CN112708581A - 一种青春双歧杆菌dh162及其发酵产物、应用和微生态制剂 - Google Patents
一种青春双歧杆菌dh162及其发酵产物、应用和微生态制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种青春双歧杆菌DH162及其发酵产物、应用和微生态制剂。该青春双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.13233。本发明青春双歧杆菌DH162微生态制剂可以通过不同的作用机制来达到抗衰老的作用，具体的机制包括能够通过增强机体抗氧化能力、提高免疫力和调节肠道菌群及改善神经递质等作用机制起到抗衰老的作用。且疗效显著，相比其他治疗方式见效快，效果好，无不良反应及副作用。可作为药品、保健品、食品、兽药和饲料添加剂等应用，社会意义巨大。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种青春双歧杆菌DH162及其发酵产物、应用和微生态制剂。
背景技术
衰老或老化是生物随着时间的推移而自发的必然过程，这个过程从生长期结束后逐渐开始，它的影响要到老年期通过机体功能、器官、细胞、蛋白质和酶分子的各种变化而逐渐显现出来，主要表现为机体结构退行性病变和机能衰退、适应性和抵抗力减退。衰老是一种多因素参与的过程，其特征是器官渐进性地失去生理完整性的过错，导致器官易损性严重，机体功能受损直至死亡。衰老相关疾病包括肿瘤、心血管疾病、糖尿病、骨质疏松和各种神经退行性疾病例如老年痴呆症和阿尔兹海默病等，减少衰老相关疾病不但能提高生活质量，还可减少家庭和社会的负担。
人们根据对衰老机理的不同理解，提出了许多种衰老学说，主要有自由基学说、免疫功能下降学说、脑中心学说、代谢失调学说等，其中自由基学说能比较清楚地解释机体衰老过程中的种种症状，是目前最有说服力的学说。自由基学说认为：在正常情况下，机体的抗氧化系统等使自由基的生成与清除保持平衡。但是，随着年龄的增长，机体内抗氧化酶活性逐渐减弱，清除自由基的能力下降，从而减弱了对自由基损害的防御能力，使机体组织器官容易受损，加速了机体的衰老。SOD、GPx是机体内清除自由基主要的抗氧化酶，SOD的作用在于阻断超氧阴离子自由基引发自由基的一级反应，从而减少其他活性氧的生成；GPx能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；MDA是脂质过氧化的产物，其含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度；所以血清与组织中SOD、GPx的活性及MDA的含量都是反映机体氧化应激水平即清除自由基能力的指标。
免疫系统作为一个完整自主的系统，在维护和调整动物生命活动中起重要作用。免疫功能逐渐下降是机体衰老最突出的特征，而免疫功能失调又加速机体的衰老。免疫器官指数可以初步反映机体非特异性免疫力的强弱。
抗衰老是一项长期而艰巨的任务。以目前的医学水平，衰老本身是不可逆转的，世上也没有长生不老药。但是，研究有效的抗衰老技术和药物可以预防或者推迟与衰老相关疾病的发生，能够显著提高老年人的生活质量，降低家庭、社会和国家的负担，对于解决老龄化问题具有深远的意义。目前，抗衰老技术主要包括：
(1)自体细胞活性物质抗衰老技术
自体细胞活性物质是指从人体自身血液获取的通过分离、浓缩、提取等技术，经科学验证具有治疗或美容作用的血液浓缩制品。通过局部注射或者外用自体细胞活性物质，促进局部组织修复、再生，以改善衰老征象，可达到局部年轻化、治愈疾患及延缓衰老等目的。随着制备方法的不断改进，自体细胞活性物质经历了从第1代的富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)，到第2代的富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)，直至最新的浓缩生长因子(concentrate growth factors,CGF)，CGF富含更高浓度的生长因子和CD34细胞，表现出更好的骨组织、软组织及皮肤的再生能力"。但仍有学者对PRP的作用存在疑问，主要原因是各位学者的PRP制备方法往往并不统一，从而影响了对PRP结果的评价，因此，十分有必要对PRP等自体细胞活性物质的制备方法制定统一标准。目前，自体细胞活性物质已广泛应用于创面修复、口腔种植、骨折愈合、运动医学及整形美容等多个医学领域，不过在抗衰老领域的应用尚缺乏长期疗效报道。
(2)心理与抗衰老
长期的慢性压力是人类衰老的重要原因之一。慢性压力能对人的身体和精神造成刺激，破坏人体的内稳态。为了应对这一系列的精神压力，人体会通过应激机制以维持内稳态，其中包括交感-肾上腺髓质通路、肾素-血管紧张素通路和下丘脑-垂体-肾上腺轴通路等。如果人体长期处于压力刺激下，这些通路将会不断被激活，这将引起自由基的累积和损伤，炎症因子的持续表达和分泌，最终导致人体各组织器官的衰老。此外，老年人由于生理和心理机能的退化，相比年轻人更难以应对所受到的压力。一些负性生活事件(如丧偶、疾病)也更容易发生，因此老年人更容易受到压力的影响，更应该重视心理上的抗衰老。目前，心理学领域已有许多方法进行心理测量，如衰老期望调查量表(ERA-12)、老年人心理健康量表(ASRSQ)等。已有研究表明，积极的情绪能够增加人体的抗压能力，加速人们从负性生活事件中恢复，降低负性事件所导致的心血管风险。同时对于老年人来说，积极情绪所带来的积极效应更为明显。因此，具备良好的情绪和年轻的心态是保持健康和延缓衰老的有效方法之一。
(3)肠道菌群与抗衰老
肠道菌群，又被誉为人类的“第二基因组”，其参与许多重要的生理功能，如食物的消化、新陈代谢、免疫反应和炎症反应等。按照肠道菌群对健康的影响，可将其分为有益、有害和中间3类。有益菌主要包括双歧杆菌，而有害菌即为腐败菌，主要包括梭菌。随着年龄增长，肠道内有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌数量将会明显减少，大肠埃希菌等腐败菌则会增多，而腐败菌所产生的氨、胺类、硫化氢、酚类和内毒毒素等有毒物质将会使机体的老化进程加速。2015年，发表在《Science》上的研究证实，不同年龄段的老年人以及不同健康状态的老年人肠道菌群分布都存在明显差异，而有学者通过植入双歧杆菌可以延长实验鼠寿命，改善老年鼠健康状况。这些研究结果为应用益生菌进行人体延缓衰老提供了依据。
(4)热量限制治疗
早在1935年，已有学者在《Science)首先阐述了热量限制(caloric restriction,CR)的理论，并证实通过该方法可以延长实验动物的寿命，其原理是通过限制热量摄入，优化代谢过程，减慢基因控制程序运行，从而延缓衰老。此外还有研究证实，热量限制可以引起激素水平、蛋白质组水平的改变。目前，基于该理论的药物治疗方法为联合应用二甲双脉和雷帕霉素的“鸡尾酒疗法”，通过分别抑制糖代谢途径和mTOR途径，起到模拟热量限制从而延长寿命的作用。
(5)激素替代治疗
激素替代疗法一直以来都是延缓衰老的一种重要治疗方法。女性的一生有1/3的时间处于雌激素缺乏的状态，而男性相对来说其雄激素下降较为平缓，症状表现不明显，但这也往往导致不能及时诊断和治疗其更年期症状。当由于激素缺乏所导致的症状影响到日常的活动和睡眠时，就需要合理应用性激素进行治疗。《The New England Journal ofMedicine》、《JAMA》等权威杂志已报道了应用性激素和生长激素进行激素替代抗衰老治疗的有效性。但是，激素替代治疗的安全性在临床上尚有争议。
目前的抗衰老技术，尤其是激素替代治疗虽可缓和衰老相关的生理症状，但是出于对其副作用和相关肿瘤风险的考虑，其推广受到限制。而益生菌疗法，可以通过多种机制参与抗衰老的过程，同时增强人体免疫力和恢复肠道菌群平衡，无副作用，效果显著，为抗衰老医学蓬勃发展提供了崭新的研究思路。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种青春双歧杆菌DH162及其发酵产物、应用和微生态制剂。该青春双歧杆菌DH162及微生态制剂可通过增强机体抗氧化能力应和提高免疫力及改善肠道菌群等机理来起到抗衰老作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种青春双歧杆菌，其保藏编号为CGMCC No.13233。
本发明还提供了该青春双歧杆菌在制备具有提高记忆力功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了该青春双歧杆菌在制备具有增强机体抗氧化功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了该青春双歧杆菌在制备具有提高免疫力功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了该青春双歧杆菌在制备具有调节肠道菌群平衡功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了该青春双歧杆菌在制备具有改善中枢神经系统功能功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了该青春双歧杆菌在制备具有抗衰老功效的微生态制剂中的应用。
本发明还提供了由该青春双歧杆菌制备的发酵产物。
本发明还提供了一种微生态制剂，包括上述青春双歧杆菌或上述发酵产物，以及制剂学上可接受的辅料。
作为优选，微生态制剂的剂型为散剂、粉剂、片剂、胶囊剂、水剂、凝胶剂、膏剂、滴丸剂、丸剂、颗粒剂中的一种。
本发明微生态制剂可用于制备抗衰老药品组合物、保健品、食品、兽药或饲料添加剂等。
本发明微生态制剂中的青春双歧杆菌指活的生物个体。
本发明微生态制剂制成固体制剂包含的总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×109CFU/g以上，最高可达到1×1011CFU/g或1×1011CFU/g以上；制成液体制剂包含的总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×109CFU/mL以上，最高可达到1×1011CFU/mL或1×1011CFU/mL以上。
本发明提供了一种青春双歧杆菌DH162及其发酵产物、应用和微生态制剂。该青春双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.13233。本发明具有的技术效果为：
本发明青春双歧杆菌DH162微生态制剂可以通过不同的作用机制来达到抗衰老的作用，具体的机制包括能够通过增强机体抗氧化能力、提高免疫力和调节肠道菌群及改善神经递质等作用机制起到抗衰老的作用。且疗效显著，相比其他治疗方式见效快，效果好，无不良反应及副作用。可作为药品、保健品、食品、兽药和饲料添加剂等应用，社会意义巨大。
生物保藏说明
生物材料DH162，分类命名：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，于2016年11月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13233。
具体实施方式
本发明公开了一种青春双歧杆菌DH162及其发酵产物、应用和微生态制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
制备例说明：这里以青春双歧杆菌DH162保藏编号CGMCC13233散剂为例进行具体说明，其他青春双歧杆菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。
本发明所用试剂、仪器和辅料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1菌粉的制备和菌种的鉴定
用无菌容器收集自然排出的新鲜粪便5-10g，迅速放入厌氧罐中，带回实验室进行菌种分离。取粪便样品1.5g，用15mL PBS缓冲液悬浮混匀，400g离心5min收集上清浊液，再加入适量PBS缓冲液8000g离心10min，收集上清浊液，即得到供试样品。
吸取1mL上浊液加入一支装有9mL PBS稀释液(含有5‰L-半胱氨酸)的试管中涡旋混匀，作为10-2稀释液，用同样方法稀释至10-3，分别取粪便原液、10-2稀释液、10-3稀释液各0.1mL涂布于BBL平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24小时后，选择培养基上呈圆形，光滑，边缘整齐，隆起，乳白色半透明，直径大小在0.5-2mm的菌落，接种于PYG液体培养基中，37℃培养24h后，将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×109CFU/g以上。
同时对菌株展开生理生化特征鉴定。通过对分离获得的菌株分别进行接触酶实验及凝乳实验，去除接触酶阳性及无凝乳现象之菌株，排除非目的菌株后，对其余的菌株继续通过BIOLOG及API50CH进行生理生化特征鉴定，最后通过提取DNA测序，进一步明确菌株的分类地位。
根据菌株的菌落、菌体形态特征，16SrDNA序列分析及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学地位，发现编号DH162的菌株为青春双歧杆菌；该株菌在形态学及一般性质上的特征如下：
1、菌体及菌落形态
菌体形态：菌体在显微镜下呈各种分叉，V型、Y型、单个、成对等不规则形状，长1.5-3微米，宽0.6-0.8微米，不运动，无芽孢，革兰氏染色阳性。
菌落形态：固体培养基上菌落形态均为圆形，光滑，边缘整齐，隆起，乳白色半透明。菌落直径大小一般为0.5-2mm。
2、生理生化特征
最适生长温度为35-37℃，46℃和20℃不生长，厌氧。菌株的最适生长pH值5.5-6.2。不具有致病性，不产毒素。
在糖发酵中，发酵L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、淀粉、糖原、龙胆二糖、D-松二糖；不发酵甘油、赤藓醇、D-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、阿冬醇、β-甲基-D-木糖甙、D-甘露糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、卫矛醇、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡萄糖胺、海藻糖、菊糖、松三糖、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐，接触酶阴性。
实施例2毒性试验
1、动物及分组
取20只SPF级别小鼠，6-8周龄，体重18-22g，随机分入青春双歧杆菌组和未给药组，每组10只。
2、制备菌液
将上述青春双歧杆菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为1×107CFU/mL的菌液。
3、方法
青春双歧杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，青春双歧杆菌组每天灌服青春双歧杆菌菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水0.5mL，饲喂6个月，观察毒性反应。
4、结果
各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，表明青春双歧杆菌不存在毒性。
实施例3青春双歧杆菌散剂的制备
根据上述步骤和方法分离鉴定后，经实验检验无毒性，就可将青春双歧杆菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选根据青春双歧杆菌菌粉的活菌数，制成散剂，主要原料为：青春双歧杆菌，其他辅料为低聚果糖、L-阿拉伯糖、中链甘油三酯微囊粉、γ-氨基丁酸，添加食品添加剂木糖醇、二氧化硅、海藻酸钠，添加营养强化剂牛磺酸、维生素C、维生素E粉、锌，通过粉碎或不粉碎、配料、混匀、包装等主要工艺加工制成的固体饮料。活菌数不低于1×107CFU/g，然后装袋。
应用效果实施例说明：本发明以青春双歧杆菌DH162保藏编号CGMCC13233为代表说明青春双歧杆菌的应用效果，但不是对本发明的限制。
应用效果实施例1：青春双歧杆菌具有提高记忆力的抗衰老作用的试验研究
1.材料与方法
1.1材料
青春双歧杆菌活菌DH162散剂，活菌数为5.8×108CFU/g。
健康清洁级小鼠20只，雌雄个半，年龄6-8周，平均年龄(8.5±0.4)周，体重18-22g，平均体重(20±15)g。
1.2方法
1.2.1衰老小鼠模型建立与治疗
小鼠按体重将其随机分5组，每组24只，分别是正常对照组(A)、模型对照组(B)、低剂量(100mg/kg)青春杆菌治疗组(C)、中剂量(200mg/kg)青春杆菌治疗组(D)、高剂量(400mg/kg)青春杆菌治疗组(E)，治疗组连续8周给小鼠灌胃，对照组给予等量蒸馏水。除正常对照组皮下注射生理盐水外，其他各组参照《药理学试验方法学》中的方法，采用D-半乳糖皮下注射法制备小鼠衰老模型：每天颈部皮下注射2％D-半乳糖，给药量为100mg/kg，连续8周。
1.2.2小鼠水迷宫试验
采用Morris水迷宫试验，第8周进行。连续训练4d，每天3次。末次训练后48h进行测定，记录小鼠从入水点开始找到水下平台的时间，记为寻找平台潜伏期。如果小鼠在120s未找到平台，人工引致平台潜伏期记录为120s.测定小鼠所用时长与错误次数。
1.2.3统计学分析
数据用“平均数±标准差”表示，组间比较采用t检验，统计学处理采用SPSS 10.0软件分析，显著性水平为p<0.05。
2.试验结果及分析
2.1青春双歧杆菌DH162对小鼠水迷宫试验的影响
表1青春双歧杆菌DH162对小鼠水迷宫试验的影响(n＝26)
| 组号 | 平台潜伏期时间(s) | 错误次数 |
| A | 57.28±10.52* | 1.23±0.34* |
| B | 113.92±13.26 | 5.67±0.74 |
| C | 78.95±11.63* | 1.42±0.29* |
| D | 71.32±12.48* | 1.27±0.17* |
| E | 64.69±14.72* | 1.39±0.27* |
注：*表示与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)，下同。
2.2分析
由表1可知，与正常对照组比较，模型对照组小鼠的平台潜伏期时间与错误次数明显增加，说明D-半乳糖造模成功(P<0.05)，小鼠的脑神经元产生了退行性变化，对其学习记忆能力产生了影响。与模型对照组相比，3个剂量的青春杆菌治疗组小鼠的平台潜伏期时间显著减少(P<0.05)，3个剂量青春杆菌治疗组小鼠错误次数显著降低(P<0.05)，说明青春杆菌对D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆障碍有显著的改善作用。
应用效果实施例2：青春双歧杆菌通过增强机体抗氧化能力达到抗衰老效果的试验研究
1.材料与方法
1.1材料
青春双歧杆菌活菌DH162菌液，活菌数均为1×107CFU/g以上。
衰老小鼠。
1.2方法
1.2.1动物分组
将衰老小鼠随机外成高剂量组(I)、中剂量组(II)、低剂量组(III)和实验对照组(衰老模型)(IV)；每组10只。10只青年小鼠为标准对照组(V)。低、中、高剂量组每日分别灌服相应剂量的青春双歧杆菌菌液(100，200，300mg/kg体重)，共30d，实验对照组和标准对照组每日灌服同等剂量的(1mL)生理盐水。眼眶取血，3000r/min离心10min取血清，各组取肝脏、脾脏、胸腺称重，取脑冰浴条件下制备组织匀浆。
脏器指数＝脏器重(g)/体重(g)×100
1.2.2检测指标
(1)脑组织中GSH-Px、SOD、MDA、LPF测定：
分别取青年组、衰老组及治疗组小鼠脑50mg，置于9倍组织重的预冷的生理盐水中，冰水浴中匀浆10min，制成10％的组织气浆液，于4℃、10000r/min离心15min，取上清液测定NO、GSH-Px、SOD、MDA、LPF含量，测定严格按试剂盒操作程序进行。
(2)血清中NO、GSH-Px、SOD、MDA测定：
分别取青年组、老年组及治疗组小鼠血，3000r/min离心10min取血清，上清液测定NO、GSH-Px、SOD、MDA含量。
1.2.3统计学分析
数据采用SPSS 11.0软件包完成统计分析。结果以X±s表示，多组间样本均数比较采用，检验进行。
2.试验结果
2.1青春双歧杆菌对脑组织MDA、SOD、GSH-Px、LPF水平的影响
表2青春双歧杆菌对脑组织MDA、SOD、GSH-Px、LPF水平的影响(x±s,n＝10)
| 组别 | MDA(umol/L) | SOD(IU/mL) | GSH-Px(U/mL) | LPF(ug/g) |
| I | 3.93±0.51 | 23.72±2.69 | 11.84±1.07 | 0.32±0.11 |
| II | 6.27±0.19 | 10.49±1.11 | 5.49±0.43 | 0.69±0.07 |
| III | 5.51±0.34* | 13.74±0.96* | 7.62±0.46* | 0.61±0.02* |
| IV | 4.86±0.29** | 15.68±1.25** | 8.97±1.17** | 0.51±0.07** |
| V | 4.41±0.49** | 18.97±1.06** | 10.93±1.07** | 0.43±0.06** |
注：*：表示与试验对照组比较有显著差异(p＜0.05)；**：表示与实验对照组相比有极显著差异(P＜0.01)，下同。
与青年小鼠比，衰老小鼠脑中MDA、LPF水平明显上升(P<0.01)，而脑中SOD、GSH-Px的活力明显下降(P<0.01)；衰老小鼠连续灌服青春双歧杆菌菌液30d后，青春双歧杆菌菌液剂量依赖地抑制脑中MDA、LPF水平含量升高和SOD及GSH-Px活性下降(P<0.05P<0.01)，见表2。
2.2青春双歧杆菌对血清中MDA、SOD、GSH-Px、NO水平的影响
表3青春双歧杆菌对血清中MDA、SOD、GSH-Px、NO水平的影响(x±s,n＝10)
| 组别 | MDA(umol/L) | SOD(IU/mL) | GSH-Px(U/mL) | LPF(umol/L) |
| I | 4.69±0.71 | 32.07±1.92 | 14.98±0.97 | 1.17±0.14 |
| II | 8.72±0.91 | 14.69±1.07 | 8.69±0.59 | 3.31±0.19 |
| III | 7.42±0.71* | 19.04±1.99* | 10.75±0.62* | 3.14±0.19* |
| IV | 6.62±0.43** | 23.37±1.69** | 13.19±0.89 | 2.59±0.15** |
| V | 5.49±0.45** | 28.84±1.49** | 16.42±0.57** | 1.87±0.15** |
与青年小鼠比，衰老小鼠血清中MDA、NO水平明显上升(P<0.01)，而血清中SOD、GSH-Px的活力明显下降(P<0.01)；衰老小鼠连续灌服青春双歧杆菌菌液30d后，抑制脑中MDA、NO水平含量升高和SOD及GSH-Px活性下降(P<0.05，P<0.01)。见表3。
结论：
本研究显示：衰老小鼠血清和脑SOD、GSH-PX活力下降、MDA含量增高，表明衰老小鼠体内产生氧化损伤，脂质过氧化物的体内蓄积量增大。青春双歧杆菌能够随剂量增加而加强体内自由基的清除，从而减少自由基对机体的损害。青春双歧杆菌不仅对衰老小鼠SOD的活性有促进作用，而且对GSH-Px的活性也有明显的提高，同时能够抑制MDA含量的增加。说明青春双歧杆菌的抗衰老作用与其提高抗氧化酶的活性和抑制脂质过氧化物的产生等抗氧化作用密切相关，而且这种作用随剂量的增加而加强。
应用效果实施例3：青春双歧杆菌通过提高免疫力达到抗衰老效果的试验研究
试验方法以及试验材料同应用效果实施例2。
试验结果：
表4青春双歧杆菌对脏器指数的影响(x±s,n＝10,g/100g)
| 组别 | 胸腺指数 | 脾脏指数 | 肝脏指数 |
| I | 0.219±0.015 | 0.629±0.036 | 5.27±0.29 |
| II | 0.107±0.011 | 0.339±0.014 | 3.54±0.19 |
| III | 0.119±0.019* | 0.359±0.034* | 3.97±0.47* |
| IV | 0.159±0.014** | 0.431±0.034** | 4.17±0.21** |
| V | 0.169±0.007** | 0.491±0.041** | 4.34±0.39** |
与青年小鼠比，衰老小鼠的胸腺指数、肝脏指数和脾脏指数显下降(P<0.01)，衰老小鼠连续灌服青春双歧杆菌菌液30d后，能剂量依赖地抑制衰老小鼠胸腺指数、肝脏指数和脾脏指数的下降(P<0.05，P<0.01)，见表4。
应用效果实施例4：青春双歧杆菌通过调节肠道菌群平衡达到抗衰老效果的试验研究
1.试验材料和方法
1.1材料：
清洁级小鼠60只，体重18-22g，雌雄各半，随机分为青年组(正常对照组)、衰老模型组、衰老模型+青春双歧杆菌DH162组、衰老模型+市售产品组。每组15只小鼠。
1.2方法
1.2.1模型制备及给药方法
动物普通饲料喂养1周以适应环境，然后将小鼠随机分4组：青年组(正常对照组)，衰老模型组、衰老模型+青春双歧杆菌组、衰老模型+市售产品组。衰老模型组按体重每日皮下注射0.2mL，0.08g·kg-1·d-1D-半乳糖，同时皮下注射蒸馏水0.5mL；青年组皮下注射0.2mL/d生理盐水，同时皮下注射0.5mL蒸馏水；青春双歧杆菌组皮下注射0.2mL/d，0.08g·kg-1·d-1D-半乳糖，同时分别皮下注射0.5mL/d青春双歧杆菌菌液；市售产品组皮下注射0.2mL/d D-半乳糖，同时分别皮下注射0.5mL/d市售产品。实验期30d，当衰老模型组小鼠出现脊椎隆起，体形消瘦，毛色灰暗稀疏，行动迟缓等老年体征，证明造模成功，末次给药后禁食24h。然后处死各组小鼠，取回盲部内容物检测肠道菌群变化。
1.2.2肠道菌群检测
检测方法参考相关相关文献，计算公式:CFU/g＝菌落数×47×稀释倍数/标本重量(g)
1.2.3内毒素检测
用眼球采血法采集小鼠血液，将血液装在去热原处理的离心管里(用去热原肝素抗凝)。500r/min离心5min后，取血浆，置于无菌试管中，严格按内毒素检测试剂盒说明书操作测定内毒素含量。
2结果
2.1一般状态观察
青年组小鼠毛非常活跃、发浓密、光亮，衰老模型组小鼠失去光亮、毛色灰暗稀疏，行动迟缓等老年体征。
2.2各组小鼠肠道正常菌群定量检测
经过D-半乳糖灌胃后，衰老模型组小白鼠与青年组相比，肠道菌群菌量发生明显改变，其中模型组双歧杆菌、乳酸杆菌数量减少，肠球菌增加(P<0.05)，而衰老模型组肠杆菌数量虽然增多了，但差异无统计学意义(P>0.05)，说明衰老模型组小白鼠出现菌群失调。这证明使用D-乳糖造衰老模成功，见表5。青春双歧杆菌DH162组与衰老模型组肠道菌群数量相比肠杆菌和肠球菌数量降低(P<0.05)，而乳酸杆菌和双歧杆菌数量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。市售产品组与模型组相比，肠杆菌、肠球菌和乳酸杆菌与模型组数量差异无统计学意义(P>0.05)。青春双歧杆菌DH162组与市售产品组相比，两组之间除了双歧杆菌数量差异无统计意义意外(P>0.05)，它们之间其他细菌数量(肠杆菌肠球菌)差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。
2.3各组小鼠血内毒素含量测定
衰老模型组小鼠血内毒素含量(0.374±0.22)与对照组(0.263±0.21)相比升高，差异有统计学意义(P<0.05)。市售产品组(0.319±0.07)和青春双歧杆菌DH162组(0.269±0.02)内毒素含量与模型组(0.374±0.22)相比降低。
表5衰老模型组与对照组小鼠肠道菌群检测结果比较(logN/g,x±s)
注:与对照组比aP＜0.05，bP>0.05；青春双歧杆菌组与衰老模型组比cP＜0.05，市售产品组与模型组比dP>0.05＝，eP＜0.05:马齿克组与市售产品组组比fP<0.05，gp>0.05。
结论：
本实验结果证实：衰老时肠道菌群出现失调，表现益生菌数量减少，同时血内毒素上升，发现青春双歧杆菌DH162可能通过调节肠道菌群，增加双歧杆菌和乳酸杆菌数量以及降低血内毒素(P<0.05)，起到预防衰老的作用。青春双歧杆菌DH162与市售产品组进行比较，两组之间除了双歧杆菌数量差异无统计学意义外(P>0.05)，它们对其他细菌数量(肠杆菌、肠球菌)的作用差异有统计学意义(P<0.05)。这说明青春双歧杆菌DH162能调整衰老机体肠道失调，从而改善了衰老机体的部分生理功能，青春双歧杆菌DH162的作用比市售产品强。青春双歧杆菌DH162组小鼠与衰老模型组比肠道有益菌增加，血内毒素减少，说明青春双歧杆菌DH162能预防菌群失调的发生、抑制细菌易位，具有延缓衰老的作用。
应用效果实施例5：青春双歧杆菌通过间接改善中枢神经系统功能达到延缓衰老效果的试验研究
1.试验材料和方法
1.1材料：
健康小鼠30只，3-4月龄，体重(20±2)g。
1.2方法
随机分成3组，空白组(10只)，衰老模型组(10只)，实验治疗组(10只)，常规饲料喂养。空白组每天生理盐水颈背部皮下注射。衰老模型组及实验组颈背部皮下注射相同剂量的D-gal溶液，同时，实验组注射青春双歧杆菌菌液(5×108CFU/mL)，体积均0.2mL，衰老模型组给予相同剂量温开水。连续30d后所有动物均断箭处死，迅速取出脑组织，分别用冷生理盐水及冷高氯酸冲洗后备用。
1.2.1 MAO的测定
按试剂盒说明的程序进行。
1.2.2 NE、DA S-HT的测定
采用高效液相色谱法进行测定。
1.2.3 统计学处理
实验各项指标用均数±标准差(x±s)表示。实验数据的统计经SAS软件处理，进行方差分析，t检验。
2.结果
青春双歧杆菌可降低衰老模型小鼠脑组织内MAO活性(P<0.05)，提高NE、DA S-HT含量(P<0.05)，见表6。
表6对小鼠组织单胺氧化酶及单胺类神经递质含量的影响
| 组别 | MAO/U/h/mgprot | NE/ug/g | DA/ug/g | 5-HT/ug/g |
| 空白组 | 5.499±0.603 | 1.047±0.409 | 0.726±0.091 | 0.764±0.107 |
| 衰老模型组 | 11.228±1.037^ | 0.751±0.092^ | 0.547±0.062^ | 0.629±0.077^ |
| 实验组 | 5.668±0.657* | 1.088±0.149* | 0.703±0.079* | 0.741±0.079* |
注：^表示与青年对照组相比较有显著差异P<0.05；*表示与衰老模型组比较有显著性差异P<0.05。
结论：
本实验结果证实，D-gal使小鼠脑组织匀浆MAO活性升高、而NE、DA、S-HT含量降低，较好地反映了衰老的病理特征，也为青春双歧杆菌延缓衰老作月用的评价打下了基础。在上述衰老模型中同时给予青春双歧杆菌菌液治疗连续30d，可明显降低模型中MAO活性，提高NE.DA 5-HT含量，表明青春双歧杆菌具有抗衰老作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种青春双歧杆菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.13233。
2.权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备具有提高记忆力功效的微生态制剂中的应用。
3.权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备具有增强机体抗氧化功效的微生态制剂中的应用。
4.权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备具有提高免疫力功效的微生态制剂中的应用。
5.权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备具有调节肠道菌群平衡功效的微生态制剂中的应用。
6.权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备具有改善中枢神经系统功能功效的微生态制剂中的应用。
7.权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备具有抗衰老功效的微生态制剂中的应用。
8.由权利要求1所述青春双歧杆菌制备的发酵产物。
9.一种微生态制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的青春双歧杆菌或权利要求8所述的发酵产物，以及制剂学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂的剂型为散剂、粉剂、片剂、胶囊剂、水剂、凝胶剂、膏剂、滴丸剂、丸剂、颗粒剂中的一种。
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