BR112019007636B1 - Usos de uma composição de alimentação compreendendo uma cepa de bacillus subtilis para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda ou síndrome da mancha branca - Google Patents
Usos de uma composição de alimentação compreendendo uma cepa de bacillus subtilis para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda ou síndrome da mancha branca Download PDFInfo
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Abstract
a presente revelação se refere a uma composição de alimentação para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda (ahpnd) ou síndrome da mancha branca (wss) que compreende uma cepa de bacillus subtilis (kccm11143p), um meio de cultura da mesma, um concentrado da mesma ou uma matéria seca da mesma como um ingrediente ativo. a composição de alimentação exibe atividade antibacteriana contra vibrio parahaemolyticus que causa ahpnd de camarão e atividade antiviral contra vírus de síndrome da mancha branca (wssv) que causa wss.
Description
[001] A presente revelação refere-se a uma composição de alimentação para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND) ou síndrome da mancha branca (WSS) que compreende uma cepa de Bacillus subtilis, um meio de cultura da mesma, um concentrado da mesma, ou uma matéria seca da mesma como um ingrediente ativo.
[002] A síndrome de mortalidade precoce (EMS), a doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND), e a síndrome de necrose hepatopancreática aguda (AHPNS) são doenças rapidamente crescentes no cultivo de camarão, e Vibrio parahaemolyticus é um agente etiológico dessas doenças; isto é, Vibrio parahaemolyticus produz toxinas de insetos que causam 100% de letalidade em 6 horas ou em uma semana (Tran et al. 2013. Dis aquat Org 105:45 a 55). As toxinas de inseto são produzidas pela expressão de genes específicos presentes em um plasmídeo específico das bactérias (isto é, toxinas relacionadas a insetos photorhabdus; toxina Pir), e são facilmente movidas, isto é, as mesmas têm mobilidade. Nesse aspecto, essas doenças se espalham mais rapidamente do que as doenças de camarão virais, como vírus de síndrome da mancha branca (WSSV), vírus de síndrome de Taura (TSV), vírus de mionecrose infecciosa (IMNV), etc., os quais receberam atenção recentemente. AHPND começou na China em 2009, e se espalhou rapidamente em países asiáticos (por exemplo, Tailândia, Malásia e Vietnã) dentro de um ano, e ocorreu adicionalmente no México, de modo a se espalhar para outros países da América Central, resultando em danos para a maioria dos mercados de camarão. A Coréia do Sul também sofreu grandes danos devido à AHPND de 2015 a 2016, e os estudos estão em ação para prevenir ou gerenciar a doença.
[003] Recentemente, devido à demanda de consumidores por produtos seguros e a estratégia de produção para cultivo contínuo, os agentes terapêuticos usados para tratar bactérias patogênicas existentes são restritos por regulações relacionadas ao cultivo. Portanto, no cultivo de camarão, é necessário considerar não apenas a qualidade e o método de criação de mercadorias principais, como também os fatores importantes que controlam as doenças.
[004] Enquanto isso, os probióticos são definidos como preparações microbianas ou componentes que auxiliam no equilíbrio de micro-organismos no intestino, e têm um significado etimológico que é oposto aos antibióticos, o qual se refere a um material antibiótico. De modo representativo, os exemplos dos probióticos incluem bactérias de ácido láctico, como Lactobacillus e Bifidobacterium. Adicionalmente, os probióticos não possuem genes tóxicos contra seres humanos e animais, nem produzem substâncias patogênicas, e são classificados, desse modo, como GRAS (geralmente reconhecidos como seguros). Portanto, o desenvolvimento de um aditivo de alimentação com o uso de probióticos, cuja segurança é demonstrada, foi ativamente alcançado.
[005] Como exemplo, A Publicação de Patente n° KR 10-2011-035554 revela uma cepa misturada de CMB L1 inovador do gênero Bacillus e CMB201 do gênero Lactobacillus, uma composição alimentar para intensificação de imunidade e anticâncer com o uso das mesmas, e uma preparação microbiana que tem atividade antibacteriana. Além disso, a Patente n° KR 10-0977407 revela um reforçador imune e aditivo alimentar para animais que contém lisados de Zygosaccharomyces bailii, o que aumenta várias atividades de neutrófilos, as células fagocíticas principais de animais, e intensifica a defesa não específica contra inoculação de ataque por bactérias patogênicas. Entretanto, a imunoatividade real do aditivo alimentar com o uso de probióticos é inadequada, e desse modo, a pesquisa por um aditivo alimentar com o uso de probióticos que ainda tenha imunoatividade excelente é necessária.
[006] Os presentes inventores fizeram esforços intensivos para desenvolver uma alimentação de camarão suplementada com probióticos (Bacillus sp.) para prevenção de AHPND de camarão. Como resultado, os mesmos confirmaram que, quando a composição de alimentação suplementada com Bacillus subtilis é alimentado a um camarão, a taxa de sobrevivência de um camarão contra infecção de AHPND (causada por uma cepa isolada da área afetada no Vietnã em 2013; Tran et. al. 2013.) ou infecção de WSSV é melhorada, e que a taxa de crescimento e a imunidade não específica de camarão são não apenas aumentadas, como também a qualidade de água é aumentada e a produção de camarão de alto teor de proteína pode ser produzida, assim completando a presente revelação.
[007] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma composição de alimentação para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND) que compreende uma cepa de Bacillus subtilis, um meio de cultura da mesma, um concentrado da mesma ou uma matéria seca da mesma como um ingrediente ativo.
[008] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda que compreende administrar a composição de alimentação a um indivíduo.
[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer uma composição de alimentação para prevenir ou tratar a síndrome da mancha branca (WSS) que compreende uma cepa de Bacillus subtilis, um meio de cultura da mesma, um concentrado da mesma, ou uma matéria seca da mesma como um ingrediente ativo.
[010] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para prevenir ou tratar a síndrome da mancha branca que compreende administrar a composição de alimentação a um indivíduo.
[011] A composição da presente revelação, que compreende uma cepa de Bacillus subtilis (KCCM11143P) cepa como ingrediente ativo, tem atividade antibacteriana contra Vibrio parahaemolyticus, que causa AHPND que é problemático no cultivo de camarão e atividade antiviral contra vírus de síndrome da mancha branca, que causa WSS, e exibe um efeito de melhora de imunidade do hepatopâncreas de camarão e, desse modo, a composição da presente revelação pode ser usada como uma composição de alimentação de camarão ou um aditivo de alimentação.
[012] A Figura 1 é um gráfico que mostra a taxa de sobrevivência de camarão infectado com Vibrio parahaemolyticus.
[013] A Figura 2 é um gráfico que mostra a análise do teor de AHPND no hepatopâncreas de camarão.
[014] A Figura 3 é de imagens que mostram recursos patológicos do hepatopâncreas de camarão.
[015] A Figura 4 é de gráficos que mostram as taxas de crescimento de camarões. As Figuras 4(a) a 4(d) mostram o peso corporal final, a taxa de ganho de peso, a taxa de crescimento diário, e a taxa de conversão de alimentação, respectivamente.
[016] A Figura 5 é de gráficos que analisam as imunidades não específicas de camarões. As Figuras 5(a) a 5(e) mostram as atividades contra macrófagos, fenoloxidase, antiproteinase, lisozima, e superóxido dismutase, respectivamente.
[017] A Figura 6 é um gráfico que mostra os resultados de análise de qualidade de água na água de criação com zero troca de água.
[018] Abaixo, no presente documento, a presente revelação será descrita em detalhes. Enquanto isso, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificativas. Isto é, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Adicionalmente, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida abaixo, no presente documento.
[019] A fim de alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece uma composição de alimentação para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND) que compreende uma cepa de Bacillus subtilis, um meio de cultura da mesma, um concentrado da mesma ou uma matéria seca da mesma como um ingrediente ativo.
[020] Conforme usado no presente documento, o termo “Bacillus subtilis” é uma bactéria aeróbica que não é tóxica e produz esporos. Bacillus subtilis é amplamente distribuído na natureza, como em grama seca, solo, esgoto, ar, etc. Essa bactéria é amplamente usada na indústria devido ao fato de que produz enzimas para coagular o leite, sacarifica amido e decompõe gordura e óleo. As condições otimizadas crescimento da bactéria são pH de 7 a 8,5 e uma temperatura de 37 °C a 40 °C. Devido às características de uma cepa do gênero Bacillus, a cepa não possui genes tóxicos para seres humanos e animais, é não patogênico, não produz substâncias patogênicas, e exibe uma taxa de crescimento rápido in vivo. Bacillus subtilis tem um habitat anaeróbico na presença de glicose, etc., e endoesporos permitem que Bacillus sobreviva em ambientes extremamente severos, como altas e baixas temperaturas.
[021] Na presente revelação, a Bacillus subtilis pode ser uma cepa depositada com Número de Acesso KCCM11143P.
[022] Na presente revelação, uma composição de alimentação que compreende o Bacillus subtilis (KCCM11143P) foi preparada.
[023] A composição da presente revelação pode compreender o Bacillus subtilis (KCCM11143P), que tem uma contagem bacteriana de 1 x 104 CFU a 1 x 1011 CFU por grama dos ingredientes ativos totais. Especificamente, a contagem bacteriana pode ser 1 x 104 CFU/g a 1 x 1010 CFU/g, e mais especificamente, a composição da presente revelação compreende o Bacillus subtilis (KCCM11143P), que tem a contagem bacteriana de 1 x 108 a 1 x 1010 CFU/g.
[024] Para os objetivos da presente revelação, Bacillus subtilis contido na composição de alimentação como um ingrediente ativo pode compreender apenas Bacillus subtilis (KCCM11143P).
[025] Conforme usado no presente documento, o termo “doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND)” se refere à doença nomeada como síndrome de mortalidade precoce (EMS) ou síndrome de necrose hepatopancreática aguda (AHPNS), e se refere coletivamente à mortalidade em massa causada por patógenos dentro de 30 dias de repouso em uma fazenda aquática. AHPND é causado por Vibrio parahaemolyticus, uma bactéria patogênica presente em água do mar, a qual tem um grande número de infecções em camarão- de-patas-brancas que responde por cerca de 96% de camarões cultivados coreanos. Devido à alta taxa de mortalidade nos estágios precoces da vida, a mesma é nociva a camarões, mas é inofensiva para seres humanos.
[026] O Vibrio parahaemolyticus é um bacillus Gram- negativo que pertence ao gênero Vibrio, o que causa uma intoxicação alimentar aguda e enterite em seres humanos e causa vibrose em peixes. Recentemente, Vibrio parahaemolyticus foi identificado como uma bactéria causativa de doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND), a qual causa mortalidade em massa na indústria de cultivo de camarão.
[027] A composição da presente revelação pode compreender adicionalmente Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, ou uma combinação dos mesmos como um ingrediente ativo. O Bacillus pumilus pode ser uma cepa depositada com N° de Acesso KCCM11144P, e o Bacillus licheniformis pode ser uma cepa depositada com N° de Acesso KCCM11270P.
[028] Conforme usado no presente documento, o termo “prevenção” se refere a qualquer comportamento que resulta na supressão ou atraso de sintomas de AHPND de camarão administrando-se a composição de acordo com a presente revelação, a qual compreende Bacillus subtilis.
[029] Conforme usado no presente documento, o termo “tratamento” se refere a qualquer ação que resulta no alívio de ou recuperação total de sintomas de AHPND de camarão administrando-se a composição de acordo com a presente revelação, a qual compreende Bacillus subtilis (KCCM11143P).
[030] Além das cepas acima contidas como ingredientes ativos, a composição pode incluir um carreador conhecido ou um aditivo que é aceitável para uso farmacêutico, alimentar ou de alimentação. Na presente revelação, como preparação probiótica que tem atividade antibacteriana contra Vibrio parahaemolyticus, que compreende o Bacillus subtilis (KCCM11143P), pode haver um aglutinante, um emulsificador, um conservante, e semelhantes, os quais são adicionados a fim de impedir a deterioração da qualidade da preparação probiótica; e pode haver um aminoácido, uma vitamina, uma enzima, um agente aromatizante, um composto de nitrogênio não proteico, um silicato, um agente tamponante, um extratante, um oligossacarídeo e semelhantes, os quais são adicionados a uma alimentação para aumentar a eficácia da preparação probiótica. Além disso, uma mistura de alimentação, etc. pode ser adicionalmente compreendida, mas a presente revelação não é limitada a isso.
[031] Em uma modalidade da presente revelação, como resultado de confirmar se a alimentação da composição de alimentação ao camarão aumentaria a imunidade contra AHPND e exibiria o efeito preventivo de doença, foi confirmado que os grupos (Grupos BS 1 e 2), nos quais as composições de alimentação (Exemplo 1 e 2) que incluem a cepa de Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação são administradas, podem aumentar a resistência à doença de camarão contra infecção de Vibrio parahaemolyticus e reduzir de modo significante a quantidade de toxina de AHPND no hepatopâncreas de camarão, em comparação com os grupos (Grupos de Controle 1 e 2), nos quais o Exemplo Comparativo 1 (não incluindo probióticos), e o Exemplo Comparativo 2 (incluindo probióticos comercialmente disponíveis (uma preparação misturada de três Bacilli (B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis))) são administrados.
[032] Em outra modalidade da presente revelação, como resultado da análise da imunidade não específica da composição de alimentação incluindo as cepas acima, foi constatado que a atividade de macrófago (NBT), atividade de glutationa peroxidase (GPx), atividade de lisozima, atividade de fenol oxidase (PO), atividade de superóxido dismutase (SOD) e atividade de antiprotease foram notavelmente mais altas do que aquelas dos Exemplos Comparativos. Com base nesse resultado, pode ser visto que a composição pode ser útil para aumentar as respostas imunes não específicas de camarão ou melhorar a imunidade do mesmo.
[033] A presente revelação fornece um aditivo alimentar para cultivo de camarão que compreende a composição de alimentação mencionada acima.
[034] No aditivo alimentar da presente revelação, um carreador conhecido ou um estabilizador que é aceitável para uso farmacêutico, alimentar ou de alimentação pode ser adicionado além dos ingredientes ativos acima. Quando necessário, todos os tipos de nutrientes, como vitamina, aminoácidos e minerais, antioxidantes, e outros aditivos podem ser adicionados, cujo formato pode ser conveniente, como pó, grânulos, péletes e suspensões. Durante o abastecimento do aditivo alimentar de acordo com a presente revelação, o aditivo alimentar pode ser abastecido sozinho ou misturado com a alimentação para animais não ruminantes.
[035] Adicionalmente, a presente revelação fornece uma alimentação para cultivo de camarão, que compreende o aditivo alimentar mencionado acima.
[036] A cepa de Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação, que é uma bactéria Gram-positiva que tem uma capacidade de esporulação, é preferencialmente formada em uma forma de esporo, mas não é limitada a isso. A alimentação da presente revelação não é particularmente limitada, mas qualquer alimentação, como alimentação em pó, alimentação sólida, alimentação de pélete úmido, alimentação de pélete seco, alimentação de pélete de extrusora (EP) e alimentação bruta está disponível.
[037] Conforme descrito acima, Bacillus sp. forma esporos endógenos e, desse modo, é muito estável contra o calor. Portanto, o Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação pode ser preparado separadamente como uma forma de aditivo alimentar e, então, misturado com uma alimentação, ou pode ser preparado adicionando-se diretamente a uma alimentação durante o preparo da alimentação. O Bacillus subtilis incluído na alimentação da presente revelação pode estar em um estado líquido ou seco e preferencialmente na forma de um pó secado. O processo de secagem pode ser realizado por secagem com ar, secagem natural, secagem por aspersão e secagem por congelamento, mas não é limitado a isso. O Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação pode ser misturado como uma forma de pó em uma quantidade de 0,05% a 10% em peso, preferencialmente 0,1% a 1% em peso, com base no peso da alimentação. Além disso, a alimentação é usada para aquicultura, e pode incluir adicionalmente, além do Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação, aditivos convencionais com capacidade para aumentar a preservabilidade da alimentação.
[038] A fim de alcançar os objetivos acima, outro aspecto da presente revelação fornece um método para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda que compreende administrar a composição de alimentação da presente revelação a um indivíduo.
[039] No presente documento, a doença de necrose hepatopancreática aguda, a prevenção e o tratamento da presente revelação são conforme descrito acima.
[040] Conforme usado no presente documento, o termo “indivíduo” pode se referir a peixes ou crustáceos, cujo cultivo é possível, e que têm ou estão com risco de desenvolver a doença de necrose hepatopancreática aguda, mas o indivíduo pode se referir a camarão de acordo com os objetivos da presente revelação.
[041] A alimentação é preferencialmente abastecida com a mesma quantidade e no mesmo intervalo de alimentação que as alimentações convencionais. Além disso, a bactéria patogênica se refere a uma bactéria que cause, no cultivo de camarão, mortalidade em massa de camarões induzindo-se AHPND, e podem se referir especificamente a Vibrio parahaemolyticus.
[042] As causas de mortalidade em massa no cultivo de camarão incluem não apenas o Vibrio parahaemolyticus, como também a infecção por vários vírus e a concentração de amônia em água de criação. No cultivo de camarão, a amônia na água de criação ocorre como metabólito de proteínas, como fezes de camarão, resíduo de alimentação, etc., e varia grandemente com o aumento de pH e temperatura de água. A amônia em alta concentração é uma causa direta de morte aguda de camarão, levando à mortalidade em massa; e amônia a uma baixa concentração pode levar a uma redução no crescimento, assim como a capacidade de alimentação e imunidade do camarão a longo prazo, o que pode, por sua vez, levar ao desenvolvimento de várias doenças.
[043] Em uma modalidade da presente revelação, a água de criação de camarão na qual a composição de alimentação da presente revelação foi alimentada foi coletada e analisada, e como resultado, foi constatado que a concentração de amônia total na água de criação foi mais baixa de modo significativo do que aquela do controle, e assim, a cepa de Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação pode melhorar a qualidade de água da água de criação de camarão.
[044] Conforme descrito acima, o Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação pode não apenas intensificar a resistência à doença de camarão, como também inibir a toxina de AHPND no hepatopâncreas de camarão. Portanto, usando-se a cepa, o efeito de prevenir Vibrio parahaemolyticus que causa a doença pode ser obtido, e assim o camarão pode ser cultivado de modo mais seguro.
[045] A fim de alcançar os objetivos acima, ainda outro aspecto da presente revelação fornece uma composição de alimentação para prevenir ou tratar síndrome da mancha branca (WSS), que compreende uma cepa de Bacillus subtilis, um meio de cultura da mesma, um concentrado da mesma, ou uma matéria seca da mesma como um ingrediente ativo.
[046] Os termos da presente revelação, Bacillus subtilis, prevenção, e tratamento são conforme descrito acima.
[047] A composição da presente revelação pode compreender o Bacillus subtilis (KCCM11143P), que tem uma contagem bacteriana de 1 x 104 CFU a 1 x 1011 CFU por grama dos ingredientes ativos totais. Especificamente, a contagem bacteriana pode ser 1 x 104 CFU/g a 1 x 1010 CFU/g, e mais especificamente, a composição da presente revelação compreende o Bacillus subtilis (KCCM11143P), que tem a contagem bacteriana de 1 x 108 CFU/g a 1 x 1010 CFU/g.
[048] Conforme usado no presente documento, o termo “vírus de síndrome da mancha branca (WSSV)” se refere a um vírus amplamente distribuído por todo o mundo. Devido ao fato de que WSSV tem uma fixação semelhante a cauda na extremidade de um vírion, e possui uma forma similar a um bacillus em formato de ovo no qual um capsídeo com formato de haste e um envelope estão presentes, o mesmo foi denominado baculovírus ou vírus formado como bacillus; entretanto, recentemente, foi renomeado whispovírus, que é um grupo viral geneticamente novo. O vírus tem um comprimento de cerca de 275 nm e um diâmetro de cerca de 120 nm, e é composto de DNA de fita dupla que tem um tamanho de cerca de 290 kb.
[049] A composição pode incluir, além das cepas acima contidas como ingredientes ativos, um carreador conhecido ou um aditivo que é aceitável para uso farmacêutico, alimentar ou de alimentação. Na presente revelação, como uma preparação probiótica que tem atividade antiviral contra vírus de síndrome da mancha branca, que compreende o Bacillus subtilis (KCCM11143P), pode haver um aglutinante, um emulsificador, um conservante, e semelhantes, os quais são adicionados a fim de impedir a deterioração da qualidade da preparação probiótica; e pode haver um aminoácido, uma vitamina, uma enzima, um agente aromatizante, um composto de nitrogênio não proteico, um silicato, um agente tamponante, um extratante, um oligossacarídeo e semelhantes, os quais são adicionados a uma alimentação para aumentar a eficácia da preparação probiótica. Além disso, uma mistura de alimentação, etc. pode ser adicionalmente compreendida, mas a presente revelação não é limitada a isso.
[050] Em uma modalidade da presente revelação, como resultado para confirmar a possibilidade de alimentar o camarão com a composição de alimentação aumentar a resistência ao vírus de síndrome da mancha branca (WSSV) e exibir o efeito preventivo de doença, foi confirmado que o grupo (Grupo BS 1), em que a composição de alimentação (Exemplo 1) incluindo a cepa de Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação é administrada, pode aumentar a resistência à doença de camarão contra infecção de vírus de síndrome da mancha branca (WSSV), em comparação com o grupo (Grupo de Controle 1), em que o Exemplo Comparativo 1 (não incluindo probióticos) é administrado.
[051] Em outra modalidade da presente revelação, como resultado de confirmar a possibilidade da resistência à infecção complexa do vírus de síndrome da mancha branca (WSSV) e doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND) ser aumentada, e a possibilidade do efeito de intensificação de taxa de sobrevivência ser exibido à medida que o camarão é alimentado com a composição de alimentação, foi confirmado que o grupo (Grupo BS 1), em que a composição de alimentação (Exemplo 1) incluindo a cepa de Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação é administrada, pode intensificar a resistência à doença de camarão contra a infecção complexa do WSSV e AHPND, em comparação com o grupo (Grupo de Controle 1), em que o Exemplo Comparativo 1 (não incluindo probióticos) é administrado.
[052] A presente revelação fornece um aditivo alimentar para cultivo de camarão que compreende a composição de alimentação mencionada acima.
[053] No aditivo alimentar da presente revelação, um carreador conhecido ou um estabilizador que é aceitável para uso farmacêutico, alimentar ou de alimentação pode ser adicionado além dos ingredientes ativos acima. Quando necessário, todos os tipos de nutrientes, como vitaminas, aminoácidos e minerais, antioxidantes, e outros aditivos podem ser adicionados, cujo formato pode ser conveniente, como pó, grânulos, péletes e suspensão. Durante o abastecimento do aditivo alimentar de acordo com a presente revelação, o aditivo alimentar pode ser abastecido sozinho ou misturado com a alimentação para animais não ruminantes.
[054] Adicionalmente, a presente revelação fornece uma alimentação para cultivo de camarão, que compreende o aditivo alimentar mencionado acima.
[055] A cepa de Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação, que é uma bactéria Gram-positiva que tem uma capacidade de esporulação, é preferencialmente formada em uma forma de esporo, mas não é limitada a isso. A alimentação da presente revelação não é particularmente limitada, mas qualquer alimentação, como alimentação em pó, alimentação sólida, alimentação de pélete úmido, alimentação de pélete seco, alimentação de pélete de extrusora (EP) e alimentação bruta está disponível.
[056] Conforme descrito acima, Bacillus sp. forma esporos endógenos e, desse modo, é muito estável contra o calor. Portanto, o Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação pode ser preparado separadamente como uma forma de aditivo alimentar e, então, misturado com uma alimentação, ou pode ser preparado adicionando-se diretamente a uma alimentação durante o preparo da alimentação. O Bacillus subtilis incluído na alimentação da presente revelação pode estar em um estado líquido ou seco e preferencialmente na forma de um pó secado. O processo de secagem pode ser realizado por secagem com ar, secagem natural, secagem por aspersão e secagem por congelamento, mas não é limitado a isso. O Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação pode ser misturado como uma forma de pó em uma quantidade de 0,05% a 10% em peso, preferencialmente 0,1% a 1% em peso, com base no peso da alimentação. Além disso, a alimentação é usada para aquicultura, e pode incluir adicionalmente, além do Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação, aditivos convencionais com capacidade para aumentar a preservabilidade da alimentação.
[057] A fim de alcançar os objetivos acima, ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para prevenir ou tratar a síndrome da mancha branca que compreende administrar a composição de alimentação da presente revelação a um indivíduo.
[058] No presente documento, os termos da presente revelação, a síndrome da mancha branca, prevenção, tratamento, e indivíduo são conforme descrito acima.
[059] As causas de mortalidade em massa no cultivo de camarão incluem não apenas o Vibrio parahaemolyticus, como também a infecção por vários vírus. Especificamente, o vírus pode se referir ao vírus de síndrome da mancha branca (WSSV).
[060] Conforme descrito acima, o Bacillus subtilis (KCCM11143P) da presente revelação pode obter um efeito de intensificar a resistência ao vírus de síndrome da mancha branca (WSSV) e, desse modo, o camarão pode ser cultivado de modo mais seguro.
[061] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes através de modalidades exemplificativas. Entretanto, essas modalidades exemplificativas têm apenas propósitos ilustrativos e não são destinadas a limitar o escopo da presente revelação.
[062] Para selecionar cepas que têm atividade antibacteriana contra Vibrio parahaemolyticus, que induz AHPND de camarão, um ensaio de zona transparente foi realizado. 0,5% de ágar (3 ml) e 100 μl de uma cultura em agitação (2,0 x 109 CFU/ml) de bactérias patogênicas foram misturados e semeados em um meio TSA+ para preparar ágar de topo. As culturas de 12 tipos de cepas de Bacillus subtilis (aquelas possuídas por CJ CheilJedang e cepas comerciais), cada uma em uma quantidade de 10 μl, foram colocadas no topo do ágar de topo preparado, cultivadas a 30 °C por 18 horas, e a presença/ausência de zones transparentes foi observada. A atividade antibacteriana de Bacillus subtilis comercialmente disponível e fago complexo foi avaliada junta.TABELA 1
[063] Conforme mostrado na Tabela 1 acima, o micro-organismo de Bacillus subtilis 1 (CJBS-01) mostrou o efeito antibacteriano mais excelente in vitro contra Vibrio parahaemolyticus, que causa AHPND. Entretanto, embora o micro-organismo tenha mostrado atividade antibacteriana in vitro contra um patógeno particular, a atividade antibacteriana observada é simplesmente um efeito in vitro e não necessariamente significa que a ingestão de Vibrio parahaemolyticus por um animal poderá dotar o animal de imunidade ou um efeito preventivo contra o patógeno particular.
[064] Consequentemente, nos experimentos a seguir, foi examinada a possibilidade de o micro-organismo Bacillus subtilis 1 (CJBS-01), quando alimentado ao camarão, poder levar à exibição de uma melhora na imunidade e um efeito preventivo de doença no camarão contra a doença de AHPND. Adicionalmente, também foi examinada a possibilidade do Bacillus subtilis 1 (CJBS-01) ter um efeito em ganho de peso e taxa de digestão.
[065] O Bacillus subtilis 1 (CJBS-01) é uma cepa depositada em Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 14 de dezembro de 2010, e foi atribuído ao N° de Acesso KCCM11143P.
[066] Uma composição de alimentação que contém o Bacillus subtilis 1 (N° de Acesso KCCM11143P, doravante “BS”) selecionada no Exemplo de Preparação 1 foi preparada.
[067] Especificamente, as composições do Exemplo Comparativo 1 que não contêm Bacillus subtilis, o Exemplo Comparativo 2 que contém espécie Bacillus comercialmente disponível (isto é, uma preparação misturada de três espécies Bacillus (B. subtilis, B. pumilus, e B. licheniformis)), o Exemplo 1 que contém o Bacillus subtilis 1 selecionado (BS) em uma quantidade de 1010 x 0,2 CFU/g, e o Exemplo 2 que contém o BS em uma quantidade de 109 x 0,2 CFU/g foram misturados, cada um, com óleo de peixe e água, e preparados na forma de um pélete. As composições de alimentação dos Exemplos Comparativos 1 e 2 e Exemplos 1 e 2 foram secadas a 25 °C por cerca de 24 horas com o uso de um secador e armazenadas a -20 °C até experimentos subsequentes.TABELA 2
[068] Trinta camarão-de-patas-brancas foram preparados por tanque de água em um total de 40 tanques de água. Todos os tanques de água experimentais foram equipados com borbulhadores de aquário para manter o oxigênio dissolvido, e a temperatura dos tanques de água foi mantida em uma faixa de 28 °C a 32 °C durante o período inteiro do experimento. A alimentação foi fornecida 4 vezes ao dia com um abastecimento limitado (4% a 12% de peso de peixe).
[069] O peso do camarão foi medido a cada 2 semanas. Os itens de avaliação e as equações para cálculo relacionadas à taxa de crescimento e eficácia de alimentação são conforme o seguinte: • Ganho de Peso (%) = 100 x (peso corporal médio final - peso corporal médio inicial)/peso corporal médio • Taxa de Conversão de Alimentação (%) = quantidade de ganho de peso/quantidade de ingestão de alimentação • Taxa de Crescimento Específico Diário (% dia-1) = 100 x (loge peso corporal final - loge peso corporal inicial)/dias Para a distribuição de alimentação experimental, um projeto completamente aleatorizado foi realizado e os resultados de crescimento e a análise foram estatisticamente analisados por ANOVA de uma via com o uso do programa SPSS Versão 18.0. As diferenças significantes em valores de dados foram comparadas entre o teste de faixa múltipla de Duncan (P < 0,05). Os dados foram expressados como média±SD e os dados de porcentagem foram calculados como valores transformados de arco seno e analisados estatisticamente.TABELA 3
1IBW: Peso corporal inicial 2FBW: Peso corporal final 3WG: Ganho de peso (%) = [(peso corporal final - peso corporal inicial)/peso corporal inicial] x 100 4SGR: Taxa de crescimento específico diário (% dia-1) = [(loge peso corporal final - loge peso corporal inicial)/dias] x 100 5FCR: Taxa de conversão de alimentação = alimentação seca consumida/ganho de peso úmido
[070] Conforme mostrado na Tabela 3, como resultado de testes de alimentação, foi confirmado que o Grupo BS 1, que foi dotado da composição de alimentação do Exemplo 1 que contém o Bacillus subtilis 1 (BS) selecionado no Exemplo de Preparação 1, exibiu uma taxa de crescimento significativamente mais alta, em comparação com o Grupo de Controle 1 e o Grupo de Controle 2, os quais foram dotados de cada um dentre a composição de alimentação do Exemplo Comparativo 1 e do Exemplo Comparativo 2. Adicionalmente, foi confirmado que o grupo dotado da composição de alimentação de Exemplo 1 teve uma taxa de crescimento específico diário mais alta do que os grupos dotados de cada uma dentre a composição de alimentação do Exemplo Comparativo 1 e do Exemplo Comparativo 2.
[071] O teste de ataque de Vibrio parahaemolyticus em camarão foi realizado por um total de dois testes divididos. No caso da cepa de Vibrio, as cepas que causam AHPND (EMS) isoladas no Vietnã em 2013 foram usadas para os testes. O teste de ataque foi executado conforme a seguir: o camarão foi alimentado com as composições de alimentação do Exemplo por duas semanas, e então, os camarões com o mesmo peso (peso médio: 2,32 g) foram distribuídos por 4 replicatas com 96 camarões por grupo. As bactérias foram cultivadas a 30 °C com 150 rpm por 24 horas com o uso do meio TSB+, e uma suspensão de Vibrio parahaemolyticus foi imersa a uma concentração de 3,1 x 105 CFU/ml por tanque. Após a imersão, a sobrevivência e a situação de nado do camarão foram confirmados a cada hora, e após 8 horas, 95% da água foram trocados. A alimentação de teste foi dada três vezes ao dia (as 8:30, 13:30 e 18:30) em uma dose dividida de maneira restrita (10 a 12% de peso corporal de peixe), e o grau de mortalidade foi observado por 70 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo.TABELA 4
[072] Conforme mostrado na Tabela 4 acima, o Grupo BS 1, que foi dotado da composição de alimentação que contém o Bacillus subtilis 1 (BS) selecionado no Exemplo de Preparação 1, exibiu uma taxa de sobrevivência mais alta no teste de ataque de Vibrio parahaemolyticus contra camarão, em comparação com o Grupo de Controle 1 e o Grupo de Controle 2.
[073] Adicionalmente, conforme mostrado na Figura 1, foi comumente observado nos dois testes acima que, após a imersão de Vibrio parahaemolyticus, o movimento de camarão se tornou atrasado e o mesmo repousou no fundo do tanque de água sem atividade de nado, e sua ingestão de alimentação também não foi ativa. Em 8 horas após a imersão, a mortalidade rápida de camarão começou a ocorrer, e a taxa de sobrevivência do Grupo BS 1 demonstrou ser mais alta em comparação com aquelas do Grupo de Controle 1 ou Grupo de Controle 2 por pelo menos 17%.
[074] O teste de ataque de Vibrio parahaemolyticus em camarões foi executado uma vez. No caso da cepa de Vibrio, as cepas induzidas por AHPND (EMS) isoladas no Vietnã em 2013 foram usadas para o teste. O teste de ataque foi executado conforme a seguir: Os camarões foram alimentados com as composições de alimentação do Exemplo por 4 semanas e, então, os camarões com o mesmo peso (peso médio: 2,30 g) foram distribuídos por 4 replicatas com 96 camarões por grupo. As bactérias foram cultivadas a 30 °C com 150 rpm por 24 horas com o uso do meio TSB+ e uma suspensão de Vibrio parahaemolyticus foi imersa a uma concentração de 6,3 x 105 CFU/ml por tanque. Após a imersão, a sobrevivência de camarões e sua situação de nado foram confirmados a cada hora, e após 8 horas, 95% da água foram trocados. A alimentação de teste foi dada três vezes ao dia (as 8:30, 13:30 e 18:30) em uma dose dividida de maneira restrita (10 a 12% de peso corporal de peixe), e o grau de mortalidade foi observado por 70 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo.TABELA 5
[075] Conforme mostrado na Tabela 5, no teste de ataque de Vibrio parahaemolyticus para os camarões, os Grupos BS 1 e 2 dotados das composições de alimentação do Exemplo 1 e 2 incluindo Bacillus subtilis selecionados a partir do Exemplo de Preparação 1 mostraram a taxa de sobrevivência mais alta do que aquelas do Grupo de Controle 1 ao qual a composição de alimentação do Exemplo Comparativo 1 é fornecida.
[076] Em cada ponto no tempo da iniciação (antes da infecção), o tempo intermediário (infecção), e a conclusão do teste de ataque de Vibrio parahaemolyticus contra camarão, dois camarões por grupo foram aleatoriamente selecionados e seus hepatopâncreas foram extraídos. Parte do hepatopâncreas extraído foi armazenado em álcool etílico (100%) para análise de PCR em tempo real quantitativa (qPCR), e outra parte foi fixada em fixativo de Davidson por 24 horas e, então, armazenada em álcool etílico (70%) para análise histopatológica.
[077] Mais especificamente, a análise histopatológica foi realizada pelo método a seguir.
[078] Para minimizar os danos do tecido de hepatopâncreas extraído, imediatamente após a amostragem em cada tanque de água, o fixativo de Davidson foi injetado no hepatopâncreas de camarão com o uso de uma seringa de 1 ml e o hepatopâncreas foi extraído. Então, cada hepatopâncreas extraído foi fixado em um tubo de Eppendorf de 1,5 ml que contém o fixativo de Davidson por 24 horas, armazenado em álcool etílico (70%), e usado para análise. Mediante conclusão de fixação, os órgãos foram cortados a uma espessura de cerca de 2 mm a cerca de 3 mm em tamanho para serem adequados para a preparação de espécimes de tecido, e inseridos num cassete, e então, os tecidos foram tratados por 13 horas. Esses tecidos foram finamente cortados a uma espessura de cerca de 4 μm, e os espécimes resultantes foram coletados com o uso de uma escova, fixados em cada placa sem quaisquer rugas, colocados no ar por cerca de 5 minutos e, então, submetidos à mancha de H&E. Após concluir a coloração, as placas foram fotografadas sob ampliação em 200 com um programa profissional para uso em microscópios (TCapture, Tucen Photonics) com o uso de um microscópio de fase de contraste (BX50, Olympus). Então, a análise de qPCR foi realizada em relação à quantidade de toxina de AHPND presente no hepatopâncreas amostrado.
[079] Os resultados são mostrados na Figura 2, em que o valor Ct mais baixo indica uma quantidade mais alta de toxina.
[080] No hepatopâncreas amostrado no ponto no tempo antes do teste de ataque (isto é, 0 h), nenhuma toxina de AHPND foi detectada em todos os grupos, enquanto no hepatopâncreas amostra no ponto no tempo de 10 horas do teste de ataque (isto é, 10 h; quando o número de indivíduos mortos foi o mais alto), a toxina de AHPND foi detectada em todas as amostras. Entretanto, o Grupo BS 1, que foi dotado da composição de alimentação que contém o Bacillus subtilis de acordo com a presente revelação, mostrou um valor de Ct significativamente mais alto em comparação com o Grupo de Controle 1 e o Grupo de Controle 2, e no hepatopâncreas amostrado no ponto no tempo de 24 horas do teste de ataque, o nível mais baixo de toxina de AHPND foi detectado no Grupo BS 1. Adicionalmente, no ponto no tempo de terminação do teste de ataque (isto é, 193 h), a toxina de AHPND não foi detectada no Grupo BS 2 e no Grupo de Controle 2.
[081] Adicionalmente, os resultados de análise histopatológica do hepatopâncreas são mostrados na Figura 3.
[082] No hepatopâncreas amostrado no ponto no tempo antes do teste de ataque (isto é, 0 h), os tecidos anormais foram observados em todos os grupos. No hepatopâncreas amostrado no ponto no tempo de 10 horas, o nível de dano foi mostrado como mais severo no Grupo de Controle 1, e o progresso de necrose de tecido foi observado no Grupo BS 1 e no Grupo de Controle 2. No hepatopâncreas amostrado no ponto no tempo de 24 horas, a inflamação foi observada em vez de a necrose de tecido devido à toxina de AHPND. No hepatopâncreas amostrado no ponto no tempo de terminação do teste de ataque (isto é, 193 h), a amostragem não foi possível devido à ocorrência de 100% de morte no ponto no tempo de 37 h no Grupo de Controle 1, enquanto algumas células inflamatórias foram observadas nos Grupos BS e Grupo de Controle 2.
[083] A partir dos resultados acima, foi confirmado que a composição de alimentação que contém o Bacillus subtilis de acordo com a presente revelação pode não apenas melhorar a resistência à doença de camarão a infecção de Vibrio parahaemolyticus, como também reduz significativamente a quantidade de toxina de AHPND no hepatopâncreas de camarão.
[084] Considerando os resultados no Exemplo de Preparação 2, as composições de alimentação (Exemplos 1 a 3) que contêm várias concentrações do Bacillus subtilis (KCCM11143P, doravante “BS”) selecionados no Exemplo de Preparação 1 foram preparadas. Os resultados são mostrados na Tabela 6 abaixo.TABELA 6
[085] A composição de cada grupo na Tabela 6 foi preparada adicionando-se óleo de peixe e água e mistura dos mesmos, e preparada na forma de pélete. A composição de cada grupo na Tabela 6 foi secada a 25 °C por cerca de 24 horas com o uso de um secador e armazenada a -20 °C até experimentos subsequentes.
[086] 30 camarões-de-patas-brancas foram preparados por tanque de água em um total de 28 tanques de água. Todos os tanques de água experimentais foram equipados com borbulhadores de aquário para manter o oxigênio dissolvido, e a temperatura dos tanques de água foi mantida em uma faixa de 28 °C a 32 °C durante o período inteiro do experimento. A alimentação foi fornecida 4 vezes por dia por 8 semanas com um abastecimento limitado (6% a 12% de peso de peixe, peso corporal inicial: 0,14 g).
[087] O peso do camarão foi medido a cada 2 semanas. Os itens de avaliação e as equações para cálculo relacionadas à taxa de crescimento e eficácia de alimentação são conforme o seguinte: • Ganho de Peso (%) = 100 x (peso corporal médio final - peso corporal médio inicial)/peso corporal médio • Taxa de Conversão de Alimentação (%) = quantidade de ganho de peso/quantidade de ingestão de alimentação • Taxa de Crescimento Específico Diário (% dia-1) = 100 x (loge peso corporal final - loge peso corporal inicial)/dias Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo.TABELA 7
1IBW: Peso corporal inicial 2FBW: Peso corporal final 3WG: Ganho de peso (%) = [(peso corporal final - peso corporal inicial)/peso corporal inicial] x 100 4SGR: Taxa de crescimento específico diário (% dia-1) = [(loge peso corporal final - loge peso corporal inicial)/dias] x 100 5FCR: Taxa de conversão de alimentação = alimentação seca consumida/ganho de peso úmido.
[088] Conforme mostrado na Tabela 7 e na Figura 4, todos os grupos de camarão alimentados por 8 semanas mostraram um aumento de taxa de crescimento sobre 7.000% em comparação com aqueles antes da alimentação. Em particular, o peso corporal médio final do Grupo BS 1 e o peso corporal médio final do Grupo BS 3 foram maiores do que o do Grupo de Controle 1, por 15,7% e 16,7%, respectivamente. Adicionalmente, em relação à taxa de crescimento específico, o Grupo BS 1 e o Grupo BS 3 mostraram valores aumentados em comparação com aquele do Grupo de Controle 1, por 3,4% e 4,1%, respectivamente. As eficácias de alimentação do Grupo BS 1 e do Grupo BS 3 foram aumentadas em comparação com aquela do Grupo de Controle 1, por 27,5% e 26,1%, respectivamente. Entretanto, não houve diferença significante na taxa de sobrevivência de camarão em todos os grupos.
[089] O camarão de teste foi pesado a cada 2 semanas e todos os camarões de teste foram submetidos a jejum para reduzir o estresse do camarão 18 horas antes da medição.
[090] Após a medição de peso final, 7 camarões foram aleatoriamente selecionados de cada tanque de água e anestesiados em água fria, e hemolinfa foi coletada com o uso de uma seringa tratada com solução de Alsever. A hemolinfa coletada foi usada para a análise de atividade de nitroazul de tetrazólio (NBT), e as amostras nas quais os soros foram separados com o uso de uma centrífuga (800 g, 10 min, 4 °C) foram usadas para a análise de imunidade não específica.
[091] Em relação à coleta de fezes de camarão para análise de taxa de digestão, a alimentação e as impurezas restantes nos tanques de água foram limpas por sifonamento e troca de água após 30 minutos de alimentação, e 3 horas após isso, as fezes excretadas foram coletadas com o uso de um sifão. As amostras coletadas foram lavadas com água destilada, filtradas com um papel de filtro, e armazenadas em um congelador de baixa temperatura de -40 °C até o uso como uma amostra para análise.
[092] Para a distribuição de alimentação experimental, o projeto completamente aleatorizado foi realizado e os resultados de crescimento e a análise foram estatisticamente analisados por ANOVA de uma via com o uso do programa SPSS Versão 18.0. As diferenças significantes em valores de dados foram comparadas entre o teste de faixa múltipla de Duncan (P < 0,05). Os dados foram expressados como média±SD e os dados de porcentagem foram calculados como valores transformados de arco seno e analisados estatisticamente.
[093] A alimentação de teste e os ingredientes comuns das fezes foram analisados de acordo com o método de AOAC (2005); os teores de umidificação por um método de secagem por aquecimento de pressão atmosférica (125 °C, 3 h) (sistema Kejltec 2300, Suíça); cinzas brutas por método de incineração direta (550 °C, 4 h); proteínas brutas por um analisador de proteína bruto automatizado (sistema Kejltec 2300, Suíça); e lipídios brutos pelo método de Folch et al. (1957). Os resultados são mostrados na Tabela 8 abaixo.TABELA 8
[094] Conforme mostrado na Tabela 8, em relação aos teores de cinzas brutas e lipídios brutos, não houve diferenças significantes entre os grupos. Entretanto, o teor da proteína bruta no Grupo BS 2 foi significativamente mais alta em comparação com aqueles do Grupo de Controle 1 e do Grupo de Controle 3. Isto é, foi confirmado que, quando as composições de alimentação de acordo com a presente revelação são fornecidas ao camarão, o teor de proteína de camarão pode ser aumentado.
[095] A quantidade de produção radical oxidativa por neutrófilos durante explosão respiratória foi determinada com o uso do método de análise de Zhang et al. (2013).
[096] Especificamente, primeiro, hemolinfa (50 μl) foi misturada com 200 μl da solução salina equilibrada de Hank (HBSS) e permitiu-se que reagisse a 25 °C. Após 30 minutos, 100 μl de zymosan (0,1% de solução de Hank) foram adicionados a isso e reagidos a 37 °C por 2 horas. A solução de NBT (0,3%) foi adicionada à mesma em uma quantidade de 100 μl a cada vez e reagiu a 37 °C por 2 horas. 100% de metanol (600 μl) foram adicionados a isso e a mistura foi centrifugada a uma taxa de 6.500 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pélete foi lavado 3 vezes com 70% de metanol (100 μl) e secado por 5 minutos. Então, KOH 2 M (700 μl) e DMSO (800 μl) foram adicionados ao mesmo, e a absorbância do resultante foi medida a 620 nm.
[097] A atividade de GPx em soro foi analisada com o uso do kit de GPx (Biovision, Inc. Califórnia).
[098] Especificamente, como o cumeno peridróxido, uma mistura de reação na qual o substrato de peróxido (ROOH), glutationa redutase (GSSG-R), e b-nicotinamida adenina reduzida denucleotídeo fosfato (NADPH) foram misturados foi usada. Primeiro, uma amostra de hemolinfa (50 μl) foi adicionada a um microplaqueador, e uma mistura de reação (40 μl) foi adicionada à mesma e reagida. Então, peridróxido de cumeno (10 μl) foi adicionado à mesma, e após 5 minutos, a absorbância do resultante foi medida a 340 nm. A atividade de GPx foi calculada como nmol/min/ml.
[099] A análise de atividade de lisozima foi analisada com base no método de Swain et al. (2007).
[0100] Especificamente, a lisozima, que é uma enzima antibacteriana envolvida em respostas imunes não específicas (inatas), é uma enzima que exibe atividade antibacteriana contra vários tipos de bactérias de maneira não específica, em vez de uma maneira específica para uma bactéria específica.
[0101] O mecanismo antibacteriano contra bactérias patogênicas é a ação antibacteriana que hidrolisa ligações β-1,4-glicosidicas de peptidoglicano, que é um constituinte de paredes de célula bacteriana, assim destruindo paredes de célula bacteriana. A lisozima é especificamente eficaz contra bactérias Gram-positivas. Com base em tal mecanismo, a atividade de lisozima é amplamente usada para análise para medir as respostas imunes não especificas em camarão incluindo peixes. Quando os imunoestimulantes (por exemplo, ácido ascórbico, β-glucano, probióticos, etc.) são adicionados à alimentação de camarão, é possível confirmar a atividade de lisozima aumentada na hemolinfa e tecidos de camarão, e esses resultados são interpretados como resultado de um aumento em uma resposta imune não específica ou melhora na imunidade de peixes (camarão).
[0102] A atividade de fenoloxidase (PO) foi analisada com base no método de Hernandez-Lopez et al. (1996).
[0103] Especificamente, fenoloxidase, que é uma enzima que tem uma função importante no mecanismo de defesa de Crustacea, está presente na forma de profenoloxidase em células sanguíneas e ativada pelo sistema de ativação de profenoloxidase. A fenoloxidase ativada produz opsonina, a qual promove a fagocitose das células sanguíneas e a ação de revestimento no antígeno estranho e participa na reação de coagulação de sangue. Consequentemente, a atividade de fenoloxidase na hemolinfa é usada como índice importante da imunidade inata de camarão.
[0104] A atividade de SOD foi analisada com o uso do kit de ensaio de SOD (Sigma-Aldrich, 19160, St. Louis, EUA).
[0105] Especificamente, um detector radical (20 μl) foi adicionado em uma placa de 96 poços, e cada amostra de sangue (20 μl) foi adicionada a cada poço. Então, xantina oxidase (20 μl) foi adicionada à mesma e reagiu por 20 minutos. A absorbância do resultante foi medida a 450 nm com o uso do Leitor de Microplaca (Thermo).
[0106] A atividade de antiprotease na hemolinfa foi analisada com o uso do método de análise de Ellis (1990).
[0107] Especificamente, a hemolinfa (20 μl) e a solução de tripsina padrão (20 μl; Tipo II-S, de pâncreas porcino, Sigma-Aldrich, A2765, St. Louis, EUA) foi misturada e cultivada a 22 °C por 10 minutos. O tampão de fosfato (200 μl; 0,1 M, pH 7,0) e azocaseína (2%) (250 μl; Sigma-Aldrich) foram adicionados à mesma, cultivados a 22 °C por 1 hora, e ácido tricloroacético (500 μl; 10%) (TCA) foi novamente adicionado à mesma, e cultivado a 22 °C por 30 minutos. A solução cultivada foi centrifugada (6.000 g, 5 min), e o resultante (100 μl) foi semeado em uma placa de 96 poços, e NaOH 1 N (100 μl) foi adicionado à mesma, e a absorbância do resultante foi medida a 430 nm com o uso do Leitor de Microplaca.
[0108] Os resultados do Exemplo Experimental 2-5-1 a 2-5-6 no qual a análise imunológica não específica foi realizada são mostrados na Tabela 9 abaixo.TABELA 9 1Nitoazul de tetrazólio; atividade fagocítica (absorbância) 2Atividade de fenoloxidase (absorbância) 3Antiprotease (% de inibição) 4Atividade de lisozima (μg ml-1) 5Superóxido dismutase (% de inibição) 6Glutationa peroxidase (mU ml-1)
[0109] Conforme mostrado na Tabela 9 e na Figura 5, em relação à atividade de NBT e atividade de PO, todo o Grupo BS 1 e o Grupo BS 3 mostraram valores significativamente mais altos, em comparação com o Grupo de Controle 1 e o Grupo de Controle 2; e em particular, no caso da atividade de PO, o Grupo BS 1 mostrou um valor mais alto em comparação com o Grupo de Controle 1 por 26,8%. Em relação à atividade de antiprotease, todo o Grupo BS 1 e o Grupo BS 3 mostraram valores significativamente mais altos, em comparação com o Grupo de Controle 1 e o Grupo de Controle 2; e em particular, o Grupo BS 1 mostrou um valor mais alto em comparação com o Grupo de Controle 1 por 15,8%. Em relação à atividade de lisozima e atividade de SOD, todo o Grupo BS 1 e o Grupo BS 3 mostraram ser significativamente mais altos em comparação com o Grupo de Controle 1. Em relação à atividade de GPx, todo o Grupo BS 1 e o Grupo BS 3 mostraram valores significativamente mais altos, em comparação com o Grupo de Controle 1 e o Grupo de Controle 2; e em particular, o Grupo BS 1 e o Grupo BS 3 mostraram valores mais altos em comparação com o Grupo de Controle 1 por 27,7% e 28,8%, respectivamente.
[0110] Durante 8 semanas do experimento de alimentação, as amostras de água de cultura foram coletadas a partir de cada tanque de água uma vez a cada 5 dias. As amostras foram coletadas a partir da mesma localização em cada tanque, e o nível de oxigênio dissolvido (DO), salinidade, pH, e a concentração de amônia (NH4+) foram medidos. O DO foi medido por um Medidor de Bancada Thermo Scientific Orion Star A216 (Thermo Scientific), a salinidade foi medida por um Refratômetro Mestre (ATAGO). O pH foi medido por um Seven Compact (METTLER TOLEDO), e a concentração de NH4+ foi analisada pelo método de acordo com Verdouw et al. (1978).
[0111] Doze camarões-de-patas-brancas (L. vannamei) que têm um peso médio de 2,87 (± 0,08) g foram aleatoriamente colocados em cada tanque de água de 96 L para um total de 14 tanques de água com o uso de um método de mudança de água zero. Houve duas replicatas para cada grupo de teste, e os camarões receberam uma alimentação de teste de 10% do seu peso corporal quatro vezes por dia em uma dose dividida (a 08:30, 12:00, 15:30 e 19:00). De acordo com Verdouw et al. (1978), as amostras de água foram coletadas uma vez por dia, e a concentração de amônia total nas amostras de água foi medida por 10 dias. Os resultados são mostrados na Tabela 10.TABELA 10
[0112] Conforme mostrado na Tabela 10 e na Figura 6, de modo interessante, foi constatado que, a partir do dia 7, todos os grupos de teste começaram a mostrar uma concentração de amônia total mais baixa do que o grupo de controle, e que no dia 10, todos os grupos de teste mostraram uma concentração de amônia significativamente mais baixa do que o grupo de controle.
[0113] A fim de analisar o teor de óxido de crômio na alimentação de teste e os pós, o método de acordo com Divakaran et al. (2002) foi usado.
[0114] Especificamente, a alimentação de teste e as amostras em pó foram submetidas à calcinação por 4 horas em um forno de calcinação (550 °C), e as amostras obtidas foram usadas para a análise. Primeiro, a fim de oxidar óxido de crômio para uma forma monocromada, 5 mg a 10 mg das amostras em pó foram pesadas e transferidas para um tubo de teste de vidro. 4 ml de reagente perclórico (HClO4) foram adicionados ao tubo de teste de vidro que contém a amostra. O reagente perclórico (70%) foi preparado misturando-se 200 ml de ácido nítrico em 100 ml de água destilada, resfriando-se a mistura e, então, misturando-se 200 ml de 70% de ácido perclórico à mesma. O tubo de teste de vidro que contém a amostra e o reagente perclórico foram colocados em uma placa de aquecimento, aquecidos a 300 °C por 15 minutos, e então, resfriados à temperatura ambiente. A amostra pré-tratada foi transferida a um frasco de vidro de 50 ml e quantificada a 25 ml com água triplamente destilada. Após isso, a absorbância foi medida a 350 nm com o uso de um espectrofotômetro (Beckman DU-730). A absorbância medida foi usada para calcular o teor de óxido de crômio da amostra com o uso de uma equação padrão preparada a partir de uma solução padrão pré-tratada como na análise de amostra.
[0115] A matéria seca e a digestibilidade de proteína da alimentação de teste foram calculadas pelo método a seguir: ADC de matéria seca (%) = 100 - 100 x (% de Cr2O3 em dieta / % de Cr2O3 em fezes); ADC de proteína (%) = 100 - 100 x (% de Cr2O3 em dieta / % de Cr2O3 em fezes) x (% proteína em fezes / % de proteína em dieta)
[0116] Os resultados da análise de digestibilidade executada no fim do experimento de alimentação são mostrados na Tabela 11.TABELA 11
Os valores são a média de grupos triplicados e apresentados como média ± S.D. Os valores com subscritos diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes (P < 0,05).1 Coeficiente de digestibilidade evidente de matéria seca 2 Coeficiente de digestibilidade evidente de proteína.
[0117] Conforme mostrado na Tabela 11, todos os grupos de teste mostraram digestibilidade de matéria seca e digestibilidade de proteína significativamente mais altas do que os grupos de controle.
[0118] A fim de confirmar a atividade antiviral das composições de alimentação incluindo Bacillus subtilis, o teste de ataque foi executado de modo que os camarões fossem atacados por vírus de síndrome da mancha branca. No caso do vírus de síndrome da mancha branca, os vírus isolados de camarões-de-patas-brancas (Litopenaues vannamei) infectados com WSSV foram obtidos a partir de fazendas domésticas em 2017 e usados para o teste. O teste de ataque foi executado conforme o seguinte: as composições de alimentação do Exemplo foram dadas ao camarão por 6 semanas e, então, os camarões que têm o mesmo peso (peso médio: 6,25 g) foram colocados em 4 replicatas com 96 camarões por grupo. A concentração de inoculação do vírus foi 4,1 x 105 copias/μl, e cada camarão foi inoculado de modo intramuscular com 100 μl de vírus com o uso de uma seringa. A concentração de inoculação final por camarão foi 4,1 x 107 copias/μl.
[0119] Após a inoculação, a mortalidade de camarão e seus estados de nado foram confirmados. A alimentação de teste foi dada três vezes ao dia (as 8:30, 13:30 e 18:30) em uma dose dividida de maneira restrita (10% a 12% de peso corporal de peixe), e o grau de mortalidade foi observado por 125 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 12 abaixo.TABELA 12
[0120] Conforme mostrado na Tabela 12, no teste de ataque de vírus de síndrome da mancha branca para os camarões, o Grupo BS 1 dotado da composição de alimentação de Exemplo 2 incluindo Bacillus subtilis mostrou a taxa de sobrevivência mais alta do que aquelas do grupo de controle 1 ao qual a composição de alimentação do Exemplo Comparativo 1 foi administrada.
[0121] A fim de confirmar a atividade antiviral das composições de alimentação incluindo Bacillus subtilis, o teste de ataque foi executado de modo que o camarão fosse atacado por Vibrio parahaemolyticus e vírus de síndrome da mancha branca. No caso da cepa de Vibrio, as cepas induzidas por AHPND (EMS) isoladas no Vietnã em 2013 foram usadas para o teste. No caso do vírus de síndrome da mancha branca, os vírus isolados de camarões-de-patas-brancas (Litopenaues vannamei) infectados com WSSV foram obtidos a partir de fazendas domésticas em 2017 e usados para o teste. O teste de ataque foi executado conforme o seguinte: as composições de alimentação do Exemplo foram dadas a camarões por 6 semanas e, então, os camarões que têm o mesmo peso (peso médio: 4,52 g) foram colocados em 4 replicatas com 96 camarões por grupo. A concentração de inoculação do vírus foi 8,3 x 103 cδpias/μl, e cada camarão foi inoculado de modo intramuscular com 50 μl de vírus com o uso de uma seringa. A concentração de inoculação final por camarão foi 4,1 x 104 copias/μl. Dois dias após a inoculação de vírus, o camarão foi infectado com a cepa de Vibrio.
[0122] As bactérias foram cultivadas a 30 °C com 150 rpm por 24 horas com o uso do meio TSB+ e uma suspensão de Vibrio parahaemolyticus foi imersa a uma concentração de 1,3 x 105 CFU/ml por tanque. Após a imersão, a mortalidade de camarões e seus estados de nado foram confirmados a cada hora. A alimentação de teste foi dada três vezes ao dia (as 8:30, 13:30 e 18:30) em uma dose dividida de maneira restrita (10% a 12% de peso corporal de peixe), e o grau de mortalidade foi observado por 7 dias. Os resultados são mostrados na Tabela 13 abaixo.TABELA 13
[0123] Conforme mostrado na Tabela 13, no teste de ataque de Vibrio parahaemolyticus e vírus de síndrome da mancha branca para os camarões, o Grupo BS 1 dotado da composição de alimentação do Exemplo 1 incluindo Bacillus subtilis mostrou a taxa de sobrevivência mais alta do que aquelas do Grupo de Controle 1 ao qual a composição de alimentação do Exemplo Comparativo 1 foi administrada.
[0124] Com base no Exemplo acima, as composições de alimentação incluindo Bacillus subtilis de acordo com a presente revelação podem aumentar o crescimento de camarão- de-patas-brancas, eficácia de alimentação, digestibilidade, qualidade de água de cultura e imunidade não específica. Além disso, espera-se que a presente revelação possibilite a produção de camarão-de-patas-brancas de alto teor de proteína e, desse modo, possa aumentar a negociabilidade do camarão.
[0125] Instituição de Depósito: Korean Culture Center of Microorganisms (Autoridade de Depósito Internacional) N° de Acesso: KCCM11143P Data de Depósito: 14/12/2010 N° de Acesso: KCCM11144P Data de Depósito: 14/12/2010 N° de Acesso: KCCM11270P Data de Depósito: 22/03/2012
Claims (10)
1. Uso de uma composição de alimentação compreendendo uma cepa de Bacillus subtilis depositada com o número de acesso KCCM11143P, um meio de cultura da mesma, um concentrado da mesma ou uma matéria seca da mesma como um ingrediente ativo caracterizado pelo fato de que é na preparação de um aditivo alimentar ou de uma composição de alimentação para prevenir ou tratar doença de necrose hepatopancreática aguda em um indivíduo em necessidade do mesmo.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Bacillus subtilis tem uma contagem bacteriana de 1 x 104 a 1 x 1011 CFU por g do ingrediente ativo.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de alimentação compreende ainda Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis ou uma combinação dos mesmos como um ingrediente ativo.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença de necrose hepatopancreática aguda (AHPND) é causada por Vibrio parahaemolyticus.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que indivíduo é um camarão.
6. Uso de uma composição de alimentação compreendendo uma cepa de Bacillus subtilis depositada com o número de acesso KCCM11143P, um meio de cultura da mesma, um concentrado da mesma ou uma matéria seca da mesma como um ingrediente ativo caracterizado pelo fato de que é na preparação de um aditivo alimentar ou composição de alimentação para prevenir ou tratar síndrome da mancha branca (WSS) em um indivíduo em necessidade do mesmo.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a síndrome da mancha branca (WSS) é causada pelo vírus da síndrome da mancha branca (WSSV).
8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o Bacillus subtilis tem uma contagem bacteriana de 1 x 104 a 1 x 1011 CFU por g do ingrediente ativo.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a composição de alimentação compreende adicionalmente Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis ou uma combinação dos mesmos como um ingrediente ativo.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um camarão.
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