적으로, NFκB의 활성화는 EPS의 부재 하에 MRx0004 세포 표면의 노출에 반응하여 증가된다. 이들 데이터는 MRx0004에 의한 효과적인 면역조절이 전체 온전한 세포를 사용하여 가장 잘 달성되고, TLR2에 대한 MRx0004 리간드가 주로 세포 표면-관련되어 있지만, 또한 탈락되거나 또는 분비될 수 있음을 시사한다.

IEC 염증의 시험관내 모델에 대한 MRx0004 및 이의 유도체 균주의 영향을 또한 조사하였다. HT29-MTX 세포를 MRx0004 및 이의 유도체로 3 시간 동안 프라이밍한 후, TNFα를 염증 자극제로 추가 24 시간 동안 웰에 첨가하였다. 이 모델을 사용하여, MRx0004는 무박테리아 대조군과 비교하여 TNFα-매개된 IL-8 분비를 감소시키지 않았다(도 12c). 그러나, 비-TNFα-자극된 세포에서 IL-8 분비는 기준선 대조군에 비해 MRx0004 처리에 의해 감소되었다. EPS^neg 처리는 MRx0004에 비해 TNFα-유도된 IL-8 분비를 유의하게 감소시켰다(p < 0.0001). EPS^vec- 및 EPS^comp-처리된 세포에서 IL-8 분비는 또한 MRx0004에 대한 반응에서보다 유의하게 더 낮았다(두 비교에 대해 p < 0.0001). 흥미롭게도, 표면-관련된 항원의 비차폐는 리포터 검정에서 EPS^neg에 의해 입증된 효과와는 대조적으로, IEC에 대한 항염증 효과가 있음을 나타낸다.

적응 면역 반응에 대한 MRx0004의 영향

적응 면역계에 대한 MRx0004의 효과를 조사하기 위해, 건강한 인간 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 세포 집단 및 사이토카인 분비 프로파일을 특징화하였다. 이 검정에서 PHA를 양성 대조군으로 사용하였다(데이터는 제시되지 않음). PBMC를 열-불활성화 박테리아 세포 및 MRx0004 및 이의 유도체 균주로부터의 무세포 배양 상청액과 함께 72 시간 동안 공-배양하였다. T-세포(CD3⁺CD4⁺ 및 CD3⁺CD8⁺), Treg(CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^-) 및 B-세포(CD3^-CD19⁺) 표면 마커의 발현을 (활성화 마커 CD25와 함께) 유세포 분석에 의해 분석하였다(게이팅 전략에 대해 도 18 참조). 살아있는 박테리아는 72 시간 배양 기간 동안 영양을 위해 성장하고 인간 세포를 능가할 가능성이 있기 때문에 이 모델에서 살아있는 박테리아보다 열-불활성화된 것을 처리로서 사용하였다. 시험된 모든 균주로부터의 박테리아 상청액과 반응한 세포 표면 마커 및 사이토카인 둘 다의 발현은 비히클(YCFA)과 반응하여 관찰된 것에 비해 유의하게 상이하지 않았다(데이터는 제시되지 않음). EPS^vec 및 EPS^comp에 대한 데이터는 도 20 및 21에 도시되어 있다.

MRx0004_HK 처리는 처리되지 않은 대조군에 비해 활성화된 CD8⁺CD25⁺ 아집단에서 유의한 증가를 초래하였지만(p = 0.0038, 도 13A), EPS^neg _HK는 대조군에 비해 활성화된 CD8⁺CD25⁺ 세포의 백분율을 유의하게 증가시키지 않았다. MRx0004_HK도 EPS^neg _HK도 대조군에 비해 CD8⁺, CD4⁺ 또는 CD4⁺CD25⁺ T-세포 집단의 백분율을 유의하게 증가시키지 않았다(도 19A 및 B, 도 13B). B 세포 집단은 처리되지 않은 세포와 비교하여 MRx0004_HK 및 EPS^neg _HK 둘 다에 의해 유사하고 통계적으로 유의한 정도로 증가하였다(각각 p = 0.001 및 0.0013, 도 13E). B-세포 활성화(CD19⁺CD25⁺)는 임의의 적용된 처리에 의해 유의한 영향을 받지 않았다(도 19-C). CD4⁺ 세포 집단 내에서, Treg 세포의 집단을 CD25⁺CD127^- 표면 마커를 사용하여 분석하였다. 처리되지 않은 세포와 비교할 때 EPS^neg _HK 처리된 PBMC에서 Treg의 상대적 백분율 증가를 관찰하였지만 MRx0004_HK PBMC는 그렇지 않았다(p = 0.0014, 도 13C). EPS^neg _HK는 MRx0004_HK에 비해 Treg를 증가시켰다(p = 0.0196). 처리되지 않은 세포와 비교하여 MRx0004HK 처리에서 조절 T 세포 반응에 대한 Treg/CD8⁺ 비의 왜곡을 관찰하였다(p = 0.0008, 도 13D. 또한, MRx0004_HK와 반응하여 증가된 CD8⁺ 양성 왜곡은 EPS^neg _HK에 대한 것보다 유의하게 더 높았다(p = 0.0272, 도 13D). 종합해 보면, 이들 데이터는 MRx0004의 면역 자극 효과를 확인하고 EPS의 손실이 Treg 및 Treg/CD8⁺ 비의 증가된 자극 및 감소된 면역 자극 효과를 초래할 수 있음을 시사한다. EPS는 CD8⁺ 세포의 활성화에서 역할을 할 수 있지만 B-세포 집단을 유의하게는 조절하는 데 수반되는 것처럼 보이지 않는다.

MRx0004_HK 및 EPS^neg _HK로 처리된 PBMC의 분비된 사이토카인 표시는 또한 Th1(IL-12p70, IFNγ, TNFα), Th2(IL-4), Th17(IL-17α, IL-1β), 및 Treg(IL-10) 집단과 주로 관련된 사이토카인을 정량화함으로써 결정하였다. TNFα, IL-12p70, IFNγ, IL-4 및 IL-17α는 처리되지 않은 세포에 비해 MRx0004_HK 처리에 의해 유의하게 증가하였다(각각 p = 0.0038, 0.0025, 0.0036, 0.027 및 0.0316, 도 14A-D). EPS^neg _HK 처리는 TNFα, IFNγ, IL-1β, IL-10 및 IL-17α에서 유의한 반응을 유도하였다(각각 p = 0.0001, 0.0267, < 0.0001, 0.0004, 및 0.0103, 도 14A, C, E-G). MRx0004_HK와는 대조적으로, EPS^neg _HK는 처리되지 않은 세포와 비교하여 IL-12p70 또는 IL-4 분비를 유의하게 증가시키지 않았다. MRx0004_HK는 또한 EPS^neg _HK와 비교하여 IL-12p70을 유의하게 증가시켰지만(p = 0.0118, 도 14B), 역으로 EPS^neg _HK 처리는 MRx0004_HK보다 더 높은 농도의 IL-1β 및 IL-10을 생성하는 것으로 밝혀졌다(각각 p = 0.0008 및 0.014, 도 14E-F).

박테리아 처리가 각각의 개별 T-헬퍼 세포 아형에 의해 생산된 사이토카인을 지시자로 사용하여 특정 아형에 대한 T-헬퍼 세포 반응을 왜곡하는지 여부를 추론하기 위해 사이토카인 비를 분석하였다(Th1 또는 Th2; IL-12p70/IL-4, Treg; IL-10/IL1p70, Th17; IL-1β/IL12p70, 도 14H-J). MRx0004_HK 처리는 처리되지 않은 세포에 비해 Th1 표현형에 대한 면역 반응을 유의하게 왜곡하는 것으로 보였지만(p = 0.0172, 도 14H), EPS^neg _HK 처리는 처리되지 않은 세포와 비교하여 Treg 및 Th17 반응 둘 다에 대한 왜곡을 유도하는 것으로 보였다(p = 0.0312 및 0.0005, 도 14I-J). EPS^neg _HK Treg 및 Th17 왜곡은 또한 MRx0004_HK와 비교하여 유의하게 증가하였다(p = 0.0423 및 0.0008, 도 14J). MRx0004_HK 및 EPS^neg _HK 처리 사이에 T 세포 반응의 상이한 아집단을 유도하는 능력에서 분명한 차이를 관찰하였다.

종합해 보면, 이 연구의 관찰은 MRx0004가 선천적 및 후천적 면역 반응의 전염증성 아암(arm)을 조절함을 입증한다. 따라서, MRx0004 및 다른 비. 브리브 균주는 면역계를 자극하고 감소된 면역 활성과 관련된 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다.

실시예 2 - 효능에 대한 MRx0004 eps 유전자좌의 효과 특징화

요약

본 연구의 목적은 MRx0004의 면역 자극 및 치료 특성에서 MRx0004 엑소폴리사카라이드(EPS)의 역할을 특징화하는 것이었다.

재료 및 방법

실험은 하기 기재된 추가 절차와 함께, 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.

불멸화된 세포의 일상적 배양

HEK-Blue™-hTLR2 세포(InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 10%(v/v) FBS, 4 mM L-글루타민, 4.5 mg/ml 글루코스, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 100 μg/ml Normocin™(InvivoGen), 30 μg/ml 블라스토시딘 및 100 μg/ml 제오신이 90% 밀도로 보충된 DMEM에서 성장시켰다. THP1-Blue™ NF-kB 세포(InvivoGen)를 10%(v/v) 열-불활성화 FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 25 mM HEPES, 100 μg/ml Normocin™, 10 μg/ml 블라스토시딘(cRPMI)이 보충된 RPMI 1640에서 성장시켰다. 세포주를 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다. 모든 시약은 달리 언급되지 않는 한 Sigma-Aldrich에서 공급받았다.

MRx0004 EPS 유전자좌 및 관련된 비. 브리브 균주의 비교 분석

GenBank 데이터베이스에서 이용가능한 비피도박테리움 균주의 게놈을 비피도박테리움 균주로부터의 추정 엑소폴리사카라이드 유전자 클러스터의 EPS 클러스터 및 물리적 맵의 인실리코(in silico) 분석에 사용하였다.

MRx0004 EPS 유전자좌의 차등 발현 분석

총 RNA를 약간의 변형과 함께 제조업체의 프로토콜에 따라 RNAprotect(Qiagen) 및 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 균주 MRx0004의 후기 대수기 배양물에서 추출하였다. 기계적 세포 용해를 Lysing Matrix B 및 MP Fast-Prep-24 조직 및 세포 균질기(MP Biomedicals, 미국 캘리포니아주 샌타애나 소재)를 사용하여 6 m/s에서 설정된 진동으로 수행하였다. 세포를 2 번의 20 초 주기 동안 파괴하였으며 주기 사이에 1 분 동안 얼음에서 휴지 상태로 두었다. RNA 품질을 Agilent RNA Screentape(Agilent Technologies)을 사용하여 Tapestation(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 샌타클래라 소재)에서 확인하였다. RNA 분해가 없는지 확인하였고, 모든 샘플의 최소 RNA 무결성 번호는 ≥9였다. MICROBExpress 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 rRNA 종을 고갈시켰다. 평가된 16S 및 23S rRNA 종의 부재를 Agilent RNA RNA Screentape(Agilent Technologies)을 사용하여 Agilent Bioanalyzer에서 확인하였다. rRNA에서 고갈된 RNA 샘플을 표준-특이적 라이브러리 제조를 위해 GATC Biotech로 보냈고 Illumina 시퀀싱에서 서열분석하여 150 bp 단일-말단 판독물을 생성하였다. RNA-Seq 라이브러리 당 평균 22,3878,08(후기 대수기 샘플) 및 18627178.6(정지기 샘플) 원시 판독물을 각각 총 10.07 Gbp 및 8.38 Gbp 이상으로 수득하였다. 원시 판독물은 Trimmomatic(1)을 사용하여 트리밍하였고 품질은 Bowtie(2)를 사용하여 MRx0004 게놈에 대해 여과하였다(98.36% 후기 대수기 샘플 및 98.26%(정지기 샘플) 판독물을 QC로 통과시켜 99.11%(LL) 및 98.72%(SP)의 맵핑된 깨끗한 판독물로 정렬). 각 성장기의 반복실험 샘플의 발현 수준을 XX 및 DeSeq2 v X(Love et al, 2014)를 사용하여 MRx0004 EPS 유전자좌에서 각 유전자에 대해 계산한 다음 Geneious R1(Biomatters, 뉴질랜드 오클랜드 소재)을 사용하여 시각화하였다. 두 성장기 사이의 차등 발현을 나타낸다. 정규화된 비에 대한 밑수 2 로그는 두 샘플 사이의 값이며 하나의 샘플에서 발현이 없거나 또는 매우 낮을 때, log2 비는 +/- 1,000,000으로 한도가 정해진다.

투과 전자 현미경(TEM)

박테리아를 고정액(0.1 M Na-포스페이트 완충액 중 0.5 M 수크로스, 2% 파라포름알데히드 및 0.16% 글루타르알데히드)에 1:5로 희석하고 실온에서 2 시간 동안 고정시켰다. 그 후에, Formvar-탄소-코팅된 구리 격자를 100 μl 액적의 비. 브리브 현탁액에서 1 시간 동안 부유시키고, PBS 중 0.02 M 글리신으로 3 회 세척하였다. 세포를 1.0% 암모늄 몰리브데이트로 음성으로 염색하였다. 격자를 조사하고, 현미경 사진을 JEM-1400 투과 전자 현미경(JEOL Ltd., 일본 도쿄 소재)을 사용하여 시각화하였다.

박테리아 부착력 검정

살아있는 박테리아(이전에 기재된 바와 같이 공-배양 배지에서 준비 및 재현탁됨)를 24 웰 플레이트에 100:1의 MOI로 HT29-MTX 세포에 적용하고, 혐기성 조건에서 37℃에서 3 시간 동안 공-배양하였다. 세포를 PBS로 2 회 세척하여 결합되지 않은 박테리아를 제거하고, 0.1%(v/v) Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 용해시켰다. 용해물을 플레이팅하고, 회수된 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 사용하여 부착력의 백분율을 결정하였다.

결과

MRx0004의 eps 유전자좌는 비. 브리브의 다른 균주와 유전적으로 구별되고 후기 대수 성장기 동안 고도로 발현된다.

균주 MRx0004의 게놈 서열분석은 비. 브리브에서 EPS 생합성에 필요할 것으로 예측되는 기능의 완전한 보체를 나타내는 27 개의 유전자를 암화화하는 것으로 밝혀진 28 Kb EPS 유전자좌를 보유하고 있음을 나타낸다. 이 영역은 프라이밍 글리코실트랜스퍼라제, 4 개의 추가 글리코실트랜스퍼라제, 막 스패닝 단백질의 하류에 암호화된 티아민 피로포스페이트 결합, 플립파제 및 쇄 길이 결정인자를 포함한다(도 9). 균주 MRx0004를 포함하여 비. 브리브 EPS 유전자좌의 대부분은 도 9에 나타낸 비. 브리브 EPS 유전자좌의 표시에서 제외된 가설 단백질(MRx0004 영역을 31.5 Kb로 확장)에 의해 플랭크되어 있다. 도 9에 도시된 균주의 대다수(16/19)는 유아 단리물이며, 이의 게놈은 공개 데이터베이스에서 과도하게 표시되어 있다. 50 Kb를 초과하는 비. 브리브 EPS 영역은 EPS-양성 표현형을 생성하는 데 필요한 모든 기능을 암호화하는 완전 유전자좌를 나타내는 것으로 생각된다 [89]. 대조적으로, 이들 영역이 < 30 Kb인 경우, 불완전 또는 나머지 유전자좌를 나타내는 것으로 생각된다 [89].

비교 분석은 EPS 유전자좌를 균주 MRx0004(데이터는 제시되지 않음) 및 비. 브리브의 다른 균주의 게놈 사이에 유전적 다양성의 주요 영역으로 식별하였다. MRx0004 EPS 유전자좌를 공개적으로 이용가능한 비. 브리브 게놈의 유전자좌와 비교하였다. EPS 유전자좌가 높은 수준의 서열 동일성(ID) 및 균주 MRx0004와의 유전자 신테니(synteny)를 나타내는 비. 브리브의 균주는 도 9에 도시되어 있으며, 균주 MRx0004에 대한 유사성(오페론 길이 대비 평균% nt ID)에 따라 정렬되어 있다. 비. 브리브 NRBB51, 유아(모유 먹이) 단리물은 두 유전자좌의 전체 길이에 걸쳐 균주 MRx0004와 함께 91.5%의 가장 높은 수준의 뉴클레오티드 동일성(ID)을 공유하였다. 두 균주에서 예측된 트랜스포사제를 암호화하는 중앙 1.3 Kb 영역은 균주 MRx0004 및 NRBB51 사이의 주요 다양성 영역을 나타낸다. MRx0004 유전자좌의 시작 및 끝에서 암호화된 유전자는 다른 비. 브리브 단리물과 가장 높은 수준의 서열 보존을 나타냈다(도 9). EPS 생합성의 1차 단계에 필수적인 MRx0004의 pGTF는 비교인자 균주의 상동체와 92.2% 쌍별 ID(aa)를 공유하였다. 쇄 길이 조절인자를 포함하는 4 Kb 영역, 및 가설 및 막 스패닝 단백질을 암호화하는 유전자는 조사된 균주 중에서 98.3% nt ID를 공유한다. 가설 단백질 및 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는 균주 MRx0004 및 10 개의 가장 밀접하게 관련된 EPS 유전자좌 사이의 주요 서열 다양성 영역을 설명하였다(도 9). 대조적으로, 균주 MRx0004와 더 유사하지 않은 것으로 밝혀진 비. 브리브 EPS 유전자좌(도 9에서 아래 9 종의 균주)는 gtf, 폴리머라제 및 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 포함하여, EPS 생산에 가장 중요한 유전자의 수 및 순서에서 변이를 나타낸다(도 9).

MRx0004의 EPS 유전자좌가 후기 대수기 또는 정지기 성장 동안 더 많이 전사되었는지 여부를 결정하기 위해, YCFA에서 성장한 균주 MRx0004의 단일 배양에서 차등 발현 분석을 수행하였다. (도 9. b). MRx0004 EPS 합성을 주로 담당하는 것으로 예측된(상기 기재됨) 유전자 대부분은 후기 대수기 성장 동안 상향조절되었다. MRx0004 EPS 유전자좌는 10 개의 가설 단백질 및 5 개의 트랜스포사제를 암호화하며, 이는 MRx0004의 정지기 성장 동안 상향조절된 유전자의 유일한 범주를 나타낸다(도 9). MRx0004 EPS의 합성에서 가설 단백질의 역할은 아직 알려지지 않았다.

MRx0004의 EPS 음성 균주의 생성

숙주-미생물 상호작용 및 면역조절에서 MRx004 EPS의 역할을 조사하고 상기 기재된 바와 같이 균주(EPS^neg)를 구축하여, EPS 유전자좌의 pGTF 유전자를 삽입 돌연변이유발을 통해 불활성화시켰다(도 16a). 이 균주는 [88]에 기재된 방법을 활용함으로써 구축되었지만, 유형 II 제한-변형(RM) 시스템을 조작하기 보다는, MRx0004 유형 I RM 시스템의 메틸라제 및 특이성 서브유닛을 발현하고 사용하여 형질전환 전에 플라스미드 DNA를 메틸화하였다. 보완된 EPS^neg 균주(EPS^comp) 및 EPS^neg 빈 벡터 균주(EPS^vec)를 또한 대조군으로 생성하였다. EPS^neg 및 EPS^vec는 MRx0004에 비해 증가된 자가응집 표현형을 나타내었다(도 16b). EPS^comp는 EPS^neg 및 EPS^vec보다 덜 응집되었지만, MRx0004에 비해 자가응집이 증가된 것으로 보였으며, 이는 이 균주가 야생형 EPS 표현형으로 완전히 복귀하지 않을 수 있음을 시사한다.

MRx0004 및 EPS^neg의 EPS 표현형을 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 조사하였다. MRx0004에 비해 EPS^neg 균주에서 EPS의 부재는 도 10A 및 10B에 도시되어 있다. 야생형 MRx0004 및 이의 유도체 균주의 부착 능력을 시험관내 IEC 모델을 사용하여 분석하였다. EPS^neg는 MRx0004보다 IEC에 대한 부착성이 2 배 이상이었으며(각각 47.5% 부착성 vs 18.7%, p = 0.006)(도 10C), 이는 EPS의 부재가 EPS^neg의 부착 능력을 증가시켰음을 시사한다. EPS^neg 에서 보인 증가된 부착력 표현형은 EPS^vec로 유지되었지만(40.1% 부착력, p = 0.03 vs MRx0004), EPS^comp의 부착력(34.1%)은 임의의 다른 균주와 비교 시 유의하게 상의하지 않았으며, 이는 추가로 EPS^comp의 야생형 표현형으로의 회귀가 불완전하였음을 암시한다.

MRx0004의 EPS 고갈은 숙주 자극에 수반되는 표면 단백질을 노출시킨다

IEC에 대한 EPS^neg의 증가된 부착력은 EPS의 고갈이 표면 관련 단백질의 노출 증가, 또는 "비차폐"를 초래할 수 있음을 시사하였다. IEC와의 접촉 후 MRx0004 및 EPS^neg 표면 관련 단백질의 조성을 분석하였다. HT29-MTX 세포와 3 시간 접촉 후, 박테리아 세포를 이전에 기재된 바와 같이 트립신으로 떼내고, 생성된 떼낸 및 탈락된 단백질 분획을 LC-MS/MS로 분석하였다. IEC와 접촉 후 MRx0004 세포 떼내기는 55 개의 떼낸 단백질(이 중 34 개는 표면-고정된 것으로 예측됨) 및 24 개의 탈락된 단백질을 산출하였다(도 11A). IEC와 접촉 후 EPS^neg 세포의 떼내기는 MRx0004보다 상당히 더 많은 단백질을 함유하였으며, 떼낸 단백질 분획에 101 개의 단백질이 있고 탈락된 단백질 분획에 45 개의 단백질이 있다(도 11B). MRx0004 탈락된 단백질 분획에서 식별된 3 개의 단백질(탄수화물, 지질 및 단백질 대사에 수반되는 효소)을 제외하고, 식별된 모든 단백질은 두 균주의 떼낸 단백질 분획에 존재하였다.

MRx0004 및 EPS^neg 떼낸 단백질 분획을 비교하여 두 샘플에 존재하는 54 개의 단백질 및 EPS^neg 균주에 특이적인 47 개의 단백질을 식별하였다(도 11C). MRx0004 떼낸 단백질 데이터세트에서 고유하게 식별된 유일한 단백질은 NlpC/P60 패밀리 단백질이었다. 세포 떼내기에 의해 수확된 단백질의 수는 MRx0004보다 EPS^neg 균주에서 더 높았으며, 이는 EPS 고갈이 트립신 절단을 위해 표면 단백질에 대한 더 나은 접근을 용이하게 하였음을 추론한다. 추가로, 비피도박테리아 및 다른 속에서 숙주-상호작용에 수반되는 것으로 알려진 단백질은 MRx0004에서보다 EPS^neg 떼낸 단백질 분획에서 더 풍부하였다(식별된 펩티드의 수/μg 총 단백질로 평가)(표 4). 이들 결과는 EPS 고갈이 비차폐 효과를 초래하여, 표면 단백질 및 MRx0004 EPS에 의해 달리 차폐될 수 있는 잠재적인 MRx0004 면역원을 노출시킨다는 가설에 추가 신뢰를 더한다.

EPS^neg 배양 상청액의 단백질 함량을 또한 LC-MS/MS로 분석하고 EPS 부족이 EPS^neg 균주에 의해 세포외 환경에서 잠재적으로 탈락되고 분비된 단백질의 수를 증가시켰음을 확인하였다(도 17). 64 개만을 식별한 MRx0004SN과 대조적으로, 총 146 개의 단백질이 EPS^neg _SN에서 식별되었지만, 이 중 87 개는 EPS^neg _SN에서만 검출되었고 59 개는 두 샘플에서 검출되었다. MRx0004_SN에서 식별되고 상기 논의된 야습 단백질은 두 샘플 사이의 필적할만한 GAPDH를 제외하고, EPS^neg _SN에서 더 높은 풍부도로 검출되었다(MRx0004_SN 및 EPS^neg _SN에서 30 ± 3.61 및 28.33 ± 0.58). 흥미롭게도, 비. 락티스(B. lactis) 및 비. 롱검에서 인간 플라스미노겐 결합에 역할을 하는 것으로 제시된 콜로일글리신 하이드롤라제(담즙산 염 하이드롤라제) 및 EfTu는 대타적으로 EPS^neg _SN에서만 검출되었다 [80,87]. 담즙산 염 하이드롤라제는 또한 장에서 환경적 스트레스로부터 공생 종을 보호할 수 있다 [90]. MRx0004_SN에 비해 EPS^neg _SN에서 증가된 단백질 검출은 EPS의 부재 하에 비차폐가 MRx0004 표면 관련 단백질의 탈락 또는 분비를 증가시킬 수 있음을 시사한다.

결론

비교 게놈 분석은 MRx0004에서 EPS 합성을 담당하는 유전자좌가 다른 비. 브리브 균주와 유전적으로 구별됨을 입증하였다. 이 영역에서 관찰된 유전적 변이는 MRx0004 및 관련된 균주의 효능 및 치료 유용성을 향상시키는 데 기여할 수 있다.

MRx0004:숙주 상호작용의 매개체 및 면역 반응의 이펙터로서 EPS의 잠재적인 중요성은 IEC와 접촉 시 pGTF 발현의 상대적 증가에 의해 뒷받침되었다. pGTF 이외에도, qPCR 분석에서 다른 유의하게 상향조절된 유전자 대부분은 IEC에 대한 부착력의 역할을 예측하였으며, 이는 MRx0004의 중요한 기능적 특성일 수 있음을 암시한다. MRx0004의 유형 IV 선모-관련 유전자 tadA는 시험관내 배양에서 발현되었으며, 이는 비. 브리브 UCC2003의 Tad 선모가 시험관내 조건 하에 생성되지 않았다는 이전 관찰로 인해 흥미로웠다 [91]. 세르핀의 발현은 또한 IEC에 반응하여 유의하게 증가하였다. 비. 롱검 NCC2705로부터의 세르핀은 최근에 생체내 셀리악병 모델의 소장에서 상피내 림프구의 침윤을 감소시키는 것으로 보고되었고 [92], 따라서 면역 자극 및 보호 효과를 유도하며, 이는 비. 브리브의 세르핀, 및 특히 MRx0004가 유사한 면역조절 효과를 가질 수 있음을 시사한다.

상청액 및 세포 떼내기의 단백질체학 분석은 탄수화물 대사에서 역할이 예측된 다수의 단백질을 검출하였다. 흥미롭게도, 세포 떼내기 데이터세트에서 가장 풍부한 단백질인 녹말 분해성 효소 풀루라나제는 시험관내에서 당단백질 및 숙주 세포에 대한 스트렙토코쿠스 피오게네스의 부착력에 수반되는 것으로 보고된 야습 단백질이다 [85,86]. 또한, 비. 아니말리스 하위종 락티스로부터의 DnaK 및 에놀라제 [82,83] 및 비. 롱검으로부터의 EfTu [87]는 시험관내에서 플라스미노겐에 부착하는 것으로 보고되었다. 또한, 엘. 락티스에서 비. 비피듐 A8의 당 분해성 효소 트랜스아돌라제의 재조합 발현은 뮤신에 대한 이 균주의 부착성을 증가시켰다 [84]. MRx0004에 의한 이들 야습 단백질의 생성은 이들이 MRx0004의 부착 능력에 역할을 할 수 있고, 따라서 숙주 세포 표면과의 상호작용을 용이하게 할 수 있음을 시사한다. 이들 비피도박테리아 야습 단백질은 면역계에 대한 MRx0004의 향상된 효과를 매개하는 특이적 숙주 세포 수용체 및 신호전달 경로에 특히 영향을 미칠 수 있다.

MRx0004는 활성화된 CD8⁺ 아집단에서 유의한 증가를 유도하였으며, 이는 EPS의 존재와 부분적으로 관련된 것으로 보였다.

EPS^neg 처리는 MRx0004와 비교하여 Treg를 유의하게 증가시켰다. 이는 EPS의 제거가 숙주 세포와 상호작용하고 Treg 반응을 촉진할 수 있는 또 다른 박테리아 표면 성분을 노출시킴을 시사한다. 변동은 CD8+ 및 Treg 집단 둘 다에서 분명하였다. EPS^neg는 기준선과 비교하여 유의하게 증가된 Treg/CD8 비에 의해 예시된 바와 같이 Treg 반응에 대해 유의한 왜곡을 유도하였다. 이는 EPS^neg에서 세포 표면의 비차폐가 항염증 효과를 초래하고, MRx0004에서 EPS의 존재가 이의 면역 자극 효능을 뒷받침함을 암시한다.

MRx0004의 EPS는 IL-12p70의 분비에 직접적으로 수반되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 시험된 모든 3 개의 Th1 사이토카인(IL-12p70, IFNγ, TNFα)의 분비는 MRx0004_HK에 의해 유의하게 상향조절되었으며, 이는 이 균주가 EPS를 통해 부분적으로 매개된 Th1 반응에 대한 왜곡을 유도함을 시사한다. MRx0004_HK는 또한 Th2 사이토카인 IL-4를 유의하게 유도하고, 유의하지 않지만 IL-10, IL-1β 및 IL-17α를 상향조절하였으며, 따라서 이 균주가 T-헬퍼 세포 미세환경에서 이동을 유도할 수 있음을 암시한다. Th1의 유도는 생체내 장 벽 안정성을 개선시키고 면역 항상성 유지에 유익할 수 있다.

MRx0004의 EPS는 특이적 면역조절 효과를 가지며, 즉, CD8+, Treg 및 Th1 반응을 조절할 수 있고, 이들 효과는 향상된 효능 및 치료 효능을 제공할 수 있다.

실시예 3 - 마우스 암 모델에서 박테리아 접종의 효능

요약

선행 실시예에 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 비. 브리브, 특히 균주 MRX004의 새로운 면역 자극 효과를 식별하였다. 상기 제시된 새로운 데이터에 비추어, 비. 브리브, 특히 균주 MRX004를 포함하는 조성물은 면역계를 자극하고 감소된 면역계 활성과 관련되거나 또는 증가된 면역계 활성의 혜택을 받는 질환을 치료하는 데 효과적일 것으로 예상된다.

암은 종양을 공격하는 증가된 면역계 활성으로부터 혜택을 받을 수 있는 질환이다. 상기 제시된 새로운 데이터 및 MRX004의 새로운 면역 자극 효과와 일치하여, MRX004는 하기 연구에서 마우스 종양 모델에서 종양 부피를 강력하게 감소시키는 것으로 제시되었으며, 이는 MRX004 투여가 질환을 치료하는 데 효과적임을 입증한다.

본 연구는 4 가지 종양 모델에서 본 발명에 따른 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 효능을 시험하고, 항-CTLA 항체에 대한 효능을 비교하였다.

물질

평가 성분 - 박테리아 균주 #MRX004, 비피도박테리움 브리브.

참조 성분 - 항-CTLA-4 항체(클론: 9H10, 카탈로그: BE0131, 이소형: 시리아 햄스터 IgG1, Bioxcell).

평가 및 참조 성분 비히클 - 박테리아 배양 배지(효모 추출물, 카시톤, 지방산 배지(YCFA)). 마우스로의 주사일마다, 항체를 PBS(ref: BE14-516F, Lonza, France)로 희석하였다.

치료 용량 - 박테리아: 200 ㎕ 중 2x10⁸. CTLA-4를 10 ㎎/㎏/inj로 주사하였다. 항-CTLA-4를 마우스의 가장 최근 체중에 따라 10 ㎖/㎏/adm의 투여 부피로 투여하였다(즉, 20 g 체중의 한 마리 마우스에 있어서, 200 ㎕의 평가 성분을 투여할 것임).

투여 경로 - 박테리아 접종물을 캐뉼라를 통해 경구 급식(입으로(per os), PO)에 의해 투여하였다. 매일 캐뉼라의 오염을 제거하였다. 항-CTLA-4를 마우스의 복강 내로 주사하였다(복강내, IP).

박테리아 균주의 배양 조건 - 박테리아 균주에 대한 배양 조건은 하기와 같았다:

· 10 ㎖의 YCFA(10 ㎖ E&O 랩 보틀에 제조됨)를 Hungate 튜브 내로 피펫팅함

· 튜브를 밀봉하고 시린지 입구 및 배출 시스템을 사용해서 CO₂로 플러싱함

· Hungate 튜브를 오토클레이브함

· 냉각되면, 1 ㎖의 글리세롤 스톡을 Hungate 튜브에 접종함

· 약 16시간 동안 정적 37℃ 인큐베이터에 튜브를 배치함.

· 다음 날, 상기 하위배양액 1 ㎖을 취해 10 ㎖의 YCFA에(모두 2개씩, 다시 사전-가온되고 플러싱된 Hungate 튜브에) 접종함

· 이를 5~6 h 동안 정적 37℃ 인큐베이터에 배치함

암 세포주 및 배양 조건 -

사용한 세포주를 아래 표에 상세히 나타낸다:

과다형성 유방 치조 결절의 임플란트 후 BALB/cCRGL 마우스에서 생긴 이식 가능한 쥣과 유방암종으로부터 EMT-6 세포주를 확립하였다[93].

원발성 루이스 폐암종의 임플란트로 생성된 종양을 보유하는 C57BL 마우스 폐로부터 LL/2(LLC1) 세포주를 확립하였다[94].

Hepa 1-6 세포주는 C57/L 마우스에서 생긴 BW7756 마우스 간암종의 유도체이다[95].

세포 배양 조건 - 모든 세포주를 가습 분위기(5% CO₂, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 배양 배지 및 보충물을 아래 표에 나타낸다:

실험적 용도를 위해, 부착성 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘을 함유하지 않는 Hank 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중 트립신-베르센(ref: BE17-161E, Lonza)으로의 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 탈착하고, 완전 배양 배지를 첨가하여 중화했다. 세포를 혈구계에서 계수하고 이의 생활성을 0.25% 트립판 블루 배제 검정에 의해 평가하였다.

동물의 사용 -

EMT6 모델 실험을 위해 매칭되는 체중 및 연령을 갖는 건강한 암컷 Balb/C (BALB/cByJ) 마우스를 CHARLES RIVER (L'Arbresles)로부터 입수하였다.

LL/2(LLC1) 및 Hepa1-6 모델 실험을 위해 매칭되는 체중 및 연령을 갖는 건강한 암컷 C57BL/6(C57BLl6J) 마우스를 CHARLES RIVER(L'Arbresles)로부터 입수하였다.

동물을 FELASA 가이드라인에 따라 SPF 건강 상태로 유지하고 실험실 동물의 케어 및 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 지침에 따른 동물 수용 및 실험 절차를 따랐다[96,97]. 동물은 제어되는 환경 조건 하에 수용실에서 유지하였다: 온도: 22±2℃, 습도 55±10%, 광주기(12 h 명주기/12 h 암주기), HEPA 여과된 공기, 재순환 없이 시간 당 15회 공기 교환. 기재된 바와 같은 침구재, 음식 및 물, 환경 및 풍부한 사회조건(군 수용)과 함께 멸균된 적절한 공간으로 동물 봉쇄를 제공하였다: 통기되는 랙에 있는 900 ㎠ 우리(참조: 녹색, Tecniplast), Epicea 침구(SAFE), 10 kGy 조사된 식이(A04-10, SAFE), 면역-적격 설치류에 대한 완전식 - R/M-H 압출물, 물병으로부터의 물.

실험 설계 및 처리

항종양 활성, EMT6 모델

처리 일정 - 최초 투여의 시작을 D0으로 간주하였다. D0에, Vivo manager® 소프트웨어(Biosystems, Couternon, France)를 사용하여 그래프팅되지 않은 마우스를 이의 개별 체중에 따라 9/8마리의 군으로 무작위화하였다. D0에, 마우스는 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여받았다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 EMT-6 종양 세포를 그래프팅하였다. D24에, 양성 대조군으로부터의 마우스는 항-CTLA-4 항체 처리를 수여받았다.

처리 일정을 아래의 표에 요약한다:

동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.

동물에서 EMT6 종양의 유도 - D14에, 마우스의 우측 넙다리 내로 200　㎕ RPMI 1640 중 1x10⁶ EMT-6 세포의 피하 주사에 의해 종양을 유도하였다.

안락사 - 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 때 또는 투여 시작 후 최대 6주 후, 각각의 마우스를 안락사시켰다.

항종양 활성, LL/2(LLC1) 모델

처리 일정 - 최초 투여의 시작을 D0으로 간주하였다. D0에, Vivo manager® 소프트웨어(Biosystems, Couternon, France)를 사용하여 그래프팅되지 않은 마우스를 이의 개별 체중에 따라 9/8마리의 7개 군으로 무작위화하였다. D0에, 마우스는 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여받을 것이다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 LL/2 종양 세포를 그래프팅하였다. D27에, 양성 대조군으로부터의 마우스는 항-CTLA-4 항체 처리를 수여받았다.

처리 일정을 아래의 표에 요약한다:

동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.

동물에서 LL/2(LLC1) 종양 종양의 유도 - D14에, 마우스의 우측 넙다리 내로 200　㎕ RPMI 1640 중 1x10⁶ LL/2(LLC1) 세포의 피하 주사에 의해 종양을 유도하였다.

안락사 - 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 때 또는 투여 시작 후 최대 6주 후, 각각의 마우스를 안락사시켰다.

항종양 활성, Hepa1-6 모델

처리 일정 - 최초 투여의 시작을 D0으로 간주하였다. D0에, Vivo manager® 소프트웨어(Biosystems, Couternon, France)를 사용하여 그래프팅되지 않은 마우스를 이의 개별 체중에 따라 9마리의 7개 군으로 무작위화하였다. D0에, 마우스는 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여받았다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 Hepa 1-6 종양 세포를 그래프팅하였다. D16에, 양성 대조군으로부터의 마우스는 항-CTLA-4 항체 처리를 수여받았다.

처리 일정을 아래의 표에 요약한다:

동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.

비장내 주사에 의한 동물에서 Hepa 1-6 종양 세포의 직교이방성 유도 - D14에, 50 ㎕ RPMI 1640 배지 중 백만 개(1x10⁶) Hepa 1-6 종양 세포를 마우스 내로 비장내 주사를 통해 이식하였다. 간략하게, 소형 좌측 갈비밑 넙다리 절개를 수행하고 비장을 노출시켰다. 비장을 멸균 거즈 패드 상에서 노출시키고, 시각적 제어 하에 27-게이지 바늘로 세포 현탁액을 주사하였다. 세포 접종 후, 비장을 절제하였다.

안락사 - 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 때 또는 투여 시작 후 최대 6주 후, 각각의 마우스를 안락사시켰다.

안락사 시 종양 부담의 평가 - 종료 시, 간을 수집하고 칭량하였다.

동물 모니터링

임상적 모니터링 - 캘리퍼로 1주 2회 종양의 길이 및 폭을 측정하고 종양의 부피를 상기 식에 의해 추정하였다[98]:

인도적 종결점[99]: 통증, 고통 또는 곤란의 징후; 통증 자세, 통증 안면 표정, 행동; 정상 체중의 10%를 초과하지만 2000 ㎣ 이하의 종양; 보행 또는 영양을 방해하는 종양; 궤양화된 종양 또는 조직 미란; 연속 3일 동안 20% 체중 손실; 불량한 신체 상태, 쇠약, 악액질, 탈수; 외부 자극에 대한 자발적 반응의 연장된 부재; 빠르고 힘든 호흡, 빈혈, 상당한 출혈; 신경학적 징후; 회선, 경련, 마비; 체온의 지속된 감소; 복부 팽창.

마취 - 모든 절차: 수술 또는 종양 접종, i.v. 주사, 혈액 수집을 위해 이소플루란 기체 마취를 사용하였다. 정위 수술 절차를 위해 케타민 및 자일라진 마취를 사용하였다.

진통 - 카프로펜 또는 다중양상 카프로펜/부프레노르핀 진통 프로토콜을 수술 절차의 중증도에 대해 적응시켰다. 모든 고통스러운 절차에 대해 비-약리학적 케어를 제공하였다. 추가적으로, 주치 수의사의 권고 시 연구(국소 처리)를 방해하지 않는 약리학적 케어를 제공하였다.

안락사 - 기체 마취 과-투여량(이소플루란)에 이어 경추 탈골 또는 사혈에 의해 동물의 안락사를 수행하였다.

결과

항종양 활성, EMT6 모델

결과를 도 1에 나타낸다. 본 발명의 박테리아 균주로의 처리는 두 음성 대조군 모두에 대해 종양 부피의 뚜렷한 감소를 야기하였다. 면역 체계를 활성화시키는 것으로 알려진 양성 대조군도 예상될 바와 같이, 종양 부피의 감소를 야기하였다.

항종양 활성, LL/2 (LLC1) 모델

결과는 도 2에 제시되어 있다. 음성 및 양성 대조군은 예상대로 나타나지 않았는데, 종양 부피가 음성 대조군 그룹에서보다 양성 대조군으로 처리된 마우스에서 더 컸기 때문이다. 그럼에도, 본 발명의 박테리아 균주로 처리된 마우스의 종양 부피는 양성 대조군 그룹과 필적할만하였으며, 이는 유용한 치료 및 면역 자극 효과와 일치한다.

항종양 활성, Hepa1-6 모델

결과는 도 3에 제시되어 있다. 처리되지 않은 음성 대조군은 예상대로 나타나지 않았는데, 간 중량이 다른 그룹보다 이 그룹에서 더 작았기 때문이다. 그러나, 비히클 음성 대조군 및 양성 대조군 그룹은 둘 다 예상대로 나타났는데, 비히클 단독으로 처리된 마우스가 항-CTLA4 항체로 처리된 마우스보다 간이 더 커서, 비히클 음성 대조군 그룹에서 더 큰 종양 부담을 반영하기 때문이다. 본 발명의 박테리아 균주를 사용한 처리는 비히클 음성 대조군 그룹의 마우스에 비해 간 중량(및 따라서 종양 부담)의 분명한 감소를 야기하였다.

이들 데이터는 MRX004가 암 치료에 효과적임을 입증하며, 실시예 1 및 2의 데이터에 비추어, 이들 데이터는 균주 MRX004가 감소된 면역계 활성과 관련된 다른 질환을 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있음을 뒷받침한다.

실시예 4 -효소적 활성의 특징화

분석 프로파일 지수(API®) 시험 시스템은 박테리아 종에서 효소적 활성을 검정하는 소형화된 생화학적 시험을 함유하는 스트립으로 이루어진다. MRX004(수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 박테리아)를 2가지 API 시험 시스템을 사용하여 특징화하였다: Rapid ID 32A - 이 시스템은 혐기성 종에 대해 특이적으로 설계되어 있고 탄수화물, 아미노산 및 니트레이트 대사 뿐만 아니라 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 시험을 포함함; 및 API® 50 CH - 이 시스템은 49 개의 탄수화물 공급원의 발효를 시험하고, 혐기성 종의 분석을 위해 API® CHL 배지와 함께 활용될 수 있음.

Rapid ID 32A 시험을 제조업체의 설명서에 따라 박테리아 콜로니에 대해 수행하였다. 간단히 말해서, 박테리아를 혐기성 작업장에서 37℃에서 24 시간 동안 YCFA 한천에서 배양하였다. 콜로니를 멸균 5 μl 접종 루프를 사용하여 플레이트로부터 제거하고 McFarland 표준 No. 4와 거의 동등한 밀도가 달성될 때까지 API® 현탁 배지의 2 ml 앰플에 재현탁하였다. 55 마이크로리터의 박테리아 현탁액을 Rapid ID 32A 스트립의 각각의 큐풀(cupule)에 첨가하였고, 우레아제 시험을 2 방울의 미네랄 오일로 덮어씌웠다. 스트립을 플라스틱 리드로 덮고 37℃에서 4 시간 동안 호기성으로 배양한 다음, 큐풀의 맨 아래 줄을 다음 시약을 사용하여 현상하였다: NIT: NIT1 및 NIT2 각각 1 방울; IND: James 시약 1 방울; 나머지 모든 큐풀: FastBlue 시약 1 방울. 스트립을 실온에서 5 분 동안 배양한 다음, 각 큐풀의 색상을 기록하고 음성, 중간 양성 또는 양성 값으로 할당하였다.

Rapid ID 32A 분석 결과는 도 4에 제시되어 있다. MRX004를 여러 탄수화물 공급원, 즉 α-갈락토시다제 및 β-갈락토시다제, α-글루코시다제 및 β-글루코시다제, α-아라비노스, 만노스 및 라피노스, 뿐만 아니라 아미노산 아르기닌, 프롤린, 페닐알라닌, 류신, 티로신, 글리신 및 히스티딘의 발효에 대해 양성으로 시험하였다.

비교 Rapid ID 32A 분석을 MRX004 및 4 종의 비. 브리브 유형 균주 사이에 수행하였으며, 도 4B에 Bif Ref 1(DSM 20091), Bif Ref 2(DSM 20213), Bif Ref 6(JCM 7017) 및 Bif Ref 7(UCC2003)로 주석을 달았다. 이 분석은 MRX004가 폴리사카라이드 라피노스를 발효하도록 시험된 유일한 균주였으며 유의할 수 있음을 입증하였는 데, 라피노스가 엑소폴리사카라이드와 같은 박테리아 성분의 생성에 수반되고, 라피노스 발효가 또한 전하는 바에 따르면 증가된 맹장 부티레이트, 증가된 위장관 증식 및 체중 감소와 같은 숙주에 대한 영향을 부여할 수 있기 때문이다.

API® 50 CH 시험을 수행하여 MRX004에서 탄수화물 대사를 추가로 조사하였다. 제조업체의 설명서에 따라, 박테리아를 혐기성 작업장에서 37℃에서 16-18 시간 동안 10 ml YCFA 브로스에서 배양하였다. 이 배양물을 10 ml API® CHL 배지에 희석하여 McFarland 표준 No. 2와 거의 동등한 밀도를 달성하였고, 이 혼합물 110 μl를 사용하여 API® 50 CH 시험 스트립 세트의 각 큐풀에 접종하였다. 시험 스트립을 48 시간 동안 혐기성 작업장에서 37℃에서 가습 배양 상자에서 배양한 다음, 각 큐풀의 색상을 기록하고 음성, 중간 양성, 양성 또는 의심 값으로 할당하였다.

API® 50을 사용하여, MRX004를 다음 탄수화물 공급원의 활용에 대해 양성으로 시험하였다: 아미돈(전분), 아미그달린, 아르부틴, 셀로비오스, 에스쿨린, 갈락토스, 겐티오비오스, 글루코스, 글리코겐, 프룩토스, 푸코스, 락토스, 말토스, 만노스, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 메틸 α-D-글루코피라노시드, N-아세틸글루코사민, 리보스, 사카로스(수크로스), 살리신, 소르비톨, 트레할로스, 투라노스 및 크실리톨(도 5). 이들 결과는 MRX004가 두 시험 시스템에서 갈락토스, 글루코스, 만노스 및 라피노스의 발효를 입증하였다는 점에서 Rapid ID 32A 시험에 대해 수득된 결과와 상관관계가 있었다.

실시예 5 -YCFA 배지에서 인간 세포에 부착

요약

인간 세포에 대한 균주 MRX004 및 다수의 다른 비피도박테리움 브리브 균주의 결합 수준을 YCFA 배지에서 3 개의 별도의 시점에서 결정하였다. 인간 세포에 부착된 박테리아를 배지에 재현탁한 다음 배지의 광학 밀도를 분석하였으며, 광학 밀도가 높을수록 박테리아 세포의 수가 많아져서, 인간 세포에 대한 박테리아 세포의 결합 수준이 높아진다. MRX004 균주는 비피도박테리움 브리브 참조 균주에 비해 인간 세포에 대해 감소된 부착을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

결과 및 분석

실험 결과는 도 6에 제시되어 있다.

도 6에 제시된 바와 같이, 참조 비피도박테리움 브리브 균주는 모든 시점에서 인간 세포에 대해 높은 부착 수준을 제시한다. 반면에, MRX004 균주는 인간 세포에 대해 크게 감소된 부착 수준을 갖는다. 따라서, 균주 MRX004의 인간 세포에 대한 낮은 부착성은 면역계에 대한 본 발명의 조성물의 유익한 효과를 증가시킬 수 있다.

실시예 6 - 안정성 시험

본원에 기재된 적어도 하나의 박테리아 균주를 함유하는 본원에 기재된 조성물을 25℃ 또는 4℃에서 밀봉된 용기에 저장하고 용기를 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95% 상대 습도를 갖는 대기에 배치한다. 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 2.5 년 또는 3 년 후, 박테리아 균주의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 표준 프로토콜에 의해 결정된 콜로니 형성 단위로 측정 시 남아있어야 한다.

실시예 7 - 항미생물 활성

도입

이 실험의 목적은 다양한 기준 균주에 대해 인간 유아에서 유래된 여러 비. 브리브 균주의 항미생물 활성 가능성을 시험하고 이들이 시험관 내에서 박테리오신을 생성하는지 여부를 평가하는 것이었다.

방법

이전에 비피도박테리움 종에 의해 억제되는 것으로 제시된 밀접하게 관련된 그람-양성, 다른 그람-양성 및 그람-음성 박테리아가 포함된 균주 패널을 기준 균주로 선택하였다(표 5) [오류! 북마크가 정의되지 않음].

공-배양 검정

균주를 Research Cell Bank(비. 브리브 시험 및 참조 균주의 경우) 또는 비드 스톡(기준 균주의 경우)으로부터 혐기성 조건(이. 콜라이, 비. 서브틸리스 및 에스. 아우레우스(S. aureus)의 경우 호기성 조건) 하에 37℃(비. 서브틸리스의 경우 30℃)에서 16 시간 동안 성장시켰다. 기준 균주의 론(lawn)을 YCFA 플레이트(E&O Labs, 영국 소재)에 만들고, 건조시키고 10 μl의 시험 균주 배양물을 론 위에 스폿팅하였다. 플레이트를 혐기성 조건 하에 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다(이. 콜라이, 비. 서브틸리스 및 에스. 아우레우스의 경우 혐기성 조건 하에 37℃에서 24 시간 이어서 호기성 조건 하에 37℃에서 24 시간). 각 검정을 삼중으로 수행하였다(MRx0004, 시험 1, 시험 2, 시험 3, 시험 4, 시험 5, 시험 6, 시험 7 및 시험 8을 사용한 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) NCIMB8045의 경우, 및 모든 비. 브리브 균주를 사용한 비피도박테리움 브리브 DSM20213, 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NCIMB8826, 클로스트리디움 스포로게네스(Clostridium sporogenes) ATCC3584, 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) NCIMB9518의 경우 중복 제외).

시험 균주 스폿 주위의 투명 구역인 관찰된 억제 구역의 너비를 측정하여 항미생물 활성을 평가하였다(도 22). 각 생물학적 반복실험에 대해 각 균주에 0 내지 3의 점수를 주었다.

배양 상청액

한천 확산법을 사용하여 배양 상청액의 항미생물 가능성을 시험하였다. 간단히 말해서, 100 μl의 여과된 무세포 상청액을 한천에 웰에 (상기 기재된 바와 같은) 기준 균주의 론으로 미리 접종시킨 YCFA 한천에 스폿팅하였다. 플레이트를 1 시간 동안 방치하여 확산시킨 다음 혐기성 조건(이. 콜라이, 비. 서브틸리스 및 에스. 아우레우스의 경우 호기성 조건) 하에 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 3 개의 생물학적 반복실험을 수행하였다.

결과

공-배양

시험된 대부분의 비. 브리브 균주는 이. 콜라이, 케이. 뉴모니아에, 에스. 티피뮤리움 및 비. 서브틸리스에 대한 길항 활성을 나타내었다(표 6). 비. 브리브 DSM 20091은 비. 브리브 DSM20213의 성장을 억제한 시험된 유일한 균주였다. MRx0004 및 다른 시험 비. 브리브 균주는 이. 콜라이, 케이. 뉴모니아에, 에스. 티피뮤리움 및 비. 서브틸리스에 대한 항미생물 활성을 나타내었으며(표 6), 비. 브리브 참조 균주보다 전반적으로 더 높은 억제가 관찰되었다. MRx0004, 시험 1, 시험 2, 시험 3, 시험 7, 시험 8, 시험 11 및 시험 12는 특히 강력한 항미생물 활성을 나타내었다. 시험된 조건에서 에스. 아우레우스, 씨. 스포로게네스(C. sporogenes) 및 엘. 플란타룸(L. plantarum)에 대한 길항적 활성은 검출되지 않았다.

이들 데이터는 MRX0004 및 관련된 시험 균주가 박테리아 감염을 치료하는에 유용할 수 있음을 나타낸다.

배양 상청액

무세포 상청액의 항미생물 활성을 동일한 기준 균주 패널에 대해 시험하였다. 임의의 기준 균주에 대해 시험된 모든 비. 브리브 균주에 대해 억제가 관찰되지 않았다(데이터는 제시되지 않음, n=3). 이는 공-배양 검정에서 관찰된 억제가 항미생물 분자의 분비 때문이 아니었음을 시사한다.

실시예 8 -효소적 활성의 추가 특징화

실시예 4에 기재된 API 32A 시험 시스템을 사용하여 실시예 7에서 시험된 비. 브리브 균주를 특징화하였다. Rapid ID 32A 시험을 제조업체의 설명서에 따라 박테리아 콜로니에 대해 수행하였다. 간단히 말해서, 박테리아를 혐기성 작업장에서 37℃에서 24 시간 동안 YCFA 한천에서 배양하였다. 콜로니를 멸균 5 μl 접종 루프를 사용하여 플레이트로부터 제거하고 McFarland 표준 No. 4와 거의 동등한 밀도가 달성될 때까지 API® 현탁 배지의 2 ml 앰플에 재현탁하였다. 55 마이크로리터의 박테리아 현탁액을 Rapid ID 32A 스트립 상의 각 큐풀에 첨가하였고, 우레아제 시험을 2 방울의 미네랄 오일로 덮어씌웠다. 스트립을 플라스틱 리드로 덮고 4 시간 동안 37℃에서 호기성으로 배양한 다음, 큐풀의 맨 아래 줄을 다음 시약을 사용하여 현상하였다: NIT: NIT1 및 NIT2 각각 1 방울; IND: James 시약 1 방울; 나머지 모든 큐풀: FastBlue 시약 1 방울. 스트립을 실온에서 5 분 동안 배양한 다음, 각 큐풀의 색상을 기록하고 음성, 중간 양성 또는 양성 값으로 할당하였다.

Rapid ID 32A 분석 결과는 도 23에 제시되어 있다. 실시예 4에서 발견된 바와 같이, MRX004는 여러 탄수화물 공급원, 즉 α-갈락토시다제 및 β-갈락토시다제, α-글루코시다제 및 β-글루코시다제, α-아라비노스, 만노스 및 라피노스, 뿐만 아니라 아미노산 아르기닌, 프롤린, 페닐알라닌, 류신, 티로신, 글리신 및 히스티딘의 발효에 양성으로 시험되었다.

Rapid ID 32A 분석을 또한 실시예 7에서 연구된 다른 시험 비. 브리브 균주(시험 1 - 시험 12) 및 비. 브리브 참조 균주(DSM 20091, DSM 20213, JCM 7017, 및 NCIMB 8807/UCC2003)에 대해 수행하였다. 시험 균주는 일반적으로 참조 균주보다 더 큰 항미생물 활성을 나타냈으며 MRX004와 유사한 대사 패턴을 나타내었다.

흥미롭게도, MRX004 및 시험 균주는 폴리사카라이드 라피노스를 발효시키는 반면, 4 종의 참조 균주는 그렇지 않았다. 상기 언급된 바와 같이, 라피노스는 엑소폴리사카라이드와 같은 박테리아 성분의 생성에 수반된다.

또한, MRX004 및 시험 3은 둘 다 강력한 항미생물 활성을 가지며 둘 다 β-글루코시다제 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타낸다.

MRX004 및 시험 2는 둘 다 강력한 항미생물 활성을 가지며 N-아세틸-β-글루코사미니다제의 양성 발효를 나타내지 않는다.

MRX004 및 시험 8은 둘 다 강력한 항미생물 활성을 가지며 둘 다 α-갈락토시다제 및 α-아라비노스의 중간 발효를 나타낸다.

시험 11 및 시험 12는 둘 다 강력한 항미생물 활성을 가지며 둘 다 세린 아릴아미다제를 발효시키지만 류실 글리신 아릴아미다제를 발효시키지 않고 알라닌 아릴아미다제를 발효시키지 않는다.

시험 3 및 시험 7은 둘 다 강력한 항미생물 활성을 가지며 둘 다 세린 아릴아미다제의 중간 발효를 나타낸다.

실시예 9 - 펄스장 겔 전기영동

펄스장 겔 전기영동(PFGE)을 사용하여 실시예 7에서 시험된 비. 브리브 균주를 특징화하였다. 결과는 도 24에 제시되어 있다. 시험 비. 브리브 균주는 참조 비. 브리브 균주보다 더 큰 항미생물 활성을 나타내며, 유사한 패턴으로 함께 그룹화되는 것으로 밝혀졌고 기준 균주와 구별될 수 있다.

실시예 10 - 펄스장 겔 전기영동

추가의 펄스장 겔 전기영동(PFGE) 연구를 MRx004 및 참조 비. 브리브 균주에 대해 수행하였다. PFGE는 일상적으로 임상 실험실에서 균주 유형화를 위해 "골드 표준"으로 적용되며 [100] 인간 배설물 비피도박테리움 단리물을 구별하는 효과적인 방법으로 보고되었다 [101]. 실제로, 많은 연구에서 XbaI 또는 SpeI 제한 효소로 소화된 게놈 DNA의 PFGE-분리된 단편의 핑거프린트 분석을 사용하여 비피도박테리움 단리물의 관계를 조사하였다 [102,103]. SpeI는 플라스미드 프로파일링 및 비피도박테리움 브리브의 특이적 유전형 분석에 특히 유용한 것으로 입증되었다 [104,105].

PFGE 플러그 제조

PFGE용 고분자량 DNA의 아가로스 겔 플로그를 공개된 프로토콜에 따라 제조하였다 [106].

PFGE 플러그 제한

단일 슬라이스(2 mm × 2 mm)를 실온에서 1 ml 10 mM Tris.Cl, 0.1 mM EDTA(pH 8.0)에서 15 분 동안 3 회 세척하였다. 각 슬라이스를 4℃에서 30 분 동안 효소에 대해 권장된 제한 완충액 250 μl와 함께 미리 배양한 다음 제한 효소 SmaI 20 단위를 함유하는 신선한 완충액 250 μl로 대체하였다. 제한 소화를 공급업체(New England Biolabs (UK) Ltd)의 권장사항에 따라 25oC에서 밤새 수행하였다.

PFGE

게놈 DNA(gDNA)의 처리된(제한 효소) 및 처리되지 않은 플러그를 다음 조건 하에 조사하였다. λ 레더(ladder)를 겔에 로딩하기 전에 45C로 가열하였다. 실행 조건은 20 시간 동안 14℃에서 6.0 V/cm였으며 펄스 시간은 0.5 × TBE 완충액에서 1 초에서 20 초로 경사를 이루었다. 람다 DNA 레더(Bio-Rad)를 크기 마커로 사용하였다. 플러그를 0.5xTBE(1 M Tris-보레이트, 0.5 M EDTA, pH 8.5)로 만들어진 1.0% 아가로스 겔(Bio-Rad)의 웰에 배치하고, 동일한 아가로스로 밀봉하였다. DNA 단편을 18 시간 동안 6 V/cm로 CHEF-DR III 펄스장 시스템(Bio-Rad Laboratories, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)을 사용하여 14℃에서 유지된 0.5Х TBE 실행 완충액에서 분리하였다. 선형 경사 펄스 시간을 선택하였다. 단편의 분리를 위해 1 초-15 초의 선형 경사 펄스 시간을 이용하였다. 겔을 광-제한 조건 하에 120 분 동안 0.5 μg/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 증류수에서 염색하였다.

PFGE 밴딩 패턴 분석

밴딩 패턴을 [107]에 요약된 지침을 사용하여 수동으로 평가하였다. PFGE 이미지를 BioNumerics 7.6(Applied Maths)에서 처리하여 각 균주에 대한 밴드 핑거프린트를 생성하였다. Jaccard 유사성 계수(핑거프린트-유형 분석을 위해 권장됨) 및 산술 평균 비가중 쌍별 그룹 방법(UPGMA)을 사용하여 핑거프린트에 대한 클러스터 분석을 수행하였다.

결과

본 연구에 이용된 DNA 소화 및 전기영동 조건은 이전에 비. 브리브의 종을 아형화하는데 효과적인 것으로 제시되었으며 [104] 비. 브리브의 균주를 아종 수준으로 구별하는 충분한 분해능(10 개 초과의 관찰가능한 밴드)을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 5 종 중 4 종의 균주의 제한 단편은 뚜렷하고 잘 분해되었다(도 25). 클러스터 분석(도 26)은 균주 MRx0004의 유전자형이 본 연구에서 분석된 다른 비. 브리브 균주보다 비. 브리브 REF7과 더 밀접하게 관련되어 있음을 시사한다.

실시예 11 - T 세포 분화

MRx0004이 T-세포 분화를 유도하는 능력을 말초혈 단핵 세포(PBMC, Stemcell, Cat:70025) 상에서 시험관내 탐색하였다. 간략하게, PBMC를 웰 당 50 ㎕ cRPMI 배지(cRPMI는 RPMI 1640(+L-Glut, 21875-034) 2 mM 최종 농도 스톡 200 mM; 10% HI FBS(Gibco life technologies, 10082-147); 50 μM 메르캅토에탄올(Gibco life technologies, 21985-023); 및 1% pen/strep(P4333, 10 ㎎/㎖)을 함유함) 중 400,000/웰로 항-CD3(Ebioscience, CD3 모노클로날 항체(OKT3 클론), 기능적 등급, cat. No. 16-0037-81)과 함께 96-웰 플레이트에 플레이트접종하였다. 이어서 열-사멸 MRx0004(30분 동안 80℃에서 인큐베이션에 의해 제조한 후, 배양을 PBS로 세척하고 적절한 세포 배양 배지 중에 재현탁하고, 생활성 세포수를 플레이트접종에 의해 확인함)을 100 ㎕/웰로, 각 웰에 4,000,000개 첨가하였다.

37℃ 인큐베이터에서 3일 후, 세포를 제거하고, 5시간 동안 PMA-(Sigma, Cat no. P8139), 이오노마이신(Sigma, Cat no. I3909) 및 GolgiSTOP(BD, Cat no 554724)을 함유하는 배지 중에 재현탁하였다. PMA 스톡은 DMSO 중 1 ㎎/㎖이었고 이를 100 ng/㎖(각 샘플은 cRPMI 중 50 ng/㎖로 요구됨)로 추가 희석하였고, 이오노마이신 스톡은 DMSO 중 1 mM이었고(cRPMI 중 1 μM을 사용함) GolgiStop 농도는 4 ㎕/6 ㎖로 사용하였다. 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시켰고 공동-배양 배지 중에 적절히 희석하였다.

이어서 세포로 유세포측정 염색을 거쳤다:

세척 후, 세포를 실온에서 암소에서 10분 동안 PBS 중 생활성 염료(Viobility 405/520 Miltenyi biotec의 고정형 염료 1 ㎕/샘플) + 인간 Fc 블록, cat. 564219(1 ㎕/샘플)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 표면 항체(각각 2 ㎕) - CD3-APC-Vio 770(Miltenyi, cat. No. 130-113-136), CD4-VioBlue(Miltenyi, cat. No. 130-114-534) 및 CD25-VioBright FITC(Miltenyi, cat. No. 130-113-283)를 실온에서 암소에서 10분 동안 웰에 직접 첨가하였다. 그 후 세포를 PBS 중에 2회 세척하고 300 g/5분/RT에서 회전 침강시켰다.

이어서 eBioscience FoxP3 전사 인자 염색 완충액(cat. No. 00-5523)을 사용하여 세포를 고정하고 투과화하였다. eBioscience 프로토콜에 따라, 1x의 농축 및 3의 희석제를 사용하여 perm/fix 완충액을 제조하였다. 세포를 RT에서 1 h 동안 고정한 후 1x Perm 세척액 중 2x 세척하고 300 g/5분/RT로 회전 침강시켰다. 하기 세포내 염색 또는 전사 인자 항체를 45mis/암소/RT에서 또는 하룻밤 동안(최대 18 h) 냉장고에서 perm 세척액(1x) 중 샘플에 첨가한 후, Perm 세척액(300 ㎕)을 사용하여 항체를 2x 세척하고, PBS(250 ㎕) 중에 재현탁하여 세포측정기 상에서 획득하였다:

· 항 IFNy-PE Vio770 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-114-025)

· 항 IL10-PE 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-112-728)

· 항 IL17a-APC 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-099-202)

· 항 RoRyt-PE 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-103-837)

· 항 Tbet-APC 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-098-655

· Foxp3 모노클로날 항체(236A/E7), Pe cy7(ebioscience) cat. No. 25-4777-41

도 27 및 28에서 알 수 있듯이, MRx0004의 상청액(SP 4) 및 열-사멸 MRx0004 (HK 4)은 모두 분화를 유도하기 위한 사이토카인의 부재 하에서도(세포 없음), T 헬퍼 세포 및 세포독성 T 세포 각각의 분화를 유도할 수 있었다.

표

표 1. 본 연구에서 균주 생성에 사용된 균주, 플라스미드, 및 프라이머

표 2. 나노LC-MS/MS에 의해 식별된 MRx0004 후기 대수기 배양 상청액에서 식별된 가장 높은 펩티드 스펙트럼 일치(PSM) 값을 갖는 20 개 단백질의 목록.

이 표는 3 개의 생물학적 반복실험에서 식별된 PSM 값 ≥5를 갖는 모든 단백질을 나열한다.

표 3. 나노LC-MS/MS에 의해 식별된 MRx0004 세포 떼내기에서 식별된 가장 높은 펩티드 스펙트럼 일치(PSM) 값을 갖는 상위 20 개 단백질의 목록.

이 표는 MRx0004 떼낸 및 탈락된 단백질 분획 둘 다에서 식별된 62 개의 단백질 및 배타적으로 MRx0004 떼낸 단백질 분획에서만 식별된 44 개의 단백질을 나열한다. 나열된 단백질은 PSM 값 ≥5 및 3 개의 생물학적 반복실험에서 검출하였다.

표 4. MRx0004 및 EPS ^neg 균주 떼낸 단백질 분획에서 식별된 숙주-상호작용 단백질의 비교.

이 표는 3 개의 생물학적 반복실험에서 PSM 값 ≥5인 떼낸 단백질 분획에서 나노LC-MS/MS에 의해 식별된 선택된 단백질을 나열한다.

표 5. 실시예 7에 사용된 기준 균주 목록

표 6. 기준 균주 패널에 대한 시험 및 참조 비. 브리브 균주의 항미생물 활성(n=3)

실시예 12 - MRx004는 비장에서 면역 자극 효과를 갖는다.

요약

본 연구의 목적은 비장에서 MRx0004의 시험관내 면역 자극 특성을 특징화하는 것이었다.

재료 및 방법

처리: 처리되지 않은, 10% YCFA 및 10% 비피도박테리움 브리브 균주 MRx0004.

비장세포 준비

비장세포를 6 내지 8 주령 암컷 C57BL/6 마우스에서 단리된 비장으로부터 신선하게 준비하였다. 간단히 말해서, 비장세포를 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 55 μM의 β-머캅토에탄올이 함유된 RPMI 1640에 96 웰 플레이트에서 900,000 개 세포/웰로 플레이팅하고, 휴지 상태로 두거나 또는 10% 박테리아 배지 YCFA+(블랭크 배지) 또는 정지 MRx0518 배양물로부터의 10% 무세포 박테리아 상청액으로 자극한 다음 37℃에서 CO2 배양기에서 72 시간 동안 배양하였다. 그 후에 무세포 상청액을 수집하고, 4℃에서 500g로 5 분 동안 스핀 다운하였다. 그 다음에 샘플을 수집하고 사이토카인 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다.

MTT 검정

MTT 검정 키트는 Merck Millipore(Cat n. CT01)에서 구입하였다. 72 시간 배양 후, 10μl의 MTT 용액을 각 웰에 첨가하였고, 세포를 4 시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 그 후에 100μl의 이소프로판올/0.04 M HCL 용액을 각 웰에 첨가하였고 560nm 파장 및 655 nm의 참조 파장에서 흡광도를 측정였다.

사이토카인 분석

사이토카인 정량화는 제조업체의 권장사항에 따라 26-플렉스 마우스 ProcartaPlex 멀티플렉스 면역검정(Thermo Fischer Scientific)을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해서, xPONENT 소프트웨어(Luminex, 미국 텍사스주 오스틴 소재)가 장착된 MAGPIX® MILLIPLEX® 시스템(Merck)을 사용하여 사이토카인 정량화를 위해 50 μl의 무세포 공-배양 상청액을 사용하였다. 데이터는 평균 형광 강도를 pg/ml 값으로 변환하기 위해 5-매개변수 로지스틱 곡선 및 배경 차감을 사용하여 MILLIPLEX® 분석 소프트웨어(Merck)를 사용하여 분석하였다.

유세포 분석

세포를 먼저 Viobility 405/520 Fixable Dye(Miltenyi Biotec Ltd. 독일 베르기슈 글라트바흐 소재)로 염색하여 실온에서 암실에서 10 분 동안 살아있는 세포 및 죽은 세포를 구별하였다. 그 다음에 CD3, CD4, CD8 및 IFN-γ에 대한 항체 칵테일로 염색하여 세포 표현형을 결정하고(Miltenyi REA 항체) 실온에서 추가 10 분 동안 배양하였다. 그 다음에 세포를 세척하고 PBS에 재현탁하고 즉시 유세포 분석을 통해 분석하였다. 이소형은 첫번째 실험 동안 모든 항채에 대해 사용되어 게이트 설정을 도왔고 FMO 대조군은 모든 실험 전반에 걸쳐 포함되었다. 모든 실험은 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences, 영국 레딩 소재)를 사용하여 "Live" 게이트에서 100,000 개 세포용 획득 설정에 대한 중지 게이트가 있는 BD FACS Aria II를 사용하여 수행하였다. 분석은 Flowjo 버전 10.4.2 소프트웨어(FlowJo LLC, 미국 오레곤 소재)를 사용하여 수행하였고 생존력 염료로 식별된 살아있는 세포를 기반으로 하였다.

결과

처리 후 비장세포의 생존력을 대사 활성을 측정하는 MTT 검정을 사용하여 평가하였다. 도 29는 비장세포가 MRx0004로 처리 후 생존가능하였음을 제시한다.

도 30은 MRx0004로 처리가 IL-6, IL-17a IL-22, TNF-α, RANTES, IFN-γ, CCL3, CCL4 및 CXCL2를 포함하여 비장에서 다양한 전염증성 사이토카인을 증가시킬 수 있음을 제시한다. 이들 데이터는 살아있는 비피도박테리움 브리브가 면역계에 대한 자극 효과를 가짐을 나타낸다. IFNγ를 생성하기 위해 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 활성화시키는 MRx0004의 능력은 도 31에 제시되어 있다.

실시예 2 및 11에 논의된 PBMC 데이터와 조합하여, 이들 데이터는 다중 조직에서 T-세포를 활성화시키고 전염증성 사이토카인의 수준을 증가시킴으로써, 면역계를 자극하는 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주의 능력을 뒷받침한다.

서열

서열번호: 1(수탁 번호 NCIMB 42380으로 기탁된 비피도박테리움 브리브 균주에 대한 공통16S rRNA 서열)

서열번호: 2-5 - 표 1 참조

참고문헌

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Claims (30)

1. 대상체에서 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한, 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 대상체에서 면역결핍 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 면역결핍 질환이 1차 면역결핍 질환 또는 2차 면역결핍 질환인, 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 1차 면역결핍 질환이 선택되는, 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 2차 면역결핍 질환이 AIDS, 백혈병과 같은 면역계의 암, 바이러스성 간염 다발성 골수종과 같은 면역-복합 질환으로부터 선택되는, 조성물.
6. 제1항에 있어서, 백신 보조제로서 사용하기 위한, 조성물.
7. 제1항에 있어서, 면역 노화를 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용하기 위한, 조성물.
8. 제1항에 있어서, CAR-T와 같은 세포 요법을 향상시키는 데 사용하기 위한, 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12p70, IL-12p70, IFNγ, IL-4, TNF-α 및/또는 IL-17α의 발현 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 사용하기 위한, 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, TLR2를 자극하는 데 사용하기 위한, 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, NFκB를 자극하는 데 사용하기 위한, 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 완전 엑소폴리사카라이드 유전자좌를 포함하는, 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 풀루라나제를 발현하는, 조성물.
14. 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물.
15. 제14항에 있어서, 위장관 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 조성물.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 그람-음성 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 서열번호: 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나 또는 상기 박테리아 균주가 서열번호: 1에 의해 나타낸 16s rRNA 유전자 서열을 갖는, 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 라피노스를 발효시킬 수 있는, 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, α-글루코시다제 및 β-글루코시다제, α-아라비노스, 만노스 및 라피노스 중 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두를 발효시킬 수 있는, 조성물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 NCIMB에 수탁번호 42380로 기탁된 균주인, 조성물.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 경구 투여를 위한, 사용하기 위한 조성물.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 사용하기 위한 조성물.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 동결건조된, 사용하기 위한 조성물.
24. 비피도박테리움 브리브 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 감소된 면역자극과 연관된 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 박테리아 균주 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포가 하나 이상의 이종성 항원을 발현하는 조성물.
26. 제25항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 이종성 항원을 제시하는 조성물.
27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 백신으로 사용하기 위한 조성물.
28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 박테리아 균주 세포로서, 상기 세포가 하나 이상의 이종성 항원을 발현하는 세포.
29. 제28항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 이종성 항원을 제시하는 세포.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 백신으로 사용하기 위한 세포.

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