JP2010099024A - 抗炎症効果を有する新規植物性乳酸菌株、該菌株を用いた炎症性腸疾患又は慢性下痢症に対する予防及び治療剤、抑制剤並びに添加剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】鮒鮨から単離した、炎症性腸疾患や慢性下痢症に対して抗炎症効果を有するラクトバシラス属に属する新規の植物性乳酸菌株であるラクトバシラス・ブーケンライs193株、ラクトバシラス・パラブーケンライs292株を得る。また、s193株及び又はs292株から得られる菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうち少なくとも一つを有効成分とする予防及び治療剤、抑制剤並びに発酵食品用の添加剤を得る。
【選択図】図1
Description
鮒鮨中には、多種のラクトバシラス属菌やその他の発酵・熟成を担う微生物が多数混在して、フローラを形成している。よって、そのフローラより抗炎症効果を有するラクトバシラス属菌のみを選抜して単離する必要がある。そのため、ラクトバシラス属菌が最も多く存在することが予想される鮒鮨の米・米麹部分1gを破砕し、リン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline (NaCl:0.138M、KCl:0.0027M)、pH7.4、at25℃) に溶解した。
もう一方は、TNF−αのmRNA量をLPS単独群に比し著しく減少させ、IL−12p40及びIL−23p19のmRNA量がLPS単独群に比し、同等であるというパターンであった(パターンB) 。そして、パターンA、Bのうち、最も優れた抗炎症効果を発揮する株をそれぞれ1つ選抜し、パターンAをs193株、パターンBをs292株と命名し、以後の解析に用いた。
図4に示すように、スクリーニングした菌株の細菌学的性質(形態学的及び生化学的特性)を調べたところ、s193株及びs292株はラクトバシラス・ブーケンライとその近縁種の特徴を、共に有していた。
ラクトバシラス・パラブーケンライs292株:FERM P−21649(識別のための表示:Lactobacillus parabuchneri s292 )
(2)s193株又はs292株単独投与及び両株の混合投与による、DSS腸炎における組織学的評価。
(3)s193株又はs292株単独投与及び両株の混合投与による、DSS腸炎における免疫組織化学染色による炎症性細胞浸潤と接着分子発現への影響。
(4)s193株又はs292株単独投与及び両株の混合投与による、DSS腸炎における大腸組織内の炎症性サイトカインmRNA発現量への影響。
・DSS腸炎における体重減少及び大腸腸管長の萎縮を阻止し、生存率を上昇させる。
・DSS腸炎における下痢を抑制することで、腸炎臨床スコアを減じる。
・DSS腸炎における大腸の組織学的障害度を低下させる。
・DSS腸炎における炎症性細胞浸潤及び接着分子発現を低下させる。
・DSS腸炎における大腸組織内の炎症性サイトカインmRNA発現量を低下させる。
しかしながら、従来よリプロバイオティクスとして用いられてきたヒトや動物の消化管若しくは乳製品より単離されたラクトバシラス属菌においては、両サイトカイン抑制の報告は無く、本発明の新規植物性乳酸菌株であるs193株及びs292株に特徴的な作用と言える。
これにより、本発明の新規植物性乳酸菌株であるs193株及びs292株が、炎症性腸疾患の予防及び治療のみならず、慢性下痢症の予防及び治療にも優れた効果を示すに至った。
<材料と方法>
・動物:C57/BL6マウス(雌8週齢)を用いた。
・腸炎モデル:デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)大腸炎モデルマウス(Gastroenteralogy(1990)107、p1643)を用いた。
s193株およびs292株のDSS大腸炎に対する抗炎症効果の検証実験として、以下(A)〜(G)の項目を実施した。
上記に基づいてDSS大腸炎誘発を実施し、s193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与を10日間行い、生死率を算出した。
(B)DSS大腸炎マウスの体重減少率に対するs193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与の影響
上記に基づいてDSS大腸炎誘発を実施し、s193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与を10日間行い、体重減少率を検討した。
(C)DSS大腸炎マウスの腸炎臨床スコアに対するs193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与の影響
上記に基づいてDSS大腸炎誘発を実施し、s193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与を10日間行い、Cooperらの方法(Lab Invest 1993;69;238−49)に若干の改良を行い、腸炎臨床スコアを算出した。すなわち、(1)体重減少率0点;変化なし若しくは増体重、1点;試験1日目に比し、−1%〜−5%、2点;試験1日目に比し、−5%〜−10%、3点;試験1日目に比し、−10%〜−20%、4点;試験1日目に比し、−20%以上(2)糞便の状態0点;通常便、2点;下痢若しくは潜血便、4点;鮮血便(下血)(3)生死状態 0点;生存、8点;死亡とした。
(D)DSS大腸炎マウスの大腸腸管長に対するs193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与の影響
上記に墓ついてDSS大腸炎誘発を実施し、s193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与を7日間行い、大腸腸管長を測定した。
(E)DSS大腸炎マウスの大腸組織障害度に対するs193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与の影響
上記に基づいてDSS大腸炎誘発を実施し、s193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与を7日間行い、大腸組織をフォルマリン固定した。得られた組織よりパラフィン切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色(H&E染色)を行った。組織を観察し、Cooperらの方法(Lab lnvest 1993;69;238−49)により点数化して評価した。
(F)DSS大腸炎マウスのリンパ球及びマクロファージ系細胞浸潤と接着分子発現に対するs193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与の影響
上記に基づいてDSS大腸炎誘発を実施し、s193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与7日間を実施した後、大腸組織を過ヨウ素酸−リジンーパラホルムアルデヒド固定(PLP固定)した。得られた組織より凍結切片を作成し、免疫組織化学染色を実施した。1次抗体に抗CD4抗体、抗CD68抗体及び抗MAdCAM−1抗体を用いる事で、それぞれ、Tリンパ球浸潤、マクロファージ系細胞浸潤及び接着分子MAdCAM−l発現を評価した。
(G)DSS大腸炎マウスの大腸組織内炎症性サイトカインmRNA発現量に対するs193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与の影響
上記に基づいてDSS大腸炎誘発を実施し、s193株単独投与、s292株単独投与及び混合投与を7日間行い、大腸組織を摘出・ホモジナイズした。そして、これより総RNAを抽出した後に、逆転写反応を行いcDNAを合成した。得られたcDNAを用いて定量的PCR法の1つであるリアルタイムPCR法を実施する事で炎症性サイトカインのmRNA発現を定量した。使用したプライマープローブは、IL−1β、IL−6、TNF−α、IL−12p40又はIL−23p19であり、すべて大腸炎の発症・増悪に密接に関与する炎症性サイトカインである。
(A):図7に示すように、6%DSSを10日間、マウスに投与したところ、DSS投与群において、激しい下血などの症状が惹起され、70%の個体が死亡した。しかしながら、s292株単独投与群及びラクトバシラス・ガッセリ投与群では死亡率が50%に減少した。s193株単独投与群では、死亡率は20%に留まった。さらに、混合投与群では、DSS投与10日目に死亡した個体はなく(死亡率0%)、ラクトバシラス・ガッセリ投与群の成績を有意に上回る結果となった。
また、図12に示すように、組織障害度を点数化した結果、ラクトバシラス・ガッセリ投与群ではDSS投与群に比し、有意な炎症スコアの減少は認められなかった。しかしながら、s193単独投与群、s292単独投与群及び混合投与群では、DSS投与群に比し、有意な炎症スコアの減少が認砂られ、特に混合投与群においてはp<0.01以下の有意差をもって、極めて強力に組織障害度を減じた。
同様に、図15に示すように、接着分子MAdCAM−1発現においても、ラクトバシラス・ガッセリ投与群では発現抑制効果が、あまり観察されなかったが、s193単独投与群及びs292単独投与群では、著しい抑制効果が認められた。
その結果、図16、17に示すように、DSS投与群では、対照群に比し、検証した全ての炎症性サイトカインmRNA発現量が増強していた。これに対し、s193単独投与群は、IL−6及びIL−12p40のmRNA発現量が有意に抑制された。s292単独投与群では、IL−1β、IL−12p40及びIL−23p19のmRNA発現量が有意に抑制された。さらに、混合投与群においては、IL−1β、IL−12p40及びTNF−αのmRNA発現量が有意に抑制された。しかしながら、ラクトバシラス・ガッセリ投与群では、DSS群に比し、検証した全ての炎症性サイトカイン血RNA発現量の有意な抑制は認められなかった。
s193株及びs292株を用いて、鮒鮨以外の植物性発酵食品(白菜漬)を、以下の材料と方法にて作成した。
・材料:白菜、食塩、滅菌生理食塩水
・使用する菌株:s193及びs292
さらに、得られた植物性発酵食品(白菜漬)を粉砕し、滅菌生理食塩水と混合しフィルタにて固形物を除去した。得られたサンプルを、MRS寒天培地に塗布し嫌気培養を行ったところ多数のコロニーが出現した。これにより、本発明の菌株を用いて製造した植物性発酵食品(白菜漬)は、生菌のs193株及びs292株を豊富に含有する事が確認された。
Claims (11)
- 鮒鮨から単離され、炎症性腸疾患や慢性下痢症に対して抗炎症効果を有するラクトバシラス属に属する新規の植物性乳酸菌株。
- ラクトバシラス・ブーケンライs193株(受託番号:FERM P−21648)である請求項1記載の植物性乳酸菌株。
- ラクトバシラス・パラブーケンライs292株(受託番号:FERM P−21649)である請求項1記載の植物性乳酸菌株。
- 配列番号1に示す16SrRNAをコードするDNAの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有することを特徴とする請求項2記載の植物性乳酸菌株。
- 配列番号2に示す16SrRNAをコードするDNAの塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有することを特徴とする請求項3記載の植物性乳酸菌株。
- 請求項2又は4記載のラクトバシラス・ブーケンライs193株及び/又は請求項3又は5記載のラクトバシラス・パラブーケンライs292株から得られる菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうち少なくとも一つを有効成分とすることを特徴とする炎症性腸疾患に対する予防および治療剤。
- 請求項2又は4記載のラクトバシラス・ブーケンライs193株及び/又は請求項3又は5記載のラクトバシラス・パラブーケンライs292株から得られる菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物の少なくとも一つを有効成分とすることを特徴とする慢性下痢症に対する予防および治療剤。
- 請求項2又は4記載のラクトバシラス・ブーケンライs193株から得られる菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうち少なくとも一つを有効成分とすることを特徴とするIL−6又はIL−12産生抑制剤。
- 請求項3又は5記載のラクトバシラス・パラブーケンライs292株から得られる菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうち少なくとも一つを有効成分とすることを特徴とするIL−1β又はIL−12又はIL−23産生抑制剤。
- 請求項2又は4記載のラクトバシラス・ブーケンライs193株及び/又は請求項3又は5記載のラクトバシラス・パラブーケンライs292株から得られる菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうち少なくとも一つを有効成分とすることを特徴とするIL−1β又はIL−12又はTNF−α産生抑制剤。
- 発酵食品製造時に使用され、請求項2又は4記載のラクトバシラス・ブーケンライs193株及び/又は請求項3又は5記載のラクトバシラス・パラブーケンライs292株から得られる菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうち少なくとも一つを有効成分とすることを特徴とする添加剤。
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