WO2020116365A1 - 鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌及びそのスクリーニング方法 Download PDF

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lactic acid
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acid bacterium
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culture
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太郎 岸田
美菜 藤谷
健志 内田
韓　力
利弘 岸
紘子 坂本
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日本水産株式会社
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a lactic acid bacterium, which is a Lactobacillus plantarum species isolated from salmon sushi.
  • ⁇ Sushi sushi (steamed sushi) is made by pickling salted boiled rice in rice and lactic acid fermentation, and is known as a local dish in Shiga prefecture.
  • Sushi sushi is generally made by salting the salmon for several months, then soaking it in rice and fermenting it for several months to several years (1 to 3 years). It is known that lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus are mainly involved in fermentation of sushi.
  • Lactic acid bacteria are bacteria that produce lactic acid by fermentation and are involved in the fermentation process of various foods such as cheese, yogurt, miso, soy sauce and pickles. Also, some lactic acid bacteria exist in the digestive tract such as the intestine. Lactic acid bacteria are divided into homo-lactic acid bacteria that produce only lactic acid during fermentation and heterolactic acid bacteria that simultaneously produce acids other than lactic acid.
  • Lactobacillus also called lactobacillus
  • the Lactobacillus genus includes more than 180 species and is used for fermentation of a wide variety of food products such as yogurt, cheese and kimchi.
  • Patent Document 1 discloses Lactobacillus boukenrai s193 strain and Lactobacillus sp. isolated as a novel plant lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus, which has an anti-inflammatory effect against inflammatory bowel disease and chronic diarrhea. Paraboukenrai s292 strain is disclosed.
  • the present inventors identified a strain of Lactobacillus plantarum spp. from the lactic acid bacteria isolated from the salmon sushi and named it Lactobacillus plantarum subsp. plantarum FS-1C.
  • the present inventors have found that when the FS-1C strain is administered to rats, the fecal weight of the rats increases and the blood triglyceride and visceral fat mass decrease.
  • the present inventors have found that the virus infection is suppressed when a virus is inoculated after administering this FS-1 strain to a mouse.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the present invention is a lactic acid bacterium, which is a Lactobacillus plantarum species isolated from chrysanthemum sushi, and exhibits viral infection inhibitory action, NK activity enhancing action, lipid reducing action, blood triglyceride lowering action and bowel movement improving action.
  • a lactic acid bacterium having at least one action selected from the group consisting of:
  • the present invention also provides a lactic acid bacterium, which is a Lactobacillus plantarum subsp. plantarum FS-1C strain deposited under accession number NITE ABP-02791.
  • the present invention also provides a virus infection inhibitor containing the lactic acid bacterium cell, culture or treated product as an active ingredient.
  • the present invention also provides an agent for enhancing NK activity, which contains the lactic acid bacterium cells, culture or treated product as an active ingredient.
  • the present invention also provides a lipid-reducing agent containing the lactic acid bacterium cells, culture or treated product as an active ingredient.
  • the present invention also provides a bowel movement-improving agent containing the lactic acid bacterium cells, culture, or treated product as an active ingredient.
  • the present invention also provides a blood triglyceride-lowering agent containing the lactic acid bacterium cells, culture or treated product as an active ingredient.
  • the present invention also provides a cosmetic containing the lactic acid bacterium cells, culture or treated product.
  • the present invention also provides a food composition containing the lactic acid bacterium, a culture or a treated product, for suppressing viral infection, for enhancing NK activity, for reducing lipid, for reducing blood triglyceride or for improving bowel movements. ..
  • the present invention from the fungus sushi, virus infection inhibitory action, NK activity enhancing action, lipid reducing action, blood triglyceride lowering action and Lactobacillus having at least one action selected from the group consisting of a bowel movement-improving action.
  • a method of screening lactic acid bacteria which is a plantarum species, in which the step of isolating lactic acid bacteria from the salmon sushi, the fermented fish surimi using the isolate collected in the isolation step, and when the surimi is fermented
  • a method of screening comprising:
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a strain of Lactobacillus plantarum sp. isolated from salmon sushi, and has a virus infection suppressing action, a NK activity enhancing action, a lipid reducing action, a blood triglyceride lowering action and a bowel movement improving action. It has at least one action selected from the group consisting of: Therefore, the present invention can provide a novel lactic acid bacterium having high functionality, which is isolated from a sushi sushi.
  • the figure which shows the evaluation result of the bleeding state of the lungs of each test group animal when the virus was inoculated after the dry powder of the FS-1C strain was administered to the mouse.
  • the present invention is a Lactobacillus plantarum species isolated from a chrysanthemum sushi, which has a virus infection suppressing action, a NK activity enhancing action, a lipid reducing action, a blood triglyceride lowering action and a bowel movement improving action.
  • a lactic acid bacterium having at least one effect selected.
  • ⁇ Sushi sushi is a fermented food that is made by pickling salted buns (funa) in rice and fermenting it.
  • the broiled sushi used for isolating the lactic acid bacteria of the present invention is not particularly limited, but may be broiled sushi produced in Shiga Prefecture.
  • the salmon used for the salmon sushi is not particularly limited, but, for example, nigorobuna, gengoroubuna, gimbunna and the like can be used.
  • the lactic acid bacteria are first isolated from the salmon sushi.
  • salmon sushi is suspended in saline or the like to prepare a diluted solution.
  • the diluted solution is then seeded in a suitable medium such as agar medium.
  • the seeded medium is cultured at an appropriate temperature such as 37°C to generate colonies. This colony is picked to obtain an isolate.
  • the isolate may be grown once.
  • the harvested isolate is used to ferment the surimi of fish, and a strain having the ability to ferment the surimi is selected and isolated.
  • the isolated strain (about 1000 CFU/g) is seeded in a medium containing 12.5% surimi and cultured at 32° C. for 2 days and the number of bacteria is 2 ⁇ 10 7 CFU/g or more
  • the number of bacteria is 2 ⁇ 10 7 CFU / g or more, and when the pH is 4.2 or less, more preferably when the number of bacteria is 2 ⁇ 10 8 CFU / g or more, particularly preferably the number of bacteria When it is 2 ⁇ 10 8 CFU/g or more and pH is 4.2 or less, it can be determined that the surimi has the ability to ferment.
  • the surimi of fish can be surimi derived from any fish, and can be, for example, a salmon surimi such as the above-mentioned Nigorobuna, Gengo Robuna, and Gimbuna.
  • a salmon surimi such as the above-mentioned Nigorobuna, Gengo Robuna, and Gimbuna.
  • the surimi it is possible to use surimi which has been crushed with water or the like in a food processor and then heat-sterilized in an autoclave or the like.
  • the lactic acid bacterium of the present invention may have only one of virus infection suppressing action, NK activity enhancing action, lipid reducing action, blood triglyceride lowering action and bowel movement improving action, and any two It may have an action, or may have all of these actions.
  • lactic acid bacterium has a viral infection inhibitory action
  • a lactic acid bacterium cell, culture or treated product is administered to an animal such as a human or a mouse, and then the virus is inoculated to the animal. And that the viral infection is suppressed as compared with the case where the bacterial cell, culture or treated product of the lactic acid bacterium is not administered.
  • the lactic acid bacterium that "has a viral infection suppressing action" can be confirmed, for example, by the procedure described in Examples. Briefly, a dry powder of lactic acid bacteria is first administered to the subject animal.
  • a suspension of lactic acid bacteria adjusted to a concentration of 2 mg/mL to 20 mg/mL is administered to a target animal such as a mouse once a day for 14 consecutive days.
  • a suspension of H1N1 virus or the like (eg, concentration 1 ⁇ 10 4 TCID 50 ) is then administered to the mice.
  • the symptoms of viral infection are evaluated 3 days after virus inoculation.
  • the symptoms of viral infection can be evaluated by, for example, weight loss, increase in lung weight, fluctuation of lung/body weight ratio, measurement of viral infection in lung by PCR, and bleeding condition by pathological observation. It is possible to evaluate whether or not the virus infection could be suppressed by comparing the above-mentioned symptoms in the animal to which the lactic acid bacterium was administered and the animal to which the lactic acid bacterium was not administered.
  • lactic acid bacterium has a NK activity-enhancing action
  • a lactic acid bacterium cell, culture or treated product is added to peripheral blood mononuclear cells and cultured, the lactic acid bacterium Includes improved production of inflammatory cytokines such as interferon- ⁇ and interleukin-12 as compared to the absence of added body, culture or treated material.
  • Lactic acid bacteria having “NK activity-enhancing activity” can be confirmed, for example, by the procedure described in Examples. Briefly, lactic acid bacteria are suspended in phosphate buffered salt solution and heat sterilized to prepare killed liquid.
  • the killed bacterial solution is added to the culture solution of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) collected from human, and the cells are cultured at 37° C. under 5% CO 2 for 20 hours. After completion of the culture, the cells are centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes, the supernatant is used for cytokine measurement, and PBMC in the precipitate is used for NK activity measurement.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Production of inflammatory cytokines such as interferon ⁇ and interleukin 12 can be measured using a commercially available kit by the ELISA method or the like.
  • NK activity using the stimulated PBMC as effector cells, using human NK cell sensitive strains such as K562 cells as target cells, cultured both together from the proportion of target cells damaged by NK cells It can be calculated. Damaged target cells can be measured, for example, by the presence or absence of staining with propidium iodide (PI). Since the damaged and killed target cells are stained with propidium iodide, the presence or absence of damage can be measured.
  • PI propidium iodide
  • the lactic acid bacterium has a lipid-reducing action
  • a lactic acid bacterium, a culture or a treated product is administered to an animal such as a rat or a mouse, the lactic acid bacterium, the culture or This means that the amount of neutral fat and/or visceral fat is reduced as compared with the case where the treated product is not administered.
  • Lactic acid bacteria having "lipid-reducing action” can be confirmed, for example, by the procedure described in Examples. Briefly, subject animals are administered a diet containing dry powder of lactic acid bacteria (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group).
  • a diet containing about 2% of the composition of the diet (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group) are continuously administered to target animals such as rats for 14 days.
  • target animals such as rats for 14 days.
  • food intake, body weight, fecal weight, etc. are measured daily.
  • 14 days later blood, liver, and lipid are collected from the target animal, and the amount of triglyceride in blood and the amount of lipid around each organ are measured.
  • the lactic acid bacterium has a lipid-reducing effect.
  • lactic acid bacterium has a blood triglyceride-lowering effect
  • a lactic acid bacterium bacterial cell a culture or a treated product is administered to an animal such as rat and mouse, the lactic acid bacterium bacterial cell It means that the blood triglyceride concentration is lower than that in the case where the culture or the treated product is not administered.
  • the lactic acid bacterium "having a blood triglyceride lowering effect" can be confirmed, for example, by the procedure described in Examples. Briefly, subject animals are administered a diet containing dry powder of lactic acid bacteria (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group).
  • a diet containing about 2% of the composition of the diet (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group) are continuously administered to target animals such as rats for 14 days.
  • target animals such as rats for 14 days.
  • food intake, body weight, fecal weight, etc. are measured daily.
  • 14 days later blood, liver, and lipid are collected from the target animal, and the amount of triglyceride in blood and the amount of lipid around each organ are measured. If a decrease in neutral fat is measured in the lactic acid bacterium group as compared with the control group, the lactic acid bacterium has a blood triglyceride-lowering effect.
  • the lactic acid bacterium has a bowel movement-improving effect means, for example, when a lactic acid bacterium cell, culture or treated product is administered to an animal such as rat or mouse, the lactic acid bacterium cell, culture or This means that the fecal weight is increased as compared with the case where the treated product is not administered.
  • Lactic acid bacteria having a bowel movement-improving effect can be confirmed, for example, by the procedure described in Examples. Briefly, subject animals are administered a diet containing dry powder of lactic acid bacteria (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group).
  • a diet containing about 2% of the composition of the diet (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group) are continuously administered to target animals such as rats for 14 days.
  • target animals such as rats for 14 days.
  • food intake, body weight, fecal weight, etc. are measured daily.
  • the lactic acid bacterium has a bowel movement improving effect.
  • the “culture of lactic acid bacterium” includes live cells and dead cells of lactic acid bacterium, concentrates, dried products, crushed products, culture solutions, culture solution extracts and fermentation solutions thereof.
  • the "treated product of lactic acid bacteria” includes a product obtained by treating live or dead lactic acid bacteria by heat treatment, enzyme treatment, or the like.
  • a known medium and culturing method can be used.
  • the medium for example, MRS medium, GAM medium and LM17 medium can be used.
  • Inorganic salts, vitamins, amino acids, antibiotics, serum and the like can be added to the medium, if necessary.
  • Culturing can be carried out, for example, at 25 to 40° C. for several hours to several days.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is Lactobacillus plantarum subsp. plantarum FS-1C strain (accession number NITE ABP-02791) (hereinafter, also simply referred to as “FS-1 strain”). be able to.
  • the FS-1C strain is a strain isolated from sushi, and, as shown in the following examples, viral infection inhibitory action, NK activity enhancing action, lipid reducing action, blood triglyceride lowering action and bowel movement improvement. Have an effect.
  • These strains are homotypic lactic acid bacteria that produce only lactic acid during fermentation.
  • the lactic acid bacterium of the present invention produces extracellular polysaccharides (EPS) during culture, but it may produce little EPS.
  • EPS polysaccharides
  • the lactic acid bacterium of the present invention may be the bacterium itself, or a culture or treated product.
  • the lactic acid bacterium of the present invention may be in the form of live bacterial powder obtained by concentrating and drying cultured cells. Such live bacterial powder can be used as an inoculum when producing a fermented product such as yogurt.
  • the lactic acid bacterium of the present invention may be in a form of dead bacterial powder obtained by sterilizing cultured bacterial cells, followed by concentration and drying. Such killed bacterial powder can be added to various medicines, cosmetics and foods regardless of temperature range and product form.
  • the lactic acid bacterium of the present invention may be in the form of a fermented liquid obtained by fermenting milk, and may be, for example, a live bacterial milk product lactic acid beverage or a sterilized dairy product lactic acid beverage.
  • the present invention also provides a virus infection inhibitor containing, as an active ingredient, the above-mentioned lactic acid bacterium cell, culture or treated product.
  • a virus infection inhibitor containing, as an active ingredient, the above-mentioned lactic acid bacterium cell, culture or treated product.
  • inhibittion of viral infection includes inhibition, prevention and amelioration of infection by a virus.
  • the virus infection inhibitor of the present invention can be used for a medicine for preventing or treating a virus infection, and a cosmetic or a food for preventing a virus infection.
  • the virus includes, but is not limited to, influenza virus and the like.
  • the present invention also provides a NK activity enhancer containing the above-mentioned lactic acid bacterium cells, culture or treated product as an active ingredient.
  • "enhanced NK activity” includes activation and promotion of NK cells.
  • the NK activity enhancer of the present invention can be used in a medicament for preventing or treating a disease that can be prevented or treated by activating NK cells.
  • the NK activity enhancer of the present invention can be used in cosmetics and foods for activating NK cells.
  • the present invention also provides a lipid-reducing agent containing the above-mentioned lactic acid bacterium cell, culture or treated product as an active ingredient.
  • lipid reduction includes reduction of visceral fat and reduction of blood lipid.
  • the lipid-reducing agent of the present invention can be used in a medicament for preventing or treating a disease that can be prevented or treated by reducing lipids. Further, the lipid-reducing agent of the present invention can be used in cosmetics and foods for reducing lipids.
  • the present invention also provides a blood triglyceride lowering agent, which contains the above-mentioned lactic acid bacterium cell, culture, or treated product as an active ingredient.
  • a blood triglyceride lowering agent which contains the above-mentioned lactic acid bacterium cell, culture, or treated product as an active ingredient.
  • the term “decrease in neutral fat in blood” includes a decrease and a decrease in neutral fat concentration in blood.
  • the blood triglyceride lowering agent of the present invention can be used in a medicament for preventing or treating a disease which can be prevented or treated by lowering blood triglyceride.
  • the blood triglyceride lowering agent of the present invention can be used in cosmetics and foods for lowering blood triglyceride.
  • the present invention also provides a bowel movement-improving agent containing, as an active ingredient, the above-mentioned lactic acid bacterium cell, culture or treated product.
  • "improvement of bowel movements” includes promotion of excretion, increase of fecal weight and improvement of symptoms of constipation.
  • the bowel movement-improving agent of the present invention can be used, for example, as a medicament for preventing, ameliorating or treating symptoms of constipation.
  • the bowel movement improving agent of the present invention can be used in cosmetics and foods for improving bowel movements.
  • the virus infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid reducing agent, blood triglyceride lowering agent and bowel movement improving agent of the present invention may be the above-mentioned lactic acid bacterium cells, culture or treated product itself, It may be formulated. Further, the virus infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid-reducing agent, blood triglyceride lowering agent and bowel movement improving agent of the present invention may further contain an active ingredient other than the lactic acid bacterium of the present invention.
  • NK activity enhancer for formulation of the virus infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid-reducing agent, blood triglyceride-lowering agent and bowel movement-improving agent of the present invention, a commonly used formulation method can be used.
  • the viral infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid reducing agent, blood triglyceride lowering agent and bowel movement improving agent of the present invention include, in addition to the active ingredient, an excipient, a binder, a lubricant, a disintegrating agent, It may contain a flavor improving agent, a solubilizing agent, a suspending agent, a coating agent, a whitening agent, a moisturizing agent, an antioxidant, an oily component, an ultraviolet absorber, a surfactant, a thickener, alcohols and the like.
  • the viral infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid reducing agent, blood triglyceride lowering agent and bowel movement improving agent of the present invention can be in the form of an oral preparation or a parenteral preparation.
  • the viral infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid reducer, blood triglyceride lowering agent and bowel movement improving agent of the present invention are tablets, powders, granules, powders, capsules, drinks, injections, suppositories. , A suspension, an ointment, a liquid, a patch and an external preparation, and the like.
  • the dose of the viral infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid-reducing agent, blood triglyceride-lowering agent and bowel movement-improving agent of the present invention should be appropriately set according to the age, weight and degree of symptoms of the subject to be administered.
  • An agent containing a microbial cell, a culture, or a treated product corresponding to the number of 10 11 particularly preferably 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 lactic acid bacteria, may be administered once or several times a day.
  • the present invention also provides a medicament containing the above-mentioned lactic acid bacterium cell, culture or treated product.
  • the medicament of the present invention is a medicament for preventing or treating a viral infection, a medicament for preventing or treating a disease that can be prevented or treated by activating an immune effect, a medicament for reducing lipid, a visceral fat. It can be a drug for reducing blood pressure, a drug for lowering blood triglyceride, or a drug for improving bowel movements.
  • the drug of the present invention can have the same constitution as the above-mentioned agent for suppressing viral infection, agent for enhancing NK activity, agent for reducing lipid, agent for lowering blood triglyceride and agent for improving bowel movement of the present invention described above.
  • the present invention also provides a cosmetic containing the above-mentioned lactic acid bacterium cells, culture, or processed product.
  • the cosmetics of the present invention are cosmetics for preventing viral infections, cosmetics for activating immune actions, cosmetics for reducing lipids, cosmetics for reducing visceral fat, and reducing blood triglyceride.
  • the cosmetic of the present invention may have the same composition as the above-described viral infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid reducing agent, blood triglyceride lowering agent and bowel movement improving agent of the present invention.
  • the cosmetic of the present invention can be any cosmetic applied to the skin, mucous membranes, body hair, hair, nails, teeth and lips of animals including humans.
  • the cosmetics of the present invention are, for example, basic cosmetics such as face washes, lotions, milky lotions, creams, gels, essences, beauty essences, packs and masks; foundations, lipsticks, blushers, eye shadows, eye liners, and mascara make-ups.
  • Cosmetics such as nail polish, base coat, top coat and remover; as well as massage agents, cleansing agents, after shave lotions, pre shave lotions, shaving creams, body soaps, soaps, shampoos, rinses, hair treatments, hair styling products It can be in the form of a hairnic agent, a hair restorer, an antiperspirant and a bath agent.
  • the present invention also includes bacterial cells, cultures or treated products of the above-mentioned lactic acid bacteria, for suppressing viral infections, for enhancing NK activity, for reducing lipids, for reducing visceral fat, for reducing blood triglyceride or for improving bowel movements.
  • the food composition of The food composition of the present invention can have the same constitution as the above-mentioned viral infection inhibitor, NK activity enhancer, lipid reducing agent, blood triglyceride lowering agent and bowel movement improving agent of the present invention.
  • the food composition of the present invention includes dairy products such as milk drinks, yogurt, fermented milk, cheese, ice cream and cream; fermented foods such as pickles, kimchi and salmon sushi; retort foods, instant noodles, instant soups and freezes.
  • dairy products such as milk drinks, yogurt, fermented milk, cheese, ice cream and cream
  • fermented foods such as pickles, kimchi and salmon sushi
  • retort foods instant noodles, instant soups and freezes.
  • Instant foods such as dry; soft drinks, lactic acid bacteria drinks, juices, coffee, tea and alcoholic drinks
  • flour products such as bread, pasta, noodles, bread crumbs and cake mixes; confectionery; seasonings; oils and fats; agricultural processing Goods; and frozen foods and the like.
  • the food composition of the present invention may be a health food, a functional food, a food for specified health use, a dietary supplement, a supplement, a probiotic product, a food for a patient, and the like.
  • the food composition of the present invention is used for "inhibition of viral infection", “enhanced NK activity”, “decreased lipid”, “decreased visceral fat”, “decreased neutral fat in blood” or “improved bowel movement”. It is possible to adopt a mode in which a display to the effect that it is given is added.
  • the present invention also comprises a fungus sushi, which has at least one action selected from the group consisting of a virus infection suppressing action, a NK activity enhancing action, a lipid reducing action, a blood triglyceride lowering action and a bowel movement improving action.
  • a virus infection suppressing action a virus infection suppressing action
  • a NK activity enhancing action a lipid reducing action
  • a blood triglyceride lowering action a bowel movement improving action.
  • a method for screening a lactic acid bacterium that is a plantarum species is a plantarum species.
  • the method for screening of the present invention comprises a step of isolating lactic acid bacteria from a sushi sushi product (isolation step), fermenting the ground fish paste using the isolate collected in the isolation step, and when the ground meat is fermented.
  • the step of selecting an isolated strain (fermentation step) and that the selected isolated strain has a viral infection suppressing action, a NK activity enhancing action, a lipid reducing action, a blood triglyceride lowering action or a bowel movement improving action
  • a test step (test step).
  • a conventionally known method can be used as a method for isolating lactic acid bacteria from the salmon sushi.
  • a sushi sushi is suspended in a liquid and diluted, and a diluted solution is seeded on an agar medium.
  • a sushi product is suspended in a liquid such as sterilized water, saline or a medium solution to prepare a suspension.
  • this suspension is diluted to an appropriate concentration with a diluting solution such as water, saline or a medium solution.
  • the suspension may be made into a 5-10 fold dilution series in 3-10 steps.
  • a dilution series diluted 10 times, 100 times, 1000 times, 10000 times, etc. can be prepared.
  • the prepared diluted solution is seeded on a medium such as an agar medium.
  • a medium such as an agar medium.
  • a known medium usually used for culturing lactic acid bacteria can be used.
  • the method of seeding on the agar medium is not particularly limited.
  • the agar medium is cultivated at an appropriate temperature such as 25 to 37°C.
  • an isolated strain for example, grown colonies are collected, single colonies are punctured with a sterilized toothpick or platinum loop, and inoculated into another medium.
  • the isolate obtained is used in the following procedure. The isolate may be grown once.
  • the surimi of fish is fermented using the isolate collected in the isolation step, and when the surimi is fermented, the isolate is selected. For example, it is possible to determine that the surimi has been fermented when the isolate is sown and cultured in a medium containing the surimi and the number of bacteria increases. More specifically, for example, when the isolate (about 1000 CFU/g) was seeded in a medium containing 12.5% surimi and cultured at 32°C for 2 days, the number of bacteria was 2 ⁇ 10 7 CFU/g or more.
  • the surimi may be determined to be fermented when the number of bacteria is 2 ⁇ 10 8 CFU/g or more and the pH is 4.2 or less.
  • the surimi of fish can be surimi derived from any fish, and can be, for example, the surimi of salmon such as the above-mentioned Nigorobuna, Gengo Robuna, and Gimbuna.
  • the surimi it is possible to use surimi which has been crushed with water or the like in a food processor and then heat-sterilized in an autoclave or the like.
  • a lactic acid bacterium which is a Lactobacillus plantarum species having any of these actions can be selected as the lactic acid bacterium of the present invention.
  • Lactic acid bacteria having a viral infection suppressing action can be confirmed, for example, by the procedure described in Examples. Briefly, a dry powder of lactic acid bacteria is first administered to the subject animal. For example, a suspension of lactic acid bacteria adjusted to a concentration of 2 mg/mL to 20 mg/mL is administered to a target animal such as a mouse once a day for 14 consecutive days. A suspension of H1N1 virus or the like (eg, concentration 1 ⁇ 10 4 TCID 50 ) is then administered to the mice. The symptoms of viral infection are evaluated 3 days after virus inoculation. The symptoms of viral infection can be evaluated by, for example, weight loss, increase in lung weight, fluctuation of lung/body weight ratio, measurement of viral infection in lung by PCR, and bleeding condition by pathological observation. It is possible to evaluate whether or not the virus infection could be suppressed by comparing the above-mentioned symptoms in the animal to which the lactic acid bacterium was administered and the animal to which the lactic acid bacterium was not administered.
  • the lactic acid bacterium having a NK activity-enhancing action can be confirmed, for example, by the procedure described in Examples. Briefly, lactic acid bacteria are suspended in phosphate buffered salt solution and heat sterilized to prepare killed liquid. Then, the killed bacterial solution is added to the culture solution of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) collected from human, and the cells are cultured at 37° C. under 5% CO 2 for 20 hours. After completion of the culture, the cells are centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes, the supernatant is used for cytokine measurement, and PBMC in the precipitate is used for NK activity measurement.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • inflammatory cytokines such as interferon ⁇ and interleukin 12 can be measured using a commercially available kit by the ELISA method or the like.
  • NK activity using the stimulated PBMC as effector cells, using human NK cell sensitive strains such as K562 cells as target cells, cultured both together from the proportion of target cells damaged by NK cells It can be calculated. Damaged target cells can be measured, for example, by the presence or absence of staining with propidium iodide (PI). Since the damaged and killed target cells are stained with propidium iodide, the presence or absence of damage can be measured.
  • PI propidium iodide
  • Lactic acid bacteria having a lipid-reducing action can be confirmed, for example, by the procedure described in the examples. Briefly, subject animals are administered a diet containing dry powder of lactic acid bacteria (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group). For example, a diet containing about 2% of the composition of the diet (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group) are continuously administered to target animals such as rats for 14 days. For each subject animal, food intake, body weight, fecal weight, etc. are measured daily. 14 days later, blood, liver, and lipid are collected from the target animal, and the amount of triglyceride in blood and the amount of lipid around each organ are measured. When a decrease in neutral fat and/or visceral fat is measured in the lactic acid bacterium group as compared with the control group, the lactic acid bacterium has a lipid-reducing effect.
  • target animals such as rats for 14 days.
  • target animals such as rats for 14 days.
  • target animals such as
  • Lactic acid bacteria having a blood triglyceride lowering action can be confirmed, for example, by the procedure described in the examples. Briefly, subject animals are administered a diet containing dry powder of lactic acid bacteria (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group). For example, a diet containing about 2% of the composition of the diet (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group) are continuously administered to target animals such as rats for 14 days. For each subject animal, food intake, body weight, fecal weight, etc. are measured daily. 14 days later, blood, liver, and lipid are collected from the target animal, and the amount of triglyceride in blood and the amount of lipid around each organ are measured. If a decrease in neutral fat is measured in the lactic acid bacterium group as compared with the control group, the lactic acid bacterium has a blood triglyceride-lowering effect.
  • target animals such as rats for 14 days.
  • target animals such as rats for 14 days.
  • Lactic acid bacteria having a bowel movement-improving effect can be confirmed, for example, by the procedure described in the examples. Briefly, subject animals are administered a diet containing dry powder of lactic acid bacteria (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group). For example, a diet containing about 2% of the composition of the diet (lactic acid bacteria group) and a diet not containing it (control group) are continuously administered to target animals such as rats for 14 days. For each subject animal, food intake, body weight, fecal weight, etc. are measured daily. When an increase in fecal weight is measured in the lactic acid bacterium group as compared with the control group, the lactic acid bacterium has a bowel movement improving effect.
  • Example 1 Identification of FS-1 strain
  • a lactic acid bacterium FS-1 strain isolated by screening from fungus sushi produced in Shiga Prefecture. Specifically, screening was performed by the method described below. First, the fish paste was stirred with an equivalent amount of pure water in a household food processor, and then heat sterilized in an autoclave at 115°C for 15 minutes. Next, a medium containing 12.5% surimi, 1.4% agar, 20 ⁇ g/ml bromcresol purple and 0.5% glucose was prepared, seeded with a strain (1000 CFU/g), and cultured at 32°C for 2 days (CFU count) /g) and pH were measured. A strain having a bacterial count of 2 ⁇ 10 8 CFU/g or more and a pH of 4.2 or less was selected as the best strain. The strains (the best strains) that exceeded the criteria in the above screening were 6 strains.
  • FS-1 strain was the only strain isolated from the egg portion of the salmon.
  • the FS-1 strain is a homotype that produces only lactic acid during fermentation, has a higher growth rate compared to other strains isolated at the same time, and has an extremely high extracellular polysaccharide (EPS) was produced.
  • EPS extracellular polysaccharide
  • Example 2 Effect on neutral fat in blood, lipids and feces
  • lactic acid bacterium dead cells of the FS-1 strain were used.
  • Food consumption, body weight and fecal weight were measured daily for each rat. After 14 days, blood and lipids were collected from the rats.
  • Blood was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes (AX-311, Tommy Industries Co., Ltd.) to collect serum, and the triglyceride E-test Wako (Wako) was used to measure the neutral fat concentration in the serum. The lipid was weighed after sampling.
  • Table 2 shows the individual measurement values and average values of fecal weight (g) in each group.
  • a graph showing the average value of fecal weight (g) in each group is shown in FIG.
  • administration of this lactic acid bacterium significantly increased the fecal weight in the lactic acid bacterium group as compared with the control group.
  • Table 3 shows the measured and average values of serum triglyceride concentration (mM) in each group
  • Fig. 2 shows a graph showing the mean value of serum triglyceride concentration (mM).
  • perirenal fat (g), mesenteric fat (g) and epididymal fat (g) were measured, and the average value of each is shown in Table 4. .
  • administration of the present lactic acid bacteria reduced all of the perirenal fat, mesenteric fat, and epididymal fat in the lactic acid bacterium group compared with the control group. It was confirmed to decrease.
  • perirenal fat showed a large decrease of about 10% as compared with the control group.
  • this lactic acid bacterium has a bowel movement improving effect, a lipid reducing effect, a blood triglyceride decreasing effect and a visceral fat decreasing effect.
  • the weight ratio of the composition of the bait used in Example 2 is shown below.
  • the composition of the bait used for the control group is shown as “Control”
  • the composition of the bait used for the lactic acid bacterium group is shown as "lactic acid bacterium”.
  • T.test indicates a t-value when performing a t-test with the fecal weight of the lactic acid bacteria group relative to the fecal weight of the control group based on these values.
  • T.test indicates a t value when a t-test is performed with the serum triglyceride concentration of the lactic acid bacteria group against the serum triglyceride concentration of the control group based on these values.
  • perirenal fat (g), mesenteric fat (g), and epididymal fat (g) in the control group and the lactic acid bacteria group fed for 14 days are shown below.
  • Example 3 Inhibitory effect against influenza virus infection
  • FIGS. 3 to 6 are T. Test tests, and FIGS. 7 to 8 are Willcox tests. *: P ⁇ 0.05, #: P ⁇ 0.1.
  • test sample A test sample, FS-1 dry powder, was accurately weighed, 0.5% CMC-Na (Sodium Carboxymethyl Cellulose) aqueous solution was added, and a uniform suspension having a concentration of 2 mg/mL and 20 mg/mL was prepared.
  • CMC-Na Sodium Carboxymethyl Cellulose
  • test sample administration and virus inoculation The test sample was orally administered once a day for 14 consecutive days to raise mice. Thereafter, 40 ⁇ l of PBS (Phosphate buffered saline) was administered to the normal control group, and 40 ⁇ l of H1N1 virus suspension (concentration 1 ⁇ 10 4 TCID 50 ) was administered to the other test groups by instillation. The administration and subsequent tests were performed in a biosafety level 2 (BSL-2) test room.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Test evaluation The test was terminated 3 days after virus inoculation, and body weight, lung weight, lung/body weight ratio were measured for each group, and lung PCR (right side) and pathological observation (left side) were evaluated.
  • body weight The measurement results of the body weight (g) of each test group animal after virus inoculation are shown in Table 6 and FIG. D0 to D3 occupy body weight on days 0 to 3 after virus inoculation, respectively. In each of the groups inoculated with the virus, the body weight on the 3rd day of the inoculation was significantly reduced as compared with the normal control group.
  • the measurement results of the body weight (g) of each test group animal after ingestion of the virus used in Example 3 are shown below as average values.
  • SD is the standard deviation
  • SE is the standard error
  • T.Test is the t-value when a t-test with other groups is performed against the normal control group (Nor C) based on these values.
  • lung weight and lung weight ratio The measurement results of lung weight (g) of each test group animal after virus inoculation are shown in Table 7 and FIG. The calculation results of the lung/body weight ratio (%) are shown in Table 7 and FIG. Vaccination increased lung weight in model control (Mod C) animals. In contrast, the increase in lung weight due to virus infection was significantly suppressed in the low sample dose group (FS-1 L) and the high sample dose group (FS-1 H).
  • the measurement results of the lung weight (g) of each test group animal after the virus inoculation used in Example 3 are shown below as the average value.
  • SD is the standard deviation
  • SE is the standard error
  • the upper part of T.Test shows the t-value when performing a t-test with the model control group (Med C) based on these values with other groups.
  • the lower part of T.Test shows a t-value when a t-test is performed with another group with respect to the normal control group (Nor C).
  • the virus infection status of the lungs of the animals in each group inoculated with the virus was measured by PCR.
  • the collected lungs were lysed using EasyPure Viral DNA/RNA Kit (TransGen Biotech), RNA was extracted and concentrated, and the RNA concentration was measured by NanoDrop 2000c ultratrace spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). Then, the relative expression level of real-time RNA in each sample was measured using an Eppendorf Realplex spectrofluorometer (Eppendorf).
  • GAPDH was used as an internal standard at the time of measurement, and the measured value was corrected.
  • the measurement results are shown in Table 8 and FIG. Compared with the model control group (Mod C), the virus expression level in the high sample dose group (FS-1 H) tended to be suppressed.
  • the virus inoculation damaged the lungs of the animals, causing bleeding.
  • the model control group (Mod C) bleeding was confirmed in more than half of the animals.
  • bleeding suppression tended to be seen in the low-dose sample (FS-1L) and high-dose group (FS-1H), especially in the high-dose sample group (FS-1H).
  • a bleeding inhibitory effect was observed. From the results of the Wilcoxon rank sum test, it is considered that the difference between the model low dose group (FS-1L) and the high sample dose group (FS-1H) and the model control group (ModC) is significant. Was given.
  • Example 3 The evaluation results obtained by observing the bleeding state of the lung of each test group animal after inoculation of the virus used in Example 3 are shown below. Each individual was evaluated as having bleeding status with bleeding (+) or without bleeding (-), and the total number of individuals evaluated as having bleeding (+) was +, without bleeding (-) The total number of is shown in the table. Vs Mod C below the table, the test value when performing the rank sum test of Wilcoxon in the sample low dose group (FS-1 L) and the model control group (Mod C) is under FS-1 L, The test values when the Wilcoxon rank sum test is performed between the sample high dose group (FS-1H) and the model control group (Mod C) are shown below FS-1H.
  • the inflammatory cell infiltration was observed by pulmonary pathological observation.
  • the inflammatory cell infiltration state was evaluated by confirming the pathological section, and each individual was evaluated as no change (-), a slight change (+), a slight change (++), and a moderate change or higher (++).
  • Table 10 shows the results of pathological observation of lungs of each group of animals inoculated with the virus.
  • FIG. Fig. 9 shows an example of the results of lung pathological observation (HE staining, ⁇ 200 times).
  • virus inoculation caused an infiltration phenomenon of inflammatory cells in the lung tissue of animals.
  • model control group Mode C
  • “mild changes” were confirmed in more than half of the animals.
  • the sample low dose group and the sample high dose group showed a tendency to suppress infection, and particularly the sample high dose group (FS-1 H) showed a remarkable infection suppressive effect.
  • FS-1L model low dose group
  • FS-1H high sample dose group
  • MODC model control group
  • the results of evaluation by pathological observation of the lungs of each test group animal after inoculation of the virus used in Example 3 are shown below.
  • the inflammatory cell infiltration state of each individual was evaluated by confirming the pathological section as either no change (-), a slight change (+), a slight change (++), or a moderate change or higher (++).
  • the total number of individuals evaluated as moderate change (+++) is +++
  • the total number of individuals evaluated as mild change (++) is ++
  • the total number of individuals evaluated as slight change (+) is The total number is shown in the table as +
  • the total number of individuals evaluated as no bleeding (-) is shown in the table.
  • the test value for the model control group (Mod C) when performing the Wilcoxon rank sum test between the positive control group (Pos C) and the model control group (Mod C) is Pos C.
  • the test value for the model control group (Mod C) when performing the Wilcoxon rank sum test between the sample low dose group (FS-1 L) and the model control group (Mod C) is below FS-1 L. Shown in.
  • the test values for the model control group (Mod C) when the Wilcoxon rank sum test is performed between the sample high dose group (FS-1 H) and the model control group (Mod C) are shown below FS-1 H.
  • Example 4 Effect on NK activity
  • Lactobacillus plantarum subsp. plantarum FS-1 strain was used as the strain.
  • the FS-1 strain was grown by using MRS medium (Difco) at 30° C. for 24 hours and frozen and stored at ⁇ 70° C. as an inoculum (FS-1C strain).
  • Inoculum sample Strain (FS-1 strain) grown in MRS medium was collected by centrifugation, washed with physiological saline, adjusted to 10 8 CFU/ml with phosphate buffered saline and adjusted to 5°C at 98°C. It was sterilized by heating for minutes to give a killed liquid.
  • Peripheral blood mononuclear cells Peripheral blood was collected from healthy subjects on the day of the test, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated by the Ficoll method. PBMC was adjusted to a concentration of 2 ⁇ 10 6 /ml with RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum (FCS), and 500 ⁇ l was dispensed into a 24-well plate per well. Next, 50 ⁇ l of killed bacteria solution was added as a stimulant, and the mixture was cultured at 37° C. under 5% CO 2 for 20 hours.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Control sample In the same manner as above, PBS was added instead of the stimulant to prepare a control sample.
  • Cytokine As a cytokine contained in the culture supernatant, interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) was measured using a commercially available ELISA measurement kit Affimetrix/eBioscience). Interleukin 12 (IL-12) was also measured using a commercially available ELISA kit (R&D System).
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • IL-12 Interleukin 12
  • NK activity Stimulated PBMC were used as effector cells, and K562 cells, which is a human NK cell sensitive strain, were used as target cells.
  • KB6 cells (5 ⁇ 10 4 cells/ml concentration) and PBMC (2 ⁇ 10 6 cells/ml concentration) stained with the hydrophobic cyanine membrane fluorescent dye 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) and membrane impermeability
  • PI Propidium iodide
  • the NK activity was measured by measuring the ratio of injured K562 cells (PI positive cells) with a flow cytometer (Beckman Coulter). The NK activity was calculated by the following formula.
  • NK activity (%) number of DiO positive PI positive cells/(number of DiO positive PI negative cells + number of DiO positive PI positive cells) x 100-spontaneouslysi
  • Test 1 Table 11 shows the measurement results showing changes in immune function due to bacterial cell stimulation in Test 1 (cytokines released into the medium and NK activity contained in PBMC after stimulation of PBMC with various samples for 20 hours at 37°C). (Exp.1). Using PBMC of donor K (female in his 60s), FS-1 strain cells and Lactobacillus casei strain, which is a commercially available lactic acid bacterium strain for comparison, were tested as samples. .. The number of bacteria in the sample was set so that the bacterial cell sample had the same concentration (final concentration 10 7 cfu/ml).
  • FS-1 strain cells induced high production of inflammatory cytokines IL-12 and IFN- ⁇ . NK activity was higher in FS-1 compared to unstimulated controls. From these results, it was found that FS-1 bacterial cells induce the production of inflammatory cytokines and enhance NK activity.
  • Test 2 In order to investigate whether the same tendency as in Study 1 was observed in other individuals, we conducted a study with two types of PBMC in addition to PBMC of donor A (male in his 60s) (Exp.2). The results are shown in Table 11.
  • test conditions were the same as in Test 1, but there were some individual differences in the response of PBMC to the test substance stimulus, and there were differences in the same person depending on the time of blood collection. Unlike the results of test 1, the production of those cytokines by other strains of lactic acid bacteria Shirota was low. Regarding the NK activity, both donor K and donor A were stimulated by the FS-1 strain.
  • the IL-12 and IFN- ⁇ production levels were correlated. Since IFN- ⁇ is also produced by NK cells activated by IL-12, the amount of IFN- ⁇ produced may reflect the degree of IL-12 activation of NK cells. In other words, it is possible that stimulation of only the bacterial cells induces IL-12 production, which activates NK cells, increases IFN- ⁇ production, and then further increases NK activity. ..
  • the FS-1 strain has high ability to suppress viral infection and enhance NK activity.
  • Cytokines (IL-12 concentration (pg/ml), IFN- ⁇ concentration (pg/ml)) released into the medium in Test 1 (provider K only) and Test 2 (provider K and A) of Example 4 ) And NK activity (%) are shown below.
  • Trial 1 is performed on the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of donor K
  • Trial 2 is performed on the PBMCs of donors K and A.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Each PBMC was stimulated with FS-1C strain, Shirota strain, and no material (PBS target), and the IL-12 concentration and IFN- ⁇ concentration produced by PBMC from the supernatant of the culture medium were measured and shown below.
  • the NK activity of PBMC obtained by measuring the damage rate of K562 cells after co-culture of stimulated PBMC and K562 cells is shown below.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is used for medicines, cosmetics and foods and drinks for suppressing viral infections, stimulating immunity, decreasing lipids, lowering blood triglycerides, and/or improving bowel movements. You can

Abstract

【課題】　鮒寿司から単離された、高い機能性を有する新規の乳酸菌を提供する。 【解決手段】　本発明は、鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌であって、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有する、乳酸菌を提供する。また、本発明は、ラクトバチルス・プランタラム亜種プランタラムFS-1C株である、乳酸菌を提供する。

Description

鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌及びそのスクリーニング方法
　本発明は、鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌に関する。
　鮒寿司（鮒ずし；鮒鮨）は、塩漬けにした鮒を米飯に漬け込み乳酸発酵させたものであり、滋賀県の郷土料理として知られている。
　鮒寿司は、一般的に、鮒を数ヶ月塩漬けにした後、米飯に漬け込んで、数ヶ月から数年間（1～3年間）発酵させることにより作られる。鮒寿司の発酵には、主にラクトバチルス属（Lactobacillus）の乳酸菌が関わっていることが知られている。
　乳酸菌は、発酵により乳酸を産生する細菌であり、チーズ、ヨーグルト、味噌、醤油および漬物などの様々な食品の発酵過程に関わっている。また、乳酸菌には、腸などの消化管内に存在するものもある。乳酸菌は、発酵の際に乳酸のみを生産するホモ乳酸菌と、乳酸以外の酸を同時に生産するヘテロ乳酸菌とに分けられる。
　乳酸菌の中でもラクトバチルス属は、乳酸桿菌ともよばれ、古くからヨーグルトの発酵に用いられてきた菌である。ラクトバチルス属には、180種以上の種が含まれ、ヨーグルト、チーズおよびキムチなどの多種多様な食品の発酵に利用されている。
　近年、乳酸菌の持つ高い機能性が注目され、より高い機能を持つ新たな乳酸菌の同定がさかんになっている。特許文献1には、鮒寿司から単離され、炎症性腸疾患や慢性下痢症に対して抗炎症効果を有する、ラクトバチルス属に属する新規の植物性乳酸菌として、ラクトバシラス・ブーケンライｓ１９３株およびラクトバシラス・パラブーケンライｓ２９２株が開示されている。
特開２０１０－０９９０２４号公報
　近年、乳酸菌およびその発酵食品が持つ様々な生理的な機能が注目を浴びており、鮒寿司などの発酵食品に、未知の有用な乳酸菌が存在することが示唆される。
　そこで、本発明は、鮒寿司から単離された、高い機能性を有する新規の乳酸菌を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鮒寿司から単離された乳酸菌の中から、ラクトバチルス・プランタラム種の菌株を同定し、ラクトバチルス・プランタラム亜種プランタラムFS-1Cと命名した。本発明者らは、FS-1C株をラットに投与したところ、ラットの糞重量が増加するとともに、血中中性脂肪および内臓脂肪量が減少することを見出した。
　また、本発明者らは、このFS-1株をマウスに投与した後にウイルスを接種すると、ウイルス感染が抑制されることを見出した。
　さらに、本発明者らは、FS-1C株を末梢血単核球（PBMC）に添加して培養したところ、PBMCのNK活性が高くなることを見出した。
　本発明は、鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌であって、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有する、乳酸菌を提供する。
　また本発明は、受託番号NITE ABP-02791で寄託されているラクトバチルス・プランタラム亜種プランタラムFS-1C株である、乳酸菌を提供する。
　また本発明は、上記乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、ウイルス感染抑制剤を提供する。
　また本発明は、上記乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、NK活性亢進剤を提供する。
　また本発明は、上記乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、脂質減少剤を提供する。
　また本発明は、上記乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、便通改善剤を提供する。
　また本発明は、上記乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、血中中性脂肪低下剤を提供する。
　また本発明は、上記乳酸菌の菌体、培養物または処理物を含む化粧品を提供する。
　また本発明は、上記乳酸菌の菌体、培養物または処理物を含む、ウイルス感染抑制用、NK活性亢進用、脂質減少用、血中中性脂肪低下用または便通改善用食品組成物を提供する。
　また本発明は、鮒寿司から、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有するラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌をスクリーニングする方法であって、鮒寿司から乳酸菌を単離する工程と、単離工程において採取した単離株を用いて魚のすり身を発酵させ、すり身が発酵されたときに上記単離株を選択する工程と、選択された単離株がウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用または便通改善作用を有することを試験する工程とを有する、スクリーニングする方法を提供する。
　本発明の乳酸菌は、鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種の菌株であって、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有する。そのため、本発明は、鮒寿司から単離された、高い機能性を有する新規の乳酸菌を提供することができる。
FS-1C株の死菌体をラットに投与したときの糞重量（g）の平均値を示すグラフ。 FS-1C株の死菌体をラットに投与したときの血清中性脂肪濃度（mM）の平均値を示すグラフ。 FS-1C株の乾燥粉末をマウスに投与した後にウイルス接種したときの各試験群動物の体重変化を示すグラフ。 FS-1C株の乾燥粉末をマウスに投与した後にウイルス接種したときの各試験群動物の肺重量（g）を示すグラフ。 FS-1C株の乾燥粉末をマウスに投与した後にウイルス接種したときの各試験群動物の肺/体重比（％）を示すグラフ。 FS-1C株の乾燥粉末をマウスに投与した後にウイルス接種したときの各試験群動物肺部のウイルス発現量を示すグラフ。 FS-1C株の乾燥粉末をマウスに投与した後にウイルス接種したときの各試験群動物肺部の出血状態の評価結果を示す図。 FS-1C株の乾燥粉末をマウスに投与した後にウイルス接種したときの各試験群動物肺部の炎症細胞浸潤状態の評価結果を示す図。 FS-1C株の乾燥粉末をマウスに投与した後にウイルス接種したときの各試験群動物の肺病理観察結果の例（HE染色、×200倍）を示す図。
　本発明は、鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種であって、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有する、乳酸菌を提供する。
　鮒寿司は、塩漬けにした鮒（フナ）を米飯に漬け込んで発酵させた発酵食品である。本発明の乳酸菌を単離するために用いる鮒寿司は、特に限定されないが、滋賀県産の鮒寿司であってもよい。また、鮒寿司に用いる鮒は、特に限定されないが、たとえばニゴロブナ、ゲンゴロウブナおよびギンブナなどを用いることができる。
　鮒寿司から本発明の乳酸菌を単離する方法については、従来公知の方法を用いることができる。簡潔には、まず鮒寿司から乳酸菌を単離する。たとえば、鮒寿司を食塩水等に懸濁して希釈溶液を作製する。次いで、寒天培地などの適切な培地に希釈溶液を播種する。播種した培地を37℃等の適切な温度において培養し、コロニーを生成させる。このコロニーを採取して単離株を得る。単離株は、一旦増殖させてもよい。次いで、採取した単離株を使用して魚のすり身を発酵させ、すり身を発酵させる能力がある菌株を選択して単離する。たとえば、12.5％のすり身を含む培地に単離株（約1000CFU/g）を播種し、32℃で2日間培養したときに、菌数が2×107CFU/g以上となった場合、好ましくは菌数が2×107CFU/g以上であり、かつpH4.2以下となった場合、より好ましくは菌数が2×108CFU/g以上となった場合、特に好ましくは菌数が2×108CFU/g以上であり、かつpH4.2以下となった場合に、すり身を発酵させる能力があると判定することができる。魚のすり身は、任意の魚に由来するすり身であることができ、たとえば上記ニゴロブナ、ゲンゴロウブナおよびギンブナなどの鮒のすり身であることができる。また、すり身は、水等と共にフードプロセッサーで粉砕した後、オートクレーブ等で加熱殺菌したすり身を使用することができる。
　本発明の乳酸菌は、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用のいずれか1つのみを有していてもよいし、任意の2つの作用を有していてもよいし、これら全ての作用を有していてもよい。
　本明細書において「乳酸菌がウイルス感染抑制作用を有する」とは、たとえば、乳酸菌の菌体、培養物または処理物をヒトまたはマウス等の動物に投与した後、ウイルスを当該動物に接種したときに、当該乳酸菌の菌体、培養物または処理物を投与しなかった場合と比較して、ウイルス感染が抑制されることを含む。「ウイルス感染抑制作用を有する」乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、まず乳酸菌の乾燥粉末を対象動物に投与する。たとえば、2mg/mL～20mg/mLの濃度に調整した乳酸菌の懸濁液をマウスなどの対象動物に対して1日1回、連続して14日間投与する。次いで、H1N1ウイルスなどの懸濁液（たとえば、濃度1×104 TCID50）をマウスに投与する。ウイルス接種の3日後にウイルス感染の症候を評価する。ウイルス感染の症候は、たとえば体重の減少、肺重量の増加、肺/体重比の変動、肺におけるウイルス感染のPCRによる測定および病理観察による出血状態などによって評価することができる。乳酸菌を投与した動物と投与していない動物において上記症候を比較して、ウイルス感染を抑制することができたか否かを評価することができる。
　本明細書において「乳酸菌がNK活性亢進作用を有する」とは、たとえば、乳酸菌の菌体、培養物または処理物を末梢血単核球に添加して培養したときに、当該乳酸菌の菌体、培養物または処理物を添加しなかった場合と比較して、NK活性が高くなることを含む。また、本明細書において「乳酸菌がNK活性亢進作用を有する」とは、たとえば、乳酸菌の菌体、培養物または処理物を末梢血単核球に添加して培養したときに、当該乳酸菌の菌体、培養物または処理物を添加しなかった場合と比較して、インターフェロンγおよびインターロイキン12などの炎症性サイトカインの産生が向上することを含む。「NK活性亢進作用を有する」乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、乳酸菌をリン酸緩衝塩溶液中に懸濁し、加熱殺菌して死菌液を調製する。次いで、ヒトから採取した末梢血単核球（PBMC）の培養液に死菌液を添加し、37℃、5％CO2下で20時間培養する。培養終了後、2000rpmで5分間遠心し、上清をサイトカイン測定用に使用し、沈渣のPBMCをNK活性の測定に使用する。インターフェロンγおよびインターロイキン12などの炎症性サイトカインの産生は、市販のELISA法によるキットなどを使用して測定することができる。NK活性は、上記の刺激したPBMCをエフェクター細胞として使用し、ヒトNK細胞感受性株であるK562細胞などを標的細胞として使用し、両者を共に培養してNK細胞によって傷害された標的細胞の割合から算出することができる。傷害された標的細胞は、たとえばヨウ化プロピジウム（PI：Propidium Iodide）による染色の有無によって測定することができる。傷害されて死滅した標的細胞は、ヨウ化プロピジウムによって染色されるため、障害の有無を測定することができる。
　本明細書において「乳酸菌が脂質減少作用を有する」とは、たとえば、乳酸菌の菌体、培養物または処理物をラットまたはマウス等の動物に投与したときに、当該乳酸菌の菌体、培養物または処理物を投与しなかった場合と比較して、中性脂肪および／または内臓脂肪量が低下することを意味する。「脂質減少作用を有する」乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、乳酸菌の乾燥粉末を含む餌（乳酸菌群）および含まない餌（対照群）を対象動物に投与する。たとえば、餌の組成の2％程度の乳酸菌を配合した餌（乳酸菌群）と配合していない餌（対照群）をラットなどの対象動物に対して連続して14日間投与する。各対象動物について、毎日、摂餌量、体重および糞重量などを測定する。14日後に対象動物から血液、肝および脂質を採材して、血中中性脂肪、各臓器の周囲の脂質量を測定する。対照群と比較して乳酸菌群において中性脂肪および／または内臓脂肪の低下が測定されれば、その乳酸菌は、脂質減少作用を有する。
　本明細書において「乳酸菌が血中中性脂肪低下作用を有する」とは、たとえば、乳酸菌の菌体、培養物または処理物をラットおよびマウス等の動物に投与したときに、当該乳酸菌の菌体、培養物または処理物を投与しなかった場合と比較して、血中中性脂肪濃度が低下することを意味する。「血中中性脂肪低下作用を有する」乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、乳酸菌の乾燥粉末を含む餌（乳酸菌群）および含まない餌（対照群）を対象動物に投与する。たとえば、餌の組成の2％程度の乳酸菌を配合した餌（乳酸菌群）と配合していない餌（対照群）をラットなどの対象動物に対して連続して14日間投与する。各対象動物について、毎日、摂餌量、体重および糞重量などを測定する。14日後に対象動物から血液、肝および脂質を採材して、血中中性脂肪、各臓器の周囲の脂質量を測定する。対照群と比較して乳酸菌群において中性脂肪の低下が測定されれば、その乳酸菌は、血中中性脂肪低下作用を有する。
　本明細書において「乳酸菌が便通改善作用を有する」とは、たとえば、乳酸菌の菌体、培養物または処理物をラットまたはマウス等の動物に投与したときに、当該乳酸菌の菌体、培養物または処理物を投与しなかった場合と比較して、糞重量が増加することを意味する。「便通改善作用を有する」乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、乳酸菌の乾燥粉末を含む餌（乳酸菌群）および含まない餌（対照群）を対象動物に投与する。たとえば、餌の組成の2％程度の乳酸菌を配合した餌（乳酸菌群）と配合していない餌（対照群）をラットなどの対象動物に対して連続して14日間投与する。各対象動物について、毎日、摂餌量、体重および糞重量などを測定する。対照群と比較して乳酸菌群において糞重量の増加が測定されれば、その乳酸菌は、便通改善作用を有する。
　本明細書において「乳酸菌の培養物」には、乳酸菌の生菌体、死菌体、これらの濃縮物、乾燥物、破砕物、培養液、培養液抽出物および発酵液などが含まれる。本明細書において「乳酸菌の処理物」には、乳酸菌の生菌体または死菌体を熱処理および酵素処理などによって処理したものが含まれる。
　乳酸菌の培養には、公知の培地および培養方法を用いることができる。培地には、たとえばMRS培地、GAM培地およびLM17培地などを用いることができる。また、培地には、必要に応じて無機塩類、ビタミン類、アミノ酸、抗生物質および血清等を添加することができる。培養は、たとえば25～40℃で数時間から数日間行うことができる。
　本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラム亜種プランタラム（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）FS-1C株（受託番号NITE ABP-02791）（以下、単に「FS-1株」ともいう。）であることができる。
　FS-1C株は、鮒寿司から単離された菌株であり、下記の実施例において示すように、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用を有する。これらの菌株は、発酵の際に乳酸のみを生産するホモタイプの乳酸菌である。本発明の乳酸菌は、培養中に細胞外多糖類（EPS）を産生するが、EPSをほとんど産生しないものであってもよい。
　本発明の乳酸菌は、菌体そのものであってもよいし、培養物または処理物であってもよい。本発明の乳酸菌は、培養した菌体を濃縮および乾燥させて得た生菌末の態様であってもよい。このような生菌末は、たとえばヨーグルトなどの発酵物を製造する際の種菌として用いることができる。
　また、本発明の乳酸菌は、培養した菌体を殺菌した後に濃縮および乾燥させて得た死菌末の態様であってもよい。このような死菌末は、温度帯および製品形態を選ばず、様々な医薬、化粧品および食品に添加することが可能である。
　また、本発明の乳酸菌は、乳を発酵させて得た発酵液の態様であってもよく、たとえば生菌乳製品乳酸菌飲料および殺菌乳製品乳酸菌飲料などであってもよい。
　本発明はまた、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、ウイルス感染抑制剤を提供する。本明細書において「ウイルス感染抑制」には、ウイルスによる感染の抑制、防止および改善が含まれる。本発明のウイルス感染抑制剤は、ウイルス感染を予防または治療するための医薬、ならびにウイルス感染を予防するための化粧品および食品に用いることができる。ウイルスには、特に限定されないが、インフルエンザウイルス等が含まれる。
　本発明はまた、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、NK活性亢進剤を提供する。本明細書において「NK活性亢進」には、NK細胞の活性化および促進が含まれる。本発明のNK活性亢進剤は、NK細胞を活性化することによって予防または治療され得る疾患を予防または治療するための医薬に用いることができる。また、本発明のNK活性亢進剤は、NK細胞を活性化するための化粧品および食品に用いることができる。
　本発明はまた、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、脂質減少剤を提供する。本明細書において「脂質減少」には、内臓脂肪の減少および血中の脂質の低下などが含まれる。本発明の脂質減少剤は、脂質を減少させることによって予防または治療され得る疾患を予防または治療するための医薬に用いることができる。また、本発明の脂質減少剤は、脂質を減少させるための化粧品および食品に用いることができる。
　本発明はまた、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、血中中性脂肪低下剤を提供する。本明細書において「血中中性脂肪低下」には、血中中性脂肪濃度の低下および減少が含まれる。本発明の血中中性脂肪低下剤は、血中中性脂肪を低下させることによって予防または治療され得る疾患を予防または治療するための医薬に用いることができる。また、本発明の血中中性脂肪低下剤は、血中中性脂肪を低下するための化粧品および食品に用いることができる。
　本発明はまた、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、便通改善剤を提供する。本明細書において「便通改善」には、排泄の促進、糞重量の増加および便秘の症状の改善などが含まれる。本発明の便通改善剤は、たとえば便秘の症状を予防、改善または治療するための医薬に用いることができる。また、本発明の便通改善剤は、便通を改善するための化粧品および食品に用いることができる。
　本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤は、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物そのものであってもよいし、製剤化したものであってもよい。また、本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤は、本発明の乳酸菌以外の有効成分をさらに含有してもよい。
　本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤の製剤化には、通常用いられる製剤化方法を用いることができる。本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤は、有効成分の他に、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、風味改善剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤およびアルコール類などを含有してもよい。本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤は、経口製剤または非経口製剤の態様であることができる。本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤は、錠剤、散剤、顆粒剤、粉末、カプセル剤、ドリンク剤、注射剤、座剤、懸濁剤、軟膏剤、液剤、貼付剤および外用剤などの任意の形態であることができる。
　本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤の投与量は、投与する対象の年齢、体重および症状の程度などにより適宜設定することができる。たとえば、1日あたり1×104～1×1014、好ましくは1×105～1×1013、より好ましくは1×106～1×1012、さらに好ましくは1×107～1×1011、特に好ましくは1×108～1×1010の数の乳酸菌に相当する菌体、培養物または処理物を含有する剤を、1日1回または数回に分けて投与してもよい
　本発明はまた、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物を含む医薬を提供する。本発明の医薬は、ウイルス感染を予防または治療するための医薬、免疫作用を活性化することによって予防もしくは治療され得る疾患を予防もしくは治療するための医薬、脂質を減少させるための医薬、内臓脂肪を減少させるための医薬、血中中性脂肪を低下させるための医薬または便通を改善するための医薬であることができる。本発明の医薬は、上述した本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤と同様の構成であることができる。
　本発明はまた、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物を含む化粧品を提供する。本発明の化粧品は、ウイルス感染を予防するための化粧品、免疫作用を活性化するための化粧品、脂質を減少させるための化粧品、内臓脂肪を減少させるための化粧品、血中中性脂肪を低下するための化粧品または便通を改善するための化粧品であることができる。本発明の化粧品は、上述した本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤と同様の構成であってもよい。
　本発明の化粧品は、ヒトを含む動物の皮膚、粘膜、体毛、頭髪、爪、歯および口唇などに適用される任意の化粧品であることができる。本発明の化粧品は、たとえば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス、美容液、パックおよびマスク等の基礎化粧品；ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナーおよびマスカラ等のメークアップ化粧品；マニキュア、ベースコート、トップコートおよび除光液等のネイル化粧料；ならびにマッサージ用剤、クレンジング用剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ボディソープ、石けん、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、整髪料、ヘアートニック剤、育毛剤、制汗剤および入浴剤等の形態であることができる。
　本発明はまた、上述した乳酸菌の菌体、培養物または処理物を含む、ウイルス感染抑制用、NK活性亢進用、脂質減少用、内臓脂肪減少用、血中中性脂肪低下用または便通改善用の食品組成物を提供する。本発明の食品組成物は、上述した本発明のウイルス感染抑制剤、NK活性亢進剤、脂質減少剤、血中中性脂肪低下剤および便通改善剤と同様の構成であることができる。また、本発明の食品組成物は、乳飲料、ヨーグルト、発酵乳、チーズ、アイスクリームおよびクリームなどの乳製品；漬物、キムチ、鮒寿司などの発酵食品；レトルト食品、即席麺、即席スープおよびフリーズドライなどの即席食品；清涼飲料、乳酸菌飲料、ジュース、コーヒー、お茶およびアルコール飲料などの飲料；パン、パスタ、麺、パン粉およびケーキミックスなどの小麦粉製品；菓子類；調味料；油脂類；農産加工品；および冷凍食品などの形態であることができる。
　本発明の食品組成物は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、サプリメント、プロバイオティック製品および病者用食品などであってもよい。また、本発明の食品組成物は、「ウイルス感染抑制」、「NK活性亢進」、「脂質減少」、「内臓脂肪減少」、「血中中性脂肪低下」または「便通改善」のために用いられるものである旨の表示を付した態様であることができる。
　本発明はまた、鮒寿司から、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有するラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌をスクリーニングする方法を提供する。
　本発明のスクリーニングする方法は、鮒寿司から乳酸菌を単離する工程（単離工程）と、単離工程において採取した単離株を用いて魚のすり身を発酵させ、すり身が発酵されたときに当該単離株を選択する工程（発酵工程）と、選択された単離株が、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用または便通改善作用を有することを試験する工程（試験工程）とを有する。
　単離工程において、鮒寿司から乳酸菌を単離する方法については、従来公知の方法を用いることができる。たとえば、鮒寿司を液体に懸濁して希釈した希釈溶液を寒天培地に播種する。まず、鮒寿司を滅菌した水、食塩水または培地溶液等の液体に懸濁し、懸濁液を作製する。次いで、この懸濁液を水、食塩水または培地溶液等の希釈液を用いて適切な濃度に希釈する。たとえば、懸濁液を、3～10段階の5～10倍希釈系列を作製してもよい。たとえば、10倍、100倍、1000倍および10000倍などに希釈した希釈系列を作製することができる。次いで、作製した希釈溶液を寒天培地などの培地に播種する。寒天培地には、乳酸菌の培養に通常用いる公知の培地を用いることができる。また、寒天培地に播種する方法は、特に限定されない。
　次いで、播種した培地を培養して、コロニーを生成させる。たとえば、希釈溶液を播種した寒天培地を培養する工程では、寒天培地を25～37℃等の適切な温度で培養する。単離株を得るためには、たとえば生育したコロニーを採取して、単一のコロニーを滅菌した楊枝または白金耳などで穿刺し、別の培地に植菌する。得られた単離株を以下の手順に使用する。単離株は、一旦増殖させてもよい。
　発酵工程では、単離工程において採取した単離株を用いて、魚のすり身を発酵させ、すり身が発酵されたときにその単離株を選択する。たとえば、すり身を含む培地に単離株を播種して培養し、菌数が増えた場合に、すり身が発酵されたと判定することができる。より具体的には、たとえば、12.5％のすり身を含む培地に単離株（約1000CFU/g）を播種し、32℃で2日間培養したときに、菌数が2×107CFU/g以上となった場合、好ましくは菌数が2×107CFU/g以上であり、かつpH4.2以下となった場合、より好ましくは菌数が2×108CFU/g以上となった場合、特に好ましくは菌数が2×108CFU/g以上であり、かつpH4.2以下となった場合に、すり身が発酵されたと判定してもよい。本工程において、魚のすり身は、任意の魚に由来するすり身であることができ、たとえば上記ニゴロブナ、ゲンゴロウブナおよびギンブナなどの鮒のすり身であることができる。また、すり身は、水等と共にフードプロセッサーで粉砕した後、オートクレーブ等で加熱殺菌したすり身を使用することができる。
　試験工程では、発酵工程において選択した単離株について、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有するか否かを試験する。これらのいずれかの作用を有するラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌を本発明の乳酸菌として選択することができる。
　ウイルス感染抑制作用を有する乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、まず乳酸菌の乾燥粉末を対象動物に投与する。たとえば、2mg/mL～20mg/mLの濃度に調整した乳酸菌の懸濁液をマウスなどの対象動物に対して1日1回、連続して14日間投与する。次いで、H1N1ウイルスなどの懸濁液（たとえば、濃度1×104 TCID50）をマウスに投与する。ウイルス接種の3日後にウイルス感染の症候を評価する。ウイルス感染の症候は、たとえば体重の減少、肺重量の増加、肺/体重比の変動、肺におけるウイルス感染のPCRによる測定および病理観察による出血状態などによって評価することができる。乳酸菌を投与した動物と投与していない動物において上記症候を比較して、ウイルス感染を抑制することができたか否かを評価することができる。
　NK活性亢進作用を有する乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、乳酸菌をリン酸緩衝塩溶液中に懸濁し、加熱殺菌して死菌液を調製する。次いで、ヒトから採取した末梢血単核球（PBMC）の培養液に死菌液を添加し、37℃、5％CO2下で20時間培養する。培養終了後、2000rpmで5分間遠心し、上清をサイトカイン測定用に使用し、沈渣のPBMCをNK活性の測定に使用する。インターフェロンγおよびインターロイキン12などの炎症性サイトカインの産生は、市販のELISA法によるキットなどを使用して測定することができる。NK活性は、上記の刺激したPBMCをエフェクター細胞として使用し、ヒトNK細胞感受性株であるK562細胞などを標的細胞として使用し、両者を共に培養してNK細胞によって傷害された標的細胞の割合から算出することができる。傷害された標的細胞は、たとえばヨウ化プロピジウム（PI：Propidium Iodide）による染色の有無によって測定することができる。傷害されて死滅した標的細胞は、ヨウ化プロピジウムによって染色されるため、障害の有無を測定することができる。
　脂質減少作用を有する乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、乳酸菌の乾燥粉末を含む餌（乳酸菌群）および含まない餌（対照群）を対象動物に投与する。たとえば、餌の組成の2％程度の乳酸菌を配合した餌（乳酸菌群）と配合していない餌（対照群）をラットなどの対象動物に対して連続して14日間投与する。各対象動物について、毎日、摂餌量、体重および糞重量などを測定する。14日後に対象動物から血液、肝および脂質を採材して、血中中性脂肪、各臓器の周囲の脂質量を測定する。対照群と比較して乳酸菌群において中性脂肪および／または内臓脂肪の低下が測定されれば、その乳酸菌は、脂質減少作用を有する。
　血中中性脂肪低下作用を有する乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、乳酸菌の乾燥粉末を含む餌（乳酸菌群）および含まない餌（対照群）を対象動物に投与する。たとえば、餌の組成の2％程度の乳酸菌を配合した餌（乳酸菌群）と配合していない餌（対照群）をラットなどの対象動物に対して連続して14日間投与する。各対象動物について、毎日、摂餌量、体重および糞重量などを測定する。14日後に対象動物から血液、肝および脂質を採材して、血中中性脂肪、各臓器の周囲の脂質量を測定する。対照群と比較して乳酸菌群において中性脂肪の低下が測定されれば、その乳酸菌は、血中中性脂肪低下作用を有する。
　便通改善作用を有する乳酸菌は、たとえば実施例に記載した手順で確認することができる。簡潔には、乳酸菌の乾燥粉末を含む餌（乳酸菌群）および含まない餌（対照群）を対象動物に投与する。たとえば、餌の組成の2％程度の乳酸菌を配合した餌（乳酸菌群）と配合していない餌（対照群）をラットなどの対象動物に対して連続して14日間投与する。各対象動物について、毎日、摂餌量、体重および糞重量などを測定する。対照群と比較して乳酸菌群において糞重量の増加が測定されれば、その乳酸菌は、便通改善作用を有する。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　〔実施例1：FS-1株の同定〕
　滋賀県産の鮒寿司からスクリーニングより単離された乳酸菌FS-1株を同定した。具体的には、以下に説明する方法によりスクリーニングを行った。まず、魚のすり身を、当量の純水と共に家庭用フードプロセッサーで撹拌したのち、オートクレーブで115℃15分間加熱滅菌した。次いで、12.5％すり身、1.4％寒天、20μg/mlブロムクレゾールパープルおよび0.5％グルコースを含む培地を作製し、菌株（1000CFU/g）を播種し、32℃で2日間培養した後の菌数（CFU/g）およびpHを測定した。菌数が2×108CFU/g以上であり、pH4.2以下であった株を、最も良好な菌株とした。上記スクリーニングで基準を超えた株（最も良好な菌株）は、6株であった。
　FS-1株は唯一、鮒の卵部分のみから分離された株であった。また、FS-1株は、発酵の際に乳酸のみを生産するホモタイプであり、同時に単離した他の株と比較し増殖速度が速く、増殖の際に非常に粘度の高い細胞外多糖類（EPS）を産生した。更に、同時に同定された菌株とFS-1株を魚のすり身懸濁液に接種したところ、FS-1株は特異的に増殖速度が速いだけでなく、魚のすり身由来の汚染菌の増殖も抑制することが分かった。その他、乳、魚、肉および米を発酵させることができ、なかでも肉、魚、米の発酵に適していた。FS-C株を用いて乳を発酵させると、カスピ海ヨーグルト様のテクスチャーとなった。FS-1株による乳、魚、肉および米の発酵は、通常の発酵手順で行った。具体的には、乳および米の発酵については、液状にして殺菌した乳または米の溶液にFS-1株の生菌を混合し、35～40℃程度で17～24時間程度発酵させた。肉および魚については、FS-1株を用いて作製したヨーグルト（上述の乳発酵物）に肉または魚を漬けて冷蔵庫で1～2日程度発酵させた。
　このFS-1株について、全遺伝子解析を行い、ラクトバチルス・プランタラム亜種プランタラムFS-1C（FS-1）と命名した。
　〔実施例2：血中中性脂肪、脂質および糞便に対する効果〕
　乳酸菌には、FS-1株の死菌体を用いた。4週齢のSDラットオスを対照（コントロール）群および乳酸菌群（死菌体2％配合群；FS-1群）に分け、それぞれに対して表1に示した組成の餌を14日間投与した（各群n=8)。各ラットについて、毎日、摂餌量、体重および糞重量を測定した。14日後には、ラットから血液および脂質を採材した。血液は、３０００rpm１５分間遠心（トミー工業株式会社AX-311）を行い、血清を回収し、血清中の中性脂肪濃度をトリグリセライド　E-テストワコー（Wako社）を用いて測定した。脂質は、採材後重量を測定した。
　各群とも、14日間の摂餌量および体重には変化が見られなかった（図示せず）。それぞれの群における糞重量（g）の個々の測定値および平均値については表2に示した。また、それぞれの群における糞重量（g）の平均値を示すグラフを図1に示した。図1および表2から明らかなように、本乳酸菌の投与により、コントロール群に対し、乳酸菌群では糞重量が有意に増加した。
　また、それぞれの群における個々の血清中性脂肪濃度（mM）の測定値および平均値については表3に、血清中性脂肪濃度（mM）の平均値を示すグラフを図2に示した。図2および表3から明らかなように、本乳酸菌の投与により、コントロール群に対し、乳酸菌群では血中の中性脂肪が有意に減少した。
　また、それぞれの群における内臓脂肪重量の評価のため、腎周囲脂肪（ｇ）、腸間膜脂肪（ｇ）及び副睾丸周囲脂肪（ｇ）を測定し、それぞれの平均値について表４に示した。表４から明らかなように、本乳酸菌の投与により、コントロール群に対し、乳酸菌群では、腎周囲脂肪、腸間膜脂肪及び副睾丸周囲脂肪のいずれもが低下し、このことから内臓脂肪量が減少することが確認された。特に腎周囲脂肪はコントロール群に比べ、約１０％の大きな減少を示した。
　これらの結果から、本乳酸菌は、便通改善効果、脂質減少効果、血中中性脂肪の減少効果および内臓脂肪の減少効果を有することが明らかとなった。
　実施例2に用いた餌の組成の重量比を下記に示す。コントロール群に用いた餌の組成は「Control」として示し、乳酸菌群に用いた餌の組成は「乳酸菌」として示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例2で14日間摂餌させて飼育したコントロール群、乳酸菌群における14日目24時間の糞重量（g）の平均値を下記に示す。T.testはこれらの値に基づいたコントロール群の糞重量に対する乳酸菌群の糞重量とのｔ検定を行う場合のｔ値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例2で14日間摂餌させて飼育したコントロール群、乳酸菌群における血清中性脂肪濃度（mM）の平均値について下記に示す。T.testはこれらの値に基づいたコントロール群の血清中性脂肪濃度に対する乳酸菌群の血清中性脂肪濃度とのｔ検定を行う場合のｔ値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　14日間摂餌させて飼育したコントロール群、乳酸菌群における腎周囲脂肪（g）、腸間膜脂肪（g）及び副睾丸周囲脂肪（g）の平均値について下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　〔実施例3：インフルエンザウイルス感染に対する抑制効果〕
　本実施例において、各図はMean±SEで表記した。図3～6はT. Test検定、図7～8はWillcox検定を実施し、＊：P < 0.05、＃：P < 0.1で表記した。
　（材料）
　試験試料として、FS-1株の乾燥粉末（Lot.001）を用いた。陽性対照には、「補中益気湯」顆粒（TJ-41）（株式会社ツムラ）を用いた。試験ウイルスにはA/Puerto Rico/8/34 (H1N1)を用いた。試料動物には、BALB/cマウス、5～6週齢、雌を用いた。
　（試験サンプルの調製）
　試験試料であるFS-1乾燥粉末を正確に秤量し、0.5%CMC-Na（Sodium Carboxymethyl Cellulose）水溶液を加え、2mg/mLおよび20mg/mLの濃度の均一な懸濁液を作製した。陽性対照は、試験試料と同様の方法で、10mg/mLの懸濁液を作製した。
　（試験群と試験サンプル投与量）
　マウスを正常対照群（Nor Cont；Nor C）、モデル対照群（Mod Cont；Mod C）、陽性対照群（Pos Cont；Pos C）、試料低投与群（FS-1 L）および試料高投与群（FS-1 H）の5つに分けた（各群n=10)。各群に対する投与量は表5に示す。なお、正常対照群とモデル対照群には0.5%CMC-Na水溶液のみを投与した。Doseは投与した試料の濃度と投与量から算出した。
　試験群への試験サンプルの投与条件について下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（試験サンプル投与とウイルス接種）
　試験サンプルは1日1回、連続14日間で経口により投与してマウスを飼育した。その後、正常対照群は40μlのPBS（Phosphate buffered saline）、その他の試験群は40μlのH1N1ウイルス懸濁液（濃度1×104 TCID50）を点滴投与した。なお、投与とその後の試験はBiosafety level 2（BSL-2）の試験室で行った。
　（試験評価）
　ウイルス接種の3日後に試験を終了し、各群について、体重、肺重量、肺/体重比を測定し、肺PCR（右側）および病理観察（左側）を評価した。
　（体重）
　ウイルス接種後の各試験群動物の体重（g）の測定結果を表6および図3に示す。D0～D3は、それぞれウイルス接種の0日～3日目の体重を占める。ウイルス接種した各群において、接種3日目の体重は、正常対照群に比べて、顕著な低下を示した。
　実施例3で用いたウイルス摂取後の各試験群動物の体重（g）の測定結果を平均値として下記に示す。SDは標準偏差を、SEは標準誤差を、T.Testはこれらの値に基づいた正常対照群(Nor C)に対する他の群とのｔ検定を行う場合のｔ値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（肺重量と肺重量比）
　ウイルス接種後の各試験群動物の肺重量（g）の測定結果は表7および図4に示す。肺/体重比（％）の算出結果は表7および図5に示す。ウイルス接種により、モデル対照群（Mod C）動物の肺重量が増加した。これに対して試料低投与群（FS-1 L）および試料高投与群（FS-1 H）では、ウイルス感染による肺重量の増加が有意に抑制された。
　実施例3で用いたウイルス接種後の各試験群動物の肺重量（g）の測定結果を平均値として下記に示す。SDは標準偏差を、SEは標準誤差を、T.Testの上段はこれらの値に基づいたモデル対照群(Med C)に対する他の群とのｔ検定を行う場合のｔ値を示す。T.Testの下段は同様に正常対照群(Nor C)に対する他の群とのｔ検定を行う場合のｔ値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（肺PCR）
　ウイルス接種した各群の動物肺部のウイルス感染状況をPCRで測定した。採材した肺は、EasyPure Viral DNA/RNA Kit（TransGen Biotech社）を用いて溶解し、RNAを抽出・濃縮し、NanoDrop 2000c超微量分光光度計（Thermo Fisher　Scientific社）でRNA濃度を測定した。その後、Eppendorf Realplex分光蛍光光度計(Eppendorf社)を用いて、各サンプル中のリアルタイムRNAの相対発現量を測定した。なお、測定時に内部標準としてGAPDHを使用し、測定値の補正を行った。測定結果を表8および図6に示す。モデル対照群(Mod C)に比べて、試料高投与群（FS-1 H）のウイルス発現量が抑制される傾向を示した。
　実施例３で用いたウイルス接種後の各試験群動物の肺部のウイルスRNA相対発現量の測定結果を下記に示す。SDは標準偏差を、SEは標準誤差を、T.Test vs Mod Cはこれらの値に基づいたモデル対照群(Mod C)に対する他の群とのｔ検定を行う場合のｔ値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（肺病理観察）
　肺病理観察により、出血状態を観察した。出血状態は、出血あり（＋）、出血なし（－）として各個体を評価した。ウイルス接種した各群動物肺部の出血状態の評価結果を表9および図7に示す。
　表9および図7に示すように、ウイルス接種により、動物の肺部がダメージを受け、出血現象が現れた。モデル対照群(Mod C)において、半数以上の動物に出血が確認された。しかし、これに比べて、試料低投与群(FS-1 L)および試料高投与群(FS-1 H)に出血抑制傾向が見られ、特に試料高投与群(FS-1 H)には高い出血抑制効果が観察された。Wilcoxonの順位和検定の結果から、試料低投与群(FS-1 L)および試料高投与群(FS-1 H)に見られたモデル対照群(Mod C)との差は有意であると考えられた。
　実施例３で用いたウイルス接種後の各試験群動物の肺の出血状態の観察による評価結果を下記に示す。各個体は出血状態を出血あり（＋）、出血なし（－）のいずれかとして評価し、出血あり（＋）として評価された個体の合計数を＋、出血なし（－）として評価された個体の合計数をーとして表中に示す。表の下のvs Mod Cは、試料低投与群(FS-1 L)とモデル対照群(Mod C)とでWilcoxonの順位和検定を行った場合の検定値をFS-1 Lの下に、試料高投与群(FS-1 H)とモデル対照群(Mod C)とでWilcoxonの順位和検定を行った場合の検定値をFS-1 Hの下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　また、肺病理観察により、炎症細胞浸潤状態を観察した。炎症細胞浸潤状態は、病理切片を確認することにより、変化なし（－）、軽微な変化（＋）、軽度な変化（＋＋）、中度な変化以上（＋＋＋）として各個体を評価した。ウイルス接種した各群動物肺部の病理観察結果を表10に示す。また、ウイルス接種した各群動物肺部の炎症細胞浸潤状態の評価結果を図8に示す。肺病理観察結果の例（HE染色、×200倍）を図9に示す。
　表10、図8および図9に示すように、ウイルス接種により、動物の肺部組織に炎症細胞の浸潤現象が現れた。特にモデル対照群(Mod C)において、半数以上の動物に“軽度な変化”が確認された。しかし、これに比べて、試料低投与群および試料高投与群には感染抑制傾向が見られ、特に試料高投与群(FS-1 H)には、顕著な感染抑制効果が見られた。Wilcoxonの順位和検定の結果から、試料低投与群(FS-1 L)および試料高投与群(FS-1 H)に見られたモデル対照群(Mod C)との差は有意であると考えられた。
　実施例3で用いたウイルス接種後の各試験群動物の肺の病理観察による評価結果を下記に示す。各個体の炎症細胞浸潤状態は、病理切片を確認することにより、変化なし（－）、軽微な変化（＋）、軽度な変化（＋＋）、中度な変化以上（＋＋＋）のいずれかとして評価し、中度な変化以上（＋＋＋）として評価された個体の合計数を＋＋＋、軽度な変化（＋＋）として評価された個体の合計数を＋＋、軽微な変化（+）として評価された個体の合計数を＋、出血なし（－）として評価された個体の合計数をーとして表中に示す。表の下のvs Mod Cは、陽性対照群(Pos C)とモデル対照群(Mod C)とでWilcoxonの順位和検定を行った場合のモデル対照群(Mod C)に対する検定値をPos Cの下に、試料低投与群(FS-1 L)とモデル対照群(Mod C)とでWilcoxonの順位和検定を行った場合のモデル対照群(Mod C)に対する検定値をFS-1 Lの下に示す。試料高投与群(FS-1 H)とモデル対照群(Mod C)とでWilcoxonの順位和検定を行った場合のモデル対照群(Mod C)に対する検定値をFS-1 Hの下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　〔実施例4：NK活性に対する効果〕
　（材料）
　菌株は、ラクトバチルス・プランタラム亜種プランタラムFS-1株を用いた。FS-1株は、MRS培地（Difco社）を用いて30℃で24時間増殖させ、マイナス70℃で凍結保存したものを種菌とした（FS-1C株）。
　（試験サンプルの調製）
　種菌試料：MRS培地で増殖させた菌株（FS-1株）を遠心して集菌し、生理食塩水で洗菌後、リン酸緩衝塩溶液で108CFU/mlに調整して98℃で5分間加熱殺菌して死菌液とした。
　末梢血単核球：試験当日に健常人から末梢血を採血し、フィコール法によって末梢血単核球（PBMC）を分離した。PBMCを10%ウシ胎仔血清（FCS）含有RPMI1640培地で2×106/ml濃度に調整し、24穴プレートにウェルあたり500μlを分注した。次に刺激物質として死菌液を50μlずつ加え、37℃、5％CO2下で20時間培養した。
　対照試料：上述と同様の方法で、刺激物質の代わりにPBSを加え、対照試料を調製した。
　（試験評価）
　培養終了後、2000rpmで5分間遠心し、上清はサイトカイン測定用に凍結保存し、沈渣のPBMCは直ちにNK活性の測定に用いた。
　（測定方法）
　サイトカイン：培養上清に含まれるサイトカインとして、インターフェロンγ（IFN-γ）を市販のELISA法による測定キットAffimetrix/eBioscience）を用いて測定した。また、インターロイキン12（IL-12）も市販のELISAキット（R&D System）を用いて測定した。
　NK活性：エフェクター細胞として刺激したPBMCを用い、標的細胞としてヒトNK細胞感受性株であるK562細胞を用いた。PBMC（2×106cells/ml濃度）を、疎水性シアニン膜系蛍光色素3,3’-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate（DiO）で染色したK562細胞（5×104cells/ml濃度）および膜不透過性核酸系都合蛍光色素Propidium iodide（PI）の存在下で、37℃2時間反応させた（E:T比＝40:1）。傷害されたK562細胞（PI陽性細胞）の割合をフローサイトメーター（Beckman Coulter）で測定することにより、NK活性を測定した。NK活性は以下の式で算出した。
　NK活性(%)＝DiO陽性PI陽性細胞数/（DiO陽性PI陰性細胞数＋DiO陽性PI陽性細胞数）×100-spontaneous lysi
　（試験1）
　試験1における、菌体刺激による免疫機能の変化（PBMCを各種試料で37℃20時間刺激した後の培地中に放出されたサイトカインおよびPBMCに含まれるNK活性）を示す測定結果を表11に示す（Exp.1）。提供者K（60代女性）のPBMCを用いて、FS-1株の菌体、比較のために市販されている乳酸菌株であるカゼイ・シロタ株（Lactobacillus casei）の菌体を試料として試験した。なお、試料中の菌数は、菌体試料が同じ濃度（終濃度107cfu/ml）になるように設定した。
　FS-1株菌体は、炎症性サイトカインであるIL-12およびIFN-γの高い産生を誘導した。NK活性は、未刺激の対照に比べて、FS-1において活性が高かった。これらの結果から、FS-1菌体は、炎症性サイトカインの産生を誘導し、NK活性を亢進させることが分かった。
　（試験2）
　試験1と同じ傾向が他の個体でも見られるかどうかを調べるため、提供者A（60代男性）のPBMCを加えて2種類のPBMCで試験を行った（Exp.2）。結果を表11に示す。
　試験条件は試験1と同様であったが、被験物質の刺激に対するPBMCの反応には多少の個人差が見られ、同一人物でも採血時期によって違いがあった。試験1の結果と異なり、他の乳酸菌のシロタ株によるそれらのサイトカインの産生は低かった。NK活性については、提供者Kおよび提供者AともにFS-1株菌体の刺激で亢進していた。
　試験1および試験2において、IL-12およびIFN-γの産生量は相関していた。IFN-γはIL-12によって活性化されたNK細胞からも産生されるので、IFN-γの産生量はIL-12によるNK細胞の活性化の程度を反映しているのかもしれない。すなわち、菌体のみの刺激での、IL-12の産生誘導、それによるNK細胞の活性化、それによるIFN-γの産生上昇、その後のさらなるNK活性の上昇という流れになる可能性が考えられる。
　これらの試験によって、FS-1株は、ウイルス感染抑制能およびNK活性亢進能が高いことが示された。
　実施例4の試験1（提供者Kのみ）及び試験2（提供者K及びA）における培地中に放出されたサイトカイン（IL-12濃度（pg/ml）、IFN-γ濃度(pg/ml)）及びNK活性（％）を下記に示す。試験１は、提供者Kの末梢血単核球（PBMC）で実施し、試験2では提供者K及びAのPBMCにて試験を実施している。各PBMCはFS-1C株、Shirota株、素材なし（PBS対象）で刺激し、培養している培地の上清よりPBMCにより産生されたIL-12濃度、IFN-γ濃度を測定し下記に示す。また、刺激されたPBMCとK562細胞の共培養後に、K562細胞の障害率を測定し得られるPBMCのNK活性を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本発明の乳酸菌は、ウイルス感染を抑制し、免疫を賦活し、脂質を減少し、血中中性脂肪を低下させ、および／または便通を改善させるための医薬、化粧品および飲食品に利用することができる。

Claims (10)

  1. 　鮒寿司から単離されたラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌であって、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、便通改善作用および血中中性脂肪低下作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有する、乳酸菌。
  2. 　受託番号NITE ABP-02791で寄託されているラクトバチルス・プランタラム亜種プランタラムFS-1C株、乳酸菌。
  3. 　請求項1または2に記載の乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、ウイルス感染抑制剤。
  4. 　請求項1または2に記載の乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、NK活性亢進剤。
  5. 　請求項1または2に記載の乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、脂質減少剤。
  6. 　請求項1または2に記載の乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、血中中性脂肪低下剤。
  7. 　請求項1または2に記載の乳酸菌の菌体、培養物または処理物を有効成分として含有する、便通改善剤。
  8. 　請求項1または2に記載の乳酸菌の菌体、培養物または処理物を含む化粧品。
  9. 　請求項1または2に記載の乳酸菌の菌体、培養物または処理物を含む、ウイルス感染抑制用、NK活性亢進用、脂質減少用、便通改善用または血中中性脂肪低下用食品組成物。
  10. 　鮒寿司から、ウイルス感染抑制作用、NK活性亢進作用、脂質減少作用、血中中性脂肪低下作用および便通改善作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有するラクトバチルス・プランタラム種である乳酸菌をスクリーニングする方法であって、
    　鮒寿司から乳酸菌を単離する工程と、
    　前記単離工程において採取した単離株を用いて魚のすり身を発酵させ、前記すり身が発酵されたときに前記単離株を選択する工程と、
    　選択された前記単離株が、前記ウイルス感染抑制作用、前記NK活性亢進作用、前記脂質減少作用、前記血中中性脂肪低下作用または前記便通改善作用を有することを試験する工程とを有する、スクリーニングする方法。

     
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