CN110331119B - 两歧双歧杆菌ccfm1063及其应用 - Google Patents

两歧双歧杆菌ccfm1063及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了两歧双歧杆菌CCFM1063及其应用，两歧双歧杆菌CCFM1063能够在肠道内快速定植，显著改善由二型糖尿病造成的空腹血糖、口服糖耐量，降低葡萄糖耐量时曲线下面积；显著改善二型糖尿病造成的血清中总胆固醇升高、高密度脂蛋白胆固醇下降；显著改善二型糖尿病造成的胰岛素抵抗情况；显著改善二型糖尿病肝脏组织中炎症的水平；显著改善二型糖尿病造成的胰腺、肝脏等组织的病理损伤；两歧双歧杆菌CCFM1063对全氟辛酸有较强的吸附能力，具有缓解全氟辛酸毒性的能力；显著改善二型糖尿病造成的便秘情况且可以提高肠道内Allobaculum属的水平，具有缓解焦虑抑郁和结肠炎的功效。

Description

两歧双歧杆菌CCFM1063及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及两歧双歧杆菌CCFM1063及其应用。
背景技术
近年来，经济的发展导致我国人民生活方式的改变、活动量减少，肥胖的比例明显增加，糖尿病和代谢综合征(Metabolic Syndrome)得患病率大幅度增高。国际糖尿病联合会(IDF)表示，2017年，全球有4.25亿年龄大于19岁的人患有糖尿病，如果维持这种趋势，约30年后，糖尿病患者人数将高达6.93亿人。因此，控制糖尿病已经成为迫在眉睫的事情。
由于二型糖尿病是多种代谢成分异常聚集的病理状态，其集簇发生与胰岛素抵抗有关，目前已成为心血管疾病和肝脏疾病研究领域共同关注的热点。此外，二型糖尿病均伴随着肠道微生态的紊乱，同时也与抑郁、焦虑等精神性疾病紧密相关。另外有研究表明，职业暴露于PFOA的工人的Ⅱ型糖尿病死亡风险增加，因此日常生活中的PFOA暴露，是人类Ⅱ型糖尿病发病的潜在风险。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供两歧双歧杆菌CCFM1063，其保藏编号为GDMCC No：60701。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用，其中：所述两歧双歧杆菌CCFM1063能够用于制备缓解二型糖尿病造成的空腹血糖和口服糖耐量异常的功能性菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述两歧双歧杆菌CCFM1063还能够用于制备改善高脂饮食导致的血清中总胆固醇升高、低密度脂蛋白胆固醇升高的功能性菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述两歧双歧杆菌CCFM1063还能够用于制备改善二型糖尿病造成的肝脏组织中炎症的功能性菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述两歧双歧杆菌CCFM1063还能够用于制备改善二型糖尿病造成的胰腺、肝脏等组织的病理损伤的功能性菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述两歧双歧杆菌CCFM1063还能够用于制备吸附PFOA、缓解PFOA毒性的功能性菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述两歧双歧杆菌CCFM1063还能够用于制备提高高糖作用下INS-1的增殖和MafA基因的表达的功能性菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述两歧双歧杆菌CCFM1063还能够用于制备改善二型糖尿病造成的便秘的功能性菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述两歧双歧杆菌CCFM1063还能够用于制备缓解焦虑抑郁的功能性菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的两歧双歧杆菌CCFM1063在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述两歧双歧杆菌CCFM1063还能够用于制备缓解结肠炎的功能性菌剂、食品和或药物。
本发明的有益效果：两歧双歧杆菌CCFM1063能够在肠道内快速定植，显著改善由二型糖尿病造成的空腹血糖、口服糖耐量，降低葡萄糖耐量时曲线下面积；显著改善二型糖尿病造成的血清中总胆固醇升高、低密度脂蛋白胆固醇升高；显著改善二型糖尿病造成的胰岛素抵抗情况；显著改善二型糖尿病肝脏组织中炎症的水平；显著改善二型糖尿病造成的胰腺、肝脏等组织的病理损伤。此外，两歧双歧杆菌CCFM1063对全氟辛酸(PFOA)有较强的吸附能力，具有缓解PFOA毒性的能力；两歧双歧杆菌CCFM1063可显著提高高糖作用下INS-1的增殖和MafA基因的表达；显著改善二型糖尿病造成的便秘情况且可以提高肠道内Allobaculum属的水平，具有缓解焦虑抑郁和结肠炎的功效。所述的两歧双歧杆菌CCFM1063能很好的耐受模拟胃肠液，可用于制备缓解二型糖尿病、便秘、焦虑抑郁、PFOA毒性和结肠炎的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1是两歧双歧杆菌CCFM1063的菌落形态；
图2是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠肠道中Allobaculum属丰度的影响；
图3是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠空腹血糖的影响；
图4是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影响；
图5是两歧双歧杆菌CCFM1063对口服葡萄糖耐量药时曲线下面积(AUCglucose)
图6是两歧双歧杆菌CCFM1063对小鼠血清总胆固醇(TC)水平的影响；
图7是两歧双歧杆菌CCFM1063对小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的影响；
图8是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠胰岛素敏感性的影响；
图9是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠肝脏炎症的影响；
图10是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠胰腺组织病理的影响；
图11是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠肝脏组织病理的影响；
图12是两歧双歧杆菌CCFM1063对PFOA的吸附情况；
图13是两歧双歧杆菌CCFM1063对高糖作用下INS-1细胞增殖情况的影响；
图14是两歧双歧杆菌CCFM1063对高糖作用下INS-1细胞MafA基因表达的影响；
图15是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠排首粒黑便时间的影响；
图16是两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠粪便含水量的影响；
注：a,b,c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
两歧双歧杆菌CCFM1063(Bifidobacterium bifidum)，于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60701。
两歧双歧杆菌CCFM1063具有下述生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。
(2)菌落特征：厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。
(3)生长特性：在37℃恒温厌氧的条件下，在mMRS培养基中培养约24小时达到对数末期。
(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力；
(5)可显著恢复二型糖尿病小鼠肠道内Allobaculum属的下降
(6)能够显著改善二型糖尿病小鼠的空腹血糖异常；
(7)能够显著改善二型糖尿病小鼠的口服糖耐量异常；
(8)能够显著缓解口服葡萄糖耐量药时曲线下面积升高；
(9)可调节血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇，使其恢复到正常水平；
(10)能够显著改善二型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗；
(11)能够显著改善二型糖尿病小鼠的肝脏炎症；
(12)能够显著改善二型糖尿病小鼠的胰腺和肝脏组织损伤；
(13)对PFOA有显著的吸附能力；
(14)能够显著改善高糖作用下INS-1细胞的增殖和MafA基因的表达；
(15)能够显著改善二型糖尿病小鼠的便秘情况；
本菌株的提取方法为：
(一)乳酸菌的分离筛选
(1)取1g健康女性的新鲜粪便。梯度稀释后涂布于mMRS固体培养基，置于厌氧环境下37℃培养72小时。
(2)观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化。
(3)在mMRS液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。
(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。
(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
(二)双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
(l)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体mMRS培养液中培养24h，然后取lmL培养物8000rpm离心2min；
(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸的pH 6.5的0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
(3)重悬于200uL添加了0.25％(质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；
(4)添加50uL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50uL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
(5)添加300uL浓度为0.139g/mL、pH 6.5的盐酸轻胺，并于室温放置10min；
(6)分别添加200uL15％(质量百分数)的三氯乙酸和4M HCI；
(7)添加200uL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1M HCI，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌。
(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定
(l)单菌基因组提取(按照TIANamp Bacteria DNA kit操作步骤进行)
A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取菌悬液l mL于1.5mL离心管，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，尽量吸净上清；
B.向菌体沉淀中加入180μL缓冲液(20mM Tris,pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton；终浓度为20mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37℃处理30min以上；
C.向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀；
D.加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
E.加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
F.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
G.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
H.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；重复操作一次；
I.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
J.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
(2)16S rDNA PCR
A.细菌16S rDNA 50uLPCR反应体系：
10×Taq buffer，5uL；dNTP，5uL；27F，0.5uL；1492R，0.5uL；Taq酶，0.5uL；模板，0.5uL；ddH2O，38uL。
B.PCR条件：
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-430×；72℃5min；12℃2min；
(3)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量5uL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(4)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为双歧杆菌，﹣80℃保藏备用。
实施例1：两歧双歧杆菌CCFM1063对模拟胃肠液具有良好的耐受性
将冷冻保存的两歧双歧杆菌CCFM1063接种于mMRS培养基(MRS培养基+0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mMRS培养液传代培养2～3次后，取1mL两歧双歧杆菌CCFM1063的培养液，与9.0mL pH 2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、pH＝2.5的mMRS培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。取取1mL两歧双歧杆菌CCFM1063的培养液加入9mL人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH＝8.0的mMRS培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。实验结果如表1和表2所示。结果表明，两歧双歧杆菌CCFM1063对人工胃肠液具有较好的耐受性。
表1两歧双歧杆菌CCFM1063在人工模拟胃液中的耐受性
Figure GDA0003547882450000071
表2两歧双歧杆菌CCFM1063在人工模拟肠液中的耐受性
Figure GDA0003547882450000072
实施例2：两歧双歧杆菌CCFM1063对C57BL/6J小鼠无毒副作用
将两歧双歧杆菌CCFM1063菌体重悬于2％的蔗糖溶液中，制成浓度为3.0×109CFU/mL的菌悬液。取体重16-20g左右的健康雄性C57BL/6J小鼠8只，适应环境一周后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。
这些试验结果列于表3中。这些结果表明，喂食浓度3.0×109CFU/mL的两歧双歧杆菌CCFM1063未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
表3小鼠体重的变化及死亡情况
Figure GDA0003547882450000081
注：-：小鼠无死亡
实施例3：两歧双歧杆菌CCFM1063对二型糖尿病小鼠的肠道菌群失调有恢复作用
取体重16-20g的健康雄性C57BL/6J小鼠48只，适应环境1周，随机分为6组：空白对照组(NC)、模型对照组(M)、罗格列酮对照组(RH)、两歧双歧杆菌CCFM1063干预组(CCFM1063)、两歧双歧杆菌CCFM10632对照组(CCFM10632)每组含小鼠8只，灌胃菌悬液的剂量为3.0×109CFU/mL，重悬于3％的蔗糖溶液中。实验动物分组及处理方法见表4：
表4实验动物分组
Figure GDA0003547882450000082
Figure GDA0003547882450000091
第2-7周：正常组小鼠喂食普通饲料，其余小鼠喂食高脂饲料。
在第11周的第1d，所有小鼠禁食不禁水12h，正常组注射50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)，其余组注射按照100mg/(kg体重)的剂量注射50mmol/L STZ(冰上避光，现配现用)，其中STZ的配制是用50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解。
试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，提取粪便中的宏基因组，并利用二代测序仪对肠道菌群结构进行分析。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血，辅以颈椎脱臼法处死。血液样本3000×g、4℃条件下离心15min，取上清，-80℃冻存用于测定相关血清指标。部分肝脏收集后迅速置于预冷的生理盐水中漂洗去血，放入多聚甲醛中固定，剩余部分肝脏于液氮中速冻并转移至-80℃冻存，后续制成肝匀浆以用于测定相关指标，具体制备方法如下：称取一定量肝脏组织，按1:9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000r离心10min，取上清冻存于-80℃备用。
菌群分析实验结果如图2所示，二型糖尿病小鼠粪便中Allobaculum属的肠道微生物显著下降，而两歧双歧杆菌CCFM1063的摄入可将Allobaculum属的丰度回调，这表明本发明筛选的两歧双歧杆菌CCFM1063具有减少焦虑抑郁、和结肠炎等疾病发生的功能。
实施例4：两歧双歧杆菌CCFM1063可降低二型糖尿病小鼠(空腹)血糖水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。
实验结果如图3所示。模型组小鼠空腹血糖显著升高，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063明显降低了模型小鼠的空腹血糖水平并接近于空白对照组。其降低小鼠空腹血糖水平的能力与罗格列酮药物组相似。
实施例5：两歧双歧杆菌CCFM1063可增强二型糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。小鼠处死前，禁食不禁水12h，腹腔注射葡萄糖溶液(2g/kg体重)，分别测量0，30，60，120min的血糖情况。
实验结果如图4和图5所示，模型组小鼠对葡萄糖的耐受能力较差，灌胃葡萄糖后，血糖值明显升高，并且下降缓慢，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063明显降低了AUCglucose面积，且与正常组无显著差异。这就说明，两歧双歧杆菌CCFM1063能够显著改善口服糖耐量，且作用效果强于两歧双歧杆菌BB12。这些结果与血糖指标结果相一致，提示两歧双歧杆菌CCFM1063可以通过增强葡萄糖耐受能力，进一步降低血糖水平。
实施例6：两歧双歧杆菌CCFM1063可降低二型糖尿病小鼠血清总胆固醇(TC)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血。血样3000×g、4℃条件下离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定血液中总胆固醇(TC)的含量。
实验结果如附图6所示。由图6可以看出，模型组小鼠血清总胆固醇含量明显升高，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063降低血清总胆固醇的含量，其对总胆固醇水平的恢复能力强于对照药物及两歧双歧杆菌BB12。
实施例7：两歧双歧杆菌CCFM1063可降低二型糖尿病小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血，颈椎脱臼处死。取肝脏-80℃冻存，测定时称取一定量肝脏组织，按1:9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000r离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。
实验结果如附图7所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇含量显著升高，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063可降低血清低密度脂蛋白胆固醇的含量，且两歧双歧杆菌CCFM1063对血清低密度脂蛋白胆固醇水平的恢复能力显著强于两歧双歧杆菌BB12。
实施例8：两歧双歧杆菌CCFM1063可提高二型糖尿病小鼠的胰岛素敏感性
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血，颈椎脱臼处死。取肝脏-80℃冻存，测定时称取一定量肝脏组织，按1:9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000r离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定胰岛素(INS)的含量，并结合空腹血糖结果计算胰岛素抵抗指数。
实验结果如附图8所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠胰岛素抵抗指数显著升高，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063可降低小鼠的胰岛素抵抗指数，提高小鼠的胰岛素敏感性，且两歧双歧杆菌CCFM1063对小鼠胰岛素敏感性的恢复能力显著强于两歧双歧杆菌BB12。
实施例9：两歧双歧杆菌CCFM1063可改善二型糖尿病小鼠肝脏的炎症状态
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血，颈椎脱臼处死。取肝脏-80℃冻存，测定时称取一定量肝脏组织，按1:9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000r离心10min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定白介素1β(IL-1β)和总蛋白的含量。
实验结果如附图9所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠肝脏IL-1β显著升高，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063可缓解小鼠肝脏的炎症状态，且两歧双歧杆菌CCFM1063对小鼠肝脏炎症的缓解能力显著强于两歧双歧杆菌BB12。
实施例10：两歧双歧杆菌CCFM1063可缓解二型糖尿病小鼠胰腺和肝脏的组织损伤
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血，颈椎脱臼处死。
取胰腺、肝脏等部分制作石蜡切片，经HE染色后光镜下观察组织形态并拍照，进行病理学评价。具体步骤如下：
(1)固定：组织样品用生理盐水洗一下，立即投入中性多聚甲醛固定液(4％)中固定，一般固定时间在72h之内。
(2)洗涤：流水冲洗或浸泡数小时或过夜。
(3)脱水：样品依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％1次20min、100％2次每次10min。
(4)透明：1/2纯酒精+1/2二甲苯混合液10min、二甲苯Ⅰ10min、Ⅱ10min(至透明为止)。
(5)浸蜡：将样品放入石蜡(62℃)透蜡2h。
(6)包埋：以最大的面在底层，使切出的面组织面所占最大。
(7)切片：用手动切片机，将蜡块切成5μm厚度的片段。
(8)展片和粘片(捞片)：打开水浴锅，使水温维持在42℃，使切片平整铺展在水面上。
(9)烤片：将载玻片连同载玻片架放入55℃的干燥箱，约2h至蜡熔化。
(10)水化：石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各级酒精溶液中各5min，再放入蒸馏水中3min。
(11)初染：切片放入苏木精中染色约20s。
(12)水洗：用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝，但要注意流水不能过大，以防切片脱落。
(13)分化：将切片放入1％盐酸乙醇溶液中褪色，7s。见切片变红，颜色较浅即可。
(14)漂洗：切片再放入自来水流水中冲洗15-20min使其恢复蓝色。
(15)复染：浸入伊红染液，立即取出进行脱水。
(16)脱水：将切片依次过95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ、70％乙醇，再放入80％乙醇50s、无水乙醇2min。
(17)透明：切片放入1/2无水乙醇，1/2二甲苯中1min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各2min。
(18)封片：切片经二甲苯透明后，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
实验结果如附图10和图11所示。由实验结果可以看出，模型组小鼠胰岛数量变少，出现萎缩现象，肝细胞出现小泡性脂变，有早期纤维化的形态学表现，而灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063可明显改善上述病变，且效果明显好于两歧双歧杆菌BB12。
实施例11：体外具有良好的PFOA吸附能力；
菌体吸附对两歧双歧杆菌CCFM1063进行纯化和活化培养，按1％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h。然后在8000r/min离心5min收集菌体，取沉淀用生理盐水清理后继续在8000r/min离心5min，去沉淀得到活菌体细胞，即湿菌体。将湿菌体重悬于50mg/LPFOA溶液中，并使最终菌体浓度达到1g干菌体/L(将湿菌体重悬于不含PFOA的超纯水中作为空白对照)。使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含菌液的PFOA溶液的pH迅速调整至3.0，添加少量的NaOH或HCl(少于0.5ml)其离子强度对PFOA吸附的影响可以忽略。随后将装有100ml样液的250ml锥形瓶置于37℃、150rpm摇床培养，6h后取样测定，2次平行试验取平均值。
PFOA吸附量的测定：吸附实验后，样液在8000r/min离心5min，并用0.22μm的水膜过滤，PFOA浓度用具有Waters SYNAPT MS系统的UPLC-MS测定，采用Acquity UPLC BEH c18柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters Co.)，柱温35℃，进样量1μL。用100％(v/v)的乙腈溶液(溶液A)和0.1％(v/v)甲酸水溶液(溶液B)作为洗脱液，进行梯度清洗，流速是0.3mL/min。
表5梯度洗脱条件
t/min 0-0.5 0.5-5.0 5.0-7.0 7.0-7.5
溶剂A比例 70％ 70-100％ 100％ 100-70％
质谱条件：电离源为ESI源；MRM检测；MS+检测；Capillary(毛细管)；3.0kV；Conc(椎体)：40.00V；Source Temperature(放射源温度)：120℃；Desolvation(去溶剂化)温度：400℃；Conc Gas Flow：50L/h；Desolvation Gas Flow：700L/h.气体流速为0.1ml/min；质子比扫描范围：100-2000；扫面时间1s，间隔0.061s。结果用MassLynxV4.1(Waters公司)分析；根据吸附前后PFOA的浓度差异计算乳酸菌对PFOA的吸附量。测定结果列于图12，两歧双歧杆菌CCFM1063对50mg/L的PFOA的吸附率为66.69％±2.94％
实施例12：两歧双歧杆菌CCFM1063可促进高糖诱导的INS-1细胞的增殖及Maf AmRNA表达
实验分成5组：正常组(含11.1mmol/L葡萄糖的普通培养液)，高糖组(含22.2mmol/L葡萄糖的高糖培养液)，罗格列酮组(高糖培养液+80μmol/L的罗格列酮)，BB12组(高糖培养液+含1*109CFU/mL BB12菌液)CCFM1063组(高糖培养液+含1*109CFU/mL CCFM1063菌液)。
将INS-1细胞(编号：BH-AC0530)培养于RPMI-1640培养液(含11.1mmol/L葡萄糖，10％FBS，50μmol/L 2-巯基乙醇，1mmol/L丙酮酸，10mmol/LHEPES)中，并放入37℃，5％CO2的培养箱中。
CCK-8法检测细胞增殖：将状态良好的细胞消化离心并接种于96孔板上，各孔约5×103个细胞，板的周边孔不接种细胞，为防止边缘效应同时向其中加入PBS溶液。待细胞贴壁，各孔中加入含0.5％胎牛血清的RPMI-1640培养基，同步化处理24h。同步化结束，依据分组向各孔加入相应培养基培养48h，每组设三个复孔，同时设置调零孔。药物干预结束，吸去旧培养基，PBS清洗2次，加入180μL无血清培养基和20μL CCK-8溶液，孵育3-4h。孵育结束，使用酶标仪于450nm下测定各孔吸光度值。
Maf A mRNA表达的测定：Trizol法提取RNA，吸弃6孔板中原培养液，同时用预冷的PBS清洗2次，各孔中分别加入1.0mL Trizol裂解细胞并将含细胞的裂解液转至无酶EP管，移液枪吹打至无明显沉淀静置5min。向各EP管加入0.2mL三氯甲烷，剧烈震荡15s，室温放置2-3min。4℃，12000rpm离心15min，吸取上清0.4m L左右，转入到另一无酶EP管中，加入0.5mL的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清，加入1.0mL 75％乙醇并颠倒混匀。4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温干燥2-5分钟。加入20μLDEPC处理水溶解，保存于80℃待用。测定RNA的浓度和质量，并按照反转录试剂盒说明书进行反转录。反转录得到的cDNA进行q RT-PCR检测，其中MafA特异性引物：F:5'-atcactctgcccaccatcac-3'，R:5'-atgacctcctccttgctgaa-3'。PCR体系为：F(10μM),0.50μL；R(10μM),0.50μL；c DNA Template，1.00μL；dd H2O，3.00μL；mix，5.00μL。PCR程序：95℃，2min；
(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，20sec)*35；72℃，5min；目的基因经过Real-timePCR检测后，采用2-△△CT法进行相对基因表达分析。先用CFX Manager软件分析各组大鼠INS-1细胞目标基因的表达量，再以正常组表达量为1，其他各组与之相比较，计算各组基因表达水平。
CCK-8法检测结果如图13所示，与正常组相比，高糖作用组细胞生长明显降低(P<0.05)，罗格列酮对照组细胞增殖较高糖组有明显增加(P<0.05)，CCFM1063组与高糖组相比细胞增殖状况也明显增加(P<0.05)。
Maf A mRNA表达情况如图14显示，高糖作用组细胞的MafA mRNA的表达量明显低于正常组(P<0.05)，而罗格列酮阳性对照组和CCFM1063组的Maf AmRNA表达量较高糖作用组明显上升(P<0.05)。
实施例13：两歧双歧杆菌CCFM1063可改善二型糖尿病小鼠的便秘情况
C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。在实验结束前一天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。
粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重
在第15周的第一天，空白组和模型组灌胃墨汁，灌菌组和药物组灌胃含有各自灌胃内容物的墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠首粒排黑便的时间。
粪便含水量、排首粒黑便时间实验结果如图15和16所示，由图可知，相比于模型组，两歧双歧杆菌CCFM1063能显著提高粪便含水量至正常水平，缩短排首粒黑便时间，且效果都优于两歧双歧杆菌BB12。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明技术方案的范围当中。

Claims (9)

1.两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063，于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，其保藏编号为GDMCC No：60701。
2.如权利要求1所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063在制备缓解二型糖尿病造成的空腹血糖和口服糖耐量异常的功能性菌剂和药物中的应用。
3.如权利要求2所述的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063在制备改善高脂饮食导致的血清中总胆固醇升高、低密度脂蛋白胆固醇升高的功能性菌剂和药物中的应用。
4.如权利要求3所述的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063在制备改善二型糖尿病造成的肝脏组织中炎症的功能性菌剂和药物中的应用。
5.如权利要求4所述的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063在制备缓解二型糖尿病造成的胰腺和肝脏的组织损伤的功能性菌剂和药物中的应用。
6.如权利要求2~5中任一项所述的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063在制备吸附PFOA、缓解PFOA毒性的功能性菌剂和药物中的应用。
7.如权利要求6所述的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063在制备提高高糖作用下INS-1的增殖和MafA基因的表达的功能性菌剂和药物中的应用。
8.如权利要求2~5、7中任一项所述的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063在制备改善二型糖尿病造成的便秘的功能性菌剂和药物中的应用。
9.如权利要求2～5、7中任一项所述的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CCFM1063在制备食品中的应用。
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