WO2019132605A1 - 바실러스 서브틸리스 균주를 유효성분으로 포함하는 급성 췌장염 괴사증 또는 흰반점 증후군의 예방 또는 치료용 사료 조성물 - Google Patents

바실러스 서브틸리스 균주를 유효성분으로 포함하는 급성 췌장염 괴사증 또는 흰반점 증후군의 예방 또는 치료용 사료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P균주, 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 급성 간췌장 괴사증(AHPND) 또는 흰반점 증후군(WSS)의 예방 또는 치료용 사료 조성물에 관한 것으로, 상기 사료 조성물은 새우 급성 간췌장 괴사증을 유발하는 장염비브리오균에 대해 항균 활성 및 흰반점 증후군을 유발하는 흰반점 증후군 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타낸다.

Description

바실러스 서브틸리스 균주를 유효성분으로 포함하는 급성 췌장염 괴사증 또는 흰반점 증후군의 예방 또는 치료용 사료 조성물
본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 급성 간췌장 괴사증(AHPND) 또는 흰반점 증후군(WSS)의 예방 또는 치료용 사료 조성물에 관한 것이다.
EMS(Early mortality syndrome, 조기치사증후군)/AHPND(Acute hepatopancreatic necrosis disease, 급성 간췌장 괴사증)/AHPNS(Acute hepatopancreatic necrosis syndrome, 급성간췌장궤사증후군) 는 새우 양식에 있어서 최근 급증하는 질병으로서, 비브리오 (Vibrio parahaemolyticus) 세균이 원인체이며, 곤충 독소를 생성하여 빠르게는 6시간 이내, 또는 일주일 내에 100% 치사를 일으킨다(Tran et.al.2013.Dis aquat Org 105:45-55). 곤충 독소는 세균 내 특정 플라스미드(Photorhabdus insect-related toxins, Pir toxin)에 존재하는 특이 유전자의 발현으로 생성되며, 따라서 여기저기 쉽게 옮겨다니는, 즉, 운동성을 가지므로, 이 질병은 기존에 관심가져졌던 흰반점 바이러스(WSSV), 타우라바이러스(TSV) 및 전염성 근괴사바이러스(IMNV) 등과 같은 바이러스성 새우 질병보다도 더 빠르게 전파된다. AHPND는 2009년 중국에서 시작하여 태국, 말레이시아, 베트남으로 1년 내 아시아 각국으로 빠르게 퍼졌고, 아시아 외 국가로는 멕시코에서 발생하여 다른 중앙아메리카 국가로 전파되어, 새우 시장 대부분이 피해를 보고 있다. 우리나라에도 2015~2016년에 처음 발생해 큰 피해를 입힌바 있으며, 이 질병에 대한 예방 및 관리를 위한 연구가 진행되고 있다.
최근 안전한 생산물에 대한 소비자의 요구와 지속적인 양식을 위한 생산 전략에 의해 기존의 병원균을 치료하기 위해 쓰이던 치료제 등은 양식 관련 규정으로 인해 제한되고 있다. 따라서, 새우 양식에 있어 종묘의 품질과 사육 방법 뿐만아니라, 질병을 제어하는 주요 인자들을 반드시 고려해야 한다.
한편, 프로바이오틱스는 항생물질을 의미하는 항생제(antibiotics)와는 대립되는 어원적 의미를 가지는 것으로, 장내의 미생물 균형에 도움을 주는 미생물 제제 또는 미생물 성분으로 정의되며, 대표적으로 락토바실러스균과 비피더스균 등의 유산균이 이에 해당된다. 또한, 프로바이오틱스는 사람과 동물에 대한 독성유전자를 보유하지 않고, 병원성 물질 또한 생산하지 않아 GRAS(generally recognized as safe)로 분류된다. 따라서, 안정성이 입증된 프로바이오틱스를 이용한 사료 첨가제의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
일 예로, 국내공개특허 제10-2011-035554호는 신규한 바실러스 속 CMB L1 및 락토바실러스 속 CMB201의 혼합균주 및 이를 이용한 항암 및 면역증강용 식품 조성물 및 항균활성이 있는 미생물 제제를 개시하고 있으며, 국내등록특허 제10-0977407호는 동물의 주요 탐식세포인 호중구의 각종 활성을 증가시키고 병원성 세균의 공격접종에 대한 비특이적인 방어능을 증진시키는 자이고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii)의 용균 추출물을 함유하는 동물용 면역증강제 및 사료 첨가제를 개시하고 있다. 그러나, 프로바이오틱스를 이용한 사료 첨가제의 실제 면역활성은 미비하여, 여전히 면역활성이 우수한 프로바이오틱스를 이용한 사료 첨가제에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명자들은 새우 AHPND 예방을 위한 프로바이오틱스 (Bacillus sp.) 첨가 새우 사료를 개발하고자 예의 노력한 결과, 바실러스 서브틸리스가 첨가된 사료 조성물을 새우에 급이한 경우, AHPND 감염 (베트남 피해지역에서 분리한 균주로서 2013년도 분리함. Tran et. at. 2013.) 또는 WSSV 감염 에 따른 새우 생존율을 개선시키고, 새우의 성장률 및 비특이적 면역력을 높일 뿐만 아니라, 수질이 개선되고 고단백의 새우 생산을 가능하게 함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 급성 간췌장 괴사증(AHPND)의 예방 또는 치료용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 사료 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 급성 간췌장 괴사증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 흰반점 증후군(WSS)의 예방 또는 치료용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 사료 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 흰반점 증후군의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P 균주는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물이 새우 양식에서 문제가 되는 AHPND를 유발시키는 장염비브리오균에 대한 항균 활성, WSS를 유발시키는 흰반점 증후군 바이러스에 대한 항바이러스 활성, 및 새우 간췌장의 면역 증진 효과를 가지므로, 새우 사료 조성물 또는 사료 첨가제로써 이용될 수 있다.
도 1은 장염비브리오균에 감염된 새우의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 새우 간췌장 중의 AHPND 함량 분석을 나타내는 그래프이다.
도 3은 새우 간췌장의 병리학적 특징을 나타내는 그림이다.
도 4는 새우의 성장률을 나타내는 그래프로서, (a) 내지 (d)는 각각, 최종 체중, 증체율, 일간성장률 및 사료변환율을 나타낸다.
도 5는 새우의 비특이적 면역력을 분석한 그래프로서, (a) 내지 (e)는 각각, 대식 세포, 페놀산화효소, 항단백분해효소, 라이소자임 및 수퍼옥시드 디스무타아제에 대한 활성을 나타낸다.
도 6은 무교환 사육수 중의 수질 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 과제를 해결하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 급성 간췌장 괴사증(AHPND)의 예방 또는 치료용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilus, 고초균)"란, 호기성균의 일종으로 독성이 없으며 포자를 생성하는 세균이다. 마른 풀, 토양, 하수, 공기 속 등 자연계에 넓게 분포해 있다. 효소를 생산해 우유를 응고시키고, 전분을 당화하며 유지를 분해하므로 공업적인 분야에 많이 사용되고 있다. 생육의 최적 상태는 pH 7~8.5, 온도 37~40℃이다. 바실러스 속 균주의 특성상 사람과 동물에 대한 독성유전자를 보유하지 않고, 그 자체로 비병원성일 뿐만 아니라 병원성 물질을 생산하지도 않으며, 생체 내에서 빠른 성장률을 나타낸다. 포도당 등이 존재하는 환경에서는 혐기적 서식을 하며, 내생포자는 바실러스가 고온이나 저온 등의 극도로 나쁜 환경에서도 생존가능하게 한다.
본 발명에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스는 기탁번호 KCCM11143P로 기탁된 균주일 수 있다.
본 발명에서는 상기 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 포함하는 사료조성물을 제조하였다.
본 발명의 상기 조성물은 전체 유효성분 g 당 1 x 104 내지1 x 1011 CFU의 균수를 갖는 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 포함할 수 있으며, 구체적으로는, 1 x 104 내지1 x 1010 CFU/g 일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 1 x 108 내지 1 x 1010 CFU/g 의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 포함한다.
본 발명의 목적상 상기 사료 조성물에 유효성분으로 포함되는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P만을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "급성 간췌장 괴사증(AHPND)"이란, 조기치사증후군 (EMS, Early mortality syndrome) 또는 급성 간췌장 궤사증후군(AHPNS, Acute hepatopancreatic necrosis syndrome) 로 명명되는 질병으로, 양식장에 입식시 30일 이내에 병원체에 의해 발생하는 대량 폐사를 포괄적으로 통칭한다. 우리나라 양식 새우의 약 96% 정도를 차지하는 흰다리새우에서 감염사례가 많고, 해수에 상존하고 있는 병원체인 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)로 인해 발생하는 질병이다. 어린 시기에 폐사율이 높기 때문에 새우에 치명적인 피해를 입히지만 인체에는 무해하다.
상기 "장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)"이란, 비브리오 속(Genus)에 속하는 그람 음성 간균으로, 인체에는 급성 식중독 및 장염을 일으키고, 어류에는 비브리오병(Vibriosis)을 일으키는 세균이다. 최근에는 새우 양식 산업에 있어서 대량 폐사를 야기하는 급성 간췌장 괴사증후군 (AHPND, Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease)의 원인균으로 밝혀졌다.
본 발명의 상기 조성물은 유효성분으로 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 바실러스 푸밀러스는 기탁번호 KCCM11144P로 기탁된 균주일 수 있고, 상기 바실러스 리체니포미스는 기탁번호 KCCM11270P로 기탁된 균주일 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스를 포함하는 조성물의 투여로 새우의 급성 간췌장 괴사증(AHPND)에 의한 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 포함하는 조성물의 투여로 새우의 급성 간췌장 괴사증(AHPND)에 의한 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
상기 조성물에는 유효성분으로 포함하는 상기 균주 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 첨가제가 포함될 수 있다. 본 발명에서의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 포함하는 장염비브리오균에 대한 항균 활성을 가지는 프로바이오틱스 제제로서, 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 사료 조성물을 새우에 급이하였을 경우에 AHPND 병에 대한 면역력을 증가시키고 질환 예방 효과를 나타낼 수 있는지 확인한 결과, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P 균주를 포함하는 사료 조성물(실시예 1 및 2)을 투여한 군 (BS 그룹 1 및 2)은 비교예 1(프로바이오틱스를 포함하지 않음) 및 비교예 2(상업적으로 판매되는 프로바이오틱스 (바실러스3종 혼합 제제 (B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis))를 포함)를 투여한 군(대조군 1 및 2)에 비해 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus) 감염에 대한 새우의 질병저항성을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 새우 간췌장 내 AHPND 독소량을 크게 낮출 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 균주를 포함하는 사료 조성물의 비특이적 면역력 분석을 실시한 결과, 대식세포 (NBT) 활성, 글루타치온 페록시다제 (GPx) 활성, 라이소자임 활성, 페놀산화효소 (PO) 활성, 수퍼옥사이드 디스무타아제(SOD) 활성 및 항단백 분해효소 활성이 비교예에 비해 유의적으로 높음을 확인하였고, 이를 통해 상기 조성물은 새우의 비특이적 면역반응 증가 또는 면역력 향상에 유용할 수 있다.
본 발명은 상기 언급한 사료 조성물을 포함하는 새우 양식용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 상기 유효성분 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 단위 동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 언급한 사료 첨가물을 포함하는 새우 양식용 사료를 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P 균주는 포자 형성이 가능한 그람 양성균이므로, 포자 형태로 제형화하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 사료는 특별히 한정되는 것은 아니고, 분말 사료, 고형 사료, 모이스트 펠릿 사료, 드라이 펠릿 사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등 어떠한 사료라도 무방하다.
상술한 바와 같이, 바실러스 속은 내생포자를 형성하여 열에 매우 안정적인 특징을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P는 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 바실러스 서브틸리스는 액상 또는 건조 상태 일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조 방법은 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 및 동결 건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P는 분말 형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1% 내지 1 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한 상기 사료는 수산양식용 으로써, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 일 실시양태로서, 본 발명의 사료 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 급성 간췌장 괴사증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
이때, 본 발명의 급성 간췌장 괴사증, 예방 및 치료는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란, 급성 간췌장 괴사증이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 양식 가능한 어류 또는 갑각류를 의미할 수 있으나, 본 발명의 목적상 새우를 의미할 수 있다.
상기 사료는 통상의 사료와 동일한 양 및 급이 간격으로 공급되는 것이 바람직하며, 상기 병원균은 새우 양식에 있어서 AHPND를 유발시킴으로써 새우의 집단 폐사를 일으키는 균을 지칭하며, 구체적으로, 장염비브리오균(vibrio parahaemolyticus)을 의미할 수 있다.
상기 새우 양식에 있어서 집단 폐사를 일으키는 원인으로는, 상기 장염비브리오균 뿐만 아니라, 각종 바이러스에 의한 감염 및 사육수 내의 암모니아 농도도 포함된다. 새우 양식 중의 사육수 내 암모니아는 주로 새우의 배설물, 사료 찌꺼기 등과 같은 단백질의 대사 산물로 발생하며, pH 및 수온의 상승에 따라 크게 달라진다. 높은 농도의 암모니아는 새우의 급성 폐사의 직접적인 원인이 되어 대량 폐사로 이어지며, 낮은 농도에서도 장기적으로는 새우의 성장 및 섭식 능력 등을 떨어뜨리고 면역력을 저하시켜 결과적으로 각종 질병 발생을 유발시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 사료 조성물을 급이한 새우의 사육수를 채취하여 이의 수질 분석을 실시한 결과, 대조구에 비해 총 암모니아 농도가 유의적으로 낮음을 확인함으로써, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P 균주는 새우 사육수의 수질을 개선할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P는 새우의 질병저항성을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 새우 간췌장 내 AHPND 독소량을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하면 상기 질병을 유발하는 장염비브리오균을 예방하는 효과를 얻을 수 있어, 보다 안전하게 새우를 양식할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 일 실시양태로서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 흰반점 증후군(WSS)의 예방 또는 치료용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilus, 고초균), 예방 및 치료는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 상기 조성물은 전체 유효성분 g 당 1 x 104 내지1 x 1011 CFU의 균수를 갖는 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 포함할 수 있으며, 구체적으로는, 1 x 104 내지1 x 1010 CFU/g 일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 1 x 108 내지 1 x 1010 CFU/g 의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 포함한다.
상기 “흰반점 증후군 바이러스(WSSV)”란, 전세계에 폭넓게 분포되어 있는 바이러스로, 바이론 말단 부위에 꼬리와 유사한 부착물을 갖고, 로드(rod) 형태의 캡시드(capsid) 및 피막(envelop)이 존재하는 난형의 바실러스와 유사한 형태를 가지고 있어, 베큘로바이러스 또는 바실러스 유사형 바이러스(bacillus-like formed virus)라 불리었으나, 최근에는 유전학적으로 새로운 바이러스 그룹인 휘스포바이러스(whispovirus)로 명명되고 있다. 이 바이러스의 길이는 약 275 nm 이고, 직경이 약 120 nm 이며, 약 290kb의 크기를 갖는 2중 나선 DNA(double-stranded DNA)로 구성되어 있다.
상기 조성물에는 유효성분으로 포함하는 상기 균주 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 첨가제가 포함될 수 있다. 본 발명에서의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지는 프로바이오틱스 제제로서, 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 사료 조성물을 새우에 급이하였을 경우에 흰반점 증후군 바이러스(WSSV)에 대한 저항성을 증가시키고 질환 예방 효과를 나타낼 수 있는지 확인한 결과, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P균주를 포함하는 사료조성물(실시예 1)을 투여한 군(BS 그룹 1)은 비교예 1(프로바이오틱스를 포함하지 않음)을 투여한 군(대조군 1)에 비해 WSSV 감염에 대한 새우의 질병저항성을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 사료 조성물을 새우에 급이하였을 경우에 흰반점 증후군 바이러스(WSSV) 및 급성 간췌장 괴사증(AHPND)의 복합 감염에 대한 저항성을 증가시키고 생존률 향상 효과를 나타낼 수 있는지 확인한 결과, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P 균주를 포함하는 사료조성물(실시예 1)을 투여한 군(BS 그룹 1)은 비교예 1(프로바이오틱스를 포함하지 않음)을 투여한 군(대조군 1)에 비해 WSSV 및 AHPND 복합 감염에 대한 새우의 질병저항성을 증진시킬 수 있다.
본 발명은 상기 언급한 사료 조성물을 포함하는 새우 양식용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 상기 유효성분 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 단위 동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 언급한 사료 첨가물을 포함하는 새우 양식용 사료를 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P 균주는 포자 형성이 가능한 그람 양성균이므로, 포자 형태로 제형화하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 사료는 특별히 한정되는 것은 아니고, 분말 사료, 고형 사료, 모이스트 펠릿 사료, 드라이 펠릿 사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등 어떠한 사료라도 무방하다.
상술한 바와 같이, 바실러스 속은 내생포자를 형성하여 열에 매우 안정적인 특징을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P는 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 바실러스 서브틸리스는 액상 또는 건조 상태 일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조 방법은 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 및 동결 건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P는 분말 형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1% 내지 1 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한 상기 사료는 수산양식용으로써, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 일 실시양태로서, 본 발명의 사료 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 흰반점 증후군의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
이때, 본 발명의 용어 흰반점 증후군, 예방, 치료 및 개체는 상기에서 설명한 바와 같다.
새우 양식에 있어서 집단 폐사를 일으키는 원인으로는, 상기 장염비브리오균 뿐만 아니라, 각종 바이러스에 의한 감염도 포함된다. 구체적으로, 상기 바이러스는 흰반점 증후군 바이러스(WSSV)를 의미할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 KCCM11143P는 흰반점 증후군 바이러스에 대한 내성을 증강시키는 효과를 얻을 수 있어, 보다 안전하게 새우를 양식할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 항균 활성을 갖는 프로바이오틱스 선별
새우 AHPND를 유발하는 장염비브리오균 (Vibrio parahaemolyticus)에 대한 항균 활성을 갖는 균주를 선발하기 위해, 생육저해환 분석을 수행하였다. 0.5% 한천(agar) 3 ml와 병원성 세균의 진탕 배양액(2.0x109 CFU/ ml)을 100 μl를 혼합하여 TSA+ 배지 위에 분주하여 탑-아가를 제조하였다. 상기 제조된 탑-아가 위에 12종의 바실러스 서브틸리스(CJ 자체 보유 균주 및 상업용 균주) 미생물 배양액을 각각 10μl 떨어뜨리고, 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 형성되는 생육저해환의 유무를 관찰하였다. 상업적으로 구할 수 있는 바실러스 서브틸리스와 복합 파지의 항균력을 함께 평가하였다.
항균 평가 대상 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)
바실러스 서브틸리스 1 (CJBS-01) ++++
바실러스 서브틸리스 2 (CJBS-02) +
바실러스 서브틸리스 3 (CJBS-03) -
바실러스 서브틸리스 4 (CJBS-04) -
바실러스 서브틸리스 5 (CJBS-05) +
바실러스 서브틸리스 6 (CJBS-06) -
바실러스 서브틸리스 7 (CJBS-07) -
바실러스 서브틸리스 8 (CJBS-08) -
바실러스 서브틸리스 9 (CJBS-09) +
바실러스 서브틸리스10 (CJBS-10) -
바실러스 서브틸리스 11 (CJBS-11) -
바실러스 서브틸리스 12 (CJBS-12) -
바실러스 서브틸리스(상업적으로 구매, A사, 한국) +
복합 phage -
++++: 활성 강함, +: 활성 있음, -: 활성 없음
상기 표 1에 나타난 바와 같이, in vitro상 AHPND 유발 균주인 장염비브리오균에 대한 항균 효과는 바실러스 서브틸리스 1 미생물 (CJBS-01)이 가장 우수하였다. 그러나, In vitro 상에서 특정 병원균에 항균활성을 보이는 미생물이라고 할지라도, 이는 in vitro 상의 효과일 뿐, 동물이 이를 섭취한다고 하여 해당 병원균에 관한 면역력 또는 예방효과가 있다고 볼 수는 없다.
따라서, 이하의 실험에서는 상기 바실러스 서브틸리스 1 (CJBS-01) 미생물을 새우에 급이하였을 경우, AHPND 병에 대한 면역력 개선 및 질환 예방 효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다. 또한, 상기 바실러스 서브틸리스 1 (CJBS-01)이 새우의 증체 및 소화율에 영향이 있는지도 확인하였다.
상기 바실러스 서브틸리스 1 (CJBS-01)은, 기탁번호 KCCM11143P로 2010.12.14 일자에 한국미생물보존센터에 기탁된 균주이다.
제조예 2. 바실러스 서브틸리스를 포함하는 새우 사료조성물 제조
상기 제조예 1에서 선별된 바실러스 서브틸리스 1 (Bacillus Subtilis: 기탁번호 KCCM11143P, 이하 'BS'로 지칭함)을 포함하는 사료조성물을 제조하였다.
구체적으로, 바실러스 서브틸리스를 포함하지 않는 비교예 1, 상업적으로 판매되는 바실러스 속 (Bacillus 3종 혼합 제제 (B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis))을 포함하는 비교예 2, 상기 선별된 바실러스 서브틸리스 1 (BS)을 1010 x 0.2 CFU/g 포함하는 실시예 1 및 상기 BS를 109 x 0.2 CFU/g 포함하는 실시예 2의 조성물을 어유 (fish oil) 및 물을 첨가하여 혼합한 후, 펠릿 형태로 제조하였다. 상기 비교예 1, 2 및 실시예 1 및 2의 사료조성물은 건조기를 사용하여 약 24시간 동안 25℃에서 건조한 후 실험 전까지 -20℃에 보관하였다.
Ingredients (%) 비교예 1 비교예 2 실시예1 실시예 2
Fish meal 40 40 40 40
SBM 44% South America 12.81 12.81 12.81 12.81
Squid liver powder 10 10 10 10
Wheat flour 25.61 25.61 25.61 25.61
Amygluten 110 3 3 3 3
Fish oil A/C 2 2 2 2
Amino acid 0.42 0.42 0.42 0.42
Vitamin/Mineral premix 5.96 5.96 5.96 5.96
Rice bran 0.2 0.18 0.00 0.00
Bacillus 3종 (1010 x CFU/g) 0.00 0.2 0.00 0.00
BS (1010 x CFU/g) 0.00 0.00 0.2 0.00
BS (109 x CFU/g) 0.00 0.00 0.00 0.2
Chemical composition (% dry mater)
Moisture 5.68 5.57 5.60 5.61
Crude protein 47.3 47.4 47.4 47.4
Crude lipid 7.31 7.47 7.49 7.48
Crude ash 6.01 6.18 6.12 6.10
실험예 1. AHPND 에 대한 사료 조성물의 예방 효과 평가
1-1. 새우 준비 및 성장률 평가
수조 당 30마리씩 총 40개의 수조에 흰다리새우를 준비하였다. 모든 시험 수조에는 용존산소 유지를 위하여 에어스톤을 설치하였고, 전 시험기간 동안 사육 수온은 28 내지 32℃ 범위로 유지하였다. 사료는 1일 4회 제한적으로 공급하였다 (어체중의 4 내지 12%).
새우의 무게는 2주마다 측정하였으며, 성장률 및 사료효율 관련 평가 항목과 계산식은 다음과 같다:
Figure PCTKR2018016893-appb-I000001
Figure PCTKR2018016893-appb-I000002
Figure PCTKR2018016893-appb-I000003
실험사료의 배치는 완전확률계획법(Completely randomized design)을 실시하고, 성장 및 분석결과는(SPSS Version 18.0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석하였다. 데이터 값의 유의차는 Duncan's multiple range test로 평균 간의 유의성(P<0.05)을 비교하였다. 데이터는 평균값 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었으며, 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석하였다.
대조군 1 대조군 2 BS 그룹 1
IBW1 (g) 0.51±0.01 0.51±0.01 0.51±0.01
FBW2 (g) 3.49±0.12bc 3.80±0.22ab 3.86±0.18a
WG3 (%) 592±18.9c 655±39.3ab 667±31.9a
SGR4 (%) 6.04±0.09b 6.31±0.16a 6.37±0.13a
FCR5 1.30±0.26 1.28±0.09 1.19±0.12
Survival (%) 80.0±3.33 75.6±6.94 71.1±6.94
1IBW: Initial body weight (초기체중)
2FBW: Final body weight (최종체중)
3WG: Weight gain (증체율) = [(final body weight - initial body weight)/ initial body weight] x 100
4SGR: Specific growth ratio (일간성장률) (% day-1) = [(loge final body weight - loge initial body weight)/days] x 100
5FCR: Feed conversion ratio (사료변환율) = dry feed fed/wet weight gain
표 3에 나타난 바와 같이, 사양시험 결과, 비교예 1 및 2의 사료 조성물이 투여된 대조군 1 및 2에 비하여, 제조예 1에서 선별된 바실러스 서브틸리스를 포함하는 실시예 1의 사료 조성물이 제공된 BS 그룹 1에서 유의적으로 높은 성장률이 나타남을 확인하였다. 또한, 실시예 1이 투여된 군은 비교예 1 및 2가 투여된 군에 비하여 유의적으로 높은 일간성장률이 나타남을 확인하였다.
1-2. 장염비브리오균의 공격시험 1
장염비브리오균의 새우에 대한 공격시험은 총 2번으로 나누어 진행하였다. 상기 비브리오 균주의 경우, 2013년도 베트남 지역에서 분리한 AHPND (EMS) 유발 균주를 시험에 이용하였다. 공격시험의 경우, 실시예의 사료 조성물을 새우에게 2주 동안 공급한 후, 동일한 무게(평균무게: 2.32 g)의 새우를 그룹당 96마리씩 4 반복으로 배치하였다. 상기 세균은 TSB+ 배지를 사용하여 30oC, 150 rpm에서 24시간 배양하였고, Tank 당 3.1 x 105 CFU/ml 농도로 장염비브리오균 현탁액을 침지하였다. 침지 후 1시간마다 새우의 폐사 및 유영 상태를 확인하였으며, 8시간 후에 95% 환수를 진행하였다. 시험사료는 1일 3회(8:30, 13:30 및 18:30시)에 나누어 제한공급(어체중의 10 내지 12%) 하였고, 70시간 동안 폐사 정도를 관찰하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
Treatment Survival (%)
Trial
대조군 1 50.0±16.0
대조군 2 49.0±23.2
BS 그룹 1 67.7±28.9
표 4에 나타난 바와 같이, 제조예 1에서 선별된 바실러스 서브틸리스를 포함하는 사료 조성물이 제공된 BS 그룹 1은 장염비브리오균의 새우에 대한 공격시험에 있어서 대조군 1 및 2에 비하여 높은 생존율을 보였다.
또한, 도 1에 나타난 바와 같이, 두 번의 시험 모두 공통적으로 장염비브리오균을 침지한 직후에는 새우의 움직임이 둔해지며, 유영활동을 하지 않고 수조 바닥에 가라앉아 있는 모습이 관찰되었고, 사료 섭이도 활발하지 않았다. 침지 후 8시간에는 급격한 폐사가 발생하기 시작하였으며, BS 그룹 1의 생존율은 대조군 1 또는 2의 생존율에 비하여 17% 이상 높은 것을 확인하였다.
1-3. 장염비브리오균의 공격시험 2
장염비브리오균의 새우에 대한 공격시험은 1번 진행하였다. 상기 비브리오 균주의 경우, 2013년도 베트남 지역에서 분리한 AHPND (EMS) 유발 균주를 시험에 이용하였다. 공격시험의 경우, 실시예의 사료 조성물을 새우에게 4주 동안 공급한 후, 동일한 무게(평균무게: 2.30 g)의 새우를 그룹당 96마리씩 4 반복으로 배치하였다. 상기 세균은 TSB+ 배지를 사용하여 30oC, 150 rpm에서 24시간 배양하였고, Tank 당 6.3 x 105 CFU/ml 농도로 장염비브리오균 현탁액을 침지하였다. 침지 후 1시간마다 새우의 폐사 및 유영 상태를 확인하였으며, 8시간 후에 95% 환수를 진행하였다. 시험사료는 1일 3회(8:30, 13:30 및 18:30시)에 나누어 제한공급(어체중의 10 내지 12%) 하였고, 70시간 동안 폐사 정도를 관찰하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Treatment Survival (%)
Trial
대조군 1 0.00±0.00
BS 그룹 1 8.93±10.7
BS 그룹 2 6.90±5.45
표 5에 나타난 바와 같이, 장염비브리오균의 새우에 대한 공격시험에 있어서, 제조예 1에서 선별된 바실러스 서브틸리스를 포함하는 실시예 1 및 2의 사료 조성물이 제공된 BS 그룹 1 및 2는 비교예 1의 사료 조성물이 제공된 대조군 1에 비하여 높은 생존율을 보였다.
1-4. 샘플 수집 방법 및 병리조직학적 분석 방법
장염비브리오균의 새우에 대한 공격시험 시작(감염 전), 중간(감염), 종료 시 그룹당 2마리의 새우를 무작위로 선별하여 간췌장을 분리하였다. 분리된 간췌장 중 일부는 quantitative real-time PCR(qPCR) 분석을 위해 에틸 알코올(100%)에 바로 보관하였고, 일부는 병리조직학적 검사를 위해 Davidson 고정액에 24시간 고정 후 에틸 알코올(70%)에 보관하였다.
보다 구체적으로, 병리조직학적 분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 상기 분리한 간췌장 조직의 파괴를 최소화하기 위해, 수조에서 샘플링한 직후 1 ml 주사기를 사용하여 Davidson 고정액을 새우의 간췌장에 주입한 후 분리하였다. 그 후, Davison 고정액이 들어있는 1.5 ml 에펜도르프 튜브에서 24시간 고정하고, 에틸 알코올(70%)에 보관한 후, 분석에 사용하였다. 고정이 완료된 장기를 조직 표본 제작에 적합한 크기의 형태(약 2 내지 3 mm)의 두께로 삭정한 후 카세트에 넣어 13시간 동안 조직처리를 실시하였다. 약 4 μm의 두께로 박절하여 발생된 절편은 붓을 이용하여 채취하고, 슬라이드에 주름이 없도록 부착한 후 공기 중에 약 5분 정도 방치하고 H&E 염색을 실시하였다. 염색이 종료된 슬라이드는 위상차 현미경(BX50, Olympus)을 사용하여 현미경 전용 프로그램(TCapture, Tucen Photonics)으로 200배 촬영하였다. 그 후, 샘플링된 간췌장 내 AHPND 독소량에 대한 qPCR 분석을 실시하였다.
그 결과를 도 2에 나타냈다. 여기서 Ct 값은 낮을수록 독소량이 많다는 것을 의미한다.
공격시험 전(0h)의 샘플링된 간췌장에서는 모든 그룹에서 AHPND 독소가 검출되지 않았으며, 폐사 개체가 가장 많았던 10시간에 샘플링된 간췌장에서는 AHPND 독소가 모든 시험구에서 검출되었다. 하지만, 본 출원에 따른 바실러스 서브틸리스를 포함하는 사료 조성물이 제공된 BS 그룹 1은 대조군 1 및 2에 비하여 유의적으로 높은 Ct 값을 나타내었고, 24시간에 샘플링된 간췌장에서는 BS 그룹 1에서 AHPND 독소를 가장 적게 검출하는 것이 확인되었다. 또한, 공격접종 종료시점(193h)에는 BS 그룹 2와 대조군 2에서 AHPND 독소가 검출되지 않았다.
또한, 간췌장의 병리조직학적 분석 결과를 도 3에 나타냈다.
공격시험 전(0h)의 샘플링된 간췌장은 모든 그룹에서 정상적인 조직형태가 관찰되었다. 10시간 후에 샘플링된 간췌장은 대조군 1의 그룹에서 손상도가 가장 심했으며, 대조군 2 및 BS 그룹 1에서도 조직 괴사가 진행되고 있는 것이 관찰되었다. 24시간 후에 샘플링된 간췌장은 AHPND 독소에 의한 조직괴사보다는 염증 소견이 관찰되었다. 공격접종 종료시점(193h)에는 대조군 1에서 이미 100% 폐사가 발생(37h)하였기 때문에 샘플링이 불가능하였고, 대조군 2 및 BS 그룹에서는 일부 염증 세포들이 관찰되었다.
상기 결과로부터, 본 출원에 따른 바실러스 서브틸리스를 포함하는 사료 조성물은 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus) 감염에 대한 새우의 질병저항성을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 새우 간췌장 내 AHPND 독소량을 크게 낮출 수 있음을 확인하였다.
실험예 2. 바실러스 서브틸리스 농도에 따른 성장률 및 면역력 평가
상기 제조예 2를 참고하여, 제조예 1에서 선별된 바실러스 서브틸리스 (KCCM11143P, 이하 'BS'로 지칭함)의 농도를 달리한 사료조성물(실시예 1 및 3)을 제조하였다. 이를 하기 표 6에 나타내었다.
Ingredients (%) 비교예 1 비교예 2 실시예 1 실시예 3
Fish meal 40 40 40 40
SBM 44% South America 12.81 12.81 12.81 12.81
Squid liver powder 10 10 10 10
Wheat flour 25.61 25.61 25.61 25.61
Amygluten 110 3 3 3 3
Fish oil A/C 2 2 2 2
Amino acid 0.42 0.42 0.42 0.42
Vitamin/Mineral premix 5.96 5.96 5.96 5.96
Rice bran 0.2 0.18 0.00 0.00
Bacillus 3종 (1010 x CFU/g) 0.00 0.2 0.00 0.00
BS (1010 x CFU/g) 0.00 0.00 0.2 0.1
Chemical composition (%, dry matter)
Moisture 5.59 5.80 5.78 5.71
Crude protein 47.3 48.6 49.2 48.9
Crude lipid 7.74 7.71 7.73 7.70
Crude ash 6.12 6.12 6.20 6.10
상기 표 6의 각 그룹의 조성물은 어유 (fish oil) 및 물을 첨가하여 혼합한 후, 펠릿 형태로 제조하였으며, 상기 각 그룹의 사료조성물은 건조기를 사용하여 약 24시간 동안 25℃에서 건조시킨 후, 실험 전까지 -20℃에 보관하였다.
2-1. 새우 준비 및 성장률 평가
수조 당 30마리씩 총 28개의 수조에 흰다리새우를 준비하였다. 모든 시험 수조에는 용존산소 유지를 위하여 에어스톤이 설치하였고, 전 시험기간 동안 사육 수온은 28 내지 32℃ 범위로 유지하였다. 사료는 8주간 1일 4회 제한적으로 공급하였다 (어체중의 6 내지 12%, 초기평균무게: 0.14 g).
새우의 무게는 2주 마다 측정하였으며, 성장률 및 사료효율 관련 평가 항목과 계산식은 다음과 같다;
Figure PCTKR2018016893-appb-I000004
Figure PCTKR2018016893-appb-I000005
Figure PCTKR2018016893-appb-I000006
이의 결과를 표 7에 나타내었다.
대조군 1 대조군 2 BS 그룹 1 BS 그룹 3
IBW1 (g) 0.14±0.00 0.14±0.00 0.14±0.00 0.14±0.00
FBW2 (g) 10.2±0.69b 11.3±0.45a 11.9±0.43a 11.5±0.60a
WG3 (%) 7029±506b 7969±413a 8381±356a 8085±464a
SGR4 (%) 7.62±0.13b 7.84±0.09a 7.93±0.07a 7.86±0.10a
FCR5 1.53±0.04c 1.21±0.09ab 1.11±0.22a 1.13±0.12a
Survival (%) 90.7±6.11 92.0±4.00 84.0±17.4 88.0±8.00
* (P < 0.05)1IBW: Initial body weight (초기체중)
2FBW: Final body weight (최종체중)
3WG: Weight gain = [(final body weight - initial body weight)/ initial body weight] x 100 (증체율)
4SGR: Specific growth ratio (일간성장률) (% day-1) = [(loge final body weight - loge initial body weight)/days] x 100
5FCR: Feed conversion ratio (사료변환율) = dry feed fed/wet weight gain
표 7 및 도 4에 나타난 바와 같이, 8주간 사료가 공급된 모든 그룹의 새우는 사료 공급 전에 비해 약 7000% 이상의 성장률을 나타내었다. 특히, BS 그룹 1과 BS 그룹 3의 최종 평균 무게는, 대조군 1의 최종 평균 무게에 비하여, 각각 15.7% 및 16.7% 높았다. 또한, 일간성장률에서도 BS 그룹 1과 BS 그룹 3은, 대조군 1과 비교하여 각각 3.4% 및 4.1% 높았다. BS 그룹 1과 BS 그룹 3의 사료 효율은, 대조군 1의 사료 효율과 비교하여 각각 27.5% 및 26.1% 향상되었다. 다만, 새우의 생존율에서는 모든 그룹에서 유의적인 차이가 없었다.
2-2. 샘플 수집
시험 새우의 무게 측정은 2주마다 실시하였으며, 측정 18시간 전에 시험 새우의 스트레스를 줄이기 위해 모든 시험 새우를 절식시켰다. 최종 무게 측정 후 수조당 7마리의 새우를 무작위로 선별하여 얼음물에서 마취시킨 후, ALSEVER'S 용액이 처리된 주사기를 이용하여 hemolymp를 채혈하였다. 채혈한 hemolymp는 대식세포활성(NBT; nitroblue-tetrazolium activity) 분석에 이용하였고, 원심분리기로(800 g, 10분, 4℃) 혈장을 분리한 샘플은 비특이적면역력 분석에 사용하였다. 소화율분석을 위한 새우의 분(feces) 수집은 사료공급 30분 후, 사이펀(siphoning) 및 환수를 통해 수조에 남은 사료와 이물질을 깨끗이 청소하고, 이후 3시간부터 배설되는 분을 사이펀으로 수집하였다. 수집된 분은 증류수로 세척한 후에 거름종이를 이용하여 필터한 후, 분석용 샘플로 사용할 때까지 -40℃ 저온 냉동고에 보관하였다.
2-3. 통계학적 분석
실험사료의 배치는 완전확률계획법(Completely randomized design)을 실시하고, 성장 및 분석결과는(SPSS Version 18.0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석하였다. 데이터 값의 유의차는 Duncan's multiple range test를 이용하여 평균간의 유의성(P<0.05)을 비교하였다. 데이터는 평균값 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었으며, 백분율 데이터는 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석하였다.
2-4. 일반성분 분석
시험사료 및 상기 분의 일반성분 분석은 AOAC (2005) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법(125℃, 3h), 조회분은 직접회화로법(550℃, 4h), 단백질은 자동 조단백분석기(Kejltec system 2300, Sweden)로 분석하였으며, 지방은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 분석하였고, 표 8에 나타내었다.
대조군 1 대조군 2 BS 그룹 1 BS 그룹 3
Dry matter 24.9±0.35 24.5±0.10 23.7±0.39 23.7±0.35
Crude ash 12.9±2.34 12.8±0.12 12.3±0.33 14.5±0.22
Crude protein 76.5±3.46b 82.0±1.67a 84.3±2.85a 83.9±2.31a
Crude lipid 5.37±0.96 5.45±1.15 5.09±0.28 5.26±1.05
(*P < 0.05 )
표 8에 나타난 바와 같이, 조회분 및 조지질 함량은 그룹 간의 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, BS 그룹 3의 조단백질 함량은 대조군 1 및 대조군 2에 비하여 유의적으로 높았다. 즉, 본 출원에 따른 사료 조성물이 새우에 제공되는 경우, 새우의 단백함량을 높일 수 있다는 점을 확인하였다.
2-5. 비특이적 면역력 관련 분석
2-5-1. NBT (Nitroblue tetrazolium) 활성 분석
호흡폭발 동안의 호중구에 의한 산화 라디컬 생성량을 측정하기 위하여, Zhang et al. (2013)의 분석방법을 응용하였다.
구체적으로, 먼저 hemolymph 50 μl를 200 μl HBSS(Hank's balanced salt solution)용액과 혼합한 뒤, 25℃에서 반응시켰다. 30분 후 zymosan (0.1% Hank's solution) 100 μl를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. NBT solution(0.3%)을 100 μl씩 넣은 뒤 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 600 μl 100% 메탄올을 넣고 10분 동안 원심분리(6500 rpm)한 후 상층액을 버려내고 70% 메탄올 100 μl로 3번 세척한 뒤, 5분 동안 건조시켰다. 그런 다음, 2M KOH 700 μl와 DMSO 800 μl를 첨가한 후, 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2-5-2. Glutathione peroxidase(GPx) 활성 분석
혈청 내 GPx 활성을 분석하기 위해, GPx kit (Biovision, Inc. California)를 이용하였다.
구체적으로, Cumenehydroperoxide는 peroxide substrate (ROOH), glutathione reductase (GSSG-R) 및 NADPH (b-Nicotinamide Adenine Denucleotide Phosphate, Reduced)가 섞인 반응혼합물을 사용하였다. 먼저, hemolymph 샘플 50 μl를 마이크로플레이트에 넣고 반응 혼합물 40 μl를 첨가하여, 15분 동안 반응시켰다. 그 후 cumenehydroperoxide 10 μl를 첨가하고, 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 5분 후 340nm에서 다시 한번 흡광도를 측정하였고, GPx 활성은 nmol/min/ ml로 계산하였다.
2-5-3. 라이소자임 활성 분석
라이소자임 활성분석은 Swain et al. (2007)의 방법을 기초로 분석하였다.
구체적으로, 라이소자임은 비특이적(선천적) 면역반응에 속하는 항균효소 중의 하나로써, 특정세균에 대한 특이적인 항균작용이 아닌 비특이적으로 다양한 균에 대한 항균작용을 나타내는 효소이다. 병원균에 대한 항균 메커니즘은 세균 세포벽의 구성성분인 peptidoglycan의 β-1,4-글루코시드 결합을 가수분해 하여 세균의 세포벽을 파괴함으로써 항균작용을 나타낸다. 라이소자임은 특히 그람양성균에 대한 항균효과가 뛰어나다. 이러한 기작에 기인하여 lysozyme activity는 어류를 포함한 새우에 있어서의 비특이적 면역반응을 측정하는 분석항목으로 널리 이용되고 있으며, 새우사료 내 면역활성인자 (ascorbic acid, β-glucan, probiotics 등)들의 첨가 시 새우의 hemolymph 및 조직에 있어서 증가된 lysozyme activity를 확인 할 수 있으며, 이러한 결과는 비특이적 면역반응의 증가 또는 어류(새우)의 면역력의 향상을 나타내는 결과로 해석된다.
2-5-4. Phenoloxidase (PO) 활성 분석
PO 활성분석은 Hernandez-Lopez et al. (1996)의 방법을 기초로 분석하였다.
구체적으로, Phenoloxidase는 갑각류의 방어기작에 매우 중요한 역할을 하는 효소로서 혈구세포 내 prophenoloxidase 형태로 존재하다가 Prophenoloxidase activating system 에 의해 활성화된다. 활성화된 phenoloxidase 는 옵소닌을 생산하여 혈구의 식세포 활동과 외래 항원에 대한 피복작용을 촉진시키며 혈액응고 반응에 참여한다. 따라서 hemolymph 내 phenoloxidase 활성은 새우의 선천성 면역의 중요한 지표로 사용된다.
2-5-5. Superoxide dismutases (SOD) 활성 분석
SOD 활성은 SOD assay kit (Sigma-aldrich, 19160, St. Louis, USA)를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트에 20 μl의 radical detector를 첨가한 후 혈액 샘플을 10 μl씩 넣었다. 그 후 20 μl xanthine oxidase를 첨가하여 20분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더기 (Themo)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2-5-6. Antiproteases 활성 분석
Hemolymph 내 antiprotease의 활성은 Ellis (1990)의 분석방법을 바탕으로 분석하였다.
구체적으로, Hemolymph 20 μl와 standard trypsin solution (Type II-S, from porcine pancreas, Sigma-aldrich, A2765, St. Louis, USA) 20 μl를 혼합한 후, 10분간 22℃에서 배양하였다. phosphate buffer (0.1 M, pH 7.0) 200 μl와 azocasein (2%) (Sigma-Aldrich) 250 μl를 첨가하고 22 ℃에서 1시간 동안 배양 후, trichloro acetic acid (10%) (TCA) 500 μl를 다시 첨가하고 22℃에서 30분간 배양하였다. 상기 배양된 용액을 원심분리(6000 g, 5분)하고 100 μl 를 96-웰 플레이트에 분주 후, 100 μl의 NaOH (1 N)를 첨가하여 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 430 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 비특이적 면역력 분석을 실시한 2-5-1 내지 2-5-6의 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
대조군 1 대조군 2 BS 그룹 1 BS 그룹 3
NBT1 1.65±0.15c 1.72±0.08bc 1.85±0.03ab 1.79±0.13ab
PO2 0.213±0.008b 0.249±0.031a 0.254±0.015a 0.249±0.009a
Antiprotease3 31.6±2.4b 35.8±0.3a 36.6±1.8a 36.1±3.4a
Lysozyme4 6.40±1.04b 8.57±0.50a 8.43±0.98a 8.08±1.26ab
SOD5 67.3±4.6b 73.1±3.3ab 74.8±4.6ab 72.8±7.7ab
GPx6 28.5±1.9d 32.7±2.4c 36.4±1.7abc 36.7±2.3a
(*P < 0.05 )
1Nitro blue tetrazolium; phagocytic activity (absorbance) 대식세포 활성
2Phenoloxidase activity (absorbance) 페놀산화효소 활성
3Antiprotease (% inhibition) 항 단백 분해효소
4Lysozyme activity (μg ml-1) 라이소자임활성도
5Superoxide dismutase (% inhibition) 수퍼옥시드 디스무타아제
6Glutathione peroxidase (mU ml-1) 글루타치온 페록시다제
표 9 및 도 5에 나타난 바와 같이, NBT 활성 및 PO 활성은 BS 그룹 1 및 BS 그룹 3 모두 대조군 1 및 대조군 2에 비하여 유의적으로 높은 수치를 나타내었으며, 특히, PO 활성의 경우, BS 그룹 1은 대조군 1 보다 26.8% 높은 수치를 나타내었다. 항 단백 분해효소 활성은 BS 그룹 1 및 BS 그룹 3 모두 대조군 1 및 대조군 2에 비하여 유의적으로 높은 수치를 나타냈었으며, 특히 BS 그룹 1은 대조군 1 보다 15.8% 높은 수치를 나타내었다. 라이소자임 활성 및SOD 활성은 BS 그룹 1 및 BS 그룹 3 모두 대조군 1에 비해 유의적으로 높았다. GPx 활성은 BS 그룹 1 및 BS 그룹 3 모두 대조군 1 및 대조군 2에 비하여 유의적으로 높은 수치를 나타내었으며, 특히 대조군 1에 비하여 각각 27.7% 및 28.8% 높은값을 나타냄을 확인하였다.
2-6. 수질 분석 및 사육수 무교환 실험
8주간의 사양시험 기간 동안 5일에 한번씩 각 수조에서 사육수 샘플을 채취하여 수질 분석을 실시하였다. 샘플은 각 탱크마다 같은 위치에서 수집하여 용존산소(Dissolve oxygen; DO), 염분, pH, 암모니아(Ammonium; NH4 +)농도를 측정하였다. DO는 Thermo Scientific Orion Star A216 Benchtop Meter (Thermoscientific), 염분은 Master Refractometer (ATAGO)를 사용하여 측정하였다. pH는 Seven Compact (METTLER TOLEDO)를 사용하여 측정하였다. NH4 +는 Verdouw et al. (1978)의 방법을 사용하여 분석하였다.
사육수 무교환(zero water change)방식으로 평균체중 2.87(±0.08)g의 흰다리새우(L. vannamei)를 총 14개의 96 L수조에 각 수조당 12마리씩 무작위로 배치하였다. 시험구당 2반복구를 두었고, 1일 4회(08:30, 12:00, 15:30 및 19:00시)에 나누어 체중의 12%의 시험사료를 급이하였다. Verdouw et al. (1978)의 방법에 따라, 매일 1회 채수하여 사육수의 총 암모니아 농도를 10일 동안 측정하였다. 이에 대한 결과를 표 10에 나타내었다.
DO mgL-1 pH NH4 + mgL-1
Mean 6.85 7.10 0.102
Max 7.21 6.78 0.154
Min 6.39 6.48 0.035
표 10 및 도 6에 나타난 바와 같이, 흥미롭게도, 7일차부터 대조구에 비해 모든 시험구가 총 암모니아 농도에서 낮은 결과를 보이기 시작하였으며, 10일차 때에는 모든 시험구가 대조구에 비해 유의적으로 낮은 암모니아 농도를 보였다.
2-7. 소화율 분석
2-7-1. 지시제(Cr2O3) 분석
시험사료와 분에서의 chromium oxide 함량을 분석하기 위해, Divakaran et al. (2002)의 방법을 이용하였다.
구체적으로, 시험사료 및 분 샘플은 회화로(550℃)에서 4시간 동안 회화시킨 후 얻어진 시료를 분석에 사용하였다. 먼저 chromium oxide를 mono-chromate 형태로 산화시키기 위해 분 샘플 5 내지10 mg을 측량하여 glass test tube에 옮겼다. 시료가 담긴glass test tube에 perchloric reagent (HClO4) 4 ml를 첨가하였다. Perchloric reagent(70%) 는 100 ml의 증류수에 200 ml의 질산을 혼합한 후, 냉각시킨 다음 70% perchloric acid 200 ml를 혼합하여 만들었다. 상기 시료와 perchloric reagent가 첨가된 glass test tube를 가열판에 넣고, 300℃에서 15분간 가열한 후 실온에서 방냉시켰다. 전처리가 끝난 샘플은 50 ml 유리플라스크에 옮기고 3차 증류수로 25 ml가 되도록 정량하였다. 그 후, 분광광도계 (Beckman DU-730)를 이용하여 350 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도는 시료분석과 같이 전처리 된 standard 용액으로 만들어진 standard 방정식을 이용하여 시료의 chromium oxide 함량을 계산하였다.
2-7-2. 건물 및 단백질 소화율 분석
시험사료의 건물 및 단백질 소화율은 다음과 같은 방법으로 계산하였다;
ADC of dry matter (%) = 100 - 100 x (%Cr2O3 in diet / %Cr2O3 in feces);
ADC of protein (%) = 100 - 100 x (%Cr2O3 in diet / %Cr2O3 in feces) x (%protein in feces / %protein in diet)
사양실험 종료 후 실시한 소화율 분석결과는 표 11에 나타내었다.
Control Bacillus3종 BS1010x0.2 BS1010x0.1
ADCd (%)1 85.6±0.7c 87.4±0.6ab 86.9±0.5b 87.9±0.4a
ADCp (%)2 93.5±0.3b 95.0±0.2a 94.8±0.2a 95.2±0.2a
Values are mean of triplicate groups and presented as mean ± S.D. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P < 0.05).
1 Apparent digestibility coefficient of dry matter
2 Apparent digestibility coefficient of protein.
표 11에 나타난 바와 같이, 건물소화율 및 단백질소화율에서 모든 시험구는 대조구에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였다.
실험예 3. WSSV에 대한 사료 조성물의 예방 효과 평가
바실러스 서브틸리스를 함유하는 사료 조성물의 항바이러스 효과를 확인하기 위해, 흰반점 증후군 바이러스(WSSV)의 새우에 대한 공격시험을 진행하였다. 상기 흰반점 증후군 바이러스의 경우, 2017년도 국내양식장에서 WSSV에 감염된 흰다리새우(Litopenaues vannamei)에서 분리한 바이러스를 이용하였다. 공격시험의 경우, 실시예의 사료 조성물을 새우에게 6주 동안 공급한 후, 동일한 무게(평균무게: 6.25 g)의 새우를 그룹당 96마리씩 4 반복으로 배치하였다. 바이러스의 접종농도는 4.1 x 105 copies/ul으로 새우 한마리당 100ul를 주사기를 사용하여 새우 근육에 접종하였다. 마리 당 최종접종 농도는 4.1 x 107 copies/ul이다.
접종후 새우의 폐사 및 유영 상태를 확인하였다. 시험사료는 1일 3회(8:30, 13:30 및 18:30시)에 나누어 제한공급(어체중의 10 내지 12%) 하였고, 125시간 동안 폐사 정도를 관찰하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
Treatment Survival (%)
Trial
대조군 1 23.21±3.57
BS 그룹 1 25.00±18.0
표 12에 나타난 바와 같이, 바실러스 서브틸리스를 포함하는 실시예 2의 사료 조성물이 제공된 BS 그룹 1은 흰반점 증후군 바이러스의 새우에 대한 공격시험에 있어서, 비교예 1의 사료 조성물이 투여된 대조군 1에 비하여 높은 생존율을 보였다.
실험예 4. WSSV 및 AHPND의 복합감염에 대한 사료 조성물의 예방 효과 평가
바실러스 서브틸리스를 함유하는 사료 조성물의 항균 및 항바이러스 효과를 확인하기 위해, 장염비브리오균 및 흰반점 증후군 바이러스의 새우에 대한 공격시험을 진행하였다. 상기 비브리오 균주의 경우, 2013년도 베트남 지역에서 분리한 AHPND (EMS) 유발 균주를 시험에 이용하였다. 상기 흰반점 증후군 바이러스의 경우, 2017년도 국내양식장에서 WSSV에 감염된 흰다리새우(Litopenaues vannamei)에서 분리한 바이러스를 이용하였다. 공격시험의 경우, 실시예의 사료 조성물을 새우에게 6주 동안 공급한 후, 동일한 무게(평균무게: 4.52g)의 새우를 그룹당 96마리씩 4 반복으로 배치하였다. 바이러스의 접종농도는 8.3 x 103 copies/ul으로 새우 한마리당 50ul를 주사기를 사용하여 새우 근육에 접종하였다. 마리 당 최종접종 농도는 4.1 x 104 copies/ul이다. 바이러스 접종 후, 2일 경과 후, 비브리오 세균감염을 진행하였다.
상기 세균은 TSB+ 배지를 사용하여 30oC, 150 rpm에서 24시간 배양하였고,Tank 당 1.3 x 105 CFU/ml 농도로 장염비브리오균 현탁액을 침지하였다. 침지 후 1시간마다 새우의 폐사 및 유영 상태를 확인하였다. 시험사료는 1일 3회(8:30, 13:30 및 18:30시)에 나누어 제한공급(어체중의 10 내지 12%) 하였고, 7일간 동안 폐사 정도를 관찰하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
Treatment Survival (%)
Trial
대조군 1 51.8±13.5
BS 그룹 1 62.50±14.7
표 13에 나타난 바와 같이, 바실러스 서브틸리스를 포함하는 실시예 1의 사료 조성물이 제공된 BS 그룹 1은 장염비브리오균 및 흰반점 증후군 바이러스의 새우에 대한 공격시험에 있어서, 비교예 1의 사료 조성물이 투여된 대조군 1에 비하여 높은 생존율을 보였다.
이상의 실시예를 통해, 본 출원에 따른 바실러스 서브틸리스를 포함하는 사료조성물은, 흰다리새우의 성장, 사료효율, 소화율, 사육수질 및 비특이적 면역력을 높일 수 있으며, 또한, 고단백 흰다리새우의 생산을 가능하게 함으로써 새우의 상품성을 높일 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11143P
수탁일자 : 20101214
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11144P
수탁일자 : 20101214
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11270P
수탁일자 : 20120322
[규칙 제26조에 의한 보정 05.03.2019] 
Figure WO-DOC-FIGURE-239
[규칙 제26조에 의한 보정 05.03.2019] 
Figure WO-DOC-FIGURE-240
[규칙 제26조에 의한 보정 05.03.2019] 
Figure WO-DOC-FIGURE-241

Claims (14)

  1. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 급성 간췌장 괴사증(AHPND)의 예방 또는 치료용 사료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스는 KCCM11143P 인 것인, 사료 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스는 유효성분 g 당 1 x 104 내지1 x 1011 CFU 균수를 갖는 것인, 사료 조성물.
  4. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    유효성분으로 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 급성 간췌장 괴사증 (AHPND)은 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)에 의해 유발되는 것인, 사료 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 사료 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 급성 간췌장 괴사증의 예방 또는 치료 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 개체는 새우인 것인, 방법.
  8. 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 흰반점 증후군(WSS)의 예방 또는 치료용 사료 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 흰반점 증후군(WSS)은 흰반점 바이러스(WSSV)에 의해 유발되는 것인, 사료 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스는 KCCM11143P 인 것인, 사료 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스는 유효성분 g 당 1 x 104 내지1 x 1011 CFU 균수를 갖는 것인, 사료 조성물.
  12. 제 8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    유효성분으로 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 사료 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 흰반점 증후군의 예방 또는 치료 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 개체는 새우인 것인, 방법.
PCT/KR2018/016893 2017-12-29 2018-12-28 바실러스 서브틸리스 균주를 유효성분으로 포함하는 급성 췌장염 괴사증 또는 흰반점 증후군의 예방 또는 치료용 사료 조성물 WO2019132605A1 (ko)

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BR112019007636A BR112019007636A2 (pt) 2017-12-29 2018-12-28 composição de alimentação para prevenir ou tratar a doença de necrose hepatopancreática aguda (ahpnd) ou síndrome da mancha branca (wss) que compreende uma cepa de bacillus subtilis como um ingrediente ativo
CN201880004734.3A CN110602950A (zh) 2017-12-29 2018-12-28 包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株的用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(ahpnd)或白斑综合征(wss)的饲料组合物
JP2019520990A JP6898989B2 (ja) 2017-12-29 2018-12-28 バチルス・サブチリス菌株を有効成分として含む急性肝膵臓壊死症(ahpnd)またはホワイトスポット病症候群(wss)の予防または治療用飼料組成物
AU2018395021A AU2018395021A1 (en) 2017-12-29 2018-12-28 Feed composition containing Bacilius subtilus strain as active ingredient for preventing or treating acute hepatopancreatic necrosis disease or white spot syndrome
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