JPH10167972A - 免疫賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】現在用いられている免疫賦活剤は、免疫担当細
胞を非特異的に活性化することにより微生物感染、腫瘍
等に対する生体の防御機構を高めるものであるが、有効
性において必ずしも満足しうるものではない。またこれ
らの免疫賦活剤は一般に作用の特異性が低いため、たと
えばＢリンパ球の活性化による全身性エリテマトーデ
ス、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患のような副作用
が懸念される。 【解決手段】ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属
する菌の中に、Ｔリンパ球共刺激作用とＢリンパ球活性
化抑制作用または/およびインターロイキン１２の産生
を選択的に促進する作用を有するものが存在することを
見出した。この菌の菌体またはその処理物を医薬として
投与または食品として摂取すると、副作用を伴うことな
く免疫を賦活させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、乳酸菌に属するラ
クトバチルス（ Lactobacillus ）の菌体またはその処
理物を含んでなる免疫賦活剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、
ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御
に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はＴ
リンパ球である。Ｔリンパ球はこれらの微生物や腫瘍
を、抗原受容体を介して認識することにより刺激を受
け、抗原特異的に活性化され、これらの異物を排除する
能力を高める。常に微生物に曝され、また細胞が変異し
ている生体内では、こうしたＴリンパ球は抗原受容体を
介して常に活性化される一方で、抗原受容体以外の経路
でも抗原非特異的に活性化されている。抗原特異的およ
び抗原非特異的のいずれの活性化においても、他からの
刺激、すなわち共刺激が加わるとＴリンパ球の活性化は
さらに促進される。現在用いられている免疫賦活剤は、
免疫担当細胞を非特異的に活性化することにより、微生
物感染、腫瘍に対する生体の防御機構を高めるものであ
るが、有効性において満足しうるものは少なく、また、
これらの免疫賦活剤は、一般に作用の特異性が低いた
め、たとえばＢリンパ球の活性化による全身性エリテマ
トーデス、慢性関節リュウマチ等の自己免疫疾患のよう
な副作用が懸念される。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、自体免疫賦
活作用を有し、さらに他の免疫賦活物質と併用すること
により、より強い免疫賦活作用を示し、実質的に副作用
がなくたとえば食品に配合して投与することもできる免
疫賦活剤を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するため免疫賦活剤に関する研究を重ねたとろ、
乳酸菌の１種であるラクトバチルス・プランタラム（La
ctobacillus plantarum）Ｌ−１３７株の菌体がＴリン
パ球共刺激作用を示すことを見いだした。また該菌体が
抗原受容体を介する刺激により活性化されたＴリンパ球
の活性をさらに上昇させ、また抗原受容体以外の経路に
より抗原非特異的に活性化されたＴリンパ球の活性をも
上昇させることを突き止めた。これらのＴリンパ球の活
性化に伴い、Ｔリンパ球のインターフェロン−γの産生
が増強される一方、Ｂリンパ球への抗原受容体を介する
刺激および抗原受容体以外の経路による活性化は抑制さ
れる事実も判明した。これとは別に該菌体がマクロファ
ージのインターロイキン１２の産生を選択的に促進する
作用を有していることも判明した。すなわち、ラクトバ
チルス・プランタラムＬ−１３７菌体は、抗原受容体を
介するＴリンパ球の活性化を上昇させることにより、生
体内で常時起こっている微生物および腫瘍細胞に対する
排除反応を高め、特にインターフェロン−γの産生を増
強することから、ウイルスや腫瘍に対する防御能を高め
る。しかし、単独ではリンパ球をほとんど活性化しない
ことから、生体にとって好ましくない免疫応答を誘導せ
ず、また、Ｂリンパ球の抗原受容体を介する活性化や抗
原非特異的な活性化を抑制することにより、免疫賦活に
伴い予測されるＢリンパ球のポリクローナルな活性化に
より誘導される自己免疫疾患等は増悪させない。またラ
クトバチリス・プランタラムＬ−１３７菌体は、腫瘍細
胞傷害性を有するナチュラルキラー細胞を活性化するサ
イトカインであるインターロイキン１２のマクロファー
ジからの産生を高める結果、腫瘍に対する防御能を特に
高めるとともに、後天性免疫不全症候群（AIDS）の発症
予防にも有用である。しかし腫瘍壊死因子αの産生は軽
度にしか上昇させないため、通常のマクロファージの活
性化剤により上昇する腫瘍壊死因子αにより引き起こさ
れる、発熱、体重減少、エンドトキシンショックへの感
受性増大などの副作用を誘導しない。このように、ラク
トバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は副作用がな
く常用に適した免疫賦活剤であり、また該菌体は抗原非
特異的なＴリンパ球の活性化を上昇させたり、またマク
ロファージによるインターロイキン１２の産生を促進す
るするので他の免疫賦活剤との併用も有効であることを
見いだし本発明を完成するに至った。すなわち、本発明
は、（１）ラクトバチルス（ Lactobacillus ）属に属
し、Ｔリンパ球共刺激作用とＢリンパ球活性化抑制作用
または／およびインターロイキン１２産生促進作用を有
する菌またはその処理物を含んでなる免疫賦活剤、
（２）菌がラクトバチルス・プランタラム（ Lactobaci
llus plantarum ）である前記（１）記載の免疫賦活
剤、および（３）菌がラクトバチルス・プランタラムＬ
−１３７株である前記（１）記載の免疫賦活剤、であ
る。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明に用いられる菌は、ラクト
バチルス属に属し、Ｔリンパ球共刺激作用およびＢリン
パ球活性化抑制作用または／およびマクロファージのイ
ンターロイキン１２産生を促進する作用を有するもので
あればどのような菌でもよい。菌のＴリンパ球共刺激作
用並びにＢリンパ球活性抑制作用は、たとえばマウス脾
臓細胞をフィトヘマグルチニン等のＴリンパ球増殖刺激
物質またはリポポリサッカライドなどのＢリンパ球増殖
刺激物質を含む培地で培養するときラクトバチルス属に
属する菌を添加し、一定期間培養して培地中の細胞のミ
トコンドリア代謝活性を臭化３−（４，５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウムを用いて測定する比色定量法により容易に判定
することができる。菌のマクロファージのインターロイ
キン１２産生促進作用は、たとえばマウス腹腔マクロフ
ァージを組織培養プレートで培養し、ラクトバチリス属
に属する菌を添加し一定期間培養して培地中のインター
ロイキン１２濃度をエンザイムイムノアッセイで測定す
ることにより容易に判定することができる。本発明の免
疫賦活剤との共刺激作用によりＴリンパ球の活性を上昇
させる物質、すなわち本発明の免疫賦活剤と併用しうる
免疫賦活剤としては、たとえばインターロイキン２など
のサイトカイン類、フィトヘマグルチニンなどのレクチ
ン類、抗ＣＤ３抗体などの抗Ｔリンパ球表面抗原抗体な
どが挙げられる。

【０００６】本発明に用いられるラクトバチルス属に属
する菌の代表的なものとしてラクトバチルス・プランタ
ラムＬ−１３７を挙げることができるが、この菌は工業
技術院生命工学工業技術研究所に平成７年１１月３０日
に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１７，微工研 菌寄第
１５３１７号として寄託されている。ラクトバチルス・
プランタラムＬ−１３７は、フィリピンの発酵食品ブロ
ングイスダ（Burong isda）から分離された微生物であ
り、特定の糖類（グルコン酸、アラビノース、ラムノー
スおよびスターチ）に対する資化性が、ラクトバチルス
・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＪＣＭ
１１４９基準株およびラクトバチルス・プランタラムＬ
−０５１（微工研菌寄第１１９１２号）と相違する。す
なわち、下記の糖類に対して次のような資化性を示す。 グルコン酸 − アラビノース − ラムノース − スターチ ＋ さらに、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７と前
記ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ １１４９基準
株およびラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１株と
の菌学的性質を対比すると、〔表１〕の通りである。

【０００７】

【表１】

【０００８】以上の菌学的性質、および細胞壁のペプチ
ドグリカンタイプがメゾ−ジアミノピメリン酸（meso-d
iaminopimelic acid）であること、さらに、Ｌ−１３７
菌株と２２タイプの乳酸菌基準株との間での DNA-DNA交
雑実験法を行ったところ、Ｌ−１３７菌株はラクトバチ
ルス・プランタラムにのみ強くDNAの相同性が得られた
ことにより、本発明に用いられる微生物はラクトバチル
ス・プランタラムと同定された。本発明の微生物につい
ては、Journal of Fermentation and Bioengineering,
Vol.73, No.3, 193-197(1992)及び Vol. 80, No.2, 124
-130(1995)にも報告されている。本発明の免疫賦活剤
は、ラクトバチルス属に属し、Ｔリンパ球共刺激作用と
Ｂリンパ球活性化抑制作用を有する菌を天然培地、合成
培地、半合成培地などの培地に培養することにより得る
ことができる。培地としては、窒素源および炭素源を含
有するものが用いられる。窒素源としてはたとえば、肉
エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、
アミノ酸等であり、炭素源としては、たとえば、グルコ
ース、キシロース、フラクトース、イノシトール、水ア
メ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等
が用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸
アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食
塩、鉄、マンガン、モリブデン更に各種ビタミン類その
他を添加することができる。

【０００９】培養温度は２５〜４０℃、好ましくは２７
〜３５℃であり、培養時間は１２〜４８時間程度であ
り、通気振盪してもよい。培地のｐＨは３〜６、好まし
くは４〜６である。培養終了後菌体を採取し蒸留水を加
え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要により
その操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採
取する。採取された菌体は生菌のまま、またはたとえば
過熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化
して投与に適した剤型にすることもできる。分離された
生菌体、死菌体はさらに摩砕や破砕処理をし、得られた
処理物を必要により加熱滅菌、無菌濾過し、濾液を凍結
乾燥して製品とすることもできる。菌体の処理物にはた
とえば、上記摩砕物、破砕物、それらからの抽出液、凍
結乾燥品が含まれる。また、本発明に用いられる乳酸菌
の一種、ラクトバチルス・プランタラム Ｌ−１３７株
は、元々発酵食品であるブロングイスダから分離された
ものであり、食品、たとえば果菜類、穀類から選択され
た少なくとも１種または、果菜類や穀類を発酵可能な形
態に処理したもの、たとえば切断物、粉砕物、摩砕物、
搾汁、搾汁濃縮物を本発明において用いられる菌により
発酵させた菌を含む発酵物をそのまま用いることがで
き、これも本発明の好ましい態様の１つである。前記の
発酵法を利用すると、野菜汁に対して、フレッシュなニ
ンジン汁などを得るためのフレッシュスクイーズ法など
の特別な前処理を施す必要がなく、また乳成分を添加す
る必要がなく、乳酸菌の果菜類などの処理物（野菜汁な
ど）に対する高い発酵能により、乳酸菌を多量に含み味
覚的にも極めて優れた発酵物を得ることができる。ま
た、被発酵処理物が臭いのきつい果菜類や穀類を含んで
いても、野菜類などの特有の不快臭や加熱による不快臭
を顕著に低減できるとともに、風味を改善でき、極めて
容易に食することができる発酵食品が得られる。しか
も、サイレージと異なり発酵食品から分離された食習慣
のある乳酸菌であるため、本発明の微生物は安全性も高
い。

【００１０】上述の乳酸菌発酵物は、果菜類及び穀類か
ら選択された少なくとも一種の処理物を前記乳酸菌によ
り発酵させることにより得られる。前記果菜類には、種
々の可食性植物、例えば、野菜類（例えば、ニンジン、
トマト、ホウレン草、ぱせり、シソ葉、大葉、芽キャベ
ツ、小松菜、カボチャ、大根葉、ピーマン、ケール、カ
ンショ葉、春菊、セリなどの緑黄色野菜類、セロリ、キ
ャベツ、アスパラガス、キュウリ、スイカなどの他の野
菜類）、リンゴ、バナナ、パパイヤ、アボガド、ミカ
ン、グレープフルーツ、レモン、パイナップル、ピー
チ、柿、イチゴ、ブドウ、メロン、ココナッツなどの果
物類などが含まれる。穀類には、米、トウモロコシ、大
豆、小麦、ライ麦などが含まれる。これらの果菜類など
は単独で又は二種以上組み合わせて使用でき、必要に応
じて、これらの果菜類などは、ジャガイモ、サツマイモ
などのイモデンプン類と併用してもよい。好ましい果菜
類には、ニンジンなどの緑黄色野菜類、バナナなどの果
物類、米などの穀類などが含まれる。また、処理物とし
ては、切断物、粉砕物、摩砕物、搾汁、搾汁濃縮物など
が単独又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい
処理物には、野菜汁、果汁などの搾汁や搾汁濃縮物など
の搾汁類が含まれる。この搾汁類において、ニンジンを
用いる場合、ニンジン汁の濃度はBrix２〜３０程度の範
囲から選択できる。また、５０重量％以上のニンジン処
理物を含む処理物は、発酵飲料などの風味を改善する上
で有用である。

【００１１】前記果菜類などの処理物は、通常、ブラン
チング処理及び／又は殺菌処理に供された後、前記乳酸
菌による発酵に供される。ブランチング処理は、前記果
菜類などやその処理物、特に果菜類やその切断物を加熱
処理し、酵素活性を失活させることにより行うことがで
き、ブランチング処理の後、遠心分離やフィルタープレ
スなどの方法で搾汁しジュースを得る場合が多い。ま
た、殺菌処理は、ブランチング処理された前記果菜類な
どやその処理物、特に搾汁類について行う場合が多い。
なお、ブランチング処理および殺菌処理は、風味を損な
わない範囲で選択でき、ブランチング処理は、慣用の方
法、例えば、必要に応じてオートクレーブを用い、７０
〜１００℃で短時間処理することにより行うことができ
る。殺菌処理は、慣用の方法、例えば、７０〜１２５℃
程度の温度又は高温短時間で加熱殺菌する方法、紫外線
などの光線を照射する方法などが採用できる。前記微生
物による発酵は、前記乳酸菌を搾汁類などの処理物に直
接接種して行ってもよいが、通常、適当な培地や前記処
理物を用いて馴化培養した前記乳酸菌をスターターとし
て搾汁類などの処理物に接種して行う場合が多い。発酵
は、慣用の方法、例えば、処理物に対して０.５〜３重
量％程度のスターターを接種し、２５〜４０℃（例え
ば、２５〜３８℃）、好ましくは２７〜３８℃（例え
ば、２７〜３５℃）程度で行うことができる。発酵時間
は、果菜類などの処理物の種類などに応じて、例えば、
数時間〜数日間程度の範囲から選択できる。本発明の好
ましい態様には、ニンジンなどの緑黄色野菜、果物及び
穀類のうちの少なくとも一種の処理物（特に野菜および
果物のうち少なくとも一種から得られた搾汁類）を前記
乳酸菌で発酵させ、乳酸菌発酵飲料（緑黄色野菜ジュー
ス、果物ジュースなど）やその加工品（緑黄色野菜ゼリ
ー，スプレットなど）として得る方法が含まれる。

【００１２】なお、発酵に際しては、必要に応じて、他
の微生物、例えば、乳酸菌（ラクトバチルス・プランタ
ラム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラム
ノサスなど）やエンテロコッカス属微生物（エンテロコ
ッカス・フェカーリスなど）、酵母などを併用してもよ
い。さらに、必要に応じて、前記処理物に、種々の添加
剤、例えば、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、植物繊
維、糖類、蜂蜜などの甘味料、香料、牛乳、脱脂粉乳な
どの乳成分、果汁などを添加して発酵させてもよく、得
られた乳酸菌発酵物に前記添加剤を添加してもよい。こ
のようにして、果菜類などの処理物を前記乳酸菌により
発酵させると、得られる乳酸菌発酵物の風味を改善でき
る。この方法により得られた乳酸菌発酵物は、被発酵処
理物が臭いのきつい果菜類や穀類を含んでいても、不快
臭を顕著に低減できるとともに、加熱による不快臭も抑
制できる。また、乳酸菌の発酵により適度な酸味（例え
ば、ｐＨ４〜５程度）を呈するとともに、官能的に優れ
た風味を有しており、極めて容易に食することができ
る。

【００１３】本発明の免疫賦活剤は、自体公知の食品あ
るいは、食品成分、医薬担体または賦形剤と自体公知の
方法で合して、免疫力を高める食品や医薬剤としても利
用可能である。用いる食品あるいは、食品成分、医薬担
体または賦形剤は特に限定するものではなく、当該免疫
賦活剤の具体的用途に応じて当業者が適宜選択できる。
また免疫賦活剤の形態も特に限定する物ではなく、具体
的用途に応じて種々の固体や液体の形態とすることがで
きる。本発明の免疫賦活剤は、医薬として用いる場合、
経口投与あるいは、非経口投与が考えられるが、一般的
に請求項１に記載の有効成分のいずれか、あるいは組み
合わせて用いることが可能であり、その投与量は、投与
形態にもよるが、経口投与の場合有効成分として成人１
日当たり４０ｍｇ〜４０ｇであり、静注の場合は０.１
ｍｇ〜１ｇである。本発明の免疫賦活剤を食品として用
いる場合、調味料、畜肉加工品、水産加工品、農産加工
品、ステープル、調味食品、調味済食品、デザート類、
乳油製品、菓子、スナック菓子等の形態で提供すること
も可能である。本発明の免疫賦活剤は、たとえば、ウイ
ルス、バクテリヤ等の微生物による感染症や各種悪性腫
瘍などの予防・治療に有効である。

【００１４】

【実施例】以下に実施例および試験例をあげて本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明はそれらによって限
定されるものではない。 実施例１ ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥菌体の製
造方法 乳酸菌培養培地であるＧＹＰ培地のグルコースの代わり
にスターチを加えた培地２００ｍｌにラクトバチルス・
プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接
種し、３２℃で２４時間前培養を行った。その後、６Ｌ
のＧＹＰ培地にその前培養した培養液をスターターとし
て１重量％接種し、３２℃にて２４時間静地培養した。
培養後、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した。そし
て、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペ
ーストを生理食塩水に良く分散し、５０００ｒｐｍで３
５分遠心分離したのち、上清を除き菌体を集めた。これ
を３回繰り返したのち、蒸留水に分散した。そして７０
℃で１０分間殺菌した。これを凍結乾燥し、乾燥菌体を
７.０７ｇ得た。

【００１５】実施例２ ４倍濃縮ニンジン汁のラクトバチルス・プランタラムＬ
−１３７発酵物の製造方法 Ｌ−１３７乾燥菌体の作成方法と同様の方法で６リット
ルのＧＹＰ培地で３２℃、２４時間培養したのち生理食
塩水中に分散、遠心分離することにより集めた菌体ペー
ストを４倍濃縮ニンジン汁（人参１／６濃縮搾汁 宮崎
農協製を蒸留水ににより希釈したもの）３００ｍｌに添
加し、３２℃で２４時間培養した。そして７０℃で１０
分間殺菌した。こうして得られたニンジン発酵液を適当
量の蒸留水で希釈し、凍結乾燥した。凍結乾燥物として
約７７.４ｇを得た。

【００１６】試験例１ 本試験例では、実施例１で得たラクトバチルス・プラン
タラムＬ−１３７菌体を用いて、マウス脾臓リンパ球の
増殖反応に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１
３７菌体のＴリンパ球共刺激効果およびＢリンパ球抑制
効果を検証した。マウス（B10．A、雌、8週令）から無
菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ １６４０培地中で脾臓
を押し潰し、＃２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を
得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置によ
り測定した後、細胞数を５×１０⁶／ｍｌの濃度にＲＰ
ＭＩ １６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレート
に１穴あたり１００μｌを播種した。Ｂリンパ球増殖刺
激物質のリポポリサッカロイド（Difco 社製）を２００
μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した
液、Ｂリンパ球増殖刺激物質の抗マウスイムノグロブリ
ンＭ（Cappel 社製）を２００μｇ／ｍｌの濃度でＲＰ
ＭＩ １６４０培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激
物質のフィトヘマグルチニン（Difco 社製）をＲＰＭＩ
１６４０培地で４００倍希釈した液、およびＲＰＭＩ
１６４０培地を、それぞれ１穴当たり５０μｌ播種した
脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群（１）、Ｂ
リンパ球刺激群（２）、Ｔリンパ球刺激群（１）、無刺
激群とした。Ｔリンパ球刺激群（２）として、細胞播種
前にＴリンパ球増殖刺激物質の抗マウスＣＤ３抗体（Ce
darlane 社製）を１０μｇ／ｍｌの濃度でホウ酸緩衝液
に溶解した液を１穴当たり１００μｌ加え、３７℃で３
時間放置し、抗マウスＣＤ３抗体を各穴に付着させ、３
時間後にＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄後、ＲＰＭＩ １
６４０培地を１穴当たり５０μｌ加えた穴に細胞を播種
した。これらの５群にＲＰＭＩ １６４０培地（対照）
あるいはラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体
を５０μｇ／ｍｌ、１２,５μｇ／ｍｌおよび３.１３μ
ｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液
をそれぞれ１穴当たり５０μｌ加え、３７℃の５％炭酸
ガス培養器内で２日間培養し、培養後代謝活性を調べ
た。細胞代謝活性は、培養の終わる３時間前に臭化３−
（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフ
ェニル−２Ｈテトラゾリウムを５ｍｇ／ｍｌの濃度でＲ
ＰＭＩ １６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０μ
ｌ加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶
液を１穴当たり５０μｌ加え、３７℃で１日放置後、マ
イクロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０ｎｍを
測定することにより細胞代謝活性を求めた。〔表２〕に
その結果を示す。

【００１７】

【表２】 〔表２〕から明らかなごとく、ラクトバチルス・プラン
タラムＬ−１３７菌体は、脾臓細胞が刺激を受けていな
い無刺激群では、わずかに細胞代謝活性を上昇させたに
すぎなかったが、抗原受容体を介するＴリンパ球刺激群
（２）および抗原受容体以外の経路のＴリンパ球刺激群
（１）では顕著に細胞代謝活性を上昇させ、ラクトバチ
ルス・プランタラムＬ−１３７菌体のＴリンパ球共刺激
効果が認められた。一方、ラクトバチルス・プランタラ
ムＬ−１３７菌体は、抗原受容体を介するＢリンパ球刺
激群（２）および抗原受容体以外の経路のＢリンパ球刺
激群（１）では細胞代謝活性の上昇を抑制する作用が認
められた。

【００１８】試験例２ 本試験例では、実施例１で得たラクトバチルス・プラン
タラムＬ−１３７菌体を用いて、マウス脾臓リンパ球の
インターフェロン−γ産生反応に対するラクトバチルス
・プランタラムＬ−１３７菌体の増強効果を検証した。
マウス（B10．A、雌、7週齢）から無菌的に脾臓を摘出
し、ＲＰＭＩ １６４０培地中で脾臓を押し潰し、＃２
００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮
遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数
を５×１０⁶／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ １６４０培地で調
製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌ
を播種した。Ｔリンパ球増殖刺激物質のフィトヘマグル
チニン（Difco 社製）をＲＰＭＩ１６４０培地で４００
倍希釈した液を１穴当たり５０μｌ播種した脾臓細胞浮
遊液に加えた。これにＲＰＭＩ １６４０培地（対照）
あるいはラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体
を２００μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でＲ
ＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれぞれ１穴当た
り５０μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で３日
間培養し、培養後の培養上清のインターフェロン−γを
エンザイムイムノアッセイで測定した。エンザイムイム
ノアッセイは、ハムスター抗マウスインターフェロン−
γ抗体（Genzyme 社製）をホウ酸緩衝液で３μｇ／ｍｌ
に調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり
１００μｌ加え、５℃で３日間放置しハムスター抗マウ
スインターフェロン−γ抗体を各穴に付着させたプレー
トを用いて行った。培養上清を１穴当たり５０μｌ加え
室温で９０分間放置し、培養上清のインターフェロン−
γをプレートに付着したハムスター抗マウスインターフ
ェロン−γ抗体と結合させた。洗浄後ラット抗マウスイ
ンターフェロン−γ抗体を加え、プレートに結合させた
インターフェロン−γに結合させた。洗浄後ペルオキシ
ダーゼで標識した抗ラットＩｇＧ抗体を加え、プレート
に結合させたラット抗マウスインターフェロン−γ抗体
に結合させた。洗浄後、過酸化水素０.００６％とオル
トフェニレンジアミン０.１％を含有するリン酸緩衝液
を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応さ
せ、反応を１.５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリ
ーダーで吸光度４９２ｎｍを測定し、リコンビナントマ
ウスインターフェロン−γで作成した標識曲線から、培
養上清中のインターフェロン−γの濃度を求めた。〔表
３〕にその結果を示す。

【００１９】

【表３】 〔表３〕から明らかなごとくラクトバチルス・プランタ
ラムＬ−１３７菌体はフィトヘマグルチニンにより誘導
されるインターフェロン−γの産生を大幅に上昇させ
た。

【００２０】試験例３ 本試験例では、実施例１で得たラクトバチリス・プラン
タラムＬ−１３７菌体を用いて、マウス腹腔マクロファ
ージのインターロイキン１２産生性に対するラクトバチ
リス・プランタラムＬ−１３７菌体の促進効果を検証し
た。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１５週齢）の腹腔に
無菌的にＲＰＭＩ １６４０培地を注入し、腹部を良く
揉んだ後、注入したＲＰＭＩ １６４０培地を回収し腹
腔細胞浮遊液を得た。腹腔細胞浮遊液の細胞数とそれに
含まれるマクロファージの割合を自動血球計測装置で測
定した後、マクロファージとして１×１０⁶／ｍｌの細
胞数にＲＰＭＩ １６４０培地で調製し、９６穴組織培
養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。３７℃
の５％炭酸ガス培養器内に２時間放置し、腹腔マクロフ
ァージを各穴に付着させ、２時間後にＲＰＭＩ １６４
０培地で洗浄後、ＲＰＭＩ １６４０培地を１穴当たり
１００μｌ加えた。これにＲＰＭＩ １６４０培地（対
照）あるいはマクロファージ活性化物質のリポポリサッ
カライド（Difico 社製）を０.２μｇ／ｍｌの濃度でＲ
ＰＭＩ １６４０培地に溶解した液、あるいはラクトバ
チリス・プランタラムＬ−１３７菌体を０.２μｇ／ｍ
ｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０培地に溶解した液をそれ
ぞれ１穴当たり１００μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス
培養器内で１５時間培養し、培養後の培養上清のインタ
ーロイキン１２と腫瘍壊死因子αをエンザイムイムノア
ッセイで測定した。エンザイムイムノアッセイは、ラッ
ト抗マウスインターロイキン１２ ＩｇＧ２ａ抗体（Gen
zyme 社製）あるいはハムスター抗マウス腫瘍壊死因子
α＆β抗体（Genzyme 社製）をホウ酸緩衝液で６μｇ／
ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当
たり１００μｌ加え３７℃で１日間放置し、ラット抗マ
ウスインターロイキン１２ ＩｇＧ２ａ抗体あるいはハ
ムスター抗マウス腫瘍壊死因子α＆β抗体を各穴に付着
させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり
５０μｌ加え室温で９０分間放置し、培養上清のインタ
ーロイキン１２あるいは腫瘍壊死因子αをプレートに付
着したラット抗マウスインターロイキン１２ＩｇＧ２ａ
抗体あるいはハムスター抗マウス腫瘍壊死因子α＆β抗
体と結合させた。洗浄後ラット抗マウスインターロイキ
ン１２ ＩｇＧ １抗体（Genzyme 社製）あるいはラビッ
ト抗マウス腫瘍壊死因子α抗体（Genzyme 社製）を加
え、プレートに結合させたインターロイキン１２あるい
は腫瘍壊死因子αに結合させた。洗浄後ペルオキシダー
ゼで標識した抗ラットＩｇＧ １抗体あるいは抗ラビッ
トＩｇＧ抗体を加え、プレートに結合させたラット抗マ
ウスインターロイキン１２ＩｇＧ １抗体あるいはラビ
ット抗マウス腫瘍壊死因子α抗体に結合させた。洗浄
後、過酸化水素０.００６％とオルトフェニレンジアミ
ン０.１％を含有するリン酸緩衝液を１穴当たり１００
μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を１.５Ｎ硫
酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４９２
ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン
１２あるいは腫瘍壊死因子αで作成した標準曲線から、
培養上清中のインターロイキン１２あるいは腫瘍壊死因
子αの濃度を求めた。〔表４〕にその結果を示す・

【００２１】

【表４】 〔表４〕から明らかなごとくラクトバチリス・プランタ
ラムＬ−１３７菌体は、マクロファージからのインター
ロイキン１２の産生を大幅に上昇させたが、腫瘍壊死因
子αの産生は軽度にしか上昇させなかった。強力なマク
ロファージ活性化剤であるリポポリサッカライドのサイ
トカイン産生促進作用と比較すると、ラクトバチリス・
プランタラムＬ−１３７菌体が選択的にマクロファージ
のインターロイキン１２の産生を上昇させることが明ら
かとなった。

【００２２】

【発明の効果】本発明の免疫賦活剤は、有効成分の生産
性が容易で且つ高く、また得られた免疫賦活剤は人体に
投与した場合安全性が高く且つ免疫賦活効果も高く単独
または他の免疫賦活剤と併用して、ウイルス、バクテリ
ヤ等による感染症、悪性腫瘍等の予防・治療に用いるこ
とができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 室山 幸太郎 兵庫県伊丹市鋳物師２丁目69番地 メゾ ン・ド・オーク303号 (72)発明者 吉開 泰信 愛知県名古屋市千種区園山町１丁目９−２

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ラクトバチルス（ Lactobacillus ）属に
   属し、Ｔリンパ球共刺激作用とＢリンパ球活性化抑制作
   用または／およびインターロイキン１２産生促進作用を
   有する菌またはその処理物を含んでなる免疫賦活剤。
2. 【請求項２】菌がラクトバチルス・プランタラム（ Lac
   tobacillus plantarum）である請求項１記載の免疫賦活
   剤。
3. 【請求項３】菌がラクトバチルス・プランタラムＬ−１
   ３７株である請求項１記載の免疫賦活剤。