JP2013188196A - ウイルス感染予防乳酸菌組成物及びウイルス感染予防乳酸発酵食品 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブチネリ(Lactobacillus buchneri)及びラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus
plantarum)のうちの少なくとも一方の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも1種を含有する。これら乳酸菌は、腸内感染防御機能を有する。
【選択図】 図1
Description
plantarum)のうちの少なくとも一方の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも1種を含有し、腸内感染防御機能を有することを特徴とする。
plantarum)のうちの少なくとも一方を含有し腸内感染防御機能を有する乳酸菌組成物を用い、食品原料を乳酸発酵させたことを特徴とする。
plantarum)は、腸管の免疫賦活化活性の他、ウイルス防御に役立つ遺伝子を上昇させるという機能を有する。したがって、これを含む乳酸菌組成物や、これら乳酸菌を用いて乳酸発酵された乳酸発酵食品は、感染防御に有益で、身体の健康維持に役立つ。
plantarum)を含むことを特徴事項とするものであり、これにより腸内感染を防御する機能を有する。
plantarum)が、ウイルスを攻撃する免疫応答を制御する遺伝子発現を上昇させ、ウイルス感染を防御する機能を有することを見出した。
buchneri)やラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)は、菌体そのものであってもよいし、菌体成分や菌体由来成分、菌体処理物等であってもよい。例えば、前記菌体成分は、水やアルコールで抽出することにより得ることができる。
plantarum)を含む乳酸菌組成物を薬剤等の形態で供する場合には、薬理上許容し得る担体、賦活剤、各種添加物等を加えることも可能である。
plantarum)を用い、各種食品原料を発酵させたものである。これら腸内感染防御機能を有する乳酸菌を予め仕込んでおくことで、特定の乳酸菌(前記ラクトバチルス・ブチネリやラクトバチルス・プランタラム)が増殖し、腸内感染防御機能に優れた乳酸発酵食品を提供することが可能となる。
数種のあじなれずし食品から発酵に関係する菌を採取して菌叢解析を実施し、単離された菌をマウスに経口投与し、小腸のリンパ節(パイエル板)細胞が産生するサイトカインのIL−2とIFN−γの産生を指標に免疫応答に及ぼす影響を調べると共に,小腸のリンパ節を含む組織を採取してtotal RNAを採取し、これを2万個の発現遺伝子が解析可能なDNAマイクロアレイに付し、有益な遺伝子群の変動を指標に健康に有用な菌を探索した。
菌体を濾過後に凍結乾燥に付し、乾燥粉末体を得た。これをサンプルとして以下の実験に用いた。
(2)実験動物
C57BL/6N(雄,5w,日本チャールズリバー)を実験時に適宜購入し、金沢大学自然研動物飼育施設で1週間以上飼育、馴化させてから実験に使用した。
(1)の方法で得られたサンプルについて、最終投与量が30mg/kg/dayになるよう、用時、精製水に懸濁して投与サンプルを調製した。この投与サンプルを(2)の条件で飼育したマウスに0.1mL/10gで1日1回(午前10時)、連続的に5日間、経口投与した。
初回のサンプル投与開始から7日後に、マウスを過剰のエーテルにより致死せしめ、無菌条件下に小腸を摘出して、散布するパイエル板を実体顕微鏡下に摘出した。得られたパイエル板を冷えたリン酸緩衝液に入れて洗浄後、750U/mLのコラゲナーゼ(typeI:シグマ・アルドリッチ社製)完全培地(RPMI−1640)に投入し、1時間インキュベートした。インキュベート終了後、分離したパイエル板構成リンパ球を200μmのナイロンメッシュを通してシングルセル懸濁液として細胞数を計測した。
A(ConA),あるいは1μg/mLのlipopolysaccharide(LPS)を各ウエルに添加し、48〜144時間、静置培養した。
ConAによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるTヘルパー細胞による免疫調節因子であるIL−2とIFN−γ(Th1)、IL−4とIL−5(Th2)を市販のELISA kit(Bioscience社製)を用いて測定した。測定方法は、kitの添付文書に従い、形成する発色色素の吸光度を測定し、標準物質による検量線からそれぞれのサイトカイン産生量を算定した。
LPSによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるB細胞が産生したIgAおよびIgG1の抗体(免疫グロブリン)量をELISA Kit(Bethyl Laboratories, Inc社製)を用いて測定した。測定方法はKitの添付文書に従って操作し、形成する発色色素の吸光度を測定した。標準物質による検量線から、培養液上清中の抗体産生量を算定した。
上記のパイエル板構成細胞の培養とは別に、(4)の操作で得られたパイエル板について、市販のRNA抽出kitを使用して、パイエル板から直接total RNAを採取した。すなわち、kitに付属する組織融解用試薬をパイエル板組織に直接添加し、以降はマニュアルに従って操作してtotal RNAを得た。RNA量は260および280nmの吸光度差を測定することにより計測し、その後、total RNA1μgを1.2%アガロースゲルで電気泳動した後、EB(エチジウムブロマイド)染色し、18Sおよび28Sのバンドの明瞭さからRNAのクオリティーを確認した。抽出したtotal RNAは、以下のDNAマイクロアレイによる発現遺伝子網羅解析を実施するまで−80℃で保存した。
パイエル板構成細胞から抽出したtotal RNAについて発現遺伝子の網羅的解析を実施した。すなわち、(7)の方法で得たRNA(700 ng)を市販の商品名MessageAmp II-Biotin Enhanced kit(Ambion社製)でcDNAを作製し、遺伝子標的ハイブリダイゼーションをマウスGeneChip(商品名)(Affymetrix社製)で測定した。すなわち、cDNAから作製した2重鎖DNAをGeneChipに滴下し、45℃、16時間作用させた。作用終了後にチップをFluidic
Station 450で洗浄して染色し、ハイブリッド染色された遺伝子をGeneChip Operating
software(商品名)を搭載したワークステーションでイメージ化し、そのイメージのヒートマップを計算機上で数値化した。ミスマッチする発現遺伝子と完全にマッチした遺伝子との差を計算機上で演算し、その後、対照となるマウスから得た遺伝子との相対的な変動をチェックし、1.5倍以上の変動する遺伝子群を抽出した。抽出された遺伝子群で変化が認められたものについては、適宜、Ingenuity Pathway Analysis(IPA)解析(データベースアクセスは米国)に付し、そのメカニズム解析を実施した。
AN1-1: Lactobacillus buchneri
AN1-3: L. alimentarius
AN1-5: L. brevis
AN1-7: L. casei
AN2-2: L. brevis = AN1-5
AN2-3: L. plantarum
AN2-5: L. alimentarius = AN1-3
AN3-2: L. plantarum = AN2-3
AN3-5: L. brevis = AN1-5, AN2-2
AN4-1: L. plantarum = AN2-3, AN3-2
AN5-1: L. paraplantarum
AN5-3: L. plantarum = AN2-3, AN3-2, AN4-1
ANP1-4: L. brevis
ANP7-1: L. plantarum
ANP7-4: L. casei
ANP7-6: L. brevis
brevis)AN1-5およびAN3-5、ラクトバチルス・プランタラム (Lactobacillus
plantarum) AN3-2およびANP7-1は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託申請し、以下の受託番号で受託された。
Lactobacillus buchneri AN1-1(受託番号:NITE P-1123)
Lactobacillus brevis AN1-5(受託番号:NITE P-1124)
Lactobacillus plantarum AN3-2(受託番号:NITE P-1255)
Lactobacillus brevis AN3-5(受託番号:NITE P-1256)
Lactobacillus plantarum ANP7-1(受託番号:NITE P-1224)
あじなれずしから単離された乳酸菌のうちAN1−1(Lactobacillus
buchneri),およびANP7−1(L. plantarum)は,抗体産生など免疫活性化の活性があった。さらに、「あじなれずし由来」のAN1−1およびANP7−1については,腸管の免疫賦活化活性の他に,DNAマイクロアレイの結果において、interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1、interferon activated gene set、guanylate nucleotide binding proteins、2'-5' oligoadenylate synthetases、およびchemokine (C-C motif) ligandなどのウイルス感染の防御に役立つ遺伝子が強く上昇していた。
パイエル板は小腸のリンパ組織であり、腸内において抗体を産生するB細胞も多数存在する。これらの細胞が産生する抗体の免疫グロブリン(IgAやIgG)は、腸粘膜において直接的な生体防御に与る因子であることから、乳酸菌がこの産生にどのような影響を及ぼすかを検討した。
DNAマイクロアレイの試験において、乳酸菌を投与して正常マウスより1.8倍以上で20以上の遺伝子発現上昇,あるいは抑制させる活性を示したのは、4種であった。中でも100以上の遺伝子を系統立てて制御し、かつ腸管の免疫上昇と関連する遺伝子の制御活性を示したのは、AN1−1(Lactobacillus
buchneri)とANP7−1(L. plantarum)だけであった。
buchneri)とANP7−1(L. plantarum)において、制御活性は、強弱の差と制御遺伝子が部分的に異なるものであり、概してANP7−1の方が変動活性が強いことがわかった。
buchneri)で制御される遺伝子群を表1〜表4に示す。また、ANP7−1(L. plantarum)で制御される遺伝子群を表5〜表9に示す。各表において、1-controlは対照マウス、2-AN1-1及び2-ANP7-1は乳酸菌を投与したマウスの数値である。また、各数値は、変化率を表す。
Claims (4)
- あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブチネリ(Lactobacillus
buchneri)及びラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)のうちの少なくとも一方の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも1種を含有し、腸内感染防御機能を有することを特徴とするウイルス感染予防乳酸菌組成物。 - 前記ラクトバチルス・ブチネリ(Lactobacillus buchneri)が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号NITE P−1123で寄託されたラクトバチルス・ブチネリ(Lactobacillus buchneri)AN1−1であり、前記ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号NITE P−1224で寄託されたラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus
plantarum)ANP7−1であることを特徴とする請求項1記載のウイルス感染予防乳酸菌組成物。 - あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブチネリ(Lactobacillus
buchneri)及びラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)のうちの少なくとも一方を含有し腸内感染防御機能を有する乳酸菌組成物を用い、食品原料を乳酸発酵させたことを特徴とするウイルス感染予防乳酸発酵食品。 - 前記ラクトバチルス・ブチネリ(Lactobacillus buchneri)が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号NITE P−1123で寄託されたラクトバチルス・ブチネリ(Lactobacillus buchneri)AN1−1であり、前記ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号NITE P−1224で寄託されたラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus
plantarum)ANP7−1であることを特徴とする請求項3記載のウイルス感染予防乳酸発酵食品。
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