JPWO2014171478A1 - ラクトバチルス属菌含有組成物 - Google Patents
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Abstract
腸管内に到達後、小腸及び／又は大腸内、好ましくは小腸内での増殖能を有することを特徴とするラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ-１４７９）を含有する組成物。本発明の組成物は、腸管内での増殖能を有する乳酸菌を含有することから、体内に摂取すると、該乳酸菌が腸管内に到達して増殖することで、脂肪吸収を抑制したり、体重増加を抑制したりすることができ、ダイエット効果を目的として好適に用いられる。
Description
本発明は、ラクトバチルス属菌含有組成物に関する。より詳しくは、新規なラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）を含有する組成物に関する。
乳酸菌やビフィズス菌には、整腸効果や免疫賦活効果等の優れた生理活性を有するものがあり、菌種の特性に応じて各種用途に用いられている。なかでも、近年、これらの菌を体内に摂取することによるダイエット効果について研究が進められており、多くの報告が挙げられている。
例えば、特許文献１では、ラクトバチルス・ラムノーサス ＡＴＣＣ５３１０３株が、肥満の原因となる脂質（トリアシルグリセロール）を分解して、体内への吸収を抑制することを報告している。また、植物性乳酸菌の一種であるＬ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＢ２９０が、生きたまま腸内に到達し、腸内生存率ならびに腸管到達性に優れることも知られている（但し、摂取菌数より排泄菌数の方が少ない）（非特許文献１参照）。また、下記非特許文献２は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌ−９２について、摂取菌数の９３％が糞便から回収されていることによって、該菌株の腸管到達性が優れているとしており、下記非特許文献３は、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＳＢＴ２０５５の腸管生存性を調べ、１×１０６〜５×１０６ｃｆｕ／ｇを含む発酵乳１００ｇを投与したところ、糞便中から最大で１×１０５ｃｆｕ／ｇ程度検出されたと報告している。
一方、ビフィズス菌については、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス ＧＣＬ２５０５株が、経口摂取後に生きて腸に到達する腸管到達性を備えるとともに、顕著な腸管内増殖性を示すことが報告されている（特許文献２参照）。下記非特許文献４は、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＤＮ−１７３ ０１０を成人に投与したところ、摂取した菌数に比べて糞便中からＤＮ−１７３ ０１０が２０％程度検出されたと報告している。
「乳酸菌の保健機能と応用」２００７年８月３１日 シーエムシー出版 １６０-１６２頁
日本乳酸菌学会誌 ２００１年１２号「ヒト腸管内で生残性の良いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌ−９２株の単離とその性質」２８−３５頁
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６年５０号「Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＳＢＴ２０５５ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ．」８６７−８７０頁
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８年１４号「Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ＤＮ−１７３ ０１０ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｆｔｅｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｆｏｒｍ ｏｒ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ − ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ａｄｕｌｔｓ．」１２８−１３６頁
しかしながら、脂肪の吸収は主に小腸で行なわれるために、通常大腸で増殖するビフィズス菌が腸管内増殖性を示したとしても、脂肪吸収の抑制は十分ではない。また、乳酸菌は大腸より上流で作用することが知られているが、腸管内で増殖性を示す菌種の報告は未だない。
本発明の課題は、腸管内増殖性を示す乳酸菌を含有する組成物を提供することにある。
本発明は、腸管内での増殖能を有するラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ-１４７９）を含有する組成物に関する。
本発明の組成物は、摂取すると、腸管内で増殖能を有する乳酸菌が増殖することで、菌体の生理活性が増強され、ひいては、ダイエット効果が得られるという優れた効果が奏される。
本発明の組成物は、腸管内での増殖能を有するラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株の乳酸菌（以降、本発明の乳酸菌ともいう）を含有することに大きな特徴を有する。
本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株であり、腸管内での増殖能を有することを特徴とする。なお、本明細書において、「腸管内での増殖能を有する」又は「腸管内で増殖する」とは、腸管内に到達後、小腸及び／又は大腸内、好ましくは小腸内で増殖することであり、増殖能の程度は、人工腸液において３７℃で６ｈｒ培養した際に、植菌時のＯＤ６６０に対して１０倍以上の数値を示す場合に、「増殖能あり」と評価することができる。
本発明者らは、本発明者らが保有する約４８０種類の乳酸菌について、人工腸液中での増殖能を調べ、その中から選択したラクトバチルス・ペントーサスに属する菌の懸濁液を動物に投与したところ、ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株が、投与菌数に比べて排出された菌数が有意に多くなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株は、識別の表示ＮＲＩＣ ０８８３、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４７９として、国際受託日２０１２年１２月１０日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されたものである。以下、ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株のことを、ＴＵＡ４３３７Ｌ株と略記する。
ＴＵＡ４３３７Ｌ株の菌学的性質を表１及び表２に示す。表２の糖資化性は細菌同定キットＡＰＩ ５０ＣＨ（ＢＩＯＭＥＴＲＩＥＵＸ）を用いて測定した結果である。なお、表２における「＋」は資化される糖であることを、「−」は資化されない糖であることを意味する。
ＴＵＡ４３３７Ｌ株は、後述の実施例にて詳述するが、摂取された菌数に対して排出される菌数が多くなる特徴、すなわち腸管内増殖性を有する。また、腸管内増殖性としては、例えば、人工腸液中にて３７℃で６時間培養後には、培養開始時の菌数を基準とすると、好ましくは１０倍以上、より好ましくは１５倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、さらにより好ましくは２５倍以上の菌数を示す。
また、ＴＵＡ４３３７Ｌ株より抽出したＤＮＡから解読されたrecA遺伝子の配列（配列番号１）は、Lactobacillus pentosus IG1株のrecA遺伝子の配列と９９％の相同性を有する。なお、本明細書において、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０））の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
ＴＵＡ４３３７Ｌ株を培養するための培地としては、特に制限されず、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む培地が挙げられる。また、寒天培地や液体培地での培養も可能である。培養温度は、好ましくは１０〜４５℃、より好ましくは１５〜４２℃、さらに好ましくは２８〜３８℃、さらに好ましくは３５〜３７℃であり、増殖可能ｐＨは、好ましくはｐＨ３．０〜１２．５、より好ましくはｐＨ３．５〜１２．０である。
本発明の組成物は、前記したような腸管内での増殖能を有するラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株を各種形態で含有する。
本発明の組成物に含有されるラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株の形態としては、乳酸菌（生菌及び死菌）そのもの、乳酸菌含有物、乳酸菌処理物等が挙げられる。生菌は当該乳酸菌培養液等の乳酸菌含有物から得ることができる。死菌は、例えば、生菌に対して加熱、紫外線照射、ホルマリン処理、酸処理などを行うことにより得ることができる。得られた生菌、死菌は、さらに磨砕や破砕等により、処理物とすることができる。なお、前記各形態における乳酸菌は、腸管内で十分に増殖する効果を発揮する観点から、生菌であることが好ましいが、死菌が混在していてもよい。
前記乳酸菌としては、例えば、生菌体、湿潤菌、乾燥菌等を挙げることができる。前記乳酸菌含有物としては、例えば、乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物（菌体、培養上清、培地成分を含む）、乳酸菌培養液（菌培養物から固形分を除去したもの）を挙げることができる。また、前記乳酸菌処理物としては、例えば、磨砕物、破砕物、液状物（抽出液等）、濃縮物、ペースト化物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等）、希釈物等を挙げることができる。
本発明におけるラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株は、腸管内での増殖能を有するのであれば単独形態で又は２種以上の形態を組み合わせて用いることができる。本発明の組成物における総含有量は特に限定はないが、通常、０．００００１〜９９．９％（ｇ／ｇ）、なかでも、０．０００１％〜５０％（ｇ／ｇ）程度が好ましい。あるいは、菌体数として、１．０×１０２〜１．０×１０１２個／ｇの範囲内であることが好ましく、１．０×１０６〜１．０×１０１２個／ｇの範囲内であることがより好ましい。上記「個／ｇ」は生菌では「ＣＦＵ／ｇ」と表すことができる。なお、本発明の乳酸菌は、腸管内で増殖する以外の作用を有する菌株と組み合わせて用いてもよい。
本発明の組成物は、腸管内での増殖能を有するラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株を含有するのであれば、食品分野や製剤分野等において通常使用される担体、基剤、及び／又は添加剤等を本発明の効果を損なわない範囲内で含有することができる。具体的には、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分や、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、安定剤等が挙げられる。
また、本発明の組成物は、必要に応じて他の有用な作用を付加するために、美容成分、生活習慣病予防・改善成分などの公知の成分を１種又は２種以上組み合わせて含有することができる。
本発明の組成物の形態としては、腸管内での増殖能を有するラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株を体内に摂取することができる形態であれば特に限定はないが、菌株の効果発揮の観点から、該菌株を配合した飲料又は食品や、手軽に摂取できる観点から、サプリメントとして摂取可能な錠剤形態等が例示される。具体的には、例えば、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、調味料、加工食品、デザート類、菓子等の各種形態が挙げられる。これらの形態の中でも、発酵食品として提供されることが好ましい。発酵食品とは、植物性乳酸菌を用いて発酵させた食品の総称であり、飲料もこれに含まれる。発酵食品の種類としては特に限定されるものではないが、例えば、発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、漬物、キムチ、果実酒、味噌、しょうゆなどの果実や野菜を醗酵させたもの、果汁、野菜果汁などを醗酵させた醗酵果汁ヨーグルトなどの発酵食品などがあげられる。
なお、本発明の乳酸菌を配合した飲料又は食品、即ち、腸管内での増殖能を有するラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株を含有する飲料又食品は、食した場合に、腸管内での増殖能を有さない乳酸菌を食した場合と比べて、高い脂肪吸収抑制作用を発揮し、また、その作用が持続することから、持続的な脂肪吸収抑制作用を有する保健機能食品や健康食品として、例えば、体重増加の抑制用又は体重低減用、あるいは、肥満の防止用又は肥満改善用、さらにはダイエット用に用いられるものである旨の表示を付して提供することが可能になると考えられる。ここで、保健機能食品とは、厚生労働省の定める保健機能食品を意味し、栄養機能食品及び特定保健用食品を含み、保健機能食品や健康食品としては、食品及び飲料のいずれであってもよい。
本発明の組成物は、その形態に応じて、食品分野や製剤分野等において公知の方法に従って、調製することができる。
本発明の組成物は、その形態、摂取目的及び該組成物の摂取対象者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではないが、例えば、乳酸菌量として、一日当たり１．０×１０6個以上／ｋｇ体重となる量を、１〜数回に分けて経口摂取されることが好ましい。また、菌体の１日の摂取量として、乾燥重量が、成人１人体重約５０ｋｇあたり、好ましくは０．００００１〜１ｇ、より好ましくは０．０００１〜０．２ｇ、さらに好ましくは０．０００３〜０．００２ｇである。例えば、本発明の組成物は、本発明の乳酸菌が脂肪の吸収を抑制するという特性を有し、かつ、腸管内での増殖能を有することから、乳酸菌量が前記範囲内となる量を、高脂肪食と共に、あるいは、高脂肪食を食する前に摂取されてもよく、脂肪吸収抑制作用が持続的に奏されることから、１日１回、朝食時に摂取されてもよい。なお、本明細書において、「摂取」とは、「摂取」及び／又は「投与」のことを意味する。
本明細書の摂取対象者としては、好ましくは脂肪吸収抑制作用を必要とするヒトであるが、ペット動物等であってもよい。
かくして、本発明の組成物を摂取することにより、腸管からの脂肪吸収を抑制することができる。従って、本発明はまた、食事由来の脂肪の腸管からの吸収を抑制するための、腸管内での増殖能を有するラクトバチルス・ペントーサスからなる脂肪吸収抑制剤を提供する。
また、本発明は、前記ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株を含有する組成物を、脂肪吸収の抑制を必要とする個体にその有効量を用いることを特徴とする、脂肪吸収を抑制する方法を提供する。
脂肪吸収の抑制を必要とする個体とは、脂肪吸収を抑制することにより治療効果がみられる疾患を呈する個体であれば特に限定はない。例えば、肥満や肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等の疾患を有する個体が例示される。また、前記疾患の予防又は改善を目的として、例えば、体重が気になる方、血糖値が気になる方、血圧が気になる方等も前記個体に含まれる。
有効量とは、ＴＵＡ４３３７Ｌ株を上記個体に投与した場合に、投与していない個体と比較して、脂肪吸収が抑制する量のことである。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び個体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。なお、本明細書において、投与とは、投与、摂取、服用、飲用の全態様を含むものとして用いられる。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
実施例１＜人工腸液における増殖能を指標にしたスクリーニング＞
本発明者らが保有する乳酸菌のうち、主に植物性乳酸菌である約４８０株（ＪＣＭ株を含む）について、人工腸液における増殖能を評価した。
本発明者らが保有する乳酸菌のうち、主に植物性乳酸菌である約４８０株（ＪＣＭ株を含む）について、人工腸液における増殖能を評価した。
具体的には、先ず、各乳酸菌をグリセロールストックからＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１０ｍＬ）へ１ｖ／ｖ％ずつとなるよう植菌し、３５℃で１６〜１７ｈｒ培養した。次に、各培養液のＯＤ６６０（６６０ｎｍにおける吸光度）を分光光度計 ＵＶ−１６００（島津製作所）を用いて測定し、各培養液のＯＤ６６０が１０となるようＭＲＳ培地で調製したもの１００μＬを下記に示す組成の人工腸液（１０ｍＬ）へ植菌した。その後、ゆるやかに振とうしながら３７℃で６ｈｒ培養した後、ＯＤ６６０を測定し、増殖倍率（６ｈｒ後のＯＤ６６０／植菌時のＯＤ６６０）を求めた。代表的なスクリーニング結果を表３及び図１に示す。
＜人工腸液（ｐＨ６．４５）＞
ＭＲＳ培地 ９ｍＬ
１０ｗ／ｖ％胆汁（和光純薬工業株式会社）溶液 １ｍＬ
１ｗ／ｖ％パンクレアチン（from Porcine：SIGMA） １００μＬ
なお、胆汁溶液及びパンクレアチン溶液は０．２２μｍのフィルター（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することにより無菌にしたものを用いた。
＜人工腸液（ｐＨ６．４５）＞
ＭＲＳ培地 ９ｍＬ
１０ｗ／ｖ％胆汁（和光純薬工業株式会社）溶液 １ｍＬ
１ｗ／ｖ％パンクレアチン（from Porcine：SIGMA） １００μＬ
なお、胆汁溶液及びパンクレアチン溶液は０．２２μｍのフィルター（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することにより無菌にしたものを用いた。
結果、ラクトバチルス・ペントーサス及びラクトバチルス・プランタラムで増殖倍率が高い傾向にあり、その中でもラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株は特に増殖倍率が高く、腸管内での増殖性に優れることが分かる。
実施例２＜in vivo 腸管増殖能評価＞
高脂肪食を自由摂取させたマウスに以下のように調製したＴＵＡ４３３７Ｌ株を投与して、排泄される菌数を定量した。具体的には、以下のように調製した投与サンプルを用いて、乳酸菌約１０億ｃｅｌｌｓ（１．０×１０９ｃｅｌｌｓ）分（菌体懸濁液２５０μＬに相当）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０週齢、雄）に午前１０時ごろに１回投与した（ｎ＝５）。
＜投与サンプル（生菌含有サンプル）の調製＞
〔１〕ＴＵＡ４３３７Ｌ株のグリセロールストックから、ＭＲＳ培地（３０ｍＬ）へ１ｖ／ｖ％植菌
〔２〕培養（３５℃、２０ｈｒ）
〔３〕培養液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）３０ｍＬで懸濁
〔４〕〔３〕の懸濁液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）５ｍＬで再懸濁
〔５〕顕微鏡で菌数カウント
〔６〕１５ｍＬの遠心管に２００億ｃｅｌｌｓ分の溶液を分取し、遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、液状飼料（高脂肪食 ６０ｋｃａｌ％ＦＡＴ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ）５ｍＬに懸濁して菌体懸濁液を調製（液状飼料はＰＢＳ（−）で調製）
高脂肪食を自由摂取させたマウスに以下のように調製したＴＵＡ４３３７Ｌ株を投与して、排泄される菌数を定量した。具体的には、以下のように調製した投与サンプルを用いて、乳酸菌約１０億ｃｅｌｌｓ（１．０×１０９ｃｅｌｌｓ）分（菌体懸濁液２５０μＬに相当）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０週齢、雄）に午前１０時ごろに１回投与した（ｎ＝５）。
＜投与サンプル（生菌含有サンプル）の調製＞
〔１〕ＴＵＡ４３３７Ｌ株のグリセロールストックから、ＭＲＳ培地（３０ｍＬ）へ１ｖ／ｖ％植菌
〔２〕培養（３５℃、２０ｈｒ）
〔３〕培養液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）３０ｍＬで懸濁
〔４〕〔３〕の懸濁液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）５ｍＬで再懸濁
〔５〕顕微鏡で菌数カウント
〔６〕１５ｍＬの遠心管に２００億ｃｅｌｌｓ分の溶液を分取し、遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、液状飼料（高脂肪食 ６０ｋｃａｌ％ＦＡＴ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ）５ｍＬに懸濁して菌体懸濁液を調製（液状飼料はＰＢＳ（−）で調製）
その後、２日分の全糞便を４回に分けて回収し（試験開始日の午後、翌日の午前と午後、翌々日の午前）、以下の方法で全糞便当りの菌数を定量し、各マウスにおけるＴＵＡ４３３７Ｌ株の腸内増加率(全糞便当りの菌数／投与菌数)を算出した。結果を表４に示す。
＜リアルタイムＰＣＲによる菌数測定法＞
〔１〕糞便１００ｍｇ（湿重量）に対してＰＢＳ（−）１ｍＬを添加後、スパチュラーを用いて解砕
〔２〕糞便１００ｍｇ分をエッペンチューブ（登録商標）に採取後、遠心（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）１ｍＬで懸濁（遠心から懸濁までの操作を２回繰り返す）
〔３〕〔２〕の懸濁液から上清除去後、キット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：キアゲン）を用いてＤＮＡを抽出
（細胞破砕は、Ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ（１５０〜２１２μｍ：ＳＩＧＭＡ）３００ｍｇ、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（２５：２４：１）３００μＬ、及びｂｕｆｆｅｒ ＡＳＬ（キット中の試薬）９００μＬを添加し、ＭＵＬＴＩ−ＢＥＡＤＳ ＳＨＯＣＫＥＲ ＭＢ−２００（ＹＡＳＵＩ ＫＩＫＡＩ）で３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ遠心後、氷上１ｍｉｎ静置の操作を３回繰り返すことで行う）
〔４〕下記に示す条件のリアルタイムＰＣＲにより腸管内容物中の乳酸菌を定量
（（リアルタイムＰＣＲ条件））
（１） ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ｌｌ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）１０μＬ、ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．８μＬ、ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅＩＩ ０．４μＬ、滅菌水６μＬ、ＤＮＡ溶液２μＬを混合してＰＣＲ反応液を調製する。プライマーはラクトバチルス・ペントーサス及びラクトバチルス・プランタラムの１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に検出する以下のプライマーを用いる（ラクトバチルス・ペントーサスとラクトバチルス・プランタラムの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は１００％同一である）。
ｐｒｉｍｅｒ１：5’-GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT-3’（配列番号２）
ｐｒｉｍｅｒ２：5’-CGGACCATGCGGTCCAA-3’（配列番号３）
（２） ＰＣＲは７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃ ３０秒の後、９５℃ ５秒、６０℃ ３４秒を１サイクルとして、合計６０サイクル反応を行い、得られた蛍光強度と腸管内容物合計量と希釈倍率から腸管内容物１ｇ当りのコピー数を求める。
（３） 別途１ｃｅｌｌ当たりの１６Ｓ ｒＤＮＡのコピー数を求め、菌数に換算する。なお、乳酸菌を投与していないマウスにおいては、前記リアルタイムＰＣＲによりラクトバチルス・ペントーサス及びラクトバチルス・プランタラムのいずれも検出されないことを確認する。
＜リアルタイムＰＣＲによる菌数測定法＞
〔１〕糞便１００ｍｇ（湿重量）に対してＰＢＳ（−）１ｍＬを添加後、スパチュラーを用いて解砕
〔２〕糞便１００ｍｇ分をエッペンチューブ（登録商標）に採取後、遠心（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）１ｍＬで懸濁（遠心から懸濁までの操作を２回繰り返す）
〔３〕〔２〕の懸濁液から上清除去後、キット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：キアゲン）を用いてＤＮＡを抽出
（細胞破砕は、Ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ（１５０〜２１２μｍ：ＳＩＧＭＡ）３００ｍｇ、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（２５：２４：１）３００μＬ、及びｂｕｆｆｅｒ ＡＳＬ（キット中の試薬）９００μＬを添加し、ＭＵＬＴＩ−ＢＥＡＤＳ ＳＨＯＣＫＥＲ ＭＢ−２００（ＹＡＳＵＩ ＫＩＫＡＩ）で３０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ遠心後、氷上１ｍｉｎ静置の操作を３回繰り返すことで行う）
〔４〕下記に示す条件のリアルタイムＰＣＲにより腸管内容物中の乳酸菌を定量
（（リアルタイムＰＣＲ条件））
（１） ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ｌｌ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）１０μＬ、ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．８μＬ、ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅＩＩ ０．４μＬ、滅菌水６μＬ、ＤＮＡ溶液２μＬを混合してＰＣＲ反応液を調製する。プライマーはラクトバチルス・ペントーサス及びラクトバチルス・プランタラムの１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に検出する以下のプライマーを用いる（ラクトバチルス・ペントーサスとラクトバチルス・プランタラムの１６Ｓ ｒＤＮＡの配列は１００％同一である）。
ｐｒｉｍｅｒ１：5’-GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT-3’（配列番号２）
ｐｒｉｍｅｒ２：5’-CGGACCATGCGGTCCAA-3’（配列番号３）
（２） ＰＣＲは７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃ ３０秒の後、９５℃ ５秒、６０℃ ３４秒を１サイクルとして、合計６０サイクル反応を行い、得られた蛍光強度と腸管内容物合計量と希釈倍率から腸管内容物１ｇ当りのコピー数を求める。
（３） 別途１ｃｅｌｌ当たりの１６Ｓ ｒＤＮＡのコピー数を求め、菌数に換算する。なお、乳酸菌を投与していないマウスにおいては、前記リアルタイムＰＣＲによりラクトバチルス・ペントーサス及びラクトバチルス・プランタラムのいずれも検出されないことを確認する。
実施例３＜体重増加抑制効果＞
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢、雄）を、通常食群、高脂肪食群、高脂肪食＋生菌群、高脂肪食＋死菌群の４群に群分けし（各ｎ＝１０）、それぞれに以下の表５に示す食餌を３２日間続け、体重を毎日測定して平均値を算出した。平均値の推移を図２に示す。なお、群間比較は、有意水準０．０５によるｔ検定を用いて行った。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢、雄）を、通常食群、高脂肪食群、高脂肪食＋生菌群、高脂肪食＋死菌群の４群に群分けし（各ｎ＝１０）、それぞれに以下の表５に示す食餌を３２日間続け、体重を毎日測定して平均値を算出した。平均値の推移を図２に示す。なお、群間比較は、有意水準０．０５によるｔ検定を用いて行った。
具体的には、食餌は、表５の各群にそれぞれの固形餌を自由摂取させた。高脂肪食＋生菌群は、実施例２と同様にして調製した投与サンプルを、高脂肪食＋死菌群は、以下のようにして調製した投与サンプルを、それぞれ、１日あたり乳酸菌約１０億ｃｅｌｌｓ分となる量を投与した。一方、通常食群には乳酸菌の入っていないＰＢＳ（−）２５０μＬ、高脂肪食群には乳酸菌の入っていない液状飼料２５０μＬを投与した。
＜投与サンプル（死菌含有サンプル）の調製＞
〔１〕ＴＵＡ４３３７Ｌ株のグリセロールストックから、ＭＲＳ培地（３０ｍＬ）へ１ｖ／ｖ％植菌
〔２〕培養（３５℃、２０ｈｒ）
〔３〕培養液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）３０ｍＬで懸濁
〔４〕〔３〕の懸濁液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）５ｍＬで再懸濁
〔５〕顕微鏡で菌数カウント
〔６〕１５ｍＬの遠心管に２００億ｃｅｌｌｓ分の溶液を分取し、遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、人工胃液（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ１．０）５ｍＬを添加して攪拌後６０ｍｉｎ放置
〔７〕〔６〕の溶液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、液状飼料（６０ｋｃａｌ％ＦＡＴ）５ｍＬで懸濁して菌体懸濁液を調製
〔１〕ＴＵＡ４３３７Ｌ株のグリセロールストックから、ＭＲＳ培地（３０ｍＬ）へ１ｖ／ｖ％植菌
〔２〕培養（３５℃、２０ｈｒ）
〔３〕培養液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）３０ｍＬで懸濁
〔４〕〔３〕の懸濁液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、ＰＢＳ（−）５ｍＬで再懸濁
〔５〕顕微鏡で菌数カウント
〔６〕１５ｍＬの遠心管に２００億ｃｅｌｌｓ分の溶液を分取し、遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、人工胃液（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ１．０）５ｍＬを添加して攪拌後６０ｍｉｎ放置
〔７〕〔６〕の溶液を遠心（８０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清除去後、液状飼料（６０ｋｃａｌ％ＦＡＴ）５ｍＬで懸濁して菌体懸濁液を調製
結果、コントロール（高脂肪食群）に対して、ＴＵＡ４３３７Ｌ生菌投与群で有意な体重増加抑制効果を示した。また生菌投与は死菌投与よりもより効果的であった。ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株が腸管で増殖したことにより効果的に宿主へ影響を与えたことが考えられる。
実施例４＜脂肪吸収抑制効果＞
実施例３における通常食群、高脂肪食群、高脂肪食＋生菌群の群構成で（各ｎ＝１２）、それぞれに実施例３と同じ内容の食餌を２週間続けた。その後、一晩絶食させた後、オリーブオイル（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を投与し（５ｍＬ／ｋｇ）、さらに３時間後に解剖して大静脈から血清を採取した。血清中のトリグリセライド（ＴＧ）をトリグリセライド Ｅ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。結果を図３に示す。なお、群間比較は、有意水準０．０５によるｔ検定による有意差判定を行った。
実施例３における通常食群、高脂肪食群、高脂肪食＋生菌群の群構成で（各ｎ＝１２）、それぞれに実施例３と同じ内容の食餌を２週間続けた。その後、一晩絶食させた後、オリーブオイル（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を投与し（５ｍＬ／ｋｇ）、さらに３時間後に解剖して大静脈から血清を採取した。血清中のトリグリセライド（ＴＧ）をトリグリセライド Ｅ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。結果を図３に示す。なお、群間比較は、有意水準０．０５によるｔ検定による有意差判定を行った。
結果、通常食群に対して高脂肪食群で、明らかに血中ＴＧの増加傾向が認められた。従って、高脂肪食を食べ続けると脂肪を吸収しやすい体になることが考えられる。また、コントロール（高脂肪食群）に対して、ＴＵＡ４３３７Ｌ生菌投与群で血中ＴＧの増加抑制が認められた。従って、体重増加抑制効果の１つのメカニズムとして脂肪吸収抑制が考えられ、ＴＵＡ４３３７Ｌ生菌投与から１日後であっても効果的であったことから持続的に効果を発揮すると考えられる。
以下、本発明のラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株を含有する組成物の具体的処方を例示する。
[製造例１：錠剤]
以下に示す方法により、ＴＵＡ４３３７Ｌ株を含有する医薬品（錠剤）を製造する。
ＴＵＡ４３３７Ｌ株の乾燥粉砕物６６．７ｇを、乳糖２３２．０ｇおよびステアリン酸マグネシウム１．３ｇとともに混合し、単発式打錠機にて打錠することにより、直径１０ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造する。
以下に示す方法により、ＴＵＡ４３３７Ｌ株を含有する医薬品（錠剤）を製造する。
ＴＵＡ４３３７Ｌ株の乾燥粉砕物６６．７ｇを、乳糖２３２．０ｇおよびステアリン酸マグネシウム１．３ｇとともに混合し、単発式打錠機にて打錠することにより、直径１０ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造する。
[製造例２：ヨーグルト]
牛乳、脱脂粉乳、水を混合したミックスを調製し、加熱殺菌した後、４０℃前後まで冷却し、スターターとしてＴＵＡ４３３７Ｌ株を接種したのち、発酵室にて静置発酵させる。ここで、静置発酵の温度は、適宜選択できる。また、発酵開始時における溶存酸素濃度を抑えるため、窒素などの不活性ガスによる置換処理を行ってもよい。このようにして得られたＴＵＡ４３３７Ｌ発酵乳を、市販の牛乳に添加し３日間静置しヨーグルトを調製する。
牛乳、脱脂粉乳、水を混合したミックスを調製し、加熱殺菌した後、４０℃前後まで冷却し、スターターとしてＴＵＡ４３３７Ｌ株を接種したのち、発酵室にて静置発酵させる。ここで、静置発酵の温度は、適宜選択できる。また、発酵開始時における溶存酸素濃度を抑えるため、窒素などの不活性ガスによる置換処理を行ってもよい。このようにして得られたＴＵＡ４３３７Ｌ発酵乳を、市販の牛乳に添加し３日間静置しヨーグルトを調製する。
[製造例３：乳酸菌飲料]
ＴＵＡ４３３７Ｌ株を用いて表６に示した原料を混合して乳酸菌飲料を調製する。
ＴＵＡ４３３７Ｌ株を用いて表６に示した原料を混合して乳酸菌飲料を調製する。
[製造例４：果汁発酵飲料、野菜汁発酵飲料]
モモ果汁に、ＴＵＡ４３３７Ｌを２重量％量を接種し、３０℃で３８時間培養してモモ発酵果汁を製造する。また、同様にニンジン汁を発酵させてニンジン発酵汁を製造する。
モモ果汁に、ＴＵＡ４３３７Ｌを２重量％量を接種し、３０℃で３８時間培養してモモ発酵果汁を製造する。また、同様にニンジン汁を発酵させてニンジン発酵汁を製造する。
本発明の組成物は、腸管内での増殖能を有する乳酸菌を含有することから、体内に摂取すると、該乳酸菌が腸管内に到達して増殖することで、脂肪吸収を抑制したり、体重増加を抑制したりすることができ、ダイエット効果を目的として好適に用いられる。
配列表の配列番号１は、ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７ＬのrecAの塩基配列である。
配列表の配列番号２は、ラクトバチルス・ペントーサス／プランタラム特異的プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号３は、ラクトバチルス・ペントーサス／プランタラム特異的プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号２は、ラクトバチルス・ペントーサス／プランタラム特異的プライマーの塩基配列である。
配列表の配列番号３は、ラクトバチルス・ペントーサス／プランタラム特異的プライマーの塩基配列である。
Claims (16)
- 腸管内での増殖能を有するラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ-１４７９）を含有する組成物。
- 腸管からの脂肪吸収抑制作用を有する請求項１記載の組成物。
- 高脂肪食による腸管での脂肪吸収を抑制する請求項１又は２記載の組成物。
- 食した場合、ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株が腸管内で増殖し、それにより増殖能のない乳酸菌を食した場合と比べて高い脂肪吸収抑制作用を発揮する、請求項１〜３いずれか記載の組成物。
- 食した場合、ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株が腸管内で増殖し、それにより増殖能のない乳酸菌を食した場合と比べて脂肪吸収抑制作用が持続する、請求項１〜４いずれか記載の組成物。
- 体重増加の抑制用又は体重低減用に供される、請求項１〜５いずれか記載の組成物。
- 肥満の防止用又は肥満改善用に供される、請求項１〜６いずれか記載の組成物。
- 高脂肪食と共に、あるいは高脂肪食を食する前に供される、請求項１〜７いずれか記載の組成物。
- 飲料又は食品である、請求項１〜８いずれか記載の組成物。
- ヨーグルトである、請求項１〜９いずれか記載の組成物。
- 食事由来の脂肪の腸管からの吸収抑制剤である、請求項１〜８いずれか記載の組成物。
- １日１回、朝食時に食する、請求項１〜１１いずれか記載の組成物。
- ダイエット用である、請求項１〜１２いずれか記載の組成物。
- 脂肪吸収を抑制させる使用のための、ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ-１４７９）を含有する組成物。
- 脂肪吸収を抑制させるための、ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ-１４７９）を含有する組成物の使用。
- ラクトバチルス・ペントーサス ＴＵＡ４３３７Ｌ株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ-１４７９）の有効量を含む組成物を脂肪吸収の抑制を必要とする個体に投与する工程を含む、脂肪吸収の抑制方法。
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