JP6812545B2 - バチルス・サブチリス菌株、バチルス・プミルス菌株及びバチルス・リケニフォルミス菌株を有効成分として含む急性肝膵臓壊死症(ahpnd)またはホワイトスポット病症候群(wss)の予防または治療用飼料組成物 - Google Patents
バチルス・サブチリス菌株、バチルス・プミルス菌株及びバチルス・リケニフォルミス菌株を有効成分として含む急性肝膵臓壊死症(ahpnd)またはホワイトスポット病症候群(wss)の予防または治療用飼料組成物 Download PDFInfo
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Description
このとき、本発明の用語、ホワイトスポット病症候群、予防、治療、及び個体は、前記で説明した通りである。
エビにAHPNDを誘発する腸炎ビブリオ菌(Vibrio parahaemolyticus)に対する抗菌活性を有する菌株を選抜するために、生育阻害環分析を行った。0.5%寒天(agar)3mlと病原性細菌の振とう培養液(2.0×109 CFU/ml)100μlを混合してTSA+培地に分注してトップアガーを製造した。前記製造されたトップアガーの上に12種のバチルス・サブチリス(CJ自体保有菌株及び商業用菌株)微生物培養液をそれぞれ10μl滴下し、30℃で18時間培養した後に形成される生育阻害環の有無を観察した。商業的に入手可能なバチルス・サブチリスと複合ファージの抗菌力を一緒に評価した。
前記製造例1で選別されたバチルス・サブチリス1(Bacillus Subtilis:寄託番号KCCM11143P、以下「BS」と呼ぶ)を含む飼料組成物を製造した。
1−1.エビの準備及び成長率の評価
水槽当たり30匹ずつ、合計40個の水槽にシロアシエビを準備した。すべての試験水槽には溶存酸素を維持するためにエアストーンを設置し、全試験期間中の飼育水温は28〜32℃の範囲に維持した。飼料は1日4回に限定的に供給した(魚体重の4〜12%)。
腸炎ビブリオ菌のエビに対する攻撃試験は、全2回に分けて行った。前記ビブリオ菌株の場合、2013年のベトナム地域で分離したAHPND(EMS)誘発菌株を試験に用いた。攻撃試験の場合、実施例の飼料組成物をエビに2週間供給した後、同様の重量(平均重量:2.32g)のエビをグループごとに96匹ずつ4つ反復して配置した。前記細菌はTSB+培地を用いて30℃、150rpmで24時間培養し、20個の110Lアクリル水槽(working volume72.5L)に2×109 CFUの濃度(OD1.7)の腸炎ビブリオ菌の懸濁液30mlを浸漬した。浸漬後1時間ごとにエビの斃死及び遊泳状態を確認し、8時間後に95%の還水を行った。試験飼料は1日3回(8:30、13:30、及び18:30)に分けて制限供給(魚体重の10〜12%)し、70時間の間、斃死程度を観察した。これに対する結果を下記の表4に示した。
腸炎ビブリオ菌のエビに対する攻撃試験の開始(感染前)、中間(感染)、終了時にグループごとに2匹のエビをランダムに選別して肝膵臓を分離した。分離された肝膵臓の一部は、quantitative real‐time PCR(qPCR)分析のためにエチルアルコール(100%)にすぐに保管し、一部は病理組織学的検査のためにDavidson固定液に24時間固定した後、エチルアルコール(70%)に保管した。
前記製造例2を参考にして、製造例1で選別されたバチルス・サブチリス(KCCM11143P、以下「BS」と呼ぶ)、バチルス・プミルス(KCCM11144P、以下「BP」と呼ぶ)及びバチルス・リケニフォルミス(KCCM11270P、以下「BL」と呼ぶ)の濃度を異にした飼料組成物(実施例1〜5)を製造した。これを表5に示した。
水槽当たり5匹ずつ、合計28個の水槽にシロアシエビを準備した。すべての試験水槽には溶存酸素を維持するためにエアストーンを設置し、全試験期間中の飼育水温は28〜32℃の範囲に維持した。飼料は8週間、1日4回に限定的に供給した(魚体重の6〜12%、初期平均重量:0.14g)。
試験エビの重量測定は、2週間ごとに実施し、測定18時間前に試験エビのストレスを軽減するために、すべての試験エビを絶食させた。最終重量測定後に水槽当たり7匹のエビをランダムに選別して氷水で麻酔した後、ALSEVER’S溶液が処理された注射器を用いてhemolympを採血した。採血したhemolympは、マクロファージ活性(NBT; nitroblue-tetrazolium activity)の分析に用い、遠心分離機で(800g、10分、4℃)血漿を分離したサンプルは、非特異的免疫力の分析に用いた。消化率の分析のためのエビの糞便(feces)の収集は飼料供給30分後、サイフォン(siphoning)及び還水を介して水槽に残った飼料と異物質をきれいに掃除して、その後3時間から排泄される糞便をサイフォンで収集した。収集された糞便は、蒸留水で洗浄した後、ろ紙を用いてフィルタした後、分析用サンプルとして使用するまで−40℃の低温冷凍庫に保管した。
実験飼料の配置は完全確率計画法(Completely randomized design)を行い、成長及び分析の結果は、SPSS Version18.0プログラム用いて、一元配置分散分析で統計分析した。データ値の有意差は ダンカンの新多重範囲検定(Duncan's multiple range test)で平均間の有意性(P<0.05)を比較した。データは、平均値±標準偏差(mean±SD)で示し、パーセントデータはarcsine変形値で計算して統計分析した。
試験飼料及び前記分の一般成分の分析は、AOAC(2005)の方法に基づいて、水分は常圧加熱乾燥法(125℃、3h)、粗灰分は直接灰化炉法(550℃、4h)、粗タンパク質は自動粗タンパク分析機(Kejltec system 2300、Sweden)で分析し、粗脂肪は非特許文献3の方法に基づいて分析して表7に示した。
2‐5‐1.NBT(Nitroblue tetrazolium)活性の分析
呼吸爆発中の好中球による酸化ラジカル生成量を測定するために、非特許文献4の分析方法を応用した。
血清中のGPx活性を分析するために、GPx kit(Biovision、Inc. California)を用いた。
リゾチーム活性の分析は、非特許文献5の方法を基に分析した。
PO活性の分析は、非特許文献6の方法を基に分析した。
SOD活性はSOD assay kit(Sigma-aldrich、19160、St. Louis、USA)を用いて分析した。
Hemolymph内のアンチプロテアーゼの活性は非特許文献7の分析方法に基づいて分析した。
8週間の飼養試験期間中に5日ごとに1回、各水槽で飼育水サンプルを採取して水質分析を行った。サンプルは、各タンクごとに同じ位置で収集し、溶存酸素(Dissolve oxygen;DO)、塩分、pH、アンモニア(Ammonium;NH4 +)の濃度を測定した。DOはThermo Scientific Orion Star A216 Benchtop Meter(Thermoscientific)、塩分はMaster Refractometer(ATAGO)を用いて測定した。pHはSeven Compact(METTLER TOLEDO)を用いて測定した。NH4 +は、非特許文献8の方法を用いて分析した。
2‐7‐1.指示剤(Cr2O3)分析
試験飼料と糞便サンプルにおける酸化クロム(chromium oxide)の含量を分析するために、非特許文献9の方法を用いた。
試験飼料の乾物及びタンパク質の消化率は、次のような方法で計算した。
前記製造例1で選別されたバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis:寄託番号KCCM11143P、以下「BS」と呼ぶ)、バチルス・プミルス (Bacillus pumilus:寄託番号KCCM11144P、以下「BP」と呼ぶ)及びバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis:寄託番号KCCM11270P、以下「BL」と呼ぶ)を含む飼料組成物を製造した。
3−1.エビ準備
水槽当たり30匹ずつ、合計40個の水槽にシロアシエビを準備した。すべての試験水槽には溶存酸素を維持するためにエアストーンを設置し、全試験期間中の飼育水温は28〜32℃の範囲に維持した。飼料は1日4回に限定的に供給した(魚体重の4〜12%)。
バチルス・サブチリス、バチルス・プミルス及びバチルス・リケニフォルミスを含有する飼料組成物の抗菌効果を確認するために、腸炎ビブリオ菌のエビに対する攻撃試験を1回行った。前記ビブリオ菌株の場合、2013年のベトナム地域で分離したAHPND(EMS)誘発菌株を試験に用いた。攻撃試験の場合、実施例の飼料組成物をエビに4週間供給した後、同様の重量(平均重量:2.30g)のエビをグループごとに96匹ずつ4つ反復して配置した。前記細菌はTSB+培地を用いて30℃、150rpmで24時間培養し、Tank当たりに6.3×105 CFU/mlの濃度で腸炎ビブリオ菌の懸濁液を浸漬した。浸漬後1時間ごとにエビの斃死及び遊泳状態を確認し、8時間後に95%の還水を行った。試験飼料は1日3回(8:30、13:30、及び18:30)に分けて制限供給(魚体重の10〜12%)し、70時間の間、斃死程度を観察した。これに対する結果を下記の表12に示した。
バチルス・サブチリス、バチルス・プミルス及びバチルス・リケニフォルミスを含有する飼料組成物の抗ウイルス効果を確認するために、ホワイトスポット病症候群ウイルス(WSSV)のエビに対する攻撃試験を行った。前記ホワイトスポット病症候群ウイルスの場合には、2017年に韓国の養殖場でWSSVに感染したシロアシエビ(Litopenaues vannamei)から分離したウイルスを用いた。攻撃試験の場合、実施例の飼料組成物をエビに6週間供給した後、同じ重量(平均重量:6.25g)のエビをグループごとに96匹ずつ4つ反復して配置した。ウイルスの接種濃度は4.1×105 コピー/μlでエビ一匹あたり100μlを、注射器を用いてエビの筋肉に接種した。一匹あたり最終接種濃度は4.1×107 コピー/μlである。
バチルス・サブチリス、バチルス・プミルス及びバチルス・リケニフォルミスを含有する飼料組成物の抗菌及び抗ウイルス効果を確認するために、腸炎ビブリオ菌及びホワイトスポット病症候群ウイルスのエビに対する攻撃試験を行った。前記ビブリオ菌株の場合、2013年にベトナムの地域で分離したAHPND(EMS)誘発菌株を試験に用いた。前記ホワイトスポット病症候群ウイルスの場合、2017年に韓国の養殖場でWSSVに感染したシロアシエビ(Litopenaues vannamei)から分離したウイルスを用いた。攻撃試験の場合、実施例の飼料組成物をエビに6週間供給した後、同じ重量(平均重量:4.52g)のエビをグループごとに96匹ずつ4つ反復して配置した。ウイルスの接種濃度は8.3×103 コピー/μlでエビ1匹当り50μlを注射器を用いてエビ筋肉に接種した。1匹当り最終接種濃度は4.1×104 コピー/μlである。ウイルス接種して2日経過後、ビブリオ細菌感染を行った。
受託番号:KCCM11143P
受託日:20101214
受託番号:KCCM11144P
受託日:20101214
受託番号:KCCM11270P
受託日:20120322
Claims (12)
- バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)菌株、寄託番号KCCM11144Pで寄託されたバチルス・プミルス(Bacillus pumilus)菌株、及び寄託番号KCCM11270Pで寄託されたバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)菌株;これらの培養液;その濃縮液;またはその乾燥物を有効成分として含む、急性肝膵臓壊死症(AHPND)の予防または治療用飼料組成物。
- 前記バチルス・サブチリスが、KCCM11143Pである、請求項1に記載の飼料組成物。
- 前記バチルス・サブチリス、前記バチルス・プミルス及び前記バチルス・リケニフォルミスが、有効成分の1g当たりに1×104〜1×1011 CFUの菌数を有するものである、請求項1または2に記載の飼料組成物。
- 前記急性肝膵臓壊死症(AHPND)が、腸炎ビブリオ菌(Vibrio parahaemolyticus)によって誘発されるものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の飼料組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の飼料組成物を個体に投与する段階を含む、急性肝膵臓壊死症の予防または治療方法。
- 前記個体が、エビである、請求項5に記載の方法。
- バチルス・サブチリス菌株、寄託番号KCCM11144Pで寄託されたバチルス・プミルス菌株、及び寄託番号KCCM11270Pで寄託されたバチルス・リケニフォルミス菌株;これらの培養液;その濃縮液;またはその乾燥物を有効成分として含む、ホワイトスポット病症候群(WSS)の予防または治療用飼料組成物。
- 前記ホワイトスポット病症候群(WSS)が、ホワイトスポット病症候群ウイルス(WSSV)によって誘発されるものである、請求項7に記載の飼料組成物。
- 前記バチルス・サブチリスが、KCCM11143Pである、請求項7または8に記載の飼料組成物。
- 前記バチルス・サブチリス、前記バチルス・プミルス及び前記バチルス・リケニフォルミスが、有効成分の1g当たりに1×104〜1×1011 CFUの菌数を有するものである、請求項7〜9のいずれか一項に記載の飼料組成物。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載の飼料組成物を個体に投与する段階を含む、ホワイトスポット病症候群の予防または治療方法。
- 前記個体が、エビである、請求項11に記載の方法。
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