TWI403327B - 副乾酪乳酸桿菌及其用途 - Google Patents

Description

副乾酪乳酸桿菌及其用途

本發明係關於一種乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，簡稱LAB)，特別是關於一種能夠降低血液中膽固醇之副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)。

膽固醇(Cholesterol)係構成人體細胞膜的重要分子，用以增加細胞膜熱穩定性及維持其流體特性，膽固醇亦係人體內合成固醇類荷爾蒙(Steroid Hormone)及合成膽鹽(Bile Salt)的原料，因此，膽固醇與人體細胞生理、內分泌系統、消化系統等機能運作有極密切的相關。

人體所含膽固醇的來源有二：一係由飲食攝取進入體內，另一來源則係體內細胞自行合成膽固醇，體內的膽固醇約有70~75%係與脂蛋白(Lipoprotein)結合，形成膽固醇酯的型態存在於血液中，其餘主要分布於肌肉及腦。

膽固醇除了作為固醇類荷爾蒙的原料而被消耗，另一種移除體內膽固醇的途徑係將膽固醇合成膽鹽，將膽鹽分泌至腸道中幫助脂肪乳化並促進腸道吸收脂肪，95%的膽鹽會被腸道再吸收而回到體內循環，剩餘5%的膽鹽則隨著食物殘渣被排出體外。

由於現代人的飲食趨於精緻，飲食中富含飽和脂肪酸、反式脂肪酸及高膽固醇食物，如蛋黃、紅肉、動物性油脂、起司、蛋糕、巧克力、冰淇淋、沙拉醬及有殼海產(蝦、蟹、貝、墨魚等)，使人體攝取過多膽固醇，使過多的膽固 醇累積在體內，人體來不及消耗膽固醇，而造成膽固醇過高症(Hypercholesterolemia)。

因此，現代人仰賴保健食品控制體內膽固醇含量，許多學者發現乳酸菌除了可維持人體腸道之正常菌相，預防外來病源菌(如Escherichia coli、Salmonella typhimurium及Clostridium sp.)的入侵、預防或治療腸胃道疾病，並可活化人體免疫反應，誘發細胞激素如IL-12及TNF-α等的產生，或者改善遺傳性過敏症狀、緩和食物過敏現象之外，乳酸菌也有降低血液中膽固醇的功能。

習知乳酸菌用以降低膽固醇的途徑有兩種，第一種途徑係利用該習知乳酸菌本身所含之酵素使膽鹽沉澱以抵抗膽鹽對其細胞膜之傷害，而第二種途徑係由習知乳酸菌的細胞膜直接吸附腸道內的膽固醇。

第一種途徑，也是大多數習知乳酸菌用以降低膽固醇的途徑，係以本身所含有的膽鹽水解酵素(Bile Salt Hydrolase，簡稱BSH)抵抗膽鹽插入乳酸菌細胞膜，維持該習知乳酸菌的生理活性，進一步降低消化道中的膽固醇。

膽固醇與膽鹽的循環路徑如下所述：在人體內的膽固醇係先合成膽酸(Bile Acid，具有-COOH)，進入腸道後成為膽鹽(Bile Salt，具有-COO^-)，當膽鹽與胺基酸或少量硫化物結合後，形成一結合性膽鹽(Conjugated Bile Salt)，例如牛膽酸(Taurocholic Acid，TCA)、牛磺脫氧膽酸(Taurodeoxycholic Acid，TDCA)等六種膽鹽，該結合性膽鹽的pKa值低，於腸道中的溶解度高，因此很容易被腸道再吸收，回到體內循環。

習知乳酸菌的膽鹽水解酵素係介入膽固醇與膽鹽之循環途徑中，使體內膽鹽的量減少，身體為了補償膽鹽不足而提取血液中膽固醇來製造膽鹽。膽鹽水解酵素可促進腸道中的結合性膽鹽水解成一非結合性膽鹽(Unconjugated Bile Salt)，由於該非結合性膽鹽的pKa值較高，該非結合性膽鹽於酸性環境下容易產生沉澱，人體不易將沉澱的非結合性膽鹽再吸收回體內，而使該非結合性膽鹽被排出體外，因此，膽鹽的循環途徑中，該非結合性膽鹽被排出後，造成體內膽鹽的缺乏，使人體利用血液中的膽固醇製造膽鹽，藉此降低血液中膽固醇的含量。

然而，以習知乳酸菌的膽鹽水解酵素降低膽固醇，可能會移除過多膽鹽，造成體內的膽鹽不足，使人體吸收脂肪、脂肪酸等的效率變差之外，人體會因應膽鹽沉澱而排出體外，使腸道中膽鹽的量不足以幫助脂肪的吸收，進而提取血液中膽固醇來製造膽鹽，大量降低血液中膽固醇的含量，而發生過低膽固醇症(Hypocholesteremic)。

由於含有膽鹽水解酵素之乳酸菌有上述之缺點，因此，利用第二種途徑之乳酸菌來降低血液中膽固醇之含量係更佳的選擇。然而，該乳酸菌在進入消化道後，除了對胃酸的耐受性低而存活率不高之外，由於該乳酸菌並無膽鹽水解酵素而無法抵抗腸道中的膽鹽，當膽鹽嵌入該乳酸菌的細胞膜後，破壞該乳酸菌細胞膜的雙層磷脂層使之破裂而死亡，因此，大多數乳酸菌對膽鹽亦不具有耐受性而無法存在於消化道中，便無法提高該乳酸菌吸附膽固醇而降低血液中膽固醇含量之效果。

因此，有必要開發新的乳酸菌係具有抗膽鹽、耐酸且具吸附細胞能力者以提升乳酸菌降低血液中膽固醇含量之效能。

本發明之主要目的係提供一種具有吸附消化道中膽固醇能力之副乾酪乳酸桿菌，以降低人體血液中膽固醇之含量。

本發明之次一目的係提供一種副乾酪乳酸桿菌，該副乾酪乳酸桿菌係具有膽鹽耐受性，使該副乾酪乳酸桿菌能於消化道中存活。

本發明之又一目的係提供一種副乾酪乳酸桿菌，該副乾酪乳酸桿菌係具有酸耐受性，使該副乾酪乳酸桿菌能通過胃部到達消化道並於消化道中存活。

本發明之又一目的係提供一種副乾酪乳酸桿菌之用途，係將一種副乾酪乳酸桿菌用以製備降低血液中膽固醇之食品組成物或藥物組成物。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910482，該副乾酪乳酸桿菌之16S rDNA序列係包含如SEQ ID NO：1所示之序列，該副乾酪乳酸桿菌之用途係用以製備降低血液中膽固醇之食品組成物或藥物組成物。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明係一種具有吸附消化道中膽固醇能力之副乾酪乳酸桿菌，係自一醱酵乳品中選殖得一副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)，給予該副乾酪乳酸桿菌之名稱為Lactobacillus paracasei NPUST_YC_M_02，該副乾酪乳酸桿菌係寄存於台灣新竹食品科學工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 910482；該副乾酪乳酸桿菌具有膽鹽耐受性及酸耐受性，且能附著於細胞，與習知乳酸菌具有較佳降低血液中膽固醇能力，可應用於製備用以治療或預防血液中膽固醇過高之食品組成物或藥物組成物。

請參照第1圖所示，本發明之副乾酪乳酸桿菌係經由以下各方式處理而獲得，包含有乳酸菌之培養S1、乳酸菌之篩選S2、乳酸菌之鑑定S3及乳酸菌之保存S4：該乳酸菌之培養S1係分離自一醱酵乳品中所含之乳酸菌，進行培養。取樣自一醱酵乳品，置於一培養液增殖培養(Enrichment Culture)，待一適當培養時間後將該培養液進行序列稀釋，另接種至一培養基，挑選可生長之菌株。

本實施例之增殖培養係將該醱酵乳品以1：100之體積比例接種於一0.1%(w/v)蛋白腖液(Peptone Water)，以溫度30℃，搖床轉速150 rpm之條件培養1小時，得一增殖培養菌液，再以生理食鹽水對該增殖培養菌液作適當序列稀釋，將稀釋後之增殖培養菌液以塗抹法接種一MRS固態培養基(Mann Rogosa and Sharp agar plate，簡稱MRS Agar，如第1表所示)，以溫度30℃，厭氧環境下培養，並挑選可生長之菌株。

該乳酸菌之篩選S2，係由所分離之數株乳酸菌菌株中挑選具有降低膽固醇能力，且挑選非以膽鹽水解酵素(BSH)降低膽固醇之乳酸菌菌株。

(S2-1)降膽固醇試驗

將所分離之數株乳酸菌菌株培養於含有0.2%(w/v)硫乙醇酸鈉(Sodium thioglycolate)、0.2%膽鹽及濃度100 ppm膽固醇微粒(Cholesterol micelle)之MRS液態培養基(MRS Broth，如第2表所示)，其中，該膽固醇微粒係依Razin等人(1980)及Noh等人(1997)所設計之方法製備：秤取22 mg磷脂膽鹼(phosphatidylcholine)及10 mg膽固醇，加入10 ml蔗糖(0.4 M)，以超音波震盪10分鐘後靜置5分鐘，重覆三次，可得到1000 ppm之膽固醇微粒，該膽固醇微粒大小介於0.1~1.0 μm。

該數株乳酸菌菌株比該MRS液態培養基之體積比為1：200，以溫度37℃，厭氧環境下培養24±2小時後，以12000 g離心10分鐘得各實驗組之上清液，以磷苯二醛法(o-phthaldialdehyde method)測定該上清液中所殘留膽固醇之濃度(測量波長550 nm之吸光值)，並以無接種乳酸菌之 MRS液態培養基作為一對照組，計算各數株乳酸菌降膽固醇之能力，其計算公式如下：

該磷苯二醛法係依照Rudel及Morris(1973)所設計測量膽固醇之方法。取0.25 ml各實驗組上清液加入1.5 ml之95%酒精混合均勻，再加入1 ml 50%(v/v)氫氧化鉀(KOH)混合，於溫度60℃之環境下反應10分鐘並冷卻至室溫，再加入2.5 ml正己烷(Hexane)震盪混合15秒，加入1.5 ml蒸餾水震盪混合15秒後，靜置10分鐘，吸取上層之有機液體至新試管中，並於溫度70℃以氮氣吹乾該有機液體，再加入2 ml磷苯二醛試劑，均勻混合後靜置10分鐘，緩緩加入1 ml濃硫酸並小心混合，靜置10分鐘後測量波長550 nm之吸光值，即可作為評量各實驗組之膽固醇濃度，OD₅₅₀吸光值越高者代表該組之膽固醇濃度越高。

該乳酸菌之篩選S2係設計一含有膽鹽及硫乙醇酸鈉(Sodium thioglycolate)之環境下，測試各實驗組乳酸菌其降膽固醇之能力，其中，本發明之乳酸菌係能夠於24小時之期間降低51.6 ppm之膽固醇，具有良好之降膽固醇能力。

(S2-2)膽鹽水解酵素活性篩選(BSH Assay)

各乳酸菌另於一BSH活性篩選固態培養基(BSH Assay Plate)中，以溫度37℃，厭氧環境下培養120±2小時，並於該培養期間每天觀察菌落周圍是否產生不透明沉澱物，其中，該BSH Assay Plate之配方係取MRS固態培養基之成份，另添加0.5%牛磺脫氧膽酸及0.037%氯化鈣製 備而成，當乳酸菌具有BSH活性，則菌落周圍會出現不透明沉澱。

分別以塗抹法將各乳酸菌進行該BSH Assay plate之培養，本發明之乳酸菌之菌落周圍或培養基底部並未產生不透明沉澱，並由此初步判定該乳酸菌不具有BSH活性，因此該乳酸菌之降膽固醇與BSH之活性並無直接相關，後續將會對本發明乳酸菌之BSH活性做進一步之確認。

該乳酸菌之鑑定S3，該乳酸菌之16SrDNA序列係包含如SEQ ID NO：1所示之序列，並且，依照該乳酸菌之外觀、生理特性或分子特徵等判斷其菌種分類。本實施例係將該乳酸菌進行革蘭氏染色(Gram Stain)、觸酶反應(Catalase Activity)之分子鑑定，由該乳酸菌之染色圖判斷為革蘭氏陽性菌、觸酶反應試驗為陰性及16S rDNA部分序列等鑑定結果確定本發明之乳酸菌係為一副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)，寄存編號為BCRC 910482，該副乾酪乳酸桿菌係一短桿菌，無活動力(Motility)，其詳細鑑定結果係與NCBI資料庫之菌種進行比對，如第3表。

該乳酸菌之保存S4，係使該副乾酪乳酸桿菌可以穩定於低溫環境下長久存放，以便後續使用。將本發明之副乾酪乳酸桿菌接種至該MRS固態培養基，以溫度37℃培養24±2小時後挑選單一菌落轉殖至一MRS液態培養基(如第2表所示)以溫度37℃、厭氧培養18±2小時，進行冷凍保存；培養結束後，該MRS液態培養基中較佳係添加抗凍劑(如甘油)，其中該體積比為3：1，暫存於-20℃之恆溫保存室，待後續使用。

為證實本發明之副乾酪乳酸桿菌係具有以吸附方式降膽固醇之能力及其耐膽鹽及耐酸之能力，分別進行下列測試：(1)該副乾酪乳酸桿菌不同生長時期與降膽固醇之能力、(2)該副乾酪乳酸桿菌耐膽鹽與降膽固醇之特性、(3)該副乾酪乳酸桿菌之酸耐受度、(4)該副乾酪乳酸桿菌之細胞吸附能力、(5)該副乾酪乳酸桿菌之膽鹽水解酵素單位活性及(6)該副乾酪乳酸桿菌用以降膽固醇之動物試驗，以下試驗均以單向變異係數分析(One-Way Analysis of Variance，ANOVA)及鄧肯氏多變域測驗(Duncan’s Multiple Range Test)進行各實驗數據之差異性多重比較。

(1)該副乾酪乳酸桿菌不同生長時期與降膽固醇之能力

請參照第4表及第2圖所示，係本發明之副乾酪乳酸桿菌於不同培養時期4-1~4-6組降膽固醇之情形，其中，該各組別之培養基係含有0.3%膽鹽及200 ppm膽固醇之MRS液態培養基，以溫度37℃培養24小時後，以磷苯二醛法測量各組別該MRS液態培養基之膽固醇濃度，其中，膽固醇濃度之檢量線係如第3圖所示，根據X軸之膽固醇濃度與Y軸之OD₅₅₀做一迴歸方程式Y=0.00296 X+0.0002(R₂=0.9945)，以該迴歸方程式計算所得OD₅₅₀其對應之膽固醇實際值。本實施例之不同培養時期係指將該副乾酪乳酸桿菌活化後，以培養之起始時間算起，分別於第0小時、第12小時、第24小時、第36小時、第48小時及第72小時進行膽固醇濃度之測試，分別為4-1~4-6組，進行前述條件之降膽固醇測試。

請參照第2圖所示，X軸為不同培養時期之4-1~4-6組別，Y1軸為各組之活菌數對數值(Log CFU/ml)，係對應圖中之折線圖，另Y2軸為各組之膽固醇濃度(ppm)，係對應圖中之長條圖。由該折線圖及該長條圖所示，培養時期為成長期(Log Phase)及平穩期(Stationary Phase)之該4-2組及該4-3組所降膽固醇之能力最高，而該4-4組該4-6組之降膽固醇能力則無顯著差異，代表本發明之副乾酪乳酸桿菌降膽固醇之能力於成長期與平穩期較佳。

由此可證，本發明之副乾酪乳酸桿菌於生長時期中之成長期及平穩期之中，具有較佳之吸附膽固醇之能力。

(2)該副乾酪乳酸桿菌耐膽鹽與降膽固醇之特性

請參照第5表及第4圖所示，係本發明之副乾酪乳酸桿菌於不同膽鹽濃度5-1~5-6組降膽固醇之情形，其中該各組別之培養基係含有100 ppm膽固醇之MRS液態培養基，培養24小時後，以磷苯二醛法測量各組別該MRS液態之膽固醇濃度。本實施例之不同膽鹽濃度組別分別係含有0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%及0.5%膽鹽之MRS液 態培養基，進行不同膽鹽濃度組別降膽固醇測試，其中測含本發明之副乾酪乳酸桿菌(Chol-LP)與不含本發明之副乾酪乳酸桿菌(Chol-Blank)之MRS液態培養基中膽固醇之濃度，以及含有膽固醇培養基(VC-100ppm)與不含膽固醇培養基(VC-0ppm)之活菌數。

請參照第4圖所示，X軸為不同膽鹽濃度之5-1~5-6組別，Y1軸係對各組之活菌數對數值(Log CFU/ml)，係對應圖中之長條圖，另Y2軸係對各組之膽固醇濃度(ppm)，係對應圖中之折線圖，其中，該長條圖之斜線組為VC-100ppm、空白組為VC-0ppm，而該折線圖之實線代表本發明之副乾酪乳酸桿菌於含有膽固醇環境下之活菌數Chol-LP，而虛線代表不含有膽固醇環境下之活菌數Chol-Blank。由不同濃度之膽鹽測試其活菌數及降膽固醇 之能力，本發明之副乾酪乳酸桿菌降膽固醇之能力會受到膽鹽的增加而成一反比趨勢，但整體來說，本發明之副乾酪乳酸桿菌於含有膽固醇之環境下，即使膽鹽濃度高達0.5%，仍可保有1×10⁸以上之活菌數，相較於其他習知乳酸菌更具有膽鹽耐受性；此外，本發明之副乾酪乳酸桿菌於膽鹽濃度高達0.5%之環境下，能夠將膽固醇降低到原來的50%(49.3 ppm)。

由此可證，本發明之副乾酪乳酸桿菌於含有膽固醇之環境中，具有較佳之膽鹽耐受性，且具有吸附膽固醇之能力。

(3)該副乾酪乳酸桿菌之酸耐受度

請參照第6表所示，係本發明之副乾酪乳酸桿菌培養於環境酸鹼值pH3.0及7.0之MRS液態培養基的存活率，其中以MRS液態培養基以氫氯酸(HCl)調整其環境酸鹼值，分別為6-1組pH 3.0及6-2組pH 7.0，以溫度37℃、搖床轉速80 rpm之條件下培養3小時後，經適當序列稀釋以MRS固態培養基培養，得到各組之活菌數，並計算本發明副乾酪乳酸桿菌之酸耐受度。

由(3)酸耐受度之試驗證實本發明之副乾酪乳酸桿菌 具有抵抗胃部pH值之能力，因此可提高本發明之副乾酪乳酸桿菌進入腸道中之存活率，進一步達到降膽固醇之功效。

由此可證，本發明之副乾酪乳酸桿菌具有酸耐受性，能通過胃部到達腸道，以於腸道中吸附膽固醇。

(4)該副乾酪乳酸桿菌之細胞吸附能力

請參照第5圖所示，係本發明之副乾酪乳酸桿菌吸附於細胞之試驗。本實施例係以Caco-2細胞進行該細胞吸附能力試驗，該Caco-2細胞係購自新竹食品工業研究所生物資源保存及研究中心，編號BCRC 60182。該Caco-2細胞經15天之培養，會分化成具有腸道細胞極化、刷狀緣及水解酵素等功能，因此選該Caco-2進行(4)細胞吸附能力試驗。

該Caco-2細胞係以DMEM培養液[Dulbecco’s Modified Eagle Medium，其成分包含15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、0.1%非必需胺基酸(Nonessential Amino Acid，NEAA)、100 U/ml青黴素G(Penicillin G)及100 μg/ml鏈黴素(Streptomycin)]於9 cm培養皿中進行細胞培養及繼代，其培養條件係溫度37℃、設定含有5%之二氧化碳之通氣量，約經過36~48小時需更換培養液，待培養至15天之細胞即可進行該細胞吸附能力試驗。

將本發明之副乾酪乳酸桿菌培養經過18小時，去除MRS液態培養基後，以PBS緩衝溶液(Phosphate Buffer Saline)調整乳酸菌菌液之菌數至1×10⁸ CFU/ml，此外，吸除培養Caco-2細胞之DMEM培養液後，注入10 ml之乳 酸菌菌液至載有Caco-2細胞之培養皿中，以溫度37℃、設定含有5%之二氧化碳之通氣量培養1小時，再以PBS緩衝溶液緩慢地沖洗該Caco-2細胞三次去除未吸附至細胞上的乳酸菌，加入5 ml甲醇後置於溫度4℃下20分鐘以固定細胞及乳酸菌於該培養皿後，進行革蘭氏染色，於400×光學顯微鏡下觀察本發明之副乾酪乳酸桿菌吸附於Caco-2細胞之情形。

如第5圖所示，於400×光學顯微鏡之視野下，經過1小時之培養後，本發明之副乾酪乳酸桿菌吸附於該Caco-2細胞量為156±14個菌體，由此可證，本發明之副乾酪乳酸桿菌具有吸附細胞之能力。

(5)該副乾酪乳酸桿菌之膽鹽水解酵素單位活性

請參照第7表及第6圖所示，係本發明副乾酪乳酸桿菌之膽鹽水解酵素單位活性。本實施例係以膽鹽水解酵素之寧海準測試(BSH Ninhydrin Assay)計算每單位菌數(10⁹ CFU/ml)乳酸菌之膽鹽水解酵素活性。

將本發明之副乾酪乳酸桿菌於含有0.3%(w/v)膽鹽之MRS液態培養基進行厭氧培養，經過18小時後，取1 ml之培養菌液進行該BSH寧海準測試。

本實施例係取1 ml之培養菌液以離心方式(6000×g，5分鐘)去除MRS液態培養基後，用PPB緩衝溶液(Potassium Phosphate Buffer，取0.287 g K₂HPO₄及0.456 g KH₂PO₄以蒸餾水定量至500 ml，調整pH至6.5)清洗3次，加入500 μl Reaction Mixture以溫度37℃厭氧培養30分鐘，再加入15%(w/v)三氯醋酸(Trichloroacetic acid)500 μl以中 止反應，以離心方式(12000×g，10分鐘)後，取500μl上清液至玻璃試管中，加入500 μl寧海準試劑以溫度100℃水浴15分鐘，自然冷卻3分鐘後，測定以牛磺酸(Taurine)為基質之OD₅₇₀，以每分鐘產生1 μmole牛磺酸代表一膽鹽水解酵素單位活性，計算吸光值OD₅₇₀對應牛磺酸之產生量，得到一牛磺酸檢量線係如第7圖所示Y=0.0177 X+0.0223(R₂=0.9996)，其中，X軸為牛磺酸產生量、Y軸為OD₅₇₀，以該牛磺酸迴歸方程式計算所得OD₅₇₀其對應膽鹽水解酵素之單位活性。

一般具有膽鹽水解酵素活性之乳酸菌，其單位菌數之膽鹽水解酵素活性至少為0.3 U/10⁹ CFU以上，由第7表可知本發明之副乾酪乳酸桿菌之膽鹽水解酵素活性低(第6圖所示低於0.1 U/10⁹ CFU)，並由前述(1)不同生長時期與其降膽固醇之能力及(2)耐膽鹽與降膽固醇之特性等試驗證實，本發明之副乾酪乳酸桿菌與習知乳酸菌利用本身含有之BSH降膽固醇之途徑不同，係以吸附膽固醇至細胞膜之方式降低膽固醇，因此本發明之副乾酪乳酸桿菌不會發生因膽鹽過度沉澱而造成血液中膽固醇濃度過低，而發生過低膽固醇症之問題。

(6)該副乾酪乳酸桿菌用以降膽固醇之動物試驗

請參照第8表及第8、9圖所示，係以高熱量飼料誘發實驗動物之肥胖症後，投予本發明之副乾酪乳酸桿菌，評估該副乾酪乳酸桿菌於動物試驗降膽固醇之功效。本實施例之實驗動物係選擇以Specific Pathogen Free(SPF)等級之四週齡Sprageu-Dawley(SD)大鼠進行該動物試驗，且該SD大鼠係購自樂斯科生物科技股份有限公司。

本實施例之動物試驗係設計四組實驗組，8-1組為控制組、8-2組為高熱量對照組、8-3組為高熱量實驗組-中劑量及8-4組為高熱量實驗組-高劑量。8-1組係餵食基礎飼料，其中成分包含有23.4%蛋白質、72.1%碳水化合物及4.5%脂肪，每克飼料含有3.3 kcal之熱量；8-2~8-4組則餵食高熱量飼料，其中成分包含有21%蛋白質、48%碳水化合物、30.8%脂肪及0.2%膽固醇，每克飼料含有4.47 kcal之熱量，其中該8-3組及該8-4組分別以管餵方式餵食2×10⁸ CFU/ml及1×10⁹ CFU/ml之該副乾酪乳酸桿菌(其餵食體積為0.5 ml)。

本實施例SD大鼠之飼養溫度為22±2℃，相對溼度50~60%，光照週期為連續12小時，四組動物於起初二週皆以基礎飼料餵食(穩定期)，第三週起該8-2組、該8-3組及該8-4組開始餵食高熱量飼料(誘導期)，並於第十二週起該8-3組及該8-4組每天管餵中、高劑量之乳酸菌0.5 ml，至第二十一週結束動物試驗(試驗期)。

請參照第8表及第9圖，各組別誘導期之總膽固醇量係無顯著差異，經過試驗後再次測得之總膽固醇量及體重，雖然該8-1組與該8-2組無顯著差異，但有餵食中及高劑量乳酸菌之該8-3組及該8-4組之總膽固醇有下降之趨勢。

根據Miao(1997)之研究，大鼠相對於人體之代謝係數為6.25，因此，動物試驗所得該大鼠每公斤體重之攝取劑量=人體攝取量÷(人體體重×6.25)。本實施例之中劑量實驗組之攝取劑量約為2×10⁸ CFU/Kg，根據上述公式計算一個體重為60公斤之成人，該成人約攝取7.5×10¹⁰ CFU(即1.25×10⁹ CFU/Kg)，依國家標準CNS3058「發酵乳」所規定，將該發酵乳製備成每毫升活菌1.0×10⁷ CFU/ml以上，則每人每天飲用該發酵乳(1.0×10⁷ CFU/ml以上)約7500 ml；又，一般市售發酵乳製備每毫升活菌數約為1.0×10^8~9 CFU/ml以上，則每人每天飲用市售發酵乳(1.0×10^8~9 CFU/ml以上)約75~750 ml即可達到本發明之功效。

又本實施例之高劑量實驗組之攝取劑量約為1.0×10⁹ CFU/Kg，根據上述公式計算，一個體重為60公斤之成人，該成人約攝取3.75×10¹¹ CFU(即6.25×10⁹ CFU/Kg)，則每人每天飲用含有活菌1.0×10^8~9 CFU/ml以上之發酵乳約375~3750 ml。

由此可證，以本發明之副乾酪乳酸桿菌餵食SD大鼠確實具有降低大鼠血液中膽固醇之能力。

由上所述，本發明之副乾酪乳酸桿菌可以在含有膽鹽之環境下生長，並且，該副乾酪乳酸桿菌具有吸附消化道中膽固醇之效果，進一步降低人體消化道吸收膽固醇的量；該副乾酪乳酸桿菌可通過酸鹼度較低(pH 3.0)的胃部，到達腸道後仍具有吸附消化道中膽固醇之效果，因此可廣泛應用於吸附消化道中膽固醇之食品組成物或藥物組成物之製備，如保健食品、醫用製劑或加工食品等；該副乾酪乳酸桿菌可以單獨或混合其他所需成分(如載劑、營養成分等)加工製成各種產品形式，如錠劑、膠囊、飲品、粉末或滴劑等，較佳係加工成一乳製品，可以係由各種方式給予個體，以有效吸附宿主消化道中之膽固醇；該副乾酪乳酸桿菌可以吸附於細胞，停留於宿主之腸道環境以增加其吸附膽固醇之效果，降低宿主消化道所吸收膽固醇之量，進一步降低血液中膽固醇之含量。

藉此，本發明之副乾酪乳酸桿菌係具有吸附消化道中膽固醇之能力，進一步降低人體血液中膽固醇之含量。

本發明之副乾酪乳酸桿菌，其細胞膜係具有膽鹽耐受性，使該副乾酪乳酸桿菌能於消化道中存活，具有增進該副乾酪乳酸桿菌吸附消化道中的膽固醇之功效。

本發明之副乾酪乳酸桿菌係具有酸耐受性，該副乾酪乳酸桿菌能通過胃部到達消化道中，達到增進該副乾酪乳酸桿菌吸附消化道中的膽固醇之功效。

本發明之副乾酪乳酸桿菌之用途係將如上所述之副乾酪乳酸桿菌應用於降膽固醇產品的製備，以控制人體吸收過多膽固醇，降低血液中膽固醇之含量，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖：本發明副乾酪乳酸桿菌之處理流程圖。

第2圖：本發明副乾酪乳酸桿菌之不同培養時期降膽固醇之折線及長條圖。

第3圖：磷苯二醛法之膽固醇檢量線圖。

第4圖：本發明副乾酪乳酸桿菌之不同膽鹽濃度與降膽固醇之折線及長條圖。

第5圖：本發明副乾酪乳酸桿菌之細胞吸附顯微照片圖。

第6圖：本發明副乾酪乳酸桿菌之膽鹽水解酵素活性折線圖。

第7圖：BSH寧海準測試之BSH檢量線圖。

第8圖：動物試驗之體重折線圖。

第9圖：動物試驗之總膽固醇長條圖。

<110> 謝寶全

<120> 副乾酪乳酸桿菌及其用途

<140> 99135568

<141> 2000-10-19

<160> 1

<210> 1

<211> 1339

<212> DNA

<213> Lactobacillus paracasei

<400> 1

Claims (2)

1. 一種副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)，係寄存於中華民國食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910482，其中，該副乾酪乳酸桿菌之16S rDNA序列係包含如SEQ ID NO：1所示之序列。
2. 一種副乾酪乳酸桿菌之用途，係將依申請專利範圍第1項所述之副乾酪乳酸桿菌用以製備降低血液中膽固醇之食品組成物或藥物組成物。