KR101870522B1

KR101870522B1 - 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법

Info

Publication number: KR101870522B1
Application number: KR1020160112720A
Authority: KR
Inventors: 박성수
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-01
Filing date: 2016-09-01
Publication date: 2018-06-26
Also published as: KR20180026021A

Abstract

활성산소의 생성억제를 통한 항산화력, 항균성, 항암성, 간기능 보호 등의 효능을 가지는 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법이 개시된다. 본 발명은, (a) 콤부차 균주를 홍차와 혼합한 다음 1차 배양하여 콤부차 배양액을 수득한 다음, 배양액과 세균막(Pellicle)을 분리하는 단계; (b) 녹차 추출액 및 감귤 추출액을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 콤부차 배양액, 새균막, 녹차 추출액 및 감귤 추출액을 혼합한 다음, 2차 배양하여 콤부차를 수득하는 단계를 포함하는 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법을 제공한다.

Description

감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법{Method of Manufacturing Kombucha with Extracts Using Green Tea and Citrus}

본 발명은 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법 에 관한 것으로, 보다 상세하게는 활성산소의 생성억제를 통한 항산화력, 항균성, 항암성, 간기능 보호 등의 효능을 가지는 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법 에 관한 것이다.

콤부차는 국내에서는 홍차버섯으로 알려진 박테리아와 효모의 공생균사체에 의해 발효되어 얻어지는 발효 음료로 주로 홍차와 설탕을 주원료로 한다. 콤부차는 고대 중국의 진 나라로부터 기원되었으며 해독작용과 강장효과가 높아 “신성한 차”로 불렸다고 하며, 이후 서기 414년경에 한국을 거쳐 일본으로 전해졌으며 현재는 주로 러시아 지역을 중심으로 “Tea Kvass"라는 이름으로 불리며 많이 음용되고 있다(1). 콤부차의 생리활성 및 공공 보건에 미치는 영향과 관련하여 많은 연구가 진행되고 있으며, 대표적으로 활성산소 생성억제를 통한 항산화력(2), 항균성(3), 항암성(4), 상처치료 효과(5), 간기능 보호(6-8) 등의 다양한 생리활성이 보고되어 있다. 이 중 콤부차의 항암활성에 대한 연구를 살펴 보면, Jayabalan 등(9)은 콤부차 추출물의 여러 용매 분획물에 대한 항암 활성을 측정한 결과 ethyl acetate 분획물에서 강력한 항암 활성을 관찰하였고, 물질의 정제 및 분리를 통하여, 말론산과 vitexin이 유효 성분임을 밝혀낸 바 있다. Srihari 등(4)은 인체 전립선암인 PC-3를 이용하여 콤부차의 항암활성을 측정하였는데 표적 분자들 중 특히 interleukin8과 VEGF의 m-RNA 발현이 현저히 감소함을 확인한 바 있으며, in vivo 신생 혈관 생성에 관여하는 것으로 알려진 matrix metalloproteinases-2 와 -9의 활성이 크게 저하됨을 확인하였다.

그러나, 콤부차의 다양한 생리활성에도 불구하고, 산업계에서의 응용 및 활용도는 현저하게 낮은데, 그 주된 원인으로는 콤부차의 발효가 미생물의 공생체를 통해 이루어지므로 사용되는 미생물의 정확한 균종 및 분포가 확립되지 않아 발생하는 미생물 안전성 및 발효 산물의 정상 세포에 대한 독성 여부를 들 수 있다. 특히 콤부차의 세포 독성에 관한 연구 결과는 일치되지 않으며, 많은 논란이 있다. 한 예로 미국의 Centers for Disease Control and Prevention(CDC)는 1995년 미국의 Iowa 주에서 콤부차 음용으로부터 발생한 2건의 임상 사례를 보고한 바 있는데, 정확한 원인은 파악이 되지 않았으나, 콤부차의 낮은 산도에 따른 세포 독성의 가능성을 제시한 바 있고(10), Srinivasan 등(11)은 콤부차를 음용한 후 발생한 환자 4명의 임상 사례를 통하여, 콤부차의 독성 가능성을 제시하였으나, 이 연구에서도 그의 직접적인 원인은 밝혀지지 않았다. 또 다른 연구들에서는 콤부차의 세포 독성이 없음을 보고하였는데, Bhattacharya 등(12)은 실험용 쥐를 이용한 실험에서 kg당 2 mL 혹은 증류수에 1%(v/v)를 첨가한 콤부차를 3개월 동안 먹인 후 장기 독성, 체중 등을 조사한 결과 독성이 없음을 보고한 바 있다. 미국 FDA에서도 콤부차가 GMP(Good Manufacturer's Practice) 과정을 거쳐 생산되면, 소비자가 섭취하기에 적합하며, 독성이 없다고 확인한 바 있으며(13), 기존에 보고된 세포 독성들도 높은 산도, 과량의 섭취, 비위생적 생산 등과 관련되었을 수 있다고 보고하였다.

대한민국 공개특허 제2015-0124258호에서는 콤부차 발효 조성물에 관하여 개시하고 있다. 이 발명에서는 녹차액, 배양액 및 한약재 추출물을 함유하여 항암효과를 가지는 조성물을 기재하고 있지만, 콤부차의 맛에 한약재의 맛이 더해저 음용하기 어렵다는 단점을 가진다.

대한민국등록특허 제0482308호에서는 녹차이용 콤부차음료의 제조방법에 관하여 개시하고 있다. 이 발명에서는 홍차 추출액에 녹차 추출물, 당을 혼합한 다음, 발효하여 제조되는 콤부차 발효음료를 기재하고 있지만, 기존의 콤부차 이상의 효능을 기대하기 어렵다는 단점을 가진다.

발명은 상기 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 기존의 콤부차에 녹차 및 감귤 추출물을 혼합하여, 음용하기 쉬우며 항암효과 및 항산화효과가 개선된 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법 을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, (a) 콤부차 균주를 홍차와 혼합한 다음 1차 배양하여 콤부차 배양액을 수득한 다음, 배양액과 세균막(Pellicle)을 분리하는 단계; (b) 녹차 추출액 및 감귤 추출액을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 콤부차 배양액, 새균막, 녹차 추출액 및 감귤 추출액을 혼합한 다음, 2차 배양하여 콤부차를 수득하는 단계를 포함하는 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법을 제공한다.

또한 상기 녹차 추출액은 설탕을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 콤부차 제조방법을 제공한다.

또한 상기 콤부차 추출액은 아세트산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 콤부차 제조방법을 제공한다.

또한 상기 녹차 추출액은 녹차 1~5g을 100~500mL의 증류수에 90~120℃의 온도로 1~30분간 추출한 것을 특징으로 하는 콤부차 제조방법을 제공한다.

또한 상기 감귤 추출액은 감귤피 1~30g을 100~500mL의 증류수에 90~120℃의 온도로 1~30분간 추출한 것을 특징으로 하는 콤부차 제조방법을 제공한다.

또한 상기 (c)단계는 콤부차 배양액 50~200mL, 세균막 1-~50g, 녹차 추출액 500~1200mL 및 감귤 추출액 100~300mL를 혼합하여 10~40℃에서 5~20일간 배양하는 것을 특징으로 하는 콤부차 제조방법을 제공한다.

또한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 가지 방법으로 제조되는 콤부차를 제공한다.

이러한 본 발명에 따르면, 기존의 콤부차에 항산화활성을 높이기 위하여 녹차 및 감귤 추출액을 혼합함에 따라, 높은 항산화 활성을 가지고, 항암성능 역시 뛰어나며, 감귤 추출액의 혼합으로 인하여 음용하기 역시 쉬우므로, 건강음료, 건강보조식품 등의 제조에 유용하다.

도 1은 본 발명의 실험예에 따른 항산화력 비교실험 결과 그래프,
도 2는 본 발명의 실험예에 따른 암세포주 성장억제 실험 결과 그래프,
도 3은 인체 유래 방광암 세포주 5637에 대한 항암성 실험 결과 그래프,
도 4는 인체 유래 방광암 세포주 5637에 대한 성장억제 정도를 MTT assay를 통하여 측정한 결과 그래프,
도 5는 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포를 사용한 세포독성 실험결과 그래프.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명자들은 기존의 쿰부차가 낮은 항산화 활성을 가지며, 특유의 신맛을 가짐에 따라 음용하기 어렵다는 문제가 있음에 주목하고, 이는 해결하기 위하여 예의 노력을 한 결과, 콤부차에 녹차와 감귤 추출액을 혼합하는 경우 항상화확성이 높아지고 음용역시 쉬워지는 것을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명은 (a) 콤부차 균주를 홍차와 혼합한 다음 1차 배양하여 콤부차 배양액을 수득한 다음, 배양액과 세균막(Pellicle)을 분리하는 단계; (b) 녹차 추출액 및 감귤 추출액을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 콤부차 배양액, 새균막, 녹차 추출액 및 감귤 추출액을 혼합한 다음, 2차 배양하여 콤부차를 수득하는 단계를 포함하는 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 녹차 추출액은 설탕을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 기존의 콤부차의 경우 특유의 신맛을 가지고 있으며, 홍차 발효물의 특성상 음용하는 것이 쉽지 않다 따라서, 신맛을 억제하기 위하여 당성분을 추가하는 것이 바람직하며, 쉽게 구할 수 있는 설탕을 첨가하는 것이 더욱 바람직하다. 이때 설탕의 사용량은 녹차 추출액 1L에 대하여 50~150g의 비율로 촘가하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 녹차 추출액 1L에 대하여 80~110g을 첨가할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 콤부차 추출액은 아세트산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 콤부차 추출액은 신맛이 강하기는 하지만, 녹차 및 감귤추출물을 혼합하여 신맛이 줄어 들었으며, 이에 따라 변질될 수 있다. 따라서, 아세트산 성분을 추가하여 맛을 일정하게 유지하며, 보존기간을 늘리는 것이 더욱 바람직하다. 이때 첨가되는 아세트산의 양은 콤부차 추출액 1L에 대하여 100~1500㎕의 비율인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 콤부차 추출액 1L에 대하여 400~600㎕의 비율일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 녹차 추출액은 녹차 1~5g을 100~500mL의 증류수에 90~120℃의 온도로 1~30분간 추출한 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 감귤 추출액은 감귤피 1~30g을 100~500mL의 증류수에 90~120℃의 온도로 1~30분간 추출한 것을 특징으로 할 수 있다. 녹차 및 감귤 추출액은 콤부차의 신맛의 정도 사용목적에 따라 원하는 방법으로 제조 가능하지만, 상기의 방법으로 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (c)단계는 콤부차 배양액 50~200mL, 세균막 1-~50g, 녹차 추출액 500~1200mL 및 감귤 추출액 100~300mL를 혼합하여 10~40℃에서 5~20일간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 가지 방법으로 제조되는 콤부차에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.

시료처리

일반 콤부차(K)와 감귤/녹차 콤부차(CK)는 원심분리 후 상등액을 사용하였고, 세포실험에는 상등액을 주사기용 필터 유닛(pore size 0.45 μm, EMD Millipore Inc. Billerica, MA, USA)을 이용하여 여과한 후 RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, USA)에 희석하여 사용하였다. 감귤피 추출액은 감귤피 10 g에 200 mL 증류수를 첨가하는 비율로 10분간 열탕 추출하였다. 녹차 추출액은 녹차 티백(1.5 g, 설록원, Jeju, Korea) 한 개에 300 mL의 증류수를 첨가하는 비율로 10분간 열탕 추출하였다. 각 시료는 세포 성장 억제에 필요한 만큼 필터 유닛(0.45 μm, EMD Millipore Inc.)으로 여과하여 사용하였다.

본 실험에서 사용한 콤부차는 local domestic Kombucha이며, 민간에서 분양하여 판매하는 것을 인터넷으로 구매하여 사용하였다(www.auction,co.kr).

통계처리

본 실험은 독립적으로 3번 이상 반복실험을 실시하였다. 실험 결과는 통계분석용 프로그램 SPSS Version 18.0 Package Program(IBM, New York, NY, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차를 계산하고 t-test분석, ANOVA분석 후 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 이용하여 처리군 간의 유의성을 검증하였다.

실시예 1

전배양을 통해 얻은 콤부차 배양액 100 mL에 녹차 추출액 700 mL, pellicle 20 g, 감귤피(남해상사, Jeju, Korea) 추출액 200 mL에 acetic acid 500 μL를 첨가하여 30℃조건으로 10일간 배양하였다.

비교예 1

콤부차는 녹차(동서녹차 티백, Seoul, Korea) 추출액 900 mL에 설탕 90 g을 교반한 후 전배양을 통해 얻은 배양액 100 mL과 pellicle 20 g을 넣어 30℃조건으로 10일간 배양(비교예 1)하였다.

실험예1 : 세포배양

실험에서 사용한 B16F10 마우스 피부악성종양 세포주, 5637 인간 방광암 세포주와 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.)배지에 10%　FBS(Gibco Inc. San Francisco, CA, USA)와 1% Penicillin(Gibco Inc.)을 넣고, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.

실험예 2 : ORAC assay

비교예 1의 일반 콤부차와 실시예 1의 감귤/녹차 콤부차의 ORAC value는 Ou 등(14)의 방법을 응용하여 비교 측정하였다. 본 실험에서 사용한 시료와 표준물질 및 시약은 75 mM phosphate buffer(pH 7.4)용액에 희석하여 사용하였다. AAPH(150 mM)는 실험 직전에 37℃ 에서 15분간 incubation한 뒤, 96-well plate에 100배로 희석된 시료 25 μμL와 fluorescein(40 nM) 120 μμL를 혼합하고 측정 시 AAPH(150 mM) 25 μμL를 첨가하였다. 측정은 fluorescence microplate reader(Spectra Max i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 37℃ 에서 excitation은 485 nm, emission은 520 nm에서 2분 간격으로 총 1시간 동안 측정하였다. 측정값은 각 시료의 area under curve(AUC)를 구한 후 trolox의 표준곡선에 대입하여 나타내었다.

비교예 1의 콤부차(K)와 실시예 1의 감귤 및 녹차의 추출액을 첨가한 콤부차(CK)의 항산화력을 비교하였다. 각 시료의 항산화력은 oxygen radical absorbance capacity(ORAC)를 측정하여 비교하였으며, 그 결과는 도 1과 같다. 앞선 연구들에 의하면, 콤부차는 높은 항산화력으로 인하여 활성산소로부터 세포를 보호하는 기능이 뛰어나다고 알려져 있다. Bhattacharya 등(12)은 당뇨 모델 생쥐를 이용한 실험에서 콤부차를 먹인 후 항산화력을 측정하였는데, 발효시키지 않은 차를 먹인 대조군에 비해 콤부차를 먹인 생쥐의 간세포 내 glutathione 감소를 현저하게 억제하였음을 보고한 바 있다. 본 연구에서 제조된 감귤/녹차 추출액 함유 콤부차의 경우는 일반 발효 콤부차의 항 산화력과 비교할 때 약 3배가량 증가하는 것으로 나타났으며, 이 항산화력의 증가는 녹차 및 감귤피 내에 강력한 항산화 물질이 존재함을 나타낸다고 할 수 있다. 실제로 감귤피 및 녹차의 항산화력 증진 효과는 많은 기존 연구들에서도 보고된 바 있다(15-17).

실험예 3 : 세포 독성 실험( MTT assay )

실시예1의 감귤/녹차 콤부차(CK)처리에 따른 B16F10 피부암 세포주, 5637 인간 방광암세포주와 Raw 264.7 마우스 대식세포의 증식 억제 정도를 측정하기 위해 96-well plate에 각 세포주를 3x103/well로 분주하여 배양한 후 CK의 농도를 달리하여 24시간 배양하였다. 그 후 5 μg/mL MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide)(Sigma Aldrich Co.) 시약을 10 μL씩 처리하여 1시간 반응시키고 배지를 제거한 후 DMSO를 100 μL씩 분주하여 생성된 formazan을 모두 녹인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식률은 시료의 흡광도를 대조군(무처리군)의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

먼저, 실시예 1의 감귤피와 녹차 추출액을 함유한 콤부차의 항산화력이 비교예 1의 일반 콤부차에 비해 월등히 높아진 결과를 기초로 하여 각 성분의 항암성을 측정하였다. 녹차 추출액, 감귤피 추출액, 그리고 그 혼합액의 암세포주 성장 억제 정도를 MTT assay를 통하여 측정하였다. 각 시료는 0~20 μL/mL 의 농도로 24시간동안 처리하였고, 도 2와 같이 무첨가 군에 대한 백분율로 나타내었다. MTT assay의 결과를 보면, 감귤피 추출물에 비해 녹차 추출물의 항암효과가 상대적으로 높았으며, 각 성분의 단일 처리군 보다는 혼합액의 처리군에서 월등히 높은 항암성을 나타내었다. 특히 감귤/녹차 혼합액은 20 uL/ml의 농도에서 80% 이상의 피부악성종양 세포주의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 각 추출물의 단일 효과와 비교할 때 현저한 상승효과를 나타낸 것으로, 각 성분은 서로 다른 기작으로 암세포의 성장을 저해하고 있음을 알 수 있다

인체 유래 방광암 세포주인 5637에 대한 항암성도 함께 측정이 되었으며, 그 결과는 도 3과 같다. 5637 방광암 세포주에 대한 항암성은 귤피 추출액 보다 녹차 추출액에서 강하게 나타났으며, 혼합액의 항암성은 녹차 추출액의 항암성과 비슷하게 나타났다. 이 결과를 토대로 보면, 방광암에 대한 항암성은 주로 녹차 성분에 의해 나타난다고 볼 수 있다. 방광암 세포주에 대한 결과에서도 약 20 μL/mL의 농도에서 60% 이상의 세포가 사멸되었으며, 세포의 50% 사멸을 나타내는 IC50는 10~20 μL/mL 농도 사이에 존재함을 알 수 있다. 앞선 피부암세포에 대한 결과와 비교할 때 5637 인간 방광암 세포주에서는 상승효과가 나타나지 않은 것으로 볼 때 추출물의 작용 기작은 5637 방광암 세포와 B16F10 피부암세포에 서로 다르다는 것을 추론할 수 있다.

실험예 4 : 인간 방광암 세포주 5637에 대한 CK의 항암성 실험

CK의 발효에 사용되는 성분 중 감귤피 추출액와 녹차 추줄액 각각의 항암성 측정 결과를 토대로 두 성분을 함유한 콤부차(실시예 1)를 10일간 배양하였다. 이 후 배양액을 45 μm필터로 제균 한 후, 방광암 세포주에 대한 성장 억제 정도를 MTT assay를 통하여 측정하였다. 그 결과는 도 4와 같았다. CK는 K와 비교하여 유의적으로 5637 방광암 세포주에 대해 높은 항암 활성을 나타내었고, 농도 의존적인 항암 활성을 나타내었다. 그러나 흥미롭게도, IC50값은 단일 성분들의 항암성 측정값과 비교할 때 증가한 것으로 나타났다. 이는 발효 과정 중에 단일 성분들의 파괴가 진행된 것으로 생각되며, 실제로 녹차 성분 중 강한 항암활성을 나타낸다고 알려진 EGCG의 생리적 활용도(bio-availability)가 시간에 따라 감소한다는 보고를 통해서도 추론 할 수 있다(18). 녹차와 감귤의 기능성분이 일반 콤부차로 이행되어 증진된 생리활성 음료를 개발 할 수 있을 것으로 생각하였고, 차후 각 성분의 화학적 안정성을 확보할 수 있는 연구가 진행되어야 할 것으로 생각이 된다.

실험예 5 : 인간 신장유래 유사 정상세포에 대한 독성

암세포에 대한 성장 억제 결과를 기초하여, 본 암세포 성장 저해능이 일반 세포 독성에 기인한 것이 아닌지를 살펴보기 위해 비사멸화(immortalization)된 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포를 사용하여 세포독성을 확인하였고 그 결과는 도 5와 같았다. K 혹은 CK는 Raw 264.7 세포에 대하여 전체적으로 낮은 세포 독성을 나타내었고, CK는 K에 비해 오히려 세포 독성이 낮게 나타났다. 방광암 및 피부암 세포주와 다르게 Raw 264.7 세포는 100 μL/ml의 농도에서도 세포 독성이 현저하게 낮았다. 이상의 실험 결과로 볼 때, 감귤과 녹차의 추출액을 첨가하여 발효시킨 콤부차는 항암성이 일반 콤부차에 비해 높게 나타났으며, 녹차와 감귤피의 추출액이 상승효과(synergistic effect)를 나타내는 것으로 확인되었고, 마우스 대식세포를 이용한 독성실험에서 나타난 결과로 볼 때, 일반 세포에 대한 독성은 낮을 것으로 판단되었다. 이상의 결과를 토대로 우리는 녹차와 감귤피 추출액의 항산화 효과를 비롯한 생리활성 기능이 또한 미생물 발효 기능성 음료의 산업화를 위해서 확보되어야 할 중요한 사항 중 한 가지는 일반 세포에 대한 독성여부이며, Raw 264.7 대식세포를 사용하여 일반 세포 독성을 확인한 사례(19)에 기초하여 본 연구에서도 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포를 이용하여 일반 세포에 대한 독성의 정도를 조사하였다. 그 결과 CK는 암세포에 적용된 농도의 약 2배에서도 세포 독성이 크지 않았다. 더 많은 실험 데이터가 확보되어야 하겠지만, 본 연구의 결과로 비추어 볼 때 CK는 항암 기능성 음료로 개발될 수 있는 가능성을 나타냈다고 볼 수 있다.

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 감귤 및 녹차 추출액을 이용한 콤부차 제조방법;
(a) 콤부차 균주를 홍차와 혼합한 다음 1차 배양하여 콤부차 배양액을 수득한 다음, 배양액과 세균막(Pellicle)을 분리하는 단계;
(b) 녹차 추출액 및 감귤 추출액을 준비하는 단계; 및
(c) 상기 콤부차 배양액, 세균막, 녹차 추출액 및 감귤 추출액을 혼합한 다음, 2차 배양하여 콤부차를 수득하는 단계;
상기 (c)단계는 콤부차 배양액 50~200mL, 세균막 1~50g, 녹차 추출액 500~1200mL 및 감귤 추출액 100~300mL를 혼합하여 10~40℃에서 5~20일간 배양하고,
상기 콤부차 배양액, 상기 녹차 추출액 및 상기 감귤 추출액을 혼합한 용액 1L에 대하여 100~1,500㎕의 비율로 아세트산을 더 혼합하는 것을 특징으로 함.
제1항에 있어서,
상기 녹차 추출액은 설탕을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 콤부차 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 녹차 추출액은 녹차 1~5g을 100~500mL의 증류수에 90~120℃의 온도로 1~30분간 추출한 것을 특징으로 하는 콤부차 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 감귤 추출액은 감귤피 1~30g을 100~500mL의 증류수에 90~120℃의 온도로 1~30분간 추출한 것을 특징으로 하는 콤부차 제조방법.
삭제
제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 가지 방법으로 제조되는 콤부차.