CN110368406B - 青春双歧杆菌ccfm1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用 - Google Patents

青春双歧杆菌ccfm1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，青春双歧杆菌CCFM1062能够显著降低血清中低密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的水平；显著改善高脂饮食诱导的血糖升高且改善胰岛素抵抗；显著降低肝脏中总胆固醇、甘油三酯的水平，减少肝脏脂肪变性、肝脏小叶炎症以及肝脏气球样病变；能够显著增加肝脏中超氧化物歧化酶水平；显著降低血浆中D‑乳酸的水平，改善肠道通透性增加；显著改善二型糖尿病造成的空腹血糖异常；显著改善二型糖尿病造成的胰腺和肝脏组织损伤；此外青春双歧杆菌CCFM1062对全氟辛酸有较强的吸附能力，减少全氟辛酸在体内吸收。

Description

青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中 的应用
技术领域
本发明属于功能性微生物技术领域，具体涉及青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用。
背景技术
肠道是一个高度复杂的生态系统，细菌种类繁多且相互作用，肠道菌群的组成影响宿主对外源化合物和病原体的敏感性，而宿主的生理状态影响肠道微生物菌群的组成。肝脏是和肠道联系最为密切的器官，肠道吸收的营养物质和脂肪随着血液进入肝脏循环，以供给全身能量所需。大量研究表明，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD)的形成跟肠道菌群失调有着密切的联系，肠道菌群失调能够促使肠道屏障破坏从而促进肠道通透性增加。随着肠道通透性的增加，肠道中的细菌所产的内毒素以及肠道损伤的产物更容易随血液进入肝脏对肝细胞造成刺激以致损伤，使NAFLD进一步恶化为更为严重的肝脏疾病，因而调节肠道菌群、保护肠道屏障是保护肝脏的重要方式。有研究表明，职业暴露于PFOA的工人的因脂肪肝死亡风险增加，因此日常生活中的PFOA暴露，是人类肝脏疾病发病的潜在风险。
益生菌被认为是一种无毒、无害，对人体健康具有一定促进作用的微生物。大量研究结果表明，多种益生菌对动物疾病具有显著的改善作用。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其中：所述青春双歧杆菌CCFM1062能够用于制备预防和减少肥胖的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备改善非酒精性脂肪性肝病造成的脂质代谢紊乱的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备改善非酒精性脂肪性肝病造成的肠道通透性增加的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备提高非酒精性脂肪性肝病肝脏的超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备回调血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶升高的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备吸附全氟辛酸、缓解全氟辛酸毒性的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备改善二型糖尿病造成的空腹血糖和糖耐量异常的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备改善二型糖尿病造成的血清中总胆固醇升高、高密度脂蛋白胆固醇下降的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备改善二型糖尿病造成的肝脏组织中炎症的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用的一种优选方案：所述青春双歧杆菌CCFM1062还能够用于制备显著改善二型糖尿病造成的胰腺、肝脏组织的病理损伤的菌剂、食品和/或药物。
本发明的有益效果：本发明提供的青春双歧杆菌CCFM1062能够显著降低血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平；显著改善高脂饮食诱导的血糖升高且改善胰岛素抵抗；显著降低肝脏中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的水平，显著降低肝脏中IL-1β的水平同时减少肝脏脂肪变性、肝脏小叶炎症以及肝脏气球样病变；能够显著增加肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)水平；显著降低血浆中D-乳酸(D-LA)的水平，改善肠道通透性增加；显著改善二型糖尿病造成的空腹血糖异常；显著改善二型糖尿病造成的胰腺和肝脏组织损伤；青春双歧杆菌CCFM1062可显著提高高糖作用下INS-1细胞的增殖和MafA基因的表达；可显著改善二型糖尿病造成的便秘情况；降低肠道内Ruminococcus属的水平，具有缓解便秘、焦虑和尿路感染的功效；此外青春双歧杆菌CCFM1062对全氟辛酸(PFOA)有较强的吸附能力，减少PFOA在体内吸收，具有缓解PFOA毒性的能力；显著提高NAFLD肠道中Parabacteroides属的丰度，提高肠道中有益菌群的比例，预防和减少非酒精性脂肪性肝病、全氟辛酸毒性、肥胖、二型糖尿病以及癫痫等疾病发生的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1是青春双歧杆菌CCFM1062的菌落形态；
图2是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠肠道中Ruminococcus属丰度的影响；
图3是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠空腹血糖的影响；
图4是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影响；
图5是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量药时曲线下面积(AUCglucose)的影响；
图6是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠血清总胆固醇(TC)水平的影响；
图7是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平的影响；
图8是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠胰岛素敏感性的影响；
图9是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠肝脏炎症的影响；
图10是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠胰腺组织病理的影响；
图11是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠肝脏组织病理的影响；
图12是青春双歧杆菌CCFM1062对PFOA的吸附情况；
图13是青春双歧杆菌CCFM1062对高糖作用下INS-1细胞增殖情况的影响；
图14是青春双歧杆菌CCFM1062对高糖作用下INS-1细胞MafA基因表达的影响；
图15是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠排首粒黑便时间的影响；
图16是青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠粪便含水量的影响；
图17是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠肠道中Parabacteroides属等特征性菌群的影响；
图18是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的影响；
图19是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的影响；
图20是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠血清谷草转氨酶(AST)水平的影响；
图21是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠空腹血糖的影响；
图22是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠的胰岛素抵抗的影响；
图23是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠血浆中D-乳酸(D-LA)的影响
图24是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠肝脏中总胆固醇(TC)的影响；
图25是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠肝脏甘油三酯(TG)的影响
图26是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠肝脏超氧化物歧化酶(SOD)的影响
图27是青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠肝脏炎症的影响；
图28是青春双岐杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠肝脏组织病理的影响；
图29是青春双岐杆菌CCFM1062对脂肪肝细胞Nrf2基因表达的影响。
注：a,b,c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P＜0.05)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
青春双歧杆菌CCFM1062(Bifidobacterium adoltescentis)，于2019年06月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60707。
青春双歧杆菌CCFM1062的特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌；
(2)菌落特征：厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-1mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色，半透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。
实施例1：青春双歧杆菌CCFM1062对模拟胃肠液具有良好的耐受性
将冷冻保存的青春双歧杆菌CCFM1062接种于mMRS培养基(MRS培养基+0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mMRS培养液传代培养2～3次后，取1mL青春双歧杆菌CCFM1062的培养液，与9.0mL pH 2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、pH＝2.5的mMRS培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。取取1mL青春双歧杆菌CCFM1062的培养液加入9mL人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH＝8.0的mMRS培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。实验结果如表1和表2所示。结果表明，青春双歧杆菌CCFM1062对人工胃肠液具有较好的耐受性。
表1青春双歧杆菌CCFM1062在人工模拟胃液中的耐受性
Figure BDA0002173480580000061
表2青春双歧杆菌CCFM1062在人工模拟肠液中的耐受性
Figure BDA0002173480580000062
实施例2：青春双歧杆菌CCFM1062对C57BL/6J小鼠无毒副作用
将青春双歧杆菌CCFM1062菌体重悬于3％的蔗糖溶液中，制成浓度为3.0×109CFU/mL的菌悬液。取体重16-20g左右的健康雄性C57BL/6J小鼠8只，适应环境一周后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。
这些试验结果列于表3中。这些结果表明，喂食浓度3.0×109CFU/mL的青春双歧杆菌CCFM1062未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
表3小鼠体重的变化及死亡情况
Figure BDA0002173480580000063
注：-：小鼠无死亡
实施例3：青春双歧杆菌CCFM1062对二型糖尿病小鼠的肠道菌群失调有恢复作用
取体重16-20g的健康雄性C57BL/6J小鼠40只，适应环境1周，随机分为5组：空白对照组(NC)、模型对照组(M)、罗格列酮对照组(RH)、青春双歧杆菌CCFM1062干预组(CCFM1062)、青春双歧杆菌BA1对照组(BA1)每组含小鼠8只，灌胃菌悬液的剂量为3.0×109CFU/mL，重悬于3％的蔗糖溶液中。实验动物分组及处理方法见表4：
表4实验动物分组
Figure BDA0002173480580000071
第2-7周：正常组小鼠喂食普通饲料，其余小鼠喂食高脂饲料。
在第11周的第1d，所有小鼠禁食不禁水12h，正常组注射50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)，其余组注射按照100mg/(kg体重)的剂量注射50mmol/L STZ(冰上避光，现配现用)，其中STZ的配制是用50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解。
试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，提取粪便中的宏基因组，并利用二代测序仪对肠道菌群结构进行分析。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.5mL/10g1％的戊巴比妥钠溶液麻醉后，心脏采血，辅以颈椎脱臼法处死。血液样本3000×g、4℃条件下离心15min，取上清，-80℃冻存用于测定相关血清指标。部分肝脏收集后迅速置于预冷的生理盐水中漂洗去血，放入多聚甲醛中固定，剩余部分肝脏于液氮中速冻并转移至-80℃冻存，后续制成肝匀浆以用于测定相关指标，具体制备方法如下：称取一定量肝脏组织，按1:9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000r离心10min，取上清冻存于-80℃备用。
菌群分析实验结果如图2所示，二型糖尿病小鼠粪便中Ruminococcus属的肠道微生物显著升高，而青春双歧杆菌CCFM1062的摄入可将Ruminococcus属的丰度回调，这表明本发明筛选的青春双歧杆菌CCFM1062具有缓解便秘、减少焦虑和尿路感染等疾病发生的功能。
实施例4：青春双歧杆菌CCFM1062可降低二型糖尿病小鼠(空腹)血糖水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
实验结果如图3所示。模型组小鼠空腹血糖显著升高，灌胃青春双歧杆菌CCFM1062明显降低了模型小鼠的空腹血糖水平并接近于空白对照组。其降低小鼠空腹血糖水平的能力与罗格列酮药物组相似。
实施例5：青春双歧杆菌CCFM1062可增强二型糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。小鼠处死前，禁食不禁水12h，灌胃葡萄糖溶液(2g/kg体重)，分别测量0，30，60，120min的血糖情况。
实验结果如图4和图5所示，模型组小鼠对葡萄糖的耐受能力较差，灌胃葡萄糖后，血糖值明显升高，并且下降缓慢，灌胃青春双歧杆菌CCFM1062明显降低了AUCglucose面积，且与正常组无显著差异。这就说明，青春双歧杆菌CCFM1062能够显著改善口服糖耐量，且作用效果强于青春双歧杆菌BA1。这些结果与血糖指标结果相一致，提示青春双歧杆菌CCFM1062可以通过增强葡萄糖耐受能力，进一步降低血糖水平。
实施例6：青春双歧杆菌CCFM1062可降低二型糖尿病小鼠血清总胆固醇(TC)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.5mL/10g 1％的戊巴比妥钠溶液麻醉后，心脏采血。血样3000×g、4℃条件下离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定血液中总胆固醇(TC)的含量。
实验结果如附图6所示。由图6可以看出，模型组小鼠血清总胆固醇含量明显升高，灌胃青春双歧杆菌CCFM1062降低血清总胆固醇的含量，其对总胆固醇水平的恢复能力强于对照药物及青春双歧杆菌BA1。
实施例7：青春双歧杆菌CCFM1062可升高二型糖尿病小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.5mL/10g 1％的戊巴比妥钠溶液麻醉后，心脏采血，血样离心后取上清，按照试剂盒的检测方法测定血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。
实验结果如附图7所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇含量显著降低，灌胃青春双歧杆菌CCFM1062可提高血清高密度脂蛋白胆固醇的含量，且青春双歧杆菌CCFM1062对血清高密度脂蛋白胆固醇水平的恢复能力显著强于青春双歧杆菌BA1。
实施例8：青春双歧杆菌CCFM1062可提高二型糖尿病小鼠的胰岛素敏感性
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.5mL/10g 1％的戊巴比妥钠溶液麻醉后，心脏采血，血样离心后取上清，按照试剂盒的检测方法测定血清胰岛素(INS)的含量，并结合空腹血糖结果计算胰岛素抵抗指数。
实验结果如附图8所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠胰岛素抵抗指数显著升高，灌胃青春双歧杆菌CCFM1062可降低小鼠的胰岛素抵抗指数，提高小鼠的胰岛素敏感性，且青春双歧杆菌CCFM1062对小鼠胰岛素敏感性的恢复能力显著强于青春双歧杆菌BA1。
实施例9：青春双歧杆菌CCFM1062可改善二型糖尿病小鼠肝脏的炎症状态
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.5mL/10g 1％的戊巴比妥钠溶液麻醉后，心脏采血，颈椎脱臼处死。取肝脏-80℃冻存，测定时称取一定量肝脏组织，按1:9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000r离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定白介素1β(IL-1β)的含量，以肝脏蛋白浓度进行校正。
实验结果如附图9所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠肝脏IL-1β显著升高，灌胃青春双歧杆菌CCFM1062可缓解小鼠肝脏的炎症状态，且青春双歧杆菌CCFM1062对小鼠肝脏炎症的缓解能力显著强于青春双歧杆菌BA1。
实施例10：青春双歧杆菌CCFM1062可缓解二型糖尿病小鼠胰腺和肝脏的组织损伤
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.5mL/10g 1％的戊巴比妥钠溶液麻醉后，心脏采血，颈椎脱臼处死。
取胰腺、肝脏等部分制作石蜡切片，经HE染色后光镜下观察组织形态并拍照，进行病理学评价。具体步骤如下：
(1)固定：组织样品用生理盐水洗一下，立即投入中性多聚甲醛固定液(4％)中固定，一般固定时间在72h之内。
(2)洗涤：流水冲洗或浸泡数小时或过夜。
(3)脱水：样品依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％1次20min、100％2次每次10min。
(4)透明：1/2纯酒精+1/2二甲苯混合液10min、二甲苯Ⅰ10min、Ⅱ10min(至透明为止)。
(5)浸蜡：将样品放入石蜡(62℃)透蜡2h。
(6)包埋：以最大的面在底层，使切出的面组织面所占最大。
(7)切片：用手动切片机，将蜡块切成5μm厚度的片段。
(8)展片和粘片(捞片)：打开水浴锅，使水温维持在42℃，使切片平整铺展在水面上。
(9)烤片：将载玻片连同载玻片架放入55℃的干燥箱，约2h至蜡熔化。
(10)水化：石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各级酒精溶液中各5min，再放入蒸馏水中3min。
(11)初染：切片放入苏木精中染色约20s。
(12)水洗：用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝，但要注意流水不能过大，以防切片脱落。
(13)分化：将切片放入1％盐酸乙醇溶液中褪色，7s。见切片变红，颜色较浅即可。
(14)漂洗：切片再放入自来水流水中冲洗15-20min使其恢复蓝色。
(15)复染：浸入伊红染液，立即取出进行脱水。
(16)脱水：将切片依次过95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ、70％乙醇，再放入80％乙醇50s、无水乙醇2min。
(17)透明：切片放入1/2无水乙醇，1/2二甲苯中1min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各2min。
(18)封片：切片经二甲苯透明后，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
实验结果如附图10和图11所示。由实验结果可以看出，模型组小鼠胰岛数量变少，出现萎缩现象，肝细胞出现小泡性脂变，有早期纤维化的形态学表现，而灌胃青春双歧杆菌CCFM1062可明显改善上述病变，且效果明显好于青春双歧杆菌BA1。
实施例11：体外具有良好的PFOA吸附能力
菌体吸附对青春双歧杆菌CCFM1062进行纯化和活化培养，按1％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h。然后在8000r/min离心5min收集菌体，取沉淀用生理盐水清理后继续在8000r/min离心5min，去沉淀得到活菌体细胞，即湿菌体。将湿菌体重悬于50mg/LPFOA溶液中，并使最终菌体浓度达到1g干菌体/L(将湿菌体重悬于不含PFOA的超纯水中作为空白对照)。使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含菌液的PFOA溶液的pH迅速调整至3.0，添加少量的NaOH或HCl(少于0.5ml)其离子强度对PFOA吸附的影响可以忽略。随后将装有100ml样液的250ml锥形瓶置于37℃、150rpm厌氧摇床培养，6h后取样测定，2次平行试验取平均值。
PFOA吸附量的测定：吸附实验后，样液在8000r/min离心5min，并用0.22μm的水膜过滤，PFOA浓度用具有Waters SYNAPT MS系统的UPLC-MS测定，采用Acquity UPLC BEH c18柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters Co.)，柱温35℃，进样量1μL。用100％(v/v)的乙腈溶液(溶液A)和0.1％(v/v)
甲酸水溶液(溶液B)作为洗脱液，进行梯度清洗，流速是0.3mL/min。
表5梯度洗脱条件
t/min 0-0.5 0.5-5.0 5.0-7.0 7.0-7.5
溶剂A比例 70％ 70-100％ 100％ 100-70％
质谱条件：电离源为ESI源；MRM检测；MS+检测；Capillary(毛细管)；3.0kV；Conc(椎体)：40.00V；Source Temperature(放射源温度)：120℃；Desolvation(去溶剂化)温度：400℃；Conc Gas Flow：50L/h；Desolvation Gas Flow：700L/h.气体流速为0.1ml/min；质子比扫描范围：100-2000；扫面时间1s，间隔0.061s。结果用MassLynxV4.1(Waters公司)分析；根据吸附前后PFOA的浓度差异计算乳酸菌对PFOA的吸附量。测定结果列于图12，青春双歧杆菌CCFM1062对50mg/L的PFOA的吸附率为67.92％±4.61％，显著高于其他菌株。
实施例12：青春双歧杆菌CCFM1062可促进高糖诱导的INS-1细胞的增殖及Maf AmRNA的表达
实验分成5组：正常组(含11.1mmol/L葡萄糖的普通培养液)，高糖
组(含22.2mmol/L葡萄糖的高糖培养液)，罗格列酮组(高糖培养液+80μmol/L
的罗格列酮)，BA1组(高糖培养液+含1*109CFU/mL BA1菌液)CCFM1062组(高糖培养液+含1*109CFU/mL CCFM1062菌液)。
将INS-1细胞(编号：BH-AC0530)培养于RPMI-1640培养液(含11.1mmol/L葡萄糖，10％FBS，50μmol/L 2-巯基乙醇，1mmol/L丙酮酸，10mmol/L HEPES)中，并放入37℃，5％CO2的培养箱中。
CCK-8法检测细胞增殖：将状态良好的细胞消化离心并接种于96孔板上，各孔约5×103个细胞，板的周边孔不接种细胞，为防止边缘效应同时向其中加入PBS溶液。待细胞贴壁，各孔中加入含0.5％胎牛血清的RPMI-1640培养基，同步化处理24h。同步化结束，依据分组向各孔加入相应培养基培养48h，每组设三个复孔，同时设置调零孔。药物干预结束，吸去旧培养基，PBS清洗2次，加入180μL无血清培养基和20μL CCK-8溶液，孵育3-4h。孵育结束，使用酶标仪于450nm下测定各孔吸光度值。
Maf A mRNA表达的测定：Trizol法提取RNA，吸弃6孔板中原培养液，同时用预冷的PBS清洗2次，各孔中分别加入1.0mL Trizol裂解细胞并将含细胞的裂解液转至无酶EP管，移液枪吹打至无明显沉淀静置5min。向各EP管加入0.2mL三氯甲烷，剧烈震荡15s，室温放置2-3min。4℃，12000rpm离心15min，吸取上清0.4m L左右，转入到另一无酶EP管中，加入0.5mL的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清，加入1.0mL 75％乙醇并颠倒混匀。4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温干燥2-5分钟。加入20μLDEPC处理水溶解，保存于80℃待用。测定RNA的浓度和质量，并按照反转录试剂盒说明书进行反转录。反转录得到的cDNA进行q RT-PCR检测，其中MafA特异性引物：F:5'-atcactctgcccaccatcac-3'，R:5'-atgacctcctccttgctgaa-3'。PCR体系为：F(10μM),0.50μL；R(10μM),0.50μL；c DNA Template，1.00μL；dd H2O，3.00μL；mix，5.00μL。PCR程序：95℃，2min；
(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，20sec)*35；72℃，5min；目的基因经过Real-timePCR检测后，采用2-△△CT法进行相对基因表达分析。先用CFX Manager软件分析各组大鼠INS-1细胞目标基因的表达量，再以正常组表达量为1，其他各组与之相比较，计算各组基因表达水平。
CCK-8法检测结果如图13所示，与正常组相比，高糖作用组细胞生长明显降低(P＜0.05)，罗格列酮对照组细胞增殖较高糖组有明显增加(P＜0.05)，CCFM1062组与高糖组相比细胞增殖状况也明显增加(P＜0.05)。
Maf A mRNA表达情况如图14显示，高糖作用组细胞的MafA mRNA的表达量明显低于正常组(P＜0.05)，而罗格列酮阳性对照组和CCFM1062组的Maf A mRNA表达量较高糖作用组明显上升(P＜0.05)。
实施例13：青春双歧杆菌CCFM1062可改善二型糖尿病小鼠的便秘情况
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。在实验结束前一天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。
粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重
在第15周的第一天，空白组和模型组灌胃墨汁，灌菌组和药物组灌胃含有各自灌胃内容物的墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠首粒排黑便的时间。
粪便含水量、排首粒黑便时间实验结果如图15和图16所示，由图可知，相比于模型组，青春双歧杆菌CCFM1062能显著提高粪便含水量至正常水平，缩短排首粒黑便时间，且效果都优于青春双歧杆菌BA1。
实施例14：青春双歧杆菌CCFM1062对NAFLD小鼠肠道菌群的调节作用
取体重16-20g的健康雄性C57BL/6J小鼠48只，适应环境1周，随机分为6组：空白对照组(NC)、模型对照组(M)、罗格列酮对照组(RC)、辛伐他汀对照组(SC)、青春双歧杆菌CCFM1062干预组(CCFM1062)、鼠李糖乳杆菌L10干预组(LC)，每组含小鼠8只。实验动物分组及处理方法见表6：
表6实验动物分组
Figure BDA0002173480580000131
Figure BDA0002173480580000141
试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，提取粪便中的宏基因组，并利用二代测序仪对肠道菌群结构进行分析。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.5mL/10g1％的戊巴比妥钠溶液麻醉后，心脏采血，辅以颈椎脱臼法处死。血液样本3000×g、4℃条件下离心15min，取上清，-80℃冻存用于测定相关血清指标。部分肝脏收集后迅速置于预冷的生理盐水中漂洗去血，放入4％中性多聚甲醛溶液中固定，剩余部分肝脏于液氮中速冻并转移至-80℃冻存，后续制成肝匀浆以用于测定相关指标，具体制备方法如下：称取一定量肝脏组织，按1:9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000r离心10min，取上清冻存于-80℃备用。
菌群分析实验结果如图17所示，显著提高NAFLD小鼠肠道中Parabacteroides属的丰度，预防和减少肥胖、非酒精性脂肪性肝病、二型糖尿病以及癫痫等疾病发生。
与模型组相比，NAFLD小鼠经青春双岐杆菌CCFM1062干预后，肠道中的Parabacteroides属丰度显著提高，而大量研究表明，Parabacteroides属与肥胖、非酒精性脂肪性肝病、二型糖尿病以及癫痫等疾病呈负相关，表明本发明的青春双岐杆菌CCFM1062具有减少肥胖、非酒精性脂肪性肝病、二型糖尿病以及癫痫等疾病发生的功能。
实施例15：青春双岐杆菌CCFM1062降低NAFLD小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。按照试剂盒的检测方法测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。
实验结果如附图18所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇含量显著升高，灌胃青春双岐杆菌CCFM1062可降低血清低密度脂蛋白胆固醇的含量，且青春双岐杆菌CCFM1062对血清低密度脂蛋白胆固醇水平的回调能力明显优于鼠李糖乳杆菌L10。
实施例16：青春双岐杆菌CCFM1062降低NAFLD小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。按照ALT试剂盒的检测方法测定血液中谷丙转氨酶(ALT)的含量。
实验结果如图19所示。模型组小鼠空腹ALT显著升高，青春双岐杆菌CCFM1062的干预明显降低了NAFLD小鼠的ALT水平，其降低小鼠空腹血糖水平的能力与辛伐他汀相似，而鼠李糖乳杆菌L10的摄入并未对ALT的升高有所逆转，值得注意的罗格列酮组的ALT水平显著高于模型组，提示长期服用罗格列酮会对肝脏造成损伤。
实施例17：青春双岐杆菌CCFM1062降低NAFLD小鼠血清谷草转氨酶(AST)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。按照试剂盒的检测方法测定血液中谷草转氨酶(AST)的含量。
实验结果如图20所示。由图20可以看出，模型组小鼠血清AST含量明显升高，灌胃青春双岐杆菌CCFM1062显著降低血清AST的含量，且其趋势和ALT趋势一致，提示青春双岐杆菌CCFM1062能够缓解肝脏损伤。
实施例18：青春双岐杆菌CCFM1062降低NAFLD小鼠的空腹血糖水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。
实验结果如图21所示。模型组小鼠空腹血糖显著升高，青春双岐杆菌CCFM1062的干预明显降低了NAFLD小鼠的空腹血糖水平，其空腹血糖控制能力显著强于鼠李糖乳杆菌L10的干预，且其降低小鼠空腹血糖水平的能力与罗格列酮相似。
实施例19：青春双岐杆菌CCFM1062缓解NAFLD小鼠的胰岛素抵抗
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。按照试剂盒的检测方法测定胰岛素(INS)的含量，并结合空腹血糖结果计算胰岛素抵抗指数。
实验结果如图22所示。与空白组相比，高脂高胆固醇饮食24周后，模型组小鼠胰岛素抵抗指数显著升高，鼠李糖乳杆菌L10干预后NAFLD小鼠胰岛素抵抗指数有所降低，但其效果不如青春双岐杆菌CCFM1062，提示青春双岐杆菌CCFM1062能够提高NAFLD小鼠的胰岛素敏感性，可能对二型糖尿病有一定缓解效果。
实施例20：青春双岐杆菌CCFM1062显著降低NAFLD小鼠血清D-乳酸(D-LA)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。
实验结果如图23所示。模型组小鼠血清D-LA含量明显升高，灌胃青春双岐杆菌CCFM1062明显降低了模型小鼠的D-LA水平并接近于空白对照组。其降低小鼠血清D-LA的能力与辛伐他汀药物组相似，显著改善NAFLD小鼠肠道通透性的增加。鼠李糖乳杆菌L10的干预没有明显的改善效果。
实施例21：青春双岐杆菌CCFM1062降低肝脏中总胆固醇(TC)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。按照试剂盒的检测方法测定总胆固醇(TC)的含量，以肝脏蛋白浓度进行校正。
实验结果如图24所示。与正常对照组相比，模型组小鼠肝脏TC显著升高，灌胃青春双岐杆菌CCFM1062降低NAFLD小鼠肝脏中TC的水平，且青春双岐杆菌CCFM1062对肝脏TC的调节能力与辛伐他汀相似。
实施例22：青春双岐杆菌CCFM1062降低肝脏中甘油三酯(TG)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。按照试剂盒的检测方法测定甘油三酯(TG)的含量，以肝脏蛋白浓度进行校正。
实验结果如图25所示。与正常对照组相比，模型组小鼠肝脏TG显著升高，灌胃青春双岐杆菌CCFM1062降低NAFLD小鼠肝脏中TG的水平，且青春双岐杆菌CCFM1062对肝脏TG的调节能力与辛伐他汀和罗格列酮相当。
实施例23：青春双岐杆菌CCFM1062提高了肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)的水平，以肝脏蛋白浓度进行校正。
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。按照超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒的说明书测定肝脏中SOD的含量。
实验结果如图26所示。空白对照组的SOD水平显著高于模型组，灌胃青春双岐杆菌CCFM1062显著提高NAFLD小鼠肝脏中SOD的水平且高于辛伐他汀干预组，而鼠李糖乳杆菌L10干预后并未呈现出相似的结果。
实施例24：青春双岐杆菌CCFM1062减轻NAFLD小鼠肝脏中的炎症水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。按照白介素-1β(IL-1β)试剂盒的说明书测定肝脏中IL-1β的浓度，以肝脏蛋白浓度进行校正。
实验结果如图27所示。由实验结果可以看出，高脂高胆固醇饮食24周后，模型组的IL-1β水平显著升高，灌胃青春双岐杆菌CCFM1062显著降低NAFLD小鼠肝脏中IL-1β水平，且其炎症缓解效果强于辛伐他汀和罗格列酮，而鼠李糖乳杆菌L10干预后NAFLD小鼠炎症缓解效果一般。
实施例25：青春双岐杆菌CCFM1062缓解NAFLD小鼠肝脏组织损伤
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例14。取部分经4％中性多聚甲醛固定的肝脏制作石蜡切片，经HE染色后光镜下观察组织形态并拍照，进行病理学评价。
实验结果如图28所示。由实验结果可以看出，模型组小鼠肝细胞排列稀疏，肝脂滴数量多且大小不一，脂滴之间相互粘连，肝小叶有炎性细胞浸润，少量肝细胞发生气球样病变，而灌胃青春双岐杆菌CCFM1062可明显改善上述病变，且效果明显优于鼠李糖乳杆菌L10干预组。值得注意的是，罗格列酮干预24周后显著加重肝脏损伤，而辛伐他汀并未显著改善肝脏损伤，提示长期服用药物对肝脏不利。
实施例26：青春双岐杆菌CCFM1062提高脂肪肝细胞中Nrf2的水平
将L02细胞在含有10％的FBS连续稳定传代三次后，接种于6孔板上，于37℃、5％CO2环境中培养24h,待细胞贴壁后，给予2mg/mL甘油三酯混合物孵育24h后再分别单独接入1mL的青春双岐杆菌CCFM1062和鼠李糖乳杆菌L10(接入PBS作为空白对照)孵育24h。所有孵育均在37℃、5％CO2环境中进行。青春双岐杆菌CCFM1062刺激实验组、鼠李糖乳杆菌L10刺激实验组和PBS对照组各三个孔，且重复三次。
弃去培养液，先用PBS缓冲液清洗每个孔，每次1mL，清洗3次后，加TRIZOL裂解，进行细胞RNA提取。将提取的RNA反转录为cDNA后进行qPCR测定青春双岐杆菌CCFM1062和鼠李糖乳杆菌L10与脂肪肝细胞共孵育后Nrf2基因的表达水平。Nrf2引物信息如表7所示。结果以GAPDH作为内参，表示为
Figure BDA0002173480580000171
表7引物信息
Figure BDA0002173480580000172
Figure BDA0002173480580000181
实验结果如图29所示。由实验结果可以看出，青春双岐杆菌CCFM1062刺激显著提高了脂肪肝细胞的Nrf2基因的表达水平，鼠李糖乳杆菌L10刺激组的Nrf2基因的表达水平也有升高但明显不及青春双岐杆菌CCFM1062刺激组，表明青春双岐杆菌CCFM1062可能具有一定抗氧化能力。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.青春双歧杆菌（Bifidobacterium adoltescentis）CCFM1062在用于制备预防和减少肥胖的菌剂、食品和/或药物的应用；其中，青春双歧杆菌CCFM1062，于2019年06月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60707。
2.如权利要求1所述的青春双歧杆菌CCFM1062在制备改善非酒精性脂肪性肝病造成的脂质代谢紊乱的菌剂、食品和/或药物中的应用。
3.如权利要求1所述的青春双歧杆菌CCFM1062在用于制备改善非酒精性脂肪性肝病造成的肠道通透性增加的菌剂、食品和/或药物中的应用。
4.如权利要求1～3中任一项所述的青春双歧杆菌CCFM1062在用于制备提高非酒精性脂肪性肝病肝脏的超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的菌剂、食品和/或药物中的应用。
5.如权利要求1～3中任一项所述的青春双歧杆菌CCFM1062在用于制备回调血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶升高的菌剂、食品和/或药物中的应用。
6.如权利要求1～3中任一项所述的青春双歧杆菌CCFM1062在用于制备吸附全氟辛酸、缓解全氟辛酸毒性的菌剂、食品和/或药物中的应用。
7.如权利要求6所述的青春双歧杆菌CCFM1062在用于制备改善二型糖尿病造成的空腹血糖和糖耐量异常的菌剂、食品和/或药物中的应用。
8.如权利要求1～3、7中任一项所述的青春双歧杆菌CCFM1062在用于制备改善二型糖尿病造成的血清中总胆固醇升高、高密度脂蛋白胆固醇下降的菌剂、食品和/或药物中的应用。
9.如权利要求1～3、7中任一项所述的青春双歧杆菌CCFM1062在用于制备改善二型糖尿病造成的肝脏组织中炎症的菌剂、食品和/或药物中的应用。
10.如权利要求1～3、7中任一项所述的青春双歧杆菌CCFM1062在用于制备显著改善二型糖尿病造成的胰腺、肝脏组织的病理损伤的菌剂、食品和/或药物中的应用。
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