CN116333915A - 乳酸菌 - Google Patents

Abstract

提供新的乳酸菌。一种乳酸菌，其为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)S25株(接收编号：NITE ABP‑03571)。

Description

乳酸菌

技术领域

本公开涉及新的乳酸菌等。需要说明的是，本说明书中记载的全部文献的内容通过参照而引入本说明书。

背景技术

正在研究利用乳酸菌发酵物来发挥各种效果。例如，已知发挥改善肠道屏障作用(专利文献1)或改善皮肤(专利文献2)等效果，真正进行有用的乳酸菌的探索。

另外，已知Th1细胞产生的IFN-γ及IL-12可活化NK细胞、细胞杀伤性T细胞等而增强细胞免疫，在初次免疫应答中尤其重要。另一方面，已知以Th2细胞所产生的IL-6为核心的细胞因子使B细胞介导的体液免疫。

由Th1细胞产生的细胞因子(也称为Th1型细胞因子)抑制Th2细胞的细胞因子产生，由Th2细胞产生的细胞因子(也称为Th2型细胞因子)抑制Th1细胞的细胞因子产生。一般认为免疫应答中两者的平衡很重要，近年日益增加的变应性疾病的主要原因在于，Th1型细胞因子/Th2型细胞因子平衡变成Th2型占优势。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开第2019-011315号公报

专利文献2：日本特开第2019-011316号公报

发明内容

发明要解决的问题

课题在于，提供诱导Th1细胞产生细胞因子的能力高的乳酸菌。

用于解决问题的方案

本发明人们发现植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)S25株(接收编号：NITE ABP-03571)具有高的IL-12产生诱导能力，进而反复进行了改良。

本公开包括例如以下项中记载的主题。

项1.

一种乳酸菌，其为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)S25株(接收编号：NITE ABP-03571)。

项2.

一种经口组合物，其包含项1所述的乳酸菌。

项3.

一种饮食品组合物或药物组合物，其包含项1所述的乳酸菌。

项4.

根据项2或3所述的组合物，其用于免疫调节或用于细胞免疫增强。

发明的效果

提供IL-12产生诱导能力高的、新的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)S25株。

附图说明

图1示出各种植物性乳酸菌的IL-12产生诱导能力(OD450处的吸光度)。

图2A示出添加植物乳植杆菌S25发酵西蓝花(broccoli)时的培养上清中的IL-6浓度(pg/ml)。

图2B示出添加植物乳植杆菌S25发酵西蓝花时的培养上清中的IL-10浓度(pg/ml)。

图2C示出添加各种发酵西蓝花时的培养上清中的IFN-γ浓度(pg/ml)。

图2D示出添加各种发酵西蓝花时的培养上清中的IL-12浓度(pg/ml)。

图2E示出添加各种发酵西蓝花时的培养上清中的Th1型细胞因子/Th2型细胞因子比(IFN-γ/IL-6)。

图2F示出添加各种发酵西蓝花时的培养上清中的Th1型细胞因子/Th2型细胞因子比(IL-12/IL-10)。

图3示出各种植物性乳酸菌所带来的NK活性。

图4示出S25死菌的抗炎症作用。

具体实施方式

以下对本公开中包括的各实施方式进一步进行详细说明。

本公开中包括的乳酸菌为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)S25株(接收编号：NITE ABP-03571)。本说明书中，有时将该乳酸菌记作“本公开的乳酸菌”。

植物乳植杆菌S25株已经于2021年12月15日被独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(现在的国家技术评估学会，专利微生物保藏中心、日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)以接收编号：NITE ABP-03571接收。

本公开的乳酸菌是从作为京都腌渍品的酸萝卜咸菜(日语：すぐき)中分离出的植物性乳酸菌。

本公开的乳酸菌与从柴渍(日语：しば漬)中分离出的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantalum)及从柴渍中分离出的戊糖乳植杆菌相比，具有高的IL-12产生诱导能力。需要说明的是，IL-12是主要由Th1细胞产生的细胞因子。

使用本公开的乳酸菌发酵西蓝花的情况下，与使用从柴渍中分离出的植物乳植杆菌、从柴渍中分离出的戊糖乳植杆菌、从酸萝卜咸菜中分离出的其它戊糖乳植杆菌、及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)时相比，能够促进IFN-γ的产生。需要说明的是，IFN-γ是主要由Th1细胞产生的细胞因子。

使用本公开的乳酸菌发酵西蓝花的情况下，与使用从柴渍中分离出的植物乳植杆菌、从柴渍中分离出的戊糖乳植杆菌、从酸萝卜咸菜中分离出的其它戊糖乳植杆菌、及长双歧杆菌时相比，能够促进IL-12的产生。

使用本公开的乳酸菌发酵西蓝花的情况下，与使用从柴渍中分离出的植物乳植杆菌、从柴渍中分离出的戊糖乳植杆菌、从酸萝卜咸菜中分离出的其它戊糖乳植杆菌、及长双歧杆菌时相比，IFN-γ/IL-6的浓度比显示1.0以上的高值。需要说明的是，IL-6是主要由Th2细胞产生的细胞因子。

另外，使用本公开的乳酸菌发酵西蓝花的情况下，能够促进IL-6的产生。

使用本公开的乳酸菌发酵西蓝花的情况下，与使用从柴渍中分离出的植物乳植杆菌、从柴渍中分离出的戊糖乳植杆菌、从酸萝卜咸菜中分离出的其它戊糖乳植杆菌、及长双歧杆菌时相比，IL-12/IL-10的浓度比显示1.0以上的高值。需要说明的是，IL-10是主要由Th2细胞产生的细胞因子。

另外，使用本公开的乳酸菌发酵西蓝花的情况下，能够促进IL-10的产生。

本公开的乳酸菌由于Th1型细胞因子、Th2型细胞因子中任一细胞因子的产生均提高，因此能够激活生物体整体的免疫。特别地，通过诱导作为由Th1细胞产生的细胞因子的IFN-γ和/或IL-12的产生，能够提高Th1型细胞因子/Th2型细胞因子比(例如IFN-γ/IL-6、IL-12/IL-10等)。

本公开的乳酸菌能够通过诱导作为由Th1细胞产生的细胞因子的IFN-γ和/或IL-12的产生而增强NK活性。

本公开还包括一种经口组合物，其包含上述乳酸菌。

另外，本公开还包括一种饮食品组合物，其包含上述乳酸菌。

另外，本公开还包括一种药物组合物，其包含上述乳酸菌。

本说明书中，有时将这些组合物统称为“本公开的组合物”。

为饮食品组合物时，例如可以为加工食品、饮料、健康食品(营养功能食品、特定保健用食品等)、补充剂、病患用食品(医院食品、病人食品或看护食品等)等。

本公开的组合物中的乳酸菌的含量没有特别限定，例如优选为0.1～100质量％左右，更优选为1～99质量％左右、2～90质量％或5～50质量％左右。

本公开的组合物中，乳酸菌可以为活菌体，也可以为死菌体。

本公开的组合物中，乳酸菌可以经过或未经例如破碎、加热、干燥(冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等)、冷冻、溶菌、提取处理等。

本公开的组合物可以包含上述乳酸菌、且还包含其它成分。作为该其它成分，可例示药理学上或食品卫生学上可接受的基剂、载体、溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、增稠剂、抗氧化剂、保存剂、包衣剂、着色剂等。这些成分可以单独使用1种或将2种以上组合使用。

将上述乳酸菌和根据需要使用的其它成分组合并按照常法，可以制备本公开的组合物。

本公开的乳酸菌例如能够诱导IL-12的产生、诱导IFN-γ的产生、提高Th1型细胞因子/Th2型细胞因子比(例如IFN-γ/IL-6、IL-12/IL-10等)、或增强NK活性。因此，本公开的组合物例如可以适宜地用于免疫调节用途、细胞免疫增强用途、肠道免疫调节用途、肠道免疫增强用途等。本说明书中，“免疫调节”是指使Th1型细胞因子在Th1型细胞因子/Th2型细胞因子平衡中占优势。另外，本公开的组合物例如也可以适宜地用作用于缓和外部刺激对身体造成的影响、使身体状况始终维持良好的、用于通过日常摄取而全身(例如肠道等)的免疫(抵抗)力提高、维持良好的全身状态的组合物。

作为本公开的组合物的摄取对象，可列举例如人、人以外的哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔子、牛、猪、狗、猫、绵羊、猴子等)。

作为人，可列举例如：血中的Th1型细胞因子/Th2型细胞因子平衡中，Th2型细胞因子占优势的人；具有变态反应症状的人(例如具有特应性皮炎、花粉症的人等)；肠道免疫变弱的人(例如免疫力随着年龄增长而降低的老年人、由于过度摄取高脂肪饮食而发生了肠炎的人等)；容易感冒的人；支气管哮喘人士；处于慢性炎症状态的人(例如溃疡性大肠炎、经常吸烟/饮酒的人、总是觉得疲劳的人、饮食不规律的人、处于压力大的环境下的人、有肥胖/糖尿病等生活习惯病的人等)；具有通常认为肠道、全身的Th1型细胞因子/Th2型细胞因子失衡为病因之一的疾病的人(作为该疾病，可列举例如变态反应(儿童/成人的特应性皮炎、花粉症)、炎症性肠疾病(溃疡性大肠炎)等)；需要激活全身免役的人(例如，由于压力、营养不足而全身免役功能(NK细胞活性)下降的人，为了预防癌症、预防感冒等病毒性感染症而想要提高全身免役功能(NK细胞活性)的人)等。另外，即使在观察不到这些症状时，也可以为了维持免疫功能而在预防中使用。

摄取的乳酸菌的量没有特别限制，例如每天(特别是成人每天)优选1～1000亿个，更优选10～100亿个。

关于本公开的组合物中包含的乳酸菌量，也可以参考该每天的乳酸菌摄取量来设定。每1g乳酸菌死菌粉末中通常包含1.0×10¹¹～1.0～10¹³个左右的乳酸菌，因此，例如也可以参考该值在本公开的组合物中以包含上述每天的乳酸菌摄取量的方式来设定乳酸菌死菌粉末并制备组合物。另外，也可以将组合物中所含的乳酸菌量设为上述每天的乳酸菌摄取量的例如1/2或1/3，并且将该组合物的摄取设为一天数次(2次或3次)。

需要说明的是，本说明书中“包含”也包括“实质上由……构成”和“由……构成”(The term"comprising"includes"consisting essentially of”and"consisting of.")。另外，本公开包括全部的、本说明书中说明的构成要件的任意组合。

另外，上述的对本公开的各实施方式进行说明的各种特性(性质、结构、功能等)在对本公开所包括的主题进行规定时，可以任意地组合。

即，本公开包括全部的、由本说明书中记载的可组合的各特性的全部组合构成的主题。

实施例

以下示出例子来更具体地说明本公开的实施方式，但是本公开的实施方式不受下述例子限定。

作为被检物质，使用表1所示的6株植物性乳酸菌。

[表1]

人外周血单核细胞(PBMC)的分离

以加肝素采血方式采集人外周血，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(NycomedPharma，Oslo，Norway)分离出PBMC，在RPMI1640培养基(补充10％FCS、5mM Hepes和抗生素)中培养。

体外刺激条件

用被检物质(干重量1μg、约l×10⁶个细胞)对人外周血PBMC(1×10⁶/ml)进行体外刺激，研究IL-12的变化。需要说明的是，作为阴性对照，使用仅PBMC，作为阳性对照，使用用10μg/ml的植物凝集素(PHA)进行了刺激的PBMC。

IL-12产生量的测定

通过ELISA测定用被检物质对PBMC进行18小时体外刺激时培养上清中的IL-12产生量。将结果示于图1。

如图1所示，确认了所评价的戊糖乳植杆菌和植物乳植杆菌S25株均具有高的IL-12产生诱导能力。

将表1所示的6株植物性乳酸菌及由Bifilon 50N进行纯培养而得长双歧杆菌菌株分别接种于按照常规方法制备的Lactobacilli MRS Broth，对于6株植物性乳酸菌6株，在30℃下培养20小时，对于长双歧杆菌菌株，在36℃下培养20小时。

另一方面，将冷冻西蓝花泥解冻，然后以每袋80g填充于透明袋，用微波炉适宜地预加热后，通过热密封进行密封，通过隔水蒸煮方式(97℃以上)进行15分钟加热灭菌。将它们冷却到30～40℃后打开，将各Lactobacilli MRS Broth培养液作为接种剂接种4％(3.2g)。将袋开口部再次通过热密封而密封后，用手充分揉搓袋而使内容物混合，对于6株植物性乳酸菌，在30℃下在恒温器内发酵24小时，对于长双歧杆菌菌株，在36℃下在恒温器内发酵24小时。结束发酵，收集检测用试样后，再次进行热密封，通过90℃以上的隔水蒸煮进行10分钟灭菌处理，冷藏保存至开始细胞因子诱导试验。

将通过与上述方法同样的方法制备的PBMC细胞制备液以1.0ml接种于12孔板(1.0×10⁶个细胞/孔)。以1mg/ml的方式添加上述的发酵后的被检体以及作为对照的等量的PBS(-)，培养24小时。24小时后，收集培养上清并离心后，使用Bio-Plex Suspension ArraySystem测定上清中的IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ。在图2A、图2B、图2C及图2D中，以给予被检体24小时后的培养上清中的IL-6、IL-10、IFN-γ及IL-12的浓度(pg/ml)形式示出结果。另外，图2E及图2F中，示出上清中的由细胞因子浓度计算而得的Th1型细胞因子/Th2型细胞因子比(IFN-γ/IL-6的浓度比、IL-12/IL-10的浓度比)。

如图2A及图2B所示，确认通过添加使用植物乳植杆菌S25株发酵后的西蓝花促进了IL-6及IL-10的产生。

如图2C及图2D所示，确认通过添加使用植物乳植杆菌S25株发酵后的西蓝花促进了IFN-γ及IL-12的产生。

如图2E及图2F所示，确认通过添加使用植物乳植杆菌S25株发酵后的西蓝花，Th1型细胞因子/Th2型细胞因子比(IFN-γ/IL-6、IL-12/IL-10)显示1.0以上的高值。

使用市售的冷冻保存人外周血单核细胞(CellularTechnology U.S.A.)。冷冻PBMC的融解培养基使用了厂家推荐的培养基CTL-Anti-Aggregate Wash Supplement，将冷冻PBMC 1管型瓶在37℃下迅速融解，用CTL-Anti-Aggregate Wash Supplement洗涤后进行离心，得到PBMC。

将解冻后的PBMC用含有10％FCS的RPMI1640培养基调整为3×10⁶/ml浓度后，向24孔板中接种500μl。接着加入50μl的植物乳植杆菌S25株(接收编号：NITE ABP-03571)或自养乐多分离而得的嗜酸乳杆菌，在37℃、5％CO₂下培养20小时。作为对照，也设置了加入PBS的试验组。

培养结束后，用带有细胞滤网式盖的管除去大的残片后，以2000rpm离心5分钟，将沉渣即PBMC用于NK活性测定。

作为效应细胞，使用了PBMC，作为靶细胞，使用作为人NK细胞敏感株的K562细胞。K562细胞在用PBS调整为l×10⁶个细胞/ml后，以终浓度8μg/ml的方式加入疏水性花青膜系荧光色素DiO，在37℃下染色10分钟。之后用PBS洗涤一次，悬浮于含有10％FCS的RPMI1640培养基后，调整为5×10⁴个细胞/ml的浓度。

向96孔U形底微孔培养板的各孔中，以终浓度25μg/ml的方式加入无膜透过性的核酸结合荧光色素PI。在其上以100μl分注悬浮于RPMI1640培养基的PBMC(2×10⁶个细胞/ml的浓度)后，以100μl分注K562细胞(E：T比＝40：1)。将微孔培养板以2000rpm离心5分钟后，在37℃下反应2小时，使用流式细胞仪(Beckman Coulter)测定NK活性。将结果示于图3。

需要说明的是，NK活性通过下式来计算。

NK活性(％)＝DiO阳性PI阳性细胞数/(DiO阳性PI阴性细胞数十DiO阳性PI阳性细胞数)×100-自发裂解.

如图3所示，确认植物乳植杆菌S25株显示出高的NK活性。

抗炎症试验

[材料]

细胞：小鼠巨噬细胞(RAW264.7)

培养基：MEM Alpha(10％(v/v)FBS、1％(v/v)青霉素-链霉素)、Gibco

[概要]

已知NF-κB为在免疫应答中随着炎症信号而核内迁移量增加、调节炎症性细胞因子的表达量的转录调节因子。使用具有在NF-κB所结合的应答序列的下游导入了荧光素酶蛋白基因的载体的RAW264.7(RAW/NFκB-luc)细胞，以荧光素酶蛋白的发光强度为指标确认抗炎症作用。

[实验方法]

将对S25死菌末进行浓度调整并添加于培养基而得者作为试验液。将任意传代数的RAW/NFκB-luc细胞接种于96孔板并进行培养。确认细胞贴壁后，除去培养基并替换为试验液。除了用试验液进行处理的组以外，准备了仅进行培养基更换而不使用试验液的组、用以终浓度15μM添加了作为NF-κB抑制剂的BAY11-7082的培养基进行处理的组。24小时后，用以终浓度100ng/mL添加成为炎症诱导刺激的脂多糖(LPS)而成的试验液进行处理。此时，对于此前仅进行培养基更换而未用试验液进行处理的组，制备了用LPS进行处理的组(LPS处理组)和未用LPS处理的组。另外，用BAY11-7082处理的组在以与此前同样的浓度添加BAY11-7082的基础上还添加了LPS。在LPS添加处理后培养3小时。3小时后，使用荧光酶试验试剂盒(Promega公司)测定荧光酶活性。对于得到的结果，在单因素方差分析处理后，使用Tukey-Kramer法进行多重比较，相对于LPS处理组在p＜0.01下显著。另外，误差棒以平均值±标准误差表示。S25死菌的抗炎症作用结果示于图4。

Claims (4)

1.一种乳酸菌，其为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)S25株(接收编号：NITE ABP-03571)。

2.一种经口组合物，其包含权利要求1所述的乳酸菌。

3.一种饮食品组合物或药物组合物，其包含权利要求1所述的乳酸菌。

4.根据权利要求2或3所述的组合物，其用于免疫调节或用于细胞免疫增强。

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