ES2768690T3 - Cepas de Bifidobacterium adolescentis probióticas - Google Patents

Abstract

Una cepa aislada de Bifidobacterium adolescentis seleccionada del grupo que consiste en DSM 29103 y un mutante de dicha cepa que es capaz de i) aumentar la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de una monocapa de células Caco-2 después de 10 h de tratamiento a más del 120% de la TER al inicio del tratamiento; ii) inducir secreción de >200 pg/ml de IL-10 cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas; e iii) inducir una proporción IL-10:IL-12 > 1 cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas de Bifidobacterium adolescentis probióticas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una cepa aislada de Bifidobacterium adolescentis seleccionada del grupo que consiste en DSM 29103 y un mutante de dicha cepa que es capaz de i) aumentar la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de una monocapa de células Caco-2 después de 10 h de tratamiento a más del 120% de la TER al inicio del tratamiento, ii) inducir la secreción de >200 pg/ml de IL-10 cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas, y iii) inducir una proporción IL-10:IL-12 > 1 cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas.

Además, la invención se refiere a una cepa aislada de la invención y a un producto probiótico que comprende una cepa aislada de la invención y un crioprotector para uso en mejorar la función barrera intestinal y/o provocar una respuesta inmunitaria antiinflamatoria.

Las cepas de Bifidobacterium adolescentis fermentan D-ribosa, no fermentan D-sorbitol y tienen una secuencia génica ribosómica 16S que comprende SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 7; y SEQ iD NO: 10.

Antecedentes de la invención

Las bifidobacterias son habitantes naturales de aparato digestivo que poseen adaptaciones genéticas que permiten la colonización de este hábitat duro y complejo. Las bifidobacterias interactúan con elementos clave del funcionamiento intestinal y contribuyen a mantener la homeostasis. Progreso científico reciente ha demostrado que las bifidobacterias, mediante interacciones dependientes de cepa con el huésped pueden reducir la carga de antígeno de la mucosa, mejorar la barrera intestinal, e inducir la regulación de las respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Debido a sus beneficios reconocidos para la salud humana, las bifidobacterias se usan como probióticos. Los probióticos son “microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio de salud al huésped” (FAO/WHO, 2001). Aproximadamente una docena de cepas de Bifidobacterium con efectos clínicamente documentados están comercialmente disponibles. La mitad de estas son cepas de Bifidobacterium animalis subsp. lactis y las restantes son cepas de Bifidobacterium longum subsp. longum, B. longum subsp. infantis, o Bifidobacterium breve.

La cepa tipo de Bifidobacterium adolescentis (ATCC15703T) se aisló del intestino de un adulto (Reuter, 1971). Las cepas de B. adolescentis con frecuencia se detectan el aparato digestivo humano adulto (Turroni et al., 2009).

El epitelio intestinal es la capa celular columnar y no ciliada que recubre el intestino delgado y grueso. La capa epitelial intestinal constituye la mayor y más importante barrera contra el medio externo y mantener la integridad epitelial es esencial para conservar la salud. El recubrimiento intestinal consiste en una única capa de células epiteliales cubierta por capas de moco producido por células caliciformes especializadas. Debajo de las células epiteliales está la lámina propia que contiene una variedad de células inmunitarias (tejido linfoide asociado al intestino; GALT). Las células epiteliales están unidas por uniones celulares de las que las uniones estrechas (TJ) desempeñan un papel principal en prevenir que entren moléculas en el epitelio entre las células.

Las TJ son responsables de restringir la difusión paracelular (entre células) de proteínas, lípidos y solutos pequeños. Por tanto, en un epitelio sano, solo agua y moléculas pequeñas (iones) penetran por vía paracelular mientras que el transporte de las moléculas más grandes está regulado por mecanismos de absorción celular. Las TJ consisten en proteínas que atraviesan el espacio entre dos células epiteliales intestinales adyacentes. Las TJ son estructuras dinámicas que están implicadas en procesos de desarrollo, fisiológicos y patológicos. Varios factores estresantes pueden producir el debilitamiento de la TJ, aumentando de esta manera el transporte paracelular (no regulado) de moléculas en la mucosa. Una función barrera intestinal comprometida se caracteriza por permeabilidad aumentada de la mucosa intestinal a macromoléculas luminales, antígenos, y toxinas que pueden producir inflamación, degeneración y/o atrofia de la mucosa. Este estado, algunas veces denominado 'síndrome del intestino permeable' se asocia con una multitud de síntomas dependiendo de la gravedad. Los lipopolisacáridos (LPS) derivados de bacterias Gram negativas en el intestino son activadores muy potentes de la respuesta inmunitaria. Una vez que el sistema inmunitario de la mucosa se activa por mediadores proinflamatorios, se agrava la apertura de las TJ lo que produce un círculo vicioso de permeabilidad aumentada e inflamación.

Se ha mostrado que las cepas bacterianas probióticas disminuyen la permeabilidad epitelial intestinal, in vitro (Anderson, et al., 2010; Karczewski et al., 2010; Liu et al., 2010a; Liu et al., 2010b; Donato et al., 2010), en modelos de ratón (Generoso et al., 2010; Liu et al., 2011; Miyauchi et al., 2009), y en seres humanos (Karczewski et al., 2010). En general, se ha encontrado buen acuerdo entre los resultados in vitro e in vivo.

Los mecanismos implicados en la mejora probiótica de la función barrera incluyen expresión aumentada de las proteínas de las TJ, tal como ocludina, claudina-1, receptor de F11 (F11R), y zona de oclusión 1 (ZO-1) y 2 (Anderson, et al., 2010; Liu et al., 2010a; Liu et al., 2010b; Miyauchi et al., 2009; Ukena et al., 2007. La localización aumentada de ocludina y ZO-1 a la vecindad de las estructuras TJ se encontró en biopsias humanas (Karczewski et al., 2010) o en monocapas de Caco-2 tratadas con L. plantarum WCFS1 (Karczewski et al., 2010) o L. rhamnosus LGG (Donato et al., 2010), que posiblemente implica señalización del receptor de tipo Toll 2 (TLR) (Karczewski et al., 2010).

En un modelo de ratón neonatal de enterocolitis necrotizante (NEC) se encontraron aumentos de permeabilidad intestinal que precedían a NEC, mientras que la administración de B. infantis BB-02 atenuaba el aumento de permeabilidad intestinal, conservaba la localización de ocludina y claudina 2 y 4 en las TJ, y disminuía la incidencia de NEC (Bergmann et al., 2013). La permeabilidad intestinal aumentada asociada con colitis en ratones se prevenía por completo por probióticos (VSL#3) al contraequilibrar la expresión disminuida y la redistribución de ocludina, ZO-1, y claudina-1, -3, -4, y -5 (Mennigen et al., 2009). Los componentes de señalización bacterianos propuestos incluyen la proteína de la capa superficial de Lactobacillus plantarum (Liu et al., 2010a), e indol (Bansal et al., 2010).

In vivo, la función barrera se puede medir por varios métodos de ensayo no invasivos administrando un bolo de, por ejemplo, CrEDTA o dos azúcares no metabolizables (por ejemplo, lactulosa y manitol) seguido por determinar el Cr o la proporción de los dos azúcares en orina, respectivamente. El manitol es un monosacárido y por tanto se absorbe fácilmente y sirve como un marcador de absorción transcelular, mientras que el disacárido lactulosa es excluido por el revestimiento celular y por tanto solo se absorbe ligeramente y sirve como un marcador para integridad de la mucosa. La prueba de la lactulosa y el manitol proporciona información de la integridad relacionada solo con el intestino delgado, debido a la rotura bacteriana de los azúcares en el intestino grueso, mientras que CrEDTA es más estable y preferentemente proporciona información sobre el epitelio colónico ya que este es dónde el compuesto está presente durante el tiempo más largo (Arrieta et al., 2006).

La función barrera intestinal insuficiente se asocia con manifestaciones clínicas tanto intestinales como sistémicas. La permeabilidad intestinal se ha estudiado de forma más extensa en el contexto de la enfermedad intestinal inflamatoria (EII) y el síndrome del intestino irritable (SII). Las enfermedades intestinales inflamatorias (EII; enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) se caracterizan por inflamación intestinal recidivante crónica con implicación del sistema inmunitario tanto innato como adaptativo (Zhang y Li, 2014). Las rutas proinflamatorias que implican la citoquina interleuquina 23 (IL-23) y células T cooperadoras 17 (T^h17) están elevadas en pacientes con colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn (Song et al., 2013) que está apoyado por descubrimientos genéticos que implican una asociación entre variantes génicas en el gen IL23R y EII (Beaudoin et al., 2013). La etiología de la EII es desconocida, pero existen datos de apoyo extensos de una función barrera intestinal comprometida en EII (Gecse et al., 2011; Gerova et al., 2011; Odenwald y Turner, 2012). En pacientes de Crohn con enfermedad activa se encontró permeabilidad intestinal aumentada (Ukabam et al., 1983) y también el 10-20% de parientes sanos respecto a pacientes con enfermedad de Crohn tienen permeabilidad aumentada (Hollander et al., 1986). Una teoría de la patogénesis de la EII sugiere que una permeabilidad intestinal aumentada expone el GALT subyacente a agentes normalmente excluidos que produce un proceso inflamatorio autoperpetuante (Poritz et al., 2007). En el modelo de ratón de colitis con sulfato sódico de dextrano (DSS) se ha mostrado que la permeabilidad intestinal aumentada precede al desarrollo de inflamación intestinal significativa (Poritz et al., 2007).

Los síntomas del síndrome del intestino irritable (SII) incluyen cólicos y dolor abdominales que con frecuencia es concurrente con hábitos intestinales anómalos con diarrea, estreñimiento, o episodios alternantes de ambos. La etiología y patofisiología del SII son desconocidas. Varios estudios han mostrado permeabilidad intestinal aumentada en SII (Camilleri et al., 2007; Camilleri et al., 2012; Gecse et al., 2011; Martinez et al., 2012; Piche et al., 2009). La permeabilidad aumentada resulta de la alteración de la expresión apical normal de las proteínas de TJ claudina-1, ZO-1 y ocludina (Camilleri et al., 2012). La permeabilidad intestinal aumentada está acompañada por activación inmunitaria de bajo grado persistente en el intestino. Un estudio previo encontró calprotectina fecal elevada en pacientes de SII (Goepp et al., 2014) que indica inflamación elevada. También puede estar implicada la disregulación de citoquinas en el proceso inflamatorio y metaanálisis recientes han mostrado asociaciones entre polimorfismos génicos de IL-10 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y SII (Qin et al., 2013; Schmulson et al., 2013; Bashashati et al., 2012). Se observó un desequilibrio suero/plasma en la citoquina TNFa en SII comparado con los controles (Bashashati et al., 2014) y en pacientes de SII con diarrea predominante los niveles en suero tanto de IL-6 como TNFa eran significativamente mayores comparados con los controles (Rana et al., 2012). En conjunto, esto sugiere un desplazamiento inmunitario hacia una fase más proinflamatoria.

El tratamiento con leche fermentada probiótica (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus, y B. longum) disminuyó significativamente la permeabilidad del intestino delgado en pacientes de SII y mejoró las puntuaciones de SII globales medias (Zeng et al., 2008).

La enfermedad hepática crónica está asociada con cambios en el intestino y las enfermedades hepáticas se han asociado con cambios microbianos del intestino (Schnabl y Brenner, 2014). Estos cambios en la composición microbiana pueden llevar a la activación del sistema inmunitario de la mucosa a través de receptores TLR y receptores de tipo Nod (NLR) que reconocen productos microbianos seguido por activación del potenciador de cadena ligera kappa del factor nuclear de células B activadas (NF-kB) que inicia el reclutamiento de células inmunitarias (Chassaing et al., 2014). Los animales genéticamente modificados tal como ratones mutantes TLR4 desarrollaron significativamente menos fibrosis hepática y reclutamiento de macrófagos hepáticos después de la ligación del conducto biliar comparado con ratones de tipo salvaje lo que indica la implicación de la ruta de TLR4 en el desarrollo de enfermedades hepáticas crónicas (Seki et al., 2007). Se mostró que la conexión entre enfermedad hepática colestática e inflamación local en la lámina propia intestinal estaba mediada por monocitos positivos para TLR2 que secretan TNFa que también se asoció con rotura de las proteínas de TJ ZO-1 y claudina-4 (Hartmann et al. 2012). La translocación de bacterias o sus productos, por ejemplo, LPS a ganglios linfáticos mesentéricos y sitios extraintestinales es común en pacientes con cirrosis hepática debido a permeabilidad intestinal aumentada (Seo y Shah, 2012), y en pacientes con enfermedad hepática crónica y crecimiento excesivo bacteriano intestinal con translocación bacteriana, la gravedad de la enfermedad se correlaciona con niveles sistémicos de LPS (Lin et al. 1995). Tanto en modelos animales como en pacientes con enfermedad hepática crónica, el tratamiento con antibióticos mejora la gravedad de la enfermedad al reducir la carga bacteriana y endotoxemia (Seki et al. 2007; Cirera et al. 2001). Sin embargo, un intestino permeable y la translocación de productos microbianos también se producen pronto en la enfermedad y los pacientes con enfermedad hepática tienen una barrera intestinal alterada y los productos bacterianos se encuentran en la circulación sistémica. Los productos microbianos alcanzan el hígado a través de la vena porta o los conductos linfáticos, donde activan receptores hepáticos del sistema inmunitario innato (Schnabl, 2013).

Experimentos en pacientes con la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) llevados a cabo por Miele et al. (2009) sugieren fuertemente que EHGNA se asocia con permeabilidad intestinal aumentada y crecimiento excesivo bacteriano en el intestino delgado. La translocación bacteriana se correlaciona con niveles en plasma de citoquinas proinflamatorias y activación de óxido nítrico sintasa (Frances at al., 2010), que pueden causar lesiones en el hígado. Por tanto, reducir la translocación bacteriana podría representar un tratamiento para aliviar las enfermedades hepáticas.

La translocación bacteriana disminuida a ganglios linfáticos mesentéricos, sangre de la porta y arterial se encontró en un modelo en rata de lesión hepática aguda después del tratamiento con combinaciones de lactobacilos (L. acidophilus NM1, L. rhamnosus GG, L. plantarum 299v, L. rhamnosus 271, y B. animalis NM2). Además, se encontraron niveles reducidos de Enterobacteriacea (bacterias Gram negativas) en el ciego y el colon. El daño hepatocelular disminuido estaba indicado por niveles más bajos de alanina aminotransferasa en suero (Adawi et al., 2001). El tratamiento probiótico no solo disminuye la translocación bacteriana, sino que también reduce la exotoxemia causada por endotoxinas, principalmente LPS derivado de bacterias Gram negativas. Parece plausible que las endotoxinas son importantes para el desarrollo de EHGNA y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) a través de la estimulación de células de Kuppfer y la producción de TNFa (Osman et al., 2007). Los niveles de endotoxinas en plasma reducidos pueden ser el resultado de disminuir la permeabilidad intestinal.

Se han encontrado concentraciones reducidas de endotoxina en plasma en pacientes de cirrosis después del tratamiento con dos mezclas probióticas (Bifidobacterium, L. acidophilus y Enterococcus [Bifico®], o Bacillus subtilis y Enterococcus faecium [Medilac-s®]) (Wigg et al., 2001), o después del tratamiento con un producto simbiótico (Pediococcus pentosaceus 5-33:3, Leuconostoc mesenteroides 32-77:1, L. paracasei subsp. paracasei F19, L. plantarum 2592 fibras fermentables bioactivas; Medipharm), o tratamiento con la mezcla probiótica sola (Zhao et al., 2004). Se encontró una disminución marginal de endotoxemia después del tratamiento con E. coli Nissle 1917 comparado con placebo en pacientes cirróticos (Liu et al., 2004).

Se sabe bien que el alcohol aumenta la permeabilidad intestinal y esto puede acelerar la evolución de la enfermedad hepática al aumentar la endotoxina circulante portal (LPS). Se encontró que factores solubles de L. rhamnosus LGG reducían el aumento de permeabilidad intestinal inducida por alcohol y la translocación de endotoxina, y mejoraban la lesión hepática inducida por alcohol aguda en un modelo de ratón (Wang et al., 2012). La mejora de la barrera intestinal por probióticos está bien documentada in vitro e in vivo. Dada la importancia de la translocación bacteriana y endotoxemia para el desarrollo de enfermedades hepáticas parece probable que los probióticos con propiedades de fortificación de la barrera intestinal tuvieran un efecto beneficioso sobre EHGNA y EHNA.

Los trastornos metabólicos (diabetes de tipo 2 y resistencia a insulina) y la obesidad están estrechamente unidos a la inflamación. Evidencia reciente sugiere una interacción entre la dieta con alto contenido en grasa y bacterias, y la mucosa intestinal puede fomentar la inflamación del intestino delgado como un suceso temprano en el desarrollo de la obesidad y resistencia a insulina (Ding y Lund, 2011). Estudios animales mostraron un aumento en TNFa en el íleon en ratones alimentados con dieta alta en grasa antes de que la ganancia de peso y grasa se hicieran evidentes y también la ruta proinflamatoria de NF-kB estaba aumentada en el íleon y a un menor grado en el colon de ratones alimentados con dieta alta en grasa (Ding et al., 2010). En niños gravemente obesos la calprotectina fecal estaba aumentada en el 47% de los pacientes, mientras que el ácido nítrico rectal era patológicamente alto en el 88% de los niños obesos y en el 100% de los pacientes diabéticos lo que apoya la hipótesis de que la inflamación intestinal distal está implicada en obesidad y diabetes (Spagnuolo et al., 2010). En un estudio en mujeres obesas, la expresión génica de rutas proinflamatorias estaba drásticamente disminuida después de una pérdida de peso inducida por dieta de una media del 10%, acompañada por reducción en TNFa, IL-1p, IL-8, y proteína quimiotáctica de monocitos 1 e infiltración de macrófagos (Pendyala et al., 2011). En conjunto, estos datos implican que el intestino en sujetos obesos y pacientes diabéticos tiene un estado inflamatorio aumentado comparado con sujetos sanos y que esto puede seguir al desarrollo de ganancia de peso y desequilibrios de glucosa/insulina. Los ratones libres de gérmenes están protegidos contra las complicaciones metabólicas de la exposición a una dieta 'occidental' alta en grasa/alta en azúcar refinado. Se ha identificado el LPS bacteriano translocado como un factor desencadenante de inflamación crónica, de bajo grado, denominada 'endotoxemia metabólica' (Cani et al., 2007). Según este modelo, se libera LPS de bacterias Gram negativas que se lisan en el intestino y se transloca a través del epitelio cuando la barrera está comprometida, por ejemplo, como consecuencia de una dieta que contiene alta grasa. Los niveles aumentados de LPS en plasma (2-3 veces) producen un tono inflamatorio ligeramente aumentado, pero persistente, que desencadena ganancia de peso y resistencia a insulina (Cani et al., 2007). En pacientes con diabetes de tipo 2 se encuentran niveles circulantes aumentados de LPS y marcadores de permeabilidad intestinal (zonulina) (Hawkesworth et al., 2012; Jayashree et al., 2014), así como en pacientes de diabetes de tipo 1 (de Kort et al., 2011; Vaarala et al., 2008). El aumento de zonulina, es decir, permeabilidad intestinal aumentada parece preceder al inicio de la diabetes de tipo 1 (Sapone et al., 2006). La colonización de los intestinos con bifidobacterias aumenta la función barrera intestinal mediante el aumento de la expresión de ZO-1 y ocludina, y mejora de forma significativa y positiva la tolerancia a glucosa, la secreción de insulina inducida por glucosa y normaliza el tono inflamatorio (Cani et al., 2007).

La endotoxemia metabólica debido a la pérdida de integridad de la barrera intestinal activa la inflamación mediada por TLR4 e induce estrés oxidativo que se asocia con riesgo cardiovascular aumentado y mortalidad. La translocación aumentada de LPS a través de la barrera intestinal produce mayores niveles circulantes de LPS que fomentan ateroesclerosis (Neves et al., 2013). Los marcadores de inflamación sistémica tal como LPS circulante está elevado en pacientes con infecciones crónicas y son predictores fuertes de riesgo ateroesclerótico aumentado (Kiechl et al., 2001).

Los elementos clave de las enfermedades autoinmunitarias son la inmunidad adaptativa y un desequilibrio entre las respuestas inmunitarias T^h1 y T^h2. En neonatos los antígenos microbianos pueden inducir una respuesta inmunitaria T^h1 que compensa la normalmente dominante respuesta inmunitaria T^h2. Una respuesta inmunitaria T^h1 es característica de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias. Recientemente, se ha propuesto que una barrera intestinal comprometida está implicada en el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias (Fasano y Shea-Donohue, 2005). Según esta hipótesis hay tres elementos clave en la patogénesis de enfermedades autoinmunitarias.

1. Una mala comunicación entre la inmunidad innata y adaptativa.

2. La estimulación continua por antígenos no propios (desencadenantes medioambientales) perpetúa el proceso.

3. Una pérdida de función protectora de las barreras mucosas que interaccionan con el medio (mucosa gastrointestinal y pulmonar).

La patología de la enfermedad celiaca es un ejemplo. Pronto en el desarrollo de la enfermedad celiaca las TJ se abren y se produce daño al tejido intestinal. La gliadina desencadena la ruta de inmunidad innata de zonulina de una manera dependiente de MyD88 que inicia la apertura de TJ e induce una respuesta proinflamatoria (T^h1) en la mucosa intestinal. Una vez la gliadina (gluten) se elimina de la dieta, los niveles de zonulina en suero disminuyen, el intestino reanuda su función barrera basal, los títulos de autoanticuerpos se normalizan y el proceso autoinmunitario se para (Fasano y Shea-Donohue, 2005, Fasano, 2012).

Varias otras enfermedades autoinmunitarias, incluyendo diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple y artritis reumatoide, se caracterizan por permeabilidad intestinal aumentada que permite el paso de antígenos desde la microbiota intestinal, desafiando al sistema inmunitario a producir una respuesta inmunitaria que se puede dirigir a cualquier órgano o tejido (por mimetismo molecular) en individuos genéticamente predispuestos (Fasano, 2012). Además, se ha reconocido que el sistema inmunitario de particularmente el intestino delgado induce respuestas tolerogénicas a, por ejemplo, antígenos de alimentos o comensales que pueden estar implicados en el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias. Se reconoció que el intestino delgado redirigía y controlaba células T^h17 proinflamatorias (Esplugues et al., 2011) y se ha propuesto que las bacterias probióticas pueden actuar modulando el sistema inmunitario intestinal y por tanto disminuir el desarrollo y la gravedad de enfermedades en modelos animales de artritis reumatoide y esclerosis múltiple (So et al., 2008; Kwon et al., 2013).

Los ratones libres de gérmenes tienen una reacción hipotalámica-hipofisiaria-suprarrenal exagerada al estrés comparada con ratones convencionales, que se puede revertir por monoasociación con B. infantis lo que sugiere una interferencia entre las bacterias del intestino y el cerebro (Sudo et al., 2004). La permeabilidad intestinal aumentada, la translocación bacteriana y la activación de la ruta de TLR4 se han implicado como un enlace entre trastornos psicológicos y enfermedades somáticas, incluyendo trastornos del estado de ánimo, trastornos cognitivos, y síndrome de fatiga crónica. Se encontró expresión elevada de marcadores de la ruta de TLR4 en pacientes diagnosticados con trastorno depresivo mayor, acompañando a translocación bacteriana aumentada a través de la barrera intestinal (Keri et al., 2014). Las bacterias intestinales Gram negativas translocadas y LPS activan células inmunitarias para provocar respuestas de IgA e IgM que producen amplificaciones progresivas de rutas inmunitarias asociadas con neuroinflamación y neuroprogresión y con el inicio de síntomas melancólicos, por ejemplo, anhedonia, anorexia, pérdida de peso, retraso psicomotor, ansiedad y fatiga (Maes et al., 2012).

Resistencia eléctrica transepitelial (TER)

Las propiedades barrera de las monocapas de células epiteliales está determinadas a un gran nivel por TJ localizadas en el espacio intracelular donde forman un sello entre el dominio de membrana apical y basolateral y regulan el paso paracelular de moléculas. La función barrera no es estática, sino que se puede modular deliberadamente por exposición a estímulos específicos. La dinámica resultante de la red de TJ se puede seguir de forma conveniente midiendo la resistencia eléctrica transepitelial (TER). Caco-2 es una línea celular bien establecida derivada de adenocarcinoma de colon humano que se usa comúnmente como un modelo de permeabilidad intestinal. Cuando monocapas de Caco-2 completamente diferenciadas forman TJ que restringen la transferencia de iones y, por tanto, producen una resistencia eléctrica a través de la monocapa.

Matriz citométrica de esferas BD™ (CBA)

Los tejidos linfoides asociados a la mucosa que recubre el aparato digestivo humano contienen una red de células inmunitarias. Las células dendríticas (CD) rigen el equilibrio entre inmunidad y tolerancia por muestreo de los contenidos intestinales e inician las respuestas inmunitarias apropiadas a antígenos luminales mediante señalización de receptor de reconocimiento de patrón, secreción de citoquinas, y su capacidad para migrar y presentar antígenos a células T indiferenciadas en ganglios linfáticos drenantes. En homeostasis, las CD en la mucosa intestinal están condicionadas por los microorganismos comensales para fomentar la proliferación de células T reguladoras (Treg) Fpxp3+, fuertes productoras de IL-10 antiinflamatoria que contribuye a la tolerancia intestinal. Los antígenos luminales que se translocan a través de la capa de células epiteliales se unen a receptores de reconocimiento de patrón expresados en las CD y activan rutas de señalización que dan como resultado la producción y secreción de una amplia gama de quimioquinas y citoquinas con distintos efectos inflamatorios. En este contexto, la secreción por CD de citoquinas inflamatorias tal como TNFa, IL-1b, IL-6 e IL-12 es central para las respuestas inflamatorias agudas, innatas que implican la atracción de neutrófilos y macrófagos al sitio de infección. Además, las CD son jugadores centrales en la regulación de las respuestas inmunitarias adaptativas, por tanto, la modulación de las CD hacia un fenotipo que secreta IL-10 contribuye a la inducción de respuestas de Treg que fomentan la tolerancia intestinal (Smith et al., 2014). Los inmunoensayos multiplexados basados en los principios de citometría de flujo permiten la determinación simultánea de numerosas proteínas solubles en volúmenes de muestra muy pequeños. La combinación de alto rendimiento y precisión impresionante, sensibilidad, y reproducibilidad hacen estas técnicas experimentales muy relevantes para fines de cribado donde la cuantificación rápida de múltiples compuestos es crítica.

El modelo de colitis por DSS

El modelo de colitis por sulfato sódico de dextrano (DSS) en roedores presenta inflamación colónica incontrolada. Puede de muchas maneras parecerse a la EII, incluyendo colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn, para la que se ha mostrado que la incidencia y prevalencia mundiales aumentan (Molodecky et al., 2012). Los mecanismos patofisiológicos subyacentes de la colitis por DSS incluye la alteración inicial de la función barrera intestinal seguido por inflamación y pérdida de criptas (Cooper et al., 1993; Iwaya et al., 2012; Poritz et al., 2007). Los síntomas de la enfermedad en colitis por DSS corresponden a lo que se observa en CU humana, incluyendo pérdida de peso corporal, diarrea y pérdida de sangre en heces (Herias et al., 2005). El mecanismo exacto por el que DSS induce colitis no se ha elucidado, sin embargo, se ha reconocido que DSS se asocia con ácidos grasos de cadena media presentes en la luz colónica y forma vesículas capaces de fusionarse con las membranas de colonocitos lo que puede producir la activación de rutas de señalización inflamatorias en el citoplasma (Laroui et al., 2012). Además, hallazgos recientes indican que el espesor de la capa de moco colónico interno, normalmente desprovista de bacterias, disminuye y se vuelve permeable a las bacterias solo 15 minutos después de la exposición a DSS. A las 12 horas después de la exposición a DSS se observó la interacción bacteriana con la capa epitelial que podría activar inflamación (Johansson et al., 2010). Como en roedores sanos, las bacterias están claramente separadas de la capa colónica epitelial en seres humanos sanos, mientras que en pacientes de colitis ulcerosa con inflamación aguda las bacterias penetran la capa de moco interna (Johansson et al., 2014), lo que indica patología común entre el modelo de colitis inducida por DSS y trastornos GI inflamatorios humanos.

Uno de los sucesos tempranos de la patología inducida por DSS es la pérdida de ZO-1 de uniones estrechas y permeabilidad intestinal aumentada, que precede a la inflamación intestinal (Poritz et al., 2007), que podría indicar que el DSS altera la función barrera intestinal, lo que permite la penetración de toxinas, antígenos y bacterias enteras o fracciones de bacterias que alimentan la inflamación. Esto también se corresponde bien con hallazgos humanos donde la permeabilidad intestinal está comprometida junto con disminución marcada en genes de TJ durante el estado inflamado intestinal (Koltun et al., 1998; Gassler et al., 2001). De forma interesante, la disminución de genes de TJ como ZO-1, claudina-1, JAM, beta-catenina y ocludina en áreas de mucosa colónica que transmigran de forma activa neutrófilos se vio en pacientes de colitis ulcerosa (Kucharzik et al., 2001) lo que sugiere una conexión estrecha entre la alteración en las TJ e inflamación.

Las bifidobacterias, lactobacilos y mezclas han mostrado eficacia en colitis inducida por DSS en ratones y ratas (Chen et al., 2009; Kim et al., 2010; Geler et al., 2007; Mennigen et al., 2009). Se han propuesto diferentes modos de acción de probióticos que implican reforzamiento de la barrera epitelial intestinal y modular las rutas inflamatorias tal como señalización de citoquinas. Por ejemplo, Lactobacillus reuteri inhibió la translocación bacteriana del intestino a los ganglios linfáticos mesentéricos además del índice de actividad de la enfermedad (Dicksved et al., 2012) que podría sugerir función barrera aumentada como parte del mecanismo de disminución de la gravedad de la enfermedad. Además, se mostró que E. coli Nissle 1917 disminuía la colitis inducida por DSS por reforzamiento de la permeabilidad intestinal y expresión de proteínas de TJ tal como ZO-1 (Ukena et al., 2007). Aunque este modo de acción no se ha verificado directamente en seres humanos hasta ahora se ha descrito que E. coli Nissle 1917 es eficaz en prevenir la recaída de la colitis ulcerosa (Kruis et al., 1997; Kruis et al., 2004) lo que indica similitudes en los mecanismos entre roedores y seres humanos.

También se mostró que las modulaciones de las rutas inflamatorias durante la colitis inducida por DSS mediante el uso de probióticos inhibían de forma eficaz la gravedad de la enfermedad. Yao y colaboradores transfectaron un B. longum con un plásmido que contiene IL-10 y dosificaron las bacterias a ratones expuestos a DSS. Las bacterias transfectadas aliviaron los síntomas de colitis al disminuir la ruta de NF-kB que de otra manera llevaría a la producción de varias citoquinas proinflamatorias (Yao et al., 2011). Miyauchi y otros, por otra parte, mostraron que B. longum subsp. infantis era capaz de reducir la gravedad de la colitis al suprimir la expresión de citoquinas específicas de T cooperadores de tipo 1 (T^h1) y T cooperadores productores de IL-17 (T^h17) en tejido colónico (Miyauchi et al., 2013).

Se divulgan cepas de Bifidobacterium adolescentis en el estado de la técnica:

Mitsuoka T et al, "Ecology of the bifidobacteria", The American Journal of Clinical Nutrition, vol. 30, no. 11, 1 de Noviembre, 1977, páginas 1799-1810

N. P. Shah: "Bacteria, Beneficial/Bifidobacterium spp.: Morphology and Physiology: En: John W Fuquay; Patrick J. Fox; Paul L H McSweeney: "Encyclopedia of dairy sciences", 1 de enero, 2011, Elsevier/Academic Press, Ámsterdam; Boston, MA, XP008178101

Yaeshima T et al, "The diversity in phenotypic characteristics of Bifidobacterium longum", Milchwissenschaft, vol 47, no. 4, 1 de enero, 1992, páginas 212-214

Documento WO 02/38798 (Raisio Yhtymae Oyj, Bioferme Oy, Salminen Seppo, Ouweha, 16 de Mayo, 2002

También se divulgan en el estado de la técnica cepas de Bifidobacterium adolescentis con efecto inmunoestimulador. Por ejemplo: T. Pozo-Rubio et al: "Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system", British Journal of Nutrition, vol.

106, no. 08, 31 de Mayo, 2011, páginas 1216-1223, divulga una cepa de Bifidobacterium adolescentis que induce producción de citoquinas (entre otras IL-10) de CMSP y células Caco-2 (cf. resumen; figura 1).

Compendio de la invención

El problema que se va a resolver por la presente invención es la provisión de cepas adicionales de Bifidobacterium adolescentis con efecto antiinflamatorio. Las propiedades específicas de la cepa de Bifidobacterium adolescentis depositada como DSM 29103 no se podrían esperar del estado de la técnica.

La invención se refiere a cepas aisladas de Bifidobacterium adolescentis. Entre los aislados bacterianos que pertenecen a B. adolescentis, cuatro subgrupos taxonómicos, no previamente descritos, se pueden identificar por características genómicas y fenotípicas. Estos subgrupos taxonómicos son claramente diferentes de la cepa tipo (B. adolescentis ATCC15703T). Los cuatro subgrupos taxonómicos de B. adolescentis se diferencian de la cepa tipo de B. adolescentis por firmas específicas en las secuencias génicas de ARNr 16S. Las firmas del ARNr 16S también diferencian los cuatro subgrupos entre sí. Como no existen definiciones taxonómicas exactas por debajo del nivel de especie, estos subgrupos se han denominado riboespecies 2, 3, 4 y 5. La riboespecie 1 es B. adolescentis ATCC15703T.

El análisis de la secuencia de ARN ribosómico de 16S es un elemento central en el enfoque polifásico para la clasificación bacteriana y para delinear taxones de especies filogenéticamente vecinas. Sin embargo, a similitudes de secuencia génica de ARNr 16S por encima del 98,7% este método no es capaz de discriminar de forma no ambigua taxones únicos y se recomienda determinar el parentesco ADN-ADN. Como la similitud de secuencia de las cepas aisladas respecto a la cepa tipo estaban todas por encima del 99,87% se decidió determinar el parentesco ADN-ADN. Los estudios de reasociación de ADN-ADN de cepas representativas de cada subgrupo con la cepa tipo de B. adolescentis mostraron más del 70% de parentesco ADN-ADN entre las cepas representativas y la cepa tipo, y por tanto confirmó que las cepas representativas en efecto pertenecen a la especie B. adolescentis. Estos datos combinados mostraron que las cepas aisladas son subgrupos novedosos de B. adolescentis, que no se han descrito previamente.

Los cuatro subgrupos se diferencian además de B. adolescentis ATCC15703T por secuencias de ADN que codifican proteínas (CDS) presentes solo en las riboespecies 2, 3, 4, y 5, pero no en la cepa tipo. Las secuencias codificantes de proteínas únicas discriminan las riboespecies individuales entre sí, mientras que otras secuencias codificantes de proteínas son únicas para las riboespecies 2 5, o las riboespecies 3 4.

La capacidad para fermentar almidón y glucógeno discrimina las riboespecies de B. adolescentis ATCC15703T, así como las riboespecies 2 5 de las riboespecies 3 4. Por tanto, las riboespecies 2 y 5, pero no B. adolescentis ATCC15703T y las riboespecies 3 4, fermentan glucógeno como la única fuente de carbono, mientras que las riboespecies 2 5 y B. adolescentis ATCC15703T, pero no las riboespecies 3 4, pueden fermentar almidón.

Por tanto, se han encontrado cuatro riboespecies (subgrupos taxonómicos) de B. adolescentis que se pueden diferenciar de forma no ambigua de B. adolescentis ATCC15703T y entre sí por firmas de secuencia génica de ARNr 16S específicas, secuencias de ADN codificantes de proteínas específicas y la capacidad para fermentar glucógeno y almidón.

La cepa aislada de Bifidobacterium adolescentis de la invención tiene una secuencia génica ribosómica de 16S que comprende SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 7; y SEQ ID NO: 10.

Un denominador común de un huésped de enfermedades y afecciones humanas es una función barrera intestinal alterada y activación proinflamatoria del sistema inmunitario de la mucosa debido a la translocación aumentada de bacterias y LPS a través del epitelio intestinal. Las enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, afecciones inflamatorias intestinales tales como EII y SII, enfermedades hepáticas incluyendo EHGNA, EHNA, cirrosis, y enfermedad hepática alcohólica, trastornos metabólicos, tal como síndrome metabólico, resistencia a insulina, diabetes de tipo 2, obesidad, ateroesclerosis cardiovascular, enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, enfermedad celiaca, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple y artritis reumatoide, y afecciones mentales incluyendo, trastornos depresivos mayores, un trastornos del estado de ánimo, un trastorno cognitivo, síndrome de fatiga crónica, y ansiedad.

Las cepas de las riboespecies 2, 3, 4, y 5 de B. adolescentis son capaces de mejorar la función barrera intestinal y/o inducir elementos reguladores de la respuesta inmunitaria.

Algunas cepas de las riboespecies 2, 3, 4, y 5 de B. adolescentis aumentan la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de monocapas de células Caco-2 después de tratamiento de 10 h a más del 120% de la TER al inicio del tratamiento, y, por tanto, mejoran la función barrera intestinal.

Algunas cepas de las riboespecies 2, 3, 4, y 5 de B. adolescentis inducen secreción de > 200 pg/ml de IL-10 y/o inducen una proporción IL-10:IL-12 > 1, cuando se coincuban con células dendríticas derivadas de CMSP humanas, y por tanto provocan una respuesta inmunitaria antiinflamatoria.

Algunas cepas de las riboespecies 2, 3, 4, y 5 de B. adolescentis aumentan la TER en monocapas de células Caco-2 a > 120% relativa a la TER del inicio del tratamiento y/o inducen la secreción de más de 200 pg/ml de IL-10 y/o inducen una proporción IL-10:IL-12 > 1, y pueden, por tanto, tanto mejorar la función barrera intestinal como provocar una respuesta inmunitaria antiinflamatoria.

Prevención, alivio de síntomas, y tratamiento de enfermedades o afecciones con una función barrera intestinal alterada subyacente y/o activación proinflamatoria de la mucosa puede ser posible con cepas de las riboespecies 2 de B. adolescentis que mejoran la función barrera intestinal determinada por la capacidad de aumentar la TER en monocapas de células Caco-2 a > 120% relativa a la TER del inicio del tratamiento, inducir una respuesta inmunitaria antiinflamatoria determinada por la capacidad de inducir secreción de > 200 pg/ml de IL-10 cuando se coincuban con células dendríticas derivadas de CMSP humanas e inducir una proporción iL-10:IL-12 > 1, cuando se coincuban con células dendríticas derivadas de CMSP humanas.

Divulgación detallada de la invención

Una manera de caracterizar cepas de Bifidobacterium adolescentis es su capacidad para fermentar y crecer en las fuentes de hidratos de carbono específicas esbozadas en el ejemplo 4. La tabla 2 proporciona una visión general de las características de crecimiento de un número de cepas de B. adolescentis. Las cepas proporcionadas en la tabla solo se deben considerar ejemplos no limitantes de cepas.

Como es evidente de la tabla un número de cepas tienen la capacidad de fermentar D-ribosa, pero no D-sorbitol, entre otras BIF084 (DSM 29106), BIF046 (DSM 29111), BIF106 (DSM 29107), BIF123 (DSM 29102) BIF129 (DSM 29104), y BIF038 (DSM 29103).

Un fin de la presente invención es proporcionar cepas de B. adolescentis que son capaces de mejorar la función barrera intestinal y provocar una respuesta inmunitaria antiinflamatoria ya que estas características están relacionadas con un número de enfermedades o afecciones con una función barrera intestinal alterada subyacente y/o activación proinflamatoria de la mucosa.

Como es evidente de los ejemplos algunas cepas de B. adolescentis aumentan la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de monocapas de células Caco-2 después de tratamiento de 10 h a más del 120% de la TER al inicio del tratamiento, y por tanto, mejoran la función barrera intestinal.

Algunas cepas de B. adolescentis inducen secreción de > 200 pg/ml de IL-10 y/o inducen una proporción IL-10:IL-12 > 1, cuando se coincuban con células dendríticas derivadas de CMSP humanas, y por tanto provocan una respuesta inmunitaria antiinflamatoria.

En una forma de realización, las cepas aisladas de la invención son capaces de i) aumentar la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de monocapas de células Caco-2 después de tratamiento de 10 h a más del 120% de la TER al inicio del tratamiento, ii) inducir secreción de > 200 pg/ml de IL-10 cuando se coincuban con células dendríticas derivadas de CMSP humanas, y iii) inducir una proporción IL-10:IL-12 > 1, cuando se coincuban con células dendríticas derivadas de CMSP humanas.

La tabla 9 proporciona un resumen de los datos in vitro de cepas de B. adolescentis seleccionadas que cumplen una o más de las características anteriores. Como es evidente de la tabla 9 todas las cepas provocan una respuesta inmunitaria antiinflamatoria, y DSM 29102, DSM 29107 y DSM 29103 mejoran además la barrera intestinal.

La invención se refiere a una cepa aislada de Bifidobacterium adolescentis de la invención o un producto probiótico de la invención para uso en la prevención, alivio de síntomas, y/o tratamiento de una afección inflamatoria intestinal tal como EII o s Ii, una enfermedad hepática tal como EHGNA, EHNA, cirrosis, o enfermedad hepática alcohólica, un trastorno metabólico tal como síndrome metabólico, resistencia a insulina, diabetes de tipo 2, obesidad, ateroesclerosis cardiovascular, una enfermedad autoinmunitaria tal como enfermedad celiaca, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple o artritis reumatoide, y/o una afección mental tal como trastorno depresivo mayor, un trastorno del estado de ánimo, un trastorno cognitivo, síndrome de fatiga crónica, o ansiedad.

Los ejemplos de síntomas que se pueden prevenir o aliviar por la administración de una cepa de Bifidobacterium adolescentis de la invención son anorexia, sangre en heces, cólicos y dolor abdominal, diarrea, estreñimiento, o episodios alternantes de ambos.

El ejemplo 8 proporciona los resultados del efecto de una de las cepas de la invención, B. adolescentis DSM 29103, sobre colitis inducida por DSS que indica que B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) previene y/o inhibe la inflamación y el daño tisular en el aparato digestivo, así como inhibe diarrea e induce un efecto que fomenta la salud global en términos de peso corporal. Basado en estos hallazgos se contempla que DSM 29103 y otras cepas que tienen propiedades similares como se esboza en el presente documento serán capaces de prevenir o aliviar al menos algunos de los síntomas gastrointestinales esbozados anteriormente.

Aunque las cepas de la invención se consideran que son de relevancia particular para su uso para seres humanos, el uso para animales tales como mascotas, por ejemplo, gatos, perros y caballos, también está incluido dentro del ámbito de la presente invención.

La cepa aislada de Bifidobacterium adolescentis se puede caracterizar en que a) la secuencia comprende SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 7; y SEQ ID NO: 10, y b) la secuencia codifica una proteína que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a al menos una proteína seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO: 12, 13, 14, 18, y 19.

En una forma de realización de b) la secuencia codifica una proteína que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a al menos una proteína seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO: 12, 13, y 14. En una forma de realización adicional de b) la secuencia codifica una proteína que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a al menos una proteína seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO: 18 y 19.

En formas de realización específicas, la cepa comprende secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que tienen al menos el 90% de identidad a al menos una proteína seleccionada de SEQ ID NO 12 a 14, 18 o 19, tal como secuencias que codifican proteínas que tienen al menos el 91% de identidad, al menos el 92% de identidad, al menos el 93% de identidad, al menos el 94% de identidad, al menos el 95% de identidad, al menos el 96% de identidad, al menos el 97% de identidad, al menos el 98% de identidad, o al menos el 99% de identidad a una o más de SEQ ID NO 12 a 14, 18 o 19. En una forma de realización, la cepa incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una o más de SEQ ID NO 12 a 14, 18 o 19.

Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos o dos secuencias de aminoácidos se determina usando el método de alineamiento de secuencias de ClustalW versión 2 (ClustalW2) para secuencias de nucleótidos (ADN) o secuencia de aminoácidos (proteína), respectivamente, alineamiento por pares como se describe por Larkin et al. (2007, Bioinformatics 23:2947-2948) y Goujon et al. (2010, Nucleic acids research 38 Supl:W695-699) con parámetros por defecto (tipo de alineamiento: lento; Matriz de ponderación de ADN: IUB; Matriz de ponderación de proteína: Gonnet; Apertura de hueco: 10; Extensión de hueco: 0.1), disponible en www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.

Una forma de realización se refiere a cepas aisladas que son capaces de crecer en almidón o glucógeno como la única fuente de hidratos de carbono. Algunas de estas cepas se caracterizan en que comprenden SEQ ID NO: 2, 4, 7 y 10. Los ejemplos de tales cepas son DSM 29103 y cepas derivadas de la misma.

La presente invención se refiere a una cepa aislada de Bifidobacterium adolescentis depositada con DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, el 16 de julio, 2014 con el No. de registro DSM 29103 y a una cepa mutante de DSM 29103 que es capaz de i) aumentar la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de monocapas de células Caco-2 después de tratamiento de 10 h a más del 120% de la TER al inicio del tratamiento, ii) inducir secreción de > 200 pg/ml de IL-10 cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas, y iii) inducir una proporción IL-10:IL-12 > 1, cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas.

Una “cepa” bacteriana como se usa en el presente documento se refiere a una bacteria que permanece genéticamente sin cambios cuando crece o se multiplica. Se incluye la multiplicidad de bacterias idénticas. “Cepa de tipo salvaje” se refiere a la forma no mutada de una bacteria, como se encuentra en la naturaleza.

En el presente contexto, el término “cepa derivada” se debe entender como una cepa derivada de una cepa madre por medio de, por ejemplo, ingeniería genética, radiación y/o tratamiento químico, y/o selección, adaptación, cribado, etc. En formas de realización específicas la cepa derivada es un mutante funcionalmente equivalente, por ejemplo, un mutante que tiene sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas, (por ejemplo, respecto a propiedades probióticas) que la cepa madre. El término “cepa derivada” incluye una cepa obtenida al someter una cepa de la invención a cualquier tratamiento de mutagenización convencionalmente usado incluyendo tratamiento con un mutágeno químico tal como metanosulfonato de etano (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV o a un mutante que se produce espontáneamente.

Una “bacteria mutante” o una “cepa mutante” se refiere a una bacteria mutante natural (espontanea, se produce de forma natural) o una bacteria mutante inducida que comprende una o más mutaciones en su genoma (ADN) que están ausentes en el ADN de tipo salvaje. Un “mutante inducido” es una bacteria donde la mutación se indujo por tratamiento humano, tal como tratamiento con cualquier tratamiento de mutagenización convencionalmente usado incluyendo tratamiento con mutágenos químicos, tal como un mutágeno químico seleccionado de (i) un mutágeno que se asocia con o se incorpora al ADN tal como un análogo de base, por ejemplo, 2-aminopurina o un agente intercalante tal como ICR-191, (ii) un mutágeno que reacciona con el ADN incluyendo agentes alquilantes tal como nitrosoguanidina o hidroxilamina, o metanosulfonato de etano (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), radiación UV o gamma etc. En contraste, un “mutante espontaneo” o “mutante natural” no ha sido mutagenizado por el hombre.

Una cepa derivada, tal como un mutante, puede haber sido sometida a varios tratamientos de mutagenización (se debe entender un único tratamiento una etapa de mutagenización seguida por una etapa de selección/cribado), pero típicamente no se llevan a cabo más de 20, no más de 10, o no más de 5, tratamientos. En formas de realización específicas de cepas derivadas, tal como mutantes, menos del 1%, menos el 0,1%, menos del 0,01%, menos del 0,001% o incluso menos del 0,0001% de los nucleótidos en el genoma bacteriano se han cambiado (tal como por sustitución, inserción, deleción o una combinación de las mismas) comparado con la cepa madre.

Las bacterias mutantes como se han descrito anteriormente son no-OMG, es decir, no modificadas por tecnología de ADN recombinante. Como alternativa al método preferido anterior de proporcionar el mutante por mutagénesis aleatoria, también es posible proporcionar tal mutante por mutagénesis dirigida, por ejemplo, usando técnicas de PCR apropiadamente diseñadas o usando un elemento transponible que es integrable en replicones bacterianos.

Cuando el mutante se proporciona como un mutante que se produce espontáneamente la cepa de tipo salvaje anterior se somete a la etapa de selección sin ningún tratamiento de mutagenización precedente.

Una cepa mutante de la cepa de B. adolescentis con número de registro DSM 29103 se puede obtener al someter a la cepa a tratamiento de mutagenización como se describe para obtener cepas mutantes y seleccionar para cepas mutantes que tienen las propiedades deseadas. Alternativamente, se realiza una selección para mutantes espontáneos.

Una forma de realización de la invención se refiere a una cepa aislada de Bifidobacterium adolescentis seleccionada del grupo que consiste en DSM 29103 y un mutante de dicha cepa depositada que es capaz de i) aumentar la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de monocapas de células Caco-2 después de tratamiento de 10 h a más del 120% de la TER al inicio del tratamiento, ii) inducir secreción de > 200 pg/ml de IL-10 cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas, y iii) inducir una proporción IL-10:IL-12 > 1, cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas.

Mediante el término “un producto probiótico” se quiere decir cualquier producto que comprenda una bacteria probiótica. Un producto probiótico que comprende una cepa según la invención se puede administrar en forma de un producto alimenticio o un suplemento nutricional. El Bifidobacterium adolescentis se puede, por ejemplo, incorporar en un producto lácteo, tal como leche, y en particular un producto lácteo fermentado, opcionalmente en combinación con otras bacterias del ácido láctico, por ejemplo, con fermentos de yogur, o en otros productos alimenticios tal como una barra para picar, o bebidas tal como zumo.

El producto probiótico que comprende Bifidobacterium adolescentis también se puede proporcionar como un suplemento nutricional en forma de un polvo, comprimido, tal como una tableta o un comprimido efervescente, pastilla, cápsula, chicle, en bolsitas individuales o como un componente de una composición más general tal como gotas de aceite, una emulsión o una pasta, o en cualquier otro soporte adecuado determinado por los expertos en la materia que es un soporte eficaz para microorganismos vivos.

Las bacterias probióticas son microorganismos vivos y esto puede ser un desafío durante la formulación y almacenamiento de los productos probióticos. Las bacterias probióticas son especialmente sensibles a la temperatura, contenido de humedad, y oxígeno y otros ingredientes en una matriz de formulación. Se prefiere que las bacterias de la invención permanezcan viables después de almacenamiento prolongado para que las bacterias impartan su efecto beneficioso tras la administración del producto probiótico de la invención al individuo en necesidad de ello.

Mediante el término “viable” se quiere decir que la célula está viva y es capaz de formar una colonia en una placa Petri durante plaqueado por vertido o plaqueado por extensión. El número de bacterias probióticas viables se determina como el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por métodos de placa por vertido o placa por extensión con incubación en condiciones adecuadas para el crecimiento de la(s) cepa(s) probiótica(s). Mediante este método se contarán las células capaces de crecer y formar colonias. Cuando se da un número en la presente especificación y reivindicaciones, se debe entender como UFC/g a menos que el contexto indique otra cosa. En algunas formas de realización, el producto probiótico de la presente invención comprende al menos 109 UFC/unidad al final de la vida útil (EOS). El final de la vida útil puede ser al menos 3 meses, tal como al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, o al menos 24 meses.

Usar una baja actividad acuosa asegura una mejor supervivencia de las bacterias probióticas durante el almacenamiento del producto.

La actividad acuosa (aw) se define como la presión de vapor parcial de agua en una composición a una temperatura especificada dividida por la presión de vapor parcial del estado estándar de agua a la misma temperatura. La actividad acuosa, por tanto, actúa como una medida de la cantidad de agua libre (sin unir) en una composición. Se puede calcular como:

aw = p/p0

donde p es la presión de vapor parcial de agua en la composición y p⁰ es la presión de vapor de agua pura a la misma temperatura. En productos probióticos en general se prefiere que la actividad acuosa (aw) esté en el intervalo de 0,1­ 0,2.

Las bacterias probióticas que se van a usar en los productos probióticos de la invención en general se congelan o liofilizan. Para obtener una alta viabilidad las bacterias se mezclan con un crioprotector antes de que se congelen o liofilicen.

El término “un crioprotector” indica una sustancia que es capaz de mejorar la supervivencia durante la congelación y/o secado para mejorar la estabilidad de almacenamiento de las bacterias. El crioprotector usado en el presente documento en general comprende un sacárido.

El sacárido puede ser un mono-, di-, oligo- o polisacárido, o una mezcla de al menos dos sacáridos. La composición puede incluso comprender tres, cuatro o más sacáridos. En algunas formas de realización, la composición comprende una mezcla de al menos un mono- o disacárido y al menos un oligosacárido. En otras formas de realización, la composición comprende una mezcla de al menos un mono- o disacárido y al menos un polisacárido.

Los monosacáridos útiles en el producto probiótico de la presente invención incluyen glucosa (también conocida como dextrosa), fructosa, ribosa y galactosa. Los disacáridos útiles en el producto probiótico de la presente invención incluyen entre otros, sacarosa, trehalosa, maltosa y lactosa. La composición puede comprender uno o más mono- o disacáridos, tal como uno, dos o tres o incluso más sacáridos diferentes.

En algunas formas de realización el producto probiótico de la invención comprende al menos un oligosacárido. Un oligosacárido es un polímero de sacárido que contiene de tres a nueve monosacáridos. Los fructooligosacáridos (FOS), que se encuentran en muchos vegetales, consisten en cadenas cortas de moléculas de fructosa. Los galactooligosacáridos (GOS), que también se dan de forma natural, consisten en cadenas cortas de moléculas de galactosa. Estos compuestos pueden ser digeridos solo parcialmente por los seres humanos. La composición puede comprender uno, dos o incluso más oligosacáridos diferentes.

En algunas formas de realización el producto probiótico de la invención comprende al menos un polisacárido. Los polisacáridos son moléculas glucídicas poliméricas compuestas de más de diez unidades de monosacárido unidas por enlaces glucosídicos y en hidrólisis dan los monosacáridos u oligosacáridos constituyentes. Varían en estructura desde lineal a muy ramificado. Los ejemplos de polisacáridos que se van a usar en un producto probiótico de la invención son maltodextrina, ciclodextrina, alginato, pectina, quitosano, almidón e inulina. La composición puede comprender uno, dos, tres o incluso más polisacáridos diferentes.

Como un ejemplo, el crioprotector puede comprender una mezcla de un disacárido, tal como sacarosa o glucosa, y un polisacárido, tal como maltodextrina.

La adición de oligo- o polisacáridos tal como FOS, GOS, inulina y otros polisacáridos puede ayudar en la reducción de la actividad acuosa y tiene la ventaja adicional de que los oligo- y polisacáridos no son tan dulces como los monoy disacáridos y además añaden fibras a la composición.

Los polioles (alcoholes de azúcar) tienen la fórmula general HOCH²(CHOH)nCH²OH. Se añaden comúnmente a los alimentos debido a su menor contenido calórico y menor dulzor que los azúcares. Además, no se rompen por bacterias en la boca o se metabolizan a ácidos, y por tanto no contribuyen al deterioro de los dientes.

La composición puede comprender además al menos un poliol tal como eritriol, inositol, isomalt, manitol, maltitol, sorbitol, o xilitol, o una mezcla de los mismos. Los polioles preferidos son xilitol, sorbitol y manitol. La composición puede comprender uno, dos, tres o incluso más polioles diferentes.

El crioprotector puede comprender además un péptido, proteína, hidrolizado de proteína o una mezcla de los mismos. Los ejemplos de péptidos y proteínas que se van a usar en el presente documento son caseína, guisante, suero, albúmina, proteína de soja, ácido glutámico o gelatina, y cualquier aislado o hidrolizado de los mismos. También pueden estar presentes otros aditivos, por ejemplo, antioxidantes tal como ascorbato, citrato de sodio, galato de propilo.

La presente invención también se refiere a un probiótico que comprende una cepa aislada según la invención y un crioprotector, tal como un sacárido.

Se pueden usar combinaciones de varias especies o cepas de bacterias probióticas, es decir, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o incluso más de las especies o cepas enumeradas en el presente documento. En formas de realización actualmente preferidas, solo una, dos, tres, cuatro o cinco cepas diferentes están presentes en un producto probiótico según la invención.

Además de las bacterias probióticas, uno o más de otros ingredientes activos, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o más ingredientes activos seleccionados del grupo que consiste en vitaminas tal como vitamina A, D, E, K2, C, B2, B6, B12, biotina, niacina, ácido fólico; minerales tal como cinc, selenio, cromo, cobre, calcio, cloruro; y extractos vegetales tal como extracto/zumo de arándano rojo, jalea real se podrían incluir en el producto probiótico.

Se contempla que para obtener un efecto terapéutico, el producto probiótico se debe administrar a diario durante al menos una semana, y ventajosamente durante un periodo más largo tal como al menos 2 semanas, al menos 4 semanas, al menos 6 semanas, al menos 9 semanas, preferiblemente al menos 12 semanas, en una cantidad correspondiente a al menos 106 UFC, tal como al menos 107 UFC, preferiblemente al menos 108 UFC, en general entre 109 UFC y 1012 UFC de Bifidobacterium adolescentis.

En los presentes estudios el producto probiótico comprende Bifidobacterium adolescentis como el ingrediente activo. Bifidobacterium adolescentis se puede usar como el único ingrediente activo. Alternativamente, el producto probiótico como se describe en el presente documento puede comprender compuestos adicionales de interés tal como otras cepas bacterianas, vitaminas, prebióticos, fibras u otros compuestos que pueden tener un efecto saludable beneficioso.

Las otras bacterias se pueden seleccionar del grupo que consiste en Bifidobacterium lactis, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. casei, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus acidophilus.

Por tanto, la composición puede comprender además una o más cepa(s) de una bacteria del ácido láctico seleccionadas del grupo que comprende Bifidobacterium animalis subsp. lactis depositada como DSM 15954, Lactobacillus acidophilus depositada como DSM 13241, Lactobacillus rhamnosus depositada como ATCC 53103, Lactobacillus rhamnosus depositada como ATCC 55826, Lactobacillus reuteri depositada como ATCC 55845, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei depositada como ATCC 55544, Lactobacillus paracasei depositada como LMG-17806, Streptococcus thermophilus depositada como DSM 15957, Lactobacillus fermentum depositada como NM02/31074, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei depositada como CCTCC M204012.

El uso de los términos “un” y “una” y “el” y “la” y referentes similares en el contexto de describir la invención (en especial en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se deben interpretar que cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. Los términos “comprender”, “tener”, “incluir” y “contener” se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que significan “incluir, pero sin limitar a”) a menos que se indique lo contrario. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento se pretende solamente que sirva como un método abreviado de referirse individualmente a cada valor separado que está dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la especificación como si enumeraran individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o de otra manera claramente se contradiga por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en el presente documento, se pretende solamente para iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el ámbito de la invención a menos que se reivindique de otra manera. El lenguaje en la especificación no se debe interpretar como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Dendograma de secuencias de ADNr 16S parciales de cepas similares a B. adolescentis generado por el método de unión de vecinos. También se incluye la cepa tipo B. adolescentis ATCC 15703T

Figura 2. Alineamiento parcial de secuencias consenso de ADNr 16S de cepas similares a B. adolescentis y la cepa tipo B. adolescentis ATCc 15703t Solo se muestran regiones variables. Los números son numeración de E. coli. Las secuencias firma que diferencian las 4 riboespecies y la cepa tipo están indicadas por sombreado.

Figura 3. Resistencia eléctrica transepitalial (TER) en monocapas de células Caco-2 después de estimulación con cepas similares a B. adolescentis. Inicialmente confluentes, las monocapas de Caco-2 diferenciadas por completo cultivadas en membranas Transwell se colocaron en un CellZscope. Las monocapas se incubaron con bacterias durante 16 h y se midió la TER cada hora. Los resultados se muestran como TER (%) relativa a la TER en la última medida antes del inicio de la incubación.

Figura 4. Resistencia eléctrica transepitalial (TER) en monocapas de células Caco-2 después de estimulación con cepas similares a B. adolescentis. Inicialmente confluentes, las monocapas de Caco-2 diferenciadas por completo cultivadas en membranas Transwell se colocaron en un CellZscope y TER se midió automáticamente cada hora durante la noche. Después de 10 h, TER había alcanzado una meseta y este punto de tiempo se usó para comparar la estimulación de TER por cepas similares a B. adolescentis. Las barras indican TER (%) después de 10 h de incubación relativa a la TER en la última medida antes del inicio de la incubación.

Figura 5. Expresión de IL-10 y la proporción de expresión IL-10:IL-12 en células dendríticas (CD) derivadas de CMSP humana después de la estimulación con cepas similares a B. adolescentis. Las CD se estimularon con bacterias a una proporción de 100:1 (bacterias:células) durante 20 h y se midió la secreción de IL10 e IL-12 mediante el kit de matriz citométrica de esferas (CBA) de citoquinas inflamatorias humanas. Las medidas de citoquinas se normalizaron a la expresión media para cada citoquina y cada donante. Las barras indican secreción de IL-10 en el eje izquierdo, las estrellas indican proporción IL-10:IL-12 en el eje derecho.

Figura 6. Peso corporal de ratas en un modelo de colitis por DSS de enfermedad intestinal inflamatoria. Después de dos semanas de dosificación de B. adolescentis BIF038 (DSM 29103), o vehículo por alimentación forzada oral, se introdujo DSS al 3% en el agua de beber durante 9 días. Los animales que no recibieron DSS sirvieron como controles sanos; DSS, recibieron vehículo y DSS; DSS+BIF038 recibieron B. adolescentis BIF038 (DSM 29103) y DSS. El peso corporal se registró a diario.

Control sano: —

Figura 7. Puntuaciones de consistencia de las heces de ratas en un modelo de colitis por DSS de enfermedad intestinal inflamatoria. Después de dos semanas de dosificación de B. adolescentis BIF038 (DSM 29103), o vehículo por alimentación forzada oral, se introdujo DSS al 3% en el agua de beber durante 9 días. Los animales que no recibieron DSS sirvieron como controles sanos; DSS, recibieron vehículo y DSS; DSS+BIF038 recibieron B. adolescentis BIF038 (DSM 29103) y DSS.

Figura 8. Puntuaciones de sangre en heces de ratas en un modelo de colitis por DSS de enfermedad intestinal inflamatoria. Después de dos semanas de dosificación de B. adolescentis BIF038 (DSM 29103), o vehículo por alimentación forzada oral, se introdujo DSS al 3% en el agua de beber durante 9 días. Los animales que no recibieron DSS sirvieron como controles sanos; DSS, recibieron vehículo y DSS; DSS+BIF038 recibieron B. adolescentis BIF038 (DSM 29103) y DSS.

Control sano: — ; DSS: — ; DSS BIF038: — .

Figura 9. Permeabilidad del intestino entero de ratas en un modelo de colitis por DSS de enfermedad intestinal inflamatoria. Después de dos semanas de dosificación de B. adolescentis BIF038 (DSM 29103), o vehículo por alimentación forzada oral, se introdujo DSS al 3% en el agua de beber durante 9 días. Los animales que no recibieron DSS sirvieron como controles sanos; DSS, recibieron vehículo y DSS; DSS+BIF038 recibieron B. adolescentis BIF038 (DSM 29103) y DSS. La permeabilidad se determinó como excreción CrEDTA en orina.

Control sano: ; DSS: ; DSS BIF038: I I .

Figura 10. Puntuaciones histológicas de tejido colónico de ratas en un modelo de colitis por DSS de enfermedad intestinal inflamatoria. Después de dos semanas de dosificación de B. adolescentis BIF038 (DSM 29103), o vehículo por alimentación forzada oral, se introdujo DSS al 3% en el agua de beber durante 9 días. Los animales que no recibieron DSS sirvieron como controles sanos; DSS, recibieron vehículo y DSS; DSS+BIF038 recibieron B. adolescentis BIF038 (DSM 29103) y DSS.

Figura 11. Puntuación macroscópica de los intestinos de ratas en un modelo de colitis por DSS de enfermedad intestinal inflamatoria. Después de dos semanas de dosificación de B. adolescentis BIF038 (DSM 29103), o vehículo por alimentación forzada oral, se introdujo DSS al 3% en el agua de beber durante 9 días. Los animales que no recibieron DSS sirvieron como controles sanos; DSS, recibieron vehículo y DSS; DSS+BIF038 recibieron B. adolescentis BIF038 (DSM 29103) y DSS.

Breve descripción de la lista de secuencias

La lista de secuencias incluye las once secuencias de la figura 2, así como las proteínas codificadas por las CDS enumeradas en las tablas 3 a 8.

SEQ ID NO: 1 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para ATCC 15703T y las cepas de las riboespecies 3 y 4.

SEQ ID NO: 2 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para las cepas de las riboespecies 2 y 5.

SEQ ID NO: 3 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para ATCC 15703T y las cepas de las riboespecies 5 y 3.

SEQ ID NO: 4 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para las cepas de la riboespecie 2. SEQ ID NO: 5 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para las cepas de la riboespecie 4. SEQ ID NO: 6 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para ATCC 15703T y las cepas de la riboespecie 3.

SEQ ID NO: 7 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para las cepas de la riboespecie 2. SEQ ID NO: 8 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para las cepas de la riboespecie 5. SEQ ID NO: 9 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para las cepas de la riboespecie 4. SEQ ID NO: 10 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para ATCC 15703T y las cepas de las riboespecies 2 y 5.

SEQ ID NO: 11 presenta una secuencia génica del ARNr 16S que es específica para las cepas de las riboespecies 3 y 4.

SEQ ID NO: 12 presenta CDS 2439 en la tabla 3.

SEQ ID NO: 13 presenta CDS 2454 en la tabla 3.

SEQ ID NO: 14 presenta CDS 2458 en la tabla 3.

SEQ ID NO: 15 presenta CDS 2027 en la tabla 4.

SEQ ID NO: 16 presenta CDS 2312 en la tabla 4.

SEQ ID NO: 17 presenta CDS 2314 en la tabla 4.

SEQ ID NO: 18 presenta CDS 2406 en la tabla 5.

SEQ ID NO: 19 presenta CDS 2425 en la tabla 5.

SEQ ID NO: 20 presenta CDS 3350 en la tabla 6.

SEQ ID NO: 21 presenta CDS 3351 en la tabla 6.

SEQ ID NO: 22 presenta CDS 3166 en la tabla 7.

SEQ ID NO: 23 presenta CDS 3123 en la tabla 7.

SEQ ID NO: 24 presenta CDS 2293 en la tabla 8.

SEQ ID NO: 25 presenta CDS 2334 en la tabla 8.

Ejemplos

Visión general del procedimiento experimental

Las bifidobacterias se aislaron de heces humanas de voluntarios sanos. La identidad de las especies de los aislados purificados se determinó por secuenciación del ADNr 16S y análisis filogenético. El análisis filogenético de 16S mostró la presencia de 4 grupos (riboespecies) de cepas más estrechamente relacionados a la cepa tipo Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703T, sin embargo, claramente distintas de la cepa tipo (cepas similares a B. adolescentis). Este subconjunto de aislados bifidobacterianos se investigó adicionalmente para determinar su afiliación taxonómica en el grupo de B. adolescentis. El parentesco ADN:ADN investigado por hibridación demostró que las cepas pertenecen a la especie B. adolescentis; sin embargo, la secuenciación del genoma identificó secuencias codificantes (genes) que distinguían 4 grupos de cepas similares a las riboespecies que eran diferentes de la cepa tipo B. adolescentis ATCC15703T La capacidad de crecer en varias fuentes de hidratos de carbono se investigó usando el sistema API. La utilización de almidón y glucógeno identificó 2 subgrupos que eran diferentes de la cepa tipo.

Se investigaron las características funcionales relacionadas con la salud GI de las cepas similares a B. adolescentis. La capacidad de estimular TJ en células epiteliales se investigó aplicando bacterias vivas a monocapas de células Caco-2 y midiendo la resistencia eléctrica transepitelial (TER). La mayoría de las cepas similares a B. adolescentis aumentó TER; sin embargo, a varios grados. La estimulación local del sistema inmunitario se determinó aplicando bacterias a células dendríticas derivadas de CMSP humanas y midiendo la producción de citoquinas. Varias cepas indujeron altos niveles de IL-10 con una proporción IL-10:IL-12 > 1 indicativa de una respuesta inmunitaria reguladora.

Una cepa similar a B. adolescentis se seleccionó por su fuerte capacidad de inducir TER y alta inducción de IL-10 y se aplicó en un modelo de colitis por DSS en rata. La cepa mejoró significativamente los síntomas inducidos por el tratamiento con DSS.

Ejemplo 1 - Aislamiento de bifidobacterias de seres humanos sanos

Se aislaron bifidobacterias de muestras de heces humanas congeladas (-80°C) recogidas de voluntarios sanos. Se obtuvo consentimiento por escrito para utilizar el material para el aislamiento de bacterias de todos los voluntarios. Las muestras se descongelaron y 4 g de muestra se mezclaron en un homogenizador stomacher a alta velocidad en 35 ml de solución salina con peptona con cloruro de cisteína al 0,05%. Después de mezclado exhaustivo, se hicieron diluciones en serie de 10 veces en solución salina con peptona. Se plaquearon alícuotas de cien pl de las diluciones 105, 106, 107, 108 y 109 en zumo de tomate/agar de Eugon pH 7,0; (zumo de tomate, pH ajustado a 7,0 (400 ml/1000 ml), 45 g de agar de Eugon (Difco)/1000 ml, maltosa al 1%, cloruro de cisteína al 0,05%, hemina al 0,0005%, 40 mg/1000 ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido)), y agar de medio Columbia pH 7,0 (medio Beerens ajustado); (Medio Columbia (Difco), glucosa al 0,005%, sal sódica del ácido propiónico al 0,1%, cloruro de cisteína al 0,05%, 40 mg de X-gal.

Las placas se incubaron anaerobiamente a 37°C. Después de 3 días, se cogieron colonias individuales. La morfología de la colonia se registró y se determinó la morfología de célula individual por microscopía. Se sembraron colonias que tenían células con forma de V o forma de Y características de bifidobacterias en caldo Man Rogosa Sharp (m Rs ) (Oxoid A/S, Dinamarca) con cloruro de cisteína al 0,05% (Merck KGaA, Alemania) y se incubaron anaerobiamente a 37°C. Las cepas se purificaron posteriormente por sembrado en estrías 3 veces en placas de MRS con cloruro de cisteína al 0,05%. La pureza de las cepas se ensayó por extensión en agar de Caso (agar de triptona y soja con sangre de oveja), e incubación aerobia, 30°C durante 2 días. Las cepas puras en MRS con glicerol al 20% se almacenaron en ampollas a -80°C.

La afiliación taxonómica de los aislados fecales se determinó por secuenciación del ADNr 16S y análisis filogenético.

Se obtuvieron 127 aislados de Bifidobacterium de muestras de heces humanas y se caracterizaron adicionalmente.

Ejemplo 2 - Secuenciación de ADNr 16S y análisis filogenético

Se determinaron secuencias parciales del gen de ARNr 16S por amplificación de parte del ADNr 16S con cebadores conservados 616V (5-AGRGTTTGATYCKGGCTCAG-3') y 612R (5-GTAAGGTTCTTCGCGT-3') y posterior secuenciación del producto de amplificación con el cebador conservado 610R (5-ACCGCGGCTGCTGGCAC-3'). Las reacciones de secuenciación de Sanger fueron realizadas por LGC Genomics, Berlín, Alemania).

Se alinearon secuencias parciales de ADNr 16S rDNA (posición de E. coli de 27 a 468; Brosius et al., 1978) de las cepas de Bifidobacterium aisladas y B. adolescentis ATCC 15703T usando Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Se generó un árbol filogenético por unión de vecinos usando ClustalW2-Phylogeny (http://www.ebi.ac.uk/Tools/phyloqeny/clustalw2 phylogeny/), y el árbol se mostró usando la impresora de árboles Phylodendron Phylogenetic (http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint-form.html).

Resultados

Treinta y seis cepas de Bifidobacterium estaban más estrechamente relacionadas con B. adolescentis basado en el análisis filogenético del ADNr 16S. Sin embargo, todas las cepas tenían secuencias de ADNr 16S divergentes de la cepa tipo, B. adolescentis ATCC 15703T. Las cepas se agruparon en 4 grupos distintos diferentes de B. adolescentis ATCC 15703T como se muestra en el dendograma de la figura 1. Los 4 grupos de nombraron riboespecies 2, 3, 4 y 5. Veinte cepas constituían un único grupo (riboespecie 2), otras 12 cepas se agruparon juntas (riboespecie 5), y 2 y 3 cepas formaron 2 grupos respectivamente (riboespecie 3 y riboespecie 4). Se identificaron secuencias firma de ADNr 16S que discriminan claramente las riboespecies entre sí y de la cepa tipo (figura 2). Las secuencias firma se marcan en la figura 2. Se encontraron todas las secuencias de ADNr 16S específicas (firmas) consistentemente entre las cepas y produjeron el agrupamiento de las cepas. Así las riboespecies 2 y 5 tienen ambas secuencias específicas en las bases 74-75 y 90-3 (numeración de E. coli) que las separan de la cepa tipo y las riboespecies 3 y 4. La riboespecie 2 se puede discernir de la riboespecie 5 por la firma ACC (bases 192-194), y por firmas en las bases 212-215, 226­ 232. Las secuencias firma en las bases 262-267 y 287-293 discriminan las riboespecies 3 y 4 de la cepa tipo y las riboespecies 2 y 5. La riboespecie 4 se diferencia de las otras riboespecies y de la cepa tipo por la firma GACAU localizada en las bases 187-191. Por tanto, las cuatro riboespecies se pueden discriminar de forma no ambigua entre sí y B. adolescentis ATCC 15703T ya sea por secuencias firma únicas o por combinaciones de firmas.

El análisis filogenético de ADNr 16S demostró la existencia de 4 grupos (riboespecies) de bifidobacterias entre las cepas aisladas de heces humanas que estaban más estrechamente relacionadas a B. adolescentis; sin embargo, con secuencias firma muy consistentes y específicas que diferencian los aislados de la cepa tipo.

Para determinar el estado taxonómico de estas riboespecies, se seleccionaron cepas representativas de cada grupo y se sometieron a análisis de reasociación ADN-ADN con cepas tipo que pertenecen al grupo B. adolescentis.

Ejemplo 3 - Reasociación ADN-ADN

El parentesco ADN-ADN de una colección de cepas similares a B. adolescentis respecto a cepas tipo de Bifidobacterium se determinó por BCCM™/LMG, Bacteria Collection Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent.

Se investigaron los siguientes cultivos BIF122, DSM 29103 (BIF038), DSM 29107 (BIF106), BIF107, B. adolescentis LMG 10502T, B. stereoris LMG 27438T, B. ruminantium LMG 21811T, B. dentium LMG 11045T, y B. angulatum LMG 11039T. Estas especies están todas afiliadas con el grupo de B. adolescentis.

Las bacterias se cultivaron en medio LMG 144, y se comprobó la pureza después de la incubación a 37°C en condiciones anaerobias. El ADN genómico se extrajo según una modificación del procedimiento de Gevers et al., (2001). Las hibridaciones se realizaron en presencia de formamida al 50% a 49°C según una modificación (Goris et al., 1998; Cleenwerck et al., 2002) del método descrito por Ezaki et al., (1989). Se realizaron reacciones recíprocas (A x B y B x A) y la diferencia entre el valor medio de A x B y de B x A para cada par de ADN se da en la tabla 1 entre paréntesis.

Resultados

Para BIF122, la diferencia entre el valor medio de A x B y el de B x A en general no está en los límites de este método (tabla 1) y por tanto los resultados de la hibridación ADN:ADN no son concluyentes.

DSM 29103 (BIF038), DSM 29107 (BIF106), BIF107 muestran más del 70% de parentesco ADN-ADN, en general aceptado como el límite de especies para delineación (Wayne et al., 1987) entre sí y con la cepa tipo de B. adolescentis y B. stercoris. B. stereoris previamente descrita como una nueva especie ya no se considera una especie discreta, sino que se incluye con B. adolescentis (Killer et al., 2013).

La cepa tipo de B. ruminantium muestra un parentesco de ADN-ADN que varía del 36 al 45% con DSM 29103 (BIF038), DSM 29107 (BIF106), BIF107, la cepa tipo de B. adolescentis y B. stereoris (Tabla 1).

En conclusión, los resultados claramente muestran que DSM 29103 (BIF038), DSM 29107 (BIF106), BIF107 pertenecen a la especie B. adolescentis y que las riboespecies identificadas son subgrupos distintos de esta especie. Puesto que no existe una definición firme de subespecie, hemos mantenido el término riboespecie para estos grupos.

Tabla 1

Parentesco ADN-ADN de cepas similares a B. adolescentis respecto a cepas tipo en el grupo de B. adolescentis.

(% de parentesco de ADN)

Para cada par de ADN la diferencia entre el valor medio de A x B y el de B x A está dentro de los límites de este método, excepto en el caso de la hibridación ADN:ADN con ADN de BIF122, donde la diferencia es en general demasiado alta (*). Loa altos valores entre paréntesis son debidos a la diferencia en la inmovilización de los ADN “recíprocos”. En este estudio el ADN de BIF122 se inmovilizó en una menor cantidad en los pocillos de la microplaca que los otros ADN. La razón para esto no está clara.

Ejemplo 4 - Fermentación de hidratos de carbono

Se investigó el crecimiento de la cepa tipo de B. adolescentis y representantes de las 4 riboespecies en varias fuentes de hidratos de carbono usando el ensayo API 50 CH.

Se investigó la capacidad para crecer sobre almidón, amigdalina, arbutina, D-celobiosa, D-fructosa, D-galactosa, D-glucosa, D-lactosa (bovina), D-maltosa, D-manitol, D-manosa, D-melbiosa, D-melezitosa, D-ribosa, D-sacarosa (sacarosa), D-sorbitol, D-trehalosa, D-turanosa, D-xilosa, gentiobiosa, glucógeno, inulina, 2-cetogluconato de potasio, gluconato de potasio, L-arabinosa, metil-aD-glucopiranósido, N-acetilglucosamina, salicina, D-adonitol, D-arabinosa, D-arabitol, D-fucosa, D-lixosa, D-rafinosa, D-tagatosa, dulcitol, eritritol, esculinferricitrato, glicerol, inositol, 5-cetogluconato de potasio, L-arabitol, L-fucosa, L-rhamnosa, L-sorbosa, L-xilosa, metil-p D-xilopiranósido, metil-aD-manopiranósido, y xilitol en un subconjunto de las cepas aisladas similares a B. adolescentis y se comparó con la cepa tipo B. adolescentis ATCC 15703T

Las bifidobacterias se sembraron a partir de cultivos nocturnos en caldo de Man Rogosa Sharp (MRS) (Oxoid A/S, Dinamarca) con cloruro de cisteína al 0,05% (Merck KGaA, Alemania) y se incubaron de forma anaerobia a 37°C. Después de 2 días las bacterias se recogieron de las placas usando un hisopo y se suspendieron en medio API 50 CHL con cloruro de cisteína al 0,5% y la suspensión bacteriana se distribuyó en tiras de API 50 CH según las instrucciones del fabricante. Las tiras se inocularon de forma anaerobia a 37°C. Las tiras se leyeron después de 5 días de incubación y el desarrollo del color se registró como o -.

Resultados

Dieciocho hidratos de carbono fueron diferencialmente fermentados por la cepa tipo B. adolescentis y los aislados fecales (tabla 2). La cepa tipo y las cepas que pertenecen a las riboespecies 2 y 5 fueron capaces de crecer sobre almidón como la única fuente de hidratos de carbono, mientras que cepas de las riboespecies 3 y 4 fueron incapaces de fermentar almidón. La cepa tipo y las riboespecies 3 y 4 no crecieron en glucógeno, mientras que las riboespecies 2 y 5 crecieron en esta fuente de hidratos de carbono. Todas las cepas de las riboespecies 3 y 4 fueron capaces de crecer en trehalosa, mientras que la cepa tipo y el 38% de las riboespecies 2 y 5 pudieron crecer en trehalosa. La cepa tipo y el 54% de las cepas pertenecientes a las riboespecies 2 y 5 crecieron en sorbitol, mientras que las riboespecies 3 y 4 no crecieron en sorbitol.

La capacidad para fermentar y crecer en fuentes específicas de hidratos de carbono muestra la presencia de dos grupos de cepas de B. adolescentis entre los aislados humanos que son diferentes de la cepa tipo. En particular, el crecimiento en almidón y glucógeno diferencia los dos subgrupos entre sí y de la cepa tipo.

Ejemplo 5 - Secuenciación del genoma

Se extrajo ADN de cultivos nocturnos de dos representantes de cada riboespecie: BIF038 (DSM 29103) y BIF060, riboespecie 2; BIF137 y BIF107, riboespecie 3; BIF122 y BIF046 (DSM 29111), riboespecie 4, y BIF016 y BIF106 (DSM 29107), riboespecie 5, con ayuda del kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación del genoma se realizó en Instituto de Genómica Beijing, Hong Kong, usando la plataforma NGS Illumina, HiSeq® 2000 (San Diego, EE UU). Para cada cepa se obtuvieron datos de 200 megabases, consistentes en lecturas de 100 pb de extremo emparejado con espaciadores de 500 pb. El ensamblaje de novo de las lecturas de la secuenciación se realizó con ayuda de software CLC Bioinfoirmatics (Aarhus, Dinamarca). Se identificaron secuencias codificantes en las colecciones de contigos resultantes con ayuda del módulo GenAnnot de Genostar Suite 4.0 (Grenoble, Francia) empleado el algoritmo Glimmer incorporado. Se usó la funcionalidad pangenoma en el módulo Pathway Explorer de Genostar Suite 4.0 para construir el pangenoma de las ocho cepas secuenciadas y B. adolescentis ATCC 15703t (No. de registro de GenBank NC_008618.1).

Resultados

Se identificaron secuencias de ADN codificantes (CDS) únicas en cada riboespecie. Así, se encontraron CDS que estaban presentes en las cepas similares a B. adolescentis secuenciadas y ausentes en B. adolescentis ATCC 15703T Se encontraron CDS específicas que definen las riboespecies 2 y 5, las riboespecies 3 y 4, así como las riboespecies individuales (2, 3, 4, y 5).

La similitud de las secuencias de aminoácidos codificadas por estas CDS respecto a cualquier proteína conocida se determinó por búsquedas Blast® (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Las búsquedas se hicieron usando blastp frente a todas las traducciones de CDS de GenBank no redundantes PDB+SwissProt PIR PRF excluyendo las muestras medioambientales de los proyectos WGS.

La tabla 3 enumera 3 CDS encontradas solo en las riboespecies 2 y 5.

CDS 2439 codifica una proteína de 91 aminoácidos con alineamiento significativo a “proteína hipotética [Bifidobacterium catenulatum]; WP_003834978.1" (E-score: 3E-22; Identidad: 67%). No se encontraron dominios conservados, y no se encontró alineamiento significativo a proteínas conocidas.

CDS 2454 codifica una proteína de 107 aminoácidos con alineamiento significativo a “proteína hipotética BMOU_0229 [Bifidobacterium moukalabense DSM 27321]; gbETY72215.1" (E-score: 5E-41; Identidad: 65%), sin dominio conservado. El mejor alineamiento a una proteína no hipotética es al “factor de transporte nuclear 2 [Mycobacterium tusciae]; WP_006241648.1" (E-score: 0.004; Identidad: 32%) con 1 dominio (25-138), "superfamilia del factor de transporte nuclear 2 (tipo NTF2)".

CDS 2458 codifica una proteína de 206 aminoácidos con alineamiento significativo a “dominio similar a Ig bacteriano, grupo 2 [Bifidobacterium moukalabense DSM 27321]; ETY72212.1", (E-score: 1E-119; Identidad: 90%). No se encontraron dominios conservados.

La tabla 4 enumera 3 CDS encontradas solo en las riboespecies 3 y 4.

CDS 2027 codifica una proteína de 427 aminoácidos que se alinea significativamente a “transportador multifármaco MatE [Bifidobacterium catenulatum]; WP_003834477.1", (E-score: 0.0; Identidad: 98%) con un dominio conservado "familia de proteína de eflujo MATE [Bifidobacterium catenulatum DSM 16992 = JCM 1194 = LMG 11043]".

CDS 2312 codifica una proteína de 330 aminoácidos con alineamiento significativo a “MULTIESPECIES: subunidad beta de ribonucleótido-difosfato reductasa [Bifidobacterium]; WP_003835055.1" (E-score: 0.0; Identidad: 97%), con un dominio conservado (20-291), "Ribonucleótido Reductasa, R2/subunidad beta, dominio de unión a dihierro similar a ferritina; cd01049". Se han encontrado proteínas homólogas en varias bifidobacterias, pero no en B. adolescentis. Además, CDS 2314 codifica una proteína de 766 aminoácidos con alineamiento significativo a "subunidad alfa de ribonucleótido-difosfato reductasa [Bifidobacterium pseudocatenulatum]; WP_004221779.1" (E-score: 0.0; Identidad: 91%). Por tanto, en las riboespecies 3 y 4 están presentes secuencias codificantes que codifican tanto la subunidad alfa como la beta de esta proteína.

La tabla 5 enumera 2 CDS encontradas solo en la riboespecie 2.

CDS 2406 codifica una proteína de 362 aminoácidos con alineamiento significativo a “proteína hipotética [Bifidobacterium catenulatum]; WP_003835002.1" (E-score: 0.0; Identidad: 99%), con un dominio conservado (22­ 114), “extremo N de proteína R de la enzima de restricción de tipo I (HSDR_N)”.

CDS 2425 codifica una proteína de 66 aminoácidos con alineamiento significativo a “proteína hipotética [Bifidobacterium boum]; WP_026502472.1" (E-score: 1E-37; Identidad: 100%) sin dominios conservados. El mejor alineamiento a una proteína no hipotética es a la "proteína de membrana de la familia OmpA [Hyphomonas neptunium]; WP_011646448.1" (E-score: 0.87; Identidad: 48%), con 2 dominios conservados (411-536), "proteína de membrana externa y (lipo)proteínas asociadas a peptidoglucano relacionadas [biogénesis de la envuelta celular, membrana externa]; COG2885"; (430-534), "dominios de unión a peptidoglucano similares al dominio C-terminal de la proteína de membrana externa OmpA; cd07185".

La tabla 6 enumera 2 CDS encontradas solo en la riboespecie 5.

CDS 3350 codifica una proteína de 60 aminoácidos con alineamiento significativo a “proteína hipotética [Pseudoclavibacter soli]; w P_028244556.1" (E-score: 7E-13; Identidad: 53%), con un dominio conservado (41-252), “dolichil-fosfato-manosa-proteína manosiltransferasa”.

CDS 3351 codifica una proteína de 462 aminoácidos con un alineamiento significativo a “proteína hipotética [Bifidobacterium bifidum]; WP_003815303.1" (E-score: 4E-42; Identidad: 31%), con un dominio conservado (1-312), “dolichil-fosfato-manosa-proteína manosiltransferasa”.

La tabla 7 enumera 2 CDS encontradas solo en la riboespecie 3.

CDS 3123 codifica una proteína de 612 aminoácidos con alineamiento significativo a “proteína hipotética [Bifidobacterium angulatum]; WP_003826727.1" (E-score: 1E-170; Identidad: 98%) con un dominio conservado (12­ 213), " subunidad permeasa del transportador ABC de protección lantibiótico, familia MutE/EpiE; TIGR03732".

CDS 3166 codifica una proteína de 612 aminoácidos con alineamiento significativo a “proteína que contiene el dominio D2 de formación de isopétido fimbrial [Bifidobacterium breve]; WP_016462071.1" (E-score: 0.0; Identidad: 95%), con 3 dominios (225-407), "dominio D2 de formación de isopétido fimbrial; TIGR04226"; (444-532) "dominio de tipo B de proteína Cna; pfam05738"; (577-610), "dominio de ancla a la pared celular con motivo LPXTG; TIGRO1167".

La tabla 8 enumera 2 CDS encontradas solo en la riboespecie 4.

CDS 2293 codifica una proteína de 1156 aminoácidos con alineamiento significativo a “proteína de unión a ATP [Bifidobacterium ruminantium]; WP_026645899.1 (E-score: 0.0; Identidad: 97%), con 2 dominios conservados (627­ 842), "dominio de función desconocida DUF87; cl19135"; (638-958), "dominio similar a AAA; pfam12846".

CDS 2334 codifica una proteína de 141 aminoácidos con alineamiento significativo a “regulador transcripcional de la familia XRE [Eggerthella lenta]; WP_015760296.1 (E-score:3E-87; Identidad: 92%), con 2 dominios conservados (4­ 117), "reguladores transcripcionales predichos [Transcripción]; COG1396"; (4-61) “proteínas similares a la familia XRE de hélice-giro-hélice”.

Ejemplo 6 - Estimulación de uniones estrechas en monocapas de células

Se midió la mejora de la barrera intestinal mediante la capacidad de las cepas para aumentar la resistencia eléctrica a través de monocapas de células Caco-2 (resistencia eléctrica transepitelial (TER).

Cultivo de célula Caco-2

La línea celular Caco-2 epitelial intestinal de mamífero (DSMZ ACC 169, Instituto Leibniiz, DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Braunschweig, Alemania) se cultivo en DMEM (Gibco) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 20% (Gibco), aminoácidos no esenciales 1X (Thermo Scientific), y Pen Strep 1X (Biological industries) a 37°C, CO² al 5% en un incubador. Se usaron células Caco-2 de los pases 15 a 25. Las células se tripsinizaron cuando estaban al 60-80% de confluencia. Se preparó una suspensión celular de 105 células/ml en DMEM y se sembraron 500 pl en el compartimento apical de insertos de 12 mm de membrana de poliéster Transwell® con tamaño de poro de 0,4 pm (Corning, EE UU), al tiempo que se añadió 1,5 ml de medio al compartimento basolateral. Las células se cultivaron en los insertos durante 21 días con cambio de medio dos veces a la semana.

El día 21 los insertos Transwell se movieron a un cellZscope® (nanoAnalytics, Alemania). El medio de cultivo se cambió a medio sin antibióticos, y según esto se añadieron 760 pl y 1,65 ml de DMEM sin antibióticos al compartimento apical y basolateral, respectivamente. El CellZscope se colocó en el incubador y se siguió la TER cada hora durante 20-23 horas con recogida automática de datos.

Preparación de bifidobacterias

Las bifidobacterias se cultivaron durante la noche anaerobiamente en caldo Man Rogosa Sharp (MRS) (Oxoid A/S, Dinamarca) con cloruro de cisteína al 0,05% (Merck KGaA, Alemania). Las bacterias se recogieron por centrifugación (6000 x g, 2 min), el sobrenadante se desechó y las bacterias se resuspendieron en DMEM. Las bacterias se recogieron de nuevo por centrifugación y se resuspendieron en DMEM para lavar las células. Después de una tercera centrifugación, las bacterias se resuspendieron en DMEM y se midió la DO⁶⁰⁰. La suspensión celular se diluyó a OD⁶⁰⁰ = 3,8.

Estimulación de células Caco-2

Para estimular las células Caco-2 con bifidobacterias, 100 pl de DMEM se retiraron suavemente de la parte apical de los insertos Transwell y se sustituyeron por 100 pl de suspensión bacteriana para dar una DO⁶⁰⁰ final de 0,5. Después el CellZscope se transfirió de vuelta al incubador y se registró la TER cada hora durante 16 horas. Todas las estimulaciones se hicieron en triplicados (3 Transwell independientes). Se usó DMEM sin suplemento bacteriano como control, es decir, monocapas de Caco-2 sin estimular. También se incluyó en cada experimento estimulación con Lactobacillus rhamnosus LGG, que es una cepa que estimula fuertemente TER. Se usó lGg para normalizar los datos entre experimentos individuales. La medida durante la noche de TER antes del inicio del experimento permitió la determinación de TER basal en cada pocillo individual y asegurar que la resistencia eléctrica era estable. Los cambios en TER durante la estimulación bacteriana se calcularon relativos al último valor registrado antes de la estimulación (fijado al 100%). Para comparar medidas de experimentos individuales los datos se normalizaron a los valores de TER medidos después de la estimulación con LGG.

Resultados

La capacidad para aumentar TER en monocapas de Caco-2 se ensayó en 21 cepas similares a B. adolescentis. La medida continua de TER mostró que después de 10 h de estimulación TER alcanzó una meseta seguido por muy poco aumento (figura 3). Según esto, la capacidad de cada cepa de mejorar TER después de 10 h se registró y las cepas se compararon en este punto de tiempo. La mayoría de las cepas similares a B. adolescentis aumentaron la TER de monocapas de Caco-2, pero a grados variables (figura 4). Seis cepas aumentaron TER después de 10 h a más del 120% de la resistencia registrada antes de la estimulación (DSM 29102 (BIF123), 148%; DSM 29107 (BIF106), 146%; DSM 29103 (BIF038), 142%; BIF060, 126%; BIF113, 124%; BIF016, 122%). Nueve cepas aumentaron TER del 110% al 120% relativa al valor antes de la estimulación mientras que seis cepas no tuvieron efecto sobre TER. Se consideró que las cepas que aumentan TER a > 120% del valor de resistencia antes de la estimulación de monocapas de Caco-2 tenían un efecto significativo sobre la barrera epitelial. Lactobacillus rhamnosus LGG aumentó TER al 155% ± 25% de la resistencia antes de la estimulación en todos los experimentos.

Ejemplo 7 - Modulación inmunitaria de células dendríticas

Se investigó el potencial efecto inmunorregulador de las cepas similares a B. adolescentis determinando la inducción de citoquinas en células dendríticas humanas después de la estimulación.

Preparación de bifidobacterias

Se prepararon cultivos congelados de bifidobacterias para la estimulación de células dendríticas (CD) inoculando bifidobacterias en 10 ml de caldo Man Rogosa Sharp (MRS) (Oxoid A/S, Dinamarca) con cloruro de cisteína al 0,05% (Merck KGaA, Alemania) y cultivando anaeróbicamente durante la noche a 37°C. Al día siguiente, el 1% del cultivo nocturno se inoculó en MRS con cloruro de cisteína al 0,0% y se hizo crecer anaeróbicamente durante la noche a 37°C. Para recoger las bifidobacterias en fase de crecimiento exponencial, 100 pl del cultivo nocturno fresco se inocularon en 10 ml de MRS (dilución del 1%) con cloruro de cisteína al 0,05%; se hicieron cinco diluciones secuenciales de 10 veces (de 10-1 a 10-5) de la inoculación al 1% y se hicieron crecer anaeróbicamente durante la noche a 37°C. La densidad bacteriana se ajustó a OD⁶⁰⁰ = 5, y los cultivos se congelaron a -80°C en glicerol al 10% en bandejas de microtitulación.

Generación de CD derivadas de monocitos

Se generaron CD inmaduras derivadas de monocitos in vitro mediante un procedimiento de 6 días. Capas leucocíticas humanas de donantes sanos fueron suministradas por el Departamento de Inmunología Clínica en e1Hospital de la Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca. El uso de muestras humanas sin información de identificación fue aprobado por el Comité Nacional sobre Investigación en Salud y La Sociedad Danesa para Inmunología Clínica, y todos los donantes dieron consentimiento escrito informado tras la donación. Brevemente, se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica humana de capas leucocíticas por centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). Los monocitos se aislaron por selección positiva para CD14 usando separación celular activada por magnetismo con microesferas de CD14 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) y se cultivaron a una densidad de 2x106 células/ml en medio de CD completo (RPMI 1640 suplementado con HEPES 10 mM (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania), L-glutamina 2 mM (Life Techonologies Ltd, Paisley, RU), suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Invitrogen, Paisley, RU), penicilina 100 U/ml (Biological Industries, Kibutz Beit-Haemek, Israel), y estreptomicina 100 mg/ml (Biological Industries, Kibutz Beit-Haemek, Israel)) que contenía IL-4 recombinante humana 30 ng/ml y GM-CSF recombinante humano 20 ng/ml (ambos de Sigma-Aldrich, San Luis, EE UU) a 37°C, CO² al 5%. Se añadió medio de CD completo fresco que contenía dosis completas de IL-4 y GM-CSF después de tres días de cultivo. El día 6, la diferenciación de CD inmaduras se verificó por análisis de expresión de marcadores de superficie (CD11c > 90% de expresión; CD1a > 75% de expresión).

Estimulación de CD

Las CD inmaduras se resuspendieron en medio de CD completo fresco que no contenía antibióticos, se sembraron en placas de 96 pocillos a 105 células/pocillo, y se dejó que se aclimataran a 37°C, CO² al 5%, durante al menos una hora antes de la estimulación. Las CD se estimularon con bifidobacterias descongeladas a una proporción bacterias:CD de 100:1, durante 20 h a 37°C, CO² al 5%. Después de 20 h de estimulación, los sobrenadantes de CD se esterilizaron por filtración a través de una placa de filtro de 96 pocillos de 0,2 pm AcroPrep Advance (Pall Corporation, Ann Arbor, MI, EE UU) y se almacenaron a -80°C hasta el momento de la cuantificación de citoquinas.

Tinción de CD para la cuantificación de moléculas coestimuladoras y receptores de quimioquinas

Inmediatamente después del tiempo de estimulación de 20 h, las CD se recogieron, se centrifugaron a 200 x g durante 5 min, y se resuspendieron en PBS frío que contenía BSA al 2%. La tinción se realizó usando los siguientes anticuerpos monoclonales: anti-CD80 humano conjugado a FITC (clon L307.4), anti-CD86 humano conjugado a FITC (clon 2331), anti-CCR6 humano conjugado a APC (clon 11A9), anti-CCR7 humano conjugado a FITC (clon 150503), y controles de isotipo apropiados (todos de BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica). Las CD se incubaron con los Acm durante 30 min en hielo protegidas de la luz, seguido por etapas de lavado repetidas usando 1 ml de PBS frío BSA al 2%. Por último, las CD se resuspendieron en BSA al 2% en PBS y se mantuvieron en hielo hasta el análisis por citometría de flujo. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo LSRFortessa (BD Biosciences, SanJose, CA, EE UU) usando software FACSDiva (BD Biosciences, SanJose, CA, EE UU).

Cuantificación de citoquinas

Se cuantificaron los niveles secretados de IL-10, IL-12, TNFa, IL-6 e IL-1p mediante el kit de la matriz citométrica de esferas (CBA) de Citoquinas Inflamatorias Humanas (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, esferas fluorescentes recubiertas con anticuerpos de captura monoclonales se mezclaron con anticuerpos de detección conjugados a PE y estándares recombinantes o muestras de prueba y se dejó que formaran complejos en sándwich durante 3 h de incubación protegidos de la luz. Después de etapas de lavado repetidas, las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo LSRFortessa (BD Biosciences, San José, CA, EE UU) y el análisis de datos se realizó usando el software FCAP Array 3 (BD Biosciences, San José, CA, EE UU). Los límites de detección para citoquinas individuales fueron como sigue: IL-12 1,9 pg/ml; TNFa 3,7 pg/ml, IL-10 3,3 pg/ml, IL-62,5 pg/ml, e IL-1p 7,2 pg/ml.

Resultados

Las cepas similares a B. adolescentis indujeron secreción de citoquinas en células dendríticas humanas. Puesto que no se pudieron ensayar todas las cepas similares a B. adolescentis en un único cribado, se usaron CD derivadas de diferentes donantes. Se encontraron variaciones sustanciales en la respuesta global de citoquinas entre donantes y en consecuencia los datos de citoquinas se normalizaron para comparar los resultados de diferentes donantes. Los datos de citoquinas sin procesar se normalizaron a la expresión media para cada citoquina y cada donante. Trece cepas similares a B. adolescentis estimularon la secreción de IL-10 por encima del límite de detección y significativamente diferentes de células sin estimular (Figura 5), entre otras en particular DSM 29111 (BIF046), DSM 29105 (BIF061), DSM 29106 (BIF084), DSM 29103 (BIF038) y DSM 29104 (BIF129). Diez de estas cepas similares a B. adolescentis además produjeron una proporción de secreción IL-10/IL-12 mayor de uno lo que sugiere potencial inmunorregulador (DSM 29111 (BIF046), 2.1; DSM 29106 (BIF084), 1.1; DSM 29103 (BIF038), 1.1; DSM 29104 (BIF129), 2.8; BIF056, 1.1; BIF059, 1.1; BIF027, 1.3; DSM 29102 (BIF123), 1.1; BIF016, 1.1; DSM 29107 (BIF106), 1.6).

Resumen de resultados in vitro seleccionados

La tabla 9 presenta un resumen de los resultados in vitro de las cepas depositadas. Se seleccionaron cepas que eran capaces de aumentar la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de una monocapa de células Caco-2 después de 10 h de tratamiento a más del 120% de la TER al inicio del tratamiento, capaces de inducir secreción de > 200 pg/ml de IL-10, cuando se coincuban con células dendríticas derivadas de CMSP humanas, o capaces de inducir una proporción IL-10:IL-12 > 1, cuando se coincuban con células dendríticas derivadas de CMSP humanas, o una combinación de dos o más de estas tres funciones.

Ejemplo 8 - Efecto de B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) sobre colitis inducida por DSS

In vivo, se ensayó B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) en un modelo de colitis por sulfato sódico de dextrano (DSS) en ratas. La colitis por DSS es un modelo de enfermedad intestinal inflamatoria, incluyendo colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn, para la que se ha mostrado que la incidencia y prevalencia mundiales aumentan (Molodecky et al., 2012). Los mecanismos patofisiológicos subyacentes de la colitis por DSS incluyen inflamación, destrucción de criptas y permeabilidad intestinal aumentada. Los síntomas de la enfermedad en colitis por DSS se corresponden a lo que se observa en CU humana, incluyendo pérdida de peso corporal, diarrea y pérdida de sangre en heces (Herias et al., 2005).

En este estudio, ratas Wistar macho de 8 semanas de edad (N = 18 para grupos de DSS, N = 6 para los controles sanos) recibieron una dieta humanizada semipurificada (alta en grasas, baja en fibra) para mimetizar las condiciones humanas. Los animales se enjaularon individualmente en jaulas metabólicas con un suelo de acero inoxidable para facilitar la recogida de heces y orina completamente separadas. Las jaulas metabólicas tenían túneles de alimentación para evitar derrame de pienso y asegurar la medida correcta de la ingesta de pienso. Se dosificaron aproximadamente 1010 UFC/día de B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) o placebo como polvo liofilizado suspendido en solución salina. Después de dos semanas de dosificación de B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) o vehículo (solución salina) por alimentación forzada oral se introdujo la colitis añadiendo DSS al 3% en el agua de beber durante 9 días. Durante la exposición a DSS los pesos corporales se registraron a diario para medir la anorexia inducida por inflamación. La consistencia de las heces y la sangre en las heces se puntuaron a diario durante la colitis como medidas de la gravedad de la enfermedad. Se puntuó la consistencia de las heces según los siguientes parámetros 0; heces formadas y duras, 1; heces formadas, pero blandas, 2; heces sueltas, 3; diarrea leve (acuosa) y 4; diarrea fuerte. Se añadió cromo inerte CrEDTA (2 g/kg de pienso) a la dieta para cuantificar la permeabilidad gastrointestinal. La ingesta de CrEDTA de la dieta se determinó a diario pesando el pienso de los animales y la permeabilidad gastrointestinal se evaluó por determinación de CrEDTA una vez antes (día -1/-2) y dos veces durante la colitis (día 4/5 y día 7/8) en muestras de orina de 24 horas. Para la medida de Cr, la orina se acidificó con ácido tricloroacético 50 g/l, se centrifugó a 14.000 g durante 2 min y se diluyó con CsCl 0,5 g/l. El cromo se analizó por espectrofotometría de emisión atómica acoplada a plasma inductivamente.

Al final se examinó el colon para evaluar las lesiones macroscópicas según los criterios de Wallace (Wallace et al., 1989), que se basa en diarrea, adhesión, hiperemia, engrosamiento del intestino y grado de ulceración. Además, se cortó un trozo de 2 cm de la mitad del colon, se almacenó en paraformaldehído al 4%, se embebió en parafina, se cortó y tiñó con hematoxilina y eosina. Los cortes histológicos se enmascararon y puntuaron según la puntuación de Cooper (Cooper et al., 1993).

Los resultados se presentan como media EEM y la evaluación estadística de los datos sin procesar se realizó como sigue: para datos emparejados se realizó la prueba de Wilcoxon de datos emparejados no paramétrica para el grupo dosificado con bacterias y los controles sanos frente a DSS (grupo de vehículo). Los datos no emparejados se comprobaron para normalidad usando la prueba de Shapiro Wilk y para varianzas uniformes en los grupos por la prueba de Barlett. Cuando se cumplieron los criterios se realizó la prueba de t de Student entre el grupo dosificado con bacterias y los controles sanos frente DSS. Si los criterios no se cumplían se usó la prueba U de Mann Whitney.

Resultados

El peso corporal se registró a diario durante la exposición a DSS y B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) inhibió significativamente la pérdida de peso corporal inducida por DSS (p = 0,002) comparado con el grupo de DSS (Figura 6).

B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) tuvo significativamente menor (p = 0,048) heces sueltas y diarrea en términos de área bajo la curva de puntuación de consistencia de heces en aproximadamente el 10% comparado con el grupo de DSS (Figura 7). Además, el número de animales con una puntuación de sangre en heces al final estaba disminuido en el 30%; 7 de 18 animales en grupo de B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) frente a 10 de 18 en el grupo de DSS (Figura 8).

La permeabilidad intestinal completa aumentó durante la exposición a DSS, y el día 7,5 CrEDTA en orina por ingesta media de agua había aumentado en el 129% en el grupo de DSS comparado con los controles sanos. El límite de B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) significativamente (p = 0,057) disminuyó la permeabilidad inducida por DSS en el 30% el día 7,5 (Figura 9).

También se observó diferencia estadísticamente significativa del 26% al comparar la puntuación histológica al final entre el grupo de B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) y el grupo de DSS (p = 0,049), mientras que la puntuación macroscópica al final disminuyó en el 19% en el grupo de B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) comparado con el DSS (Figura 10 y Figura 11, respectivamente).

En conjunto, esta intervención con B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) llevó a mejoras en anorexia inducida por enfermedad, consistencia de heces, número de animales, sangre en heces, puntuación macro y microscópica y permeabilidad intestinal comparado con ratas que recibieron el tratamiento de DSS solo.

Estos datos indican que B. adolescentis DSM 29103 (BIF038) previene y/o inhibe la inflamación y daño tisular en el aparato digestivo, así como que inhibe diarrea e induce un efecto global de fomento de la salud en términos de peso corporal.

Depósito y solución experta

El solicitante solicita que una muestra de los microorganismos depositados para la presente solicitud como se describe a continuación se pueda hacer disponible solo a un experto, hasta la fecha en la que se conceda la patente.

CHCC12845 se depositó con DSMZ-Colección Alemana de Microorganismo y Cultivos Celulares GmbH; Inhoffenstr.

7B, D-38124 Braunschweig, el 16 de julio, 2014 con el no. de registro DSM 29102.

CHCC12855 se depositó con DSMZ-Colección Alemana de Microorganismo y Cultivos Celulares GmbH; Inhoffenstr.

7B, D-38124 Braunschweig, el 16 de julio, 2014 con el no. de registro DSM 29103.

CHCC12867 se depositó con DSMZ-Colección Alemana de Microorganismo y Cultivos Celulares GmbH; Inhoffenstr.

7B, D-38124 Braunschweig, el 16 de julio, 2014 con el no. de registro DSM 29104.

CHCC12895 se depositó con DSMZ-Colección Alemana de Microorganismo y Cultivos Celulares GmbH; Inhoffenstr.

7B, D-38124 Braunschweig, el 16 de julio, 2014 con el no. de registro DSM 29105.

CHCC12957 se depositó con DSMZ-Colección Alemana de Microorganismo y Cultivos Celulares GmbH; Inhoffenstr.

7B, D-38124 Braunschweig, el 16 de julio, 2014 con el no. de registro DSM 29106.

CHCC12999 se depositó con DSMZ-Colección Alemana de Microorganismo y Cultivos Celulares GmbH; Inhoffenstr.

7B, D-38124 Braunschweig, el 16 de julio, 2014 con el no. de registro DSM 29107.

CHCC12876 se depositó con DSMZ-Colección Alemana de Microorganismo y Cultivos Celulares GmbH; Inhoffenstr.

7B, D-38124 Braunschweig, el 16 de julio, 2014 con el no. de registro DSM 29111.

Los depósitos se hicieron según el tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los fines de procedimiento de patentes.

Referencias

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Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1 Una cepa aislada de Bifidobacterium adolescentis seleccionada del grupo que consiste en DSM 29103 y un mutante de dicha cepa que es capaz de

   i) aumentar la resistencia eléctrica transepitelial (TER) de una monocapa de células Caco-2 después de 10 h de tratamiento a más del 120% de la t Er al inicio del tratamiento;

   ii) inducir secreción de >200 pg/ml de IL-10 cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas; e

   iii) inducir una proporción IL-10:IL-12 > 1 cuando se coincuba con células dendríticas derivadas de CMSP humanas.
2. 2. Una cepa aislada según la reivindicación 1 que es la cepa de Bifidobacterium adolescentis depositada como DSM 29103.
3. 3. Un producto probiótico que comprende una cepa aislada según la reivindicación 1 o 2 y un crioprotector.
4. 4. Un producto probiótico según la reivindicación 3 en donde el crioprotector es un sacárido.
5. 5. Una cepa aislada según la reivindicación 1 o 2 o un producto probiótico según la reivindicación 3 o 4 para uso en mejorar la función barrera intestinal.
6. 6. Una cepa aislada según la reivindicación 1 o 2 o un producto probiótico según la reivindicación 3 o 4 para uso en provocar una respuesta inmunitaria antiinflamatoria.

   '. Una cepa aislada según la reivindicación 1 o 2 o un producto probiótico según la reivindicación 3 o 4 para uso en la prevención, alivio de síntomas, y/o tratamiento de una afección inflamatoria intestinal tal como EII o SII, una enfermedad hepática tal como EGHNA, EHNA, cirrosis, o enfermedad hepática alcohólica, un trastorno metabólico tal como síndrome metabólico, resistencia a insulina, diabetes de tipo 2, obesidad, ateroesclerosis cardiovascular, una enfermedad autoinmunitaria, tal como enfermedad celiaca, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple o artritis reumatoide, y/o una afección mental tal como trastorno depresivo mayor, un trastorno del estado de ánimo, un trastorno cognitivo, síndrome de fatiga crónica, o ansiedad.