CN110087656A - 肌苷在治疗T-reg缺乏中的应用 - Google Patents

肌苷在治疗T-reg缺乏中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供肌苷在治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病，特别是免疫失调、多内分泌腺病、肠病、X‑连锁综合征(IPEX)中的用途。在本发明的一个实施方案中，肌苷可以一种能够刺激肌苷产生的细菌菌株的形式提供。还提供在受试者中使用所述菌株刺激肌苷产生的方法，以及选择能够在受试者中刺激肌苷产生的细菌菌株的方法。

Description

肌苷在治疗T-reg缺乏中的应用
发明领域
本发明涉及肌苷在治疗人类中的某些应用。本发明还涉及用于选择能够刺激肌苷产生的特定细菌菌株(包括乳酸细菌菌株)的方法，以及这样的菌株对宿主生物体产生有益作用的用途。
发明背景
肌苷是一种在次黄嘌呤与核糖环相连时形成的核苷，和通常存在于tRNA中。已知肌苷具有很强的免疫调节和神经保护作用，并且可作为膳食补充剂市售获得。肌苷在摄入后产生尿酸，和提示为一种天然抗氧化剂。肌苷已在几个临床试验中，例如在帕金森氏病和多发性硬化症中得到研究。
益生菌被定义为在消费时提供健康益处的微生物。例如，联合国食品和农业组织将益生菌定义为“当以适当量给予时赋予宿主健康益处的活微生物”。产乳酸细菌(例如，乳酸菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacteria))的某些菌株，常被用作各种类型的食品(如酸奶)中的益生菌。有害微生物的生长和定植可以被产乳酸菌通过其自身在哺乳动物上或在哺乳动物内的定植，通过生物膜的形成，通过有效养分的竞争，以及还有特定物质如过氧化氢、细菌素或降低pH的有机酸(包括乳酸和乙酸)的产生来阻止。例如乳酸细菌的一些菌株还已显示在炎性疾病的治疗方案中具有作用，以及对宿主的免疫成熟和稳态也具有影响。
调节性T细胞(Treg)是一个调节免疫系统，保持对自身抗原的耐受性并消除自身免疫性疾病的T细胞亚群。Treg一般抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。调节性T细胞以多种形式出现，其中最充分被理解的是表达CD4、CD25和Foxp3的那些(CD4+CD25+调节性T细胞)。在人类和小鼠中编码Foxp3的基因的基因突变已基于由这些突变引起的遗传疾病而被鉴定。具有Foxp3的突变的人患有严重且迅速致命的自身免疫性病症，称为免疫失调、多内分泌腺病、肠病X-连锁(IPEX)综合征。
发明简述
本发明基于这样的令人惊讶的发现，即当研究scurfy小鼠模型(其是一种由于Foxp3的突变导致的免疫失调多内分泌腺病肠病X-连锁综合征(IPEX综合征)的模型)时，单独的肌苷可以补偿Treg缺乏或Treg功能障碍。
因此，本发明的目的是使用含有肌苷的产品来补偿Treg功能障碍或Treg缺乏，例如在IPEX的治疗中。对于具有某种Treg功能障碍的各种疾病的疗法，或甚至在缺乏或减少Treg-细胞数量的情况下，这是有利的发现。
本发明还基于这样的令人惊讶的发现，即乳酸细菌的某些菌株，特别是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的菌株，能够在体内刺激肌苷产生。事实上，据发明人所知，从前尚未报道益生菌在体内产生肌苷或刺激肌苷产生。因此，本发明还提供一种选择在体内有效刺激或诱导肌苷产生的特定细菌菌株(包括乳酸细菌的菌株)的新方法。
因此，在一个方面，本发明提供用于治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病的肌苷。
在另一个方面，本发明提供一种在受试者中治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的肌苷的步骤。
在另一个方面，本发明提供肌苷在制备用于治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病的药物或组合物中的用途。
在一些实施方案中，和如本文其它地方更详细描述的那样，肌苷可通过给予细菌菌株提供。因此，在一些实施方案中，肌苷通过给予能够刺激或诱导肌苷产生的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株来提供。
附图简述
图1：实验方案。a, 罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)早期治疗SF小鼠(SFL)的方案，在8天龄(d8)开始，每日，至d125，以供生存确定。b, 罗伊氏乳杆菌：晚期治疗SF小鼠(SFL)，在d15开始，每日，至d38，以供生存确定。c, 肌苷治疗SF小鼠(SFI)，在d8开始，每日给予，直至d125，以供生存分析。
图2：生命早期的罗伊氏乳杆菌治疗在SF小鼠中增加生存和抑制自身免疫。a, SF(n=17)和SFL (在d8开始LR-治疗) (n=10)小鼠的生存曲线。b, 在d22，WT、SF和SFL小鼠的肝和肺的代表性H&E染色。c, WT (n=12)、SF (n=12)和SFL (n=10)的肝和肺的炎性浸润的形态计量学定量。d, IFN-γ和IL-4的血浆水平。e, f, 在脾(e)和肠系膜淋巴结(f)中产生IFN-γ或IL-4的CD4+T细胞的比例。误差条，均值± s.e.m。* p < 0.05，*** p< 0.001，SF对比WT。# p < 0.05，## p < 0.01，### p<0.001，SFL对比SF。
图3：罗伊氏乳杆菌治疗结果：晚期治疗在SF小鼠中延长存活和抑制炎症。a, SF(n=17)与从d15至d38用罗伊氏乳杆菌治疗的SF (SFL, n=10)比较的生存曲线。b, WT、SF和SFL小鼠的肝和肺的代表性H&E染色。c, WT (n=12)、SF (n=12)和SFL (n=10)小鼠的肝(左)和肺(右)中炎性浸润的定量。d, IFN-γ和IL-4的血浆水平。e, 在脾中产生IFN-γ或IL-4的CD4+ T细胞的比例。误差条，均值± s.e.m。*** p< 0.001，SF对比WT。## p < 0.01，###p < 0.001，SFL对比SF。
图4：罗伊氏乳杆菌治疗结果：早期治疗提高SF小鼠的小肠绒毛高度和隐窝深度。a, WT、SF和SFL小鼠的小肠的代表性H&E染色。b, c, WT (n=12)、SF (n=12)和SFL (n=10)中的平均绒毛高度(b)和隐窝深度(c)。误差条，均值± s.e.m。** p < 0.01, *** p<0.001，SF对比WT。## p < 0.01, ###p< 0.001，SFL对比SF。
图5：罗伊氏乳杆菌：早期治疗改变SF小鼠中因Treg-缺乏破坏的粪便和血浆的代谢组学特征。a, WT (n=6)、SF (n=6)和SFL (n=4)小鼠的粪便中657种代谢产物的热图。比例尺条指示SF对比WT或SFL对比SF的倍数变化。b, 由SF对比WT或SFL对比SF小鼠影响的粪便代谢产物数量，上调(↑)或下调(↓) (p < 0.05)。c, WT (n=6)、SF (n=6)和SFL (n=5)小鼠血浆中525种代谢产物的热图。比例尺条指示SF对比WT或SFL对比SF的倍数变化。d, 由SF对比WT或SFL对比SF小鼠影响的血浆代谢产物数量，上调(↑)或下调(↓) (p < 0.05)。e, 显示用罗伊氏乳杆菌早期治疗的SF小鼠中明显改变的29种血浆代谢产物的水平的热图。颜色指示倍数变化(SF对比WT或SFL对比SF)。通过对比双向方差分析，指明的所有变化均为p <0.05。G = 绿色，LG = 浅绿色，LR = 浅红色，R = 红色。
图6：血浆和粪便中的肌苷的相对定量。显示WT (n=6)、SF (n=6)和SFL (n=5)小鼠的血浆(a)和粪便(b)中肌苷的代谢产物的相对定量的图。误差条，均值± s.e.m。* p <0.05, SF对比WT。# p < 0.05, SFL对比SF。
图7：罗伊氏乳杆菌早期治疗对SF小鼠中肌苷代谢途径的影响。a, b, 显示WT (n=6)、SF (n=6)和SFL (n=5)小鼠的血浆(a)和粪便(b)中肌苷代谢途径的代谢产物的相对定量的图。误差条，平均± s.e.m. ** p < 0.01，SF对比WT。
图8：肌苷抑制SF小鼠中的TH1/TH2分化和自身免疫。肌苷-治疗的SF小鼠(SFI, n=8)对比SF (n=17)的生存曲线。b, 肌苷对来自WT小鼠(n=3)的TH1和TH2细胞的体外分化的影响。c, WT、SF和SFI的肝和肺的代表性H&E染色。d, WT (n=12)、SF (n=12)和SFI (n=8)的肝和肺中炎性浸润的定量。e, IFN-γ和IL-4的血浆水平。f, 脾的产生IFN-γ或IL-4的CD4+ T细胞的比例。误差条，均值 ± s.e.m。* p < 0.05, *** p< 0.001，SF对比WT。††† p <0.001，SFI对比SF。
图9：肌苷不抑制B和T-淋巴细胞的增殖，但分别抑制在TH1和TH2中IFNγ和IL-4的表达。a, 96h后用指定浓度的肌苷治疗的总淋巴细胞的细胞活力(n=4)。b, 96h治疗后肌苷对LPS-刺激的B-淋巴细胞增殖的影响(n=4)。c, 96h治疗后肌苷对PHA-刺激的T-淋巴细胞增殖的影响(n=4)。d, 分别24h后用2mM肌苷治疗的TH1中的IFN-γ (左)或TH2中的IL-4(右)的相对mRNA表达(n=4)。e, 分别72h后用2mM肌苷治疗的TH1中的IFN-γ (左)或TH2中的IL-4 (右)的相对mRNA表达(n=4)。*** p < 0.001。
发明详述及其优选的实施方案
如上所述，本发明提供用于治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病的肌苷。
肌苷可以任何适宜的方式和以任何适宜的形式给予，包括作为化学实体本身，例如单独或作为产品的一部分，例如组合物或药物组合物，其含有作为活性组分的肌苷。一些适宜的含有肌苷的组合物或产品是可市售获得的，例如作为口服制剂(例如胶囊)或注射制剂(例如安瓿)。
例如，肌苷可以方便地作为干粉提供，例如用于口服给予。肌苷的这样的制剂可包封在胶囊中，或作为片剂提供，例如100或500 mg胶囊或片剂。每日剂量(例如对于人受试者)可以是任何适宜的有效剂量，例如可以是在从100 mg至2000或3000 mg的范围内。肌苷也可以通过静脉内注射或肌内注射(或其它胃肠外给予途径)来给予，例如在干燥形式的肌苷重新构成后。在这样的实施方案中，肌苷可以以这样的剂量，例如至多500 mg，例如至多100 mg、200 mg、300 mg、400 mg或500 mg的每日剂量给予。这样的剂量可以以任何适宜的体积，便利地以至多10 ml的体积，例如以至多1 ml、2 ml、5 ml或10 ml的体积或20-100mg/ml的剂量给予。
肌苷可作为唯一的活性组分给予或与其它活性组分一起给予。
以另一种方式，任何能够刺激肌苷产生(例如体内)的药物可用于本发明的治疗方法。例如，在本发明的优选的实施方案中，使用能够在体内刺激肌苷产生的细菌菌株。
本发明因此提供一种选择细菌菌株，特别是乳酸细菌菌株的新方法，所述菌株用作益生菌和用作治疗药物。这样的菌株因为它们具有刺激肌苷产生的能力，特别是它们在给予受试者时在体内刺激肌苷产生的能力而被选择。用于本发明的方法的菌株可以任何适宜的方式刺激或诱导肌苷产生。例如，本发明包括其中细菌菌株本身能够直接产生肌苷，例如分泌肌苷的实施方案，或其中细菌菌株间接刺激或诱导肌苷产生的实施方案。用于本发明的方法的菌株通过例如改变摄取/排泄(例如从GI道)，也可调节肌苷利用。因此，用于本发明的适宜的菌株是可导致有关受试者的肌苷水平增加的那些菌株。
因此，本发明的一个方面提供一种选择能够刺激肌苷产生的细菌菌株，优选乳酸细菌菌株的方法，其中所述方法包括：
a) 将要测试的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株给予合适的动物模型，例如小鼠模型，例如scurfy小鼠模型；
b) 从所述动物模型，例如小鼠模型获得样品，例如血浆和/或粪便样品；
c) 测量代谢产物，例如血浆和/或粪便代谢产物，例如通过代谢组学分析，例如非靶向代谢组学分析平台进行；
d) 选择能够刺激肌苷产生的细菌菌株。
步骤c)中分析或定量的代谢产物之一是肌苷，以致可在步骤d)中选择能够刺激肌苷产生的细菌菌株。在其它实施方案中，步骤c)可包括以任何适当的方法，单独测量或分析肌苷，或与其它代谢产物一起测定或分析肌苷。执行一个或多个这样的步骤的优选方法在实施例中概述。在优选的实施方案中，分析血浆(或其它全身样品，例如外周血或血清)。
按另一种观点，本发明提供一种通过筛选细菌菌株(例如乳酸细菌菌株)刺激肌苷产生的能力，并选择具有这种能力的菌株，选择细菌菌株，优选乳酸细菌菌株的方法。优选的方法步骤已在上文概述。
具有刺激高水平或显著或增加水平的肌苷，例如血浆或GI道中的肌苷水平(例如与在缺乏所述细菌菌株的情况下观察到的水平比较)的能力的细菌菌株是优选的，例如以在受试者中为治疗有效的水平刺激肌苷产生的细菌菌株。因此，在优选的实施方案中，选择具有在体内刺激肌苷产生的能力的细菌菌株，并且在优选的实施方案中，选择方法是体内方法。
因为用于本发明的优选的细菌菌株具有在体内刺激肌苷产生的能力，因此一个优选的选择是在适当的体内实验测定中评估这些菌株，例如使用适宜的小鼠或其它实验动物模型，例如scurfy小鼠模型。测定细菌菌株的肌苷产生刺激和肌苷产生水平(例如在血浆、粪便或GI道中)的适宜方法是本领域技术人员熟知的。例如，肌苷在适宜的小鼠模型中产生的相对定量和比较野生型小鼠、疾病模型小鼠和已给予细菌菌株的小鼠中产生的水平的方法，在实施例中描述。
因此，在本发明的一些实施方案中，选择方法将包括检测或测定通过候选细菌菌株的肌苷刺激的量或水平(例如浓度、水平，或相对水平)的步骤(例如与不存在细菌菌株的肌苷刺激相比)。由于本发明方法所选细菌菌株的下游用途，在筛选或分离出能够刺激肌苷产生的细菌菌株后，其它实施方案将涉及以下进一步的步骤：培养或繁殖或产生这些细菌菌株，并任选地将所述培养或繁殖或产生的菌株配制成包含所述菌株的组合物，例如药物或营养组合物，例如如本文其它部分所述，或可能储存这样的细菌菌株以供将来使用，例如通过冻干或冷冻干燥，此后，它们可进行培养等，并任选配制等，如上文所述。
在使用本发明的方法筛选超过一种细菌菌株的实施方案中，生成的肌苷的量可被定量(例如以绝对或相对的方式)，并且可以选择刺激产生最高量或水平或浓度的肌苷的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株。或者，例如与在所述细菌菌株的不存在下观察到的水平比较，任何能够刺激肌苷水平增加(优选显著增加)的细菌菌株可被选择。
一旦已使用本发明的方法选择适宜的细菌菌株，则它可用于刺激受试者中肌苷的产生，例如局部或全身产生(或增加)。因此，所述细菌菌株还必须能够在受试者中，即体内刺激肌苷的产生，例如局部或全身产生。
在体内进行的本发明的任何一种选择方法(例如使用体内非人类动物模型)中，这样的方法是实验方法，并非为治疗或手术的目的而进行，例如不作为通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法实施，或是非治疗或非手术方法。
因此，本发明的另一个方面提供本发明的细菌菌株或通过本发明的选择方法选择、获得或可获得的细菌菌株在例如体内刺激肌苷产生的方法中的用途。本发明因此提供一种在体内刺激肌苷产生的方法，所述方法包括给予受试者能够在体内刺激肌苷产生的细菌菌株。本发明的选择方法也可用来选择适合用于如本文描述的治疗的新的细菌菌株，其中所述菌株能够在体内刺激肌苷产生。
因此，肌苷可通过使用细菌菌株提供。例如，所述菌株可刺激肌苷产生(例如通过一种间接的机制，其中细菌菌株以某种方式增加肌苷水平，所述方式涉及该菌株本身以外的另一个成分或实体或过程，例如通过诱导其它细胞释放肌苷或通过促进对肌苷的吸收，从而提高肌苷的循环水平，例如血液/血浆水平)。这将因此导致肌苷的全身增加。在另一个实例中，所述菌株可以例如通过改变自例如胃肠道的摄取/排泄来调节肌苷的利用。
因此，本发明的进一步的方面提供一种由本发明的选择方法选择、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株，其中所述菌株能够刺激或诱导肌苷产生，以供用于在受试者中产生，例如局部或全身产生(或增加)肌苷。因此，所述菌株可刺激或诱导体内产生肌苷(或肌苷水平增加)。
本发明的可供选择的实施方案提供一种细菌菌株，例如乳酸细菌菌株，其中所述菌株能够刺激或诱导肌苷产生，以供用于在受试者中产生，例如局部或全身产生(或增加)肌苷。因此，所述菌株可刺激或诱导体内产生肌苷(或肌苷水平增加)。
这种细菌菌株的优选的特征及其应用，例如治疗应用，将在本文其它部分进行描述。例如，依据此类实施方案要治疗的优选的疾病将在本文其它部分进行描述。
因此，如本文其它部分所述，优选的用途是治疗因产生肌苷(或增加肌苷水平)而受益的疾病，例如与缺乏或减少肌苷有关的疾病或与Treg缺乏或Treg功能障碍有关的疾病。
还提供治疗方法或在受试者中刺激肌苷产生(例如局部或全身产生(或增加))的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效刺激肌苷产生，例如局部或全身产生，或水平增加的量给予所述受试者通过本发明的选择方法选择、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株，或给予所述受试者细菌菌株，例如乳酸细菌菌株，其中所述菌株能够刺激或诱导肌苷产生。所述菌株的优选特征及其治疗应用在本文其它部分进行描述。例如，依据此类实施方案要治疗的优选的疾病在本文其它部分进行描述。
本发明还提供通过本发明的选择方法选择、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株(其中所述菌株能够刺激或诱导肌苷产生)在制备用于在受试者中产生肌苷，例如局部或全身产生，或增加水平的组合物或药物中的用途。可供选择的实施方案提供细菌菌株，例如乳酸细菌菌株(其中所述菌株能够刺激或诱导肌苷产生)在制备用于在受试者中产生肌苷，例如局部或全身产生，或增加水平的组合物或药物中的用途。这样的用途是治疗用途，菌株的优选特征及其治疗用途在本文其它部分进行描述。例如，依据此类实施方案要治疗的优选的疾病在本文其它部分进行描述。
包含所述细菌菌株的产品或组合物及所述产品或组合物在本文描述的方法和用途中的应用，形成了本发明的更多方面。
本文其它部分描述的本发明的替代和优选的实施方案和特征同样适用于本发明的治疗方法、用途和产品。
通过本发明的选择方法选择、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株(其中所述菌株能够(例如体内)刺激或诱导肌苷产生)是本发明的又一个方面。还提供由本发明选择的菌株的治疗用途。在本发明的优选的此类实施方案中，选择、获得、可获得或使用的菌株不是罗伊氏乳杆菌DSM 17938。
任何适宜的细菌菌株，例如益生菌细菌菌株，例如任何益生菌细菌，可经受本发明的选择方法，任何适宜的细菌菌株，例如益生菌细菌菌株(其能够刺激肌苷产生(或增加肌苷的水平))可用于本发明的方法或用途，例如用于本文描述的治疗方法或用途。因此，这样的菌株可用于在受试者中体内产生或局部或全身产生肌苷(或增加肌苷水平)。
优选的细菌菌株是乳酸细菌，例如乳杆菌(Lactobacillus)。特别优选的细菌菌株是罗伊氏乳杆菌。因此，本发明的更进一步的方面提供这样的菌株治疗如本文描述的一或多种疾病的用途。在本发明的一些实施方案中，所用的菌株不是罗伊氏乳杆菌DSM 17938。罗伊氏乳杆菌DSM 17938菌株根据布达佩斯条约在2006年1月30日在DSMZ-DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig)保藏。这样的细菌菌株可以是分离的菌株或纯培养物。在一些实施方案中，这样的菌株将与自然存在的细菌菌株不相对应。
如上文所述，如本文描述的肌苷或细菌菌株，或由本发明的选择方法选择的或可获得的菌株，具有治疗用途。因此，本发明的进一步的方面提供如本文描述的肌苷或肌苷刺激菌株，或使用本发明的选择方法选择、获得或可获得的菌株，以供用于在受试者中产生，例如局部或全身产生肌苷。在本发明的优选的实施方案中，所述肌苷或肌苷刺激菌株被用于治疗将从产生或增加产生，例如局部或全身产生肌苷受益的疾病(或病症)。在其它实施方案中，所述肌苷或肌苷刺激菌株被用于治疗可通过给予，例如局部或全身给予肌苷而治疗的疾病(或病症)。示例性疾病是与肌苷水平缺乏或减少相关的那些疾病。
如本文描述的肌苷的产生(或肌苷产生的刺激或诱导)通常指受试者中肌苷的水平(例如浓度)或量的增加。这样的产生可例如是局部产生和/或全身产生。局部产生(或肌苷的局部水平)指给予本文所述的肌苷或细菌菌株的部位(例如GI道、GU道、口腔等)的肌苷的量(或水平，例如浓度)。全身产生(或肌苷的全身水平)指在循环，特别是在外周血、血浆或血清中发现的肌苷的量(或水平，例如浓度)。
因此，当此处提到肌苷的增加时，例如由细菌菌株刺激肌苷产生，或直接给予肌苷或含有肌苷的化合物或产品或组合物所致，这样一种增加可指肌苷的量或水平(例如浓度)的增加。优选地，这样的增加是可测量的增加，更优选它们是显著的增加，优选是有临床意义或有统计学意义的增加，例如当与适宜的对照水平或值比较(例如与未治疗或安慰剂治疗的样品或受试者(例如未给予肌苷)比较，或与其中不存在细菌菌株的样品或受试者比较)时，概率值<0.05。例如，与适宜的对照水平或值比较，肌苷的水平可增加至少0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍，或更多倍。可供选择地或另外地，如本文其它部分所述，增加是例如产生治疗益处或效果，例如抑制或减少TH1和/或TH2细胞的分化。
肌苷的这样的增加通常在体内观察到并可以是例如局部增加和/或全身增加。肌苷的局部增加指在给予本文描述的肌苷或细菌菌株的部位，例如GI道、GU道、口腔等肌苷的量(或水平，例如浓度)增加。肌苷的全身增加指在循环，特别是在血、血浆或血清中发现的肌苷的量(或水平，例如浓度)增加。全身水平增加是优选的，本发明提供基于全身给予肌苷或增加全身肌苷，例如血、血浆或血清中的肌苷的治疗方法。优选的要治疗的疾病或病症在本文其它部分进行描述。
在其它实施方案中，如本文描述的肌苷或肌苷刺激细菌菌株，或使用本发明的选择方法选择、获得或可获得的细菌菌株，可用于治疗与Treg缺乏相关的疾病，或以Treg缺乏为特征的疾病，或与Treg功能障碍相关的疾病，或以Treg功能障碍为特征的疾病，例如Treg缺乏或Treg功能障碍诱导的(或介导的或相关的)炎性疾病或自身免疫性疾病。示例性疾病是与Foxp3+ Tregs缺乏或功能障碍有关或以Foxp3+ Tregs缺乏或功能障碍为特征的那些疾病。发明人已表明，肌苷可模拟Tregs抑制或减少CD4+细胞(例如TH1/TH2细胞)分化的作用。这种对促炎性Th1/Th2细胞的作用可以导致抑制或减少TH1/TH2细胞诱导或介导的炎症。因此，虽然不希望受理论的束缚，本发明可用来治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的任何疾病，因为所给予的肌苷或由细菌菌株刺激的肌苷，可以替代(或弥补) Tregs缺乏(或功能失调)，或模仿缺乏或功能失调的Tregs。
本发明的治疗方法和用途(或肌苷，包括如本文描述的刺激肌苷产生的细菌菌株的方法和用途)可用来抑制或减少CD4+ T-细胞，特别是TH1和/或TH2细胞的分化(和例如抑制或减少TH1/TH2细胞诱导的或介导的炎症或免疫反应)。因此，待治疗的疾病的其它实例是其中期望抑制或减少CD4+ T-细胞，特别是TH1和/或TH2细胞的分化，或抑制或减少TH1和/或TH2细胞诱导或介导的炎症或免疫反应的那些疾病。本发明的治疗方法和用途(或肌苷，包括如本文描述的刺激肌苷产生的细菌菌株的方法和用途)可用来治疗自身免疫性疾病。
待治疗的疾病的其它实例是CD4+ T-细胞驱动的疾病，特别是TH1和/或TH2细胞驱动的疾病，例如由CD4+ T-细胞，特别是TH1和/或TH2细胞的异常(或反常或不希望的)功能或行为(例如不受调节的行为)引起或与其相关的疾病，例如自身免疫性疾病或其它炎性疾病(例如与异常(或反常或不希望的)或增加的炎症相关的疾病)。其它待治疗的疾病是其中CD4+ T-细胞，特别是TH1和/或TH2细胞增加的那些疾病。在此类疾病中观察到的CD4+ T-细胞，例如TH1和/或TH2细胞的这样的增加可以是例如CD4+ T-细胞(例如TH1和/或TH2细胞)的绝对数量或比例的增加，或例如由CD4+ T-细胞，例如TH1和/或TH2细胞产生的细胞因子的水平的增加。CD4+细胞，特别是TH1和/或TH2细胞的这样的增加，或细胞因子的增加可在受试者的血浆或其它部分，例如脾或淋巴结中观察到。为TH1细胞的特征并可被测量的示例性细胞因子是IFN-γ，为TH2细胞的特征并可被测量的示例性细胞因子是IL-4。
Tregs是T细胞的亚群，其调节免疫系统，保持对自身抗原的耐受性，和消除自身免疫性疾病。Tregs通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。调节性T细胞以多种形式出现，其中最充分理解的是表达CD4、CD25和Foxp3的那些(CD4+CD25+调节性T细胞)。编码Foxp3的基因的基因突变在人类和小鼠中基于这些突变引起的遗传疾病而被鉴定。携带Foxp3突变的人类患有严重且迅速致命的自身免疫性病症，称为免疫失调、多内分泌腺病、肠病X-连锁(IPEX)综合征。
因此，可依据本发明治疗的与Treg功能障碍或Treg缺乏相关的疾病(或病症)的更多实例有：
- IPEX
- 与Foxp3的突变或改变有关的疾病
- IPEX-样综合征，例如因CTLA4、CD25、STAT1、STAT5b、ITCH和IL-2Rb的一个或多个的突变所致或与CTLA4、CD25、STAT1、STAT5b、ITCH和IL-2Rb的一个或多个的突变有关的IPEX-样综合征。
从另一个角度来看，本发明还提供了如本文描述的肌苷或肌苷刺激细菌菌株，或使用本发明的选择方法选择、获得或可获得的细菌菌株，用于治疗如本文描述的疾病或病症，特别是治疗IPEX、与Foxp3的突变或改变有关的疾病或IPEX-样综合征，例如因CTLA4、CD25、STAT1、STAT5b、ITCH和IL-2Rb的一个或多个的突变所致或与CTLA4、CD25、STAT1、STAT5b、ITCH和IL-2Rb的一个或多个的突变有关的IPEX-样综合征。
在本文描述的所有实施方案中，术语“与…相关的疾病”或“与…相关的病症”也可指“以…为特征的疾病(或病症)”或“由…引起的疾病(或病症)”。
如本文描述的肌苷(包括刺激肌苷产生的细菌菌株)的治疗用途通常导致相关疾病或疾病症状的减少或减轻，例如可能导致增加或延长生存时间。所述用途可导致受试者中肌苷水平的显著增加或减轻免疫反应(例如减少炎症或减少由效应T细胞例如TH1和/或TH2细胞介导的免疫反应)或降低自身免疫。如本文其它部分所述，增加肌苷水平(或肌苷，包括如本文描述的刺激肌苷产生的细菌菌株的方法和用途)还可补偿Treg细胞的缺乏，或者可模拟Treg细胞并可导致免疫反应的抑制或减少，例如CD4+效应细胞，特别是TH1和/或TH2细胞分化的抑制或减少。这可例如通过为本领域技术人员熟知的任何适宜的方法观察或评估，例如，通过寻找例如治疗后在受试者血浆中的IL-4 (TH2)和/或IFN-γ (TH1)水平的降低或减少，或治疗后在受试者中这样的TH1和/或TH2细胞(例如在受试者的血浆或脾或淋巴结中)的比例(百分比)或频率或数目的减少。
此外，本发明的实施方案涉及提供增加的循环肌苷水平，例如在受试者的血液/血浆中。这样的增加水平可通过静脉内或肌内给予肌苷，或者可供选择地，通过例如，肌苷被更有效地从GI道吸收，或者从血液/血浆中的其它细胞释放(作为细菌的间接结果)获得。本发明的优选的实施方案涉及细菌菌株，其可增加或刺激肌苷从细菌局部给予的部位(例如GI道)吸收到血液/血浆中。以此方式，实现血液/血浆中肌苷水平的增加(或全身肌苷水平的增加)。
因此，疾病或其症状(例如临床症状或严重性，例如对生存的影响)的这种减轻或缓解可通过对于讨论中的疾病或症状或参数(例如细胞因子的水平或T-细胞的类型或生存)的任何适宜的测定来测量，其实例是本领域技术人员熟知的，其一些实例也在本文的实施例中显示。优选疾病或症状的减轻或缓解(或一个或多个参数，例如上述的那些参数的改变)是可以测量的，且优选是显著的，例如有临床意义或有统计学意义，优选具有<0.05的概率值。疾病或症状的这样的减轻或缓解(或一个或多个参数，例如上述的那些参数的改变)通常与适宜的对照个体或群体，例如健康动物或受试者(或其群体)或未治疗或安慰剂治疗的动物或受试者(或其群体)比较，或者方便地与治疗前的同一个体受试者比较来确定。
在本发明的治疗方法和用途中，以药理学或生理学上有效的量实施对有治疗需要的受试者(动物或哺乳动物)给予如本文描述的肌苷(包括刺激肌苷产生的细菌菌株)。因此，所述方法和用途可包括鉴定有治疗需要的受试者的额外步骤。
依据本发明的疾病或病症的治疗(例如治疗已存在的疾病)包括治愈所述疾病或病症，或疾病的任何减轻或缓解(例如减少疾病严重性)或疾病的症状。
本发明的方法和用途适合于预防疾病或病症以及主动治疗疾病或病症(例如治疗已存在的疾病)。因此，本发明还涵盖预防性治疗。为此，在本发明的方法和用途中，在适当时，治疗或疗法也包括预防或防止。
这样的预防(或保护)方面可以方便地对健康或正常或处于危险的受试者进行，并且可以包括完全预防和显著预防。类似地，显著预防可以包括与如果不给予治疗时预期的严重程度或症状相比，减少(例如可测量地或显著地减少)疾病的症状或疾病的严重程度的情景。
本发明的又一个方面提供用于如本文其它地方所定义的治疗用途的肌苷(包括刺激肌苷产生的细菌菌株)，其中所述用途还包括给予至少一种另外的试剂，例如治疗剂或营养剂。在使用细菌菌株的实施方案中，示例性的试剂可能是将增加或促进由所述细菌菌株刺激肌苷的产生的基质成分或其它成分，或这类成分的来源。支持细菌代谢活性的碳源也可以加入到最终制剂中。
所述另外的试剂可与细菌菌株一起给予(例如作为合并的制剂或单一组合物)或可以分开给予。如果分开给予，所述另外的试剂可与细菌菌株同时(或基本上同时)给予，或在不同的时间点给予。合适的给药方案和给予时间可以根据提及的另外的试剂，容易地由技术人员决定。
本发明还提供一种组合物，其包含：
(i) 能够刺激肌苷产生的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株，例如通过本发明的选择方法选择、获得或可获得的乳酸细菌菌株；和
(ii) 一或多种将增加或促进刺激肌苷产生的基质成分或试剂，或这样的成分或试剂的来源。
如本文所用的术语"受试者"包括任何哺乳动物，例如人和任何家畜、驯养动物或实验动物。特别的实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、羊、兔、牛、马和猴。然而，优选受试者是人受试者。在涉及本文描述的治疗方法和用途的实施方案中，适宜的受试者是那些患有、怀疑患有或处于患有待治疗的疾病风险中的受试者。
本发明的方法和用途通常涉及给予如本文定义的肌苷或选择的细菌菌株，例如乳酸细菌菌株至受试者，优选人。
方便地，所述给药是一种局部给药方式，例如口服、直肠、阴道、局部或经管饲。因此，如本文描述的肌苷或细菌菌株可给予至GI道、GU道或口腔，如所需的或适宜的。然而，同样对于一些实施方案，静脉内注射或肌内注射将是适宜的。
根据需要肌苷或刺激肌苷生产，例如局部生产或全身生产，或增加肌苷产生或增加肌苷水平的部位，选择肌苷或细菌菌株的适宜的过药方式和制剂等。优选的给药方式是口服，以便例如促进或导致胃肠道中的肌苷水平增加。如本文其它部分所述，这样的给药方式也可导致血液/血浆中的肌苷水平增加，并且这在一些实施方案中是优选的。当给予肌苷(例如含有肌苷的产品或组合物)且血液/血浆中的肌苷水平增加是需要的时，则静脉内注射或肌内注射可能是适宜的。
如本文描述的肌苷(包括刺激肌苷产生的细菌菌株)的适宜的剂量可根据待治疗的疾病(或病症)、给药方式和有关制剂而容易地选择。因此，通常选择一种剂量和给予方案，以便依据本发明给予受试者的肌苷或细菌菌株可导致肌苷水平或刺激肌苷产生，例如局部产生或全身产生，或肌苷的产生增加或水平增加，例如增加局部产生或全身产生，并产生需要的治疗效果或健康益处(例如增加Tregs (或增加功能性Tregs)或补偿Tregs缺少或如本文其它部分所述的Treg缺乏，例如TH1和/或TH2细胞分化的抑制或减少，或自身免疫、例如与Treg缺乏或功能障碍相关的自身免疫的抑制或减少，或其它减少的TH1和/或TH2细胞介导的炎症，或例如如本文其它部分所述的相关疾病或疾病症状的任何其它减轻或缓解)。
例如，在本发明的一个实施方案中，肌苷被制备为干粉，例如用于口服给予。在这样的实施方案中，肌苷可能被封装在胶囊中，例如100或500 mg胶囊，和每日剂量(例如对于人受试者)可在从100 mg至2000或3000 mg范围内。肌苷也可通过静脉内注射或肌内注射给予，例如在干粉形式的肌苷重新构成后。在这样的实施方案中，肌苷可以以至多500 mg，例如至多100 mg、200 mg、300 mg、400 mg或500 mg的剂量，例如每日剂量给予。这样的剂量可以以任何适宜的体积，便利地至多10 ml的体积，例如至多1 ml、2 ml、5 ml或10 ml的体积或20-100 mg/ml的剂量给予。
在其中肌苷以给予细菌菌株的方式提供给受试者的实施方案中，优选所述剂量是适宜于动物类型和待治疗的病症的治疗有效剂量。例如，可使用104-1013，例如105-109，或106-108，或108-1010，或109-1012总CFU的细菌的每日剂量。优选的每日剂量是约108总CFU，例如107-109或108-109。另一个优选的每日剂量是约1012总CFU，例如1010 或1011-1013，或1011-1012或1012-1013。
如本文所用的“肌苷”被赋予其技术领域所理解的意义。它是一种当次黄嘌呤与核糖环结合时形成的核苷，并且可以通过本领域众所周知和描述的方法来制造，例如通过发酵法。肌苷的系统(IUPAC)命名是9-[2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)氧戊环-2-基]-6,9-二氢-3H-嘌呤-6-酮。用于本发明的肌苷制剂可容易地获得，例如，肌苷已用于其它药物应用，并且肌苷可作为膳食或营养补充剂经商业获得。
如本文描述的应用的肌苷可呈现为含有肌苷或其盐，例如其药学上可接受的盐的产品或组合物的形式，其实例是本领域技术人员熟知的。例如，肌苷可呈现为组合物(例如药物组合物)的形式，其包含所述肌苷化合物以及一种或多种可接受的(例如药学上可接受的)载体、赋形剂或稀释剂。可接受的载体、赋形剂和稀释剂，例如对于治疗应用，是本领域熟知的并可根据预期的给予途径和标准实践进行选择。实例包括粘合剂、润滑剂、助悬剂、溶剂、涂布剂、增溶剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、表面活性剂、甜味剂、着色剂、调味剂、除臭剂、缓冲剂、抗氧化剂、稳定剂和/或盐。含有肌苷的组合物是本领域众所周知的和描述的，可使用这些的任何一种。
本文描述的肌苷化合物可根据本领域熟知的技术，用一种或多种常规载体和/或赋形剂配制。例如，这些可使用常规赋形剂，例如溶剂、稀释剂、粘合剂，甜味剂、芳香剂、pH调节剂、粘度调节剂、抗氧化剂等配制为常规口服给予形式，例如片剂、包衣片、胶囊、散剂、颗粒剂、溶液、分散剂、悬浮液、糖浆、乳剂等。合适的赋形剂可包括，例如，玉米淀粉，乳糖，葡萄糖，微晶纤维素，硬脂酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，柠檬酸，酒石酸，水，乙醇、甘油，山梨醇，聚乙二醇，丙二醇，鲸蜡硬脂醇，羧甲基纤维素或脂肪物质例如硬脂或其合适的混合物等。
构思了本文所述的肌苷化合物或组合物也可通过其它常规给药途径，例如胃肠外给予。当采用胃肠外给予时，例如，这可能是通过静脉内注射、皮下注射或肌内注射来实现的。
如本文所用的术语“Treg”指调节性T细胞。调节性T细胞(Tregs)在维持免疫激活和耐受性之间的平衡，从而控制免疫反应和炎症方面，起着至关重要的作用。Tregs是CD4+T辅助细胞的抑制性子集，对免疫反应的调节很重要。因此Tregs是免疫抑制剂，通常抑制或下调效应T细胞例如TH1和TH2细胞的诱导(例如分化)和增殖。此外，一种关键的转录因子，叉头盒(forkhead box) P3(FOXP3)是它们的发展和适当的功能所必需的。Tregs是CD4+ T细胞对TH1和TH2细胞的不同子集。本领域技术人员将能够很容易地区分这些亚型，例如通过使用特征性细胞表面标记。例如，Tregs可与其它亚型的T-细胞区分开来，因为除了CD4外，它们对FOXP3都是阳性的。
“Treg-功能障碍”意指调节性T细胞(Tregs)不能正常工作(或功能不正常或异常，或以一种不理想或病态的方式发挥功能)，例如通过失去其对免疫反应的控制，例如导致不受控制的免疫反应或免疫活性。它包括Tregs和T效应细胞之间的不平衡，例如其中T效应细胞(例如TH1和/或TH2细胞)是过度反应或过度产生的，例如导致不受控制的或增加的免疫反应或炎症(例如TH1和/或TH2细胞介导的或诱导的炎症)。Treg-功能障碍可能是异常或反常或病理性FOXP3功能的结果，例如由FOXP3，例如FOXP3基因或蛋白中的突变、改变或其它缺陷引起。
“Treg-缺乏”意指缺乏调节性T细胞(Tregs)并包括从正常水平减少Tregs的数量，或者生成不足够的Tregs的情况。Treg缺乏，例如由于FOXP3缺乏，导致称为免疫失调、多内分泌腺病、肠病、X-连锁综合征(IPEX)的疾病发生，其是一种在婴儿早期开始的严重自身免疫性疾病。
Treg缺乏或功能障碍可在动物模型例如SF (scurfy)小鼠中分析，其在Foxp3的叉头结构域中具有缺失，并且不能发育胸腺源性Foxp3+调节性T细胞(nTreg)。这导致伴有多器官炎症的胎儿淋巴增生综合征的发生。
不受控制的免疫活性是有问题的并且可能是有害的且导致许多不同类型的严重病症。关于Tregs的调节以及在缺乏Tregs或Tregs不能正常发挥功能的情况下如何恢复其功能，仍然知之甚少。本发明提供一种克服这样的Treg缺乏和/或Treg功能障碍的解决方案。在本文的实例中，已表明给予肌苷或给予可刺激肌苷产生的细菌菌株可在SF小鼠中导致延长的生存和其它有益效果，从而明显地补偿在这样的小鼠中的Treg缺乏/功能障碍。
如本文描述的术语"降低"或"减少"或“缺乏” (或等同术语)，例如涉及生存、细胞因子、TH1细胞、TH2细胞或Tregs的水平的所述术语，包括在与适宜的对照比较时的任何可测量的降低或减少。适宜的对照将容易地由本领域的技术人员鉴定，并可包括非-治疗的受试者或在较早的时间点测量的相同个体受试者的特定参数水平(例如与该受试者的"基线"水平比较)。优选降低或减少将是显著的，例如在临床上或统计学上显著的。
如本文描述的术语"增加"或“促进” (或等同术语)，例如涉及生存、细胞因子、TH1细胞、TH2细胞或Tregs的水平的所述术语，包括在与适宜的对照比较时的任何可测量的增加或升高。适宜的对照将容易地由本领域的技术人员鉴定，并可包括非-治疗的受试者或在较早的时间点测量的相同个体受试者的特定参数水平(例如与该受试者的"基线"水平比较)。优选增加将是显著的，例如在临床上或统计学上显著的。
测定受试者的测试组之间的差异或特定参数水平的差异的统计显著性的方法是众所周知的，并在本领域中有记录。例如，如果使用显著性检验的统计比较显示概率值<0.05，本文中特定参数水平的降低或增加或受试者的测试组之间的差异则一般认为具有统计学显著性。一些适宜的统计学方法在下面的实施例中概述。
本发明将参照以下非限制性实施例进一步描述。
实施例
。
表1 所用的抗体和细胞因子
。
表2 所用的qPCR引物序列
方法
小鼠
野生型C57BL/6和杂合子B6.Cg-Foxp3sf/J雌性小鼠购自Jackson Laboratories。然后，所有的小鼠都在Houston, Houston, Texas, USA的The University of Texas HealthScience Center按照机构批准的方案(Institutional Animal Care and Use Committeeno. AWC-14-056)繁殖和饲养。杂合子B6.Cg-Foxp3sf/J雌性小鼠与C57BL/6J雄性小鼠繁殖，产生半合子B6.Cg-Foxp3sf/Y，scurfy(SF)雄性小鼠。由于Foxp3基因位于X染色体上，所以在每一窝繁育对中，所有雄性是用作实验的SF，或者作为对照的WT同窝仔鼠。
在每一组不同的实验中使用的动物数量在图和图例中有显示。
罗伊氏乳杆菌制剂及治疗SF小鼠
人乳源性罗伊氏乳杆菌DSM17938 (L. reuteri)由Biogaia AB (瑞典斯德哥尔摩)提供。罗伊氏乳杆菌如前所述(Liu Y. et al. Am. J. Physiol Gastrointest. LiverPhysiol 307, G177-G186 (2014))制备。SF小鼠通过管饲每日给予罗伊氏乳杆菌，从8天龄(d8) (罗伊氏乳杆菌早期治疗)或d15 (罗伊氏乳杆菌晚期治疗)开始，直至实验程序结束，如分别在图1a和b中所示。每只小鼠每天给予107 CFU的罗伊氏乳杆菌。由于SF小鼠一般在d13-d15表现出SF表型，所以所有雄性小鼠均给予罗伊氏乳杆菌以供早期治疗。在每日观察后，仅最终表现SF表型并通过流式细胞术在脾细胞中证实Foxp3-阴性T细胞的雄性小鼠被标记为SF+罗伊氏乳杆菌(SFL)。
肌苷制剂及治疗SF小鼠
肌苷(Sigma-Aldrich)以40 mg/ml溶解在灭菌水中。为测定肌苷对SF小鼠自身免疫的影响，将800mg/kg肌苷每天口服给予SF小鼠，从d8直至实验结束，如在图1c中所示。
组织病理学
从WT和SF小鼠(图1)获得的所有组织，经Cellular and Molecular Morphology CoreLab (the Texas Medical Center Digestive Diseases Center, Houston, TX)固定和处理后，用苏木精和伊红(H&E)染色以供组织学评估。用Image J形态测量软件(NIH, USA)测量肝和肺的淋巴细胞浸润面积，以及小肠的绒毛高度和隐窝深度。
用于流式细胞术分析的体外组织制备及刺激
通过将组织轻轻地破碎并通过40 μm细胞滤器(BD Bioscience)将组织过滤到由磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.5%牛血清白蛋白(BSA) (Hyclone Laboratories)和2 mM EDTA(Lonza)组成的MACS缓冲液中，从脾和肠系膜淋巴结(MLN)获得单细胞悬液。
对于体外刺激，用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA) (50 ng/mL)和伊屋诺霉素(1 μg/mL)在布雷菲德菌素A (brefeldin A) (5 μ/mL)的存在下刺激细胞4小时，以分析产生IFN-γ(TH1)和产生IL-4(TH2)的CD4+ T细胞。
幼稚CD4+T细胞分离和体外分化为TH1和TH2
通过磁细胞分选，使用幼稚CD4+ T细胞分离试剂盒(MACS Miltenyi Biotec)，从6-8周龄C57BL/6或腺苷受体敲除小鼠的脾脏中分离出幼稚CD4+ T细胞。
对于TH1分化，于37℃，将幼稚T细胞(5 ×105个细胞/孔)平铺到24-孔板中，孔中含有在RPMI1640完全培养基中的1 μg/mL抗-CD3、2 μg/mL抗-CD28、20 ng/mL IL-2、10 μg/mL抗-IL-4中和抗体和20 ng/mL重组小鼠IL-12，持续5天，伴有或没有2 mM肌苷。
对于TH2分化，于37℃，将幼稚T细胞在RPMI1640完全培养基中的1 μg/mL抗-CD3、2μg/mL抗-CD28、20 ng/mL Il-2、10 μg/mL抗-IFN-γ中和抗体和10 ng/mL重组小鼠IL-4的存在下培养5天，伴有或没有2 mM肌苷。在第5天，在布雷菲德菌素A的存在下，用PMA和肌霉素刺激细胞，如上所述。
详细的抗体和细胞因子列于表1中。
染色细胞以供流式细胞术分析
为评价幼稚CD4+ T细胞的纯度，分选后，细胞使用荧光素标记的CD44、CD45RB、CD4和CD62L染色。
对于TH1和TH2细胞的特征鉴定，细胞用荧光素标记的-CD4进行表面染色并用IFN-γ对TH1和用IL-4对TH2进行细胞内染色。根据制造商的方案(eBioscience, San Diego,CA)，细胞内染色用固定/渗透试剂盒执行。
在BD FACSCalibur上采集来自所有样品的数据，并使用FlowJo软件(TreeStar,Inc. Ashland, OR)进行分析。
所用的详细抗体列于表1中。
淋巴细胞增殖试验
将脾淋巴细胞以2 x 104个细胞/孔的初始密度分配到96孔板中，并分别在对照、40μg/ml LPS或10μg/ml PHA条件下与不同剂量的肌苷一起孵育。96 h后，细胞活力用TACS XTT细胞增殖测定试剂盒(Trevigen, Inc. Gaithersburg, MD)测量。
血浆细胞因子测定
IFN-γ、IL-4、IL-2、IL-1β和IL-10的血浆细胞因子水平根据制造商的方案，使用MesoScale Discovery (Gaithersburg, MD)的小鼠多点促炎面板试剂盒进行评估。
粪便微生物群落分析
从指定年龄的用罗伊氏乳杆菌治疗(SFL)的WT、SF和SF组收集从盲肠到直肠挤出的粪便(图1a-b)。用Quick Stool DNA Isolation Kit (Qiagen)提取粪便DNA。如前所述(Gupta,R.W. et al. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 56, 397-400 (2013))，采用PCR扩增的16s rRNA基因的高通量测序分析对粪便微生物群的组成进行分析。细菌多样性、物种组成和丰富度使用QIIME (Caporaso,J.G. et al. Nat. Methods 7, 335-336(2010))评价。
血浆和粪便代谢组学分析
血浆和粪便代谢产物用Metabolon Inc测定，如前所述(He B. et al. Sci. Rep. 5,10604 (2015))。用非靶向代谢组学分析平台，包括UPLC- MS/MS和GC/MS分别检测了粪便中总共657种代谢产物和血浆中总共525种代谢产物。然后通过模式识别分析(无监督主成分分析和热图)分析代谢组学数据，揭示了Treg-缺乏或罗伊氏乳杆菌治疗诱导的生化紊乱。
统计学分析
本研究中的所有复制都是生物学的，也就是说，用其它小鼠的重复实验。采用D'Agostino-Pearson多项检验以验证所有数据均为正态分布的。采用用于多重比较的校正单向ANOVA与Tukey和Dunnett事后检验，或用于多重比较的双向ANOVA与Bonferroni检验，确定了显著性。数据以平均值± s.e.m表示。绘制了Kaplan-Meier生存曲线，并用具有卡方检验的Logrank进行比较分析。使用GraphPad Prism版本4.0 (GraphPad Software, SanDiego, CA, USA)进行统计分析。在P<0.05时差异被记录为显著的。未采用统计学方法预先确定样本大小。没有动物被排除在分析之外。没有采用随机化。所有组织学分析由2名盲法观察者进行(图1、2和4，图6、8、9和14)。
实施例1
T-reg缺乏小鼠的罗伊氏乳杆菌治疗
为了确定靶向肠道微生物群是否会影响Treg缺乏相关的自身免疫，发明人用人共生的罗伊氏乳杆菌DSM 17938治疗SF小鼠，根据上述方法在第8天龄(“早期”)或第15天龄(“晚期”)开始(图1a、b)。无论是早期或晚期治疗显著延长SF小鼠的生存(图2a和图3a)。此外，罗伊氏乳杆菌减少肝和肺的炎性浸润(图2b、c和图3b、c)。罗伊氏乳杆菌减少血浆中细胞因子IFN-γ和IL-4的水平，和脾和MLN中的TH1和TH2细胞的频率(图2d-f和图3d、e)。罗伊氏乳杆菌还挽救了Treg-缺乏对小肠的绒毛高度和隐窝深度的影响(图4a-c)。组织病理学、细胞因子测量和淋巴细胞调查如上所述进行。这些结果表明罗伊氏乳杆菌可治疗及预防SF小鼠的自身免疫，并且罗伊氏乳杆菌还可用于在人中治疗T-reg缺乏疾病，例如IPEX。
实施例2
代谢组学特征
鉴于共生细菌代谢的代谢产物在微生物与宿主的相互作用中起着关键作用，发明人根据上述方法分析了粪便和血浆的代谢组学特征。粪便和血浆中分别有657和525种代谢产物(图5a、c和表1、2)。Treg-缺乏导致粪便和血浆中的所有检测的代谢产物显著改变分别为11%和51% (图5b、d和表1、2)。有趣的是，罗伊氏乳杆菌治疗对与Treg-缺乏相关的粪便和血浆代谢组具有显著的影响(图5a-d)。
当发明人关注由Treg-缺乏明显改变并通过罗伊氏乳杆菌恢复到对照水平的血浆代谢产物时，发明人观察到肌苷在SF中降低了5倍，但被罗伊氏乳杆菌治疗完全恢复(图6、图5e和表2)。肌苷代谢中涉及的其它代谢产物在血浆中由Treg-缺乏而改变，但不被罗伊氏乳杆菌治疗恢复(图7a)。
值得注意的是，粪便中的肌苷水平不被Treg-缺乏改变，但被罗伊氏乳杆菌治疗减少(图6)。粪便中肌苷的减少可能与小肠的吸收增加有关，可能是由于肠绒毛高度的升高和肠隐窝深度的加深所致。肌苷代谢中涉及的其它代谢产物在SFL小鼠的粪便中没有改变(图7b)。
实施例3
在T-reg缺乏小鼠中肌苷的口服治疗
根据如上所述的方法和分析，发明人检查增加血浆肌苷是否足以抑制Treg缺乏-介导的自身免疫。口服喂食肌苷给SF小鼠显著延长它们的生存(图8a和图1c)。肌苷还减少肝和肺的炎性细胞浸润，血浆中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平，和脾中TH1和TH2细胞的频率(图8c-f)。此外，肌苷抑制TH1和TH2细胞的分化(图8b和图9d、e)，但不抑制淋巴细胞的体外增殖(图9a-c)。组织病理学、细胞因子测量和淋巴细胞调查如上所述进行。这些结果表明SF小鼠中的肌苷作用可能是由于抑制TH1/TH2细胞分化。在这些结果的基础上，肌苷可用于在人中治疗T-reg缺乏疾病，例如IPEX。

Claims (24)

1.在治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病中应用的肌苷。
2.权利要求1的肌苷，其中肌苷呈现为含有肌苷作为活性组分的组合物或药物组合物的形式。
3.权利要求1或权利要求2的肌苷，其中肌苷呈现为口服制剂或注射制剂的形式。
4.权利要求3的肌苷，其中所述肌苷呈现为胶囊或安瓿的形式。
5.权利要求1的肌苷，其中肌苷以能够刺激肌苷产生的乳酸细菌菌株的形式提供。
6. 权利要求5的肌苷，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。
7.权利要求1-6的任一项的肌苷，其中所述疾病是Treg缺乏或Treg功能障碍介导的自身免疫性疾病。
8.权利要求1-7的任一项的肌苷，其中所述疾病选自：免疫失调多内分泌腺病肠病X-连锁综合征(IPEX)；IPEX-样综合征；和与Foxp3的突变或改变有关的疾病。
9.权利要求8的肌苷，其中所述IPEX-样综合征由CTLA4、CD25、STAT1、STAT5b、ITCH和IL-2Rb的一种或多种的突变引起，或与CTLA4、CD25、STAT1、STAT5b、ITCH和IL-2Rb的一种或多种的突变相关。
10.权利要求1-9的任一项的肌苷，其中所述应用对人受试者进行。
11.一种在受试者中刺激肌苷产生的方法，所述方法包括以在所述受试者中有效刺激肌苷产生的量给予所述受试者乳酸细菌菌株，其中所述菌株能够刺激肌苷产生。
12.权利要求11的方法，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌。
13.权利要求11或权利要求12的方法，其中所述方法用于治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病，优选地其中所述疾病是如在权利要求7-9的任一项中所定义的。
14.权利要求11-13的任一项的方法，其中所述受试者是人受试者。
15.一种选择能够刺激肌苷产生的乳酸细菌菌株的体内方法，其中所述方法包括筛选细菌菌株在体内刺激肌苷产生的能力，并选择具有在体内刺激肌苷产生的能力的菌株。
16.权利要求15的方法，其中与在所述菌株的不存在下观察到的水平比较，能够刺激肌苷水平增加的菌株被选择。
17.权利要求15或权利要求16的方法，其中所述方法在实验小鼠模型系统中进行。
18.权利要求15-17的任一项的方法，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌。
19.权利要求15-18的任一项的方法，其还包括培养或繁殖或产生这样的细菌菌株，并任选地将所述培养或繁殖或产生的菌株配制为包含所述菌株的组合物的步骤。
20.一种通过权利要求15-19的任一项的方法选择或产生的乳酸细菌菌株，其中所述菌株具有在体内刺激肌苷产生的能力。
21.权利要求20的乳酸细菌菌株，其用于疗法，优选用于治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病。
22.权利要求21的乳酸细菌菌株，其中所述疾病是如在权利要求7-9的任一项中所定义的。
23.一种在受试者中治疗与Treg缺乏或Treg功能障碍相关的疾病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的肌苷的步骤。
24.权利要求23的方法，其中所述肌苷是如在权利要求2-6的任一项中所定义的，或其中所述疾病是如在权利要求7-9的任一项中所定义的。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CA3103356A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Biogaia Ab Therapeutic methods using bacterial strains which are capable of increasing adenosine levels

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100913405B1 (ko) * 2008-03-25 2009-08-21 광주과학기술원 Ｔｈ２－매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물
TW201231057A (en) * 2011-01-31 2012-08-01 Univ Nat Taiwan Lactic acid bacteria isolated and their use

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100913406B1 (ko) * 2008-03-25 2009-08-21 광주과학기술원 Ｔｈ１－매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100913405B1 (ko) * 2008-03-25 2009-08-21 광주과학기술원 Ｔｈ２－매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물
TW201231057A (en) * 2011-01-31 2012-08-01 Univ Nat Taiwan Lactic acid bacteria isolated and their use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RODRIGO LEDESMA-AMARO 等: "Increased production of inosine and guanosine by means of metabolic engineering of the purine pathway in Ashbya gossypii", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *
YUYING LIU 等: "Lactobacillus Reuteri DSM 17938 Reduces Inflammation in Experimental Necrotizing Enterocolitis and Increases Regulatory T Cells in Mensenteric Lymph Nodes", 《GASTROENTEROLOGY》 *
YUYING LIU 等: "Oral Feeding Lactobacillus Reuteri DSM17938 Reduces Inflammation in Lungs of Treg-Deficient Scurfy Mice", 《GASTROENTEROLOGY》 *

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