JP3471789B2 - アレルギー疾患治療剤およびその製造方法 - Google Patents

アレルギー疾患治療剤およびその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本願は、２０００年６月１４日に日本に出
願された特許出願番号２０００−１８４５４１号に基づ
き、優先権の利益を享受するものであって、その出願内
容のすべてが引用により、本願明細書の一部として組み
込まれる。
【０００２】本発明は、アレルギー疾患、たとえば、喘
息、アトピー性皮膚炎、結膜炎、鼻炎、食物アレルギー
の治療剤及びその製造方法に関する。また、本発明は前
記治療剤から分離された酵母に関する。
【０００３】背景技術 人体には、体内に、細菌やウイルスなどの異物が侵入し
てきたときに、それらに立ち向かい、体を守るための生
体防御機構である免疫システムが備わっている。アレル
ギー疾患はこの免疫システムが過剰に働くために起こる
ものである。近年、大気汚染、食生活の変化、肉体的あ
るいは精神的ストレスの増加、居住環境の変化による室
内汚染などの環境の変化または人間の体質の変化による
ものか、その原因は明確ではないがアレルギー疾患に罹
る人が増加している。このアレルギー疾患としては、喘
息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギ
ー性鼻炎、たとえば、花粉症、食物アレルギーなどがあ
る。
【０００４】これらのアレルギー疾患の、消極的ではあ
るが、第一の治療は、アレルゲンを回避することであ
る。家の中の埃やダニがアレルゲンである場合には、家
の中を清潔にして、アレルゲンを取り除いたり、花粉が
アレルゲンの場合には、花粉の飛ぶ季節には、外出をひ
かえたり、マスクをしたりして、アレルゲンを吸い込ま
ないようにしたり、食物アレルギーの場合には、その食
物を食べないことである。しかしながら、この消極的な
治療法は、手間がかかり、また、患者の行動をひどく制
限する。
【０００５】また、喘息の治療としては、発作を止める
か、発作を予防する対症治療が行われており、アドレナ
リンなどの交感神経系の薬、副腎皮質ステロイドホルモ
ン剤、テオフィリン系などの薬が使われている。しかし
ながら、喘息は、時に「死」に至る病であるが、未だ、
完治するという治療法は無かった。
【０００６】アトピー性皮膚炎は、乳幼児期には、その
かゆみのために患者だけでなく、その親をも悩ませるも
のであり、多くは成人する前に治るが、成人期まで続く
と顔や胸、ひじやひざの内側などの皮膚が厚くなり、激
しいかゆみが起こり、思春期の男女を悩ませる。この治
療法としては、外用療法が主な方法であって、症状に応
じて、副腎皮質ホルモン剤、抗ヒスタミン剤、その他の
抗炎症剤を用いる。かゆみが強い場合には、抗ヒスタミ
ン剤の内服が必要となる。
【０００７】しかしながら、これらの療法は対症療法で
あって、アレルギー疾患を完治させるものではなく、ま
た、薬を用いることによる副作用などもある。
【０００８】アレルゲンが特定できるときは、減感作療
法といって、そのエキスを、始めは極少量、皮下注射
し、次第に量を増やすことにより、抵抗力をつける方法
がある。しかしながら、この療法は、週に１〜２回定期
的に注射するもので、長期間かかる上、人によっては、
効果がないこともあり、また、人によっては、死に至る
こともあるアナフラキーショックを引き起こすことがあ
る。
【０００９】また、喘息やアトピー性皮膚炎の治療には
多くの民間薬もあるが、時にはかえって症状を重くする
ことがある。
【００１０】本発明は、上記のようなアレルギー疾患の
治療の現状に対して、アレルギー疾患を、副作用がな
く、短期間の服用で、完治させることができる治療剤及
びその製造方法を提供することを課題とする。
【００１１】発明の開示 本発明のアレルギー疾患治療剤は、松科植物の新芽と、
水と、糖質とを混合し、これを自然発酵させて得られる
もので、喘息やアトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾
患に有効な治療剤である。前記松科植物としては松属の
植物が好ましく、また前記糖質としては砂糖が好まし
い。
【００１２】また、本発明のアレルギー疾患治療剤は、
松の新芽と、水と、砂糖とを混合し、自然発酵させて得
られるもので、喘息やアトピー性皮膚炎のようなアレル
ギー疾患に有効な治療剤である。
【００１３】さらに、本発明は上記のアレルギー疾患治
療剤の製造方法を包含し、このアレルギー疾患治療剤の
製造方法は、（１）滅菌した水に糖質を溶解し、糖質を
溶解した溶液を調製する工程と、（２）前記糖質を溶解
した溶液に松科植物の新芽を加え、自然発酵させる工程
とを含む。前記松科植物としては松属の植物が好まし
く、また前記糖質としては砂糖が好ましい。
【００１４】また、本発明のアレルギー疾患治療剤の製
造方法は、（１）滅菌した水に砂糖を溶解し、砂糖を溶
解した溶液を調製する工程と、（２）前記砂糖を溶解し
た溶液に松の新芽を加え、自然発酵させる工程とを含む
ことを特徴とする。
【００１５】前記の自然発酵としては、嫌気的な条件
下、１０〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃で、３〜９
ヶ月、好ましくは４〜８ヶ月程度行うことが好ましい。
【００１６】より具体的なアレルギー疾患治療剤の製造
方法としては、（１）熱湯に砂糖を溶解し、周囲温度ま
で冷却させた砂糖水溶液を調製する工程と、（２）前記
砂糖水溶液に、水洗した松の新芽を加え、容器に入れて
密封し、自然発酵させる工程とを含むものであり、この
自然発酵は、密閉した容器を直射日光の当たる場所で初
冬頃まで行うことが好ましい。
【００１７】また、本発明は、松科植物の新芽と、水
と、糖質とを混合し、自然発酵させて得られる健康食品
をも意図するものであり、この健康食品は松の新芽と、
水と、砂糖とを混合し、自然発酵させて得られたもので
あることが好ましい。
【００１８】さらに、本発明は、上記の自然発酵を行っ
た発酵産物、すなわちアレルギー疾患治療剤から分離さ
れた新規な酵母を包含する。この酵母は、平成１３年
（２００１）３月１２日に、独立行政法人産業技術総合
研究所 特許生物寄託センター、茨城県つくば市東１丁
目１番地１ 中央第６（旧名称：経済産業省技術総合研
究所生命工学工業技術研究所（National Institsute of
Bioscience and Human-Technology National institut
e of Advanced Industrial Science and Technolog
y）、茨城県つくば市東１−１−３、２００１年４月１
日をもって、名称が変更されている）に、ハルイサンＡ
−３として寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９
９で特定される酵母であり、また、この寄託された酵母
と同等の菌体的性質を有する一連の酵母が本発明に含ま
れるものである。さらに、本発明においては、前記の酵
母を用いて発酵させて得られた発酵生成物が対象とな
り、この発酵生成物としては、例えば、アレルギー治療
剤のような医薬品、健康食品、健康飲料や、化粧品の原
料などがある。ここで、健康食品および健康飲料とは、
体質を改善し、健康を維持することを目的に使用するサ
プリメントなどの食品および飲料を意味するものであ
る。
【００１９】発明を実施するための最良の形態 本発明のアレルギー疾患治療剤は、松科植物の新芽と、
水と、糖質とを混合し、自然発酵させて得られるもので
ある。本発明で使用できる松科植物としては、いわゆる
モミ（Abies firma Sieb. & Zucc.）、ウラジオモミ（A
bies homolepis Sieb. & Zucc.）、オオシラビソ（Abie
s mariesii M. T. Mast.）、アオドドマツ（Abies sach
alinensis (Friedr. Schmidt) M. T. Mast. varmari
e）、トドマツ（Abies sachalinensis (Friedr. Schmid
t) M.T. Mast.）、シラベ（Abies veitchii Lindl.）、
ヒマラヤスギ（Cedrus deodara (Roxb. ex D. Don) G.
Don）、グイマツ（Larix gmelini(Rupr.) Kuzeneva）、
カラマツ（Larix kaempferi(Lamb.) Carriere）、ドイ
ツトウヒ（Picea abies (L.) Karst.）、アカエゾマツ
（Picea glehnii (Friedr. Schmidt) M.T. Masters）、
トウヒ（Picea jezoensis (Sieb. & Zucc.) Carriere v
ar. hondoensis）、エゾマツ（Picea jezoensis (Sieb.
& Zucc.) Carriere）、ヤツガタケトウヒ（Picea koya
mae Shirasawa）、ハリモミ（Picea polita (Sieb. & Z
ucc.) Carriere）、アイグロマツ（Pinus x densi-thun
bergii Uyeki）、アカマツ（Pinus densiflora Sieb. &
Zucc.）、タギョウショウ（Pinus densiflora Sieb. &
Zucc. cv. Umbraculifera）、チョウセンゴヨウ（Pinu
s koraiensis Sieb. & Zucc.）、ダイオウショウ（Pinu
s palustris Mill.）、ヒメコマツ（Pinus parviflora
Sieb. & Zucc. var. parviflora）、キタゴヨウ（Pinus
parviflora Sieb. & Zucc. Var. pentaphylla (Mayr)H
enry）、ハイマツ（Pinus pumila (Pall.) Regel）、リ
ギダマツ（Pinus rigida Mill.）、ストローブマツ（Pi
nus strobus L.）、ヨーロッパアカマツ（Pinus sylves
tris L.）、テーダマツ（Pinus teada L.）、クロマツ
（Pinus thunbergii Parl.）、トガサワラ（Pseudotsug
a japonica (Shiras.) Beissn.）、コメツガ（Tsuga di
versifolia (Maxim.) M.T. Mast.）、ツガ（Tsuga sieb
oldii Carriere）などが例示される。この中でも松属の
植物である、アイグロマツ、アカマツ、タギョウショ
ウ、チョウセンゴヨウ、ダイオウショウ、ヒメコマツ、
キタゴヨウ、ハイマツ、リギダマツ、ストローブマツ、
ヨーロッパアカマツ、テーダマツ、クロマツが好まし
く、特に、アカマツ、タギョウショウ、チョウセンゴヨ
ウ、ダイオウショウ、ハイマツ、クロマツなどは一般に
育成されている松であり、入手の容易さの面からも好ま
しいものである。
【００２０】また、本発明の使用する糖質としては、シ
ョ糖、転化糖、麦芽糖のようなものが例示される。これ
らのうちショ糖が入手の容易さの点で好ましいが、使用
するショ糖としては、白砂糖、黒砂糖、三温糖、甜菜
糖、きび砂糖などいずれの砂糖でも使用できるが、白砂
糖が好ましい。
【００２１】使用する水は、予め滅菌したものを用い、
雑菌の繁殖を防止することが好ましく、滅菌方法として
は、一般に行われる公知の方法が使用でき、例えば、煮
沸などのような方法によって行うことができる。
【００２２】本発明のアレルギー疾患治療剤は、上記の
滅菌した水を用いて糖質を溶解した水溶液に、松科植物
の新芽を加え、これを自然発酵することにより得られる
が、水溶液に加える松科植物の新芽は、いかなる種類の
松科植物から採取した新芽でもよいが、特に、松属の植
物から採取した新芽が好ましい。採取の時期は、松科植
物の花が咲きおわったときが好ましく、この時期に採取
した新芽がアレルギー疾患治療剤としての有効性がもっ
とも高く好ましいものである。松の場合でいえば、その
土地の気候にもよるが、一般に４月上旬〜６月下旬頃
に、枝の先端に赤みがかった雌花が咲き、新枝の周りに
黄色の雄花が咲くので、これらの花が咲き終わった後
に、枝の先端部にある新芽を採取して用いることが好ま
しい。
【００２３】発酵に用いる原液の調製は、水約１リット
ルに対して、糖質を約０．５ｋｇの割合で溶解し、得ら
れた溶液に対して松科植物の新芽約２５本の割合で添加
する。この場合、糖質は完全に溶解している必要はな
く、未溶解のまま液中に存在していても差し支えない。
また、発酵させる原液には、上記の割合で松の新芽のよ
うな松科植物の新芽を含んでいればよく、新芽以外の葉
や花を含むものであっても差し支えない。
【００２４】自然発酵は、嫌気的な条件下で行い、１０
〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃で、３〜９ヶ月、好
ましくは４〜８ヶ月程度静置して発酵を行う。嫌気的な
条件としては、例えば、密閉した遮光容器に充填するな
どの方法が採用され、この密閉した容器を直射日光の当
たる場所に、初冬頃まで載置することにより達成され
る。自然発酵の期間が経過した後、容器を開封して、松
科植物の新芽などの固形物を取り除くことにより、本発
明のアレルギー疾患治療剤が得られる。なお、上記の初
冬頃は、新芽の採取時期、すなわち仕込み時期との兼ね
合いであり、製造する地方で開花時期が４月上旬から５
月初旬で、花が咲き終わり新芽を採取する時期を５月中
旬から６月初旬とすれば、発酵終了の時期が初冬（１１
月中旬）となるが、あくまでも１つの目安であり、任意
に変更することができる。
【００２５】本発明のアレルギー疾患治療剤は、アレル
ギー疾患、特に喘息やアトピー性皮膚炎に有効である
が、作用機序から考慮すると、これら以外にも、薬物に
よるアナフィラキシーショック、アレルギー性鼻炎、急
性蕁麻疹、花粉症、食物アレルギーなどのアレルギーＩ
型の疾患、自己免疫性溶血性貧血、薬物アレルギーによ
る溶血や血小板減少などのアレルギーＩＩ型の疾患、血
清病、ＳＬＥ、急性腎炎、多発性動脈炎などのアレルギ
ーＩＩＩ型の疾患、および、接触性皮膚炎、アレルギー
性脳炎などのアレルギーＩＶ型疾患の改善、治療にも有
効であると考えられる。
【００２６】本発明のアレルギー疾患治療剤は、自然発
酵により得られた発酵産物をそのまま用いるものである
が、これに、甘味料や着香剤などを添加し、飲みやすい
ものに仕立てもよく、長期保存などのため、保存剤など
の各種添加剤を添加してもよい。
【００２７】本発明のアレルギー疾患治療剤を適用する
には、一般に大人の場合、１日に２〜３回、各々、約３
０〜５０ミリリットルを服用させる。また、小人の場合
には、大人の半量を服用させる。また、本発明のアレル
ギー疾患治療剤は、毒性もなくまた変異原性もなく安全
なものであるので、前記の服用量を超える量を用いても
何ら問題はない。
【００２８】本発明の自然発酵により得られた発酵産物
は、アレルギー疾患治療剤としてばかりでなく健康食品
または健康飲料としても使用することができる。健康食
品または健康飲料とは、治療を主目的とするものではな
いが、体質を改善し、健康状態を維持するために使用す
るものである。この場合、消費者の嗜好を考慮し、上記
の甘味料や着香剤などを添加し、食しやすく、飲みやす
く、かつ嗜好に適合するものに仕上げることが好まし
い。
【００２９】さらに、本発明は、上記の発酵産物から分
離された酵母を包含するものである。この酵母は次のよ
うにして分離されたものである。本発明のアレルギー疾
患治療剤である発酵産物を用いて、ＧＰＬＰ寒天平板培
養法により平板上に培養し、培養平板上に優勢に生育し
ている集落を釣菌し、分離酵母を得た。分離酵母につい
て形態観察および性状試験を行い、文献（Kurtzman, C.
P. et al., 「The yeasts, A Taxonomic Study」４版
(1998)、Elsevier Science B.V. ; Barnett, J. A. et
al., 「Yeasts:Characeristics and identification」
３版（2000)、Cambridge University Press、これらの
文献は引用により本願明細書の一部として組み込まれ
る）を参考にして同定した。なお、発酵産物中の酵母数
は１．４×１０５／ｇであった。分離酵母の性状試験結
果を表１に、分離酵母の子嚢胞子の一例を図１に示し
た。
【００３０】
【表１】
【００３１】以上の結果によれば、分離酵母は形態上お
よび性状上チゴサッカロミセス ビスポラス（Zygosacc
haromyces bisporus）と同定される。このチゴサッカロ
ミセス ビスポラスは子嚢菌酵母の一属で、それぞれ独
立した細胞間で接合し、球形〜楕円形の子嚢胞子を１〜
４個形成するものである。また、チゴサッカロミセス
ビスポラスは、耐浸透圧性の酵母で発酵食品、清涼飲料
水などから分離されるものである。
【００３２】一方、分離された酵母に対する、対象株と
のＤＮＡ相同性試験を行ったところ、次のような結果が
得られた。すなわち、江崎孝行ら、日本細菌学会誌、４
５巻、８５１頁（１９９０）、および高橋正明ら、東京
農業大学アイソトープセンター研究報告、７号、６９頁
（１９９３）（これらの文献は引用により本願明細書の
一部として組み込まれる）に従い、対象株としてチゴサ
ッカロミセス ビスポラス ＩＦＯ １１３１およびチ
ゴサッカロミセス バイリー ＩＦＯ １０９８（Zygo
saccharomyces bailii IFO 1098）を用いて、得られた
酵母とのＤＮＡ相同性試験を、マイクロプレートを用い
たフォトビチオン標識法により、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リダイゼーション試験を行った。なお、ＤＮＡの調製
は、Jahnke, K.-D. et al., Trans. Br. mycol. Soc.,
Vol,87, pp.175-191 (1996)（この文献は引用により本
願明細書の一部として組み込まれる）に従い調製した。
結果を表２に示した。
【００３３】
【表２】
【００３４】上記の対象株との相同性試験の結果によれ
ば、本発明の酵母は、形態上および性状上チゴサッカロ
ミセス ビスポラスと同定されるが、ＤＮＡの配列自体
はチゴサッカロミセス ビスポラスよりもむしろチゴサ
ッカロミセス バイリーに近いものであり、いずれの対
象株とも相違する新種の株であることが理解される。出
願人は、このチゴサッカロミセス属に属すると推定され
る新種の酵母を「ハルイサンＡ−３」と命名した。な
お、この新種の酵母「ハルイサンＡ−３」が新種の株で
はなく新種の種あるいは属であるか否かは、現時点で明
確ではない。しかしながら、出願人は、分離され「ハル
イサンＡ−３」と命名された新種の酵母を、特許手続上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に
従い、２００１年３月２１日に、受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７４９９として、新名称：独立行政法人産業技術総
合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば
市東１丁目１番地１ 中央第６（旧名称：経済産業省技
術総合研究所生命工学工業技術研究所（National Insti
tsute of Bioscience and Human-Technology National
institute of Advanced Industrial Science and Techn
ology）、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地３）に
寄託した。なお、上記寄託機関は、２００１年４月１日
をもって独立行政法人化され、独立行政法人産業技術総
合研究所と改編されたことにより、２００１年４月１日
に名称が変更されたものである。
【００３５】本発明の分離された新種の酵母は、松科植
物の新芽とともにアレルギー疾患治療剤としての有効性
に大きく寄与しているものと考えられ、極めて有用な酵
母である。
【００３６】次に、本発明のアレルギー疾患治療剤を例
をあげて詳しく説明するが、本発明は以下の例示により
限定されるものではない。
【００３７】本発明のアレルギー疾患の治療剤は、例え
ば、次のようにして製造することができる。
【００３８】クロマツ、アカマツ、カラマツの松の新芽
を、松に花が咲き終わった頃（福島県では、５月中旬〜
６月初旬）に、採取し、採取した松の新芽をよく水洗す
る。熱湯に、白砂糖を加えて溶解させ、室温付近まで冷
ました砂糖水と水洗した松の新芽とを容器、たとえば、
プラスチック製容器にいれて、密封して、初冬頃（福島
県では、１１月中旬頃）まで、直射日光の当たる場所に
載置することにより、自然発酵させることにより製造す
る。初冬頃に容器を開封し、松の新芽を取り除くと、本
発明のアレルギー疾患の治療剤が得られる。
【００３９】使用した砂糖水は、水約２リットルに対し
て、約１Ｋｇの白砂糖の割合で用い、松の新芽は、約５
０本の割合で用いた。上記のようにして、約２リットル
の水に１Ｋｇの白砂糖、約５０本の松の新芽を用いて製
造したところ、約１．２リットル（仕込んだ砂糖水の約
６０％）の白色の濁りを有する液状のアレルギー疾患治
療剤が得られた。この治療剤について、含有成分を分析
すると、表３に示すような結果が得られた。
【００４０】
【表３】
【００４１】この分析は、主に食品一般に関する上記検
査項目についてのみに行われたものであり、本発明のア
レルギー疾患治療剤には、これら以外の成分が存在して
いる可能性がある。したがって、どの成分がアレルギー
疾患の治療剤として特に有効であるかは、特定すること
ができないが、アレルギー疾患治療剤としての薬効を奏
するものであった。
【００４２】次に、上記のようにして製造した複数の本
発明のアレルギー疾患治療剤について、治療剤中に含有
されるカビ数、酵母数、一般細菌数（生菌数）について
調べた。カビ数および酵母数については、ＧＰＬＰ寒天
平板培養法で行い、一般細菌数（生菌数）については、
抗真菌剤添加ＳＣＤＬＰ寒天平板培養法で、酒石酸を用
いて培地のｐＨを３．５に調整したものと、培地を調整
しないものとの２とおりの試験を行い測定した。得られ
た結果を表４に示した。
【００４３】
【表４】
【００４４】上記の結果によれば、本発明のアレルギー
疾患治療剤中には、カビの発生は認められず、また一般
細菌（生菌数）も極めて少ないことがわかる。また、酵
母は発酵産物のロットにより若干のバラツキはあるが、
発酵産物中には１０２〜１０５個／ｇのオーダーで酵母
が存在していることがわかる。この発酵産物中に存在す
る酵母が寄託した新種の酵母に該当するものである。
【００４５】次に、本発明のアレルギー疾患治療剤の経
口毒性について検討した。本発明のアレルギー疾患治療
剤の原液およびこれに蜂蜜（１０重量％）を加えたもの
を用いて、これらの被験物質をそれぞれ２０００ｍｇ／
ｋｇ投与する群と、対照群として注射用水を投与する群
（投与量０ｍｇ／ｋｇ）とについて、１群雌雄各５例の
ＳＤ系［Crj:CD(SD)IGS］ラットに経口胃ゾンデを取り
付けたディスポーザブルシリンジ（１ｍＬ容量）を用い
て強制経口投与し、その後１５日間（投与日を含む）の
観察期間を設け、毒性徴候および概略の致死量について
検討した。
【００４６】試験期間を通じて対照群を含む、本発明の
アレルギー疾患治療剤およびこれに蜂蜜を加えたものの
２０００ｍｇ／ｋｇouy投与群の雌雄に死亡は認められ
なかった。また、一般状態、体重および剖検においても
被験物質投与に起因する変化は認められなかった。以上
の結果から、本試験条件下における本発明のアレルギー
疾患治療剤の概略の致死量は雌雄ともに２０００ｍｇ／
ｋｇ以上であると結論された。
【００４７】次に、本発明のアレルギー疾患治療剤の変
異原性について検討した。本発明のアレルギー疾患治療
剤の変異原性について、Ａｍｅｓらの変法（Maron,D.M.
et al., 「Revised methods for the Salmonella mutag
enicity test」 、Mutation Res., Vol.113, pp.173 - 2
15 (1983)、この文献は引用により本願明細書の一部と
して組み込まれる）に準拠したプレート法を用い、ネズ
ミチフス菌のヒスチジン要求性であるＴＡ９８、ＴＡ１
００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７株および大腸菌のト
リプトファン要求性であるＷＰ２ｕｖｒＡ株にそれぞれ
処置し、その変異原性を代謝活性化による場合とよらな
い場合との双方で検討した。
【００４８】試験の用量としては、３１２．５、６２
５、１２５０、２５００および５０００μｇ／plateで
行った。この結果、各試験菌株の被験物質群の復帰変異
コロニー数は、代謝活性化系の有無にかかわらず、用量
依存性ならびに陰性対照群の２倍以上の増加を認めなか
った。また、生育阻害および被験物質の沈澱は認められ
なかった。結果を図２および３に示した。図２は、塩基
対置換型菌株（ＴＡ１００：□、ＴＡ１５３５：○、Ｗ
Ｐ２ｕｖｒＡ：△）を用いた場合の結果が示してある。
図中、Ａは代謝活性化によらない場合であり、Ｂは代謝
活性化による場合で、Ｓ９ｍｉｘが添加された場合の結
果がそれぞれ示してある。図３は、フレームシフト型菌
株（ＴＡ９８：□、ＴＡ１５３７：○）を用いた場合の
結果が示してある。図中、Ａは代謝活性化によらない場
合であり、Ｂは代謝活性化による場合で、Ｓ９ｍｉｘが
添加された場合の結果がそれぞれ示してある。なお、陰
性対照物質としては、被験物質の調製時に溶媒として用
いた注射用蒸留水を使用した。また、陽性対照物質とし
ては、2-(2-Furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide
（ＡＦ−２）、2-Aminoanthracene（２−ＡＡ）、Sodiu
m azide（ＳＡ）、および、9-Aminoacridine（９−Ａ
Ａ）の各化合物を使用した。ＡＦ−２、９ＡＡ、２−Ａ
ＡはＤＭＳＯで、ＳＡは注射用蒸留水でそれぞれ溶解
し、菌株および代謝活性化によらない場合、代謝活性化
による場合に応じて、それぞれ使用した。
【００４９】以上の結果から、この試験条件下における
本発明のアレルギー疾患治療剤の変異原性は陰性と判断
された。
【００５０】次に、本発明のアレルギー疾患治療剤の薬
理作用について検討した。抗アレルギー作用の一つであ
る抗喘息作用を調べる方法として、モルモット摘出気管
を用いた平滑筋収縮に対する作用を調べた。また、アト
ピー性皮膚炎の改善作用を調べる方法として、アレルギ
ー性接触皮膚炎モデルの一つであるマウス耳浮腫厚測定
試験（ear swelling test）を行った。
【００５１】１．モルモット摘出気管を用いた平滑筋収
縮試験 ５週齢のHartley系雄モルモット(クリーン)２２匹を入
手し、１週間の検疫期間を含む予備飼育を行い、その期
間に異常の認められなかった２０匹を本試験に用い、次
のようにして平滑筋収縮試験試験を行った。
【００５２】本発明のアレルギー疾患治療剤は、注射用
水で所定の濃度に希釈して用いた。アレルギー誘導物質
として用いた卵白アルブミン（ＯＶＡ）は生理食塩液で
溶解した。モルモットの感作投与では、ＯＶＡとフロイ
ントの完全アジュバント（ＦＣＡ）とを等量混和して投
与検体とした。
【００５３】1-1)感作法 以下に示す４群を設定した。
【００５４】
【表５】
【００５５】感作のためのＯＶＡあるいは生理食塩液の
投与は、週２回、２週間、計４回皮下投与により行っ
た。被験物質である本発明のアレルギー疾患治療剤（発
酵産物）あるいは注射用水の投与は気管摘出日３日前か
ら前日までの３日間経口投与により行った。
【００５６】最終感作投与の１１日後から５日間にわた
って、各群１例の動物から気管を摘出し、平滑筋収縮試
験を行った。さらに、気管摘出時に開腹して下大静脈よ
り採血して血清を得、血清中抗ＯＶＡ ＩｇＧ抗体価を
測定し、感作成立を確認するとともに本発明のアレルギ
ー疾患治療剤の経口投与の影響についても調べた。
【００５７】1-2)摘出気管を用いた平滑筋収縮試験 体重５２０．７〜６８１．５の動物に、ベントバルビタ
ールナトリウム３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、麻酔し
た。開胸して気管を摘出し、Krebs-Henseleit液中で連
鎖標本を作製した。９５％Ｏ２-５％ＣＯ２混合ガスを
通気した３７℃Krebs-Henseleit液中で、負荷０．５ｇ
における気管標本の張力変位を変位トランスジューサ
（45347、日本電気三栄）により等張性に測定し、記録
器（RECTI - HORIZ-8K、日本電気三栄）により記録し
た。はじめにアセチルコリン１０−４Ｍによって収縮を
誘発し、この収縮を１００％とした。ＯＶＡ ０．１〜
１０００ｎｇ／ｍＬ、ヒスタミン１０−８〜１０−３Ｍ
およびアセチルコリン１０−５〜１０−４Ｍの誘発収縮
に対する本発明のアレルギー疾患治療剤の経口投与によ
る影響を比較した。また、本発明のアレルギー疾患治療
剤をorgan bathへ直接適用(最終濃度：０．０２％、１
０分間インキュベーション）し、その影響について検討
した。
【００５８】1-3)抗−ＯＶＡ ＩｇＧ抗体価の測定 ＯＶＡを固相化したマイクロタイタープレート（ＮＵＮ
Ｃ）をブロックエース（大日本製薬（株））でブロッキ
ングしたものを用いた。血清を１０、１０２、１０３、
１０４倍にＢＰＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈し、それらをＮ＝
２で１００μＬずつウェルに添加した。
【００５９】室温で２時間反応させた後、ＢＰＳ−Ｔｗ
ｅｅｎで洗浄した。次にブロックエース１０倍希釈液
（０．０５％ ＮａＮ３添加）で１０００倍に希釈した
アルカリフォスファターゼ標識抗モルモットＩｇＧを各
ウェルに１００μＬずつ添加し、室温で２時間反応させ
た。
【００６０】ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後フォスファタ
ーゼ基質キット（ＫＬＰ）を用いて発色させ、５Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液で反応を停止し、４０５ｎｍの吸光
度をオートマチックプレートリーダー（Bio-Tek Instru
ments,Inc.）で測定した。
【００６１】２ウェルの吸光度の平均値を求め、ＩＶ群
の血清の吸光度の平均値＋３ＳＤ（標準偏差）以上の吸
光度を示したものを陽性と判定した。
【００６２】1-4)結果 モルモット摘出気管を用いた平滑筋収縮試験では、動物
の途中死亡はなく、彼験物質の投与に起因したと考えら
れる一般状態の変化は認められなかった。
【００６３】ＯＶＡを感作投与し、本発明のアレルギー
疾患治療剤を投与したＩ群と、ＯＶＡ感作のみのＩＩ群
の間に、摘出気管標本におけるＯＶＡ、ヒスタミンおよ
びアセチルコリン誘発収縮に差は認められなかった。ま
た、ＯＶＡで感作せず、本発明のアレルギー疾患治療剤
を投与したＩＩＩ群と、無処置群であるＩＶ群との間に
も、ヒスタミンおよびアセチルコルン誘発収縮に差は認
められなかった。なお、このＩＩＩ群とＩＶ群ではＯＶ
Ａ誘発収縮は認められなかった。
【００６４】しかしながら、ＩＩ群でのＯＶＡ誘発収縮
は、本発明のアレルギー疾患治療剤をorgan bath に適
用する（bath内濃度：０．０２％）ことにより抑制傾向
が認められた（ＯＶＡ １０ｎｇ／ｍＬでｐ＜０．０
５、図４参照）。ヒスタミンおよびアセチルコリン誘発
収縮に対しては、全群で本発明のアレルギー疾患治療剤
は影響なし〜抑制傾向を示した（例えば、ＩＩＩ群で
は、ヒスタミン１０−６Ｍでｐ＜０．０５）。
【００６５】血清中の抗−ＯＶＡ ＩｇＧ抗体価は、Ｉ
Ｖ群の吸光度の平均＋３ＳＤ（標準偏差）は０．２４３
であった。これに対し、ＯＶＡを感作投与したＩ群およ
びＩＩ群の１０４倍希釈血清の平均吸光度は、それぞれ
１．４６５および１．４８８となりＯＶＡの感作成立が
確認された。Ｉ群とＩＩ群の吸光度に有意な差はなく本
発明のアレルギー疾患治療剤の投与による影響は認めら
れなかった。 ２．マウスを用いた耳浮腫厚測定試験（ear swelling t
est） ６週齢のＢＡＬＢ／ｃ系雄マウス（BALB/c AnNCrj, SP
E）１８匹を入手し、１週間の検疫期間を含む予備飼育
を行い、その期間に異常の認められなかった１５匹を本
試験に使用し、次のようにして耳浮腫厚測定試験（ear
swelling test）を行った。
【００６６】被験物質である本発明のアレルギー疾患治
療剤は、注射用水で所定の濃度に希釈して用いた。アレ
ルギー誘導物質として用いた１−クロロ−２，４−ジニ
トロベンゼン（ＤＮＣＢ）は、アセトン：オリブ油＝
４：１混液に溶解して用いた。
【００６７】2-1)感作法 以下に示す３群を設定した。
【００６８】
【表６】
【００６９】アセトン：オリブ油混液に溶解した０．１
％ＤＮＣＢあるいはアセトン：オリブ油混液は、４日間
連続塗布し、その１２日後にオリブ油に溶解した１％Ｄ
ＮＣＢあるいはオリブ油を皮下投与した。
【００７０】最終感作投与の１３日後に耳浮腫厚測定試
験（ear swelling test）を実施した。本発明のアレル
ギー疾患治療剤（発酵産物）あるいは注射用水の投与
は、惹起日の３日前から前日までの３日間経口投与によ
り行った。
【００７１】2-2)耳浮腫厚測定試験（ear swelling tes
t） 感作投与終了１３日後に動物の左耳に１％ＤＮＣＢ、右
耳にアセトン・オリブ油を２０μＬ塗布して惹起した。
２４時間後および４８時間後に左右の耳の厚さをダイア
ルシックネスゲージ（三豊製作所）で２回ずつ測定し
た。２回測定の平均値をもとめ、個体毎に左右の耳厚差
をもとめた。さらに、群毎に平均値および標準偏差をも
とめ、群間の差の検定を行った。
【００７２】２回の測定値の差が０．１ｍｍ以上の場合
再測定を行い、近い値２つを選んで平均値を求めた。
【００７３】2-3)結果 ＢＡＬＢ／ｃ系マウスを用いた耳浮腫厚測定試験（ear
swelling test）では、動物の途中死亡はなく、被験物
質の投与に起因したと考えられる一般状態の変化は認め
られなかった。
【００７４】ＤＮＣＢ惹起後２４時間の測定においてＤ
ＮＣＢを感作し、本発明のアレルギー疾患治療剤を投与
したＩ群では、ＤＮＣＢ感作のみのＩＩ群に比べＤＮＣ
Ｂ惹起による耳介の肥厚反応が有意に抑制された（ｐ＜
０．０５、図５参照）。ＤＮＣＢ惹起後４８時間におけ
る反応では、Ｉ群とＩＩ群の間に差は認められなかっ
た。対照群であるアセトン・オリブ油で感作し、本発明
のアレルギー疾患治療剤を投与したＩＩＩ群では、ＤＮ
ＣＢ惹起による耳介の肥厚はほとんど認められなかっ
た。
【００７５】以上のように、モルモット摘出気管を用い
た試験では、本発明のアレルギー疾患治療剤の経口投与
による影響は認められなかった。一方、本発明のアレル
ギー疾患治療剤をorgan bathに直接適用した場合には、
ＯＶＡ、ヒスタミン、アセチルコリンのすべての刺激に
対して、全体的に収縮反応が抑制される傾向が認められ
た。この結果から本発明のアレルギー疾患治療剤は、細
胞膜に直接作用して膜を安定化させる作用を有する可能
性が考えられる。
【００７６】また、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスを用いた耳浮
腫厚測定試験（ear swelling test）では、ＤＮＣＢ惹
起後２４時間の測定で、本発明のアレルギー疾患治療剤
投与群の反応が有意に抑制された。本発明のアレルギー
疾患治療剤の投与は惹起の３日前〜前日までの３日間行
ったことから、今回認められた抑制は、感作成立の抑制
ではなく、惹起による感作リンパ球から炎症性細胞への
シグナル伝達および炎症反応の抑制によるものと考えら
れる。
【００７７】このように、本発明のアレルギー疾患治療
剤は、細胞膜の安定化作用などによってヒスタミン等の
炎症性物質の遊離を抑制し、抗アレルギー作用を示すこ
とがわかる。次に、本発明のアレルギー疾患治療剤を用
いた、具体的な治療例を記載する。
【００７８】例１．喘息の治療 ７歳の喘息の男児に、朝晩、２回、各約３０〜５０ミリ
リットルの本発明のアレルギー疾患治療剤を服用させた
ところ、１ヵ月位服用後、前よりは症状が軽くなり、３
ヵ月を過ぎるころには、非常に良くなった。
【００７９】例２．喘息の治療 ６５歳の喘息で朝晩咳き込み苦しんでいた男性に、朝晩
２回、各約３０〜５０ミリリットルの本発明のアレルギ
ー疾患治療剤を約２週間服用させたところ、朝晩の咳込
みがなくなった。
【００８０】例３．アトピー性皮膚炎の治療 アトピー性皮膚炎の２人の成人女性に、朝晩、２回、各
約３０〜５０ミリリットルの本発明のアレルギー疾患治
療剤を服用させたところ、両人共、２週間位服用後、症
状が改善した。
【００８１】例４．アトピー性皮膚炎の治療 幼児期よりアトピー性皮膚炎で苦しんでおり、本治療剤
の服用前には、首、腕の関節及び膝の裏の３ヵ所に炎症
があった、２１歳の女性に、毎日２〜３回、各約３０〜
５０ミリリットルの本発明のアレルギー疾患治療剤を服
用させたところ、先ず、膝の裏の炎症が治まって、地肌
が見えるようになり、３週目には首の部分の傷もなくな
り、次いで左腕の部分の炎症が治まり、２ヵ月後には右
腕の部分の炎症も治まり、きれいな肌を取り戻すことが
できた。
【００８２】このように、多くの人に服用させた結果、
アレルギー疾患の治療に効果があることが分かった。喘
息やアトピー性皮膚炎の場合、２週間位から症状が軽く
なり、３ヵ月位で症状がなくなり、再発することがなか
った。
【００８３】産業上の利用可能性 本発明のアレルギー疾患治療剤は、従来のアレルギー治
療剤と比べて、アレルギー疾患、特に喘息およびアトピ
ー性皮膚炎を、短期間の服用で、副作用もなく、完治さ
せることができるものであり、極めて有用なアレルギー
疾患治療剤が得られる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/72 Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 11/06 17/00 17/00 27/14 27/14 27/16 27/16 37/08 37/08 Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｇ Ｃ１２Ｎ 1/16 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 35/78 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 松科植物の新芽と、水と、糖質とを混合
    し、自然発酵させて得られるアレルギー疾患治療剤。
  2. 【請求項２】 前記松科植物が松属の植物である請求項
    １記載のアレルギー疾患治療剤。
  3. 【請求項３】 前記糖質が、砂糖である請求項１記載の
    アレルギー疾患治療剤。
  4. 【請求項４】 前記アレルギー疾患が、喘息である請求
    項１に記載のアレルギー疾患治療剤。
  5. 【請求項５】 前記アレルギー疾患が、アトピー性皮膚
    炎である請求項１に記載のアレルギー疾患治療剤。
  6. 【請求項６】 松の新芽と、水と、砂糖とを混合し、自
    然発酵させて得られるアレルギー疾患治療剤。
  7. 【請求項７】 滅菌した水に糖質を溶解し、糖質を溶解
    した溶液を調製する工程と、 前記糖質を溶解した溶液に松科植物の新芽を加え、自然
    発酵させる工程とを含むアレルギー疾患治療剤の製造方
    法。
  8. 【請求項８】 前記松科植物が松属の植物である請求項
    ７記載のアレルギー疾患治療剤の製造方法。
  9. 【請求項９】 前記糖質が、砂糖である請求項７記載の
    アレルギー疾患治療剤の製造方法。
  10. 【請求項１０】 前記自然発酵を、嫌気的な条件下、１
    ０〜７０℃で、３〜９ヶ月行う請求項７記載のアレルギ
    ー疾患治療剤の製造方法。
  11. 【請求項１１】 滅菌した水に砂糖を溶解し、砂糖を溶
    解した溶液を調製する工程と、 前記砂糖を溶解した溶液に松の新芽を加え、自然発酵さ
    せる工程とを含むアレルギー疾患治療剤の製造方法。
  12. 【請求項１２】 前記自然発酵を、嫌気的な条件下、１
    ０〜７０℃で、３〜９ヶ月行う請求項１１記載のアレル
    ギー疾患治療剤の製造方法。
  13. 【請求項１３】 熱湯に砂糖を溶解し、周囲温度まで冷
    却させた砂糖水溶液を調製する工程と、 前記砂糖水溶液に、水洗した松の新芽を加え、容器に入
    れて密封し、自然発酵させる工程とを含むアレルギー疾
    患治療剤の製造方法。
  14. 【請求項１４】 前記自然発酵を、１０〜７０℃で、３
    〜９ヶ月行う請求項７記載のアレルギー疾患治療剤の製
    造方法。
  15. 【請求項１５】 前記自然発酵を、密閉した容器を直射
    日光の当たる場所で初冬頃まで行う請求項１１記載のア
    レルギー疾患治療剤の製造方法。
  16. 【請求項１６】 松科植物の新芽と、水と、糖質とを混
    合し、自然発酵させて得られるアレルギー疾患用の健康
    食品。
  17. 【請求項１７】 松の新芽と、水と、砂糖とを混合し、
    自然発酵させて得られるアレルギー疾患用の健康食品。
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