WO2004084922A1

WO2004084922A1 - 魚介類用感染防御剤

Info

Publication number: WO2004084922A1
Application number: PCT/JP2004/003884
Authority: WO
Inventors: Shunsuke Koshio; Yoshihiro Yamamoto
Original assignee: Takeda Food Products, Ltd.
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2004-03-22
Publication date: 2004-10-07
Also published as: JPWO2004084922A1

Abstract

ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus　plantarum）の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤。

Description

明細書魚介類用感染防御剤技術分野

本発明は、魚介類用感染防御剤、魚介類用飼料、及び魚介類生存率改善方法に関する。背景技術

従来から、魚介類の養殖場において、養殖飼料の散逸による底質の悪化や過密養殖等の環境悪化にともない、魚介類の感染症が多発しており、魚介類養殖産業に甚大な被害をもたらしている。魚介類の感染防御剤として、抗生物質が汎用されており、また、生物製剤も知られている。生物製剤としては、例えば、バチラス ·サチラス、ブレピバクテリウム ·ラクトフアーメンタム、コリネバクテリゥム ·ダル夕二カム、ェセリシァ ·コリ、ラク卜バチラス ·ァシドフィラス、ストレプトコッカス ·サ一モフィラス、ス卜レプトマイセス ·夕ナシェンシス又はビフィドパクテリゥム ·サーモフィラムなどの細菌の殺菌処理物を含有する魚類 ·甲殻類のウィルス病及び細菌病の予防治療剤が報告されている

(特許文献 1、 2 )。

また、アルテロモナス ·ハ口プランクティスを甲殻類の養殖に使用することにより、病害の発生を抑制すると共に、甲殻類の個体の成長を促進する方法が報告されている（特許文献 3 )。さらに、ェンテロコッカス ·フエシゥムを配合したことを特徴とする魚介類用飼料（特許文献 4 ) や通常の酵母よりセレンを多く含有するパンイーストを含有する養魚用飼料が報告されている（特許文献 5 ) o

しかしながら、抗生物質を感染防御剤として用いる場合、抗生物質が魚介類に残留し、耐性菌の発現やその魚介を食した人体への悪影響が懸念される。また、特許文献 1、 2の生物製剤は、抗菌力や保存安定性、水中安定性において必ずしも満足すべきものではない。さらに、特許文献 3〜 5の生菌を用いる生物製剤は、製造工程や製剤の保存に厳密な管理が必要であるという問題点がある。

【特許文献 1】特開平 6— 181656号公報

【特許文献 2】特開平 4— 193832号公報

【特許文献 3】特開平 5— 76351号公報

【特許文献 4】特許第 2727517号

【特許文献 5】特許第 3013871号発明の開示

本発明は、顕著な抗菌力を示し、保存安定性、水中安定性に優れた、生物製剤としての魚介類用感染防御剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ラクトバチルス ·プランタラム (Lactobacillus pi ant arum) の死菌体又はその処理物を含有する生物製剤が、上記問題点を一挙に解決することを見出した。

すなわち、本発明は、

(1) ラクトバチルス ·プランタラム (Lactobacillus pi ant arum) の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤、

(2) ラク卜バチルス ·プランタラム (Lactobacillus pi ant arum) が、ラクトバチルス 'プランタラム L— 137株（Lactobacillus pi an tar urn L - 1 37、受託番号 FERM BP- 08607) であることを特徴とする上記

(1) 記載の魚介類用感染防御剤、

(3) ラクトバチルス ·プラン夕ラム（Lactobacillus pi ant arum) の死菌体又はその処理物の含有量が、全体量に対して 0. 01〜95質量％でぁることを特徴とする上記（1) 又は（2) に記載の魚介類用感染防御剤、

(4) 細菌感染防御剤であることを特徴とする上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、

(5) ウィルス感染防御剤であることを特徴とする上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、

(6) 寄生虫感染防御剤であることを特徴とする上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、

( 7 ) 魚介類が淡水魚又は海水魚であることを特徴とする上記（ 1 )〜（ 6 ) のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、

(8) 魚介類が甲殻類であることを特徴とする上記（1) 〜（6) のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、

( 9 ) 補体活性増強効果又は好中球数増加効果を奏する上記（ 1 ) 〜（ 8 ) のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤、

(10) 上記（1) 〜.（9) のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤を含有する魚介類用飼料、及び

(11) 上記（1) 記載の魚介類用感染防御剤又は上記（10) 記載の魚介類用飼料を魚介類に投与することを特徴とする魚介類の生存率改善方法、に関する。発明を実施するための最良の形態

本発明に用いられるラクトバチルス ·プランタラムに属する菌の代表的なものとして、ラクトバチルス ·プランタラム L— 137、ラクトバチルス ·プランタラム J CM 1 149基準株、ラクトバチルス ·プラン夕ラム L— 051 (微ェ研菌寄第 1 19 12号）などを挙げることができるが、ラクトバチルス ·プランタラム L— 137が最も好ましい。上記のラクトバチルス ·プラン夕ラム L一 137は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に、受託番号 F E RM B P— 0 8 6 0 7号（平成 7年 1 1月 3 0日に寄託された F E RM P— 1 5 3 1 7号より移管）として寄託されている。

上記の本発明に用いる菌は天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することにより得ることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としては、たとえば、肉エキス、ペプトン、ダルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が用いられ、炭素源としては、たとえば、グルコース、キシロース、フラクト一ス、イノシ 1 ^一ル、マル 1 ス、水ァメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニゥム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデンなどを添加することができ、更に各種ビタミン類その他を添加することができる。培養温度は約 2 5〜4 0 °C, 好ましくは約 2 7〜 3 5 °Cであり、培養時間は約 1 2〜 4 8時間程度であり、通気振盪してもよい。培地の p Hは約 3〜6、好ましくは約 4〜 6である。 . . . 培養終了後、菌体を採取した後、死菌体を調製してもよいし、又は菌体を培饕液から一旦分離することなく、培養液中の菌体を死菌体にし、その死菌体を採取してもよい。菌体を採取する方法としては、例えば培養液に蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採取する方法がある。死菌体は、採取された生菌ぁるいは生菌を含んだ培養液ごと、たとえば加熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化することにより得られる。加熱処理により死菌体を得る場合、加熱温度は通常約 6 0〜1 0 0 °C、好ましくは約 7 0〜 9 0 °Cである。加熱手段としては、ヒー夕一を用いる公知の手段であってよい。加熱時間は所望の温度に達した後、通常約 5〜4 0分、好ましくは約 1 0〜3 0分である。死菌体の処理物は、例えば、死菌体を凍結乾燥や噴霧乾燥することによって得られる。また、死菌体にデキストリンゃセルロースなどの適当な賦形剤を加えて、これを凍結乾燥や噴霧乾燥することによつても得られる。死菌体の処理物はまた、死菌体の抽出物であってもよい。

本発明における魚介類としては、特に限定されず、淡水魚、海水魚、甲殻類のいずれであってもよく、また、養殖魚類、観賞魚類のいずれであってもよい。淡水魚としては、ゥナギ、コィ、ニジマス、ァュ、ティラピア、フナ、金魚類 (例えば、ランチユウ、和金、コメット、朱文金、オランダシシガシラ、出目金等)、グッピー、ァピストグラマ、デイスカス等が挙げられ、海水魚としては、クロマグロ、プリ、タイ、ギンザケ、マアジ、ヒラメ、カレイ、クロソィ、トラフグ、カンパチ等が挙げられる。また、淡水魚及び海水魚のいずれにも属するものとして、サケ ·マス類等が挙げられる。甲殻類としては、クルマエビ、ブラックタイガー、ゥシェビ、コゥライェビ、ガザミ等が挙げられる。

魚介類の病気の原因は、病原性細菌、ウィルス、寄生虫等による感染症が主であり、これらの感染症のいずれに対しても本発明の魚介類用感染防御剤は適用できる。細菌感染における細菌としては、大腸菌、.サルモネラ菌、パスッレラ菌、ビブリオ病菌、連鎖球菌、糸状菌などが挙げられる。ウィルス感染におけるウィルスとしては、バキュロウィルス、ラブドウィルス、ェピ類を死滅させるウィルス ( P R D V： Penaeid Rod-Shaped D NA Vi rus) などが挙げられる。寄生虫感染における寄生虫としては、通称はだむしと呼ばれる皮膚寄生虫 {例えば、ベネデニア ·セリオラエ (Benedeni a ser iol ae) , ベネデニア .ホシナイ (Benedenia hoshinai )、べ不ァニァ · ェピネフエリ (Benedenia epinephel i) , ネオべ二デニア 'エスピー（Neobenedeni a sp. ) など }、通称えらむしと呼ばれる魚鰓寄生虫 {例えば、へテラキシネ · ヘテロセル力 (Heteraxine heterocerca ゼゥクサフタ ·ジャポニカ (Zeuxapia j aponic a) , ビバギナ ·タイ（Bivagina tai ) など }、コクシジゥムなどが挙げられる。なお、前記コクシジゥムには、トラ河豚が罹患する通称コクシジゥム症の原因である粘液胞子虫ゃ微胞子虫などの寄生虫が含まれる。本発明の魚介類用の感染防御剤は、ラクトバチルス · プランタラム

(Lactobaci l lus pi ant arum) の死菌体又はその処理物そのものであってよいし、死菌体又はその処理物を賦形剤又は希釈剤と混合した製剤であってもよい。製剤全体に対する死菌体又はその処理物の配合割合は好ましくは約 0 . 0 1〜 9 5質量％であり、より好ましくは約 0 . 1〜5 0質量％である。剤型としては、ペレット剤、錠剤、液剤、粉剤、粒剤、ペース卜剤などが挙げられる。そのような製剤は魚介類に接触させたり、経口で与えることができる。

固状の賦形剤又は希釈剤としては、例えば、魚粉、骨粉、スキムミルク、綿実粕、小麦粉、小麦胚芽、米ぬか、ビール酵母、セルロース、ビタミン類（例えば一カロチン、ビタミン D ₃、メナジオン一亜硫酸水素ナトリウム、ひ一トコフエロール、チアミン一硝酸塩、リボフラビン、ピリドキシン一塩酸塩、シァノコバラミン、ピオチン、イノシ] ^一ル、ニコチン酸、パントテン酸カルシゥム、葉酸、塩化コリン、パラアミノ安息香酸、ビタミン C等）、又はミネラル類（例えば硫酸マグネシウム、リン酸 2ナトリウム、リン酸 2ナトリウムカリウム、クェン酸鉄、乳酸カルシウム、水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、ヨウ素酸カルシウム、硫酸コバルト等）などのいわゆる飼料原料が挙げられる。液状の賦形剤又は希釈剤としては、水あるいは水とァルコールとの混合物などが挙げられる。本発明の魚介類用感染防御剤は、ラクトバチルス ·プランタムの死菌体又はその処理物を上記した賦形剤又は希釈剤と混合することによって容易に製造できる。混合に際して、所望により加熱し、フレーク状製剤を得ることもできる。このようにして製造された本発明の製剤は、魚介類用の飼料として使用されてよい。飼料として使用される場合、飼料中の死菌体又はその処理物の濃度は好ましくは約 0 p p mを超え 2 0 0 p p m以下であり、より好ましくは約 0 . l〜2 0 0 p p mであり、最も好ましくは 0 . l〜5 0 p p mである。

本発明製剤の魚介類感染防御のメ力ニズムは、補体活性増強及び好中球数増加によるものと考えられる。

本発明の魚介類用感染防御剤を、魚介類に投与すると魚介類の感染症を有効に予防又は治療することができ、魚介類の体重増加が観察され、魚介類の成長、生存率がアップする。

本発明の魚介類用感染防御剤は、上記乳酸菌の死菌体又はその処理物に換算して、魚介類の体重 1 kg当たり 1日 0. 0005〜5mg与えるのが好ましく、 0. 005〜0. 5mg与えるのがより好ましく、 0. 005〜0. 12 5 mg与えるのが最も好ましい。実施例

以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。なお、実施例中の「％」は「質量％」を意味する。実施例 1

[ラク卜バチルス ·プランタラム L一 137株 (Lactobacillus pi ant arum L-

137) の死菌体を含むペレツト剤の製造]

(菌の培養）

グルコース 1 %、酵母エキス 1 %、ポリペプトン 0. 5%、肉エキス 0. 2%、酢酸ナトリウム 0. 2%, 硫酸マンガン · 4水和物 0. 001%、硫酸鉄 · 7 水和物 0. 001%、食塩 0. 001%、ショ糖脂肪酸エステル 0. 05%含む培地 6 Lにラクトバチルス ·プラン夕ラム L一 137 (受託番号 FERM BP— 08607) 株を接種し、 32 °Cで 24時間培養した。培饕後、培養液を 5000 r pmで 35分間遠心分離し菌体を集めた。得られた菌体を生理食塩水によく分散し、 5000 r pmで 35分間遠心分離した後、上清を除き菌体を集めた。この操作を 3回繰り返した後、菌体をイオン交換水に分散し、 7 0°C 10分間加熱した後、凍結乾燥することにより、加熱死菌体を約 7 g得た。 (死菌体からペレツ卜剤の製造）

ブラウンフィッシュミール 65. 6質量部、 a—スターチ 3. 4質量部、デキストリン 3. 4質量部、ダイズレシチン 4. 2質量部、メナジオン一亜硫酸水素ナトリウム 0. 01428質量部、チアミン一硝酸塩 0. 01797質量部、リボフラビン 0. 05981質量部、ピリドキシン一塩酸塩 0. 0142 8質量部、シァノコバラミン 0. 00002質量部、セルロース 0. 5986 9質量部、ピオチン 0. 00181質量部、イノシトール 1. 19769質量部、ニコチン酸 0. 23954質量部、パントテン酸カルシウム 0. 0838 6質量部、葉酸 0045質量部、塩化コリン 2. 44855質量部、パラァミノ安息香酸 0. 1 1929質量部、ビタミン CO. 04681質量部、ミネラルミックス 4. 3質量部、イノシン酸 1質量部、ベ夕イン 0. 6質量部、ァラニン 0. 4質量部及び活性化ダルテン 5. 0質量部からなる飼料原料をよく混合し、キッチンエンドで 10分間混合した。これに、ビタミン含有鳕肝油（鳕肝油 7質量部に、）3—力ロチン 0. 02996質量部、ビタミン D₃ 0. 00301質量部、 α—トコフエロール 0. 1 1993質量部を加え、超音波洗浄機を用いて混合したもの）を加えた。これに、ラクトバチルス。プラン夕ラム L一 1 37加熱死菌体を所定濃度となるように加えた後、 α—セル口 —スを加え、全量を 100質量部に調整して死菌体含有飼料とした。加熱死菌体の添加濃度は、死菌体含有飼料中、それぞれ 0、 20 p pmの 2水準とした。上記で得られた死菌体含有飼料に水を該飼料に対して 40質量％となるように加え 10分間混ぜ合わせた。得られた混合物をチヨッパーで 2回ひき、直径 1. 2 cmのペレツ卜状飼料を作製した。それをオーブンで乾燥させ、水分含量が全体の 10%以下にしたものを試験飼料とした。なお、上記ミネラルミックスの組成を下記第 1表に示す。第 1表

[好中球数の増加効果]

ラクトバチルス ·プランタラム L一 137株 (Lactobacillus pi ant arum L- 137) の加熱死菌体を 0 p pm (対照飼料) 或いは 2 O ppm (試験飼料) 濃度で含有した飼料 (水分 10質量％以下、直径 1. 2 cmのペレツト状)を、 2年間飼育したマダイ (体重： 1. 11 ±0. 22 kg) に与えた。すなわち、マダイを 500 L円形ポリエチレンタンクに 3尾ずつ収容し、これを一試験区当り 2タンクずつセットし、注水率 5LZ分、水温 24. 0°Cで飼育し、給餌は朝夕の一日二回行い、体重の 1〜5質量％を与えた。給餌 1週目の浮き袋に滲出した好中球数の測定を行った。

浮き袋から好中球の回収は、エンドゥらの方法（Fisheries science 64(4)， 644-645 (1997)) に従った。得られた好中球浮遊液（ハンクス緩衝液）にトリパンブルー染色液を加え、死細胞を染色した後、血球計測版にて生細胞数を測定した。結果を第 2表に示した。

第 2表

マダイ浮き袋中の好中球数

第 2表に示したように試験飼料摂取マダイは、給餌前及び対照食摂取マダイと比較して著しく好中球の増加を示した。このことより、試験飼料摂取により、免疫機能が上昇し感染防御能が高まったことがわかる。実施例 2

[血清の殺菌能増加効果]

ラクトバチルス ·プラン夕ラム L— 137株 (Lactobacillus pi ant. arum L 137) の加熱死菌体を 0 p pm (対照飼料) 或いは 2 O ppm (試験飼料) 濃度で含有した飼料 (水分 10質量％以下、直径 1. 2 cmのペレツト状)を、実施例 1と同一の方法で製造し、 2年間飼育したマダイ (体重: 1. 11±0. 22 kg) に与えた。すなわち、マダイを 500 L円形ポリエチレンタンクに 3尾ずつ収容し、これを一試験区当り 2タンクずつセットし、注水率 5 L/分、水温 24. 0°Cで飼育し、給餌は朝夕の一日二回行い、体重の 1〜5質量％を与えた。給餌 2週目に尾部より末梢血をスピッツ管に採血し、 24時間冷所に保存した後、スピッツ管の壁面にガラス棒を沿わせて血餅を剥がし、遠心分離機（3000 r pm、 15分、 4 ）を用いて血清を調製した。血清の殺菌活性は、大腸菌に対する殺菌能をャマモト及びィイダの方法（Fish pathol ogy, 30 (2) 123-124 (1995) ) の方法に従って測定することにより評価した。結果を第 3表にまとめた。

3 ^fe

マダイ血清による大腸菌殺菌能

第 3表に示したように、試験飼料摂取魚は、血清による大腸菌殺菌能が高く、補体活性の上昇が示され、免疫機能増強による感染防御能の向上が認められた。産業上の利用可能性

本発明によって、顕著な抗菌力を示し、保存安定性、水中安定性に優れた、生物製剤としての魚介類用感染防御剤を提供できる。

Claims

請求の範囲

1. ラクトバチルス ·プランタラム（Lactobacillus pi ant arum) の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用感染防御剤。

2. ラクトバチルス 'プランタラム（Lactobacillus plantarum) が、ラクトバチルス ·プランタラム L— 137株（Lactobacillus plantarum L- 137、受託番号 FERM BP— 08607) であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の魚介類用感染防御剤。

3. ラク卜バチルス ·プランタラム (Lactobacillus plantarum) の死菌体又はその処理物の含有量が、全体量に対して 0. 01〜95質量％であることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の魚介類用感染防御剤。

4. 細菌感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。

5. ウイルス感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。

6. 寄生虫感染防御剤であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。

7. 魚介類が淡水魚又は海水魚であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。

8 . 魚介類が甲殻類であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。

9 . 補体活性増強効果又は好中球数増加効果を奏する請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤。

1 0 . 請求の範囲第 1項〜第 9項のいずれかに記載の魚介類用感染防御剤を含有する魚介類用飼料。

1 1 . 飼料中の乳酸菌の死菌体又はその処理物の濃度が、 0を超え 2 0 0 p p m以下であることを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載の魚介類用飼料。

1 2 . 請求の範囲第 1項に記載の魚介類用感染防御剤又は請求の範囲第 1 0 項に記載の魚介類用飼料を魚介獰に投与することを特徴とする魚介類の生存率改善方法。