NO312105B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av ribozymer - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av ribozymer Download PDFInfo
- Publication number
- NO312105B1 NO312105B1 NO20000369A NO20000369A NO312105B1 NO 312105 B1 NO312105 B1 NO 312105B1 NO 20000369 A NO20000369 A NO 20000369A NO 20000369 A NO20000369 A NO 20000369A NO 312105 B1 NO312105 B1 NO 312105B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- rna
- ribozyme
- sequence
- ribonucleotides
- equal
- Prior art date
Links
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 title claims description 214
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 title claims description 208
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 title claims description 206
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 148
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 41
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 41
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 13
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 62
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 26
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- 241000726311 Citrus exocortis viroid Species 0.000 description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 17
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 10
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108020005543 Satellite RNA Proteins 0.000 description 6
- 241001428638 Tobacco ringspot virus satellite RNA Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000724705 Lucerne transient streak virus Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000724703 Subterranean clover mottle virus Species 0.000 description 5
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 241000724704 Solanum nodiflorum mottle virus Species 0.000 description 3
- 241000724701 Velvet tobacco mottle virus Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 101100268665 Caenorhabditis elegans acc-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000269333 Caudata Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 2
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 101100442582 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) spe-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 2
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004487 Satellite DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000723677 Tobacco ringspot virus Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 2
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002245 ribonucleolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- GGKNTGJPGZQNID-UHFFFAOYSA-N (1-$l^{1}-oxidanyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)-trimethylazanium Chemical compound CC1(C)CC([N+](C)(C)C)CC(C)(C)N1[O] GGKNTGJPGZQNID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039601 ARF GTPase-activating protein GIT1 Human genes 0.000 description 1
- 101710194905 ARF GTPase-activating protein GIT1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039602 ARF GTPase-activating protein GIT2 Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002494 Endoribonucleases Human genes 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710081758 High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208133 Nicotiana plumbaginifolia Species 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006231 SLC7A2 Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 ligations Proteins 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108090000446 ribonuclease T(2) Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
- A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
- A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/60—Isolated nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/121—Hammerhead
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/124—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes based on group I or II introns
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling av ribozymer for bruk i human eller veterinær medisin.
Oppfinnelsen vedrører fremstilling av en klasse av syntetiske RNA-molekyler og derivater derav, i det følgende benevnt ribozymer, som har høy spesifikk endoribonukleaseaktivitet.
Et antall naturlig forekommende RNA-molekyler som f.eks. Avocardo Sunbloth Viroid (ASBV), satellitt-RNA av Tobacco Ringspot Virus (sTobRV) og Lucerne Transient Streak virus (sLTSV) undergår selvkatalysert kutting. Slik kutting synes
å være en essensiell og særegen del av livssyklusen for disse og andre RNA.
Selvkatalyserte RNA-kuttereaksjoner deler et felles krav for toverdige metallioner og nøytral eller høyere pH, og resulterer i produksjon av RNA med ender med 5 1-hydroksyl og 2 1 , 31-cykliske fosfatgrupper (Prody et al., Science 231: 1577-1580 (1986) og Buzayan et al., Virology 151: 186-199
(1986)). Kuttereaksjonene katalyseres ved selve RNA, antagelig som et resultat av konformasjon som bringer reaktive grupper nær inntil hverandre. Setene av selvkatalysert kutting i naturlig forekommende RNA er lokalisert inne i sterkt konserverte regioner av RNA sekundær struktur (Buzayan et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83: 8859-8862
(1986) og Forster, A.C. og Symons, R.H. Cell 50: 9-16
(1987) ) .
Forsøk gjennomført med satellitt RNA av Tobaco Ringspot Virus (sTobRV) har ført til konstruksjon av nye endoribonukleaser (i det følgende benevnt "ribozymer"), d.v.s. enzymer omfattende RNA som katalyserer spesifikk kutting av RNA-targetmolekyler.
Betegnelsen ribozym som benyttes i den foreliggende beskrivelse refererer til molekyler fullstendig bestående av RNA eller derivater derav.
Ribozymene fremstilt i samsvar med oppfinnelsen er distinkte fra RNA-endoribonuklease som forekommer naturlig i Tetrahymena Thermophila (kjent som IVS, eller L-19 IVS RNA) og som er utfyllende beskrevet av Thomas Cech og medarbeidere (Zaug, A.J. et al, Science (1984) 224: 574-578, Zaug, A.J. og Cech, T.R., Science (1986) 231: 470-475, Zaug, A.J. et al, Nature.(1986) 324: 429-433, publisert internasjonal patentsøknad WO 88/04300 i navnet University Patents-Inc.). Cech-endoribonukleasen har et aktivt sete med åtte basepar som hybridiseres til en target RNA-sekvens hvoretter kutting av target RNA foregår, med et krav til fritt guanosin eller guanosinderivater. De fragmenter som skriver seg fra kuttingen inneholder terminale 5'-fosfat og 3'-hydroksylgrup-per. Det begrensede antall nukleotider tilgjengelig for hybridisering til et RNA-substrat begrenser effektiviteten eller virkningsgraden av Cech-endoribonukleasen ettersom oligonukleotider med mindre enn tolv nukleotider generelt hybridiserer dårlig til targetsekvenser. Det viser seg også at et antall nukleotider i det aktive sete av Cech-endoribonukleasen kan behøve å bli konservert for effektiv endoribonukleaseaktivitet. Dette begrenser antallet av permutasjoner av aktive setesekvenser som kan bygges opp for å bevirke hybridisering til targetsekvenser, slik at området av RNA-targetsekvenser som kan kuttes av Cech-endoribonukleasen begrenses. Cech-endoribonukleasen modifiserer også RNA ved å addere et fritt guanosinnukleotid til 5'-enden av kuttet RNA.
I motsetning til dette hybridiserer ribozymene fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse effektivt til en lang rekke target RNA-sekvenser og modifiserer ikke det kuttede target RNA.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for fremstilling av et ribozym som har formelen:
hvori hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,
hvor hver av (X)n og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen,
hvor hver av n og n' representerer et helt tall som definerer antallet ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n1 er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,
hvor hver <*> representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvor a representerer et helt tall som definerer et antall ribonukleotider med den betingelse at a kan være 0 eller 1 og hvis 0 er A som er lokalisert 5' til (X)a bundet til G lokalisert 3' til (X)a,
hvor hver av m og rn' representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,
hvori hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding bestående av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og
hvori (X)b representerer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis- (X)b er tilstede,
for bruk i human eller veterinær medisin, som er kjennetegnet ved at det benyttes en standard genteknologisk fremgangsmåte.
Ved en utførelsesform av oppfinnelsen fremstilles et ribozym som har formelen:
hvori hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,
hvori hver av (X)^! og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen,
hvori hver av n og n' representerer et helt tall som definerer antallet ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n' er større enn eller lik 7 og
er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,
hvor hver * representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori a representerer et helt tall som definerer et antall ribonukleotider med den betingelse at a kan være 0 eller 1 og hvis 0 er A som er lokalisert 5' til (X)a bundet til G lokalisert 3' til (X)a,
hvor hver av m og m<1> representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,
hvor hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og hvori (X)b representerer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)b er tilstede.
Ved en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen fremstilles et ribozym som har formelen:
hvor hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,
hvori hver av (X)n.1 og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke--er tilstede i forbindelsen,
hvori hver av n og n<1> representerer et helt tall som definerer antallet ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n' er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,
hvori hver <*> representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori hver av m og m' representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,
hvori hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding bestående av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og
hvori (X)b representerer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)b er tilstede.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et ribozym som har formelen:
3 ' -[-(Y)r-Q-(Y)s-] z-5'
hvori Q representerer en forbindelse fremstilt i samsvar med oppfinnelsen som angitt i det foregående,
hvori hver Y representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,
hvori hver av r og s representerer et helt tall som kan være større enn eller lik 0, og
hvori z representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,
for bruk i human eller veterinær medisin, som er kjennetegnet ved at det benyttes en standard genteknologisk fremgangsmåte.
En region i formlene ovenfor representerer armene eller flankerende sekvenser av et ribozym som hybridiserer til respektive deler av en target RNA-sekvens. Armene kan hybridisere langs den fulle lengde av target RNA eller del derav. En RNA-katalytisk region er avbildet i formlene ovenfor. Den katalytiske region kan inneholde ett eller flere ytterligere nukleotider som ikke skadelig påvirker katalytisk aktivitet. Slike addisjoner kan lett testes for ribozymaktivitet uten for mye eksperimentering ved å følge læren i den foreliggende beskrivelse. Den katalytiske region kan også danne en del av den hybridiserende region.
Oligoribonukleotidene kan omfatte opp til 5000 eller flere nukleotider.
Ribozymene kan fremstilles ved hjelp av metoder som er i og for seg kjent på området for syntese av RNA-molekyler, f.eks. i henhold til de anbefalte protokoller til Promega, Madison, WI, USA). Spesielt kan ribozymene fremstilles fra en tilsvarende DNA-sekvens (DNA som ved transkripsjon gir et ribozym, og som kan syntetiseres i henhold til metoder som er i og for seg kjent på området for syntese av DNA) operabelt knyttet til en RNA-polymerasepromoter som f.eks. en promoter for T7 RNA-polymerase eller SP6 RNA-polymerase. En DNA-sekvens tilsvarende et ribozym fremstilt i samsvar med oppfinnelsen kan ligeres inn i en DNA-transfervektor, som f.eks. et plasmid eller bakteriofag DNA. Hvor transfervektoren inneholder en RNA-polymerasepromoter operabelt knyttet til DNA tilsvarende et ribozym, kan ribozymet fordelaktig fremstilles ved inkubasjon med en RNA-polymerase. Ribozymer kan derfor fremstilles in vitro ved inkubasjon av RNA-polymerase med en RNA-polymerasepromoter operabelt knyttet til DNA tilsvarende et ribozym, i nærvær av ribonukleotider. In vivo kan prokaryotiske eller eukaryotiske celler (inkluderende mammalceller og planteceller) transfiseres med en passende transfervektor inneholdende genetisk material tilsvarende et ribozym fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse, operabelt knyttet til en RNA-polymerasepromoter slik at ribozymet kan transkriberes i vertscellen. Transfervektorer kan være bakterieplasmider eller virale RNA eller DNA. Nukleotidsekvenser tilsvarende ribozymer blir generelt bragt under kontroll av sterke promotere som f.eks. lac, SV4 0 sen, SV40 tidlig, metallotionin, eller A.-promotere. Ribozymer kan direkte transkriberes in vivo fra en transfervektor, eller kan alternativt transkriberes som et større RNA-molekyl. F.eks. kan DNA tilsvarende ribozymsekvensene ligeres inn i 3'-enden av f.eks. et bærergen, etter et translasjonsstoppsignal. Større RNA-molekyler kan hjelpe til å stabilisere ribozymmolekylene mot nukleasebehandling inne i cellene. Ved translasjon kan bærergenet gi anledning til et protein, hvis nærvær direkte kan påvises, f.eks. ved enzymatisk reaksjon. Bærergenet kan f.eks. kode for et enzym.
Ved en foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av et ribozym blir to syntetiske oligonukleotider av komplementær sekvens fremstilt ved standard prosedyrer (f.eks. under anvendelse av en Applied Biosystems Model 38OA DNA Synthesizer (Applied Biosystems Inc., Foster City, California 94404)), og hybridisert sammen. Ett av oligonukleotidene koder for et ønsket ribozym. De respektive ender av de hybridiserte oligonukleotider tilsvarer forskjellige restriksjonsenzymseter, f. eks. EcoRl ved en ende og Pstl ved den andre enden. Etter kutting med passende restriksjonsenzymer (EcoRl og Pstl i det ovennevnte eksempel) kan det dobbelttrådede DNA-fragment klones inn i en transfervektor. Hvor plasmidvektoren inneholder en RNA-polymerasepromoter oppstrøms fra DNA-sekvens tilsvarende et ribozym fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse, kan RNA-transkripter tilsvarende ribozymet passende fremstilles enten in vitro eller in vivo. Hvor ribozymet omfatter to halvdeler som holdes sammen ved baseparing mellom komplementære nukleotider, kan hver halvdel av ribozymet fremstilles ved hjelp av de ovennevnte metoder, og halvdelene kan inkuberes sammen til å danne ribozymet.
De foretrukne ribozymer fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kutter target RNA som inneholder sekvensen X°UY, hvor X° er et hvilket som helst ribonukleotid, U er uracil og Y er adenin, cytosin eller uracil. X°U danner del av en baseparflankerende region og Y er ikke baseparet. Foretrukket, men ikke på noen måte obligatorisk, er X° guanidin, og X°UY er GUC eller GUA. Et hvilket som helst RNA-molekyl inneholdende disse sekvenser kan kuttes med ribozymene fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Når først sekvensen av et RNA-transkript inneholdende sekvensen X°UY er blitt bestemt, kan armene av ribozymsekvensen syntetiseres til å være komplementære til og således hybridiserbare til RNA på den targetsekvens som flankerer X°UY-sekvensen. Ved hybridisering av armene av ribozymet til target RNA-sekvensen som flankerer X°UY-sekvensen, kutter den katalytiske region av ribozymet target RNA inne i X°UY-sekvensen. RNA-kutting lettes i nærvær av magnesium eller annet toverdig kation ved en pH på omtrent 8,0. Følgelig kan de foretrukne ribozymer fremstilt i samsvar med oppfinnelsen bygges opp til å kutte hvilket som helst RNA med kjent sekvens. Den høye frekvens av restene kuttet av ribozymene i RNA (1:64 for GUC i et RNA med tilfeldig eller lik frekvens av basefordeling) betyr at et antall potensielle seter for ribozymkutting kan forutsies med pålitelighet i et hvilket som helst gitt RNA.
Den foreliggende oppfinnelse muliggjør en metode for inaktivering av en target RNA-sekvens, omfattende at den nevnte target RNA-sekvens omsettes med et ribozym fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.
In vivo, d.v.s. inne i cellen eller cellene av en organisme, kan en transfervektor som f.eks. et bakterielt plasmid eller viralt RNA eller DNA, som koder for ett eller flere ribozymer, transfiseres inn i f.eks. celler (Llewellyn et al., J. Mol. Biol. (1987) 195: 115-123, Hanahamet al. J. Mol. Biol. (1983) 166). Når den først er inne i cellen kan transfervektoren replikere og bli transkribert av cellulære polymeraser til å fremstille ribozym RNA som så kan inaktivere et ønsket target RNA. Alternativt kan en transfervektor inneholdende en eller flere ribozymsekvenser transfiseres inn i celler eller innføres i celler ved mikromanipulasjons-metoder som f.eks. mikroinjeksjon, slik at transfervektoren eller en del derav blir integrert i genomet av vertcellen. Transkripsjon av det integrerte genetiske material gir anledning til ribozymer som virker til å inaktivere et ønsket target RNA.
Ribozymene fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse har utstrakte terapeutiske og biologiske anvendelser. F.eks. kan sykdomsforårsakende virus i mennesker og dyr inaktiveres ved at et individ infisert med et virus tilføres et ribozym fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse tilpasset til å hybridisere og kutte RNA-transkripter av viruset. Slike ribozymer kan tilføres parenteralt eller på annen måte. Alternativt kan et individ infisert med et sykdomsfremkallende virus tilføres et ikke-virulent virus som vaccinia eller adenovirus som er blitt genmanipulert til å inneholde DNA tilsvarende et ribozym operabelt knyttet til en RNA-promoter, slik at ribozymet transkriberes inn i cellene av vertsdyret, transfiseres med det manipulerte virus slik at det bevirker kutting og/eller inaktivering av target RNA-transkriptet av det sykdomsfremkallende virus. Ribozymene fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse har særlig anvendelse mot virale sykdommer bevirket f.eks. av herpes simplex virus (HSV) eller AIDS virus (HIV).
Ribozymene fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse har også særlig anvendelse ved inaktivering av RNA-transkriptene i bakterier og andre prokaryotiske celler og dyr. I bakterier kan RNA-transkripter av f.eks. bakteriofag, som bevirker bakteriecellens død, inaktiveres ved transf eks jon av en celle med en DNA-transf ervektor som er i stand til å fremstille et ribozym fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse som inaktiverer fag DNA. Alternativt kan selve ribozymet adderes til og opptas av bakteriecellen for å bevirke kutting av fag RNA.
Endogene gentranskripter i dyr eller andre celletyper kan inaktiveres under anvendelse av ribozymene fremtilt ir samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Følgelig kan uønskede fenotyper eller karakteristikker moduleres. Det kan f.eks. ved å anvende ribozymene fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse være mulig å behandle arvelige sykdommer i mennesker bevirket ved produksjon av et skadelig protein, eller overproduksjon av et spesielt protein.
Oppfinnelsen skal nå illustreres ved henvisning til de etterfølgende eksempler og figurer.
I figurene vises:
Fig. 1 viser RNA-selvkutteseter av villtype og muterte RNA, og en elektroforetisk profil som viser selvkatalyserte RNA-kutteprodukter. a) Oppsummerer de konserverte strukturer assosiert med naturlig forekommende RNA-kutteseter i ASBV, salamander-satellitt DNA-transkripter og satellitt RNA av sTobRV, LTSV, Velvet Tobacco Mottle virus, Solanum Nodiflorum Mottle virus og subterreng Clover Mottle virus. Nukleotidsekvenser som er konservert mellom disse strukturer er vist, mens andre er representert som X. Baseparing representert ved "<*>" og setet for RNA-kuttinger er forsynt med pil. b) Viser den konserverte nukleotidsekvens assosiert med kuttingen av (+) tråden av sTobRV RNA. Kuttesetet
er forsynt med pil.
c) En in vitro mutant av sTobRV inneholdende et innskudd av åtte nukleotider (vist i ramme) sammen med
en flankerende duplikasjon av tre nukleotider (UGU-rester 7 til 9) er vist.
d) Subklonede Haelll-fragmenter av villtype sTobRV og D-51 in vitro mutant ble hver transkribert i både (+)
og (-) orienteringer og radiomerkede transkripter fraksjonert ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese. Posisjonene av ukuttet 159 og 170 base-transkripter fra villtype (WT) og mutant (D-51)
.sekvenser er forsynt med pil. Størrelsen av kutte
produkter er vist. Fig. 2 viser nukleotidsekvensen av et ribozym og produktene fra ribozymkutting separert ved hjelp av gelelektroforese. a) De innskutte nukleotider i D-51 mutanten (fig. lc) inneholder et BamHI-restriksjonsendonukleasesete.
BamHI ble anvendt for å kutte mutant DNA og de to sekvenser ble subklonet og transkribert separat in vitro. RNA-transkriptene er vist skjematisk, med potensielle baseparinger mellom RNA indikert med "<*>". Fragmentet inneholdende det med pil forsynte sete for kutting er omtalt som et S-RNA, mens fragmentet inneholdende ribozymet er betegnet Rz-RNA.
32
b) [ P] -Rz-RNA (101 baser) ble inkubert alene (bane 1) og med umerket S-RNA (bane 2). [<32>P]-S-RNA ble
32 inhibert alene (bane 3) og med umerket og P-merket Rz-RNA (baner 4 henholdsvis 5) .
Fig. 3 viser en skjematisk modell av et ribozym fremstilt i samsvar med en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse. Region A representerer kuttesekvensen inne i target RNA. Region B representerer en katalytisk region og regioner C representerer armene av ribozymet. Fig. 4 viser konstruksjonen av ribozymer som er targetrettet mot CAT (kloramfenikolacetyltransferase) gentran-skript. Ribozymer, betegnet RzCAT-1, 2 og 3, ble targetrettet mot tre seter inne i et 835 base in vitro transkript av CAT-genet. De relative lokaliseringer av kuttesetene på transkriptet er vist skjematisk med de flankerende baser nummerert a). De tre ribozymsekvenser er vist ((b) til d)) med deres targetsekvenser. Aminosyresekvenser av CAT-genet er nummerert og de forutsagte seter for RNA-kutting er forsynt med pil. RzCAT-1 og 3 inneholder 24 basesekvenser avledet fra ( + ) tråd sTobRV (region B, fig. 3) , mens RzCAT-2 inneholder en enkel U-A endring i denne region. Fig. 5 viser resultatene av CAT RNA-kutting med ribozymer RzCAT-1 til 3. .a) [ P]-CAT RNA ble gelfraksjonert etter inkubasjon alene (-) eller med en av tre ribozymer, RzCAT-1 til 3 (henholdsvis baner 1, 2 og 3) . Lokaliseringen av fullengde-transkriptet er vist forsynt med pil. b) 5 *-terminalbaseanalyse. 3'-fragmentene produsert ved ribozymkutting av CAT mRNA ble [5'- <3>2P]-kmase-behandlet, gelrenset, underkastet fullstendig nukleasebehandling og de frigitte terminale rester fraksjonert ved hjelp av pH 3,5 polyakrylamidgelelektroforese. 5 1 -terminalnukleotidene, bestemt ved henvisning til markører (bane M) , var A, U og G for fragmentene produsert ved hjelp av RzCAT-1 til 3 (henholdsvis baner 1, 2 og 3). Fig. 6 viser et tidsforløp for ribozym (RzCAT-1) katalytisk aktivitet mot CAT RNA. Mengdene av 139 nukleotid kuttingsproduktet ble kvantifisert og plottet. Innskuddet viser akkumulering av 13 9 basefragmentet med tiden, etter polyakrylamidgelelektroforese. Fig. 7 viser de relative grader av kutting av CAT RNA under forskjellige temperaturbetingelser. Substrat RNA er representert ved hjelp av en heltrukket linje. I hvert tilfelle er kutteproduktet representert ved hjelp av en brutt linje. Fig. 8 avbilder tre ribozymer (tilsvarende RzCAT-2) med armer
eller flankerende sekvens av varierende lengde.
Fig. 9 viser skjema for produksjon av et ribozym omfattende katalytisk antisense RNA inneholdende hver av kuttedomenene RzCAT-1 til 3. Fig. 10 viser ribozymer som hybridiserer til targetsekvenser inneholdende GUA (10a) og GUU (10b) enheter i CAT mRNA.
Fig. 11 viser seter for selvkatalysert RNA-kutting i
Citrus Exocortis viroid (CEV) RNA og dets komplement.
Fig. 12 viser ribozymet RzCEV25x(+) hybridisert til target CEV RNA(a), og en gelelektroforetisk profil av
(+)CEV RNA og komplementær (-)CEV RNA inkubert med RzCEV2 5x( + ) (b, henholdsvis baner 1 og 2) . Kutteproduktet er forsynkt med pil.
Fig. 13 viser ribozymet RzCAT-2 som hybridiserer til sin
. targetsekvens (a) og ribozymet RzSCMoV(b). Det katalytiske domene i hvert ribozym er forsynt-med ramme. Forskjeller i den katalytiske region av RzSCMoV ved sammenligning med RzCAT-2 er markert. Fig. 14 viser ribozymet RzCEV-2 som hybridiserer til en targetsekvens i Citrus Exocortis viroid (CEV) RNA. Kuttesetet tilsvarer nukleotidet 336 i CEV RNA-sekvensen. Endringen i nukleotidsekvens i det katalytiske domene, ved sammenligning med det katalytiske domene av sTobRV, er innsirklet (a) . Fig. 14 (b) viser en elektroforetisk profil av en kontroll [(-)tråd av CEV] RNA, bane 7, og (+) tråden av CEV RNA, bane 8, etter inkubasjon med RzCEV2. Fig. 15 viser ribozymet RzCAT-2 (a) sammenlignet med ribozymet RzCAT-2B (b). Katalytiske domener er innrammet. Endringer i det katalytiske domene av RzCAT-2B sammenlignet med RzCAT-2 er også innrammet.
Fig. 16 viser et kart av plasmid pJ35SN, og
Fig. 17 er en grafisk fremstilling av gjennomsnittet av fire forsøk ved inhibering av CAT-ekspresjon i planter (tobakksprotoplaster).
De etterfølgende eksempler gis for å illustrere oppfinnelsen.
Reaksjoner og manipulasjoner som involverer DNA, som lige-ringer, restriksjonsenzymbehandlinger, bakteriell transformasjon, DNA-sekvensering etc. ble gjennomført ved hjelp av standard metoder, som f.eks. dem som er beskrevet av Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, 1982). Manipulasjoner som involverer RNA ble også gjennomført ved hjelp av standard metoder, som f.eks. dem som er beskrevet av Uhlenbeck (Nature 328, 596-600 (1987)) og Haseloff og Gerlach (Nature 334, 585-591 (1988)).
EKSEMPEL 1
Selvkatalytsert kutting av mutert sTobRV RNA:
En oppstilling av domenene assosiert med naturlig forekommende RNA-kutteseter i ASBV, salamander-satellitt DNA-transkripter og satellitt RNA fra sTobRV, LTSV, Velvet Tobacco Mottle virus (VMoV), Solanum Nodiflorum Mottle virus (SNMV) og subterreng Clover Mottle virus (SCMoV) er vist i fig. la. Nukleotidsekvenser som er konservert mellom disse strukturer er vist, mens ikke-konserverte sekvenser er representert som X. En ekstra U er posisjonert etter rest <X>A i LTSV(+) tråden.
Domenet assosiert med den selvkatalyserte kutting av (+) tråden av sTobRV ble undersøkt for å fastslå den enzymatiske substrataktivitet innenfor dette domene. Først ble klonet sTobRV cDNA mutagenisert under anvendelse av en oligo-nukleotidlinker (BamH 1) innskuddsprotokoll.
Konstruksjon av en vektor for in vitro uttrykking av sTobRV: Et 160 bp Taq 1 - Spe 1-fragment av sTobRV cDNA ble isolert fra pSP653 (Gerlach et al. 1985, Virology 151: 172-185) og ligert til Acc 1 - Spe 1-kuttet, fosfatasebehandlet pGEM 4 for å reformere Accl-setet. Et resulterende klon ble linearisert med Acc l, fosfatasebehandlet og et 359 bp Taq l-fragment av sTobRV cDNA ble innskutt. De resulterende kloner ble underkastet screening for nærvær av en sirkulært permutert 520 bp sTobRV cDNA-sekvens inneholdende de terminalt over-flødige rester 277 til 81 (pTTS). sTobRV-sekvensen flankeres av promotere for T7 og SP6 RNA-polymeraser, og in vitro transkripsjon ga dannelse av RNA av (+) eller (-) orientering inneholdende to seter for selvkutting.
In vitro mutågenese:
Plasmidet pTTS (50 fig) ble linearisert med BamH 1, behandlet med Sl-nuklease og religert for å fjerne et eneste BamH 1-sete. Den resulterende konstruksjon, pTTS-B, ble behandlet med 2 x 10 - 4 enheter DNase 1 i 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 15 mM MnCl2 i ti minutter ved 3 7°C. De resulterende lineære DNA
ble trimmet og/eller endefylt ved anvendelse av T4 DNA-polymerase, og renset ved hjelp av 0,7 % LGT-agarosegelelektroforese og ekstraksjon. Kinasebehandlet BamH 1 linker-sekvenser (CGGATCCG) ble ligert til det lineariserte plasmid over natten ved romtemperatur i nærvær av 5 % polyetylen-glykol. Deretter ble reaksjonsblandingene behandlet med BamH 1 og de lineære plasmid DNA renset på nytt ved hjelp av 0,7 % LGT agarosegelelektroforese (dette ble funnet nødvendig for å fjerne de siste spor av sirkulært plasmid, sammen med uligerte linkere). Plasmider ble resirkularisert under anvendelse av T4 DNA ligase og transformert inn i E. coli DH-1. Kolonier (større enn 1000) ble avskrapet fra agarplater, dyrket i væskekultur til metning og en blandet populasjon DNA fremstilt. De blandede sTobRV cDNA- innskutt ble kuttet ut ved hjelp av behandling med restriksjonsenzym ved flankerende EcoRl og Pstl-seter, renset ved hjelp av 1 % LGT agarosegel-elektrof orese , og subklonet inn i EcoRl - Pstl-kuttet, fosfatbehandlet pGEM 4. De resulterende transformanter ble på nytt slått sammen, dyrket i væskekultur og plasmid DNA fremstilt. Plasmid DNA ble behandlet med BamH 1 for å kutte bare de plasmider som inneholdt en BamH 1 linkersekvens, og de lineære former ble på nytt renset ved hjelp av to runder 0,7 % LGT agarosegelelektroforese, resirkularisert ved T4 DNA ligase, og transformert inn i E. coli DH-1. Individuelle transformanter ble underkastet screening for den tilnærmede posisjon av den innskutte BamH l linker inne i sTobRV-sekvensen ved hjelp av behandling med restriksjonsenzym, subklonet inn i M13 mpl9 og sekvensert via dideoksynukleotidkjede-terminasj onsteknikk.
Et bibliotek av sTobRV-mutanter resulterte, og nukleotidse-kvensanalyse viste at hver mutant inneholdt en innskutt BamH 1-linkersekvens (CGGATCCG) sammen med flankerende duplikerte eller utelatte sTobRV-sekvenser. Mutantene ble transkribert in vitro og RNA underkastet assay for deres evne til å under-gå kutting. Fra disse forsøk ble en 52-nukleotidsekvens identifisert som inneholdende både substrat- og kuttedelene av sTobRV RNA. Denne 52-nukleotidsekvens, avbildet i fig. lb, inneholdt domenet av konservert sekvens nødvendig for selvkutting av andre RNA (fig. la). En mutant, betegnet D-51, inneholdt en åtte nukleotid BamH 1-linkersekvens innskutt mellom tre duplikerte sTobRV-nukleotider nummerert 7 til 9. Denne mutant undergikk selvkatalysert RNA-kutting. 97 og 108 basepar Haelll-fragmenter inneholdende den 52-nukleotidkuttesekvens av villtypen og D-51 RNA (som vist i fig. lb og lc) ble kuttet ut fra sekvenserte plasm-idkloner. Fragmentene ble ligert inn i Smal-setet av pGEM4 og underkastet screening for å oppnå begge orienteringer av innskuddet. Plasmidene ble linearisert under anvendelse av EcoRl og (+) og (-) tråd RNA av lengder 159 og 170 baser ble transkribert under anvendelse av 2 00 enheter/ml T7 RNA polymerase i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 2 mM spermidin, 1000 enheter/ml RNasin, 500 /iM ATP, CTP og GTP med 200fiM [ a 32P]UTP. RNA ble fraksjonert ved elektroforese på en 10 % polyakrylamid, 7 molar urea, 2 5 % formamidgel, og autoradiografert. Som vist i fig. Id ble det ikke iakttatt noen kutting av (-) tråd RNA-transkriptene. Dette var som forventet, ettersom (-) tråden ikke inneholdt et selvkatalysert kuttesete. Med (+) trådene av både villtypen og D-51 sekvensene foregikk kutting, med kutting av D-51 RNA noe mindre effektivt enn av villtypen (fig. Id) . Dette forsøk indikerer at den enkelttrådede løkkeregion ved den høyre side av 52-nukleotidsekvensen involvert i den selvkatalyserte kutting av RNA ikke er essensiell.
Separering av enzymatiske og substrataktiviteter:
Ved å anvende BamH 1-restriksjonsendonukleasesetet innskutt i D-51 ble de flankerte Haelll-BamH 1 og BamH 1-HaeIII-fragmenter oppnådd og hver ble subklonet inn i E. coli plasmid egnet for in vitro transkripsjon. Dette førte til eliminering av den muterte enkelttrådede løkke fra selvkuttedomenet, idet regionen ble splittet i to RNA-segmenter (fig. 2a). Det minste Haelll-BamH 1-fragment inneholdt nukleotidene 321 til 9, inkluderende det aktuelle sete for kutting og ble betegnet S-fragmentet. BamH 1-HaeIII-fragmentet inneholdende sTobRV-
nukleotider 7 til 48 ble betegnet ribozym- eller Rz-fragmentet. E. coli plasmidene anvendt for in vitro transkripsjon var pGEM3 og pGEM4 (Promega, Madison, WI, USA) . Disse uttrykkingsplasmider inneholder:
a) en kilde for replikasjon,
b) selekterbar medisinresistens (Amp<r>) gen,
c) et multippel kloningssete flankert av RNA polymerase-promotere som kan anvendes for in vitro produksjon av
transkripter.
T7 DNA-polymerasebehandlet, Kpnl-behandlet Rz-pGEM3 og Xbal behandlet S-pGEM4 ble transkribert under anvendelse av SP6 RNA-polymerase under de samme betingelser som angitt i det foregående.
Som vist i fig. 2 viste hverken S eller Rz-RNA noen vesentlig nedbrytning ved inkubering alene (fig. 2b, baner 1 og 3) under betingelser egnet for meget effektiv selvkutting (50°C, 2 0 mM MgCl2, pH 8,0). Det merkede Rz-RNA viste seg også uendret etter inkubasjon med S-RNA (fig. 2b, baner 2 og 5) . Når S-RNA ble blandet med Rz-RNA opptrådte imidlertid effektiv kutting av S-RNA (fig. 2b, baner 4 og 5) og frembragte to fragmenter. Produktstørrelsene var i samsvar med kutting av S-RNA (84 baser) ved det normale sete mellom nukleotider nr. 359 og nr. l, til å gi 5' og 3' proksimale fragmenter av henholdsvis nukleotider 67 og 17. Dette viser at S-RNA virket som et substrat for ribonukleolytisk kutting med Rz-RNA, som virker på en katalytisk måte.
En modell av et ribozym basert på den katalytiske region av sTobRV RNA er vist i fig. 3. Ribozymet har to armer eller flankerende sekvenser av enkelttrådet RNA vist ved C, som hybridiserer til komplementære sekvenser på et substrat RNA, d.v.s. RNA som skal kuttes. Hver flankerende sekvens vist ved C inneholder åtte ribonukleotider. Antallet av nukleotider inneholdt i region C er ikke kritisk. Tilstrekkelig nukleotider må imidlertid være tilstede til å tillate at ribozymet hybridiserer til et target RNA. Fire nukleotider i hver region C synes å være minimumsantallet for hybridisering .
Den katalytiske region B inneholder sekvenser som er sterkt konservert i naturlig forekommende kuttedomener (se fig. la) . Fra en sammenligning med kuttedomener av de kjente sekvenser er lengden av baseparstammen II uviktig, og likeledes nærværet av en assosiert løkke ved en ende derav.
Kuttesetet inne i target RNA er avbildet ved A (i fig. 3) som GUC. På basis av foretatte forsøk (ikke vist) og andre av Koizumi (FEBS LETT 288, 288-230 (1988), og FEBS LETT 239, 285-288 (1988)) på kuttesetene i naturlig forekommende RNA, virker sekvensene GUA, GUC, CUC, AUC og UUC også som kutteseter inne i RNA.
EKSEMPEL 2
Demonstrasjon av konstruksjon, syntese og aktivitet av ribozymer med ny og høyspesifikk endoribonukleaseaktivitet: Som en illustrasjon av oppfinnelsen ble det konstruert tre ribozymer som er targetrettet mot transkriptet av et vanlig anvendt indikatorgen avledet fra bakterier, Tn9-kloramfenikolacetyltransferase (CAT), som kan tilveiebringe antibiotisk resistens i bakterier, planter og dyr og som lett kan be-stemmes. Disse ribozymer, betegnet RzCAT-1 til 3 tilsvarer potensielle GUC-kutteseter i CAT RNA ved posisjoner henholdsvis 139-140, 494-495 og 662-663. Sekvensene av disse ribozymer er avbildet i fig. 4. I hvert tilfelle var de flankerende sekvenser av ribozymet som hybridiserer til target CAT RNA åtte nukleotider lange. Den katalytiske region ble valgt til å tilsvare regionen av sTobRV RNA som vist i fig. 3.
CAT-genet ble oppnådd fra pGEM4 og subklonet som et BamH 1-fragment inn i pGEM-32 (fra Promega, Madison, WI, USA).
Dette plasmid ble linearisert med Hindlll og CAT-gentranskripter ble oppnådd under anvendelse av T7 RNA polymerase
32
med 220 /xM [a- P]UTP. Ribozymsekvenser ble syntetisert som oligodeoksynukleotider, henholdsvis RZ CAT-l, 2 og 3. De ble
kinasebehandlet, ligert med fosfatasebehandlet EcoRI-Pstl-kuttet pGEM4 og inkubert med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase 1 før bakteriell transformasjon. EcoRI-lineariserte plasmider ble transkribert med T7 RNA-polymerase og produserte ribozym RNA. Ribozymer ble inkubert med CAT-transkript i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM MgCl2 ved 50°C i 60 minutter, og produktene fraksjonert med 5 % polyakrylamid, 7M urea, 25 % formamidgelelektroforese før autoradiografi.
Når 84 0-nukleotid CAT-transkriptet ble inkubert med hvilken som helst av de tre ribozymer, forekom effektiv og høy sekvensspesifikk kutting (fig. 5) og produserte to RNA-fragmenter i hver reaksjon. Fragmentstørrelsene var i samsvar med de forutsagte seter for kutting, (d.v.s. 139 og 696, 494 og 341, 662 og 173 basefragmenter var henholdsvis 5' og 3' produktene fra RzCAT-1 til 3 katalysert kutting). Betingelsene for disse ribozymkatalyserte kuttinger var tilsvarende dem som iakttas for naturlig forekommende kuttereaksjoner (Foster, A.C. og Symons, R.H., Cell 49: 211-220
(1987) og Foster, A.C. og Symons, R.H., Cell 50: 9-16
(1987)), med mer effektiv kutting forekommende ved forhøyet pH, temperatur og toverdige kationkonsentrasjoner (data ikke vist) . Når de er tilstede i molart overskudd katalyserte de tre ribozymer nesten fullstendig kutting av CAT RNA-substratet etter 60 minutter i 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 20 mM MgCl2 ved 50°C. Under lignende betingelser med 0,1/iM substrat og 3 /zM ribozymer var '^ 1/ 2 av CAT tnRNA_su^stratet henholdsvis 3,5, 3,5 og 2,5 minutter i nærvær av RzCAT-1 til 3 . Ribozymsekvensene var inaktive overfor komplementet av substratet RNA (d.v.s. ( + ) tråden) og i form av oligodeoksyribonukleotider (data ikke vist). De 3<1> terminale kutte-fragmenter fra hver ribozymkatalysert reaksjon ble isolert og 5'<32>P-kinasebehandlet (50 mM Tris HCl, pH 9, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT med 50 //Ci Y-<32>p ATP og fem enheter T4 polynukleotid-kinase i 30 minutter ved 37°C). Effektiv kinasebehandling av fragmentene indikerte at de hadde 5' terminale hydroksy-grupper, tilsvarende dem som produseres ved naturlig forekommende kuttereaksjoner. Det terminale nukleotid av fragmentene produsert ved kutting av CAT-sekvensene med RzCAT-1 til 3 ble bestemt. Kort sagt ble radiomerkede fragmenter renset på en 5 % polyakrylamidgel og behandlet med et like stort volum av 50 0 enheter/ml RNase Tl, 25 enheter/ml RNase T2 og 0,125 mg/ml RNaseA i 50 mM ammoniumacetat, pH 4, 5, i 12 0 minutter ved 3 7°C. Produktene ble fraksjonert på en 2 0 % polyakrylamidgel inneholdende 2 5 mM natriumcitrat, pH 3,5, og 7 molar urea. Fig. 5b viser at kuttingen av CAT-sekvensene ved RzCAT-1 til 3 foregår nøyaktig før de respektive nukleotider A,U og G.
Den terminale sekvens av CAT-genfragmentene ble bestemt direkte under anvendelse av den partielle enzymatiske behandlingsteknikk (Donis-Keller et al., Nucleic Acids Res. 4: 2527-2538 (1980)) under anvendelse av basespesifikk partiell ribonukleolytisk kutting. Sekvensen av fragmentene bekreftet at kutting forekom ved de forventede steder inne i CAT RNA (ikke vist).
Enzymatisk katalyse:
For å demonstrere at ribozymer bevirker kutting av CAT mRNA-substratet på en katalytisk måte, ble hvert inkubert med et molart overskudd av substrat, under betingelser som bør begunstige både effektiv kutting og produktdissosiasjon.
Fig. 6 viser resultatene av et forsøk hvor etter 75 minutter ved 50°C, pH 8,0 i 20 mM MgCl2, 10 pmol RzCAT-1 hadde katalysert spesifikk kutting av 163 pmol av et avkortet CAT mRNA (173 baser) substrat til å gi 5' og 3' fragmenter med henholdsvis 13 9 og 34 baser. Gjennomsnittlig hadde hvert ribozym deltatt i mer enn ti kutteprosesser. Etter 75 minutter ved 50°C ble det bemerket noen ikke-spesifikk kutting av RNA som skyldes de ekstreme betingelser, men 70 % av de resterende intakte RNA (163 pmol) hadde akkumulert som 13 9 basefragmentet. Lignende resultater ble oppnådd for RzCAT-2 og 3 (data ikke vist), og således virker hvert som et RNA-enzym.
EKSEMPEL 3
Virkning av temperaturen på ribozymaktivitet:
Virkningen av reaksjonstemperaturen på in vitro graden av ribozymaktiviteten ble undersøkt.
Et tidsforløp for reaksjoner for ribozymer RzCAT-1 til 3 på CAT RNA-substrat ved 3 7°C og 50°C ble gjennomført.
Ved dette forsøk ble reaksjoner for hvert ribozym utført dobbelt, under anvendelse av reaksjonsbetingelsene for ribozymkutting angitt i eksempel 2. En reaksjon ble inkubert ved 3 7°C og den andre ved 50°C. Prøver ble fjernet ved tidspunkter opp til 90 minutter og reaksjonsgraden ble analysert ved denaturerende plyakrylamidgelelektroforese.
Fig. 7 viser tidsforløpet for reaksjonen for hvert av ribozymene RzCAT-1 til 3 ved 37°C og 50°C. Reaksjonshastigheten for hvert ribozym øker med økt reaksjonstemperatur.
Tiden for 50 % (t1/2) kutting av CAT RNA er angitt i tabell 1.
Som vist i tabell 1 er reaksjonshastigheten for ribozymer ved 3 7°C omtrent 2 0 ganger saktere enn reaksjonshastigheten ved 50°C.
EKSEMPEL 4
Virkningene av å variere armlengdene av ribozymer (eller flankerende sekvens) på ribozymkatalytisk aktivitet: Armene eller flankerende sekvenser av et ribozym (region i tidligere angitte formler) hybridiserer ribozymet til et target RNA hvoretter kutting av RNA foregår. Ved dette forsøk ble det undersøkt virkningen på kuttegraden av en targetsekvens ved å endre graden av komplementæritet og derav følgende lengde av bareparing av ribozymarmene til targetsekvensen.
Ribozymer ble fremstilt med 4, 8 og 12 basekomplentæritet til targetsekvensen RzCAT-2 på hver arm (fig. 8a) . Ribozymene ble fremstilt ved hjelp av metodene i eksempel 2. Ribozymaktiviteten ble bestemt ved å inkubere ribozym RNA med CAT RNA som tidligere beskrevet.
Ribozymet med en 4 basekomplementæritet på hver arm kuttet ikke substrat RNA. Ribozymet med 8 basekomplementæritet på hver arm kuttet CAT-substratet og tilsvarende for ribozymet med 12 basekomplementæritet. Ribozymer med 12 basekomplementæritet kuttet target RNA mer effektivt, som bedømt ved reaksjonshastigheten in vitro, enn ribozymer med et mindre antall av basekomplementæriteter. Selv om det synes nødvendig å ha mer enn 4 basekomplementæritet, vil økning av lengden av den hybridiserende region av ribozymer øke deres reaksjons-hastighet.
I et ytterligere forsøk ble reaksjonseffektivitet av et ribozym med (a) komplementæritet til hele lengden av CAT-transkripttarget RNA og (b) multiple katalytiske domener undersøkt.
Fire GUC-targetseter i CAT RNA sekvenser ble valgt. Ribozymkatalytiske domener mot disse seter ble "innskutt" i en komplett antisense (-)-sekvens for CAT-transkriptet og den katalytiske aktivitet ble testet.
De fire valgte seter var de tre som er spesifisert ved RzCAT-1 til 3 beskrevet i det foregående og et ytterligere sete som kan representeres som følger:
Nytt CAT-sete
nr. 192
hvori "192" refererer til aminosyren 192 i CAT-polypeptidet og refererer til kuttesetet.
Oligodeoksyribonukleotider inneholdende ribozymkatalytiske domener og som spenner over hvert av disse kutteseter ble anvendt for M13 mutageneseforsøk for å fremstille en sekvens inneholdende hele komplementet av CAT-sekvensen, men med de fire ribozymkatalytiske domener inskutt deri. M13 mutagenese ble gjennomført ved binding av oligonukleotider inneholdende ribozyminnskudd til enkelttrådede M13 DNA inneholdende uracil, etterfulgt av syntese av komplementære DNA inneholdende innskuddet. De komplementære DNA ble isolert etter kloning i en passende Escherichia coli stamme (T.A. Kunkel 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 488-492). Det resulterende dobbelttrådede cDNA ble klonet i en in vitro ekspresjonsvektor for å produsere ribozym RNA under anvendelse av T7-polymerase transkripsjonssystemet. Ribozymaktiviteten ble bestemt ved inkubasjon av ribozym RNA med CAT-transkript etterfulgt av gelelektroforese av reaksjonsblandingen, etter glyoksalbehandling for å denaturere nukleinsyrene.
Autolytisk kutting foregikk ved alle de forventede seter på CAT-transkriptet. Følgelig kan de flankerende sekvenser av armer eller et ribozym strekke seg langs den fulle lengde av RNA-transkriptet som skal kuttes.
Fig. 9 viser skjematisk produksjon av katalytisk antisense RNA inneholdende hvert av de fire ribozymer. Det katalytiske antisense RNA inneholder omtrent 90 0 baser.
Under de ovennevnte reaksjonsbetingelser danner ribozymet og targetsekvensene komplekser med høy molekylvekt antagelig ved hjelp av utstrakt baseparing. En sterk denaturerende behandling som f.eks. glyoksalbehandling er nødvendig for å resol-vere reaksjonsprodukter under elektroforese.
EKSEMPEL 5
Targetsekvenser for ribozymkutting:
GUA-enheten i mRNA ble testet for å se om et ribozym ville bevirke RNA-kutting av denne sekvens.
Et spesifikt sete i CAT mRNA, inkluderende GUA-enheten
(fig. 10a) ble valgt og en passende ribozymsekvens ble fremstilt og testet for aktivitet. Ribozymet inneholdt armer av åtte ribonukleotider.
Syntetiske oligonukleotider tilsvarende ribozymet i fig. 10 ble fremstilt i samsvar med eksempel 2 og dobbelttrådet cDNA klonet inn i en in vitro ekspresjonsvektor (pGEM4, se-det foregående) i E. coli for å produsere ribozym RNA under anvendelse av T7 polymerasetranskripsjonssystemet. Ribozymaktivitet ble bestemt ved inkubering av ribozym RNA med CAT mRNA etterfulgt av gelelektroforese av reaksjonsblandingen som tidligere beskrevet.
Ribozymet bevirket kutting av GUA-targetsetet (ikke vist). Følgelig er enheten GUA i RNA et substrat for ribozymer fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Dette var ikke fullstendig uventet ettersom et naturlig forekommende kuttesete i satellitt RNA av Lucerne Transient Streak virus krever gjenkjennelse av et GUA-sete.
På lignende måte ble en GUU-enhet i CAT RNA targetsekvensen testet med et passende ribozym (se fig. 10b), og kutting ble bevirket.
EKSEMPEL 6
Ribozymkutting av viralt RNA:
Viroid RNA i form av Citrus Exocortis viroid RNA ble kuttet under anvendelse av et ribozym fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.
To GUC-targetseter ble valgt i Citrus Exocortis viroid (CEV) RNA. Et sete i den komplementære trådsekvens ble også valgt. Ribozymer ble fremstilt mot alle disse seter og testet for aktivitet. Ribozymene ble betegnet CEV9x(+), CEV9x(-) og CEV25x( + ) . Fig. 11 viser de tre kutteseter i CEV RNA for hvert av disse ribozymer.
Ribozymer ble fremstilt i henhold til de tidligere metoder. Ribozym RzCEV25x(+) er vist i fig. 12. Dette ribozym kutter GUC-enheten ved nukleotid 116 av CEV RNA.
Fig. 12b viser kutting av CEV RNA med ribozym RzCEV9x( + ) . Ingen kutting iakttas med ribozym RzCAT9x(-) .
Dette forsøk indikerer at ribozymer er aktive mot target RNA-sekvenser fra forskjellige kilder. Dette kunne forventes, ettersom alle RNA er dannet fra de grunnleggende ribonukleotid-byggeblokker av adenin, guanin, cytosin og uracil, uansett deres animalske, plante- eller mikrobielle opprin-nelse .
EKSEMPEL 7
Eksempler på ribozymer med variable katalytiske domener:
Et ribozym som er targetrettet mot et CAT-2 sete ble fremstilt under anvendelse av den katalytiske domenesekvens fra satellitt RNA av subterreng Clover Mottle virus (SCMoV). Tolv basekomplementæritet av ribozymarmflankerende sekvens ble innlemmet i konstruksjonen av ribozymet RzSCMoV. Ribozymene RzCAT-2 og RzSCMoV er vist i fig. 13a henholdsvis 13b. Løkkeregionen av RzSCMoV inneholder fem nukleotider med sekvensen AAAUC. Dette er i motsetning til løkkeregionen RzCAT-2 som inneholder fire nukleotider med sekvensen AGAG.
I tillegg inneholder RzSCMoV en C i den katalytiske region, i stedet for U<*> i RzCAT-2. De forskjellige sekvenser i RzSCMoV i sammenligning med RzCAT-2 er markert.
RzSCMoV ble fremstilt i henhold til eksempel 2. RzSCMoV var aktivt og gir to kutteprodukter som forventet.
Ved et ytterligere forsøk ble Citrus Exocortis viroid (CEV)
targetsete ved nukleotid -336 i sitt komplementære RNA kuttet under anvendelse av et ribozym RzCEV2 med sekvensen angitt i fig. 14a. Løkkeregionen betegnet med bokstaven "L" i fig. 14 omfatter seks nukleotider med sekvensen 3<1->CCTATA-5<1>. Dette er forskjellig fra løkkeregionen av sTobRV som omfatter fire nukleotider med sekvensen 3'-AGAG-5'. Dette ribozym kutter
target CEV komplementært RNA ved posisjon - 336 som vist i den elektroforetiske profil av fig. 14b.
Dette forsøk indikerer at antallet av nukleotider, og nukleotidsekvensen av løkkeregionen er uviktig ved ribozymaktiviteten. I disse forsøk ble ribozymet fremstilt ved hjelp av metoder som er beskrevet tidligere i beskrivelsen.
Ved et ytterligere forsøk ble virkningen av baseparing i det katalytiske område (stammeområde) på ribozymaktiviteten undersøkt.
Et modifisert ribozym tilsvarende RzCAT-2 men inneholdende fire ekstra basepar ble fremstilt og testet. I fig. 15a er sekvensen av ribozymet RzCAT-2 vist hybridisert til target CAT RNA. Testribozymet er vist ved 15b, med de ytterligere basepar innrammet. Testribozymet hadde sammenlignbar aktivitet med RzCAT-2. Dette indikerer at den baseparede region av det ribozymkatalytiske domene kan ha varierende lengde uten å påvirke katalytisk aktivitet.
Det er iakttatt (data ikke vist) at den stabile in vivo form av sTobRV RNA-transkripter uttrykt i transgene planter primært er sirkulær, antagelig på grunn av ligering av 5' og 3'-enden. Bruken av to autolytiske kutteseter som flankerer en sekvens av interesse i et in vivo RNA-transkript vil således sannsynligvis føre til et sirkularisert produkt som kan ha større stabilitet enn lineære transkripter. Denne metode synes å tilveiebringe en ny metode for in vivo stabilisering av ribozymsekvenser. Denne betegnes sirkular-isering.
REFERANSEEKSEMPEL
In vivo aktivitet av ribozymer:
In vivo aktivitet av ribozymer i planteceller undersøkes i dette eksempel.
Forsøksprotokoll.
Plasmider inneholdende anti-CAT (CAT=kloramfenikolacetyltransferase) eller kombinert anti-CAT/ribozymgen-konstruksjoner (se det følgende) ble innført i tobakksprotoplaster i samme mengde og forhold til hverandre, sammen med et ytterligere plasmid som inneholdt en funksjonell CAT-genkonstruksjon. CAT-aktiviteter ble målt og sammenlignet med basisnivå for genaktivitet.
Materialer og metoder:
a) Elektroporeringer og CAT-bestemmelser.
Disse ble gjennomført som beskrevet i Llewellyn et al. J.
Mol. Biol. (1987) 195: 115-123. Kort sagt ble protoplaster av Nicotiana plumbaginifolia linje T5 fremstilt fra en suspensjon to døgn etter subdyrking, suspendert i 10 mM HEPES, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,2M mannitol og innstilt til en densitet på 3 x l06/ml. Elektroporering ble gjennomført under anvendelse av en enkelt 50 ms puls ved 250V. Protoplaster ble fortynnet ti ganger og dyrket i 2 0 timer ved 2 6°C i mørke. De ble brutt opp ved ultralydbehandling og ekstrak-ter oppnådd. Ekstraktene ble normalisert med hensyn til proteininnhold og bestemt for CAT-aktivitet in vitro under anvendelse av <14>C-kloramfenikol og acetyl CoA. Reaksjonsprodukter ble separert ved hjelp av tynnsjiktkromatografi og visualisert ved hjelp av autoradiografi. Graden av reaksjoner ble beregnet ved produksjon av radioaktive produkt-derivater fra <14>C-kloramfenikolmodellen.
b) Genkonstruksjoner.
Genkonstruksjoner ble innført i 0,1 ml protoplastsuspensjoner
som plasmid DNA som var blitt renset fra bakterier ved ekstraksjon og to sykluser av CsCl-ekvilibriumdensitet gradientsentrifugering. De ble resuspendert i 10 mM Tris/l mM EDTA/pH=7,5 for bruk.
Den aktive CAT-genkonstruksjon ble overført på plasmidet betegnet pCAT7+. Det ble avledet ved fusjon av en CAT-gensekvens (fra plasmid pCM4, se T.J. Close og R. Rodriguez, 1982, Gene 20: 305-316) inn i plasmidet pJ35SN (avledet fra p35SN, W.L. Gerlach et al., 1987, Nature 328: 802-805) slik at den aktive genkonstruksjon var:
35S refererer til 35S CaMV (Cauliflower Mosaic virus) promoter, NOS til nopalin syntetase polyadenyleringssignal, T/C til transkripsjon.
Sammen med 0,2 fig av pCAT7+ ble det tilsatt forskjellige genkonstruksjoner i overskudd som beskrevet i det følgende. Genkonstruksjonene var inneholdt i plasmider med følgende betegnelser: pJ3 5SN - Dette vektorplasmid, hvorav et kart er vist i
fig. 16, inneholder en 3 5S CaMV promoter og plante-nopalinsyntase 3' polyadenyleringssignal, som kan avbildes som følger: pCAT7- - Dette inneholder CAT-gensekvensen innskutt i pJ35SN
slik at transkripsjon vil resultere i produksjon av antisense CAT RNA, som kan avbildes som følger: pCAT19- - Dette inneholder CAT-genet med fire katalytiske
ribozymdomener inkludert deri (se eksempel 4 og fig. 9), innskutt i pJ35SN slik at transkripsjon vil resultere i fremstilling av antisense CAT RNA inneholdende fire katalytiske ribozymdomener, som kan avbildes som følger:
katalytiske domeneinnskudd
Resultater:
Den følgende tabell viser de relative CAT-aktiviteter i celler tyve timer etter elektroporering. Aktivitet uttrykkes som prosent omdannelse av kloramfenikolsubstrat ved et en times forsøk.
Følgende konklusjon kan trekkes fra disse resultater:
a) Innføring av CAT genkonstruksjonen resulterer i vesentlig CAT-aktivitet - sammenlign 2A, B med IA, B. Det er
variabilitet mellom duplikatene. Fra de tendenser som sees i de andre prøver (se "b" og "c" i det følgende) er
det sannsynlig at 2A viser en abnormt lav aktivitet.
b) Samtidig innføring av en antisense genkonstruksjon resulterer i en nedsettelse i aktivitetsnivået - sammenlign 3A, B og 4A, B med 2B. Graden av nedsettelse er direkte relatert til nivået av antisense gen tilsatt som
plasmid - sammenlign 3A, B og 4A, B.
c) Samtidig innføring av den kombinerte antisense/ribozym genkonstruksjon resulterer i en nedsettelse i genaktivitet - sammenlign 5A, B og 6A, B med 2B. Videre er nedset-telsen mer markert enn for de tilsvarende nivåer av antisense genkonstruksjoner - sammenlign 5A, B med 3A, B og 6A, B med 4A, B.
De gjennomsnittlige resultater for fire in vivo forsøk er vist i fig. 17. I denne figur representerer "Kontroll" behandling 2. "Antisense" representerer behandling 4. "Katalytisk" representerer behandling 6 og "Bakgrunn" representerer behandling 1.
Det katalytiske ribozym inhiberer CAT-aktivitet med et gjennomsnitt på 4 7 %, sammenlignet med et gjennomsnitt på 34 % for et antisense ribozym.
Innføring av ribozymbærende gener i planteceller inhiberer aktiviteten av genene som de er targetrettet mot. Videre er inhiberingen større enn for tilsvarende antisense RNA-molekyler .
Disse resultater viser at ribozymer vil være aktive i animalske, plante- eller mikrobielle celler mot et område av target RNA-molekyler.
Virkningsmekanismene for ribozymene i dette eksempel er uklare. F.eks. kan antisense ribozymet irreversibelt hybridisere til et target RNA og katalysere fosfodiester-båndkutting ved ett eller flere selekterte targetseter langs target RNA. Alternativt kan cellulære enzymer vikle opp antisense RNA fra sin targetsekvens, slik at target RNA kuttes_ opp i to eller flere fragmenter.
EKSEMPEL 8
In vivo aktivitet av ribozymer i animalske celler: Aktiviteten av ribozymer ved inaktivering av et target RNA i mammalceller er demonstrert i dette eksempel.
Materialer og metoder:
De aktive genkonstruksjoner som koder for ribozymer ble transfisert inn i den lett tilgjengelige apenyre-cellelinje COSI ved elektroporering. I denne metode ble 3 x 10<6>/ml COSl-celler suspendert i en bufret saltløsning med 10 % FCS (fatalt kalveserum) bragt i kontakt med forskjellige genkonstruksjoner og en elektrisk utladning påsatt for å bevirke elektroporering av DNA inn i cellene. De transfiserte celler ble inkubert ved 37°C i 48 timer i dyrknings-medium før bestemmelse av CAT og luciferaseaktivitet.
CAT-genkonstruksjonene ble overført på plasmidet betegnet pTK CAT (Miksicek et al., Cell 46: 283-290, 1986). Dette plasmid var avledet ved innføring av en CAT-gensekvens inn i plasmidet pSV2 slik at det er under kontroll av tymidin-kinasepromoteren av herpes simpleks virus.
Genkonstruksjoner som koder for ribozymer ble overført på plasmidet pSV232A (De Wet et al., Molecular and Cellular Biology 7: 725-737, 1987) inneholdende luciferasegenet fusjonert til SV40 tidlig promoter. DNA-kodende ribozymer ble ligert inn i Xbal-setet ved 3•-enden av luciferasegenet i henhold til standardmetodene til Maniatis et al.
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, 1982) .
De følgende konstruksjoner ble fremstilt under anvendelse av standardmetodene til Maniatis et al. (Supra): pFC58 - Denne plasmidvektor inneholder DNA som koder for ribozym RzCAT-1 fusjonert til 3'-enden av luciferasegenet i en ikke-funksjonell orientering.
Dette.kan avbildes som følger:
hvor 232A refererer til pSV232A-sekvenser, SV40 tidlig refererer til den tidlige promoter av SV4 0 og liten T er DNA som koder for den lille T mellomliggende sekvens av SV40. Denne konstruksjon resulterer i konstruksjon av et RNA-molekyl som koder for luciferase og ribozymet RzCAT-1, idet det siste er i en orientering slik at det ikke ville ventes at det var katalytisk.
pFC4 - Dette plasmid er det samme som pFC58 med unntagelse av at RzCAT-1 er erstattet med RzCAT-3. pFCl-6 - Dette plasmid er det samme som pFC58 med unntagelse av at RzCAT-l er erstattet med RzCAT-3 i
sense-orienteringen 5'-3'.
pFC2 0 - Dette plasmid er det samme som pFCl-6 med unntagelse av at RzCAT-3 er erstattet med RzCAT-2 med
åtte nukleotidflankerende sekvenser.
pFCl2 - Dette plasmid er det samme som pFC2 0 med unntagelse av at ribozymet RzCAT-2 inneholder tolv
nukleotidflankerende sekvenser.
pFC50 - Dette plasmid inneholder CAT-genet med fire katalytiske ribozymdomener inkludert deri (se eksempel 4 og fig. 9) i sense-orienteringen 5'-3', som ved transkripsjon gir anledning til et inaktivt ribozym.
Dette plasmid kan avbildes som følger:
pFC54 - Dette plasmid er det samme som pFC50 med unntagelse av at CAT-genet og ribozymdomenene er i
antisense 3'-5' aktiv orientering.
pFC64 - Dette plasmid deler SV4 0-promoteren og polyadenyl-eringssignaler med pFC50 og inneholder villtype CAT-genet uten noen innskutte ribozymdomener. Dette gen er i en antisense-orientering og
frembringer således ikke CAT-protein.
pFC65 - Dette plasmid er det samme som pFC64 med unntagelse av at villtype CAT-genet er i sense 5'-3<* >orienteringen og er således produktivt for CAT-protein .
Bestemmelser:
Luciferaseaktivitet ble bestemt ved hjelp av metodene til
De Wet et al. (Supra). Kort sagt ble COS-celler lysert 48 timer etter transfeksjon, og cellelysatet inkubert med luciferin, substratet for luciferase, og luminiscens-detektert under anvendelse av en seintillasjonsteller.
CAT-aktivitet ble også målt under anvendelse av COS-cellelysater (cellelysater ble oppdelt i to, og hver del bestemt enten for luciferase eller CAT-aktivitet), i henhold til metoden til Sleigh, M.J., Anal. Biochem. 156: 251-256
(1986) .
I in vivo forsøkene påvirket pFC58 og pFC4 ikke CAT-aktiviteten i transfiserte celler. Denne aktivitet ble betegnet med 100 % CAT-aktivitet og 0 % CAT-undertrykking. CAT-aktiviteten i celler transfisert med andre plasmider ble målt i forhold til pFC58. Prosent av CAT-undertrykkeIse ble målt som
normalisert til luciferaseproduksjon. CATtest = CAT"Destem" melsesresultat for testkonstruksjoner. ^"^Jcontroll = <-AT~ bestemmelse for kontrollkonstruksjoner (pFC4 og pFC58).
Luciferaseproduksjon er en intern kontroll for elektroporering og gir et mål på ribozymfremstilling inne i hver individuelt elektroporert vevsdyrkningsplate.
Resultater:
Forsøk (i)
Alle behandlinger ble gjennomført i duplikat og en gjennomsnittlig verdi er anført.
Forsøk (ii)
Behandlinger 5 til 10 ble gjennomført i duplikat og en gjennomsnittlig verdi er anført.
Behandlinger ble gjennomført femdobbelt og en gjennom-snittsverdi er gitt.
Forsøk (iv)
Hver av behandlingene 13 til 16 ble gjennomført firedobbelt.
Sense CAT-konstruksjonen (behandling 16) medførte høye nivåer av CAT-aktivitet i seg selv og prosent undertrykkelse er derfor ikke anført (NA).
Et antall forsøk ble også gjennomført med TK-promoteren av pTKCAT erstattet med den humane metallotioneinpromoter. Når denne CAT-konstruksjon ble kotransfisert inn i COSl-celler med plasmider som koder for ett eller flere ribozymer ble det iakttatt en markert nedsettelse i CAT-aktiviteten.
De ovennevnte resultater viser klart den in vivo inaktiver-ende aktivitet av ribozymer i animalske celler.
Mens effektiviteten av ribozymene in vivo antas å skyldes en eller flere katalytiske regioner som er i stand til kutting av et target RNA, behøver nærværet av slike regioner i "antisense" RNA-type ribozymer faktisk ikke føre til kutting in vivo hvis hele RNA/antisense RNA-molekylet ikke går i stykker. Uansett om molekylet går i stykker eller ikke, viser imidlertid de foregående eksempler effektiviteten av ribozymet ved inaktivering av target RNA. Således er oppfinnelsen anvendbar for alle ribozymer med en katalytisk region i stand til å bevirke kutting og en hybridiserende region, uansett om kutting faktisk foregår i target RNA, d.v.s. den hybridiserende region kan være så stor at den bevirker at det kombinerte RNA/ribozym blir stående samlet og forhindrer at target RNA kuttes til separate komponenter selv om den katalytiske region i seg selv er i stand til å bevirke kutting.
Claims (8)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et ribozym som har formelen:
hvori hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,
hvor hver av (X)n og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen,
hvor hver av n og n<1> representerer et helt tall som definerer antallet ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n<1> er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,
hvor hver * representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvor a representerer et helt tall som definerer et antall ribonukleotider med den betingelse at a kan være 0 eller 1 og hvis 0 er A som er lokalisert 5' til (X)a bundet til G lokalisert 3' til (X)a,
hvor hver av m og rn' representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,
hvori.hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding bestående av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og
hvori (X)b representerer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b represen-terer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)b er tilstede,
for bruk i human eller veterinær medisin, karakterisert ved at det benyttes en standard genteknologisk fremgangsmåte.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvori ribozymet er et ribozym som har formelen:
hvori hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,
hvori hver av (X^^ og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen,
hvori hver av n og n' representerer et helt tall som definerer antallet ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n<1> er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabiLt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,
hvor hver * representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori a representerer et helt tall som definerer et antall ribonukleotider med den betingelse at a kan være 0 eller 1 og hvis 0 er A som er lokalisert 5' til (X)a bundet til G lokalisert 3' til (X)a,
hvor hver av m og m<1> representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,
hvor hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og
hvori (X)b representerer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)b er tilstede,
karakterisert ved at tilsvarende standard genteknologisk fremgangsmåte benyttes.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvori ribozymet er et ribozym som har formelen:
hvor hver X representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,
hvori hver av (Xjj^ og (X)n, representerer et oligoribonukleotid som har en forutbestemt sekvens som er i stand til å hybridisere med en RNA-targetsekvens som skal kuttes og som er definert ved en forutbestemt sekvens som ikke forekommer naturlig kovalent bundet til henholdsvis sekvensene C-A-A-A-G-C- og X-C-U-G-A-, idet slik RNA-targetsekvens ikke er tilstede i forbindelsen,
hvori hver av n og n' representerer et helt tall som definerer antallet ribonukleotider i oligonukleotidet med den betingelse at summen av n + n' er større enn eller lik 7 og er tilstrekkelig til å tillate ribozymet å stabilt interagere med RNA-targetsekvensen gjennom baseparing,
hvori hver * representerer baseparing mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori hver hel linje representerer en kjemisk binding som består av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav,
hvori hver av m og rn' representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,
hvori hver av de stiplete linjer uavhengig representerer enten en kjemisk binding bestående av kovalente bindinger mellom ribonukleotidene lokalisert på den ene eller andre siden derav, eller fraværet av enhver slik kjemisk binding, og
hvori (X)b representerer et oligoribonukleotid som kan være tilstede eller fraværende med den betingelse at b representerer et helt tall som er større enn eller lik 2 hvis (X)b er tilstede,
karakterisert ved at tilsvarende standard genteknologisk fremgangsmåte benyttes.
4 . Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-3, hvori summen av n + n<1> er større enn eller lik 14, karakterisert ved at tilsvarende standard genteknologisk fremgangsmåte benyttes.
5. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-4, hvori hver av n og n<1> er større enn 6, karakterisert ved at tilsvarende standard genteknologisk fremgangsmåte benyttes.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av et ribozym som har formelen: 3'-[-(Y)r-Q-(Y)s-]z-5'
hvori Q representerer en forbindelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-4,
hvori hver Y representerer et ribonukleotid som kan være lik eller forskjellig,
hvori hver av r og s representerer et helt tall som kan være større enn eller lik 0, og
hvori z representerer et helt tall som er større enn eller lik 1,
for bruk i human eller veterinær medisin, karakterisert ved at det benyttes en standard genteknologisk fremgangsmåte.
7. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1-6, hvori RNA-targetsekvensen som skal kuttes er en viral RNA-sekvens,
karakterisert ved at tilsvarende standard genteknologisk fremgangsmåte benyttes.
8. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 7,
karakterisert ved at ribozymet fremstilles ved en metode som omfatter trinnene med: (a) ligering inn i en transfervektor omfattende DNA, RNA eller en kombinasjon derav av en nukleotidsekvens tilsvarende den nevnte forbindelse, (b) nukleotidsekvensen fra trinn (a) transkriberes --med en RNA-polymerase, og (c) forbindelsen isoleres.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AUPI591187 | 1987-12-15 | ||
AUPI995088 | 1988-08-19 | ||
AUPJ035388 | 1988-09-09 | ||
AUPJ130488 | 1988-11-04 | ||
AUPJ133388 | 1988-11-07 | ||
PCT/AU1988/000478 WO1989005852A1 (en) | 1987-12-15 | 1988-12-14 | Ribozymes |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20000369L NO20000369L (no) | 1990-08-14 |
NO20000369D0 NO20000369D0 (no) | 2000-01-25 |
NO312105B1 true NO312105B1 (no) | 2002-03-18 |
Family
ID=27507391
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO902661A NO308610B1 (no) | 1987-12-15 | 1990-06-14 | Ribozymer for anvendelse som midler for behandling av planter, fremgangsmÕte for fremstilling derav, og preparater omfattende slike ribozymer |
NO20000369A NO312105B1 (no) | 1987-12-15 | 2000-01-25 | Fremgangsmåte for fremstilling av ribozymer |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO902661A NO308610B1 (no) | 1987-12-15 | 1990-06-14 | Ribozymer for anvendelse som midler for behandling av planter, fremgangsmÕte for fremstilling derav, og preparater omfattende slike ribozymer |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0640688A1 (no) |
JP (1) | JP3046318B2 (no) |
KR (1) | KR970010758B1 (no) |
CN (1) | CN1102174C (no) |
AR (1) | AR243935A1 (no) |
AT (1) | ATE115999T1 (no) |
AU (1) | AU632993B2 (no) |
CA (1) | CA1340831C (no) |
DE (1) | DE3852539T3 (no) |
DK (1) | DK175956B1 (no) |
ES (1) | ES2065919T5 (no) |
FI (1) | FI104562B (no) |
GR (1) | GR3015374T3 (no) |
HU (2) | HUT54407A (no) |
MC (1) | MC2115A1 (no) |
NO (2) | NO308610B1 (no) |
NZ (1) | NZ227332A (no) |
RO (1) | RO114469B1 (no) |
WO (1) | WO1989005852A1 (no) |
Families Citing this family (182)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5019556A (en) * | 1987-04-14 | 1991-05-28 | President And Fellows Of Harvard College | Inhibitors of angiogenin |
CA1340323C (en) * | 1988-09-20 | 1999-01-19 | Arnold E. Hampel | Rna catalyst for cleaving specific rna sequences |
US5866701A (en) * | 1988-09-20 | 1999-02-02 | The Board Of Regents For Northern Illinois University Of Dekalb | HIV targeted hairpin ribozymes |
US5624824A (en) * | 1989-03-24 | 1997-04-29 | Yale University | Targeted cleavage of RNA using eukaryotic ribonuclease P and external guide sequence |
US5168053A (en) * | 1989-03-24 | 1992-12-01 | Yale University | Cleavage of targeted RNA by RNAase P |
DE4091533T (no) * | 1989-08-31 | 1992-01-30 | ||
US5225337A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Ribozyme compositions and methods for use |
US5225347A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors |
DE3933384A1 (de) * | 1989-10-06 | 1991-04-18 | Hoechst Ag | Multifunktionelle rna mit selbstprozessierungsaktivitaet, ihre herstellung und ihre verwendung |
DE3935473A1 (de) * | 1989-10-25 | 1991-05-02 | Hoechst Ag | Rna mit endonuclease- und antisense-aktivitaet, ihre herstellung und ihre verwendung |
HUT63170A (en) * | 1990-01-11 | 1993-07-28 | Isis Pharmaceuticals Inc | Process and composition for detecting and modifying rna activity and gene expression |
US5519164A (en) * | 1990-02-01 | 1996-05-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Expression of a multigene RNA having self-splicing activity |
DE4002885A1 (de) * | 1990-02-01 | 1991-08-08 | Hoechst Ag | Expression einer multigen rna mit self-splicing aktivitaet |
US5180818A (en) * | 1990-03-21 | 1993-01-19 | The University Of Colorado Foundation, Inc. | Site specific cleavage of single-stranded dna |
WO1991018913A1 (en) * | 1990-06-07 | 1991-12-12 | City Of Hope | Ribozyme mediated reversal of transformation by cleavage of the hras oncogene rna |
WO1991018625A1 (en) * | 1990-06-07 | 1991-12-12 | City Of Hope | Ribozyme mediated reversal of transformation by cleavage of the hras oncogene rna |
US6008343A (en) * | 1990-06-19 | 1999-12-28 | Gene Shears Pty. Ltd. | Nucleotide based endonucleases |
WO1991019789A1 (en) * | 1990-06-19 | 1991-12-26 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Endonucleases |
US5246921A (en) * | 1990-06-26 | 1993-09-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Method for treating leukemias |
EP0639226A1 (en) * | 1990-06-26 | 1995-02-22 | The Wistar Institute | Rna molecule for use in treating leukemias |
JPH06502988A (ja) * | 1990-07-26 | 1994-04-07 | ファウンデーション・フォー・リサーチ・アンド・テクノロジー ― ヘラス(エフオー.アール.ティー.エイチ.)インスティテュート・オブ・モレキュラー・バイオロジー・アンド・バイオテクノロジー | ポータブルリボザイムカセット、それを含有するdna配列、これらdna配列によりコードされるリボザイム、およびこれらリボザイムを含有する組成物 |
JP3257675B2 (ja) | 1990-10-12 | 2002-02-18 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルング デル ビッセンシャフテン エー.ファウ. | 修飾リボザイム |
NZ314629A (en) * | 1991-01-17 | 2000-08-25 | Gen Hospital Corp | Use trans-splicing ribozymes to prepare medicaments for gene therapies |
NZ314630A (en) * | 1991-01-17 | 2000-11-24 | Harvard College | Use of trans-splicing ribozymes for genetic modification and cell ablation in a host cell |
FR2675803B1 (fr) | 1991-04-25 | 1996-09-06 | Genset Sa | Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications. |
FI913197A0 (fi) | 1991-07-01 | 1991-07-01 | Xyrofin Oy | Nya jaeststammar med reducerad foermaoga att metabolisera xylitol, foerfarande foer bildande av dessa och deras anvaendning vid framstaellning av xylitol. |
JPH07502898A (ja) * | 1992-01-13 | 1995-03-30 | デューク・ユニバーシティー | 酵素rna分子 |
KR100260483B1 (ko) * | 1992-04-17 | 2000-07-01 | 마나배 게이사꾸 | Rna 비루스에 대하여 저항성을 갖는 식물 제조방법 |
ATE312510T1 (de) * | 1992-06-29 | 2005-12-15 | Gene Shears Pty Ltd | Nukleinsäuren und sie verwendende verfahren zur bekämpfung viraler pathogene |
EP0653488B1 (en) * | 1992-07-02 | 2003-04-09 | Sankyo Company Limited | Looped, hairpin ribozyme |
US5409823A (en) * | 1992-09-24 | 1995-04-25 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for the production of hybrid seed |
US5864028A (en) * | 1992-11-03 | 1999-01-26 | Gene Shears Pty. Limited | Degradation resistant mRNA derivatives linked to TNF-α ribozymes |
AU680843B2 (en) * | 1992-11-03 | 1997-08-14 | Gene Shears Pty. Limited | TNF-alpha ribozymes and degradation resistant mRNA derivatives linked to TNF-alpha ribozymes |
US6080851A (en) * | 1992-12-04 | 2000-06-27 | American Home Products Corporation | Ribozymes with linked anchor sequences |
JPH08507203A (ja) * | 1992-12-04 | 1996-08-06 | イノーバー ラボラトリーズ,インコーポレイテッド | 調節可能な核酸治療およびそれらの使用方法 |
EP1195442A3 (en) * | 1992-12-04 | 2002-07-31 | Innovir Laboratories, Inc. | Ribozyme amplified diagnostics |
FR2701960B1 (fr) * | 1993-02-26 | 2002-09-13 | Gene Shears Pty Ltd | Polyribozyme apte à conférer, aux plantes, une résistance aux virus et plantes résistantes produisant ce polyribozyme. |
US5817635A (en) * | 1993-08-09 | 1998-10-06 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Modified ribozymes |
AU5334294A (en) * | 1993-10-15 | 1995-05-04 | Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts | Asymmetric hammerhead ribozymes and nucleotide sequences for their construction |
US5869248A (en) * | 1994-03-07 | 1999-02-09 | Yale University | Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences |
US5998193A (en) * | 1994-06-24 | 1999-12-07 | Gene Shears Pty., Ltd. | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof |
US6350934B1 (en) | 1994-09-02 | 2002-02-26 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding delta-9 desaturase |
US5683873A (en) * | 1995-01-13 | 1997-11-04 | Innovir Laboratories, Inc. | EGS-mediated inactivation of target RNA |
US6057153A (en) * | 1995-01-13 | 2000-05-02 | Yale University | Stabilized external guide sequences |
FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
AU708995B2 (en) * | 1995-06-07 | 1999-08-19 | Gene Shears Pty. Limited | Optimized minizymes and miniribozymes and uses thereof |
US6010904A (en) * | 1995-06-07 | 2000-01-04 | The General Hospital Corporation | Cell ablation using trans-splicing ribozymes |
US6004806A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization | Optimized minizymes and miniribozymes and uses thereof |
WO1997010328A2 (en) * | 1995-07-13 | 1997-03-20 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and method for modulation of gene expression in plants |
US5824519A (en) * | 1995-11-08 | 1998-10-20 | Medical University Of South Carolina | Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes |
US6620805B1 (en) | 1996-03-14 | 2003-09-16 | Yale University | Delivery of nucleic acids by porphyrins |
US5877162A (en) * | 1996-03-14 | 1999-03-02 | Innovir Laboratories, Inc. | Short external guide sequences |
US6610478B1 (en) | 1996-08-16 | 2003-08-26 | Yale University | Phenotypic conversion of cells mediated by external guide sequences |
US5976874A (en) * | 1996-08-16 | 1999-11-02 | Yale University | Phenotypic conversion of drug-resistant bacteria to drug-sensitivity |
US6884430B1 (en) | 1997-02-10 | 2005-04-26 | Aventis Pharma S.A. | Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles |
US6969601B2 (en) | 1997-04-03 | 2005-11-29 | Jensenius Jens Chr | MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
MX224646B (es) | 1997-04-15 | 2004-12-03 | Commw Scient Ind Res Org | Genes de acido graso epoxigenasa de vegetales y usos de los mismos |
US7589253B2 (en) | 1997-04-15 | 2009-09-15 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism |
AU8444798A (en) | 1997-06-30 | 1999-01-25 | Centre National De La Recherche Scientifique | Improved method for transferring nucleic acid into the striped muscle and combination therefor |
EP2194131A3 (en) | 1997-09-16 | 2010-09-22 | CropDesign N.V. | Cyclin-dependent kinase inhibitors and uses thereof |
DE19741375C2 (de) * | 1997-09-19 | 1999-10-21 | Max Planck Gesellschaft | Transgene Pflanzen, deren oberirdische Teile früher reifen und vollständig absterben |
WO1999017798A1 (en) | 1997-10-02 | 1999-04-15 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the modulation of neovascularization and/or the growth of collateral arteries and/or other arteries from preexisting arteriolar connections |
EP1032595B1 (en) | 1997-11-18 | 2011-05-18 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Nucleic acids involved in the responder phenotype and applications thereof |
US6013447A (en) * | 1997-11-21 | 2000-01-11 | Innovir Laboratories, Inc. | Random intracellular method for obtaining optimally active nucleic acid molecules |
NZ547283A (en) | 1998-03-20 | 2008-06-30 | Commw Scient Ind Res Org | Control of gene expression |
AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
US6248525B1 (en) | 1998-03-30 | 2001-06-19 | Yale University | Method for identifying essential or functional genes |
EP1088086A4 (en) | 1998-06-24 | 2003-01-08 | Musc Found For Res Dev | RIBOZYMES SPECIFIC TO TISSUE AND TARGET RNA |
DE19836098A1 (de) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke |
EP1121437B1 (en) | 1998-10-15 | 2008-02-20 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Metastatic breast and colon cancer regulated genes |
BR9915152A (pt) | 1998-11-09 | 2001-08-07 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Moléculas de ácido nucléico de arroz e o seu uso para a produção de amido modificado |
ATE542907T1 (de) | 1998-11-12 | 2012-02-15 | Max Planck Gesellschaft | Chimäre promotoren, befähigt zur vermittlung der genexpression in pflanzen durch pathogeninfektion und deren anwendungen |
AU2367600A (en) | 1998-12-16 | 2000-07-03 | Chiron Corporation | Human cyclin-dependent kinase ((hpnqalre)) |
US6271359B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-08-07 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes |
AUPQ005299A0 (en) | 1999-04-29 | 1999-05-27 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor |
CA2375940A1 (en) | 1999-07-20 | 2001-01-25 | Ernst Heinz | Novel method for the generation and selection of transgenic linseed/flax plants |
US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
DK2364734T3 (en) | 2000-07-21 | 2017-10-30 | Revance Therapeutics Inc | Biological multicomponent transport systems |
AU1480402A (en) | 2000-11-09 | 2002-05-21 | Commw Scient Ind Res Org | Barley with reduced SSII activity and starch containing products with a reduced amylopectin content |
ITMI20011364A1 (it) * | 2001-06-28 | 2002-12-28 | Metapontum Agrobios S C R L | Robozima hammerhead specifico per la stearoyl-acp desaturesi di piante oleaginose differenti |
US7994144B2 (en) | 2001-07-10 | 2011-08-09 | Johnson & Johnson Research Pty, Limited | Process for the preparation of a composition of genetically modified hematopoietic progenitor cells |
DE60238486D1 (de) | 2001-07-10 | 2011-01-13 | Johnson & Johnson Res Pty Ltd | Verfahren zur genetischen modifikation hämatopoetischer vorläuferzellen und verwendungen der modifizierten zellen |
US8022272B2 (en) | 2001-07-13 | 2011-09-20 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids |
FR2829136B1 (fr) | 2001-08-29 | 2006-11-17 | Aventis Pharma Sa | Derives lipidiques d'aminoglycosides |
US7456335B2 (en) | 2001-09-03 | 2008-11-25 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants |
WO2003025220A2 (en) | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Carnegie Institution Of Washington | Fusion proteins useful for detecting analytes |
AU2002359761A1 (en) | 2001-12-18 | 2003-06-30 | Invenux, Inc. | Antibiotic compounds |
US20040005546A1 (en) | 2002-02-28 | 2004-01-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Use of ribozymes in the detection of adventitious agents |
DE10212892A1 (de) | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression |
EP1900827A3 (en) | 2002-05-21 | 2008-04-16 | Bayer HealthCare AG | Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia |
AU2003280420A1 (en) | 2002-06-26 | 2004-01-19 | Yale University | Modulators and modulation of the interacton between rgm and neogenin |
EP1527183B1 (de) | 2002-07-26 | 2008-08-20 | BASF Plant Science GmbH | Neue selektionsverfahren |
WO2004048552A2 (en) | 2002-11-21 | 2004-06-10 | Celltech R & D, Inc. | Modulating immune responses |
SI1578973T1 (sl) | 2002-12-19 | 2009-02-28 | Bayer Cropscience Ag | Rastlinske celice in rastline, ki sintetizirajo škrob s povečano končno viskoznostjo |
CN1798769A (zh) | 2003-05-12 | 2006-07-05 | 内蒂穆恩公司 | 抗masp-2抗体 |
WO2005001098A1 (en) | 2003-06-30 | 2005-01-06 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived thereform |
EP1522594A3 (en) | 2003-10-06 | 2005-06-22 | Bayer HealthCare AG | Methods and kits for investigating cancer |
EP1602926A1 (en) | 2004-06-04 | 2005-12-07 | University of Geneva | Novel means and methods for the treatment of hearing loss and phantom hearing |
US7604947B2 (en) | 2004-06-09 | 2009-10-20 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection and modulation of cancer stem cells |
HUE032349T2 (en) | 2004-06-10 | 2017-09-28 | Omeros Corp | Procedures for the treatment of conditions associated with MASP-2 dependent complement mediated activation |
US7919094B2 (en) | 2004-06-10 | 2011-04-05 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
US8840893B2 (en) | 2004-06-10 | 2014-09-23 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
US8237013B2 (en) | 2004-07-08 | 2012-08-07 | Dlf-Trifolium A/S | Means and methods for controlling flowering in plants |
CA2834275A1 (en) | 2004-08-02 | 2006-02-09 | Basf Plant Science Gmbh | Method for isolation of transcription termination sequences |
AU2005286427B2 (en) | 2004-09-24 | 2011-09-15 | Basf Plant Science Gmbh | Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress |
JP5638736B2 (ja) | 2004-12-30 | 2014-12-10 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | 腸の健康を改善する方法および手段 |
EP1707632A1 (de) | 2005-04-01 | 2006-10-04 | Bayer CropScience GmbH | Phosphorylierte waxy-Kartoffelstärke |
CA2624562A1 (en) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (rgm) protein family and functional fragments thereof, and their use |
AU2006311089C1 (en) | 2005-11-08 | 2012-11-08 | Basf Plant Science Gmbh | Use of armadillo repeat (ARM1) polynucleotides for obtaining pathogen resistance in plants |
WO2007080143A1 (en) | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Basf Plant Science Gmbh | Use of stomatin (stm1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants |
EP2090662A3 (en) | 2006-04-05 | 2012-10-31 | Metanomics GmbH | Process for the production of a fine chemical |
EP2030021B1 (en) | 2006-05-18 | 2012-11-21 | Andreas Reichert | Method for diagnosing mitochondrial dysfunction |
US8383597B2 (en) | 2006-05-25 | 2013-02-26 | Cornell Research Foundation, Inc. | G proteins in tumor growth and angiogenesis |
JP5688507B2 (ja) | 2006-10-06 | 2015-03-25 | スピーデクス ピーティーワイ リミテッド | 分子スイッチおよびそれらの使用のための方法 |
US8592652B2 (en) | 2007-01-15 | 2013-11-26 | Basf Plant Science Gmbh | Use of subtilisin-like RNR9 polynucleotide for achieving pathogen resistance in plants |
EP2074219B1 (en) | 2007-02-16 | 2013-11-20 | BASF Plant Science GmbH | Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants |
BRPI0809244A2 (pt) | 2007-03-27 | 2014-09-23 | Omeros Corp | Métodos de tratamento de uma anormalidade de movimento, e para identificação de um agente que inibe a atividade pde7. |
DE112008001453T5 (de) | 2007-05-22 | 2010-04-29 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und erhöhter Biomasseproduktion-KO |
CL2008002775A1 (es) | 2007-09-17 | 2008-11-07 | Amgen Inc | Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea. |
EP2040075A1 (en) | 2007-09-24 | 2009-03-25 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Compounds and markers for surface-enhanced raman scattering |
EP2628486A3 (en) | 2007-12-14 | 2013-10-30 | Amgen, Inc. | Method for treating bone fracture with anti-sclerostin antibodies |
EP2240587A2 (en) | 2007-12-21 | 2010-10-20 | BASF Plant Science GmbH | Plants with increased yield (ko nue) |
US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
EP2100962A1 (en) | 2008-03-12 | 2009-09-16 | Biogemma | Plants having improved resistance to pathogens |
US10517839B2 (en) | 2008-06-09 | 2019-12-31 | Cornell University | Mast cell inhibition in diseases of the retina and vitreous |
EP2331071A1 (en) | 2008-09-05 | 2011-06-15 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Novel multimodular assembly useful for intracellular delivery |
EP2184351A1 (en) | 2008-10-30 | 2010-05-12 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Polynucleotides encoding caryophyllene synthase and uses thereof |
ES2363358B1 (es) | 2009-04-03 | 2012-06-21 | FUNDACIÓ INSTITUT DE RECERCA HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HEBRON (Titular al | Agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades asociadas con una proliferación celular indeseable. |
EP2421976B1 (en) | 2009-04-22 | 2015-09-16 | BASF Plant Science Company GmbH | Whole seed specific promoter |
EP2475367A1 (en) | 2009-09-10 | 2012-07-18 | Centre National De La Recherche Scientifique | NOVEL INHIBITORS OF STEAROYL-CoA-DESATURASE-1 AND THEIR USES |
EP2305285A1 (en) | 2009-09-29 | 2011-04-06 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Means and methods for treating ischemic conditions |
RU2600876C2 (ru) | 2009-10-16 | 2016-10-27 | Омерос Корпорейшен | Способ лечения диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови путем ингибирования masp-2 зависимой активации комплемента |
AU2010311321B2 (en) | 2009-10-30 | 2014-11-27 | Prexton Therapeutics S.A. | Novel oxime derivatives and their use as allosteric modulators of metabotropic glutamate receptors |
EP2322149A1 (en) | 2009-11-03 | 2011-05-18 | Universidad del Pais Vasco | Methods and compositions for the treatment of ischemia |
WO2011070045A1 (en) | 2009-12-08 | 2011-06-16 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration |
EP2338492A1 (en) | 2009-12-24 | 2011-06-29 | Universidad del Pais Vasco | Methods and compositions for the treatment of alzheimer |
US8476485B2 (en) | 2010-06-24 | 2013-07-02 | Academia Sinica | Non-human animal model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) with loss-of-TDP-43 function |
US9220715B2 (en) | 2010-11-08 | 2015-12-29 | Omeros Corporation | Treatment of addiction and impulse-control disorders using PDE7 inhibitors |
AU2011326173B2 (en) | 2010-11-08 | 2015-08-27 | Omeros Corporation | Treatment of addiction and impulse-control disorders using PDE7 inhibitors |
US9644035B2 (en) | 2011-04-08 | 2017-05-09 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
EP3287142B1 (en) | 2011-04-08 | 2021-08-04 | University Of Leicester | Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation |
AU2012333134B2 (en) | 2011-07-22 | 2017-05-25 | John Paul Guilinger | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
WO2013025936A1 (en) | 2011-08-18 | 2013-02-21 | Cornell University | Detection and treatment of metastatic disease |
WO2013039880A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Biomarkers and therapeutic targets of hepatocellular cancer |
US10428342B2 (en) | 2011-12-16 | 2019-10-01 | Board Of Trustees Of Michigan State University | P-coumaroyl-CoA:monolignol transferase |
NZ714482A (en) | 2012-01-27 | 2017-08-25 | Abbvie Inc | Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration |
WO2013138463A1 (en) | 2012-03-14 | 2013-09-19 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Neurofibromatoses therapeutic agents and screening for same |
EP2666775A1 (en) | 2012-05-21 | 2013-11-27 | Domain Therapeutics | Substituted pyrazoloquinazolinones and pyrroloquinazolinones as allosteric modulators of group II metabotropic glutamate receptors |
WO2014127835A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel | Plant-derived resistance gene |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
EP3057993B1 (en) | 2013-10-17 | 2020-08-12 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation |
CA3241340A1 (en) | 2013-12-18 | 2015-06-25 | Grains Research And Development Corporation | Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids |
CA2953008C (en) | 2014-06-27 | 2024-03-19 | Nuseed Pty Ltd | Lipid comprising docosapentaenoic acid |
EP3000814A1 (en) | 2014-09-26 | 2016-03-30 | Domain Therapeutics | Substituted pyrazoloquinazolinones and pyrroloquinazolinones as allosteric modulators of group II metabotropic glutamate receptors |
WO2017070632A2 (en) | 2015-10-23 | 2017-04-27 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
SG10202011469UA (en) | 2015-11-09 | 2020-12-30 | Omeros Corp | Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation |
CN108495652A (zh) | 2016-01-05 | 2018-09-04 | 莱斯特大学 | 用于抑制有需要的受试者的纤维化的方法 |
JP6865767B2 (ja) | 2016-03-31 | 2021-04-28 | オメロス コーポレーション | 血管形成の阻害を必要とする対象において血管形成を阻害するための方法 |
MX2018014496A (es) | 2016-05-26 | 2019-03-28 | Nunhems Bv | Plantas productoras de frutas sin semillas. |
CA3032699A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
WO2018031683A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
WO2018129544A1 (en) | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of altering gene expression by perturbing transcription factor multimers that structure regulatory loops |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
US10883089B2 (en) | 2017-04-04 | 2021-01-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Feruloyl-CoA:monolignol transferases |
US10883090B2 (en) | 2017-04-18 | 2021-01-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | P-coumaroyl-CoA:monolignol transferases |
US11452709B2 (en) | 2017-07-17 | 2022-09-27 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions and methods for preventing and treating radiation-induced bystander effects caused by radiation or radiotherapy |
EP3658573A1 (en) | 2017-07-28 | 2020-06-03 | President and Fellows of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace) |
TWI818919B (zh) | 2017-08-15 | 2023-10-21 | 美商歐米諾斯公司 | 用於治療和/ 或預防與造血幹細胞移植有關的移植物抗宿主病和/ 或瀰漫性肺泡出血和/ 或靜脈閉塞性病的方法 |
WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
CN111757937A (zh) | 2017-10-16 | 2020-10-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 腺苷碱基编辑器的用途 |
US11584714B2 (en) | 2018-05-29 | 2023-02-21 | Omeros Corporation | MASP-2 inhibitors and methods of use |
EP3806619A1 (en) | 2018-06-15 | 2021-04-21 | Nunhems B.V. | Seedless watermelon plants comprising modifications in an abc transporter gene |
BR112021007864A2 (pt) | 2018-11-09 | 2021-08-10 | Wisconsin Alumni Research Foundation | ácido nucleico recombinante, métodos e vegetal transgênico fértil |
WO2020191249A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
JP2023504541A (ja) | 2019-12-04 | 2023-02-03 | オメロス コーポレーション | Masp-2阻害剤および使用方法 |
WO2021113682A1 (en) | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Omeros Corporation | Masp-2 inhibitors and methods of use |
MX2022014008A (es) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | Broad Inst Inc | Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo. |
EP4192952A1 (en) | 2020-08-10 | 2023-06-14 | Novartis AG | Treatments for retinal degenerative diseases |
WO2024038090A1 (en) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | Mitodicure Gmbh | Use of substituted benzoxazole and benzofuran compounds for the treatment and prevention of diseases associated with chronic fatigue, exhaustion and/or exertional intolerance |
WO2024042160A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Mitodicure Gmbh | Use of a therapeutic agent with sodium-hydrogen antiporter 1 inhibitory activity for the treatment and prevention of diseases associated with chronic fatigue, exhaustion and/or exertional intolerance |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4987071A (en) * | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
US5116742A (en) * | 1986-12-03 | 1992-05-26 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods |
DE3642623A1 (de) * | 1986-12-13 | 1988-06-23 | Burbach & Bender Ohg | Gasspuelstein fuer metallurgische gefaesse |
DE3939771A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Behringwerke Ag | Verfahren zur biologischen inaktivierung von nukleinsaeuren |
-
1988
- 1988-12-14 AU AU28007/89A patent/AU632993B2/en not_active Expired
- 1988-12-14 MC MC882115D patent/MC2115A1/xx unknown
- 1988-12-14 RO RO145344A patent/RO114469B1/ro unknown
- 1988-12-14 AR AR88312737A patent/AR243935A1/es active
- 1988-12-14 KR KR1019890701528A patent/KR970010758B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-12-14 CA CA000585845A patent/CA1340831C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-14 NZ NZ227332A patent/NZ227332A/xx unknown
- 1988-12-14 DE DE3852539T patent/DE3852539T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 AT AT88311816T patent/ATE115999T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-14 EP EP94107862A patent/EP0640688A1/en not_active Withdrawn
- 1988-12-14 ES ES88311816T patent/ES2065919T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 JP JP1500279A patent/JP3046318B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-14 HU HU89382A patent/HUT54407A/hu unknown
- 1988-12-14 WO PCT/AU1988/000478 patent/WO1989005852A1/en active IP Right Grant
- 1988-12-14 EP EP88311816A patent/EP0321201B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-15 CN CN88108572A patent/CN1102174C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-06-12 DK DK199001433A patent/DK175956B1/da not_active IP Right Cessation
- 1990-06-12 FI FI902923A patent/FI104562B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-06-14 NO NO902661A patent/NO308610B1/no unknown
-
1995
- 1995-03-13 GR GR940403895T patent/GR3015374T3/el unknown
- 1995-06-22 HU HU95P/P00362P patent/HU211891A9/hu unknown
-
2000
- 2000-01-25 NO NO20000369A patent/NO312105B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO312105B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av ribozymer | |
US5707835A (en) | Ribozymes | |
US5543508A (en) | Ribozymes | |
US5874414A (en) | Trans-splicing ribozymes | |
US5641673A (en) | Cell ablation using trans-splicing ribozymes | |
US5998193A (en) | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof | |
RU2144080C1 (ru) | Рибозим, способ инактивации рнк-мишени, способ получения рибозима | |
IL88683A (en) | Ribozymes their production and pharmaceutical compositions containing them | |
AU653787C (en) | Cell ablation using trans-splicing ribozymes |