TWI693894B - 包括枯草桿菌菌株、短小芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株作為活性成分之用於預防或治療急性肝胰臟壞死病（ａｈｐｎｄ）或白斑綜合症（ｗｓｓ）之飼料組成物 - Google Patents

包括枯草桿菌菌株、短小芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株作為活性成分之用於預防或治療急性肝胰臟壞死病（ａｈｐｎｄ）或白斑綜合症（ｗｓｓ）之飼料組成物 Download PDF

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Abstract

本揭示內容有關一種用於預防或治療急性肝胰臟壞死病(AHPND)或白斑綜合症(WSS)之飼料組成物，包括枯草桿菌(KCCM111 43P)菌株、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢桿菌(KCCM 11270P)菌株；其培養物；其濃縮物；或其乾物質作為活性成分。該飼料組成物表現出對引起蝦AHPND之副溶血性弧菌之抗菌活性，以及對引起WSS之白斑綜合症病毒(WSSV)之抗病毒活性。

Description

包括枯草桿菌菌株、短小芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株作為活性成分之用於預防或治療急性肝胰臟壞死病(AHPND)或白斑綜合症(WSS)之飼料組成物
本揭示內容涉及一種用於預防或治療急性肝胰臟壞死病(AHPND)或白斑綜合症(WSS)之飼料組成物，包括枯草桿菌(Bacillus subtilus)菌株、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株；其培養物；其濃縮物；或其乾物質作為活性成分。
早期死亡綜合症(early mortality syndrome，EMS)、急性肝胰臟壞死病(acute heptopancreatic necrosis disease，AHPND)和急性肝胰 臟壞死綜合症(acute heptopancreatic necrosis syndrome，AHPNS)是養蝦業中迅速發展的疾病，副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是這些疾病的病原體；亦即，副溶血性弧菌產生昆蟲毒素，在6小時內或一周內造成100%的致死率(Tran等人2013.Dis aquat Org 105：45-55)。昆蟲毒素係藉由表現存在於細菌的特定質粒中的特定基因(即，光桿菌昆蟲相關毒素；皮爾毒素)而產生，並且易於移動，即它們具有移動性。在這方面，這些疾病比病毒性蝦病，例如白斑綜合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)，桃拉綜合徵病毒(Taura syndrome virus，TSV)，傳染性肌肉壞死病毒(infectious myonecrosis virus，IMNV)等傳播得更快，已最近受到關注。AHPND於2009年在中國開始，並在一年內在亞洲各國(如泰國、馬來西亞和越南)迅速蔓延，以及在墨西哥進一步蔓延到其他中美洲國家，導致大多數蝦市場受損。南韓也因2015年至2016年的AHPND而遭受嚴重損害，目前正在進行研究以預防或控制該疾病。
最近，由於消費者對安全產品的需求和連續養殖的生產策略，用於治療現有致病菌的治療劑受到與養殖相關規定的限制。因此，在蝦養殖中，不僅要考慮苗產品的質量和繁殖方法，還要考慮控制疾病的重要因素。
同時，益生菌被定義為幫助腸中微生物平衡的微生物製劑或組分，並且具有與抗生素相反的詞源意義，抗生素是指抗生素材料。代表性地，益生菌的實例包括乳酸菌，例如乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。此外，益生菌不具有針對人類和動物的毒性基因，也不產生致病物質，因此被歸類 為GRAS(generally regarded as safe，通常被認為是安全的)。因此，業經積極達成使用經證實具安全性之益生菌開發飼料添加劑。
例如，韓國專利公開案第10-2011-035554號揭露了芽孢桿菌屬的新型CMB L1和乳桿菌屬的CMB201的混合菌株，使用該混合菌株之用於抗癌和增強免疫力之食物組成物和具有抗菌活性之微生物製劑。此外，韓國專利第10-0977407號揭露了一種用於動物之免疫增強劑和飼料添加劑，其含有拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)之裂解物，以增加嗜中性細胞的各種活性，動物的主要吞噬細胞，並增強針對由接種之致病菌引起的攻擊的非特異性防禦。然而，使用益生菌的飼料添加劑的實際免疫活性不足，因此需要使用仍具有優異免疫活性的益生菌對飼料添加劑進行研究。
本案發明人已經進行了大量努力以開發補充益生菌(芽孢桿菌屬菌種)的蝦飼料，用於預防蝦AHPND或白斑綜合症(WSS)。結果，他們已證實當以補充了枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之飼料組成物餵養蝦時，蝦對AHPND感染(由越南在2013年的受影響區域單離的菌株所引起；Tran等人，2013年)或WSSV感染的存活率得到改善，蝦的成長速度和非特異性免疫力不僅增加，而且水質也得到改善，可以產生高蛋白蝦的生產，從而完成本揭示內容。
本揭示內容之一個目的係提供一種用於預防或治療急性肝胰臟壞死病(AHPND)之飼料組成物，其包括枯草桿菌菌株、短小芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株；其培養物；其濃縮物；或其乾物質作為活性成分。
本揭示內容之另一個目的係提供一種用於預防或治療急性肝胰臟壞死病之方法，包括投予受試者組成物。
本揭示內容之又一個目的係提供一種用於預防或治療白斑綜合症(WSS)之飼料組成物，包括枯草桿菌菌株、短小芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株；其培養物；其濃縮物；或其乾物質作為活性成分。
本揭示內容之又一個目的係提供一種用於預防或治療白斑綜合症之方法，包括將飼料組成物投予受試者。
本揭示內容的組成物，其包含枯草桿菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)菌株作為活性成分，具有對副溶血性弧菌(其導致蝦養殖中產生問題之AHPND)的抗菌活性，並且對引起WSS的白斑綜合症病毒之抗病毒活性，以及具有提高蝦肝胰臟免疫力的作用，因此本揭示內容的組成物可用作蝦飼料組成物或飼料添加劑。
第1圖係顯示感染副溶血性弧菌的蝦的存活率圖。
第2圖係顯示蝦肝胰臟中AHPND含量的分析圖。
第3圖係顯示蝦肝胰臟的病理特徵圖。
第4圖係顯示蝦的成長率圖。第4(a)至4(d)圖分別顯示了最終體重、體重增加率、日成長率和飼料轉化率。
第5圖係分析蝦的非特異性免疫圖。第5(a)至5(e)圖分別顯示了對巨噬細胞、酚氧化酶、抗蛋白酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性。
第6圖係顯示在零水交換的育種水中水質分析結果的圖。
後文中，將詳細描述本揭示內容。同時，本文揭露的每個解釋和例示性具體實施例可以應用於其他解釋和例示性具體實施例。亦即，本文揭露的各種因素的所有組合都屬於本揭示內容的範疇。此外，本揭示內容的範疇不應受下文提供的具體揭示內容的限制。
為了實現上述目的，本揭示內容的一個態樣提供了一種用於預防或治療急性肝胰臟壞死病(AHPND)之飼料組成物，包括枯草桿菌菌株、短小芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株；其培養物；其濃縮物；或其乾物質作為活性成分。
如本文所用，術語“枯草桿菌”係一種無毒並產生孢子之嗜氧菌。枯草桿菌廣泛分佈於自然界，諸如乾草、土壤、汙水、空氣等。這種細菌廣泛用於工業，因為它產生凝結乳、糖化澱粉和分解脂肪和油之酶。細菌生長之最佳條件是pH為7至8.5，溫度為37℃至40℃。由於芽孢桿菌屬菌株的特性，該菌株不具有人和動物的毒性基因，是非致病性的，不產生致病物質，並且在體內表現出快速生長率。枯草桿菌在葡萄糖等存在 下具有厭氧生境，內生孢子使芽孢桿菌在極端惡劣的環境(如高溫或低溫)中生存。
如本文所用，術語“短小芽孢桿菌”係產生孢子的嗜氧性革蘭氏陽性細菌。短小芽孢桿菌以土壤中的菌落形式分布或存在於某些植物的根部。短小芽孢桿菌孢子通常對環境壓力(包括暴露於紫外線、乾燥和存在氧化劑如過氧化氫之存在)具有高度抗性。
如本文所用，術語“地衣芽孢桿菌”係通常在土壤中發現的細菌，並且是嗜溫性革蘭氏陽性細菌。該細菌的最佳生長溫度約為50℃，但即使在更高的溫度也能存活。地衣芽孢桿菌可以休眠孢子的形式存在，以抵禦惡劣的環境。
在本揭示內容中，枯草桿菌可以係以登錄號KCCM11143P寄存之菌株。
在本揭示內容中，短小芽孢桿菌可以係以登錄號KCCM11144P寄存之菌株。
在本揭示內容中，地衣芽孢桿菌可以係以登錄號為KCCM11270P寄存之菌株。
在本揭示內容中，製備包含枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)之飼料組成物。
本揭示內容的組成物可包括細菌數為1×104CFU至1×1011CFU/公克之總活性成分枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM11 144P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)。具體地，細菌數可以是1×104CFU/g至1×1010CFU/g，更具體地，本揭示內容之組成物包括細 菌數為1×108CFU/g至1×1010CFU/g之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)。
為了本揭示內容之目的，飼料組成物中所含作為活性成分之枯草桿菌可僅包含枯草桿菌(KCCM11143P)。
為了本揭示內容之目的，飼料組成物中所含作為活性成分之短小芽孢桿菌可僅包含短小芽孢桿菌(KCCM11144P)。
為了本揭示內容之目的，飼料組成物中所含作為活性成分之地衣芽孢桿菌可僅包含地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)。
如本文所用，術語“急性肝胰臟壞死疾病(AHPND)”是指稱為早期死亡綜合症(EMS)或急性肝胰臟壞死綜合症(AHPNS)的疾病，並且統稱為在海洋牧場中停留(standing)30天內由病原體引起的大規模死亡率。AHPND係由副溶血性弧菌引起的，副溶血性弧菌是一種存在於海水中的致病菌，在白蝦中有大量感染，約佔韓國養殖蝦的96%。由於在生命早期的高死亡率，它會對蝦造成傷害，但對人類無害。
副溶血性弧菌是屬於弧菌屬的革蘭氏陰性桿菌，其在人類中引起急性食物中毒和腸炎並引起魚的弧菌病。最近，副溶血性弧菌已被確定為急性肝胰臟壞死疾病(AHPND)的致病菌，其導致蝦養殖業的大量死亡。
如本文所用，術語“預防”是指藉由投予根據本揭示內容之包括枯草桿菌之組成物，而導致蝦AHPND症狀抑制或延遲的任何行為。
如本文所用，術語“治療”是指藉由投予根據本揭示內容之包括枯草桿菌(KCCM11143P)之的組成物，而導致蝦AHPND症狀減輕或完全恢復的任何作用。
除了包含作為活性成分之上述菌株外，組成物還可包括可接受於藥物，食品或飼料用途之已知的載體或添加劑。在本揭示內容中，作為對副溶血性弧菌具有抗菌活性之包括枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)的益生菌製劑，其可存在為了防止益生菌製劑的品質下降而添加之黏合劑、乳化劑、防腐劑等；並且可以添加到飼料中以增加益生菌製劑的效率之胺基酸、維生素、酶、調味劑、非蛋白質氮化合物、矽酸鹽、緩衝劑、提取劑、寡聚醣等。另外，可以進一步包含飼料混合物等，但本揭示內容不限於此。
在本揭示內容的一個具體實施例中，作為確認餵食蝦飼料組成物是否會增加對AHPND的免疫力並表現出疾病預防功效的結果為，證實了與比較例3和4的群組(BS組3和4)(其中投予比較例1(不包括益生菌)且比較例3和4(僅包含枯草桿菌)相比，這些群組(BS+BP+BL組1和2))(其中投予包括本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)菌株之飼料組成物(實施例5和6))可以增加蝦對副溶血性弧菌感染的疾病抗性和顯著地降低蝦肝胰臟中AHPND的毒素量。
在本揭示內容之另一個具體實施例中，分析包含上述菌株的飼料組成物的非特異性免疫力的結果為，發現巨噬細胞(NBT)活性、穀胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性、溶菌酶活性、苯酚氧化酶(PO)活性、超氧化物歧 化酶(SOD)活性和抗蛋白酶活性明顯高於比較例所具者。基於該結果，可以看出組成物可用於增加蝦的非特異性免疫反應或改善其免疫力。
本揭示內容提供了一種蝦養殖用飼料添加劑，包括上述飼料組成物。
在本揭示內容的飼料添加劑中，除了上述活性成分外，還可以加入可接受於醫藥、食品或飼料用途的已知載體或安定劑。必要時，可以添加各種營養素，諸如維生素、胺基酸和礦物質、抗氧化劑和其他添加劑，其形狀可以是便利的，例如粉末，顆粒，丸和懸浮液。當供應根據本揭示內容之飼料添加劑時，飼料添加劑可以單獨供應或與飼料混合供給非反芻動物。
另外，本揭示內容提供了一種蝦養殖用飼料，其包括上述飼料添加劑。
本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)菌株和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)菌株係具有孢子形成能力的革蘭氏陽性菌，較佳以孢子形式配製，但不是限於此。本揭示內容之飼料沒有特別限制，但可以使用任何飼料如粉末飼料、固體飼料、濕丸飼料、乾燥丸飼料、擠壓機丸(EP)飼料和原料飼料。
如上所述，芽孢桿菌屬形成內源孢子，因此對熱非常穩定。因此，本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)可以作為飼料添加劑形式單獨製備，然後與飼料混合，或者可以藉由直接添加到準備飼料時的飼料。包含在本揭示內容之飼料中之枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可 以是液態或乾態，並且較佳為經乾燥之粉末形式。乾燥程序可以藉由空氣乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥和冷凍乾燥而進行，但不限於此。本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)可以粉末形式混合，其量以飼料的重量為基準計，為0.05重量%至10重量%，較佳為0.1重量%至1重量%。本揭示內容之枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可以1至5：1至5：1至5的濃度比混合。此外，該飼料係用於水產養殖，並且除了本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)之外，可進一步包含能夠提高飼料保存性的傳統添加劑。
為了實現上述目的，本揭示內容之另一態樣提供了一種用於預防或治療急性肝胰臟壞死病之方法，包括投予受試者本揭示內容之飼料組成物。
本文中，本揭示內容之急性肝胰臟壞死病、預防和治療係如上所述。
如本文所用，術語“受試者”可以指養殖之魚或甲殼類動物，並且具有急性肝胰臟壞死疾病或有發展急性肝胰臟壞死疾病之風險，但可根據目的而提及受試者為蝦。
進料較佳以與傳統飼料相同的量和相同的餵食間隔供應。此外，致病菌是指在蝦養殖中藉由誘發AHPND而導致蝦的大量死亡的細菌，並且具體地可以指副溶血性弧菌。
養蝦業中之大規模死亡原因不僅包括副溶血性弧菌，還包括各種病毒的感染和繁養殖水(breeding water)中氨的濃度。在蝦養殖中，繁 養殖水中的氨以蝦糞、飼料廢棄物等蛋白質的代謝產物發生，並且隨著pH和水溫的增加而變化很大。高濃度的氨是蝦急性死亡的直接原因，導致大規模死亡；低濃度的氨可能導致蝦的成長以及餵食能力和免疫力的長期降低，從而導致各種疾病的發展。
在本揭示內容的一個具體實施例中，採集並分析其中餵時本揭示內容之飼料組成物之蝦之繁養殖水，並且結果發現繁養殖水中的總氨濃度顯著低於對照組所具者，因此本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)菌株可以改善對蝦繁養殖水的水質。
如上所述，本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)不僅可以增強蝦的疾病抗性，還可以抑制蝦肝胰臟中AHPND的毒素。因此，藉由使用該菌株，可以獲得預防引起疾病的副溶血性弧菌的功效，並且還可以獲得增強對白斑綜合症病毒的抗性的功效，從而可以更安全地養殖蝦。
為了實現上述目的，本揭示內容之又一態樣提供了一種用於預防或治療白斑綜合症(WSS)之飼料組成物，包括枯草桿菌菌株、短小芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株；其培養物；其濃縮物；或其乾物質作為活性成分。
本揭示內容之枯草桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、預防和治療之術語係如上所述。
本揭示內容之組成物可包括細菌數為1×104CFU至1×1011CFU/公克之總活性成分之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌 (KCCM11144P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)。具體地，細菌計數可以是1×104CFU/g至1×1010CFU/g，更具體地，本揭示內容之組成物包括細菌數為1×108CFU/g至1×1010CFU/g之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)。
如本文所用，術語“白斑綜合症病毒(WSSV)”是指廣泛分佈於世界各地的病毒。因為WSSV在病毒粒子的末端具有尾狀附著物，並且具有類似於其中存在桿狀衣殼和包膜之蛋形桿菌的形式，所以它被稱為桿狀病毒或桿狀病毒形成之病毒；然而，最近，它已被重命名為白點病毒屬(whispovirus)，這是一種基因上新的病毒群組。該病毒的長度約為275nm，直徑約為120nm，由大小約為290kb的雙鏈DNA組成。
除了含有作為活性成分的上述菌株外，組成物還可包括可用於醫藥、食品或飼料用途之已知載體或添加劑。在本揭示內容中，作為對白斑綜合症病毒具有抗病毒活性之包含枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)之益生菌製劑可以有為了防止益生菌製劑品質惡化之黏合劑、乳化劑、防腐劑等；並且可以添加添加到飼料中以增加益生菌製劑的效率之胺基酸、維生素、酶、調味劑、非蛋白質氮化合物、矽酸鹽、緩衝劑、提取劑、寡聚醣等。另外，可以進一步包含飼料混合物等，但本揭示內容不限於此。
在本揭示內容之一個具體實施例中，作為確認飼料組成物是否會增加蝦對白斑綜合症的免疫力並表現出疾病預防功效的結果為，證實了與群組(BS組4)(其中投予比較例1(不包括益生菌)和僅包括枯草桿菌KCCM11143P菌株之飼料組成物(比較例4))相比，群組(BS+BP+BL組1 和2)(其中投予包括本揭示內容之枯草桿菌(KCCM1 1143P)菌株、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢桿菌(KCCM 11270P)菌株之飼料組成物(實施例5和6))可以增加蝦對白斑綜合症病毒(WSSV)感染的疾病抗性。
在本揭示內容之另一個具體實施例中，作為確認白斑綜合症病毒(WSSV)和急性肝胰臟壞死疾病(AHPND)的複合感染是否會增加，以及當餵食蝦飼料組成物時是否表現出存活率增強功效的結果為，證實了與群組(BS組4)(其中投予比較例1(不包括益生菌)和僅包括枯草桿菌(KCCM11143P)菌株之飼料組成物(比較例4))相比，群組(BS+BP+BL組1和2)(其中投予包括枯草桿菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢桿菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)菌株之飼料組成物(實施例5和6))可以增強蝦對WSSV和AHPND複合感染的疾病抗性。
本揭示內容提供了一種蝦養殖用飼料添加劑，包括上述飼料組成物。
在本揭示內容之飼料添加劑中，除了上述活性成分外，還可以加入可接受於醫藥、食品或飼料用途的已知載體或安定劑。必要時，可以添加各種營養素，諸如維生素、胺基酸和礦物質、抗氧化劑和其他添加劑，其形狀可以是便利的，例如粉末、顆粒、丸和懸浮液。當供應根據本揭示內容之飼料添加劑時，該飼料添加劑可以單獨供應或與飼料混合供給非反芻動物。
另外，本揭示內容提供了一種蝦養殖用飼料，其包含上述飼料添加劑。
本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢桿菌(KCC M1114P)菌株和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)菌株是具有孢子形成能力的革蘭氏陽性菌，較佳為以孢子形式配製，但不限限於此。本揭示內容之飼料沒有特別限制，但可以使用任何飼料如粉末飼料、固體飼料、濕飼丸進料、乾燥丸飼料、擠壓機丸(EP)飼料和原料飼料。
如上所述，芽孢桿菌屬形成內源孢子，因此對熱非常穩定。因此，本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)可以作為飼料添加劑形式單獨製備，然後與飼料混合，或者可以藉由直接添加到準備飼料時的飼料。包含在本揭示內容之飼料中之枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可以是液態或乾態，並且較佳為乾粉末形式。乾燥過程可以藉由空氣乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥和冷凍乾燥而進行，但不限於此。本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)可以粉末形式混合，其量以飼料之重量為基準計，為0.05重量%至10重量%，較佳為0.1重量%至1重量%。此外，該飼料用於水產養殖，並且除了本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)之外，還可以包括能夠提高飼料保存性的傳統添加劑。
為了實現上述目的，本揭示內容之另一態樣提供了一種用於預防或治療白斑綜合症之方法，包括投予受試者本揭示內容之飼料組成物。
本文中，本揭示內容之白斑綜合症、預防、治療和受試者之術語係如上所述。
蝦養殖的大規模死亡原因不僅包括副溶血性弧菌，還包括各種病毒的感染。具體而言，病毒可以指白斑綜合症病毒(WSSV)。
如上所述，本揭示內容之枯草桿菌(KCCM11143P)、短小芽孢桿菌(KCCM1114P)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P)可以獲得增強對白斑綜合症病毒(WSSV)的抗性的功效，因此蝦可以更安全地養殖。
[進行本發明之較佳模式]
後文中，將通過例示性具體實施例詳細描述本揭示內容。然而，這些例示性具體實施例僅用於說明目的，並不旨在限制本揭示內容的範疇。
製備例1. 具有抗菌活性之益生菌之選擇
為了選擇對誘發蝦AHPND之副溶血性弧菌具有抗菌活性之菌株，進行透明區測定。將0.5%瓊脂(3mL)和100μL振盪培養物(2.0×109CFU/mL)的致病菌混合並接種在TSA+培養基上以製備頂層瓊脂。將12種枯草桿菌菌株(彼等CJ CheilJedang所具者和市售菌株)各自的量為10μL的培養物滴在經製備之頂層瓊脂上，在30℃培養18小時，並且觀察存在/不存在明顯的區域。一起評價市售枯草桿菌和複合噬菌體之抗菌活性。
Figure 107147913-A0202-12-0016-1
如上表1所示，枯草桿菌1微生物(CJBS-01)在體外對引起AHPND之抗副溶血性弧菌顯現出最優異的抗菌作用。然而，儘管微生物在體外對特定病原體顯示出抗菌活性，觀察到的抗菌活性僅僅是體外效應，並不一定意味著動物攝入副溶血性弧菌將能夠為動物提供免疫力或對特定 病原體的預防作用。
因此，在如下實驗中，檢驗了當餵食蝦枯草桿菌菌株1(CJBS-01)微生物時，是否可以表現蝦對抗AHPND疾病的免疫力和疾病預防功效的改善。此外，還檢驗了枯草桿菌1(CJBS-01)是否對體重增加和消化率有影響。
枯草桿菌1(CJBS-01)是2010年12月14日寄存於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)的菌株，並給定登錄號為KCCM11143P。
製備例2. 用於蝦之含枯草桿菌之飼料組成物之製備
製備含有製備例1中之選擇之枯草桿菌1(登錄號KCCM11143P，後文稱“BS”)之飼料組成物。
具體而言，將不含枯草桿菌之比較例1、含有市售芽孢桿菌種的比較例2(即，三種芽孢桿菌種(枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)之混合製劑)以及含有1010×0.2CFU/g之量之選擇之枯草桿菌1(BS)之實施例1之組成物與魚油和水混合，並製成丸形式。比較例1和2以及實施例1之飼料組成物用乾燥器在25℃乾燥約24小時，並儲存在-20℃直到後續實驗。
Figure 107147913-A0202-12-0018-2
實驗例1. 飼料組成物對AHPND之預防功效之評估
1-1. 蝦之製備和成長速度之評估
在總共40個水箱中，每個水箱準備30隻白蝦。所有實驗水箱都配備有空氣石以維持溶解氧，並且在整個實驗期間將水箱之溫度保持在28℃至32℃之範圍內。飼料以有限的供應量(魚體重之4%至12%)每天餵食4次。
每2週測量一次蝦的重量。與成長率和餵食效率相關之評估項目和計算公式如下：
‧體重增加(%)=100 x(最終平均體重-初始平均體重)/平均體重
‧飼料轉化率(%)=體重增加量/進食量
‧每日特定成長率(%天-1)=100×(loge最終體重-loge初始體重)/天數
對於實驗飼料之分布，進行完全隨機化之設計，並使用SPSS Version 18.0程式，藉由單向ANOVA而統計分析成長和分析的結果。在鄧氏多距檢定(Duncan’s multiple range test)中比較了數據值的顯著差異(P<0.05)。數據以平均值±SD表示，而且百分比數據經計算為反正弦變換值並進行統計分析。
Figure 107147913-A0202-12-0020-5
如表3所示，餵養試驗之結果為，證實了與對照組1和對照組2(其被提供比較例1和比較例2之各飼料組成物)相比，BS組1(其被提供實施例1之含製備例1中選擇之枯草桿菌1(BS)之飼料組成物)表現了顯著更高之成長率。另外，經證實被提供比較例1和比較例2之各飼料組成物之群組相比，實施例1之飼料組成物具有顯著更高的每日特定成長率。
1-2. 副溶血性弧菌對蝦之攻擊試驗
副溶血性弧菌對蝦的攻擊試驗在總共兩次分開的試驗中進 行。在弧菌菌株之情況下，使用2013年在越南單離之AHPND(EMS)造成之菌株進行試驗。攻擊試驗如下方式進行：將實施例之飼料組成物餵食蝦兩週，然後將相同重量(平均重量：2.32g)之蝦分成4個重複，每群組96隻蝦。使用TSB+培養基在30℃，150rpm培養細菌24小時，並將副溶血性弧菌之懸浮液(30mL)以2×109CFU(OD：1.7)之濃度浸入20個丙烯酸水箱中之每一者(110L，工作體積：72.5L)。浸潤後，每小時確認蝦之存活和游泳狀態，並於8小時後，交換95%的水。測試飼料以限制的方式(魚體重的10%至12%)，每天分次給予劑量三次(於8：30、13：30和18：30)，並觀察死亡率70個小時。結果如下表4所示。
Figure 107147913-A0202-12-0021-6
如上表4所示，與對照組1和對照組2相比，BS組1(其被提供含製備例1中選擇之枯草桿菌1(BS)之飼料組成物)在副溶血性弧菌對蝦的攻擊試驗中表現出較高的存活率。
另外，如第1圖所示，在上述兩個試驗中通常觀察到，在浸潤副溶血性弧菌後，蝦的運動變慢並且牠們停在水箱底部而沒有游泳活動，並且牠們的飼料攝食也不活躍。在浸潤後8小時，蝦的快速死亡開始發生，並且BS組1的存活率顯示出比對照組1或對照組2的存活率高至少17 %。
1-3. 樣本採集方法和組織病理學分析方法
在起始(感染前)、中間時間(感染)和副溶血性弧菌對蝦的攻擊試驗結束時的每個時間點，從每群組隨機選擇兩隻蝦並提取其肝臟。將部分提取的肝胰臟儲存在乙醇(100%)中以用於定量實時PCR(qPCR)分析，另一部分在戴維森氏固定劑(Davidson’s fixative)中固定24小時，然後儲存在乙醇(70%)中以用於組織病理學分析。
更具體地，組織病理學分析係藉由以下方法進行。
為了盡量減少提取的肝胰臟組織的損傷，剛在每個水箱取樣後即使用1mL注射器將戴維森氏固定劑注入蝦的肝胰臟中，並提取肝胰臟。然後，將每個提取的肝胰臟在1.5mL含有戴維森氏固定劑的微量離心管中固定24小時，儲存在乙醇(70%)中，並用於分析。完成固定時，將器官修剪至約2mm至約3mm的厚度，以適用於製備組織樣本並插入盒中，並將牠們的組織處理13小時。將這些組織薄切成約4μm的厚度，用刷子採集所得樣本，附著於每個載玻片上但沒有任何皺褶，在空氣中放置約5分鐘，然後進行H&E染色。完成染色後，使用相差顯微鏡(BX50，Olympus)，用於顯微鏡(TCapture，Tucen Photonics)以專業程式在200×放大率下拍照。然後，對採樣之肝胰臟中存在的AHPND毒素的量進行qPCR分析。
結果如第2圖所示，其中較低的Ct值表示較高量的毒素。
在攻擊試驗前的時間點(即，第0小時)取樣的肝胰臟中，在所有群組中未檢測到AHPND毒素，而在攻擊試驗的10小時時間點(即， 第10小時；當死亡受試者的數量最高時)取樣之肝胰臟中，在所有樣本中檢測到AHPND毒素。然而，與對照組1和對照組2相比，BS組1(其被提供根據本揭示內容之含枯草桿菌之飼料組成物)顯示出顯著更高的Ct值，以及在攻擊試驗之24小時時間點採樣之肝胰臟中，在BS組1中偵測到最低水平的AHPND毒素。此外，在攻擊測試的終止時間點(即，第193小時)，在BS組1和控制組2中未檢測到AHPND毒素。
另外，肝胰臟的組織病理學分析結果顯示在第2圖中。
在攻擊試驗前的時間點(即，第0小時)取樣的肝胰臟中，在所有群組中觀察到異常組織。在10小時時間點取樣的肝胰臟中，顯示對照組1中的損傷水平最嚴重，並且在BS組1和對照組2中觀察到組織壞死的進展。在24小時時間點取樣的肝胰臟中，觀察到發炎，而不是由AHPND毒素引起的組織壞死。在攻擊試驗之終止時間點(即，第193小時)採樣的肝胰臟中，由於在對照組1中之第37小時時間點發生100%死亡而不可能進行取樣，而在BS組1和對照組2中觀察到一些發炎細胞。
從以上結果可以看出，證實了根據本揭示內容之含有枯草桿菌之飼料組成物不僅可以改善蝦對副溶血性弧菌感染的疾病抗性，還可以顯著降低蝦肝胰臟細胞中AHPND毒素的含量。
實驗例2. 根據枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌濃度之蝦成長率和免疫力之評估
考慮到製備例2中的結果，製備含有各種濃度的製備例1中選擇之枯草桿菌1(KCCM11143P，後文中稱為“BS”)、短小芽孢桿菌 (KCCM11144P，後文中稱為“BP”)和地衣芽孢桿菌(KCCM11270P，後文中稱“BL”)中之每一者之飼料組成物(實施例1至5)。結果如下表5所示。
Figure 107147913-A0202-12-0024-7
表5中各群組之組成物係藉由加入魚油和水，混合然後造粒而製備。將表5中各群組之組成物用乾燥器在25℃乾燥約24小時，並在-20℃儲存直到後續實驗。
2-1. 蝦之製備和成長速度之評估
在總共280個水箱中，每個水箱準備五隻白蝦。所有實驗水箱都配備有空氣石以維持溶解氧，並且在整個實驗期間水箱的溫度保持在28℃至32℃的範圍內。飼料以有限的供應量(6%至12%的魚重，初始體重：0.14g)每天餵食4次，持續8週。
每2週測量一次蝦的重量。與成長率和飼料效率相關之評估項目和計算公式如下：
‧體重增加(%)=100×(最終平均體重-初始平均體重)/平均體重
‧飼料轉化率(%)=體重增加量/進食量
‧每日特定成長率(%天-1)=100×(loge最終體重-loge初始體重)/天數結果如下表6所示。
Figure 107147913-A0202-12-0026-8
如表6和第4圖所示，餵食8週之所有蝦群組與餵食前相比，成長率增加超過7,000%。特別地，BS組1(被提供實施例1之飼料組 成物)之最終平均體重和BS組2(被提供實施例2之飼料組成物)之最終平均體重分別大於對照組的最終平均體重15.7%和16.7%。與對照組1之最終平均體重相比，BS+BP組1(被提供實施例3之飼料組成物)之最終平均體重、BS+BP組2(被提供實施例4之飼料組成物)之最終平均體重以及BS+BP+BL組1(被提供實施例5之飼料組成物)之最終平均體重分別增加7.8%、15.6%和8.8%。另外，關於每日特定生長率，BS組1和BS組2與對照組1相比，顯示出分別為3.4%和4.1%之增加的值。與對照組1之每日特定成長率相比，BS+BP組1，BS+BP組2和BS+BP+BL組1之每日特定生長率分別增加2.4%、3.4%和2.5%。與對照組1之餵食效率相比，BS組1和BS組2之餵食效率分別提高了27.5%和26.1%。與對照組1相比，BS+BP組1、BS+BP組2和BS+BP+BL組1之餵食效率分別增加了11.1%、20.9%和13.1%。然而，所有群組中蝦的存活率沒有顯著差異。
2-2. 樣本採集
每2週對測試蝦稱重，並且在測量前18小時將所有測試蝦禁食以減少蝦的壓力。
在測量最終重量後，從各水箱隨機選擇7隻蝦並在冰水中麻醉，並且使用經Alsever氏溶液處理之注射器採集血淋巴。採集之血淋巴用於分析氮藍四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)活性，並且其中使用離心機(800g，10分鐘，4℃)分離血清之樣本係用於分析非特異性免疫。
關於採集用於消化率分析之蝦糞，在餵食30分鐘後，藉由虹吸和水交換而清潔水槽中剩餘之飼料和雜質，並且此後3小時，使用虹 吸管採集排泄的糞便。將採集之樣本用蒸餾水洗滌，通過濾紙過濾，並在-40℃之低溫冷凍機中儲存，直到用作分析樣本。
2-3. 統計分析
對於實驗飼料之分布，進行完全隨機化之設計，並使用SPSS Version 18.0程式，藉由單向ANOVA而統計分析成長和分析之結果。在鄧氏多距檢定(Duncan’s multiple range test)中比較了數據值的顯著差異(P<0.05)。數據以平均值±SD表示，而且百分比數據經計算為反正弦變換值並進行統計分析。
2-4. 共同成分之分析
根據AOAC(2005)方法分析糞便之測試飼料和糞便之共同成分；藉由大氣壓力加熱乾燥法(125℃，3小時)而得到水分含量(Kejltec system 2300，Sweden)；藉由直接焚燒法(550℃，4小時)而得到到粗灰粉；藉由自動化粗蛋白質分析儀(Kejltec system 2300，Sweden)而得到粗蛋白質；藉由Folch等人之方法(1957年)而得到粗脂質。結果如下表7所示。
Figure 107147913-A0202-12-0029-11
如表7所示，關於粗灰分和粗脂質的含量，各群組之間沒有顯著差異。然而，與對照組1和對照組2之粗蛋白相比，BS組2中之粗蛋白的含量顯著更高。亦即，證實了當提供根據本揭示內容之飼料組成物給蝦時，蝦之蛋白質含量可以增加。
2-5. 與非特異性免疫有關之分析
2-5-1. 氮藍四唑(NBT)活性分析
將Zhang等人之分析方法(2013年)用於測定呼吸爆炸期間嗜中性細胞產生之氧化自由基的量。
具體而言，首先，將血淋巴(50μL)與200μL之Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)混合，並使其在25℃反應。30分鐘後，向其中加入100μL 酵母聚醣(0.1%Hank溶液)，並在37℃反應2小時。每次以100μL的量向其中加入NBT溶液(0.3%)，並在37℃反應2小時。向其中加入100%甲醇(600μL)，並將混合物以6,500rpm之率離心10分鐘。將上清液丟棄，用70%甲醇(100μL)洗滌沉澱物3次，並乾燥5分鐘。然後，向其中加入2M KOH(700μL)和DMSO(800μL)，並在620nm測量所得物之吸光度。
2-5-2. 穀胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性之分析
將GPx試劑盒(Biovision,Inc.，California)用於分析血清中之GPx活性。
具體地，將其中混合過氧化物基質(ROOH)、穀胱甘肽還原酶(GSSG-R)和還原之b-菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)之反應混合物用作氫過氧化異丙苯。首先，將血淋巴樣本(50μL)加入微量滴定儀中，並向其中加入反應混合物(40μL)並反應。然後，向其中加入氫過氧化異丙苯(10μL)，而且5分鐘後，在340nm測量所得物之吸光度。GPx活性經計算為nmol/min/mL。
2-5-3. 溶菌酶活性分析
溶菌酶活性係根據Swain等人(2007年)之方法而分析。
具體地，溶菌酶係參與非特異性(先天性)免疫反應之抗菌酶，以非特異性之方式對各種細菌表現出抗菌活性的酶，而不是以特定方式針對特定細菌。
對致病菌之抗菌機制係水解肽聚糖(其係細菌細胞壁之組成部分)之β-1,4-醣苷鍵之抗菌作用，從而破壞細菌細胞壁。溶菌酶對革蘭氏陽性細菌特別有效。基於這種機制，溶菌酶活性被廣泛用於分析以測量蝦 (包括魚)中之非特異性免疫反應。當將免疫刺激劑(例如抗壞血酸、β-葡聚糖、益生菌等)加到蝦飼料中時，可以證實蝦之血淋巴和組織中之溶菌酶活性增加，而且這些結果被解釋為增加非特異性免疫反應或改善魚類(蝦)之免疫力。
2-5-4. 酚氧化酶(PO)活性之分析
基於Hernandez-Lopez等人之方法(1996)而分析酚氧化酶(PO)活性。
具體地，酚氧化酶係在甲殼類動物之防禦機制中具有重要作用之酶，其在血液細胞中以酚氧化酶之形式存在並由原酚氧化酶活化系統活化。活化之酚氧化酶產生調理素，其促進血液細胞之吞噬作用和對外來抗原之包覆作用，並參與血液凝固反應。因此，血淋巴內之酚氧化酶活性係用作蝦之先天免疫力之重要指標。
2-5-5. 超氧化物歧化酶(SOD)活性之分析
將SOD測定試劑盒(Sigma-Aldrich，19160，St.Louis，USA)用於分析SOD活性。
具體地，將自由基偵測劑(20μL)添加到96孔板中，並且將每個血液樣本(20μL)加到每個孔中。然後，向其中加入黃嘌呤氧化酶(20μL)並反應20分鐘。使用Microplate Reader(Thermo)在450nm測量所得物的吸光度。
2-5-6. 抗蛋白酶活性之分析
血淋巴內之抗蛋白酶活性係使用Ellis之分析方法(1990)而分析。
具體地，將血淋巴(20μL)和標準胰蛋白酶溶液(20μL；來自豬胰臟的II-S型，Sigma-Aldrich，A2765，St.Louis，USA)混合，並在22℃培養10分鐘。向其中加入磷酸鹽緩衝液(200μL；0.1M，pH7.0)和偶氮酪蛋白(2%)(250μL；Sigma-Aldrich)，在22℃培養1小時，並再度向其中加入三氯乙酸(500μL；10%)(TCA)，在22℃培養30分鐘。將培養液離心(6000g，5分鐘)，將所得物(100μL)接種到96孔板中，在其中加入1N NaOH(100μL)，測定所得物的吸光度。使用Microplate Reader進行430nm。
其中進行非特異性免疫分析之實驗例2-5-1至2-5-6之結果示於下表8中。
Figure 107147913-A0202-12-0032-12
 (*P<0.05) 1氮藍四唑；吞噬活性(吸光度) 2酚氧化酶活性(吸光度) 3抗蛋白酶(抑制%) 4溶菌酶活性(μgmL-1) 5超氧化物歧化酶(抑制%) 6穀胱甘肽過氧化物酶(mU mL-1)
如表8和第5圖所示，關於NBT活性和PO活性，與對照相1和對照組2相比，所有BS組1、BS組2、BS+BP組1、BS+BP組2和BS+BP+BL組1顯示出顯著更高的值；特別是，在PO活性之情況下，BS組1顯示出比對照組1高出26.8%之值。關於抗蛋白酶活性，與對照組1和對照組2相比，所有BS組1、BS組2、BS+BP組2和BS+BP+BL組1顯示出顯著更高的值；特別是，BS組1顯示出比對照組1高出15.8%之值。關於溶菌酶活性和SOD活性，與對照組1相比，所有BS組1、BS組2、BS+BP組1、BS+BP組2和BS+BP+BL組1顯示出顯著更高之溶菌酶活性和SOD活性。關於GPx活性，與對照組1和對照組2相比，所有BS組1、BS組2、BS+BP組1、BS+BP組2和BS+BP+BL組1顯示出顯著更高的值。特別是，BS組1和BS組2顯示出比對照組1分別高出27.7%和28.8%之值。
2-6. 水質分析與零水交換實驗
在餵食實驗的8週期間，每5天從每個水箱採集培養水樣本。從每箱中的相同位置採集樣本，並測量溶解氧(DO)、鹽度、pH和氨(NH4+)濃度。藉由Thermo Scientific Orion Star A216 Benchtop Meter(Thermo Scientific)而測量DO，且藉由主折射儀(ATAGO)測量鹽度。藉由Seven Compact(METTLER TOLEDO)測量pH，並且藉由根據Verdouw等人之方法(1978年)分析NH4 +之濃度。
將12隻平均重量為2.87(±0.08)g之白蝦(中南美白對蝦)用零換水方法隨機放入每個96L水槽中，總共14個水槽。每個試驗組有兩個重複，並且每天四次以分次劑量(在08：30、12：00、15：30和19：00)對蝦投予10%體重之測試飼料。根據Verdouw等人(1978)，每天採集一次水樣本，測量水樣本中之總氨濃度10天。結果如表9所示。
Figure 107147913-A0202-12-0034-13
如表9和第6圖所示，有趣的是，從第7天開始，所有試驗組開始顯示出比對照組更低的總氨濃度，並且在第10天，所有試驗組顯示出比對照組顯著更低的氨濃度。
2-7. 消化率分析
2-7-1. 指示劑(Cr 2 O 3 )分析
將根據Divakaran等人之方法(2002)用以分析測試飼料和粉末中之氧化鉻含量。
具體地，將測試飼料和粉末樣本在灰化爐(550℃)中灰化4小時，並將獲得的樣本用於分析。首先，為了將氧化鉻氧化成單鉻酸鹽形式，稱量5mg至10mg粉末樣本並轉移到玻璃試管中。將4mL高氯酸試劑(HClO4)加到含有樣本的玻璃試管中。藉由將200mL硝酸在100mL蒸餾水中混合，冷卻混合物，然後向其中混合200mL之70%高氯酸而製備高氯酸試劑(70%)。將含有樣本和高氯酸試劑之玻璃試管置於加熱板中，在300℃加熱15分鐘，然後冷卻至室溫。將預處理之樣本轉移到50mL玻璃燒瓶中，並用三重蒸餾之水定量至25mL。此後，使用分光光度計(Beckman DU-730)在350nm測量吸光度。將如在樣本分析中從預處理之標準溶液準備之標準公式用以利用測量之吸光度計算樣本的氧化鉻含量。
2-7-2. 乾物質和蛋白質消化率之分析
藉由以下方法而計算測試飼料之乾物質和蛋白質消化率：乾物質之ADC(%)=100-100×(飲食中之Cr2O3/糞便中之%Cr2O3)；蛋白質之ADC(%)=100-100×(飲食中的%Cr2O3/糞便中之%Cr2O3)×(糞便中之蛋白質%/飲食中之%蛋白質)
在飼養實驗結束時進行的消化率分析的結果顯示在表10中。
Figure 107147913-A0202-12-0036-14
如表10所示，與對照組相比，所有測試組顯示出顯著更高的乾物質消化率和蛋白質消化率。
製備例3. 包括枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之蝦飼料組成物之製備
製備包括枯草桿菌1(登錄號KCCM11143P，以下簡稱“BS”)、短小芽孢桿菌(登錄號KCCM11144P，以下簡稱“BP”)和製備例1中選擇之地衣芽孢桿菌(以下簡稱“BL”)飼料組成物。
具體而言，比較例1之不含芽孢桿菌屬菌株之組成物、比較例3之含有109×0.2CFU/g之BS之組成物、比較例4之含有1010×0.2CFU/g之BS之組成物、實施例5之含有109×0.2CFU/g之BS、BP和BL之組成物，以及實施例6之含有1010×0.2CFU/g之BS、BP和BL之組成物係藉由添加魚油和水且將其混合，而以丸形式製備。比較例1、3和4以 及實施例5和6之飼料組成物用乾燥器在25℃乾燥約24小時，並在-20℃儲存直至實驗。
Figure 107147913-A0202-12-0037-16
實驗例3. 飼料組成物對AHPND的預防功效的評價
3-1. 蝦的製備
在每個水箱中製備30隻白蝦，總共40個水箱。所有水箱都配備有空氣石以維持溶解氧，並且在整個實驗過程中供水的水溫保持在28℃至32℃的範圍內。飼料以限制的方式(魚體重的4%至12%)每天給予4次。
3-2. 副溶血性弧菌之攻擊試驗
為了確認包括枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之飼料組成物之抗菌活性，進行了一次攻擊試驗，使得蝦被副溶血性弧菌攻擊。在弧菌菌株之情況下，使用2013年從越南單離之AHPND(EMS)誘發之菌株進行測試。攻擊試驗按如下方式進行：將實施例之飼料組成物餵食蝦4週，然後將相同重量的蝦(平均重量：2.30g)分成4個重複，每群組96隻蝦。將細菌用TSB+培養基在30℃，150rpm培養細菌24小時，並將副溶血性弧菌之懸浮液以每箱6.3×105CFU/mL之濃度浸潤。浸潤後，每小時確認蝦之存活率和游泳狀態，並且於8小時後，交換95%之水。測試飼料以限制的方式(魚體重的10%至12%)，每天分次給予劑量三次(8：30、13：30和18：30)，並且觀察死亡率70個小時。結果如下表12所示。
Figure 107147913-A0202-12-0039-17
如表12所示，在副溶血性弧菌對蝦之攻擊試驗中，BS+BP+BL組1和2(其被提供實施例5和6之包括枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之飼料組成物)，顯示較對照例1(其被提供比較例1之飼料組成物和BS組3和4(被比較例3和4之飼料組成物)更高之存活率。
實驗例4. 飼料組成物對WSSV之預防功效之評估
為了確認包括枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之飼料組成物之抗病毒活性，進行了攻擊試驗，使蝦受到白斑綜合症病毒的攻擊。在白斑綜合症病毒之情況下，從感染WSSV之白蝦(中南美白對蝦(Litopenaues vannamei))中單離之病毒係於2017年從家庭農場獲得並用於測試。攻擊試驗如下進行：將實施例之飼料組成物給予蝦6週，然後將具有相同重量(平均重量：6.25g)之蝦分成4重複，每群組96隻蝦。病毒之接種濃度為4.1×105拷貝(copy)/μL，並使用注射器以100μL病毒肌內接種每隻蝦。每隻蝦之最終接種濃度為4.1×107拷貝/μL。
接種後，確認蝦之死亡率及其游泳狀態。測試飼料以限制的方式(魚體重的10%至12%)，每天分次給予劑量三次(8：30、13：30和18：30)，並且觀察死亡率125小時。結果如下表13所示。
Figure 107147913-A0202-12-0040-18
如表13所示，在白斑綜合症病毒對蝦之攻擊試驗中，BS+BP+BL組1和2(其被提供實施例5和6之包括枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之飼料組成物)顯示出比對照組1(其被投予比較例1之飼料組成物)和BS組4(齊備投予比較例和4之飼料組成物)更高之存活率。
實驗例5. 飼料組成物對WSSV和AHPND共感染之預防功效的評價
為了確認包括枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之飼料組成物之抗菌和抗病毒活性，進行了攻擊試驗，使蝦受到副溶血性弧菌和白斑綜合病毒的攻擊。在弧菌菌株之情況下，使用2013年從越南單離之AHPND(EMS)誘發之菌株進行測試。在白斑綜合症病毒之情況下，從感染WSSV之白蝦(Litopenaues vannamei)中單離之病毒係於2017年從家庭農場獲得並用於測試。攻擊試驗如下進行：將實施例的飼料組成物給予蝦 6週，然後將具有相同重量(平均重量：4.52g)之蝦分成4重複，每群組96隻蝦。病毒的接種濃度為8.3×103拷貝/μL，用注射器以50μL病毒肌內接種每隻蝦。每隻蝦的最終接種濃度為4.1×104拷貝/μL。病毒接種後兩天，用弧菌菌株感染蝦。
將細菌用TSB+培養基在30℃，150rpm培養24小時，並將副溶血性弧菌的懸浮液以每箱1.3×105CFU/mL之濃度浸潤。浸潤後，每小時確認蝦之死亡率及其游泳狀態。測試飼料以限制的方式(魚體重的10%至12%)，每天分次給予劑量三次(8：30、13：30和18：30)，並且觀察死亡率7天。結果如下表14所示。
Figure 107147913-A0202-12-0041-19
如表14所示，在副溶血性弧菌和白斑綜合症病毒對蝦之攻擊試驗中，BS+BP+BL組1和2(其被提供包括枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之實施例5和6的飼料組成物)顯示出比對照組1(其被投予比較例1之飼料組成物)和BS組4(其被投予比較例4之飼料組成物)更高的存活率。
基於上述實施例，根據本揭示內容之包括枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之飼料組成物可以增加白蝦之成長、飼料效率、消化率、培養水質和非特異性免疫。此外，預期本揭示內容能夠生產高蛋白白蝦，從而可以提高蝦的適銷性。
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Claims (8)

  1. 一種用於預防或治療急性肝胰臟壞死病(AHPND)之飼料組成物，包括枯草桿菌菌株、以KCCM11144P寄存之短小芽孢桿菌菌株和以KCCM11270P寄存之地衣芽孢桿菌菌株；其培養物；其濃縮物；或其乾物質作為活性成分。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之飼料組成物，其中該枯草桿菌為KCCM11143P。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之飼料組成物，其中該枯草桿菌、該短小芽孢桿菌和該地衣芽孢桿菌具有細菌數為1×104CFU至1×1011CFU/公克之活性成分。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之飼料組成物，其中該急性肝胰臟壞死疾病(AHPND)係由副溶血性弧菌引起。
  5. 一種用於預防或治療白斑綜合症(WSS)之飼料組成物，包括枯草桿菌菌株、短小芽孢桿菌菌株和地衣芽孢桿菌菌株；其培養物；其濃縮物；或其乾物質作為活性成分，其中該短小芽孢桿菌菌株以KCCM11144P寄存，和該地衣芽孢桿菌菌株以KCCM11270P寄存。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之飼料組成物，其中該白斑綜合症(WSS)係由白斑綜合症病毒(WSSV)引起。
  7. 如申請專利範圍第5或6項所述之飼料組成物，其中該枯草桿菌為KCCM11143P。
  8. 如申請專利範圍第5或6項所述之飼料組成物，其中該枯草桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌具有細菌數為1×104CFU至1×1011CFU/公克之活性成分。
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Shabanzadeh Katayoon Nofouzi, Najmeh Sheikhzadeh, Hossein Varshoie, Sona Khadir Sharabyani, Mehran Jafarnezhad