JP2007189973A - 血中コレステロール低減作用を有する新規乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ラクトバチルス ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)、及びラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の何れかに属する乳酸菌の内、死菌の乾燥菌体重量1mg当たり、60容量%エタノール溶液において1.2μg以上のコレステロール吸着量を示し、且つリン酸緩衝液(pH6.8)において33nmol以上の胆汁酸吸着量を示す乳酸菌を採用する。
【選択図】なし
Description
項1. ラクトバチルス ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)、及びラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の何れかに属し、死菌の乾燥菌体重量1mg当たり、60容量%エタノール溶液において1.2μg以上のコレステロール吸着量を示し、且つリン酸緩衝液(pH6.8)において33nmol以上の胆汁酸吸着量を示すことを特徴とする、乳酸菌。
項2. 胆汁酸脱抱合作用を示さないことを特徴とする、請求項1に記載に乳酸菌。
項3. ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株(NITE P-161)、ラクトバチルス ファーメンタムNLB209株(NITE P-162)、ラクトバチルス ファーメンタムNLB214株(NITE P-163)、ラクトバチルス プランタラムNLB136株(NITE P-158)、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株(NITE P-159)、又はラクトバチルス パラカゼイNLB163株(NITE P-160)である、項1又は2のいずれかに記載の乳酸菌。
項4. 項1乃至3のいずれかに記載の乳酸菌を含有する、食品。
項5. 食品が発酵乳製品である、項4に記載の食品。
項6. 項1乃至3のいずれかに記載の乳酸菌を含有する、高脂血症患者用食品。
項7. 項1乃至3のいずれかに記載の乳酸菌を含有する、血中コレステロール値低減剤。
1.乳酸菌
本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)、及びラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の何れかに属するものであって、以下(1)及び(2)の特性を有することを特徴とするものである:
(1)死菌の状態において、乾燥菌体重量1mg当たり、60容量%エタノール溶液において1.2μg以上のコレステロール吸着量を示す。
(2)死菌の状態において、乾燥菌体重量1mg当たり、リン酸緩衝液(pH6.8)において33nmol以上の胆汁酸吸着量を示す。
(1)分離源からの目的乳酸菌種の分離
ラクトバチルス ファーメンタムに属する乳酸菌については、例えば、以下の方法に従って分離することができる。即ち、まず、鮒寿司や糠漬等の分離源を約9倍量のMRS液体培地に添加し、45℃で1〜3日間培養する。得られた培養液の適量をLBS寒天培地に塗布して、45℃で1〜3日間再度培養する。培地上に形成された集落及び菌体の形状を目視及び顕微鏡により観察し、更にラクトバチルス ファーメンタム特異的プラマー(Byun et al.: J. Clin. Microbiol. 42, 3128-3136(2004))を使用した16S rDNAの部分増幅産物の塩基配列解析を行う。これらの結果から、ラクトバチルス ファーメンタムに属する乳酸菌を選定する。
(2)コレステロール吸着量及び胆汁酸吸着量の測定
次いで、上記(1)で選定された乳酸菌について、コレステロール吸着量及び胆汁酸吸着量を、前述する方法に従って測定する。コレステロール吸着量及び胆汁酸吸着量の測定結果に基づいて、本発明の乳酸菌を同定し、単離する。
(i)ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、NLB209株、及びNLB214株
これらの乳酸菌は、糠漬から単離されたものである。これらの乳酸菌の菌学的性質について以下の表2及び3に示す。
これらの乳酸菌は、鮒寿司から単離されたものである。本乳酸菌の菌学的性質について以下の表4及び5に示す。
これらの乳酸菌は、糠漬から単離されたものである。これらの乳酸菌の菌学的性質について以下の表6及び7に示す。
前記乳酸菌は、死菌の状態においても、コレステロール吸着能及び胆汁酸吸着能の双方の点で優れているので、食品の一成分として使用されて摂取されることにより、生体内で血中コレステロール低減作用を効果的に発揮することができる。それ故、前記乳酸菌を含有する食品(以下、「本発明食品」と表記する)は、血中コレステロールの低減用として有用である。また、本発明食品は、高脂血症患者用食品としても極めて優れている。なお、本発明において、食品とは飲料を含む意で使用する。
前記乳酸菌は、血中コレステロール値低減剤の有効成分として製剤化されて使用することもできる。当該血中コレステロール値低減剤は、高脂血症等の予防又は治療剤として有用である。
実施例1 コレステロール吸着能及び胆汁酸吸着能の測定
<試験方法>
本発明の乳酸菌(ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB209株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB214株、ラクトバチルス プランタラムNLB136株、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株、及びラクトバチルス パラカゼイNLB163株)、及び表8に示す公知又は日清食品株式会社所有の乳酸菌を用いて、凍結乾燥生菌体及び凍結乾燥死菌体を調製し、コレステロール吸着能及び胆汁酸吸着能を測定した。その具体的方法を以下に示す。
供試菌株をMRS液体培地で32℃、24時間培養後、培養液を新鮮MRS液体培地に1容量%接種し、32℃で18時間培養した。培養後、菌体を遠心分離により収集した。滅菌蒸留水で菌体を2回洗浄した後、凍結乾燥することにより、凍結乾燥生菌体を調製した。また、別途、滅菌蒸留水で洗浄した菌体を少量の滅菌蒸留水に懸濁後、100℃で30分間加熱した後、凍結乾燥することにより、凍結乾燥死菌体を調製した。
前述する方法に従って、供試菌株のコレステロール吸着能の測定を行った。即ち、供試菌株の凍結乾燥菌体12 mgを、コレステロールを100μg/mLの濃度で含有する60容量%エタノール水溶液0.4 mLに懸濁し、37℃で1時間保温した。遠心分離により菌体除去後、上清0.1 mLを33重量%水酸化カリウム水溶液0.3 mL及びエタノール3.0 mLと混合し、60℃で15分間保温した。室温まで冷却後、n-ヘキサン5.0 mLを添加撹拌し、次に蒸留水3.0 mLを添加撹拌した。ヘキサン層回収後、窒素気流下で乾固し、0.05重量% o-フタルアルデヒド/氷酢酸溶液1 mLを加えた。室温で10分間静置後、硫酸0.5 mLを添加して、吸光度(550 nm)を測定した。前述する式に従って、コレステロール吸着量を測定した。
前述する方法に従って、供試菌株の胆汁酸吸着能の測定を行った。即ち、供試菌株の凍結乾燥菌体12 mgを1.25 mmol/Lタウロコール酸/10 mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.8)溶液0.8 mLに懸濁し、37℃で2.5時間保温した。遠心分離により菌体除去後、反応液上清のタウロコール酸濃度を総胆汁酸-テストワコー(酵素比色法:和光純薬社製)を用いて測定した。前述する式に従って、胆汁酸吸着量を測定した。
得られた結果を表8に示す。この結果から、本発明の乳酸菌の凍結乾燥死菌体は、いずれも、1.2μg以上のコレステロール吸着量を示し、且つ33nmol以上の胆汁酸吸着量を示すことが確認された。また、ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB209株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB214株、及びラクトバチルス プランタラムNLB136株については、凍結乾燥死菌体のみならず、凍結乾燥生菌体でも、1.2μg以上のコレステロール吸着量を示し、且つ33nmol以上の胆汁酸吸着量を示すことが確認された。
本発明の乳酸菌(ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB209株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB214株、ラクトバチルス プランタラムNLB136株、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株、及びラクトバチルス パラカゼイNLB163株)について、胆汁酸脱抱合作用の有無を以下の方法に従って評価した。
du Toit et al.の方法(J. Food Microbiol. 40, 93-104(1998))に従った。具体的には、MRS液体培地中37℃で24時間培養した供試菌株の培養液を滅菌した円形ペーパーディスク(抗生物質検定用直径8 mm)に浸潤させ、0.5重量%タウロデオキシコール酸ナトリウム−0.37 g/L 塩化カルシウム添加MRS寒天培地に置き、37℃で3日間培養した。ペーパーディスク下のMRS寒天培地中に白色沈殿が形成された場合、胆汁酸脱抱合作用陽性と判定した。
Walker et al.の方法(J. Dairy Sci. 76, 956-961(1993))に従った。具体的には、供試菌株のMRS培養液を、0.2重量%タウロコール酸ナトリウム及び0.2重量%チオグリコール酸ナトリウムを含むMRS液体培地に、1容量%接種し、37℃で24時間培養した。培養液10 mLを1 mol/L水酸化ナトリウム水溶液でpH7.0に調整し、純水で全量を12.5 mLとした後、遠心分離により菌体除去した。培養上清7.5 mLを10 mol/L塩酸でpH1.0に調整、純水で全量を12 mLとした。これに3倍量の酢酸エチルを加え、撹拌した。酢酸エチル層0.75 mLを窒素気流下で蒸発乾固後、乾個物を0.01 mol/L水酸化ナトリウム水溶液 0.25mLに溶解し、更に16 mol/Lの硫酸1.5 mL及び1重量% フルフラール 0.25 mLを加えて65℃で13分間加温した。冷却後、氷酢酸 1.25 mLを添加し、吸光度(660 nm)を測定することにより、コール酸の遊離量を定量した。
本発明の乳酸菌(ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB209株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB214株、ラクトバチルス プランタラムNLB136株、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株、及びラクトバチルス パラカゼイNLB163株)について、胃液に対する耐性を東らの方法(食科工. 48, 656-663(2001))に従って評価した。具体的には、供試菌株のMRS培養液を0.32重量%ペプシン含有MRS液体培地(pH2.0、2.5、3.0及び4.0)に接種(2〜8×106cfu/mL)し、37℃で4時間培養後、生存菌数をMRS寒天培地で計測した。本試験における各条件の設定根拠は、次の通りである。
pH:健常人の胃内pHは通常1〜2だが、食事により上昇する(牛乳180 mL摂取:pH3〜4)ことから、pH2.0、2.5、3.0、4.0を設定した。
処理時間:通常、胃内容物が十二指腸に移送されるのに約2時間かかるといわれていることから処理時間を2倍の4時間とした。
本発明の乳酸菌(ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB209株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB214株、ラクトバチルス プランタラムNLB136株、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株、及びラクトバチルス パラカゼイNLB163株)について、胆汁に対する耐性を東らの方法(食科工. 48, 656-663(2001))に従って評価した。具体的には、供試菌株のMRS培養液を、ウシ胆汁末(Oxgall:Becton Dickinson製)を0(対照)、0.1、0.2、0.5、1重量%含有するMRS培地に1%接種し、37℃で18時間培養後、濁度(600 nm)を測定することにより、相対増殖率[対照に対する濁度の割合(%)]を算出した。ヒト腸管内の胆汁濃度は2重量%であり、0.2重量% Oxgallに相当すると報告されている(瀧口ら:腸内細菌学雑誌. 11, 11-18(2000))。
本発明の乳酸菌(ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB209株、ラクトバチルス ファーメンタムNLB214株、ラクトバチルス プランタラムNLB136株、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株、及びラクトバチルス パラカゼイNLB163株)について、コレステロール負荷マウスに対する作用効果を以下の方法に従って評価した。
乳酸菌凍結乾燥物として、ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、NLB209株、NLB214株、及びラクトバチルス ラムノサスLGG(ATCC53103)株の生菌凍結乾燥物及び加熱死菌凍結乾燥物を用いて、以下の試験を実施した。実験動物として、6週令のC57BL6/J系雄マウス(日本クレア製)を使用した。マウスは購入後、個体別にケージに収容し、表12に示す基礎飼料を与えて6日間予備飼育後、平均体重がほぼ等しくなるよう1群7匹に群分けした。表11に示す基礎飼料、対照飼料及び試験飼料を与え、14日飼育した。水及び飼料は自由摂取させた。
基礎飼料を与えた群、対照飼料を与えた群、乳酸菌含有試験飼料を与えた群間で摂餌量に有意な差はみられなかった。体重増加量は、ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株、NLB209株、及びNLB214株の生菌投与群又は死菌投与群において、対照群に比べ有意に多かった。
<血漿総コレステロール値>
対照飼料を与えた群の血漿総コレステロール値は、基礎飼料を与えた群に比べ有意に高かった(37.2%増加)。 一方、各乳酸菌含有試験飼料を与えた群の血漿総コレステロール値は、対照飼料を与えた群に比べ有意に低い、若しくは低い傾向を示した(LGG株:22.4%減少、NLB202株生菌:22.7%減少、NLB202株死菌:8.5%減少、NLB209株生菌:20.3%減少、NLB209株死菌:7.4%減少、NLB214株生菌:16.8%減少、NLB214株死菌:16.7%減少)。
<血漿HDLコレステロール値>
対照飼料を与えた群の血漿HDLコレステロール値は、基礎飼料を与えた群に比べ有意に低かった(40.8%減少)。各乳酸菌含有試験飼料を与えた群の血漿HDLコレステロール値は、対照飼料を与えた群に比べ有意に高い、若しくは高い傾向を示した(LGG株:17.3%増加、NLB202株生菌:12.0%増加、NLB202株死菌:26.8%増加、NLB209株生菌:8.9%増加、NLB209株死菌:16.3%増加、NLB株214生菌:12.4%増加、NLB株214死菌:29.3%増加)。
<血漿非HDLコレステロール値>
対照飼料を与えた群の血漿非HDLコレステロール値(VLDLコレステロール+LDLコレステロールに相当:動脈硬化原性コレステロールを含む)は、基礎飼料を与えた群に比べ有意に高かった(215.8%増加)。一方、各乳酸菌含有試験飼料を与えた群の血漿非HDLコレステロール値は、対照飼料を与えた群に比べ有意に低い、若しくは低い傾向を示した(LGG株:39.4%減少、NLB202株生菌:37.6%減少、NLB202株死菌株:23.6%減少、NLB209株生菌:32.8%減少、NLB209株死菌:17.6%減少、NLB214株生菌:29.4%減少、NLB株214死菌:36.5%減少)。
<動脈硬化指数>
対照飼料を与えた群動脈硬化指数(非HDLコレステロール値とHDLコレステロール値の比)は、基礎飼料を与えた群に比べ有意に高かった(525%増加)。一方、各乳酸菌含有試験飼料を与えた群の動脈硬化指数は対照飼料を与えた群に比べ有意に低い、若しくは低い傾向を示した(LGG株:48%減少、NLB202株生菌:48%減少、NLB202株死菌:40%減少、NLB209株生菌:40%減少、NLB209株死菌:32%減少、NLB214株生菌:32%減少、NLB214株死菌:52%減少)。
乳酸菌凍結乾燥物として、ラクトバチルス プランタラムNLB136株(生菌)、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株(加熱死菌)、NLB163株(加熱死菌)及びラクトバチルス ラムノサスLGG(ATCC53103)株(生菌)の凍結乾燥物を用いて、表15に示す基礎飼料、対照飼料及び試験飼料を調製し、上記と同様の方法で、6週令のC57BL6/J系雄マウスに給餌して、コレステロール負荷マウスに対する作用効果を評価した。得られた結果を表16に示す。
基礎飼料を与えた群、対照飼料を与えた群、乳酸菌含有試験飼料を与えた群間で摂餌量及び体重増加量に有意な差はみられなかった。
<血漿総コレステロール値>
対照飼料を与えた群の血漿総コレステロール値は、基礎飼料を与えた群に比べ有意に高かった(63.3%増加)。 一方、各乳酸菌含有試験飼料を与えた群の血漿総コレステロール値は、対照飼料を与えた群に比べ有意に低かった(LGG株:29.0%減少、NLB株136:28.0%減少、NLB162株:33.1%減少、NLB163株:35.8%減少)。特に、NLB163株の試験飼料群の値は、LGG群よりも9.7%低かった。
<血漿HDLコレステロール値>
対照飼料を与えた群の血漿HDLコレステロール値は、基礎飼料を与えた群に比べ有意に低かった(60.5%減少)。NLB162株及び163株の試験飼料群の血漿HDLコレステロール値は、対照飼料を与えた群に比べ有意に高かった(NLB162株:50.1%増加、NLB163株:62.2%増加)。また、NLB162株及び163株の試験飼料群の血漿HDLコレステロール値は、LGG株の試験飼料群に比べても有意に高かった。
<血漿非HDLコレステロール値>
対照飼料を与えた群の血漿非HDLコレステロール値(VLDLコレステロール+LDLコレステロールに相当:動脈硬化原性コレステロールを含む)は、基礎飼料を与えた群に比べ有意に高かった(276.2%増加)。一方、各乳酸菌含有試験飼料を与えた群の血漿非HDLコレステロール値は、対照飼料を与えた群に比べ有意に低かった。特に、NLB162株及びNLB163株の試験飼料群の値は、LGG株の試験飼料群に比べ21.0%及び29.3%低かった。
<動脈硬化指数>
対照飼料を与えた群の動脈硬化指数(非HDLコレステロール値とHDLコレステロール値の比)は、基礎飼料を与えた群に比べ有意に高かった(1048%増加)。一方、各乳酸菌含有試験飼料を与えた群の動脈硬化指数は対照群に比べ有意に低かった。特に,NLB162株及びNLB163株の試験飼料群の値は、LGG株の試験飼料群に比べ60.0%及び62.3%低かった。
本発明の乳酸菌(ラクトバチルス プランタラムNLB136株、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株、及びラクトバチルス パラカゼイNLB163株)について、還元脱脂乳における増殖性を以下の方法に従って評価した。即ち、0.3重量%酵母エキス添加10%還元脱脂乳で前培養した供試菌株の培養液を、10%還元脱脂乳に1容量%接種し、32℃で24及び48時間培養し、培養液中の生菌数の測定及び培養液のpHの測定を行った。生菌数計測にはMRS寒天培地を使用した。また、培養液のpHは、pHメーターで測定した。
Claims (7)
- ラクトバチルス ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)、及びラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)の何れかに属し、死菌の乾燥菌体重量1mg当たり、60容量%エタノール溶液において1.2μg以上のコレステロール吸着量を示し、且つリン酸緩衝液(pH6.8)において33nmol以上の胆汁酸吸着量を示すことを特徴とする、乳酸菌。
- 胆汁酸脱抱合作用を示さないことを特徴とする、請求項1に記載に乳酸菌。
- ラクトバチルス ファーメンタムNLB202株(NITE P-161)、ラクトバチルス ファーメンタムNLB209株(NITE P-162)、ラクトバチルス ファーメンタムNLB214株(NITE P-163)、ラクトバチルス プランタラムNLB136株(NITE P-158)、ラクトバチルス パラカゼイNLB162株(NITE P-159)、又はラクトバチルス パラカゼイNLB163株(NITE P-160)である、請求項1又は2のいずれかに記載の乳酸菌。
- 請求項1乃至3のいずれかに記載の乳酸菌を含有する、食品。
- 食品が発酵乳製品である、請求項4に記載の食品。
- 請求項1乃至3のいずれかに記載の乳酸菌を含有する、高脂血症患者用食品。
- 請求項1乃至3のいずれかに記載の乳酸菌を含有する、血中コレステロール値低減剤。
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