JP2014000026A - 消化管免疫調節乳酸菌組成物及び消化管免疫調節乳酸発酵食品 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ(Leuconostoc sp.)KK101、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)KK102、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス(Lactobacillus alimentarius)SN1−7のうちの少なくとも一方の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも1種を含有する。これら乳酸菌は、消化管免疫調節機能を有する。
【選択図】 図1
Description
を含有しているので、健康を維持する上で極めて有用なものである。
(1)サンプルの作製
菌体を濾過後に凍結乾燥に付し、乾燥粉末体を得た。これをサンプルとして以下の実験に用いた。なお、実験に使用した乳酸菌は、下記の3種である。
KK101:ロイコノストック・スぺシーズ(Leuconostoc
sp.)
KK102:ロイコノストック・メッセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)
SN1-7:ラクトバチルス・アリメンタリウス(Lactobacillus alimentarius)
KK101:(受託番号:NITEP1239)
C57BL/6N(雄,5w,日本チャールズリバー)を実験時に適宜購入し、金沢大学自然研動物飼育施設で1週間以上飼育、馴化させてから実験に使用した。
(1)の方法で得られたサンプルについて、最終投与量が30mg/kg/dayになるよう、用時、精製水に懸濁して投与サンプルを調製した。この投与サンプルを(2)の条件で飼育したマウスに0.1mL/10gで1日1回(午前10時)、連続的に5日間、経口投与した。
初回のサンプル投与開始から7日後に、マウスを過剰のエーテルにより致死せしめ、無菌条件下に小腸を摘出して、散布するパイエル板を実体顕微鏡下に摘出した。得られたパイエル板を冷えたリン酸緩衝液に入れて洗浄後、750U/mLのコラゲナーゼ(typeI:シグマ・アルドリッチ社製)完全培地(RPMI−1640)に投入し、1時間インキュベートした。インキュベート終了後、分離したパイエル板構成リンパ球を200μmのナイロンメッシュを通してシングルセル懸濁液として細胞数を計測した。
ConAによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるTヘルパー細胞による免疫調節因子であるIL−2とIFN−γ(Th1)、IL−4とIL−5(Th2)を市販のELISA kit(Bioscience社製)を用いて測定した。測定方法は、kitの添付文書に従い、形成する発色色素の吸光度を測定し、標準物質による検量線からそれぞれのサイトカイン産生量を算定した。
LPSによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるB細胞が産生したIgAおよびIgG1の抗体(免疫グロブリン)量をELISA Kit(Bethyl Laboratories, Inc社製)を用いて測定した。測定方法はKitの添付文書にしたがって操作し、形成する発色色素の吸光度を測定した。標準物質による検量線から、培養液上清中の抗体産生量を算定した。
上記のパイエル板構成細胞の培養とは別に、(4)の操作で得られたパイエル板について、市販のRNA抽出kitを使用して、パイエル板から直接total RNAを採取した。すなわち、kitに付属する組織融解用試薬をパイエル板組織に直接添加し、以降はマニュアルに従って操作してtotal RNAを得た。RNA量は260および280nmの吸光度差を測定することにより計測し、その後、total RNA1μgを1.2%アガロースゲルで電気泳動した後、EB(エチジウムブロマイド)染色し、18Sおよび28Sのバンドの明瞭さからRNAのクオリティーを確認した。抽出したtotal RNAは、以下のDNAマイクロアレイによる発現遺伝子網羅解析を実施するまで−80℃で保存した。
パイエル板構成細胞から抽出したtotal RNAについて発現遺伝子の網羅的解析を実施した。すなわち、(7)の方法で得たRNA(700 ng)を市販の商品名MessageAmp II-Biotin Enhanced kit(Ambion社製)でcDNAを作製し、遺伝子標的ハイブリダイゼーションをマウスGeneChip(商品名)(Affymetrix社製)で測定した。すなわち、cDNAから作製した2重鎖DNAをGeneChipに滴下し、45℃、16時間作用させた。作用終了後にチップをFluidic
Station 450で洗浄して染色し、ハイブリッド染色された遺伝子をGeneChip Operating
software(商品名)を搭載したワークステーションでイメージ化し、そのイメージのヒートマップを計算機上で数値化した。ミスマッチする発現遺伝子と完全にマッチした遺伝子との差を計算機上で演算し、その後、対照となるマウスから得た遺伝子との相対的な変動をチェックし、1.5倍以上の変動する遺伝子群を抽出した。抽出された遺伝子群で変化が認められたものについては、適宜、Ingenuity Pathway Analysis(IPA)解析(データベースアクセスは米国)に付し、そのメカニズム解析を実施した。
(1)乳酸菌のThサイトカイン産生に及ぼす結果
図1に示すように、乳酸菌KK101、KK102を30mg/kg/dayの用量で5日間、マウスに経口投与した結果、パイエル板構成細胞におけるIFN−γ産生を有意に活性化したが、乳酸菌SN1−7を経口投与した場合、IFN−γ産生は有意的に抑制された。一方、図2に示すように、IL−2の産生は以上3種乳酸菌の処理で顕著的に下降した。
パイエル板は小腸のリンパ組織であり、腸内において抗体を産生するB細胞も多数存在する。これらの細胞が産生する抗体の免疫グロブリン(IgAやIgG)は、腸粘膜において直接的な生体防御に与る因子であることから、本発明で使用する乳酸菌がこの産生にどのような影響を及ぼすかを検討した。
3−1:乳酸菌KK101について
図5は、何も処置しないマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動であり、色が濃くなるほど頻繁に発現している遺伝子を表す。中線を軸に上下の閾線を設け、上に発現するドットは遺伝子中で上方調節(up−regulation)される遺伝子群、閾線の下側は、下方調節(down−regulation)される遺伝子群をそれぞれ表す。定常状態にある場合には、発現方向に向かう遺伝子はなく、中線を境に1.8倍以上の変動を示す遺伝子は10個から100個程度に収まる。
図6に、何も処置しないマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示し、表2−1〜2−4に、乳酸菌KK102の投与により変動する遺伝子を示す。本菌を投与した場合のマウスでは、何も処置しないマウスに比べ85個の重複しない遺伝子に変動が認められた。そのうち23個はup−regulationされ、残り62個はdow−regulationされることがわかった。
図7に、何も処置しないマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示し、表3に、乳酸菌SN1−7の投与により変動する遺伝子を示す。本菌を投与した場合のマウスでは、何も処置しないマウスに比べ21個の重複しない遺伝子に変動が認められた。そのうち10個はup−regulationされ、残り11個はdow−regulationされることがわかった。
Claims (2)
- 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ(Leuconostoc sp.)KK101、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス(Leuconostoc
mesenteroides)KK102、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス(Lactobacillus alimentarius)SN1−7のうちの少なくとも1種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも1種を含有し、消化管免疫調節機能を有することを特徴とする消化管免疫調節乳酸菌組成物。 - 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号NITEP1239で寄託された乳酸菌ロイコノストック・スぺシーズ(Leuconostoc sp.)KK101、乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス(Leuconostoc
mesenteroides)KK102、乳酸菌ラクトバチルス・アリメンタリウス(Lactobacillus alimentarius)SN1−7のうちの少なくとも1種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも1種を含有し、消化管免疫調節機能を有する乳酸菌組成物を用い、食品原料を乳酸発酵させたことを特徴とする消化管免疫調節乳酸発酵食品。
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