CN101600808B - 分子开关及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及允许操作多组分核酸复合体催化活性的组合物和方法。本发明还提供使用这些组合物的方法和产生如下物质的方法：自催化的自我复制级联与其它迭代过程的分子传感器、分子开关、和/或调节剂或传播物。更具体地，本发明涉及允许活性和无活性多组分核酸复合体自组装的组合物、制备这些组合物的方法及使用方法。

Description

分子开关及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年10月6日提交的第60/828,451号美国临时专利申请的权益，其整体通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及允许操作多组分核酸(MNA)复合体催化活性的组合物和方法。本发明还提供使用这些组合物的方法和产生如下物质的方法：自催化的自我复制级联与其它迭代过程的分子传感器、分子开关、和/或调节剂或传播物。更具体地，本发明涉及允许活性和无活性多组分核酸复合体自组装的组合物、制备这些组合物的方法及使用方法。
发明背景
核酸除了其进化优化功能外，它特别的物理性能和功能特性为过多的新生物分子装置和方法提供了可能。设计者核酸涉及治疗实体、生物传感器、纳米级装置和分子计算的工具。所述方法利用DNA自组装特性、导电性、信息元件、放大、开关、分子检测和催化活性。而且，由于DNA是强健的、稳定的和耐热的，因此它为手工和计算装置的分子设计提供了理想材料。
单链核酸如DNA和RNA具有折叠成复杂三维结构的能力，所述三维结构能以高特异性受体(适体)和催化剂(核酶和DNAzymes)起作用。而且，核酸链之间杂交的互补性要求形成了广泛技术的基础，它允许靶标检测(例如微阵列分析、Northern印迹或Southern印迹)，和/或靶标扩增(例如聚合酶链式反应)。而且，杂交为核酸纳米级构建和基于DNA的计算策略提供了基础。
自我复制是个体通过其能复制(拷贝)自身的方法。在所述方法中，每个反应的产物指导从组成部分形成所述个体的新拷贝(复制子)。已开发了用于核酸序列自我复制的广泛多样的技术。
靶标核酸序体外复制(靶标扩增)的方法是本领域熟知的。这些方法中的许多使用靶标作为模板指导合成，其需要能与靶标DNA或RNA特异性杂交的寡核苷酸引物，所述靶标DNA或RNA通过DNA或RNA聚合酶被延伸以产生所述靶标的新拷贝(扩增子)。这样的技术(综述在Schweitzer and Kingsmore，2001)包括聚合酶链式反应、链置换扩增、滚环扩增和环介导的等温扩增、转录介导的扩增、基于自主序列复制和核酸序列复制的扩增。被称为连接酶链式反应(“LCR”)的可选方法使用蛋白连接酶扩增核酸靶标。所述反应取决于每轮连接产物作为模板指导所述靶标的新拷贝的连接的能力(Barany，1991)。
靶标扩增技术如上述的那些已广泛用于研究和/或临床诊断中。然而，每个方法尽管有其能力，但都有内在的缺点。它们都需要使用蛋白酶(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和或连接酶)。蛋白酶包涵体增加了试剂制造的复杂性和成本，并降低了含有试剂的试剂盒的贮藏寿命。其它相关技术挑战包括导致假阳性信号的反应前的复制子(靶标扩增子)污染，和/或引物序列复制(引物二聚物)引起的背景信号或独立于靶标连接引起的背景信号。
最近20年已发现具有酶活性或催化活性的广泛多样的核酸分子。RNA酶(“核酶”)存在于自然界中，但能被设计为特异性识别和修饰靶标RNA底物(Haseloffand Gerlach，1988)。体外演化技术已经促进了许多催化核酸的发现和开发，所述催化核酸包括通常被称为“DNA酶”或“DNAzymes”的脱氧核糖核酸(综述在Emilsson and Breaker，2002)。已发现体外演化的DNAzymes和/或核酶具有催化大范围的反应的能力，所述反应包括核酸切割(Carmi et al.，1996；Raillard and Joyce，1996；Breaker，1997；Santoro and Joyce，1998)、核酸的连接(Cuenoud andSzostak，1995，Prior et al，2004)、卟啉金属化(Li and Sen，1996)，以及碳-碳键(Tarasow et al.，1997)、酯键(Illangasekare et al.，1995)或酰胺键(Lohse and Szostak，1996)的形成。
具体地，已经表征出在通过Watson Crick碱基配对杂交之后特异性切割不同核酸序列的DNAzymes和核酶。DNAzymes能够切割或者RNA(Breaker and Joyce，1994；Santoro and Joyce，1997)或者DNA(Carmi et al.，1996)分子。核酶也能够切割RNA(Haseloff and Gerlach，1988)和DNA(Raillard and Joyce，1996)靶标序列两者。许多核酸酶的催化切割速率取决于二价金属离子如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+的存在和浓度(Santoro and Joyce，1998；Brownet al.，2003)。
“10:23”和“8:17”DNAzymes能够在特定的RNA磷酸二酯键处切割核酸底物以产生具有2’，3’-环磷酸酯和5’-羟基基团的反应产物(Santoro and Joyce，1997；综述在Emilsson and Breaker，2002)。能连接2’，3’-环磷酸酯和5’-羟基产物的脱氧核酶(DNAzymes)的实例包括“7Z81”和“7Z48”连接酶(Prior，2004)。
包括锤头核酶、10:23和8:17 DNAzymes以及“7Z81”和“7Z48”连接酶的一些催化核酸具有相似的基本结构，具有多个结构域。这些核酸酶具有保守的催化结构域(催化核心)，其侧邻有两种非保守的底物结合结构域(“臂”)，所述底物结合结构域特异性识别并杂交底物。虽然这些核酸酶能作为真正的多周转酶起作用，但每种酶仅具有识别一种分子的能力，所述一种分子即所述酶能随后催化修饰的底物。
已表明催化核酸仅容许在形成催化核心的区域内的某些修饰(Perreault et al，1990；Perreault et al，1991；Zaborowska et al，2002；Cruzet al，2004；Silverman，2004))。取决于反应条件的严紧性，在底物臂内可允许一些错配度。然而Watson Crick碱基配对的要求是足够严格的，使得能够开发使用催化核酸以促进辨别紧密相关的序列的实验方案(Cairns et al.，2000)(WO 99/50452)。
“适体”是DNA、RNA或肽序列，由于它们的高水平结构，例如三维结合结构域或口袋，其具有以高亲和性和特异性识别一种或多种配体的能力。许多适体因其与配体结合的能力而被体外演化，所述配体包括例如核酸、蛋白、朊、有机小化合物和/或完整有机体。“适体酶”具有由适体和催化核酸序列(核酶或DNAzymes)两者组成的序列。配体与适体的结合诱导适体酶的构象变化，这活化了核酶或DNAzyme。
Sando和同事(2003)使用传感分子(靶标辅助的自我切割(TASC)探针)开发了信号放大策略，它包含组成靶标传感序列的多结构域、DNAzyme结构域和用于连接DNAzyme的双标记DNA/RNA嵌合底物。虽然该方法避免了使用蛋白酶，但TASC探针是复杂和昂贵的分子，其必须对每个新靶标进行定制。
几个组已报道对于核酸靶标和具有比色读出的其它分析物的检测(Elghanian et al.，1997，Mirkin et al.，1996，以及Liu and Lu，2004)。该策略使用与寡核苷酸连接的纳米金粒。所述金粒随后通过添加“桥连寡核苷酸”被聚集，引起颜色从红到蓝的变化(Mirkin et al.，1996)。Liu andLu(2004)通过将DNAzyme底物并入桥连寡核苷酸延展了该策略，使得DNAzyme的活化导致切割、金粒分散和颜色从蓝到红的变化。该组使用所述方法采用铅敏感DNAzyme检测铅，并采用适体酶检测腺苷。
使用催化核酸的放大级联的几个实例是本领域已知的。酶原/DzyNA方法将靶标扩增(例如PCR)与DNAzyme复制结合。与靶标一起被共扩增的DNAzymes切割一种或多种通用的报告分子底物，允许对一种或多种靶标的一般检测(US 6,140,055；US 6,201,113；US6365724；WO 99/45 146，Todd et al，2000)。放大级联策略已被设计使用催化核酸而不是蛋白酶介导扩增。在另外的方法中，信号放大级联使用两种无活性的环状10:23 DNAzymes，所述酶通过交叉切割能彼此活化导致线性化。Paul and Joyce(2004)描述了由具有连接酶活性的核酶介导的复制级联。在该反应中，第一核酶连接含有寡核苷酸的两种RNA形成第二核酶。第二核酶随后连接含有寡核苷酸的两种其他RNA形成新的第一核酶，这样触发复制级联，其产生第一和第二核酶两者的新拷贝。
核酸级联已被考虑用于一系列的生物技术应用尤其在诊断中。它们通过促进信号放大允许检测用于疾病诊断的蛋白和核酸。催化核酸和/或级联反应能被用于除诊断外的一些应用中，例如计算分析领域和可在治疗中使用的纳米级装置和开关的生物分子工程领域中。
根据有限的步骤将信息从一种形式转换成另一形式的装置被称为自动机。使用蛋白酶(限制性内切酶和连接酶)和双链DNA已产生能解决计算问题的可编程的有限自动机(Benenson et al，2001)。所述酶用作“硬件”，所述DNA编码“软件”。输入和自动机通过选择的合适的DNA软件被编程。自动机经由切割、杂交和连接循环的级联进行，产生可检测的输出分子，其编码自动机的最终状态和由此的计算结果。
使用生物分子作为输入数据和生物活性分子作为输出的简单分子规模的可编程计算机能被用于产生逻辑调控生物过程的系统(Benenson et al，2004)。作为体外概念的证据，Benenson等人开发了生物分子计算机，其能够(i)测量许多特异性信使RNA种类，和(ii)通过释放能够影响基因表达的单链DNA反义分子进行响应。使用DNAzyme网产生分子规模的逻辑门的另外的分子自动机被编程进行“井字游戏(tic-tac-toe)”(Stojanovic and Stefanovic，2003)。近来，具有连接酶活性的二元DNAzyme被设计以识别并杂交(“读”)一种序列，以及连接(“写”)单独的不同的序列，其依次通过PCR能被扩增(Tabor et al，2006)。
DNA计算与生物学接口的方法具有广泛的应用。例如，简单的DNA逻辑门基于生理学信号的组合例如高血糖和低胰高血糖素能调节胰岛素的释放(Cox and Ellington 2001)。同时，在发现新功能性核酸中的进展提供了一系列工具，如适体和催化核酸，以及允许产生新纳米级分子“机器”组分的新结构组分。
几个步骤已用于操纵纳米装置和自动机，包括(i)杂交步骤，其包括支链迁移、二级结构形成如发夹形成的互补链之间杂交的抑制，(ii)使用限制性核酸内切酶的切割和(iii)诸如围绕中心DNA轴的旋转、收缩/延伸和平移运动的构象变化的诱导。用于通过适体可调控释放蛋白的模块化DNA信号译码器使用任意DNA序列作为“输入”(Beyerand Simmel，2006)。
因此，本领域亟需简单、快速、有成本效益的方法用于靶标的检测和纳米级装置的组装，包括能使用稳定的核酸组分进行的可编程装置。
发明概述
本发明一方面提供了包含至少一种寡核苷酸部件酶(partzyme)和至少一种另外的寡核苷酸组分的分子开关，其中所述部件酶包含至少一种催化核心部分、感应臂部分、和底物臂部分，所述另外的寡核苷酸组分选自：组装易化子寡核苷酸、底物寡核苷酸、活性抑制剂和组装抑制剂或其任何组合，其中所述分子开关能形成多组分核酸(MNA)复合体。
在一个实施方案中，所述开关可包含解组装的复合体、部分组装的复合体、完全组装的MNAzyme、或完全组装的无催化活性MNA复合体。所述开关还可包含MNAi。
在另一实施方案中，活性抑制剂包含与至少一种所述寡核苷酸基本上不互补的核苷酸序列。
在另一实施方案中，所述部件酶感应臂、所述部件酶底物臂、所述组装易化子寡核苷酸和所述底物寡核苷酸中的一种或多种包含至少两种分子。所述部件酶感应臂、所述部件酶底物臂、所述组装易化子寡核苷酸、所述底物寡核苷酸、所述活性抑制剂或组装抑制剂中的一种或多种还包含至少一种自身互补区。
在另一实施方案中，所述部件酶感应臂、所述部件酶底物臂、所述组装易化子寡核苷酸和所述底物寡核苷酸中的一种或多种还包含至少一种适体和至少一种组装抑制剂。
在另一实施方案中，所述开关的至少一种组分能够被适应以增加或减少复合体对输入事件的敏感性和/或改变输出信号的强度。
在另外的实施方案中，活性抑制剂可包含组装易化子结构域、活性抑制剂结构域、报告分子结构域、底物结构域中的至少一种、或其任意组合。
在另一实施方案中，所述开关还包含至少一种稳定因子臂。
在另一实施方案中，所述开关的至少一种组分可包含核酸。
在另外的实施方案中，所述开关的至少一种组分还可包含至少一种纳米颗粒、微粒、或其组合。
在本发明的另一方面，提供了MNA复合体作为分子开关的用途，其中所述复合体从无活性转变为活性MNA复合体响应输入事件。
在一实施方案中，无活性复合体可包含解组装的复合体、部分组装的复合体、或完全组装的无催化活性复合体。无催化活性MNA复合体还可包含组装抑制剂。无催化活性MNA复合体还还可以是MNAi。
在另一实施方案中，MNAi可包含活性抑制剂，所述活性抑制剂包含活性抑制剂结构域、活化剂组装易化子结构域、报告分子结构域、底物结构域中的至少一种，或其任意组合。
在另一实施方案中，向活性MNAzyme的转变可包含从所述MNAi移出至少所述活性抑制剂或活性抑制剂结构域。所述移出还可包含对连接所述活性抑制剂结构域和所述活化剂组装易化子结构域的可切割底物的切割。
在另一实施方案中，输入事件可包含抑制剂的去除或其抑制功能的失活。输入事件还可导致催化活性MNAzyme的组装。输入事件还可进一步包含活化剂的供应，所述活化剂(i)由外源供应提供或(ii)是在MNA复合体的环境中反应的产物。
本发明另一方面，提供了MNA复合体作为分子开关的用途，其中所述复合体从活性转变为无活性MNA复合体响应输入事件。
在一个实施方案中，所述活性复合体可以是MNAzyme。
在另一实施方案中，向无活性MNA复合体的转变可与活性MNA复合体的解组装相关。向无活性MNA复合体的转变还可与无活性MNA复合体的组装相关。
在另一实施方案中，所述输入事件可以是抑制剂的添加或其抑制功能的活化。所述输入事件还可以是对抑制剂的结合。所述抑制剂还可以是组装抑制剂。所述抑制剂还进一步可以是活性抑制剂或活性抑制剂结构域。
在另一实施方案中，所述无活性MNA复合体可以是MNAi。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂或组装抑制剂可以(i)由外源供应提供或(ii)是在MNA复合体的环境中反应的产物。
在前述两方面的任一方面的另一实施方案中，所述转变可导致输出信号的变化。
在前述两方面的任一方面的另一实施方案中，输入事件可选自在温度，盐浓度，离子强度，pH，二价阳离子的存在或不存在、类型或浓度，电荷，磁荷，物理操作上的变化，在MNA或调节剂组分或微环境组分的浓度上的变化，或其任意组合。
在前述两方面的任一方面的另一实施方案中，输出信号的变化可包含先前不存在的信号的出现、先前存在的信号的消失、或输出信号的增强或减弱。
在前述两方面的任一方面的另一实施方案中，所述输出信号可取决于底物修饰的程度，其中所述修饰选自切割，连接，卟啉金属化，碳-碳键、酯键或酰胺键的形成，或其任意组合。
在前述两方面的任一方面的另一实施方案中，所述输出信号可通过如下测定：荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，光度测定，闪烁扫描法，电子方法，UV、可见光或红外光谱，酶促方法或其任意组合。所述测定还可以允许以定量输出信号的方式进行。所述输入事件的量还可进一步由所述定量的输出信号测定。所述输入事件或所述输出信号任一者或两者还可进一步被放大。所述输出信号放大还可进一步由信号级联产生。
在本发明另一方面，提供了包含两种或多种寡核苷酸组分和至少一种活性抑制剂分子的MNAi。
在一个实施方案中，MNAi还包含至少一种组装易化子。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂可包含活化剂组装易化子结构域、活性抑制剂结构域、报告分子结构域、底物结构域中的至少一种，或其任意组合。所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种可位于活性抑制剂的不同结构域。所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种还进一步可被不稳定的连接子或可切割的底物连接。所述底物还可进一步包含活化剂组装易化子结构域、活性抑制剂结构域、报告分子结构域中的至少一种，或其任意组合。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂可包含与所述两种或多种寡核苷酸组分中的至少一种基本上不互补的核苷酸序列。
在另一实施方案中，所述组装易化子可以是靶标。所述核酸还可以选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA，其衍生物、扩增子或其任意组合。
在另一实施方案中，MNAi的至少一种组分还可包含适体。
在本发明的另一方面，提供了MNAi组合物，其包含至少两种或多种寡核苷酸组分，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在至少一种MNA复合体活性抑制剂存在的情况下能自组装，其中所述至少第一和第二寡核苷酸组分各自包含底物臂部分、催化核心部分和感应臂部分；其中当自组装时，所述第一和第二寡核苷酸组分的所述感应臂部分作为感应臂，所述第一和第二寡核苷酸组分的所述底物臂部分作为底物臂，所述第一和第二寡核苷酸组分的所述催化核心部分形成非功能的催化核心；和
其中当自组装时，至少一种感应臂与所述活性抑制剂相互作用，所述第一和第二寡核苷酸组分的邻近维持它们各自的催化核心部分缔合以形成非功能的催化核心。
在一个实施方案中，MNAi组合物还可包含至少一种组装易化子。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂可包含活化剂组装易化子结构域、活性抑制剂结构域、报告分子结构域、底物结构域中的至少一种，或其任意组合。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种可位于所述活性抑制剂的不同结构域。所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种还可被不稳定的连接子或可切割的底物连接。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂可以是底物。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂可包含与所述两种或多种寡核苷酸组分中的至少一种基本上不互补的核苷酸序列。
在另一实施方案中，所述复合体的至少一种组分可包含至少一种适体或其部分，其中所述适体或其部分结合选自如下的配体：核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊或其任意衍生物、部分或组合。
在本发明的另一方面，提供了使用信号级联检测组装易化子的方法，包括第一MNAzyme、最初以基本上无催化活性形式存在的MNA复合体(MNAi)、能被所述第一MNAzyme修饰以提供可检测作用的活性抑制剂，其中所述活性抑制剂既是活性抑制剂又是潜在的底物；和
其中在允许所述第一MNAzyme的催化活性的条件下所述组装易化子与所述第一MNAzyme的部件酶的结合促进了所述第一MNAzyme的催化活性，由此提供了对所述活性抑制剂修饰，以释放所述活性抑制剂的活化剂组装易化子结构域和活性抑制剂结构域，其中所述释放提供所述可检测作用；和
其中所述释放的活化剂组装易化子结构域促进从所述MNA复合体的组分组装第二MNAzyme；和
其中所述第二MNAzyme的催化活性修饰所述活性抑制剂以释放更多的活性抑制剂结构域和更多的活化剂组装易化子结构域，其中所述释放提供了更多的可检测作用，和；
其中所述更多的活化剂组装易化子结构域促进另外的第二MNAzyme的组装，由此提供更多的所述催化活性的第二MNAzyme，由此提供指示所述组装易化子存在的更多的可检测作用。
在一个实施方案中，所述活性抑制剂可以是报告分子-抑制剂-易化子。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂、所述第一MNAzyme或所述第二MNA复合体组分中的一种或多种可以连接在不溶性载体上。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂、所述第一MNAzyme或所述第二MNA复合体组分中的一种或多种在溶液中可以是游离的。
在另一实施方案中，所述活性抑制剂可包含组装易化子结构域、活性抑制剂结构域、报告分子结构域、底物结构域中的至少一种，或其任意组合。活性抑制剂还可包含可检测部分和淬灭剂，其中当通过所述第一或所述第二MNAzyme对所述活性抑制剂进行修饰时，通过所述可检测部分提供的可检测作用被增加或降低。可检测作用还可通过以下检测：荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，光度测定，闪烁扫描法，电子方法，UV、可见光或红外光谱，酶促方法，或其任意组合。所述可检测作用还可被测定，所述测定的量指示组装易化子的量。
在另一实施方案中，所述组装易化子可以是靶标。所述靶标可以是选自如下的核酸：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA，其衍生物、扩增子或其任意组合。
在另一实施方案中，所述第一MNAzyme和/或第二MNA复合体的组分中的至少一种还可包含适体，其中所述方法提供了对与所述适体结合的配体的检测。所述配体还可包含蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊或其任意衍生物、部分或组合。
在另一实施方案中，组装易化子可以是作为输入事件的合成寡核苷酸。
在另一实施方案中，催化活性MNAzyme的组装可被选自如下的输入事件调节：在温度，盐浓度，离子强度，pH，二价阳离子的存在或不存在、类型或浓度，电荷，磁荷，物理操作上的变化，和在MNA或调节剂组分或微环境组分的浓度上的变化，或其任意组合。
本发明另一方面提供了使用级联检测靶标的方法，其中所述级联包含在所述靶标存在的情况下形成的起始MNAzyme；在所述起始MNAzyme的产物存在的情况下形成的第一MNAzyme；在所述第一MNAzyme的产物存在的情况下形成的另外的MNAzyme，其中所述方法包括如下步骤：
(i)用所述起始MNAzyme修饰第一底物以产生第一组装易化子；
(ii)用所述第一组装易化子组装所述第一MNAzyme；
(iii)用所述第一MNAzyme修饰另外的底物以产生另外的组装易化子；
(iv)用所述另外的组装易化子组装所述另外的MNAzyme；
(v)用所述另外的MNAzyme修饰所述第一底物以产生所述第一组装易化子；
(vi)用从(v)释放的所述第一组装易化子组装所述第一MNAzyme，由此形成放大级联；和
其中所述第一或所述另外的底物的至少一种的所述修饰产生指示所述靶标存在的可检测作用。
在一个实施方案中，所述第一或所述另外的组装易化子的任一或两者可以是活化剂组装易化子。
在另一实施方案中，所述第一底物可以是所述第一MNAzyme的活性抑制剂。
在另一实施方案中，所述放大级联可以是反馈放大级联。
在另一实施方案中，所述另外的底物可以是所述另外的MNAzyme的活性抑制剂。
在另一实施方案中，第一和/或所述另外的MNAzyme可以包含两种部件酶，所述两种部件酶在至少一种组装易化子存在的情况下变得有催化活性。
在另一实施方案中，第一和/或所述另外的MNAzyme可以包含两种部件酶，所述两种部件酶在至少两种组装易化子组分存在的情况下变得有催化活性。
在另一实施方案中，第一和/或所述另外的MNAzyme可以包含两种部件酶，所述两种部件酶在三种或更多种组装易化子组分存在的情况下变得有催化活性。
在另一实施方案中，所述靶标可以是待检测的、鉴定的或量化的组装易化子分子。所述靶标还可以包含核酸。所述核酸还可以选自：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA，其衍生物、扩增子或其任意组合。所述核酸的来源还可进一步选自合成、哺乳动物、人、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或其任意组合。
在另一实施方案中，至少一种所述MNAzyme还可包含至少一种适体。所述适体还可结合至少一种配体。所述配体还可选自蛋白、多肽、肽、核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊或其任意衍生物、部分或组合。
在另一实施方案中，所述MNAzyme或所述底物中的至少一种组分可被连接在不溶性载体上或在溶液中是游离的。
在另一实施方案中，所述一种或多种底物可包含可检测部分和淬灭剂部分，其中当通过至少一种所述MNAzyme对所述底物修饰时，通过可检测部分提供可检测作用。
在另一实施方案中，可检测作用可以通过下述的至少一种检测：荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，光度测定，闪烁扫描法，电子方法，UV、可见光或红外光谱，酶促方法或其任意组合。所述可检测作用还可被测定，其中所述测定的量指示靶标的量。
本发明另一方面提供了使用信号放大级联检测靶标的方法，所述信号放大级联包含第一MNAzyme的部件酶、第一底物、第二MNAzyme的部件酶、DNAzyme连接酶、第二底物、另外的部件酶和另外的MNAzyme的组装易化子和另外的底物，所述方法包括下述步骤：
(i)在可检测的靶标分子存在的情况下从第一MNAzyme的所述部件酶形成所述第一MNAzyme
(ii)用所述第一MNAzyme切割所述第一底物以产生多个切割底物
(iii)通过所述DNAzyme连接酶将至少一种所述切割产物与所述第二底物连接以产生所述另外的MNAzyme的连接的部件酶；
(iv)通过与至少一种所述切割产物的组装从第二MNAzyme的所述部件酶形成所述第二MNAzyme；
(v)用所述第二MNAzyme切割所述第一底物以产生更多的所述多个切割产物；
(vi)通过与至少一种所述更多的所述多个切割产物的组装形成更多的所述第二MNAzyme，其中更多的所述第二MNAzyme的组装由此形成放大级联，导致更多的所述多个切割产物的积累，其中至少一种所述更多的所述多个切割产物作为所述DNAzyme切割酶的底物；
(vii)用所述另外的部件酶和所述连接的部件酶以及所述组装易化子形成所述另外的MNAzyme；
(viii)用所述另外的MNAzyme修饰所述另外的底物，导致指示所述靶标存在的可检测作用。
在一个实施方案中，所述放大级联可以是反馈放大级联。
在另一实施方案中，与所述第二底物连接的所述切割产物在其3’端具有2’，3’-环磷酸酯。
在另一实施方案中，至少一种所述切割产物可以是活化剂组装易化子。
在另一实施方案中，所述靶标可以是待检测的、鉴定的或量化的分子。所述靶标还可以是核酸。所述核酸还可以选自：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA，其衍生物、扩增子或其任意组合。所述核酸的来源还进一步可选自合成、哺乳动物、人、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或其任意组合。
在另一实施方案中，第一MNAzyme的所述部件酶、所述第一底物、第二MNAzyme的所述部件酶、所述DNAzyme连接酶、所述第二底物、所述另外的部件酶和另外的MNAzyme的所述组装易化子和所述另外的底物中的至少一种还可包含至少一种适体。所述适体还可结合至少一种配体。所述配体还可选自蛋白、多肽、肽、核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊或其任意衍生物、部分或组合。
在另一实施方案中，第一MNAzyme的所述部件酶、所述第一底物、第二MNAzyme的所述部件酶、所述DNAzyme连接酶、所述第二底物、所述另外的部件酶、另外的MNAzyme的所述组装易化子和所述另外的底物中的至少一种还可包含至少一种纳米颗粒、微粒或其组合。
在另一实施方案中，第一MNAzyme的所述部件酶、所述第一底物、第二MNAzyme的所述部件酶、所述DNAzyme酶连接酶、所述第二底物、所述另外的部件酶、另外的MNAzyme的所述组装易化子和所述另外的底物中的至少一种可连接于不溶性载体或在溶液中是游离的。
在另一实施方案中，至少一种所述底物可包含可检测部分和淬灭剂部分，其中当通过所述MNAzyme对所述底物修饰时，通过可检测部分提供可检测作用。
在另一实施方案中，可检测作用还可通过以下的至少一种检测：荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，光度测定，闪烁扫描法，电子方法，UV、可见光或红外光谱，酶促方法，或其任意组合。所述可检测作用还可被测定，其中所述测定的量指示所述靶标的量。
在前述方面的任一方面的一个实施方案中，所述靶标可以是待检测的、鉴定的或量化的分子。所述靶标可以包含核酸。所述核酸可以选自：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA，其衍生物、扩增子或其任意组合。
所述核酸的来源可选自合成、哺乳动物、人、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或其任意组合。
在前述方面的任一方面的一个实施方案中，所述方法或组合物可结合适体并能检测结合适体的配体，包括但不限于蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊或其任意衍生物、部分或组合，或任何其它实体
在前述方面的任一方面的一个实施方案中，MNA复合体的至少一种组分可包含核酸或蛋白。所述核酸可包含标记的核酸、RNA、DNA、核酸类似物、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体中的至少一种，或其任意组合。所述蛋白可包含抗体、多肽、糖蛋白、脂蛋白中的至少一种，或其任意组合。
MNA复合体的至少一种组分还可包含至少一种纳米颗粒或微粒，或其组合。所述组分可连接于不溶性载体或在溶液中是游离的。底物组分可包含可检测部分和淬灭剂部分，其中当通过所述MNAzyme对所述底物修饰时，通过可检测部分提供的检测作用被增加或降低。
在前述方面的任一方面的一个实施方案中，可检测作用还可通过以下检测：荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，光度测定，闪烁扫描法，电子方法，UV、可见光或红外光谱，酶促方法，或其任意组合。所述可检测作用还可被测定，其中所述测定的量指示靶标的量。
本发明另一方面提供了包含多个MNA复合体的全加器，其中所述全加器可包含三种输入的八个可能的组合以产生两种输出的四个可能的组合，其中所述四个可能的组合是无输出、第一输出、第二输出、或第一和第二输出两者。
在一个实施方案中，所述无输入的存在产生无输出。
在另一实施方案中，为了响应任意且恰好一种输入，所述全加器可产生第一输出。
在另一实施方案中，为了响应任意且恰好两种输入，所述全加器可产生第二输出。
在另一实施方案中，为了响应三种输入，所述全加器可产生第一和第二输出。
在另一实施方案中，至少一种所述输入可以是可检测的事件。
在另一实施方案中，至少一种所述输出可以是通过下述的至少一种测定的可检测事件或可检测作用：荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，光度测定，闪烁扫描法，电子方法，UV、可见光或红外光谱，酶促方法，或其任意组合。
在另一实施方案中，所述第一或第二输出作为另一个全加器的输入。
附图简述
现在将仅通过举例的方式参考附图描述本发明的优选实施方案，其中：
图1：多组分核酸(MNAzyme)的一个示例性设计的描述。作为示例性公开，MNAzyme由两种部件酶(A和B)组成，其在组装易化子存在下自组装。当所述两种部件酶在组装易化子存在下组装时，催化活性MNAzyme形式能修饰例如切割底物。所述两种组分部件酶具有(i)与组装易化子结合的感应臂，(ii)结合底物的底物臂，和(iii)部分催化核心序列。
图2：活性MNAzyme的另外的示例性设计。插图(i)：当MNAzyme形成需要多种组装易化子组分时的MNAzyme的示例性设计描述。在该设计中，组装易化子的一种组分(F1)与部件酶A和B两者的感应臂区域互补，而第二组装易化子组分(F2)仅与部件酶B(按照该图解)或仅与部件酶A互补。所述两种组装易化子组分一起指导能修饰(如切割)底物的活性MNAzyme的组装。插图(ii)：当部件酶A组分和两部分构成的部件酶B组分在组装易化子存在下组装以产生能修饰(如切割)底物的活性MNAzyme时的示例性设计描述。在该示意图中，部件酶B具有截短的感应臂(T)，其在缺乏被称为稳定因子臂组分(S)的第二组分的情况下不足以允许稳定的MNAzyme组装。在邻近部件酶截短的感应臂的位置，稳定因子臂与组装易化子的杂交允许活性MNAzyme的组装。
图3：存在活性和无活性多组分核酸复合体的情况下，输出信号(荧光)随时间的变化。在该实例中，第一部件酶(A)是标准的设计。第二部件酶(B)具有含有底物臂的一种组分、部分催化核心和截短的感应臂(T)、以及作为稳定因子臂(S)的第二组分。
在反应(i)中观察到荧光的增加，其含有部件酶A和B以及组装易化子的全部组分。这与该反应中活性MNAzyme的组装和底物的切割是一致的。省略部件酶B的稳定因子臂部分(反应(ii))导致信号不随时间增加，表明该组分在该系统中对活性MNAzyme的组装是必需的。缺乏组装易化子的对照反应(反应(iii))也表明荧光不随时间增加。
图4：MNAi(左边)和活性MNAzyme(右边)的示例性设计的描述。当部件酶A和B与组装易化子组分和活性抑制剂(左边)复合时形成MNAi。MNAi能与底物相互作用，但不催化性修饰底物。在一些实施方案中，活性抑制剂还包括不稳定的或可切割的连接子(由虚线箭头所指)其在活性抑制剂中可分成两种或多种结构域。这样的结构域可包括例如(i)活性抑制剂结构域，其与部件酶组分基本上不互补，并通过破坏形成催化活性MNAzyme所需的二级结构起抑制作用，和(ii)活化剂组装易化子结构域，其如果从活性抑制剂结构域分离，可作为组装易化子组分起作用，并指导活性MNAzyme的组装。
图5：不同的多组分核酸复合体催化活性的证明。所有反应包含部件酶A、部件酶B、和荧光团淬灭剂染料对标记的底物。此外，反应包含或者(i)组装易化子F1/2，(ii)包含组分F1和F2(它们合起来的序列对应于组装易化子F1/2的序列)的组装易化子，(iii)组装易化子部分F1和含有两种连接的结构域的活性抑制剂，所述两种连接的结构域对应于活性抑制剂结构域和具有与F2相同的序列的结构域，或者(iv)无组装易化子或活性抑制剂。
监测荧光随时间的变化，作为通过活性MNAzyme复合体对底物的催化性切割的量度(图5)。在含有或者组装易化子F1/2或者组装易化子F1和F2的反应中荧光快速增加，表明分别形成了活性MNAzyme1和2，这两者都能切割底物。相反，含有F1和活性抑制剂的反应显示随时间没有荧光增加，表明MNAi复合体的形成。在缺乏组装易化子的情况下，没有观察到荧光的增加。
图6：使用DNA的信号级联(SCUD)的图示。图示的试验方案包括下述组分：(i)含有多个结构域的双标记的RIF(报告分子-抑制剂-易化子)组分；
a.RI结构域，包含活性抑制剂/报告分子结构域，其具有如下双重功能：首先作为活性抑制剂(当并入RIF中时)和其次当RIF被切割时提供荧光输出信号，
b.活化剂组装易化子结构域F2b，其对活性MNAzyme 2a复合体的组装是必需的组分，和
c.位于RI和F2b之间的底物序列，其当被或者MNAzyme 1a或MNAzyme 2a切割时，导致RI和F2b结构域的分离
(ii)组装易化子组分F2a
(iii)仅在另一种组装易化子(F1)存在下能形成活性MNAzyme 1a结构的部件酶组分，所述F1例如能够是测试样品中存在的靶标核酸；能够切割RIF、由此通过去除RI结构域(接着能发荧光并产生输出信号)释放和活化F2b结构域的活性MNAzyme 1a，
(iv)仅当部件酶臂结合所释放的邻接于F2a结构域的F2b结构域时能形成活性MNAzyme 2a的部件酶。MNAzyme 2a依次能切割更多的RIF释放更多的F2b，由此产生MNAzyme 2a的自身催化的自主复制级联。在完整的RIF存在下，MNAzyme 2a的组分组装成MNAi 2i复合体。
在缺乏F1的情况下，MNAzyme 2a部件酶会与完整的RIF形成MNAi 2i复合体。存在F1的情况下，活性MNAzyme 1a会形成并切割RIF释放F2b，所述F2b随后会自由地结合并促进活性MNAzyme 2a的组装。由于MNAzyme 2a还能切割更多的RIF，这启动了信号级联。如果SCUD策略与适体-MNAzyme系统相结合(如图7所示)，SCUD(图6)能被核酸靶标(DNA和/或RNA)或者其他靶标分析物(蛋白、小分子等)启动。
图7：调节MNAzyme活性的示例性策略。
该系统的所述策略可以用作(i)采用配体作为活化剂分子的调控MNAzyme活性的方法，和/或(ii)采用适体-MNAzyme(apta-MNAzyme)检测非核酸靶标的方法。
在该示例性适体-MNAzyme检测策略中包括的核酸寡核苷酸包括：
a)标准部件酶
b)适体部件酶(apta-partzyme)，其是具有适体的部件酶，所述适体并入其末端之一；
c)组装易化子，其是与适体部件酶和部件酶两者结合的寡核苷酸，能够组装活性MNAzyme；
d)报告分子底物；和
e)组装抑制剂寡核苷酸，其与适体部件酶在如下区域杂交：跨越至少部分适体序列和适体-部件酶序列的部分底物结合臂。
在缺乏活化剂配体的情况下(左插图)，组装抑制剂寡核苷酸与适体-部件酶结合，由此与报告分子底物竞争并阻断与报告分子底物的结合。当活化剂配体存在时(右插图)，活化剂配体与适体-部件酶的适体序列结合，阻断组装抑制剂寡核苷酸的结合，由此允许报告分子底物的结合和切割。同样地，在能结合适体的配体存在下，MNAzyme仅能形成并引起荧光信号产生。该方法能用于开发分子开关，所述分子开关能开启和关闭MNA系统的催化活性。可选地，所述方法能用于检测核酸和非核酸靶标配体两者。
本领域技术人员应理解能将一种或多种适体并入任意寡核苷酸组分，包括但不限于部件酶、组装易化子或底物。还能将适体并入任一这些寡核苷酸的任一端。在一个实施方案中，所述适体与部件酶的至少一种感应臂连接。在另一实施方案中，所述适体与部件酶的至少一种底物臂连接。
图8：DNAzyme连接酶和MNAzyme介导的切割/连接级联的实例：诸如寡核苷酸1/2的寡核苷酸能被MNAzyme切割为切割产物寡核苷酸1和寡核苷酸2，由此产生2’，3’-环磷酸酯和5’-羟基产物，它们参与了随后的连接反应。DNAzyme连接酶如7Z81(Prior et al，2004)能将第一寡核苷酸(寡核苷酸1)连接到第二寡核苷酸(寡核苷酸2)以产生具有相同的核苷酸序列寡核苷酸1/2的寡核苷酸连接产物。
图9.MNAzyme和MNAi设计的示例性结构：活性MNAzyme结构的一些实例显示在插图A至D(左边的结构)中。这些结构都能形成能切割底物(S)的催化活性酶。MNAi结构的实例显示在插图A至D(活性MNAzyme右边的结构)中。这些MNAi结构含有活性活性抑制剂(I)，其与活性MNAzyme中组装易化子(F)占据的位点相结合。所述图解含有MNAzyme的示意图，其包括一种组装易化子F1(插图A)，两种组装易化子F1和F2(插图B和D)或三种组装易化子F1、F2和F3(插图C)。显示在插图A中的MNA的实例包括在部件酶感应臂中具有自身互补性区域的感应臂。MNA结构还包括在插图D中所示的一种或多种稳定臂(sA)。参考实施例7至10会更好地理解标记为a至h的具体的MNAzyme和MNAi结构。
图10：使用两种底物级联的示例性策略。在该策略中，存在靶标(T)的情况下形成起始MNAzyme(Mt)。起始MNAzyme(Mt)切割第一底物(S1)产生第一活化剂组装易化子组分(S1f)，其指导形成第一MNAzyme(级联MNAzyme Mc1)。在该实例中，第一MNAzyme(Mc1)包含两种部件酶和命名为F1、F2和S1f的三种组装易化子组分。Mc1能切割另外的底物(S2)由此释放另外的活化剂组装易化子组分(S2f)，其指导形成第二MNAzyme(级联MNAzyme Mc2)。在该实例中，第二MNAzyme(Mc2)包含两种部件酶和命名为F3、F4和S2f的三种组装易化子组分。Mc2随后能切割更多的第一底物(S1)由此产生更多的第一活化剂组装易化子组分(S1f)。这导致形成进一步的第一MNAzyme(Mc1)，由此形成放大级联。
图11.使用起始MNAzyme的信号放大级联、SCUD级联放大和DNAzyme连接酶介导的MNAzyme切割读出。在该图中说明的所述策略具有如下特点：
(i)靶核酸(F1)促进形成起始MNAzyme(MNAzyme 1a)，其切割第一底物(底物A)并产生第一切割产物(产物Aa)和第二切割产物(活化剂组装易化子)(产物Ab)，第一切割产物(产物Aa)是反应第(ii)方面中必需的组分，第二切割产物(产物Ab)是反应第(iii)方面中必需的组分。
(ii)第一切割产物(产物Aa)在其3’端具有2’，3’-环磷酸酯，适合作为具有连接酶活性的DNAzyme 2a的底物起作用。DNAzyme连接酶2a将第一切割产物(产物Aa)连接到第二底物(底物B)以产生另外的MNAzyme(MNAzyme 4a)的连接的部件酶。
(iii)第二切割产物(产物Ab)作为活化剂组装易化子组分起作用以指导形成第二MNAzyme(MNAzyme 3a)。第二MNAzyme(MNAzyme3a)修饰更多的第一底物(底物A)产生更多的第一切割产物(产物Aa)和第二切割产物(产物Ab)。更多的第二切割产物(产物Ab)接着指导形成更多的第二MNAzyme(MNAzyme 3a)。这导致SCUD自身催化地自主复制反馈放大级联。该SCUD级联导致更多的第二切割产物(产物Ab)的进一步积累，所述更多的第二切割产物(产物Ab)组装更多的第二MNAzyme(MNAzyme 3a)，这导致更多的第一切割产物(产物Aa)的积累，所述更多的第一切割产物作为第(ii)方面中DNAzyme 2a的底物起作用。
(iv)在第(ii)方面通过将第一切割产物(产物Aa)与第二底物(底物B)连接产生的另外的MNAzyme的连接的部件酶形成另外的MNAzyme(MNAzyme 4a)的新部件酶。另外的MNAzyme(MNAzyme4a)和易化子F4一起形成，并修饰荧光团和淬灭剂染料对之间的底物C，导致指示靶标核酸F1存在的荧光信号的增加。
图12.使用MNAzyme的分子全加器。三种输入FAC1、FAC2和FAC3以灰色显示，指定为‘绿色’和‘蓝色’的阴影线代表具有不同荧光团的底物，C寡核苷酸以黑色显示。部件酶也以黑色显示，其与C寡核苷酸和底物预先复合。
定义
在此使用具有如下阐述的含义的某些术语。
术语“包含”(“comprising”)意思是“基本上包括，但不一定仅仅包括”。此外，单词“包含”(“comprising”)的变体，如“包含”(“comprise”)和“包含”(“comprises”)具有相应地变化的含义。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可以互换地使用并涉及下列物质的单链或双链聚合体：脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或其类似物、衍生物、变体、片段或组合，包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体微小RNA和初始微小RNA、其它非编码RNA、核糖体RNA，其衍生物、其扩增子或其任意组合。以非限制性实例的方式，所述核酸的来源可以选自合成、哺乳动物、人类、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌或上述的任意组合。
术语“催化核酸分子”、“催化核酸”、“核酸酶”和“催化核酸序列”在此可互换使用，并表示DNA分子或含有DNA的分子(本领域中也称为“DNA酶”、“脱氧核酶”或DNAzyme)或RNA或含有RNA的分子(本领域中也称为“RNA酶”或“核酶”)或上述的组合，是可以识别底物并催化所述底物的修饰的DNA-RNA杂交分子。所述催化核酸中的核苷酸残基可以包括碱基A、C、G、T和U，及其衍生物和类似物。
术语“多组分核酸复合体”、“多组分核酸”、“MNA”或“MNA复合体”指包含选自但不限于下述的两种或多种组分的复合体：部件酶、稳定因子臂、组装易化子、底物、以及包括活性抑制剂、组装抑制剂和其组分的调节剂组分。在一些实施方案中，所述MNA复合体是活性MNAzyme。在其他实施方案中，MNA复合体是无活性复合体如MNAi，MNAi在本文也可以称为多组分核酸无活性酶原(MNAi)。还在其他实施方案中，MNA复合体可以缺少MNAzyme组装和催化所必需的一种或多种组分，包括但不限于底物、组装易化子、稳定因子臂和部件酶，或其组分。
本文所用的术语“MNAzyme”是指两种或多种寡核苷酸序列(例如部件酶)，其仅在MNAzyme组装易化子(例如靶标)存在下才能形成能够催化性修饰底物的活性核酸酶复合体。图1描述了包含部件酶A和部件酶B的示例性MNAzyme。参考图1，部件酶A和B各自与组装易化子结合(例如，通过Watson-Crick碱基配对)。仅当部件酶A和B的感应臂在组装易化子上彼此邻近杂交时形成所述MNAzyme。所述MNAzyme的所述底物臂接合所述底物，由部件酶A和B的所述催化结构域相互作用形成的所述MNAzyme的所述催化核心催化所述底物的修饰(例如切割)。附图中例示了DNA/RNA嵌合报告分子底物的切割。所述MNAzyme在荧光基团和淬灭基团染色对之间切割所述底物，从而产生信号。术语“多组分核酸酶”和“MNAzyme”在此可以互换使用并包含由两种分子组成的二分结构，或由三种核酸分子组成的三分结构，或其它多分结构，例如由四种或更多核酸分子形成的那些。
图2(ii)说明了由多于两种分子组成的MNAzyme的实例。部件酶可包含多种组分，包括但不限于：具有截短的感应臂的部件酶组分和稳定臂组分，所述稳定臂组分通过与任一组装易化子(如图2(ii)中所示)或与底物相互作用稳定MNAzyme结构。
本文所用的术语“MNAi”指无催化活性状态的MNA复合体，其中催化活性被本文所定义的“活性抑制剂”抑制。在优选实施方案中，所述MNAi可以是由于例如图4所示的活性抑制剂寡核苷酸的结合引起的无催化活性，图4显示了MNAi的示例性设计。例如，当部件酶A、部件酶B、组装易化子和活性抑制剂结合形成无活性复合体时形成MNAi。图9说明了MNAi结构的另外实例。
本文所用的术语“无催化活性MNA复合体”、“无活性MNA复合体”、“无催化活性MNA”或“无活性MNA”指没有催化活性状态的多组分核酸复合体。在一个实施方案中，“无活性MNA复合体”是MNAi，其可以是由于活性抑制剂寡核苷酸的结合引起的无催化活性。在另一实施方案中，“无活性MNA复合体”是部分组装的或部分解组装的MNA复合体，其中催化MNAzyme活性所必需的一种或多种组分不与MNA复合体结合。在一个实施方案中，反应环境中MNAzyme活性所必需的一种或多种组分的缺乏可以导致“无活性MNA复合体”的形成。在另一实施方案中，微环境例如温度可以不容许活性MNAzyme所必需的所有组分的结合。在另一实施方案中，“无活性MNA复合体”可以包含活性MNAzyme结构形成所必需的所有组分，但“无活性MNA复合体”由于缺少催化所需要的一种或多种必要成分(诸如例如二价阳离子)而缺乏活性。在另一实施方案中，无活性MNA复合体可以是由于存在组装抑制剂而无活性。
本文所用的“分子开关”或“开关”指任意MNA复合体，其能响应输入事件，将无活性转变为有活性复合体，反之亦然。在优选的实施方案中，所述无活性复合体是无催化活性复合体。无催化活性复合体可以包含解组装的复合体、部分组装的复合体或诸如MNAi的复合体或具有相关组装易化子的复合体。催化活性复合体可以是MNAzyme。
本文使用的术语“组装易化子分子”、“组装易化子”、“MNAzyme组装易化子分子”、“易化子”、“MNAzyme组装易化子”和“活化剂组装易化子”指通过与MNAzyme的感应臂相互作用能促进部件酶组分自组装以形成催化活性MNAzyme的实体。在优选实施方案中，组装易化子是MNAzyme自组装所必需的。在一实施方案中，组装易化子可以由与一种或多种寡核苷酸“部件酶”的感应臂配对或结合的一种(图1)或多种分子或组分(图2(i)、图4-6和9-10)组成。组装易化子也可以与没有催化活性的MNA复合体结合，所述没有催化活性的MNA复合体包括但不限于MNAi和部分组装的或解组装的MNA复合体。
MNA复合体的组分可以包含具有对所述整体组分分离功能的结构域。例如活化剂组装易化子结构域可以包含在其他组分内，例如在活性抑制剂分子内，在这里它们以如下状态存在：直到它们通过例如切割从所述组分释放才有助于活性MNAzyme组装。本文使用的“活化剂组装易化子”或“活化剂组装易化子组分”指如下实体：一旦从另一组分内释放或外源提供，就能通过与MNAzyme的感应臂相互作用促进部件酶组分的自组装以形成催化活性MNAzyme。
组装易化子如活化剂组装易化子能用于调控活性MNAzyme的组装或促进从无活性多组分核酸复合体转变为活性MNAzyme。所述多组分核酸复合体由于例如活性抑制剂如MNAi的存在可以是无催化活性的。
本文所用的“活化剂”是导致MNAzyme活化的任意MNA结构或调节剂寡核苷酸组分、任意“分子效应剂”、“配体”、“靶标”或“事件”。活化剂寡核苷酸包括但不限于作为组装易化子、部件酶或其组分起作用的寡核苷酸，例如具有截短的感应臂或底物臂的那些和部件酶稳定因子臂组分。
在其他实施方案中，活化剂通过除去起抑制作用的寡核苷酸可以活化MNAzyme。能通过这种机制活化的寡核苷酸实例包括能移去(除去)抑制组分的调节剂寡核苷酸，所述抑制组分包括但不限于“活性抑制剂”或“组装抑制剂”。
在其他实施方案中，“活化剂”可以是与MNA复合体组分的适体结构域相互作用的配体，其中所述相互作用的结果是MNA复合体的活化。
本文所用的术语“稳定因子臂”指下述实体：与至少一种组装易化子在邻接于部件酶感应臂的位置能相互作用，以允许包括但不限于活性MNAzyme的MNA复合体的组装。
本文使用的术语“靶标”包括采用或不采用另外的扩增步骤试图通过特定MNAzyme检测、鉴定或定量的任何天然或合成的实体、组分或分析物，所述放大步骤包括但不限于MNAzyme放大实验方案，例如“使用DNA的信号级联”或“SCUD”反应。靶标因此包括最广范围的可检测实体、组分或分析物，为此需要灵敏的检测、鉴定和/或定量方法。某些示例性靶标包括但不限于蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、完整有机体、细胞、病毒、细菌、古细菌、酵母、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊或其任何衍生物、部分或组合。本文也包括使用其它靶标。应理解所述靶标还可以是组装易化子或活化剂。
本文所用的“可检测事件”、或“输入”或“输入事件”包括MNA复合体的微环境的变化，所述MNA复合体包括但不限于MNAzyme和/或无活性MNA复合体。所述变化可以是例如在温度，盐浓度，离子强度，pH，二价阳离子的存在或不存在、类型或浓度，电荷，磁荷，物理操作上的变化，和在MNA或调节剂组分或微环境组分的浓度上的变化，或其任意组合。应理解提及的“在浓度上的变化”包括浓度的增加或降低，也包括先前不存在或在MNA复合体微环境不可检测浓度的实体的出现，所述MNA复合体包括MNAzyme和/或无活性MNA复合体如MNAi。
由于微环境的变化能用于操纵MNA复合体的催化活性，代表可检测事件的实体也可用作MNAzyme的催化活性的“活化剂”或“抑制剂”。同样地，这些实体允许MNAzyme的催化活性转换“开”或“关”，例如通过促进从无活性MNA复合体转变为活性MNAzyme，或反之亦然。在一些实施方案中，所述实体促进MNAzyme的组装和活化。在一些实施方案中，所述事件或实体促进MNAzyme的解组装和失活。在其他实施方案中，所述事件或实体可以指导MNAi或其他MNA复合体的组装或解组装。在优选的实施方案中，MNAzyme催化活性的活化和失活过程是可逆的。
术语“活性抑制剂”指能结合MNA复合体的一种或多种组分并指导无催化活性的“MNAi”组装的任意实体(例如图4-6和9-11)。活性抑制剂对催化活性的抑制可由“活性抑制剂结构域”介导，所述“活性抑制剂结构域”也称为“活性抑制剂组分”、“抑制剂结构域”或基本上不与部件酶互补的“活性抑制剂结构域”。在优选的实施方案中，活性抑制剂可包含几种不同的功能结构域，例如包括但不限于选自如下结构域的任意组合的功能结构域：活性抑制剂结构域、活化剂组装易化子结构域、底物结构域、和/或报告分子结构域。这些不同的功能结构域可以与活性抑制剂内几种不同的结构结构域一致或不一致。因此，在一些实施方案中，活性抑制剂可以包含下述活性抑制剂结构域：基本上不与部件酶组分互补并通过破坏形成催化活性MNAzyme所需的二级结构起抑制作用。活性抑制剂的存在驱动MNAi复合体的组装，所述MNAi复合体能与底物相互作用，但不催化修饰底物。在一些实施方案中，活性抑制剂可以包含组装易化子结构域。
在一些实施方案中，活性抑制剂还可以包含不稳定的或可切割的连接子或底物，所述连接子或底物可以例如位于活性抑制剂内的两种或多种结构域之间，例如活性抑制剂结构域和活化剂组装易化子结构域。在底物或连接子位点的切割可以允许活性抑制剂结构域与活化剂组装易化子结构域分离，所述活化剂组装易化子结构域随后作为组装易化子组分起作用并指导活性MNAzyme的组装。
在一些实施方案中，活性抑制剂可以与其他实体偶联。在一些实施方案中，活性抑制剂与结合到射频磁场的金纳米颗粒偶联以允许杂交的远程电子调控。在该方法中，射频磁场起天线的作用，使得特定的寡核苷酸能够可逆热变性，同时使周围分子相对地不受影响。在一些实施方案中，所述活性抑制剂能用生物素标记以促进活性抑制剂的捕获和物理隔离。
本文所用的“组装抑制剂”是通过与活性MNAzyme复合体的必要组分互补性结合(例如通过与部件酶组分或组装易化子或底物结合)抑制MNAzyme复合体组装的组分。组装抑制剂序列与第一MNAzyme复合体组分的结合导致组装抑制剂和所述第一组分竞争结合第二MNAzyme复合体组分。例如，组装抑制剂可结合部件酶底物臂(其结合底物)或部件酶感应臂(其结合组装易化子)。当所述组装抑制剂与所述底物臂互补(和结合)时，其竞争(和阻断)底物与部件酶的结合(图7)。当所述组装抑制剂与所述感应臂互补(和结合)时，其竞争(和阻断)组装易化子与部件酶的结合。组装抑制剂以这种方式阻断了MNAzyme复合体的组装。所述组装抑制剂分子能用于调控MNAzyme的组装，并还允许开发检测非核酸和核酸靶标分析物两者的策略。
本文使用的术语“底物”、“底物分子”和“化学底物”包括能够被诸如MNA复合体的分子识别、作用或化学修饰的任何分子。所述底物的修饰提供了用于监测MNA系统的活性的“输出”信号或“可检测作用”。在具体实施方案中，底物可以被酶识别并修饰。在其它实施方案中，底物可以被催化核酸分子识别并修饰。在优选的实施方案中，底物可以被MNAzyme识别并修饰。底物的化学修饰可以通过修饰反应产物的出现或增加或通过修饰反应的底物的消失或减少来测量。
本文使用的“报告分子底物”、“报告分子探针”或“报告分子寡核苷酸”是特别适合于促进测量与催化反应相关的底物的消失或产物的出现的底物。报告分子底物可以在溶液中游离或结合(或“附着”)于例如表面或另一分子。报告分子底物能够通过许多种手段中的任何手段进行标记，包括，例如，荧光基团(含有一种或多种另外的组分，如淬灭基团)、放射标记物、生物素标记(例如生物素化)或化学发光标记物。
本文使用的“通用”或“普遍性”底物是被多种MNAzyme识别并对其起催化作用的底物，其中每一MNAzyme能够识别不同的组装易化子，例如报告分子底物。应用这样的底物促进开发用结构上相关的MNAzyme检测、鉴定或定量许多种组装易化子的单独测定，所有所述MNAzyme识别普遍性底物。这些普遍性底物各自能够独立地用一种或多种标记物标记。在优选实施方案中，使用可独立检测的标记物标记一种或多种通用底物以便为用MNAzyme独立地或同时检测多种组装易化子创造方便的系统。在一些实施方案中，被MNAzyme切割的底物使用DNAzyme连接酶能再生，因此再循环。
本文使用的术语“调节剂”是能增加或减少MNA系统催化活性的实体。调节剂可以是活化或转换MNAzyme活性的“活化剂”。在一些实施方案中，调节剂是“抑制剂”，包括但不限于“组装抑制剂”或“活性抑制剂”。
本文使用的“适体”可以包含能够识别一种或多种配体的结构。例如，所述识别可以由于所述适体的较高水平结构如三维结合结构域或口袋而具有高度特异性。因此，适体可以结合蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊或其任何衍生物、部分或组合，或任何其它实体。本文优选的适体可以包括短的单链DNA或RNA寡聚体，所述寡聚体能够通过吸附、回收和再扩增的重复过程从合成核酸的复合体库中分离出来。因此，可以产生针对几乎任何靶标的适体，所述靶标的范围从小分子如氨基酸或抗生素到蛋白和核酸结构。在本发明中，适体用于使分子开关成为含有组装抑制剂的MNA系统的一部分。活化剂配体的存在能打开MNAzyme活性(图7右边)，活化剂配体的除去或缺乏能关闭MNAzyme活性(图7左边)。而且，在本发明中适体还用于促进核酸和非核酸配体的检测。配体的检测还能用于触发放大级联，包括但不限于SCUD放大级联。
本文使用术语“部件酶”、“组分部件酶”、“部件酶组分”和“组分寡核苷酸”是指含有DNA或含有RNA或含有DNA-RNA的寡核苷酸，其中两种或更多种所述寡核苷酸仅在如本文定义的MNAzyme组装易化子的存在下能够一起形成“MNAzyme”。在某些优选实施方案中，一种或多种组分部件酶，并优选至少两种可以包含三种区域或结构域：形成催化化学修饰的催化核心部分的“催化”结构域；可以与组装易化子缔合和/或结合的“感应臂”结构域；以及可以和底物缔合和/或结合的“底物臂”结构域。这些区域或结构域的示例描述显示在图1中。部件酶可以包含至少一种另外的组分，包括但不限于适体，所述适体在本文称为“适体-部件酶”。
本文使用的术语“全加器”指对三种二元输入进行操作以产生两种独立二元输出的逻辑元件。全加器操作遵从下述规则：i)任意且恰好一种输入的存在仅产生第一输出；ii)任意且恰好两种输入的存在仅产生第二输出；iii)所有恰好三种输入的存在产生第一输出和第二输出；和iv)所有三种输入的缺乏产生无输出。
本文使用术语“级联”是指在连续阶段中发生的任何连续的过程或操作，在所述连续阶段中每一阶段的发生通常依赖于前一阶段的发生。因此级联可以包括但不限于酶促级联或任何其它信号转导级联。在某些实施方案中，级联可以包括因MNAzyme的催化活性而产生的信号放大。在优选实施方案中，这样的放大级联可以包括反复并因此而循环的信号放大，其中第一MNAzyme的催化活性使得第二MNAzyme的催化活性所需要的分子可获得，所述第二MNAzyme的催化活性进一步使得另外的第二MNAzyme的催化活性所需要的活化剂可获得。在某些实施方案中，所述所需要的活化剂可以包含部件酶、酶、组装易化子、底物、靶标、其部分或片段或上述的组合。在某些实施方案中，级联可以因此包括累积效应的产生，从而通过使信号产生至可以检测的水平来检测低丰度靶标。在其它实施方案中，可以利用多于两种的催化阶段。所述级联可以是线性的。在优选实施方案中，所述级联可以是指数的。在优选的实施方案中，所述级联可以包含通过去除活性抑制剂的影响来活化MNAi。在某些实施方案中，MNA复合体组分可以通过对其他MNA复合体组分的切割产生。在某些实施方案中，MNA复合体组分可以例如通过使用DNAzyme连接酶对其他MNA复合体组分进行连接来产生。
术语“寡核苷酸”通常代表DNA片段或含有DNA的核酸分子、或RNA或含有RNA的分子或上述的组合。寡核苷酸的实例包括核酸靶标；底物，例如，能够被MNAzyme或DNAzyme修饰的那些；引物，如通过诸如PCR的方法进行体外靶标扩增所用的那些；和MNA复合体的组分。MNA复合体组分包括但不限于组装易化子、组装抑制剂、活性抑制剂、稳定因子臂和/或底物臂，在某些实施方案中，MNA复合体组分可以包含如本文所定义的寡核苷酸。本文使用的部件酶也可以包含寡核苷酸。
除非另有说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”包括提及的任何指定的序列以及与其互补的序列。寡核苷酸可以包含至少一种添加或取代，包括但不限于4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧基甲基氨基甲基硫代尿苷、二氢尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、2’-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、β-D-甘露糖基甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-硫代甲基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-硫代甲基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰)苏氨酸、尿苷-5-氧基乙酸甲基酯、尿苷-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、β-D-阿拉伯糖基尿苷、β-D-阿拉伯糖基胸苷。
当术语“衍生物”用于本发明的核酸或核苷酸时，其包括任何功能等同的核酸或核苷酸，包括完整地制备(例如，通过重组方法)或在合成后添加(例如，通过化学方法)的任何融合分子。这样的融合可以包含其中添加了RNA或DNA或与多肽(例如，嘌呤霉素或其他多肽)、小分子(例如，补骨脂素)或抗体偶联的本发明的寡核苷酸。
当术语“类似物”涉及核酸或核苷酸时，其包括具有与DNA或RNA分子或残基相关的物理结构的化合物，并能够与DNA或RNA残基或其类似物形成氢键(即，它能够与DNA或RNA残基或其类似物退火形成碱基对)，但是这样的成键并非为包括在术语“类似物”中的所述化合物所需。这样的类似物可以具有与在结构上与之相关的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基不同的化学和生物学性质。甲基化、碘化、溴化或生物素化残基是类似物的实例。已经描述了含有核苷酸类似物的活性DNAzyme，所述核苷酸类似物包括脱氧肌苷、C-5-咪唑脱氧尿苷、3-(氨基丙炔基)-7-去氮-dATP、2’-O-甲基RNA、2’-O-甲基帽(Warashinaet al.，1999；Cairns et al.，2003；Schubert et al.，2004；Sidorov et al.，2004)。其它的类似物与DNAzyme的催化活性相适宜。催化核酸序列的变化，例如用一个碱基取代另一个、用类似物取代碱基、或糖组分或磷酸二酯主链的变化，对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，能够在合成期间进行改变，或通过在合成后修饰特定碱基进行改变。引入诸如碱基改变或碱基类似物的变化的催化核酸的经验性测试允许评价改变的序列或特定类似物对催化活性的影响。碱基A、C、G、T和U的类似物为本领域已知，其亚类列于表1中。
表1：本文使用的核苷酸类似物实例
    缩写     名称
ac4c  4-乙酰胞苷
chm5u  5-(羧基羟基甲基)尿苷
Cm  2’-O-甲基胞苷
Cmnm5 s2u  5-羧基甲基氨甲基硫代尿苷
D 二氢尿苷
Fm  2’-O-甲基假尿苷
Galq β-D-半乳糖基Q核苷
Gm  2’-O-甲基鸟苷
1 肌苷
缩写     名称
i6a  N6-异戊烯基腺苷
m1a  1-甲基腺苷
m1f  1-甲基假尿苷
m1g  1-甲基鸟苷
M11  1-甲基肌苷
m22g  2，2-二甲基鸟苷
m2a  2-甲基腺苷
m2g  2-甲基鸟苷
m3c  3-甲基胞苷
m5c  5-甲基胞苷
m6a  N6-甲基腺苷
m7g  7-甲基鸟苷
mam5u  5-甲基氨基甲基尿苷
mam5s2u  5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷
Manq β，D-甘露糖基甲基尿苷
mcm5s2u  5-甲氧基羰基甲基尿苷
Mo5u  5-甲氧基尿苷
Ms2i6a  2-硫代甲基-N6-异戊烯基腺苷
Ms2t6a  N-((9-β-呋喃核糖基-2-硫代甲基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸
Mt6a  N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰)苏氨酸
Mv 尿苷-5-氧基乙酸甲基酯
o5u 尿苷-5-氧基乙酸(v)
Osyw  Wybutoxo sine
 P 假尿苷
Q  Q核苷
s2c  2-硫代胞苷
s2t  5-甲基-2-硫代尿苷
s2u  2-硫代尿苷
s4u  4-硫代尿苷
    缩写     名称
T  5-甲基尿苷
t6a  N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸
tm  2’-O-甲基-5-甲基尿苷
Um  2’-O-甲基尿苷
Yw  Wybuto sine
X  3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷，(acp3)u
AraU  β-D-阿拉伯糖基尿苷
AraT  β-D-阿拉伯糖基胸苷
本文使用的术语“严紧性”是指两种核酸可以杂交的条件，并且可以包括例如溶液中盐和/或去垢剂的浓度、在两种核酸杂交期间使用的溶液的温度和杂交的时间段。因此，本文使用的术语“高度严紧性”是指有益于两种核酸杂交的溶液条件，只有在该条件下所述核酸才具有高度的互补性。所述互补性的程度可以包括但不限于约55％到100％的范围。因此，“高度严紧性”条件可以包括但不限于，使用变动的温度和包含各种浓度的去垢剂、盐和二价阳离子的缓冲液。
下列缩写在此使用并贯穿本说明书：
MNA：多组分核酸，或多部分核酸；
MNA复合体：多组分核酸复合体，或多部分核酸复合体；
MNAzyme：多组分核酸酶，或多部分核酸酶；
MNAi：多组分核酸无活性酶原复合体，或多部分核酸无活性酶原复合体；
DNAzyme：脱氧核糖核酸酶；
PCR：聚合酶链式反应；
LCR：连接酶链式反应；
LNA：锁核酸；
PNA：肽核酸；
An：分析物或靶标；
F：荧光基团；
Q：淬灭基团；
FAM或6-FAM：6-羧基荧光素。
BHQ1：黑孔淬灭基团1
BHQ2：黑孔淬灭基团2
shRNA：短发夹RNA
siRNA：短干扰RNA
mRNA：信使RNA
tRNA：转运RNA
snoRNA：核仁小RNA
stRNA：瞬时小RNA
smRNA：调节小RNA
pre-microRNA：前体微小RNA
pri-RNA：初始微小RNA
SCUD：使用DNA的信号级联
TASC：靶标辅助的自我切割
RIF：报告分子-抑制剂-易化子
RI：报告分子-抑制剂结构域
GTP：5’-三磷酸鸟苷
CTP：5’-三磷酸胞苷
dATP：5’-三磷酸脱氧腺苷
ATP：5’-三磷酸腺苷
LP：连接产物
CP：切割产物
oligo：寡核苷酸
说明性实施方案详述
首先应当理解，本文提供的附图和实施例是用于举例说明而不是限制本发明及其各种不同的实施方案。
根据本发明，提供了调节MNA复合体的组合物、方法和试剂盒。本方法通常包括使用包含多组分或多部分核酸复合体的组合物，所述多组分或多部分核酸复合体优选由多核酸组分形成，所述多核酸组分在组装易化子的存在下自组装以形成催化活性或无催化活性的核酸复合体。
根据本发明，可选地，将MNAzyme检测与靶标扩增(例如PCR)联合是将MNAzyme与信号放大结合，优选地仅使用核酸酶。这样的信号级联反应能取代诸如PCR的靶标扩增技术。此外，可以开发不需要任何蛋白酶的诊断方案，因此较为便宜并具有较长的适用期。
根据本发明，已经包括了使用MNAzyme加或减DNAzyme的几种信号级联策略。
1.组合物-MNAzyme和无活性MNA复合体
多组分核酸酶(Multi-component Nucleic Acid enzymes)(本文也称为多部分核酸酶(multipartite nucleic acid enzymes)或“MNAzyme”)已详细描述于2005年10月13日提交的序列号为60/726,291和2005年10月7日提交的序列号为60/724,567的美国申请，以及国际申请PCT/AU2006/001473中，其内容通过引用全部并入本文。本文定义的MNAzyme是一类MNA复合体。MNAzyme能从两种或多种寡核苷酸组分自组装，本文也称为部件酶。部件酶寡核苷酸在组装易化子的存在下自组装以形成MNA复合体。MNAzyme是催化活性MNA复合体。在某些实施方案中，MNAzyme的存在能被检测，并指示靶标的存在，这是因为所述MNAzyme仅在所述靶标的存在下形成，其中所述靶标包含所述组装易化子。本文提供了基于上述基本原理的多种测定。本文还提供了包含能够形成MNAzyme的寡核苷酸的组合物，以及各种序列的MNAzyme。在某些实施方案中，所述寡核苷酸组分、组装易化子或底物中的至少一种可以包含能够与活化剂或靶标结合的适体。
图1显示了MNAzyme的示例性设计。所述组装易化子分子提供“输入”信号，其指导部件酶组分以遵从调节的高特异性方式组装。在某些实施方案中，所述组装易化子可以是例如在测试样品中存在的靶标核酸序列。在其他实施方案中，所述组装易化子可以是例如环境中包括的合成寡核苷酸，以指导部件酶组分在可检测的实体或事件存在时自组装。组装的MNAzyme对底物的修饰能提供“输出”信号，其可以被检测和/或定量。仅作为例子，当底物用荧光团(F)和淬灭剂(Q)双标记时，活性MNAzyme对底物的切割使荧光团和淬灭剂分离，导致伴随的荧光增加。
先前公开的MNAzyme涉及靶标分析物的检测、鉴定和定量。本发明描述了MNA复合体的新方法、组合物和应用。本发明描述了提供寡核苷酸组分的新组合物，所述寡核苷酸组分通过形成缺乏催化活性的可选择结构如解组装的或部分组装的复合体，能被用于操纵MNAzyme活性。本发明还公开了包含寡核苷酸组分的无活性MNA复合体，如MNAi’s，所述寡核苷酸组分在适当条件下能被组装成活性MNAzyme，但当其与“活性抑制剂”组装时导致形成无催化活性的复合体。这样的无活性MNA复合体在本文定义为“MNAi”，这样的无活性是由于活性抑制剂的抑制影响引起的。MNAi能通过部件酶组分的底物臂与底物相互作用，但不能催化修饰底物。
所述活性抑制剂还可以包含组装易化子结构域、活性抑制剂结构域、报告分子结构域、底物结构域中的至少一种，或其任意组合。所述活性抑制剂可包含活化剂组装易化子结构域和活性抑制剂结构域。所述活性抑制剂可包含活化剂组装易化子结构域、活性抑制剂结构域和报告分子结构域。所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域、底物结构域和所述报告分子结构域中的至少两种可位于活性抑制剂的不同结构域。所述活性抑制剂的所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种可由不稳定的连接子或可切割的底物连接。
所述活性抑制剂结构域可以包含与至少一种MNA组分包括部件酶基本上不互补的核苷酸序列。
所述底物可包含活化剂组装易化子结构域、活性抑制剂结构域和报告分子结构域中的至少一种，或其任意组合。
所述活性抑制剂还可包含至少一种组装抑制剂。
所述组装易化子结构域可以是活化剂组装易化子结构域。所述活性抑制剂还可包含活化剂组装易化子结构域和活性抑制剂结构域。图4所示的活性抑制剂说明了该方案。所述活性抑制剂可以包含活化剂组装易化子结构域、活性抑制剂结构域和报告分子结构域，例如图6所示的RIF分子。就RIF分子而言，所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种可以位于活性抑制剂的不同结构域。
关于图6所示的RIF分子，所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种由不稳定的连接子或可切割的底物连接。
本发明还公开了催化活性的抑制在特定事件发生时可被去除，所述特定事件例如包括但不限于：活化剂如本文定义的组装易化子的存在，或参数的变化，包括但不限于在温度、波长、压力、盐浓度、去垢剂、阳离子或任何其他参数上的变化。此外，包括如活性抑制剂的MNA组分可以结合另外的实体以促进通过物理手段的去除，所述另外的实体包括但不限于：吸附的核酸、纳米颗粒、微粒、蛋白、抗体、RNA、DNA、核酸类似物、生物素基团、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体、射频部分，或其任意组合。无催化活性的MNA复合体代表“关”状态，而催化活性MNAzyme代表“开”状态。
活化剂可直接或间接诱导活性状态。例如当组装易化子组分(活化剂)与部件酶相互作用时可发生活性状态的直接诱导。例如通过一种或多种中间物的作用可发生活性MNAzyme状态的间接诱导，例如其中活化剂包含如下试剂或由如下试剂组成：其作用于抑制剂以引起活性抑制剂的去除，如通过释放由抑制剂结构域和组装易化子结构域组成的活性抑制剂的抑制剂结构域。在其他实施方案中，所述活化剂去除组装抑制剂。
在优选的实施方案中，MNA复合体，包括MNAzyme和无活性MNA复合体，基于一种或多种DNAzyme和/或核酶。MNAzyme的多个优选的部件酶组分和无活性MNA复合体基于特定的DNAzyme结构。目前的优选结构基于包括10:23和8:17 DNAzyme的DNAzyme。在各种实施方案中所述MNAzyme和无活性MNA复合体包含核苷酸碱基和脱氧核糖核苷酸碱基中的任一者或两者都包含。在更优选的实施方案中，MNA复合体，包括MNAzyme和无活性MNA复合体，至少部分基于DNAzyme的结构。在其它优选实施方案中，MNA复合体，包括MNAzyme和无活性MNA复合体，包含至少一些脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施方案中，组装成MNAzyme和/或无活性MNA复合体的部件酶的催化核心部分包含一种或多种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施方案中，一种或多种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物参与通过MNAzyme对底物的催化。在其它实施方案中，所述催化核心中的至少一种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物提高了MNAzyme的催化活性。在其它实施方案中，在用于催化的MNAzyme的催化核心严格需要至少一种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物，以在活性抑制剂的抑制影响一旦被去除时产生可测量的速率，所述速率相对于不存在脱氧核糖核苷酸碱基的情况下可比较的MNAzyme的速率。
如本文所提供的，MNA复合体，包括MNAzyme和无活性MNA复合体，可以含有本领域技术人员所熟知的一种或多种取代，如类似物，衍生物，修饰或改变的碱基，核糖核苷酸，糖或磷酸主链的改变，各种删除、插入、取代、重复或其它修饰，或这些的任意组合。这样的修饰、取代、删除、插入等可以在如本文所阐述的感应臂和/或底物臂和/或催化核心部分进行，使得所述分子保持催化活性。与所述底物或组装易化子结合的臂的取代和修饰可以被良好耐受并且实际上是允许改变所述分子以适合不同底物/组装易化子的基础。例如，对所述感应臂的修饰会允许针对不同的组装易化子进行调整，而对所述底物臂的修饰会允许针对不同的底物进行调整。对多个通用底物的分析允许同时检测多个“输出”信号。
在某些优选实施方案中，本发明涉及具有催化活性的MNAzyme，所述MNAzyme由脱氧核糖核苷酸组成或通过某些修饰/置换等衍生自这样的分子。作为通常规则，将整个分子用例如核糖核苷酸取代会使所述分子失活，因为它的活性依赖于某些关键的脱氧核糖核苷酸。在相应的方式中，核酶中的某些核苷酸可以用脱氧核糖核苷酸置换但是将整个分子用例如脱氧核糖核苷酸替代会使所述分子失活。
本领域技术人员应当理解，MNA复合体，包括MNAzyme和无活性MNA复合体，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸中的任一者或甚至两者都包括。目前优选的是包含至少一种和更优选全部脱氧核糖核苷酸组分的寡核苷酸的那些MNAzyme和无活性MNA复合体。在含有MNAzyme和/或无活性MNA复合体的所述部件酶的至少一部分催化核心中包含至少一种脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物的那些MNAzyme和无活性MNA也是优选的。甚至更优选的是其中这样的碱基为MNAzyme催化活性所必需的那些实施方案。
在某些优选的实施方案中，MNA复合体的至少一种组分可包含自身互补区域，其在某些条件下形成发夹结构。在一个实施方案中，自身互补区域可位于部件酶感应臂的一者或两者中。在另一实施方案中，自身互补区域可位于部件酶底物臂的一者或两者中。在另一实施方案中，一种或多种自身互补区域可存在于组装易化子、组装抑制剂或活性抑制剂组分、或其任意组合中。在其他实施方案中，MNA复合体可结合含有自身互补区域的底物。
本领域技术人员也应当理解，多部分DNAzyme比多部分核酶具有优势，例如在稳定性和使用的容易程度方面。还应理解，在某些实施方案中，MNAzyme比单分子核酸酶如DNAzyem有优势，所述单分子核酸酶仅能够识别一种底物，而单一MNAzyme(和/或无活性MNA复合体)能够识别两种分子，即组装易化子和底物。例如，MNAzyme的这些性质使它们适合于需要能“读”“输入”信号和“写”“输出”信号的组分的系统，例如在使用逻辑门的系统中。MNAzyme的这些性质提供了转换信号的能力，例如接受输入信号和应答适当的输出反应。
2.调节MNA复合体催化活性的方法和它们用途的应用。
MNA复合体组装和解组装可被微环境的变化调控。这些变化的实例包括但不限于温度，二价阳离子类型和浓度，盐浓度，pH，添加剂，组装所必要的关键组分的的存在或不存在，和/或活性MNAzyme的活性。
组装的MNAzyme代表“开”状态，而其解组装的或部分组装的组分代表“关”状态。组装和解组装能受温度调控。通过将温度转换到适合MNAzyme的组装和催化活性的温度范围中的一个温度来诱导“开”状态。相反地，通过将温度转换到适合MNAzyme的组装和/或催化活性的温度范围外来诱导“关”状态。能将MNA复合体组分的熔融温度调节至仅允许在限定的温度范围内组装。特别用于本发明这方面的寡核苷酸包括但不限于稳定因子臂组分、具有截短的感应臂的部件酶组分和组装易化子组分和/或调节剂寡核苷酸。MNA复合体提供了很大的柔性，其中基本设计的组分(图1)还被分裂成较小组分的亚单位或部分，如图2所示的截短的感应臂或稳定因子臂部分，其序列能依据熔解温度、序列组成和与其他组分寡核苷酸的互补性或缺乏互补性被设计。关于图2，本领域技术人员应理解被截短的部件酶臂可以是下述的任一种：部件酶A感应臂、部件酶B感应臂(如图2所示)、部件酶A底物臂或部件酶B底物臂，或其组合。
能利用MNAzyme对温度的敏感性建立热敏元件和变阻器。如果温度对于组分寡核苷酸的组装(杂交)和/或催化活性过高或者过低，那么MNAzyme底物不会被修饰(例如被切割)。如果温度对MNAzyme活性是容许的，那么底物会被修饰并将产生信号。温度从与MNAzyme活性不相容的温度升高或降低到与MNAzyme活性相容的温度，会通过由MNAzyme对底物修饰后产生的信号被检测。MNAzyme因此能提供能检测温度变化的装置。本领域技术人员应理解，使用对温度敏感的MNAzyme的本发明的简单装置能应用于许多工业，包括例如药物、食品和农业工业。
在其他实施方案中，磁力能调节阳离子浓度，并因此提供调节MNAzyme活性开和关的开关。带正电的阳离子对某些MNAzyme的催化活性是必需的。可选择地，磁力能通过将带负电的部件酶组分与带正电的阳离子如Mg2+物理上分离来关闭MNAzyme活性。随后，通过允许部件酶与阳离子恢复接触，可以再打开MNAzyme活性。
在某些实施方案中，使用与活性相容的范围内的pH能诱导活性“开”状态(MNAzyme)。相反，使用与活性相容的范围外的pH能诱导“关”状态。pH还通过诱导不稳定序列的水解被用于调控MNA复合体的活性，这样产生或破坏MNAzyme的新组分和/或无活性MNA复合体。
MNA复合体任意组分的存在或缺乏能提供“开”或“关”开关。改变例如寡核苷酸序列、熔解温度和或浓度能获得精细调节。对能组装成MNA复合体的组分(例如两部分组装易化子和/或两部分部件酶组分(具有截短的感应结构域和稳定因子臂))的广泛设计将柔性引入如下系统：能允许对与杂交和因此的MNA复合体组装相容的条件的设计(细调)。此外，杂交强度和MNA复合体内特定寡核苷酸结合的严紧性受许多因素的影响，所述因素包括但不限于盐浓度、阳离子浓度、温度和添加剂(DMSO)的存在或缺乏。同样地，影响杂交的实体能提供调控MNA复合体(包括活性MNAzyme和无活性MNA)的组装和解组装的工具。
例如通过利用作为分子“钩”的连接部分的物理特性，和/或通过利用寡核苷酸的固有性质如负电荷或序列互补性可以实现对组分的物理操作。在另一实施方案中，连接部分允许寡核苷酸被选择性捕获，例如使用生物素基团。在另一实施方案中，所述部分含有射频磁场无线电以促进杂交的远程电子控制。设计该方法以允许通过对MNA复合体内特定寡核苷酸的靶向热变性来选择性去除组分分子，因此允许依赖所述组分分子自身是否是活化剂或抑制剂序列来活化或抑制酶活性。例如，可以选择地使来自MNAi复合体的活性抑制剂变性以允许向活性MNAzyme状态的转变。
其他策略能被用于去除活化剂或抑制剂分子的影响，由此促进活性MNAzyme和无活性MNA复合体的组装或解组装。例如，在单链末端两种寡核苷酸之间的杂交能引起分支迁移和双链核酸区域的拉开拉链。在一个实施方案中，通过调节剂寡核苷酸能从MNAi复合体去除活性抑制剂，所述调节剂寡核苷酸通过支链迁移起作用。
在其他实施方案中，互补性寡核苷酸可以用于在竞争中胜过寡核苷酸组分，并由此“关”掉或关闭寡核苷酸组分，所述寡核苷酸组分本身包含活化的(MNAzyme)或无活性MNA复合体如MNAi。通过该方法抑制的所述组分可包含MNAzyme或无活性MNA复合体的活化剂或抑制剂组分。
去除或抑制活化剂组装易化子结构域可允许催化活性MNAzyme转变为无活性MNA复合体如MNAi。去除活化剂组装易化子结构域可包含由活性抑制剂取代MNAzyme的活化剂组装易化子结构域。
本领域技术人员应理解本文提供的各种方法通常用于调节单一MNA复合体或多个MNA复合体在单一反应或测定中的组装或活性。
3.组合物作为分子开关的用途
本领域技术人员应认识到并理解本发明等同于分子或生物“开关”其应用也包括在本文。下表2列出了开和关MNAzyme活性的机制的示例性实例。
表2.活性和无活性MNA状态以及两种状态之间转换的机制
在这点上，多组分核酸复合体的任何组分的存在或缺乏都能提供“活化剂”或“开”转换，或可提供抑制性“关”转换。
在某些实施方案中，稳定因子臂的存在或添加能提供“开”转换。在一个实施方案中，在例如通过活性抑制剂或任何其他MNA组分的切割的反应过程中，能在系统中产生新的稳定因子臂。在其他实施方案中，稳定因子臂的缺乏、修饰或去除能提供“关”转换。
在某些实施方案中，组装易化子或其组分的存在能提供“开”转换。在某些实施方案中，通过MNAzyme对MNA复合体组分的切割，例如通过对SCUD过程中活性抑制剂的切割或通过对反应环境中提供的其他组分的修饰，能产生新的组装易化子。在某些实施方案中，组装易化子能提供序列内编码的特定“输入”信号系统。在某些实施方案中，组装易化子能被识别或“读”。在某些实施方案中，部件酶感应臂能“读”组装易化子序列，包括在一种或多种单碱基上不同的组装易化子序列。在其他实施方案中，组装易化子或其组分的缺乏或去除能提供“关”转换。
在某些实施方案中，通过连接反应环境中存在的组分可产生MNA复合体的组分。在某些实施方案中，通过连接寡核苷酸产生部件酶，由此产生新的部件酶组分，其伴随形成例如活性MNAzyme。在某些实施方案中，通过连接寡核苷酸产生组装易化子，由此产生新的易化子组分，其能促进MNA复合体的组装。
活化(MNAzyme)和失活(无活性MNA)状态之间的转换能提供产生分子开关的机制，所述分子开关能通过活性和无活性构象之间的改变被调节。这样的分子开关可例如应用于核酸复制级联的调控，或自主治疗、诊断和计算分子规模装置的调节。
本发明提供了组合物，其包含用于自组装MNAi复合体的组分，在一种或多种MNAzyme组装易化子分子存在下的自组装形成MNAi，其中至少一种组装易化子分子包含活性抑制剂。
参照附图可以较好地理解本发明。图1描述了使用组装易化子组装MNAzyme的基本方法的实例。更具体地，部件酶A和部件酶B显示在图1中，各自包含(i)感应臂部分、(ii)底物臂部分和(iii)催化核心部分。在组装易化子的存在下，部件酶A和部件酶B的所述感应臂部分能够与所述组装易化子如DNA或RNA序列杂交并与其互补部分碱基配对。当以这样的方式与所述组装易化子接触时，所述MNAzyme自组装形成的催化核心能够修饰被底物臂结合的底物。优选地，所述MNAzyme的存在通过其催化活性的检测或测量来检测。因而组装的MNAzyme的底物臂能够通过所述底物臂和所述底物上互补序列的相互作用接合底物，例如图1所示的报告分子底物。一旦所述底物与所述底物臂这样接合，所述催化核心能够促进对所述底物的修饰(例如切割)，从而能够直接或间接测量或检测。可以使用各种方法选择性地组装(开)和解组装(关)所述MNAzyme。
关于图2，显示了活性MNAzyme的另外的示例性设计。一种MNAzyme的示例性结构描述在插图(i)中，其中多种组装易化子组分对MNAzyme的形成是必需的。在该设计中，一种组装易化子组分(F1)与部件酶A和B两者的感应臂区域互补，而另一种组装易化子组分(F2)仅与部件酶B(按照图2(i))或仅与部件酶A互补。所述两种组装易化子组分一起指导能修饰(例如切割)底物的活性MNAzyme的组装。图9(左边结构)说明了用于MNAzyme组装的易化子的其他设计。
图2的插图(ii)描述了示例性设计，其中部件酶A与二分的部件酶B组分在组装易化子存在下的组装产生了能修饰(例如切割)底物的活性MNAzyme。在该设计中，部件酶B具有截短的感应臂(T)，其在缺乏本文称为稳定因子臂组分(S)的第二组分的情况下，不足以允许稳定的MNAzyme组装。然而，当稳定因子臂组分与组装易化子在邻近部件酶截短的感应臂与组装易化子结合的位置杂交时，这允许组装成活性MNAzyme。
由部件酶A、部件酶B组分与截短的感应臂和稳定因子臂组分在组装易化子存在的情况下组装形成的活性MNAzyme代表“开”状态。部件酶稳定因子臂组分或组装易化子组分的省略、去除或修饰导致催化活性“关”状态。同样地，MNAzyme催化活性的调节能通过各种寡核苷酸的存在或缺乏和/或通过这样的寡核苷酸组分具有功能活性的能力，例如能够与其他寡核苷酸组分杂交形成稳定的MNAzyme复合体。截短的臂被设计为不足以允许稳定的MNAzyme在反应条件下的组装，除非伴随有稳定因子臂组分。所述稳定因子臂组分和组装易化子能对MNAzyme活性起“开”转换的作用。
图3所示的反应代表MNA复合体的两种可选择的状态。活性MNAzyme反应(i))代表“开”状态。其中部件酶稳定因子臂组分(反应(ii))或组装易化子组分(反应(iii))被省略的那些反应是代表“关”状态的无活性MNA复合体。同样地，MNAzyme催化活性的调节能通过各种寡核苷酸的存在或缺乏和/或通过这样的寡核苷酸组分具有功能活性的能力，例如能够与其他寡核苷酸组分杂交形成稳定的MNAzyme。截短的臂被设计为不足以允许稳定的MNAzyme在反应条件下的组装，除非伴随有稳定因子臂组分。所述稳定因子臂和组装易化子能对MNAzyme活性起“开”转换的作用。
本领域技术人员应理解截短的部件酶臂可以是下述的任一种：部件酶A感应臂、部件酶B感应臂(如图示的)、部件酶A底物臂或部件酶B底物臂。
本领域技术人员应认识到MNAzyme能用于产生自催化自我复制级联与其它迭代过程的分子传感器、分子开关、和/或调节剂或传播物的策略。应用的潜在领域包括但不限于医学、兽医、农业、食品技术、成像和生物恐怖应用。
关于图4，当部件酶A和B与组装易化子和活性抑制剂复合时形成MNAi(左图)。所述MNAi能与底物相互作用但不催化修饰底物。在某些实施方案中，活性抑制剂还包括不稳定的或可切割的连接子，其可以在活性抑制剂中使两种或多种结构域分离。这样的结构域可包括例如(i)活性抑制剂结构域，其与部件酶组分基本上不互补，并通过破坏形成催化活性MNAzyme所需的二级结构起抑制作用，和(ii)活化剂组装易化子结构域，其如果从活性抑制剂结构域分离，可作为另外的组装易化子组分起作用，并指导活性MNAzyme的组装。
对活性抑制剂修饰后，如对切所述分子和使所述(i)抑制剂结构域和所述(ii)活化剂组装易化子结构域分离，能从所述MNAi的组分得到活性MNAzyme(图4，右边)。所述释放的活化剂组装易化子结构域随后能作为另一组装易化子组分起作用，所述另一组装易化子与第一组装易化子组分一起能指导部件酶组分A和B组装成为能催化修饰底物的活性MNAzyme。
MNAi的其他示例性结构显示在图9中。
所述MNAi和催化活性MNAzyme代表组装组分的两种可选择状态，即分别为“关”状态和“开”状态。
4.组合物作为逻辑门的用途
本领域技术人员应认识到本文所述的MNA复合体可以用作逻辑门。“开”状态包括组装的催化活性MNA复合体，包括但不限于MNAzyme或在其活化剂配体存在下的适体-MNAzyme。“关”状态包括无催化活性的MNA复合体，包括但不限于完全或部分解组装的MNA复合体、活化剂配体不存在时的适体-MNA复合体以及MNAi。根据本发明的一个方面，提供了MNA复合体逻辑门，包括至少一种无活性MNA复合体、至少一种输入和至少一种输出，其中所述输入的存在活化所述无活性MNA复合体逻辑门，其中所述活化提供所述输出。所述门能是至少两种不同的输出状态，其中所述状态依赖于所述无活性MNA复合体逻辑门的活化。
在本发明另一方面，MNA复合体门具有至少两种输入，和其中所述MNA复合体是无活性的第一输出状态，以及其中所述MNA复合体是活化的第二输出状态。其中所述MNA复合体不被活化的所述第一输出状态对应逻辑关，其中所述MNA复合体是活化的第二输出状态对应逻辑开。可选择地，所述第一输出状态可对应逻辑开，所述第二输出状态可对应逻辑关。
在本发明另一优选的方面，所述MNA复合体逻辑门的输出可被以下的任一种或任意组合检测：荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，电子方法，UV、可见光或红外光谱，酶促方法。
还在本发明另一实施方案中，所述MNA复合体逻辑门可包含两种输入，并且可以是逻辑与门，其中所述MNA复合体被活化，由此只有当第一和第二输入存在时提供对应于逻辑开的输出。在存在单独的输入或缺乏输入的情况下，所述MNA复合体保持无活性，对应于逻辑关。
还在本发明另一实施方案中，所述MNA复合体逻辑门可包含一种输入，并可以是逻辑感应门，其中所述输入活化了无活性MNA复合体逻辑门，由此提供对应于逻辑开的输出，在缺乏所述输入的情况下，所述无活性MNA复合体逻辑门保持无活性，对应于逻辑关。
在本发明另外的实施方案中，所述MNA复合体逻辑门可包含两种输入，并可以是逻辑或门，其中所述输入的任一或两者活化了MNA复合体逻辑门，由此提供对应于逻辑开的输出，其中在无输入存在的情况下，所述MNA复合体逻辑门保持无活性，对应于逻辑关。
在本发明的另一实施方案中，所述所述MNA复合体逻辑门可包含两种输入，并可以是逻辑EX-OR(唯一的或)门，其中所述输入的任一种而不是两种活化了MNA复合体逻辑门，由此提供对应于逻辑开的输出，其中如果存在无输入，或如果两种输入都存在，所述MNA复合体逻辑门保持无活性，对应于逻辑关。
本领域技术人员还应认识到MNAzyme的解组装和组装相当于提供了两种状态，开状态和关状态，两种状态之间的转换能被许多实体和事件调节。这些状态也能以与上述类似的的方式应用于逻辑门系统。
在全加器中应用逻辑门的实例示例在图12并描述于实施例12中。
5.使用不溶性载体和固体载体的方法
还应理解，通常所述方法无论复合与否可应用于溶液中，或与不溶性载体或固体载体联合，其中底物、MNA复合体组分或其部分中的一种或多种可连接在所述不溶性载体或固体载体上。因此，部件酶组分、底物、组装易化子、组装抑制剂和/或活性抑制剂中的至少一种可以是结合的、连接的或系留的。此外，在提供本文示例性的方法和变化以及工作实施例的情况下，这样的测定系统的特征通常为本领域技术人员所理解。因此，本发明不应被认为局限于本文字面上的教导，而是能进行与本文提供的教导的原则和范围以及本领域常识相一致的修饰和变化。
包括“芯片”(又称为阵列或微阵列)形式的不溶性载体的本发明的实施方案通常包括偶联、系留或连接到芯片上的多个底物。在具体实施方案中，所述底物包含核酸。多个核酸可以通过本领域已知的任何适当方法定位在芯片上，例如，通过吸液管、喷墨打印、接触打印或光刻法。芯片可以由至少一种元件组成，每一所述元件包含至少一种核酸。所述至少一种元件可以由具有相同序列的多个核酸组成。包含芯片的所述元件数可以是任何数量，并且在芯片上定位有多个所述元件时，所述元件可以以均一的距离隔开或以变化的距离隔开、或为其组合。在某些实施方案中，所述元件可以随机定位，然后测定每一所述元件各自的位置。所述元件的大小和形状会取决于本发明的具体应用，并且具有不同大小和形状的所述元件可以组合成单一芯片。芯片表面可以基本平坦或可以具有如凹陷或突起的特征，且所述元件可以定位在凹陷内或定位到突起上。这样的凹陷可以为所述元件被浸入的溶液提供贮液器，或这样的突起可以促使所述元件干燥。例如，可以将所述元件放在96孔板的每一孔中。在某些实施方案中，所述芯片可以包括独特的鉴定物如指示剂、射频标记、整合装置如微处理器、条形码和其它标记以便鉴定每一所述元件。独特的鉴定物可以另外或可选择地包含阵列表面上的凹陷或突起。此外，独特的鉴定物能够提供芯片的正确定位或鉴定。独特的鉴定物可以通过数据捕获装置或通过光学扫描仪或检测器直接读取。
6.方法中使用的报告分子底物系统
根据本发明，还提供了通用报告分子底物系统，通过轻易的设计改变以产生识别不同组装易化子的新MNAzyme和无活性MNA复合体，所述通用报告底物系统可以用于快速系统的开发。如本文所论述的，部件酶的底物臂部分和催化核心部分可以保持不变，仅改变新组装易化子所必需要求的一种或多种部件酶的感应臂部分。提供通用底物序列并且因此能够将相同底物引入许多不同应用的系统中。此外，可以将相同底物引入本文各种实施方案的方法中，包括其中底物在溶液中游离或拴系或连接在载体上的测定。可以将一系列通用底物用在可以同时检测多种组装易化子的复合反应中。
被切割的底物能使用DNAzyme连接酶再生并因此再循环。
7.方法中使用的底物
如下述更详细的描述，诸如MNAzyme和无活性MNA复合体的MNA复合体在某些实施方案中具有能利用普遍性或通用底物的有利特性。图1以目前优选的构型示出了这样的底物，其中所述底物包含可检测部分和淬灭剂部分两者。淬灭剂部分适合于使来自所述底物可检测部分的可检测信号减少或消除，直到所述底物被MNAzyme切割。例如，淬灭剂部分可以包含“黑孔淬灭剂1”(BHQ1)或“黑孔淬灭剂2”(BHQ2)。
因此，MNAzyme在可检测部分和淬灭剂部分之间切割底物使这两部分在溶液中分离，从而使得在远离淬灭剂部分时或淬灭剂部分被从可检测部分的局部环境有效去除时，可检测信号出现或增加。
通过设计MNAzyme的组分部件酶，能够使用通用或普遍性底物。通过仅改变部件酶的感应臂，但不改变底物臂，能够设计特异性针对多种组装易化子中的每一种的多种MNAzyme和无活性MNA复合体，其全部都利用普遍性底物产生输出信号。本领域技术人员应当理解下述优势，即这不再需要对每种输入事件的反应都提供专门的或独特的底物。每一新组装易化子的检测只需要一种或多种感应臂部分的一种或多种改变；底物臂部分和催化核心部分可以保持不变。因此，可以使用MNA复合体如MNAzyme将单个报告分子底物用于单个组装易化子或其他输入事件，并使用改变的MNA复合体如MNAzyme将单个报告底物在一系列系统中用于多种组装易化子。多个报告分子底物允许在一个系统中复合监测多个MNA复合体和MNAzyme。
此外，所述底物可以包括另外的实体如标记核酸、纳米颗粒、微粒、蛋白、抗体、RNA、DNA、核酸类似物、生物素基团、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、锁核酸、肽-核酸嵌合体、射频磁场部分，或上述的任意组合。
底物可以被MNAzyme修饰从而提供“可检测作用”或“输出”信号。在检测过程中，MNAzyme对底物的修饰可以包括，例如，切割、连接、卟啉金属化，和碳碳键、酯键或酰胺键的形成。由于MNAzyme修饰底物，产生了可检测作用并且该作用的强度因此可以指示输入信号的量。可检测作用可以通过多种方法检测，包括荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，光度测定，闪烁扫描法，电子方法，紫外、可见光或红外光谱，酶促方法或上述的任意组合。
一些组已经报道了用比色读数检测核酸组靶标以及其它分析物(Elghanian et al.，1997，Mirkin et al.，1996，以及Liu and Lu，2004)。该策略包括批量制备金纳米颗粒，每一所述颗粒表面附着有截然不同的DNA寡核苷酸序列。然后能够通过加入与附着到金颗粒上的序列互补的“桥连寡核苷酸”使金颗粒聚集。颗粒聚集引起颜色从红到蓝的伴随改变(Mirkin et al.，1996)。在桥连寡核苷酸中引入DNAzyme底物序列能够提供逆转金颗粒聚集的机制(Liu and Lu，2004)。对依赖铅的DNAzyme通过加入铅的活化引起桥连寡核苷酸的切割、金颗粒的解离和颜色从蓝到红的改变。
可以使用这样的原理和MNA复合体如MNAzyme开发用于监测变化的简易检测器。温度或其他实体或事件的变化能活化一种或多种MNA复合体形成一种或多种MNAzyme，其能切割桥连寡核苷酸引起纳米颗粒的解离和颜色的变化。
8.方法的优化
本领域技术人员会容易理解，本文描述的方法可以使用各种实验参数进行优化。优化的具体实验参数和该优化的水平会取决于采用的具体方法和/或待检测的具体事件。这样的参数包括但不限于：时间、温度，盐浓度、去垢剂、阳离子和包括但不限于二甲亚砜(DMSO)的其它试剂，以及核酸的长度、互补性、GC含量和解链温度(Tm)。实施这样的方法的温度可以是约20℃到约96℃、约20℃到约75℃、约20℃到约60℃或约20℃到约55℃。温度可以是恒定的，或可以在与MNAzyme的组装和催化活性相容的温度和与催化活性不相容的温度之间循环。
此外或作为选择，参数和/或微环境的变化可用于将MNA复合体从无活性转换为活性状态。因此，在微环境中的参数可包含本文定义的“活化剂”，包括但不限于事件，如在温度，波长、盐浓度，去垢剂，阳离子，结构和调节剂组分(包括但不限于组装易化子或组装易化子组分、部件酶或部件酶组分、底物、组装抑制剂、活性抑制剂和活化剂寡核苷酸组分)的浓度上的变化。因此，可进行对参数和/或微环境的所述最优化以实现MNA复合体作为分子开关的用途。
在一优选的实施方案中，本文提供优化的反应以实践使用MNA复合体的方法。在这样的优化反应中，催化活性的活化比未优化的反应增加高达10％、20％或30％。更优选的反应条件使催化活性增加至少35％或40％，并优选高达50％或更多。在更优选的实施方案中，优化反应的催化活性的活化增加超过50％，并高达66％、75％或甚至100％。在更优选的实施方案中，被充分优化的反应方法会使催化活性的活化增加100％、200％或甚至300％或更多。其它优选的反应条件与以未优化的反应条件实践的方法相比，能够使催化活性的活化增加高达1000％或更多。用于优化在此提供的方法的高度优选的反应条件是引入某些二价阳离子。二价阳离子的浓度可以以浓度依赖方式影响大多数核酸酶的催化活性。优选的优化反应于Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+中的一种或多种进行优化。
9.使用适体的方法
参考图7，例示了如下方法：借此方法活化剂配体能用于转换适体-MNAzyme的活性“开”或“关”。图示了使用组装抑制剂在缺乏活化剂的情况下阻断适体-MNAzyme的活性的方法。这些方法使用适体，其可包含能够识别一种或多种配体的核酸或蛋白、多肽或肽或上述的组合。适体可结合例如蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊或上述的任何衍生物、部分或组合，或任何其它实体(Lee et al.，2004)。
本文优选的适体可以包括短单链DNA或RNA寡聚体，其能够通过吸附、回收和再扩增的反复过程从合成核酸的复合体库中分离出来。因此，可以产生针对几乎任何靶标的适体，所述靶标的范围从诸如氨基酸或抗体的小分子到蛋白和核酸结构。在优选的实施方案中，适体包括例如优选通过演化和选择技术产生的核酸结合分子。优选地，适体可以包括DNA或RNA分子，或二者的组合，包括但不限于按照例如上述表1的核苷酸类似物。
本领域技术人员应当理解，可以将适体并入一种或多种组装易化子分子和或活性抑制剂的任意端。此外，应当理解，能将一种或多种适体并入一种或多种部件酶寡核苷酸组分。还应理解，也能将一种或多种适体并入至少一种部件酶寡核苷酸组分。图7所示的策略中的所述组装易化子可包含例如DNA、RNA、LNA、PNA或含有一种或多种核苷酸碱基类似物的序列。
在图7所示的策略中，可将适体序列以存在活化剂时仅形成活性MNAzyme的构型并在部件酶(适体-部件酶)的末端。
本领域技术人员也应当理解，能将一种或多种适体并入任何寡核苷酸组分中，包括部件酶、组装易化子或底物。此外，能将适体并入这些寡核苷酸中任意一种的任意端。
图7所示的策略能用于(i)提供使用配体如活化剂分子调控MNA复合体活性的方法，和/或(ii)提供使用适体-MNA复合体检测非核酸和核酸靶标的方法，所述适体-MNA复合体当与配体活化剂接触时形成MNAzyme。所述适体-MNAzyme检测策略需要的核酸寡核苷酸包括：
(a)标准部件酶；
(b)适体-部件酶，其是在其一端有适体并入的部件酶；
(c)组装易化子，其是与适体-部件酶和使活性MNAzyme组装的部件酶两者结合的寡核苷酸；
(d)报告分子底物；和
(e)组装抑制剂寡核苷酸，其在跨越至少部分部件酶序列和适体-部件酶序列的部分底物结合臂的区域与适体-部件酶杂交。
当缺乏活化剂配体时(左图)，组装抑制剂寡核苷酸与适体-部件酶结合从而与报告分子底物竞争并阻断报告分子底物的结合。这一结构代表无活性MNA复合体。当存在活化剂配体时(右图)，活化剂配体与适体-部件酶的适体序列结合，阻断组装抑制剂寡核苷酸的结合，并因此允许底物的结合和催化活性MNAzyme的形成，所述催化活性MNAzyme接着在此情形下切割所述底物。同样地，催化活性MNAzyme仅在能结合适体的活化剂存在下形成并引起荧光信号的产生。
在一些实施方案中，使用核酸或非核酸靶标活化剂配体作为开关机制能实现对MNAzyme活性的调节。在其他实施方案中，通过其他手段操纵组装抑制剂分子以调节活性。例如，通过以下几种策略能去除组装抑制剂：包括选择性热变性或使用寡核苷酸竞争结合的方法和/或使用支链迁移取代片段的方法。
10.使用级联的方法
本领域技术人员应当理解，本文描述的方法可以用来实施在此定义的级联。实施本文公开的方法的具体实施方案包括但不限于(1)仅在靶标或事件的存在下，活化无活性MNA复合体以形成MNAzyme来修饰底物，其中所述底物随后可用于参与诸如产生可检测信号的第二事件，或(2)仅在靶标或事件的存在下，活化无活性MNA复合体以形成MNAzyme来修饰底物，其中所述底物随后可用于参与第二事件，其中所述第二事件的实施又可获得参与任意数目的后续事件的更多的底物，使得后续事件可获得参与实施较早事件的底物，从而产生循环级联，如图6、图10和图11(iii)所示，其中这样的循环级联可用于放大信号，例如，在输入事件是低强度的应用中，例如当靶标是低丰度的并否则不能提供可检测的输出信号。
设计用于靶标分析物检测的产生MNAzyme复制级联的一个机制使用SCUD级联策略。所述SCUD策略在所说明的各种设计中能被并入级联，如在图6中，其中并入了两种MNA复合体；在图10中，其中并入了三种MNA复合体；以及在图11中，MNA复合体和DNAzyme连接酶都被并入级联反应中。
所述SCUD方法依赖于调控活性MNAzyme和MNAi从存在于混合物中的组分寡核苷酸组装的能力。图6描述了SCUD的一种形式。该SCUD实例描述了信号放大的通用方法。
如图6所示的称为SCUD(使用DNA的信号级联)的该方法的一个实施方案包含下述组分：
(i)含有三种区域的活性抑制剂(例如图6所示的双标记的RIF(报告分子-抑制剂-易化子))；
a.活性抑制剂/报告分子(RI)结构域，其具有如下双重功能：首先当并入RIF中时作为活性抑制剂，和其次当RIF被切割时提供荧光信号，和
b.活化剂组装易化子组分F2b，其形成MNAzyme 2a的必要组分，
c.位于RI和F2b结构域之间的底物结构域，其可被MNAzyme 1a或MNAzyme 2a切割，
(ii)组装易化子组分F2a
(iii)仅在组装易化子(F1)存在下能形成活性MNAzyme 1a结构的部件酶，所述F1例如可以是测试样品中存在的靶标核酸；活性MNAzyme1a，其能够将RIF切割成RI和F2b组分，由此产生荧光、消除MNAzyme活性抑制作用以及伴随产生新的活化剂组装易化子组分F2b。
(iv)仅当部件酶臂将组装易化子组分F2a邻接于所释放的活化剂组装易化子组分F2b时能形成活性MNAzyme 2a复合体的部件酶。MNAzyme 2a依次能切割更多的RIF释放更多的RI和F2b，由此产生MNAzyme 2a自主复制级联并伴随荧光信号放大。
在缺乏F1的情况下，其例如能是靶标核酸，MNAzyme 2a部件酶会与完整的RIF形成无活性复合体MNAi 2i。完整的RIF作为形成MNAi 2i的活性抑制剂起作用。存在靶标分析物的情况下，活性MNAzyme 1a会形成，并由此切割RIF且释放活化剂组装易化子组分F2b，所述F2b随后会自由地结合并成为活性MNAzyme 2a的组分。由于MNAzyme 2a还能切割更多的RIF，这启动了复制/信号放大级联。
MNAzyme 2a每次切割RIF分子，就会产生新的MNAzyme 2a形成所需的更多组分(活化剂F2b组装易化子)。MNAzyme级联导致MNAzyme 2a复合体的组装，所述MNAzyme 2a复合体与采用下述组分的亲本MNAzyme是完全相同的，所述组分是通过MNAzyme 2a催化活性产生的产物。同样地，所述MNAzyme切割的产物(F2b)在自身催化的自主复制系统中能指导新的(亲本)MNAzyme分子的组装。
本文描述的所述结构和其他分子开关能形成包括自主复制级联的级联组分。
关于图10，这样的级联可包含MNA复合体，其在靶标的检测中起作用，例如通过与靶标的相互作用。这样，所述靶标作为组装易化子起作用，并通过促进起始MNAzyme的形成启动级联。该起始MNAzyme(在图10中的Mt)可修饰底物。所述修饰可以是例如切割。在该情形下，所述修饰导致产生第一组装易化子以形成级联第一MNAzyme(在图10中的Mc1)。所述级联第一MNAzyme随后可修饰另外的底物以产生另外的组装易化子来指导另外的MNAzyme的形成(在图10中的Mc2)。所述另外的MNAzyme随后可修饰第一底物以产生更多的第一组装易化子来级联第一MNAzyme，由此产生反馈到所述级联的较早阶段。在某些实施方案中，所述组装易化子可以是活化剂组装易化子。
本领域技术人员应认识到，在该级联中所述第一底物在其未切割状态时可以作为级联第一MNAzyme的活性抑制剂起作用。也就是说所述级联第一MNAzyme在所述第一底物被起始MNAzyme切割产生第一活化剂组装易化子之前实际上是MNAi，所述第一组装易化子随后将所述级联第一MNAi从“关”状态转换为所述级联第一MNAzyme的催化活性“开”状态。
同样地，本领域技术人员应认识到，所述另外的底物在其未切割状态时可以作为另外的MNAzyme的活性抑制剂起作用。也就是说所述另外的MNAzyme在所述另外的底物被级联第一MNAzyme切割产生另外的活化剂组装易化子之前实际上是MNAi，所述另外的活化剂组装易化子随后将另外的MNAzyme转换为开。
本领域技术人员应认识到图10显示了促进活性MNAzyme组装所需的三种组装易化子组分。在类似的方案中能使用更多或更少的组装易化子组分。
关于图11，本文所述的结构和其他分子开关能形成信号放大级联，其中靶标分子促进第一MNAzyme的形成，导致切割第一底物产生两种切割的产物(指定为Aa和Ab)。Aa作为连接步骤中的组分起作用(图11中框ii所示)，Ab作为SCUD放大中的组分起作用(图11中框iii所示)。Aa通常在其3’端具有2’，3’-环磷酸酯以允许其作为DNAzyme连接酶的底物起作用。
在连接步骤中，DNAzyme连接酶将Aa连接到第二底物以产生另外的MNAzyme的部件酶(图11中框iv显示了另外的MNAzyme)。
在SCUD放大步骤(图11中框iii所示)中，Ab作为第二MNAzyme的组装易化子起作用，所述第二MNAzyme修饰第一底物产生更多的Aa和Ab。所述更多的Aa和Ab被分别用于连接和SCUD放大步骤，由此形成导致Aa和Ab积累的反馈放大级联。
所述连接步骤的连接产物是另外的MNAzyme的部件酶，所述另外的MNAzyme修饰另外的底物导致指示靶标存在的可检测作用。
在本发明优选的实施方案中，对一种或多种所述底物的修饰可通过以下的任一或任意组合检测：荧光光谱，表面等离子体共振，质谱，NMR，电子自旋共振，荧光偏振光谱，圆二色谱，免疫测定，色谱法，辐射线测定，电子方法，UV、可见光或红外光谱，酶促方法。
本领域技术人员应认识到，在该级联中所述第一底物在其未切割状态时作为第二MNAzyme的活性抑制剂起作用。也就是说所述第二MNAzyme在所述第一底物被所述第一MNAzyme切割产生组装易化子之前实际上是MNAi，所述组装易化子随后将所述第二MNAi转换为开。
如果所述策略与适体-MNAzyme系统联合，那么MNAzyme介导的放大级联能通过核酸靶标(DNA/RNA)或其他的靶标配体(蛋白、小分子等)启动。由于所述反应在配体或其他输入事件存在的情况下仅被启动，这提供了用于检测和/或鉴定靶标分析物的技术。MNAzyme介导的放大级联基于多组分核酸复合体的活化。不同于靶标扩增技术如聚合酶链式反应或连接酶链式反应，MNAzyme介导的复制和信号放大不需要蛋白酶促进该过程。这提供了优于这些常规使用方案的主要优势。此外，使用一些寡核苷酸组分如稳定因子臂组分或组装易化子组分调节和控制MNAzyme催化活性的能力使MNAzyme的组装受到微环境中的条件和组分的紧密调控。
MNAzyme介导的放大级联能用于生物技术的范围，尤其在诊断中。它们通过促进信号放大能允许用于疾病诊断的蛋白和核酸的检测。催化核酸和/或级联反应能用于除了诊断以外的应用中，例如可用于治疗的纳米级装置和开关的计算分析和生物分子设计领域。
11.通过去除诸如活性抑制剂或组装易化子的组分允许在MNA复合体的活性和无活性状态之间转换的方法。
在活性MNAzyme和无活性MNA复合体之间的转换，或反之亦然，能通过供应或去除MNA复合体组分来实现，所述MNA复合体组分包括但不限于一种或多种活性抑制剂、组装易化子、组装抑制剂、部件酶、或稳定因子臂或其部分。在某些实施方案中，所述活性抑制剂可包括不稳定或可切割的连接子或底物，它们可位于活性抑制剂内的两种或多种结构域之间，例如活性抑制剂结构域和活化剂组装易化子结构域之间。在连接子部位的切割可允许将活性抑制剂结构域与活化剂组装抑制剂结构域分离，所述活化剂组装抑制剂结构域随后可作为组装易化子组分起作用，并指导活性MNAzyme的组装。对所述连接子的切割能通过一些方法实现，所述方法包括但不限于MNAzyme切割、蛋白酶切割、或由pH和或温度的变化诱导的水解。
可选择地，能使用包括分支迁移和/或与组分寡核苷酸互补性的方法选择性去除所述组装抑制剂和/或组装易化子。通过互补性起作用的调节剂寡核苷酸可通过改变与他们结合的寡核苷酸的二级结构做到这一点。在某些实施方案中，这可以产生可选择的构象，其中活化剂序列于能与其他组分组装以形成活性MNAzyme。例如，这样的调节剂寡核苷酸可引起分子内结构如发夹的破坏，这将活化剂分子限定于无功能构象。
在某些实施方案中，MNA组分如抑制剂包括但不限于活性抑制剂或组装抑制剂，其可与其他实体偶联。在某些实施方案中，所述组分与结合了射频磁场的金纳米颗粒偶联。这允许对杂交的远程电子控制，所述射频磁场作为天线起作用，能使特定的寡核苷酸可逆热变性，同时使周围的分子相对不受影响。在某些实施方案中，所述组分能用生物素标记以促进捕获和物理分离所述组分。
12.试剂盒
本发明也提供了用于实践本文公开的方法的试剂盒。通常，实施本发明方法的试剂盒含有实施本方法的所有必需试剂。例如，在一实施方案中试剂盒可以包含含有无活性MNA复合体如MNAi的第一容器，其中所述无活性MNA复合体活化形成MNAzyme需要通过将无活性MNA复合体暴露于活化剂消除对催化活性的抑制，其中所述活化剂消除抑制剂的抑制影响。例如，在一实施方案中，试剂盒在单独的容器内可包含用于形成无活性MNA复合体的一种或多种组分。
在一实施方案中，试剂盒可包含含有用于无活性MNA复合体的第一容器，其中所述MNA复合体活化形成MNAzyme需要通过本文公开的方法将MNA复合体暴露于活化剂来活化催化活性。
通常，本发明的试剂盒也会包含一种或多种其它的容器，其含有例如去垢剂和/或在实施本发明的方法中需要的其它试剂。
在本发明中，区室化的试剂盒包括其中试剂包含在独立容器中的任何试剂盒，并可以包括小玻璃容器、塑料容器或塑料条或纸条。这样的容器可以使试剂从一个区室向另一区室进行高效的转移，同时避免样品与试剂的交叉污染，并且每一容器中的试剂或溶液可以定量地从一个区室加入另一区室。这样的试剂盒也可以包括会接受测试样品的容器、含有在分析中使用的试剂的容器、含有去垢剂的容器和含有检测试剂的容器。通常，本发明的试剂盒也会包括使用试剂盒组分实施适当方法的说明书。本发明的试剂盒和方法可以与自动分析仪器及系统结合使用，例如，包括但不限于实时PCR仪器。
对于检测、鉴别或定量不同靶标或事件的应用，本发明的单一试剂盒可以是适合的，或者可选地需要不同的试剂盒，例如含有对每一靶标具有特异性的试剂。本发明的方法和试剂盒应用于其中要求检测、鉴定或定量任何实体或事件的任何情形。
现在将参考如下具体的实施例更详细地进一步描述本发明，这些实施例不应以任何方式解释为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：部件酶B包含两种分子的MNAzyme例子
本发明在MNAzyme基本设计的基础上涉及许多变体。本实施例中，MNAzyme是在组装易化子存在下从部件酶A和含有两种组分的部件酶B组装的，所述两种组分即一种是带有截短的感应臂的部件酶组分，一种是作为稳定因子臂的组分。MNAzyme的组装是由部件酶感应臂和组装易化子序列通过Watson-Crick碱基识别进行的。以下实施例展现了截短的部件酶臂和稳定因子臂的用途。
图2(插图(ii))和图3显示了本实施例中所用MNAzyme的检测策略。
所需寡核苷酸如下所述：
a)标准部件酶A；
b)部件酶B，其包含第一组分，以及第二稳定因子臂组分，所述第一组分含有底物臂、部分催化核心和截短的感应臂，所述第二稳定因子臂组分与邻接于所述部件酶截短感应臂的组装易化子杂交。当部件酶中截短的感应臂与组装易化子发生杂交时，稳定因子臂的设计促进MNAzyme的组装；以及
c)底物，例如报告分子探针底物。
活性MNAzyme组装还需要有组装易化子的存在。
1.1部件酶寡核苷酸和稳定因子臂
在本实施例中，部件酶B的截短感应臂只有5个核苷酸长。部件酶A以及部件酶B的两种组分的序列如下所示(5’-3’)。以下序列中，粗体显示的碱基与组装易化子发生杂交，带有下划线的碱基构成组装好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜体显示的碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：1部件酶A4 Xd-P：
ACAACGA -P
SEQ JD NO：2部件酶B5 Xd-P组分1：
GGCTAGCT
SEQ ID NO：3部件酶B稳定因子臂组分XdS-P：
-P
1.2.报告分子底物
本实施例所用的报告分子底物是5’末端标记有6-FAM部分、  3’末端标记有BHQ1部分的SubBi-2，命名为SubBi-2-FB。以490nm(FAM激发波长)激发，于520nm(FAM发射波长)监测对SubBi-2-FB的切割。以下列出了SubBi-2-FB的序列(5’到3’)，小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4 SubBi-2-FB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
1.3.组装易化子分子
以下是用作组装易化子的合成寡核苷酸序列(5’到3’)。该组装易化子与部件酶B感应臂完全匹配。用无核酸酶水代替靶组装易化子作为“无靶标”对照。
SEQ ED NO：5组装易化子Xd-T：
TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGTATACAGACAGATGGACATCCAGTTGGTGA
1.4反应条件
催化活性MNAzyme对报告分子底物的切割引起荧光信号的增加，通过测量这个增加检测到组装易化子，通过加入底物引发反应，全部反应的总体积是50μL。反应在FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)上在55℃下进行。每2秒钟读一次各个反应的荧光度，总共5分钟。所有反应含有200nM A4Xd-P、200 nM B5Xd-P、1 x PCR缓冲剂II(Applied Biosystem)以及25mM MgCl2。此外，反应含有如表3所示寡核苷酸。
表3.MNAzyme反应中的其他试剂
反应 组装易化子 稳定因子臂
(i) 200nM Xd-T  200 nM XdS-P
(ii) 200nM Xd-T 无稳定因子臂
(iii) 无组装易化子(水对照) 200nM XdS-P
1.5结果：在有部件酶和组装易化子的情况下，活性MNAzyme的组装
当组装易化子和部件酶稳定因子臂组分均包含在反应中(反应(i)：图3)，活性MNAzyme组装，并对底物进行了切割，造成荧光随时间提高。相反，没有组装易化子时，荧光信号没有增加(反应(iii)：图3)。此外，表明稳定因子臂的存在对于活性MNAzyme的形成非常关键。含有包括组装易化子在内的所有反应成分，但是缺少稳定因子臂组分的反应，荧光未随时间提高(反应(ii)：图3)。因此，部件酶B的感应臂的5个碱基不足以形成稳定的MNAzyme复合体，而稳定因子臂组分的存在显示能够弥补部件酶感应臂短的长度(截短的)，使得在严谨温度条件下(本实施例的55℃)形成稳定的MNAzyme。本系统中使用了带有截短的感应臂的部件酶，所以稳定因子臂组分是组装活性MNAzyme的关键寡核苷酸。
另外，当含有部件酶A和部件酶B之两种组分的反应中包含的是替代的组装易化子，即其与部件酶感应臂有单个核苷酸错配时，荧光信号不随时间增加(数据没有提供)。
本实施例表明，在所述实验条件下，只有存在完全匹配的组装易化子时才能形成MNAzyme。本领域技术人员应理解可以通过提供完全匹配或带有错配的组装易化子来调节活性MNAzyme和无活性MNA复合体之间的转换。此外，本实施例展示了双组分部件酶的用途，该部件酶包含含有截短的感应臂的第一分子和第二稳定因子臂分子。这类系统中对稳定因子臂分子的需求提供了另一个能调节MNAzyme的组装的工具。
含有多寡核苷酸组分的MNA系统提供了极大的灵活性，因为所述组分的序列可以根据熔解温度、序列组成，以及与其他寡核苷酸组分有或缺乏互补性来具体决定。较短序列包括但不限于，带有截短臂的部件酶组分、稳定因子臂，以及组装组分，它们在本发明的这个方面特别有用。
实施例2：利用温度调节MNA复合体的组装和解组装，及其在构建用于温度感应的DNA纳米规模设备中的应用
也可以通过温度来控制MNAzyme的组装和解组装。温度的升高或降低能提供用于将MNAzyme的催化活性“打开”和“关上”的机制。能利用MNAzyme对温度的敏感性来建成温度感应器和可变电阻器。
如果温度对于MNAzyme的组分寡核苷酸的组装(杂交)，以及/或者催化活性来说过高或过低，就无法形成能够对底物进行修饰(例如切割)的活性复合体。如果温度能够允许MNAzyme的组装和/或活性，则底物将被修饰，并产生信号。
通过变换碱基组成和/或寡核苷酸长度来改变组分寡核苷酸(例如，包括稳定因子臂组分和/或组装易化子的部件酶)的熔解温度的能力使得能够建成这样的系统，该系统可以对MNAzyme体系进行更细致的调节。这就使得MNAzyme不仅能够处于完全“开”或完全“关”的状态，而是能够产生适用于可变电阻器的活性渐变。它还使得能够调制MNAzyme反应发生的温度范围。
由MNAzyme活性所不适合的温度升高或降低到与MNAzyme活性适合的温度可以通过底物被MNAzyme修饰后产生的信号检测到。读取方式可以是例如荧光的或比色的。
所述MNAzyme复合体可以通过对桥接寡核苷酸进行切割来对温度变化做出反应，从而导致金纳米颗粒的聚集。这使得能够开发可以检测温度变化的简单比色设备。本领域技术人员会理解本发明利用MNAzyme进行温度感应的简单设备可以应用在许多工业中，例如制药业、食品业和农业。
一个应用可以包括将MNAzyme温度感应器与温度敏感性药物或其他化合物包装在一起。如果包装未能保存在合适的温度条件下(例如，冷藏)，MNAzyme可能形成并产生信号，从而认定所述化合物变质。类似的，可以借助MNAzyme温度感应器来监测某些需要维持在设定温度范围内的食品，例如冷冻食品，所述感应器能够识别出储存过程中在某个阶段已融化的食品。
这个利用温度来控制MNAzyme的催化活性的例子展示了将MNAzyme催化活性打开和关闭的一般策略。因此，可以通过能够影响到催化速率的许多因素来控制MNAzyme的组装和解组装。这类例子包括，但不限于组分部件酶或组装易化子的存在与否、盐浓度、pH、二价阳离子的类型和浓度、添加剂的存在与否，以及温度。
实施例3：促进和抑制活性MNAzyme或MNAi的组装的机制
MNAzyme由部件酶组成，后者在有一或多种组装易化子组分的情况下，组装形成活性酶(例如图1、2、4(右侧插图)、图5(i)和(ii)以及图9(左侧结构))。能够与部件酶感应臂结合的组装易化子可以是靶分析物，或者是加入反应混合物来推动MNAzyme的组装的合成核酸分子。除了协助组装活性MNAzyme的能力，当与“活性抑制剂”分子杂交时，部件酶还可以组装成无催化活性的MNAi复合体(图4(左侧插图)，图5和图9(MNAzyme结构右侧的结构))。我们测试了多种替代的寡核苷酸序列，看它们调节活性MNAzyme复合体或MNAi的组装的能力。
本实施例中(图4和5描述的)，MNAzyme的组装是在有(i)单分子(组装易化子F1/2)或者(ii)两种分子(组装易化子组分F1和组装易化子组分F2)(其序列共同构成存在于易化子F1/2的序列)的情况下检验的。易化子F2与一种部件酶的整个感应臂结合，并且重叠结合第二种部件酶的感应臂的4个碱基对。在另一个反应中，“活性抑制子”分子具有的序列包括易化子F2的序列加上另外的活性抑制子结构域，该分子被检测了其推动反应向组装MNAi复合体的方向进行的能力。
3.1部件酶寡核苷酸
以下序列中，粗体表示的碱基与组装易化子杂交，带下划线的碱基构成组装好的MNAzyme的催化核心，斜体显示的碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO 6：部件酶A RO5A4/2-P：
ACAACGA -P
SEQ ID NO 7：部件酶B RO5B5/2-P：
GGCTAGCT -P
3.2报告分子底物
本实施例所用报告分子底物是序列5’到3’如下所示的SubBi-2-FB。SubBi-2-FB的5’末端标记有6-FAM部分，3’末端标记有BHQ1部分。以485nm(FAM激发波长)激发，于530nm(FAM发射波长)监测对SubBi-2-FB的切割。小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4 SubBi-2-FB：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
3.3调节剂寡核苷酸
本实施例中检测了多个分子调节MNAzyme和/或MNAi的组装的能力。构成组装易化子F2的序列也包含在易化子F1/2和活性抑制剂的序列中，用粗体和下划线表示。
SEQ ID NO 8：组装易化子F1/2：
GCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCT
SEQ ID NO：9组装易化子F1：
GCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCT
SEQ ID NO：10组装易化子F2：
SEQ ID NO：11活性抑制剂分子：
AAGGTTTCCTCGTCCCTGGGCA
3.4反应组分和对MNAzyme活性的监测
对MNAzyme活性的实时监测在BMG LabTech FluoStar荧光仪上，共50μL反应体积中进行。反应于55℃等温监测4分钟。通过向反应混合液中注入荧光底物SubBi-2-FB(10μl 1μM溶液)来引发反应，所述反应混合液含有1x PCR缓冲剂II(Applied Biosystems)、25mMMgCl2、200nM部件酶A RO5A4/2-P、200 nM部件酶B RO5B5/2-P，以及或者是(i)400nM组装易化子F1/2，或者(ii)400nM组装易化子组分F1和400nM组装易化子组分F2，或者(iii)400nM活性抑制剂和400nM组装易化子组分F1，或者是(iv)不含有组装易化子。
3.5结果：
采用多种调节性或者结构性组分寡核苷酸的组合得到的结果示于图5。在含有组装易化子F1/2(图5(i))或者组装易化子成分F1和F2(图5(ii))的反应中可以看到荧光信号快速增加，表明了高水平的MNAzyme切割活性。缺乏易化子时荧光没有随时间增加(图5(iv))。这表明组装易化子不需要总是完整的寡核苷酸，而是可以分成多个短的易化子组分，它们相互邻接地排列在部件酶的感应臂上。
在含有活性抑制剂和易化子F1(图5(iii))的反应中没有观察到荧光信号随时间增加。因为活性抑制剂分子包括易化子F2的序列，所以邻接着易化子F2的另外的非互补抑制序列是推动MNAi复合体组装的元件。MNAi可以结合到底物上，但是不能催化性地修饰它。结果，所述底物未被切割，在有MNAi复合体的情况下，荧光没有随时间增加(图5(iii))。将含有组装易化子组分F1和F2的反应(图5(ii))与含有组装易化子F1和活性抑制剂(引入了F2序列)的反应(图5(iii))进行比较表明，活性抑制剂中存在的抑制结构域通过推动MNAi复合体的组装，阻止形成活性MNAzyme，从而提供可以用来调节酶活性的工具。
因此被设计成在有组装易化子F1/2时可以形成的MNAzyme产生了荧光。本实施例表明组装易化子F1/2可以被分成两部分(组装易化子组分F1和F2)，而保留指导催化活性MNAzyme组装的能力。这两种组装易化子组分如果在部件酶感应臂上彼此相邻结合，那么它们合在一起可以稳定活性MNAzyme的形成并引起荧光。在相同条件下进行的后续实验表明，在仅有组装易化子序列组分F2的情况下，没有观察到荧光随时间增加(数据未显示)。因此，本实施例表明，部件酶组合成活性MNAzyme可能需要有多个组分组装易化子的存在。当需要多组分组装易化子时，一或多个这些组分的存在与否可以被用来控制活性MNAzyme的组装，从而将它们打开和关闭。
我们进一步发现，活性抑制剂分子能通过与部件酶杂交和破坏两种组装易化子组分在部件酶感应臂上结合处的二级结构来阻止MNAzyme组装，所述二级结构是酶活性所必需的(见图4和5的例子)。本领域技术人员会理解，可以设计与部件酶A或B，或者与部件酶感应或底物臂杂交的抑制分子。
包括活性抑制剂、部件酶稳定因子臂组分以及组装易化子或其组分在内的分子均可被用来调节活性MNAzyme和无活性状态如MNAi的组装。在活化(MNAzyme)和失活(比如MNAi)状态之间转换可以为生成分子开关提供一种机制，通过在活性和失活构象之间交替来调节所述分子开关。这类分子开关可以应用来控制核酸复制级联(图6，实施例4)，或者自主治疗、诊断以及计算分子规模设备的调节。贯穿在本文件中讨论了可以应用来诱发特定寡核苷酸组分发生解离的多种实验方案。
实施例4：使用DNA的信号级联(SCUD)
产生用于靶分析物检测的MNAzyme复制级联的一个机制利用了SCUD级联策略。该SCUD策略可以引入大量设计中的级联，以举例的方式，在例如图6(引入了两种MNA复合体)、图10(引入了三种MNA复合体)和图11(级联反应中引入了MNA复合体和DNAzyme)中有阐述。
SCUD方法依赖于对由混合液中存在的组分寡核苷酸组装成活性MNAzyme和MNAi的控制能力。图6中描述了SCUD的一种形式。该SCUD例子描述了信号放大的一般方法。
如图6所示，被称为SCUD(使用DNA的信号级联)的该方法的一个策略含有以下组分：
(i)  含有三种区域的双标记RIF(报告分子-抑制剂-易化子)；
a.活性抑制剂/报告分子(RI)结构域，其具有双重功能，其一在引入RIF时是活性抑制剂；其二在RIF被切割时提供荧光信号，以及
b.活化剂组装易化子组分F2b，其构成MNAzyme 2a的关键组分，
c.位于RI和F2b结构域之间的底物结构域，其可被MNAzyme 1a或MNAzyme 2a切割，
(ii)组装易化子组分F2a
(iii)仅在有组装易化子F1的情况下能够形成活性MNAzyme 1a结构的部件酶，以举例的方式其可以是测试样品中的靶标核酸；活性MNAzyme 1a，其能将RIF切割成RI和F2b组分，从而产生荧光，消除MNAzyme活性抑制作用，同时产生新的活化剂组装易化子组分F2b。
(iv)仅在部件酶臂与组装易化子组分F2a结合时才能够形成活性MNAzyme 2a复合体的部件酶，其中所述组分F2a邻接着被释放的活化组装易化子组分F2b。随之MNAzyme 2a可以切割更多的RIF，释放出更多的RI和F2b，从而产生MNAzyme 2a自身复制和相伴的荧光信号放大的级联。
在没有F1(例如其可以是靶标核酸)时，MNAzyme 2a的部件酶会形成带有完整RIF的无活性复合体MNAi 2i。在有靶标分析物的情况下，活性MNAzyme 1a会形成，因此将RIF切割，释放出活化剂组装易化子组分F2b，然后后者就自由结合，变成活性MNAzyme 2a的组分。因为MNAzyme 2a可以进一步切割更多的RIF，这就引发了复制/信号放大的级联。
每次MNAzyme 2a切割RIF分子，就会产生形成新MNAzyme 2a所需要的更多组分(活化剂F2b组装易化子)。利用由MNAzyme 2a催化活性产生的产物的组分，MNAzyme级联导致组装成与亲本MNAzyme相同的MNAzyme 2a复合体。因此，MNAzyme切割产物(F2b)能够在自身催化的自身复制系统中，引导新(亲本)MNAzyme分子的组装。
如果将SCUD策略与适体-MNAzyme系统联系起来，SCUD可以被核酸靶标(DNA/RNA)或者其他靶标分析物(蛋白质、小分子等)所引发。因为所述反应仅在有靶标分析物的情况下被引发，这就提供了一种检测和/或鉴定靶标分析物的技术。该方法建立在多组分核酸复合体失活和活化状态之间的转换的基础上。与靶扩增技术(比如聚合酶链式反应或连接酶链式反应)不同，通过SCUD的MNAzyme复制和信号放大不需要蛋白酶来协助其过程。此外，利用几种寡核苷酸组分(比如稳定因子臂组分或组装易化子组分)来控制和调节MNAzyme的催化活性的能力，使得MNAzyme的组装受到微环境中的条件和组分的紧密调节。
实施例5：应用MNAzyme来检测包括小分子(比如腺苷5’三磷酸)在内的非核酸分析物
适体是由很大的随机序列寡核苷酸库，就其以高亲和性和特异性结合靶标分析物的能力体外演化得到的单链DNA或RNA分子。根据其特异结合许多类型的分析物(包括蛋白质、碳水化合物、脂类、核苷酸、完整细胞和病毒)的能力对适体进行了选择。在本实施例中，将适体序列引入部件酶(适体-部件酶)的末端，其构象使得在有活化剂配体的情况下，仅形成活性适体-MNAzyme。实现这一目标有多种途径，包括以下实施例中使用的策略，该策略在图7中进行了阐述。
图7列出了本示例性适体-MNAzyme检测策略中涉及的核酸寡核苷酸，包括
a)标准部件酶；
b)适体-部件酶，它是一端引入了适体的部件酶；
c)组装易化子，其既能结合所述适体-部件酶，也结合使得活性MNAzyme组装的所述部件酶；
d)报告分子底物；以及
e)组装抑制剂寡核苷酸，其与适体-部件酶发生杂交的区域跨越至少适体序列的一部分和部件酶序列底物结合臂的一部分。
在没有活化剂配体的情况下(图7，插图(i))，组装抑制剂寡核苷酸结合到适体-部件酶上，从而阻止它与底物的结合。有活化剂配体的情况下(图7，插图(ii))，活化剂配体能够与适体-部件酶的适体序列发生相互作用，从而阻止组装抑制剂的结合，使得活性适体-MNAzyme得以组装，然后与底物结合并对其进行切割。这样，在有活化剂配体的情况下，仅能形成适体-MNAzyme并产生荧光信号。
利用对小分子ATP进行的检测论证了这一策略。本实施例中使用的长27个核苷酸的适体序列曾被报导是高度特异结合ATP和dATP的(Achenbach，2005，Huizenga and Szostak，1995)。
5.1部件酶寡核苷酸、组装易化子以及抑制性寡核苷酸
在本实施例中，ATP适体序列被连接到部件酶的底物臂上，从而产生适体-部件酶分子(图7)。适体-部件酶和标准部件酶的感应臂被设计成能够结合合成组装易化子，反应中包含该易化子以便当有靶标或调节分析物时，推动MNAzyme的组装。适体-部件酶AtpA2/1和部件酶AtpB3/1的序列如下所示(5’到3’)。以下序列中粗体表示的碱基与组装易化子杂交，带下划线的碱基形成了组装成的MNAzyme的催化核心，斜体表示的碱基与底物杂交。此外，部件酶AtpA2/1中常规字体表示的碱基代表能够结合ATP或dATP的DNA适体序列。
SEQ ID NO：12适体-部件酶A2 AtpA2/1：
CGGTCGAA ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT
SEQ ID NO：13部件酶B3 AtpB3/1：
CCGAGC
组装易化子的序列如下所示(5’到3’)
SEQ ID NO：14组装易化子AtpC/1：
GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT
“组装抑制剂”寡核苷酸的序列如下所示(5’到3’)
SEQ ID NO：15组装抑制剂AtpR/1：CCAGGTACTCACTATT
5.2报告分子底物
通过对双标记核酸报告分子底物的切割来监测适体-MNAzyme的活性。用于本实施例的报告分子底物是SubBi-1-FB，其序列5’到3’如下所示。小写字母的碱基表示RNA，大写字母的碱基表示DNA。带有下划线的碱基指示5’端的6-FAM部分和3’端的BHQ1部分的位置。以490nm(FAM激发波长)激发，于520nm(FAM发射波长)监测由于对SubBi-1-FB在FAM和BHQ1之间的核糖核苷酸的切割所造成的荧光变化。
SEQ ID NO：16 SubBi-1-FB：ACTCACTATaGGAAGAGATG
5.3靶标或调节分析物以及对照分子
用于本实施例的活化剂配体是腺苷5’-三磷酸(ATP)和脱氧腺苷5’-三磷酸(dATP)。鸟苷5’-三磷酸(GTP)和胞嘧啶5’-三磷酸(CTP)用作阴性对照分子。所有分子购自Bioline。无核酸酶水用作无分析物对照。
5.4反应条件
催化活性适体-MNAzyme对报告分子底物的切割导致荧光信号的增加，通过测量这个增加确定活化剂配体的存在。通过加入底物引发反应，所有反应的总体积均为50μL。在注入底物前，所有反应于60℃温育5分钟(以减少二级结构)。反应于47℃在FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)上进行。每3秒钟给各个反应读取荧光读数，共读10分钟。每个反应含有终浓度200nM AtpA2/1、200nM Atp B3/1、200nMAtpC/1、200nM AtpR/1、200nM SubBi-1-FB、25mM MgCl2、50mMTris HCl pH 7.5以及2mM的ATP或者dATP或者GTP或者CTP或者没有分析物(水对照)。
5.5结果：SubBi-1-FB报告分子底物的检测和切割
没有ATP或dATP的情况下，可观察到低水平的荧光，并且不会随时间增加，这表明在没有ATP时，组装抑制剂阻止了活性适体-MNAzyme/底物复合体的组装。而存在ATP或dATP时，荧光信号更高并随时间增加。这说明抑制剂寡核苷酸被dATP和ATP所取代，并且形成了活性适体-MNAzyme。适体-MNAzyme的组装是配体依赖性的。在有GTP或CTP时，可以观察到低水平荧光，且不随时间增加。有GTP或CTP情况下观察到的荧光与没有ATP或dATP时(即无配体的水对照)观察到的荧光类似。本实施例表明，可以将MNAzyme偶联到适体上，通过对靶标分析物高度特异的方法来检测分析物。本实施例进一步表明，可以用组装抑制剂分子来控制适体-MNAzyme的组装，ATP可以作为该系统中的活化剂配体或分子调节剂。
本领域技术人员会认识到这一策略的设计是灵活的。可以将所述适体引入含有部分催化核心序列的两种部件酶的任一端(5’或3’)。这样，组装抑制剂可以结合到适体区域上，或者与底物臂(其结合底物)或感应臂(其结合组装易化子)结合。在前一设计(图7和本实施例)中，抑制剂阻断了与底物的结合，在后面的设计中，抑制剂会阻止组装易化子与适体-部件酶的结合，从而阻止了活性MNAzyme的组装。
现有文献中含有能够检测许多类型分析物的大量适体的序列。所述待分析物包括蛋白质、碳水化合物、脂类、朊、核苷酸、完整细胞和病毒。可以将所有这些类型的待分析物的适体连接到部件酶上以便检测非常多样化的分子。与待分析物结合适体(或者适体-部件酶)以及MNAzyme对报告分子底物进行切割均适合的反应条件(缓冲液、温度、二价阳离子浓度等)可以通过经验测试来确定。
通过去除或添加组装抑制剂可以调整MNAzyme活性。改变寡核苷酸序列、熔解温度和/或浓度可以实现更精细的调节。MNA中的组装抑制剂的杂交受到许多因素的影响，这些因素包括，但不限于盐浓度、阳离子浓度、温度以及添加剂(例如，DMSO)的存在与否。这样，影响杂交的实体就提供了控制MNA复合体的组装和解组装的工具。
可以通过物理操纵，例如通过利用附着部分的物理特性将它作为分子“钩”，以及/或者利用寡核苷酸的内在特性(例如负电荷或序列互补性)来去除组装易化子、组装抑制剂或其他MNA成分。
实施例6：利用具有连接酶活性的DNAzyme和具有切割活性的MNAzyme的分子开关
图8概括了利用两种DNA酶的催化活性的分子开关。第一个反应由MNAzyme介导，其能够将含有寡核苷酸的RNA切割成2’，3’-环化磷酸酯和5’-羟基产物。第二个反应由DNAzyme连接酶介导，其能够将2’，3’-环化磷酸酯和5’-羟基产物连接起来。这类DNAzyme的例子是本领域已知的，包括例如“7Z81”和“7Z48”连接酶(Prior et al，2004)。
在最简单的形式中，寡核苷酸 1/2可以被MNAzyme切割成切割产物寡核苷酸1和寡核苷酸2，从而再次产生2’，3’-环化磷酸酯和5’-羟基产物，它们再参与随后一轮的连接。然后DNAzyme连接酶可以利用切割产物作为连接的底物。DNAzyme可以将第一寡核苷酸产物(寡核苷酸1)连接到第二寡核苷酸产物(寡核苷酸2)上，产生与寡核苷酸1/2序列相同的连接产物。
在复合形式中，MNAzyme可以将几种寡核苷酸，例如四种寡核苷酸切割成带有2’，3’-环化磷酸酯和5’-羟基末端的产物。这些产物可以被一组16个DNAzyme连接酶连接成16个新的单一连接产物(即寡核苷酸1、2、3和4的每种组合)。
如果能达到MNAzyme切割的最低序列要求，其他MNAzyme可以再将16个连接产物寡核苷酸中的一或多个，在寡核苷酸1、2、3和/或4之间的原有连接点之外的位点进行切割。例如，实施例1中的MNAzyme要求底物的切割位点上有嘌呤嘧啶核糖核苷酸。
一组MNAzyme可使用共同的组装易化子，并且/或者MNAzyme可以将来自前面几轮连接反应的连接产物作为自己的组装易化子。这样，寡核苷酸的连接所产生的新信息(输入)数据可以被MNAzyme识别为“读”。然后所述MNAzyme可以切割“写”而产生新的输出产物以及/或者信息。其中MNAzyme可以读出输入连接产物，然后将其切割成不是本来就存在于起始分子库的产物寡核苷酸的系统可以被用来重写或重编码新的输出序列。
在某些实施方案中，DNAzyme进行的连接可以通过例如形成新的组装易化子或其组分来“写”输入数据。MNAzyme可以利用部件酶感应臂通过查询组装易化子中编码的信息来这些数据。然后MNAzyme可以“写”数据，例如新序列(切割产物)，从而产生新的输出数据，后者再被DNAzyme连接酶“读”(通过确定MNAzyme切割产物是否适合作为DNAzyme连接酶的底物)。
这样，这一MNAzyme/DNAzyme连接酶级联可以形成自动机。这类设备能够遵照设定的程序，将一个形式的信息转换为另一形式。这种情况中，所述程序是由MNAzyme和DNAzyme连接酶的底物臂和/或感应臂编码并指导的。
Benenson et al(2001)利用DNA和蛋白质酶(限制性内切酶和连接酶)开发出能够解决计算问题的自动机。级联反应中，所述限制性内切酶将双链DNA切割，蛋白连接酶将切割产物连接起来。所述蛋白酶作为“硬件”，而DNA编码了“软件”。通过选择恰当的DNA软件序列对输入和自动机进行编程。自动机通过限制内切酶切割、杂交和连接循环的级联进行，从而产生可检测的输出分子，其编码了自动机的最终状态，因此也就是计算结果(Benenson et al，2001)。
可以类似于Benenson et al(2001)使用的级联方式来使用MNAzyme/DNAzyme连接酶级联，从而提供能够解决计算问题的设备。与Benenson的设备不同的是，MNAzyme/DNAzyme连接酶级联不需要蛋白酶来得到同样的结果。Benenson的设备是由双链DNA编程的，而MNAzyme/DNAzyme连接酶级联可以由各种序列编码，包括例如，最初输入的寡核苷酸、MNAzyme的底物臂以及/或者感应臂和DNAzyme连接酶的底物臂。
在另一个实施方案中，所述MNAzyme/DNAzyme连接酶级联还可以作为构建分子文库以及/或者提高该文库的多样性的方法，用于对寡核苷酸序列进行“重组”。
在一个实施方案中，DNAzyme连接酶可被用于产生或破坏MNAzyme以及/或者无活性MNAi的组分。作为一个例子，DNA连接酶可以使“活性抑制剂”附着到“组装易化子组分”上，导致MNAi的组装(“关”状态)。可选地，DNAzyme连接酶可以使感应或底物臂附着到部件酶组分上，如图11(ii)和(iv)方面所示，通过促进组装而产生MNAzyme的“开”转换。在另一个实施方案中，DNAzyme连接酶可以附着带有下述部分的标记序列：所述部分使得利用例如一个生物素基团，寡核苷酸能够被选择性地捕获；或者所述部分含有射频磁场无线电，以便协助对杂交的电子遥控。这个方法使得能够对组分分子进行选择性去除，实现酶活性的活化或抑制。例如，MNAi复合体的活性抑制剂可以被选择性地变性，使得转变成活性MNAzyme状态。
在某些实施方案中，由DNAzyme进行的连接可以通过例如产生新的组装易化子或其成分来“写”输入数据。MNAzyme可以利用部件酶感应臂查询组装易化子内编码的信息来“读”数据。然后MNAzyme可以“写”数据，例如新序列(切割产物)，从而产生新的输出数据。后者随之可以被其他DNAzyme连接酶通过确定该MNAzyme切割产物是否适合作为底物来“读”。
实施例7：MNAzyme和MNAi分子开关的一个示例性结构
形成活性MNAzyme所需要的组装易化子可以包含两种或多种组分寡核苷酸。活性抑制剂寡核苷酸的存在或缺失可以促成MNAi结构的形成。本领域技术人员会认识到这类MNAzyme和MNAi有许多设计。活性MNAzyme结构的一些例子如图9(插图A到D，左侧结构)所示。MNAi结构的例子也示于图9(插图A到D，活性MNAzyme右侧的结构)。本实施例展示了图9插图B结构c(MNAzyme)和d(MNAi)的结构。
本实验使用的MNAzyme是由部件酶R05A4/2和5FAC2B5(6)/2(16)构成的，该MNAzyme的设计使之在被称为组装易化子1(FAC2)和组装易化子2(d6p-1)这两种寡核苷酸的指导下组装好后，切割报告分子底物SubBi-2-FB。这个实验还显示了包含活性抑制剂的复合体的形成导致了MNAi复合体的产生。
7.1部件酶寡核苷酸
以下序列中，粗体显示的碱基与靶标核酸(或者组装易化子)序列杂交，带下划线的碱基形成组装好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜体表示的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：17部件酶A RO5A4/2：
ACAACGA
SEQ ID NO：18部件酶B 5FAC2B5(6)/2(16)：
GGCTAGCT
7.2报告分子底物
本实施例中的报告分子底物是序列5’到3’如下所示的SubBi-2-FB。SubBi-2-FB的5’端标记有6-FAM部分，3’端标记有BHQ1部分。以485nm(FAM激发波长)激发，于530nm(FAM发射波长)监测对SubBi-2-FB的切割。小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4  SubBi-2-FB：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
7.3易化子和活性抑制剂寡核苷酸
所用组装易化子的序列5’到3’如下所示。小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。组装易化子2和活性抑制剂共有的序列以粗体显示。
活性抑制剂SubBi-6-TRB的5’端标记了Texas Red部分，3’端标记了BHQ2部分。
SEQ ID NO：19组装易化子2(F2)d6p-1：
SEQ ID NO：20组装易化子1(F1)FAC2：
GACAGAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
SEQ ID NO：21活性抑制剂SubBi-6-TRB：
uTCCTCCCAG
7.4反应组分和对MNAzyme活性的监测
在SmartCycler(Cepheid)上，于25μL总反应体积中对MNAzyme活性进行实时监测。于52℃对反应等温监测30分钟。通过向反应混合液中注入荧光底物SubBi-2-FB(5μl 1μM溶液)来引发反应。所述反应混合液含有1xPCR BufferII(Applied Biosystems)、50mM MgCl2、部件酶RO5A4/2和5FAC2B5(6)/2(16)各200nM、200nM易化子FAC2以及200nM的组装易化子2(d6p-1)或者200nM活性抑制剂(SubBi-6-TRB)。
7.5结果：
在本实施例中，组装易化子由两种寡核苷酸组分构成。图9显示了通过MNA形成的结构，即活性MNAzyme(插图B结构c)和MNAi(插图B结构d)的示意图。该MNAzyme的组装需要两种组装易化子(F1和F2)和两种部件酶。可选地，活性抑制剂(I)可以与部件酶结合并形成MNAi结构。
在这个实验中，将部件酶和两种组装易化子F1和F2孵育导致形成活性MNAzyme，它对报告分子底物进行的切割使得荧光随时间增加了大约500个单位(从400到900单位)。相反，部件酶与一种组装易化子(F1)以及一种活性抑制剂(I)孵育导致形成MNAi结构，该结构不能切割报告分子底物。结果随时间仅观察到荧光有低水平的背景增加，大概有20个单位的基线移动(从390到410单位)。因为含有共有序列，组装易化子(F2)和活性抑制剂(I)结合到部件酶上的相同区域。但是，活性抑制剂上有，而组装易化子F2上没有的额外的抑制序列使得形成了MNAi结构。从活性抑制剂上除去这个额外的抑制序列会导致产生活化剂组装易化子F2。这样，添加或除去该抑制序列提供将活性MNAzyme转换成MNAi或反之亦然的机制。
实施例8：MNAzyme和MNAi分子开关
形成活性MNAzyme所需要的组装易化子可以包含两种或多种组分寡核苷酸。活性抑制剂寡核苷酸的存在或缺失可以促成MNAi结构的形成。本领域技术人员会认识到这类MNAzyme和MNAi复合体有许多设计。活性MNAzyme结构的例子如图9(插图A到D，左侧结构)所示。MNAi结构的例子也示于图9(插图A到D，活性MNAzyme右侧的结构)。本实施例展示了图9所示插图C结构e(MNAzyme)和f(MNAi)的结构。
本实验中产生的MNAzyme由两种部件酶(FACA4/6(22)和5FAC2B5(2)/6(33))以及三种组装易化子组分即易化子1(F1)、易化子2(F2)和易化子3(F3)组装而成。本实验同样显示了包含活性抑制剂(SubBi-2-FB)和易化子1(F1)以及(F3)的复合体的形成可以产生MNAi复合体。
8.1部件酶寡核苷酸
以下序列中，粗体显示的碱基与靶标核酸(或者组装易化子)序列杂交，带下划线的碱基形成组装好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜体表示的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：22部件酶A FACA4/6(22)：
ACAACGA
SEQ ID NO：23部件酶B 5FAC2B5(2)/6(33)：
GGCTAGCT
8.2报告分子底物
本实施例所用报告分子底物是SubBi-6-TRB，其序列5’到3’如下所示。SubBi-6-TRB的5’端标记了Texas Red部分，3’端标记了BHQ2部分。以585nm(Texas Red激发波长)激发，在610nm(Texas Red发射波长)监测对SubBi-6-TRB的切割。小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。
SEQ ID NO：21 SubBi-6-TRB：ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
8.3易化子和活性抑制剂寡核苷酸
所用组装易化子的序列5’到3’如下所示。组装易化子F2和活性抑制剂共有的序列以粗体显示。小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。活性抑制剂SubBi-2-FB的5’端标记了6-FAM部分，3’端标记了BHQ1部分。
SEQ ID NO：24组装易化子F1 STAB：CGCAGTCTGGACGACG
SEQ ID NO：25组装易化子F2 d2p-1：
SEQ ID NO：4活性抑制剂SubBi-2-FB：
uCCCTGGGCA
SEQ ID NO：20组装易化子F3 FAC2：
GACAGAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
8.4反应组分和对MNAzyme活性的监测
在SmartCycler(Cepheid)上，于25μL总反应体积中对MNAzyme活性进行实时监测。于52℃对反应等温监测30分钟。通过向反应混合液中注入荧光底物SubBi-6-FB(5μl 1μM溶液)来引发反应。反应混合液含有1xPCR Buffer II(Applied Biosystems)、50mM MgCl2、部件酶FACA4/6(22)和5FAC2B5(2)/6(33)各200nM、200nM易化子F1STAB、200nM易化子F3 FAC2，以及200nM的组装易化子F2(d2p-1)或者200nM活性抑制剂(SubBi-2-FB)。
8.5结果：
在本实施例中，组装易化子由三种寡核苷酸组分构成。图9显示了通过MNA复合体形成的结构，即活性MNAzyme(插图C结构e)和MNAi(插图C结构f)的示意图。该MNAzyme需要三种组装易化子组分(F1、F2和F3)和两种部件酶来组装成具有催化活性的复合体。可选地，活性抑制剂(I)可以与部件酶结合并形成MNAi结构。
在这个实验中，将部件酶和三种组装易化子组分F1、F2和F3孵育导致形成活性MNAzyme，它对报告分子底物进行的切割使得荧光随时间增加了大约330个单位(从140到470单位)。相反，部件酶与两种组装易化子(F1和F3)以及一种活性抑制剂(I)的共孵育导致形成MNAi结构，该结构不能切割报告分子底物。结果随时间观察到荧光仅有低水平的背景增加，大概有40个单位的基线移动(从80到120单位)。因为含有共有序列，组装易化子组分(F2)和活性抑制剂结合到部件酶上的相同区域。但是，活性抑制剂上有，而组装易化子组分F2上没有的额外的抑制序列使得形成了MNAi结构。从活性抑制剂上除去这个额外的抑制序列会导致产生活化剂组装易化子F2组分。这样，添加或除去该抑制序列提供将活性MNAzyme转换成MNAi或反之亦然的机制。
实施例9：另一种MNAzyme和MNAi分子开关
形成活性MNAzyme所需要的组装易化子可以包含两种或更多组分寡核苷酸。活性抑制剂寡核苷酸的存在或缺失可以促成MNAi结构的形成。本领域技术人员会认识到这类MNAzyme和MNAi复合体有许多设计。活性MNAzyme结构的例子如图9(插图A到D，左侧结构)所示。MNAi结构的例子也示于图9(插图A到D，活性MNAzyme右侧的结构)。本实施例展示了图9所示插图D结构g(MNAzyme)和h(MNAi)的结构。
本实验中的MNAzyme由这样的部件酶构成，它们被设计成在有两种组装易化子组分F1和F2的情况下进行组装，并且能切割报告分子底物SubBi-2-FB。部件酶(4SYNTB6/2(8))之一的感应臂被截短到8个碱基。另一种寡核苷酸，稳定因子臂sA(B6/tag(13))与组装易化子F1杂交从而稳定了MNAzyme复合体，其中F1与部件酶(4SYNTB6/2(8))的截短了的感应臂相邻。所述组装易化子有两种组分F1和F2。
9.1部件酶寡核苷酸
以下序列中，粗体显示的碱基与靶标核酸(或者组装易化子)序列杂交，带下划线的碱基形成组装好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜体表示的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：26部件酶A 4SYNTA5/2(22)：
TACAACGA
SEQ ID NO：27部件酶B 4SYNTB6/2(8)：
GGCTAGC
9.2报告分子底物
本实施例中的报告分子底物是具有如下所示的序列5’到3’的SubBi-2-FB。SubBi-2-FB的5’端标记有6-FAM部分，3’端标记有BHQ1部分。以485nm(FAM激发波长)激发，于530nm(FAM发射波长)监测对SubBi-2-FB的切割。小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4 SubBi-2-FB：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
9.3易化子、活性抑制剂以及稳定因子臂寡核苷酸
所用组装易化子组分的序列5’到3’如下所示。小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。组装易化子1和活性抑制剂共有的序列以粗体显示。
SEQ ID NO：28组装易化子F2(RO5/cA(18))：
AAGGCCAGGACTCGTTTG
SEQ ID NO：29组装易化子F1(r2p-SYNT/cB(25)：
SEQ TD NO：30活性抑制剂(2-SYNT/cB(25))：
uCCCTGGGCA
SEQ ID NO：31稳定因子臂sA(B6/tag(13))：ATTACACCTTCCC
9.4反应组分和对MNAzyme活性的监测
在BMG LabTech FluoStar荧光仪上，于50μl总反应体积中对MNAzyme活性进行实时监测。于40℃对反应等温监测3分钟。通过向反应混合液中注入荧光底物SubBi-2-FB(10μl的1μM溶液)来引发反应。反应混合液含有1xPCR Buffer II(Applied Biosystems)、25mMMgCl2、部件酶4SYNTA5/2(22)和4SYNTB6/2(8)各200nM、200nM稳定因子臂B6/tag(13)、200nM易化子F2 RO5/cA(18)，以及200nM的组装易化子F1(r2p-SYNT/cB(25))或者活性抑制剂(2-SYNT/cB(25))。
9.5结果：
在本实施例中，组装易化子由两种寡核苷酸组分构成。图9显示了通过MNA形成的结构，即活性MNAzyme(插图D结构g)和MNAi(插图D结构h)的示意图。该MNAzyme需要两种组装易化子组分(F1和F2)、两种部件酶以及一种稳定因子臂来组装成具有催化活性的复合体。可选地，活性抑制剂(I)可以与部件酶结合并形成MNAi结构。
在这个实验中，将两种部件酶、两种组装易化子组分F1和F2，以及一种稳定因子臂孵育导致形成活性MNAzyme，它对报告分子底物进行的切割使得荧光随时间增加了大约28,000个单位(从12,000到40,000单位)。相反，部件酶与一种组装易化子(F2)、一种稳定因子臂以及一种活性抑制剂(I)的共孵育导致形成MNAi结构，该结构不能切割报告分子底物。随时间观察到荧光仅有低水平的背景增加，大概有1,500个单位的基线移动(从12,000到13,500单位)。因为含有共有序列，组装易化子组分(F1)和活性抑制剂(I)结合到部件酶和稳定因子臂上的相同区域。但是，活性抑制剂上有，而组装易化子组分F1上没有的额外抑制序列使得形成了MNAi结构。从活性抑制剂上除去这个额外的抑制序列会导致产生活化剂组装易化子F1组分。这样，添加或除去抑制序列提供将活性MNAzyme转换成MNAi或反之亦然的机制。
实施例10：SCUD级联
用于产生MNAzyme复制级联的一个机制利用了SCUD级联策略，其中所述MNAzyme复制级联是设计用来进行靶标分析物检测的。可以将SCUD策略引入到图示的多种设计的级联中，例如图6，其中引入了两种MNA复合体；图10，其中引入了三种MNA复合体；以及图11，其中级联反应中引入了MNA复合体和DNAzyme两者。
SCUD方法依赖于调控从混合液中存在的组分寡核苷酸组装成活性MNAzyme和MNAi的能力。图10图释了SCUD级联的一个示例性方案。在该策略中，在有靶标(T)的情况下形成了起始MNAzyme(Mt)。这个起始MNAzyme切割底物(S1)从而产生形成级联MNAzyme1(Mc1)所需要的活化剂组装易化子组分之一(S1f)。然后MNAzymel切割底物(S2)而产生形成级联MNAzyme 2(Mc2)所必需的其他的活化剂组装易化子组分。然后MNAzyme 2切割底物(S1)由此引发级联反应。
以下实验实施例展示了起始MNAzyme(Mt)在有靶标存在的情况下，将底物(S1)切割成两种片段的能力。实施例进一步显示了起始MNAzyme(Mt)可以将S1底物切割成这样的片段，其中之一(S1f)可以作为活化剂组装易化子组分，与两种其他易化子组分(F1和F2)一起形成能够切割第二种底物(S2)的MNAzyme Mc1。
本实验中，起始MNAzyme Mt由部件酶RO5A5/2-P和RO5B6/2-P组成，它们是设计用来检测人RPLPO基因(RO5靶标)的片段，并切割S1底物SubBi-2h-FB。SubBi-2h-FB的切割片段(S1f)与F1和F2组装易化子组分FAC5和FAC6一起结合到包含部件酶CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6的Mc1级联MNAzyme 1的感应臂上。完全组装好的活性级联MNAzyme 1被设计用于切割底物SubBi-6-TRB。
10.1部件酶寡核苷酸
以下序列中，粗体显示的碱基与靶标核酸(或组装易化子)序列发生杂交，带有下划线的碱基构成组装好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜体显示的碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：51部件酶A RO5A5/2-P：
TACAACGA -P
SEQ ID NO：32部件酶B RO5B6/2-P：
GGCTAGC -P
SEQ ID NO：33部件酶A CasA4(2h)/6：
ACAACGA
SEQ ID NO：34部件酶B CasB5(2h)/6：
GGCTAGCT
10.2报告分子底物
本实施例的报告分子底物S1和S2是SubBi-2h-FB和SubBi-6-TRB，其序列5’到3’如下。SubBi-2h-FB在5’端末端标记了6-FAM部分，3’端内部标记了BHQ1部分。SubBi-6-TRB在5’端末端标记了TexasRed部分，3’端末端标记了BHQ2部分。带下划线的碱基表示荧光团的位置。以485nm(FAM激发波长)激发，于530nm(FAM发射波长)监测对SubBi-2h-FB的切割。以585nm(Texas Red激发波长)激发，于610nm(Texas Red发射波长)监测对SubBi-6-TRB的切割。小写字母表示的碱基代表RNA，大写字母表示的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：35 SubBi-2h-FB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCACACGAGG
SEQ ID NO：21 SubBi-6-TRB：ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
10.3易化子寡核苷酸
本实施例中使用了两种分子作为组装易化子组分来和部件酶CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6的感应臂杂交。F1和F2组装易化子FAC5和FAC6的序列5’到3’如下所示。
SEQ ID NO：36组装易化子F1 FAC5：GCAAGAACACACGATAC
SEQ ID NO：37组装易化子F2 FAC6：TAGAGGTAGGAGTGCG
10.4靶标序列
本实施例的靶标序列是合成寡核苷酸RO5靶标，其序列5’到3’如下所示。这个靶标序列与人RPLPO基因的一部分外显子5序列相同。
SEQ ID NO：38 RO5靶标：
GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
10.5反应组分以及对MNAzyme活性的监测
在SmartCycler(Cepheid)上，于25μL总反应体积中对MNAzyme活性进行实时监测。于50℃对反应等温监测12分钟。通过向反应混合液中注入荧光底物SubBi-2h-FB和SubBi-6-TRB(每种底物各5μl的2.5μM溶液，终浓度均为0.5μM)来引发反应。反应混合液含有1x PCRBuffer II(Applied Biosystems)、25mM MgCl2、部件酶RO5A5/2-P、RO5B6/2-P、CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6各500nM、易化子组分FAC5和FAC6各500nM，以及100nM的RO5靶标或者无靶标(水)对照。
10.6结果：
在有RO5靶标序列的情况下，部件酶RO5A5/2-P和RO5B6/2-P形成了起始MNAzyme Mt，它切割S1底物SubBi-2h-FB，造成FAM荧光增加大约1250个单位(从1200到2450单位)。被切割的S1底物产生S1f易化子片段，然后后者与F1和F2易化子组分FAC5和FAC6，以及部件酶CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6形成Mc1级联MNAzyme 1。该MNAzyme 1然后切割第二S2底物SubBi-6-TRB，使得Texas Red荧光增加大约900个单位(从250到1150单位)。这样，FAM和TexasRed荧光均发生增加表明该MNAzyme级联反应中存在着靶标序列。
没有RO5靶标的情况下，没有观察到FAM的荧光随时间增加，Texas Red的荧光随时间仅有低水平背景增加，基线迁移大约100个单位(从240到340单位)。不存在靶标时，部件酶RO5A5/2-P和RO5B6/2-P不能形成起始MNAzyme Mt，因而S1底物SubBi-2h-FB不被切割，FAM荧光不会增加。缺少切割的S1底物，则没有S1f易化子片段来指导Mc1级联MNAzyme 1的形成。然而未被切割的S1底物SubBi-2h-FB仍可结合到包含易化子FAC5和FAC6，以及部件酶CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6的复合体上，这就产生了不能切割S2底物SubBi-6-TRB的MNAi结构。结果Texas Red的荧光保持低水平。FAM和Texas Red的荧光均没有显著增加表明在这个MNAzyme级联反应中没有靶标序列。
实施例11：靶标检测，其利用起始MNAzyme事件、随后的SCUD反馈级联放大以及DNAzyme连接酶介导的MNAzyme切割读数
用于本实施例的策略如图11所示。该实施例论述了图中该策略(i)到(iv)部分的方面。
(i)靶标核酸(F1)指导形成MNAzyme 1a，所述MNAzyme 1a切割割底物A并产生两种切割产物，产物Aa和第二产物Ab，所述产物Aa是连接反应(ii部分)所需要的组分，所述第二产物Ab作为活化剂组装易化子是(iii)部分所示的方面中所需要的。
(ii)产物Aa的3’端有2’，3’-环磷酸酯，因此适合作为具有连接酶活性的DNAzyme 2a的底物。DNAzyme连接酶2a将(i)部分方面中产生的产物Aa连接到另一种寡核苷酸连接底物B上，从而产生了MNAzyme 4a的新部件酶。
(iii)产物Ab作为活化剂组装易化子，指导部件酶组分形成活性MNAzyme 3a。MNAzyme 3a切割底物A产生两种产物Aa和Ab。然后产物Ab可以作为活化剂组装易化子，其指导产生更多的活性MNAzyme 3a。这一MNAzyme3a系统产生SCUD自主催化自身复制反馈放大级联。该SCUD级联造成Ab的进一步积累，而Ab可以作为MNAzyme 3a的活化剂组装易化子，并在Aa的积累中起作用，所述Aa可以作为DNAzyme 2a的底物。
(iv)Aa和底物B连接所产生的连接产物形成了MNAzyme 4a的新的连接好的部件酶。与易化子F4一起形成MNAzyme 4a，并将底物C在荧光团和淬光剂染料对之间切割，使得荧光增强，指示存在着靶标核酸F1。
本实施例中，(i)、(ii)和(iii)方面在一个试管中于单一温度同时发生。读数检测步骤(iv方面)是在向反应中加入其他试剂后进行的。本实施例中使用的DNAzyme连接酶以前曾被报导通过由2’，3’-环磷酸酯和5’-羟基基团形成2’-5’磷酸二酯键来连接RNA(Silverman et al)。除了需要带有2’，3’-环磷酸酯末端的5’底物，用于本实施例的DNAzyme连接酶还需要位于连接点上的特异序列基序是UA*G(A或G)(其中*代表连接位点)。
11.1 DNAzyme连接酶B
作为DNAzyme连接酶的DNA寡核苷酸序列如下所示。
SEQ ID NO 39：DNAzyme连接酶7Z81-10/10：
CCTCTCGTTGACGGCGGAGTGATTGGGAGGTTAGCTCTAGTGAGTGC
11.2部件酶寡核苷酸
以下序列中，粗体显示的碱基与靶标核酸序列杂交，带下划线的碱基形成组装好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜体表示的碱基与底物杂交。
以下是部件酶的序列，其形成MNAzyme 1a的组分：
SEQ ID NO：40部件酶A miR20A2/1：
CGGTCGAA
SEQ ID NO：41部件酶B miR20B3/1：
CCGAGC
以下序列对应部件酶，其与连接产物/部件酶结合形成MNAzyme4a的组分。
SEQ ID NO：42部件酶B STB5/2(21)：
GGCTAGCT
以下是部件酶的序列，其形成SCUD MNAzyme 3a的组分：
SEQ ID NO：43部件酶A 4SYNTA2/1i-10HP：
CGGTCGAA
SEQ ID NO：44部件酶B 4SYNTB3/1i-12HP：
CCGAGC
11.3 MNAzyme底物A(MNAzyme 1a和3a的底物)
以下序列中，小写字母表示的碱基代表RNA，大写字母表示的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：45 preSub5：
CTGTAGCACTCACTAuaGGAAGAGATG
11.4 DNAzyme连接酶底物B
以下序列中，小写字母表示的碱基代表RNA，大写字母表示的碱基代表DNA。3’DNAzyme连接酶底物被合成为具有以下序列和5’羟基团：
SEQ ID NO：46 preSub3：
gGAACAACGAGAGGAAACCTT
11.5 MNAzyme底物C(MNAzyme 4a的荧光报告分子底物)
用于本实施例的报告分子底物是SubBi-2。本实施例中，SubBi-2的5’端标记了6-FAM部分，3’端标记了BHQ1部分，被命名为SubBi-2-FB。以490nm(FAM激发波长)激发，于520nm(FAM发射波长)监测对SubBi-2-FB的切割。SubBi-2-FB的序列5’到3’如下所示；小写字母表示的碱基代表RNA，大写字母表示的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4 SubBi-2-FB：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
11.6 MNAzyme 1a的靶标序列F1
MNAzyme 1a所识别的靶标序列是与人microRNA miR-20 RNA序列同源的合成DNA寡核苷酸。其具有以下序列：
SEQ ID NO：47 D-20靶标(MNAzyme 1a靶标)：
TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
11.7 MNAzyme 4a的组装易化子
形成MNAzyme 4a所需要的组装易化子F4是具有以下序列的合成DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：48 MNAzyme 4a的组装易化子F4：
CGACGACCACTCCGACGACAGTCCTATAGTGAGTGCTACAG
11.8反应条件
所有反应在一个SmartCap试管(Cepheid)中如下所述进行。MNAzyme 1a切割、DNAzyme 2a连接和SCUD MNAzyme 3a级联放大(分别是(i)、(ii)和(iii)方面)在一个15μl的起始反应体积中，在热循环仪(Cepheid)上，于40℃经等温温育2小时。反应含有200nM preSub5，100nM preSub3、100nM DNAzyme连接酶7Z81-10/10、MNAzyme 1a的部件酶(50nM miR20A2/1和300nMmiR20B3/1)、MNAzyme 3a的部件酶20nM(部件酶A 4SYNTA2/1i-10HP和部件酶B 4SYNTB3/1i-12HP)、150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(25℃ pH9.0)和50mM MgCl2，以及100nM D-20靶标、或者100 pM D-20靶标、或者100 fM D-20靶标或者没有靶标(只有dH2O的对照)。
对照反应缺少SCUD MNAzyme 3a部件酶组分，因此只发生(i)、(ii)和(iv)方面。这些反应含有200nM preSub5、100nM preSub3、100nMDNAzyme连接酶7Z81-10/10、MNAzyme 1a的部件酶(50nMmiR20A2/1和300nM miR20B3/1)、150mM NaCl、2mM KCl、50mMTris HCl(25℃ pH9.0)和50mM MgCl2，以及100nM D-20靶标、或者100pM D-20靶标、或者100fM D-20靶或者没有靶标(只有dH2O的对照)。
将SCUD和对照反应进行温育后，向SmartCap System试管中加入10μl等分检测试剂得到25μl总反应体积中终浓度如下：300nM的部件酶STB5/2(21)、100nM的MNAzyme 4a的组装易化子F4、150mMNaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(25℃ pH 9.0)、50mM MgCl2、以及100nM的底物SubBi-2-FB。反应由55℃到80℃进行了90个热循环(55℃80秒，80℃20秒)，并在(Cepheid)上监测荧光。
随时间监测SCUD和对照反应中，由于切割MNAzyme底物C(SubBi-2-FB)导致的荧光增加。荧光的阈值设置为100个单位的荧光，测量每个反应达到阈值水平的荧光所需要的时间。
11.9结果
最初的等温阶段(对于对照反应，包括(i)和(ii)方面；对于包括SCUD放大级联的反应，包括(i)、(ii)和(iii)方面)后，在热循环阶段((iv)方面)测量荧光值。在含有SCUD级联组分和100nM靶标的反应中，荧光在一个循环内达到阈值，反应在10个循环时达到平台期(表4)。在含有SCUD级联组分和100pM靶标的反应中，荧光在第19个循环达到阈值，80个循环后仍未达到平台期。在含有SCUD级联组分和100fM靶标的反应中，荧光在第18个循环达到阈值，80个循环后仍未达到平台期。
相反，含有SCUD级联组分，但没有靶标的反应，在80个热循环后未能达到阈值。这样，达到阈值荧光表明这些反应中存在着靶标核酸。
表4.达到阈值荧光的时间
对照反应缺少SCUD级联组分，但含有100nM的靶标，则在对照反应中，一个循环内达到阈值荧光，34个循环达到平台(表4)。在含有100pM靶标的对照反应中，59个循环达到阈值荧光，80个循环后反应仍未达到平台。在含有100fM靶标的对照反应中，80个循环后仍未达到阈值荧光。类似的，缺少靶标的对照反应在80个循环后未能达到阈值。这样，达到荧光阈值表明这些反应存在着靶标核酸。以上观察与含有(i)、(ii)、(iii)和(iv)方面所有组分的反应的酶扩增步骤是一致的(图11)。首先，MNAzyme 1a在有F1特异靶标(D-20)的情况下，切割底物A产生两种片段(Aa和Ab)((i)方面)。Aa片段是具有2’-3’环磷酸酯末端的5’片段(CTGTAGCACTCACTAua)(SEQ ID NO：49)。第二，Ab产物作为活化剂组装易化子组分，指导活性MNAzyme 3a的形成。MNAzyme 3a将底物A切割产生两种产物Aa和Ab。然后产物Aa作为易化子指导形成更多活性MNAzyme 3a。这样MNAzyme 3a系统产生SCUD自主催化自身复制反馈放大级联((iii)方面)。这个SCUD级联还造成Aa的进一步积累，而Aa可以作为DNAzyme 2a的底物。第三，5’片段Aa连接到反应混合液中存在的第二个连接酶底物B上，从而形成新的寡核苷酸(连接产物Aa/B)，其序列为CTGTAGCACTCACTAuagGAACAACGAGAGGAAACCTT(SEQ IDNO：50)(其中大写字母表示DNA碱基，小写字母表示RNA碱基)((ii)方面)。这个连接产物随之作为MNAzyme 4a的部件酶组分。最后，这个新产生的部件酶与第二个部件酶STB 5/2(21))以及F4组装易化子结合产生MNAzyme 4a((iv)方面)。然后MNAzyme 4a切割MNAzyme底物C(SubBi-2-FB)使得荧光团与淬光剂染料对分离，导致荧光增加。
在仅含有用于(i)、(ii)和(iv)方面的组分的对照反应中(图11)，以上观察与下述事件一致。首先，MNAzyme 1a在有F1特异靶标(D-20)的情况下，将MNAzyme底物A切割成两种片段(Aa和Ab)((i)方面)。Aa片段是具有2’-3’环磷酸酯末端的5’片段(CTGTAGCACTCACTAua)(SEQ ID NO：49)。5’片段Aa连接到反应混合液中存在的第二连接酶底物B上，从而形成新的寡核苷酸(连接产物Aa/B)((ii)方面)。这个连接产物随之作为MNAzyme 4a的部件酶组分。最后，这个新产生的部件酶与第二个部件酶STB 5/2(21))以及F4组装易化子结合产生MNAzyme 4a((iv)方面)。然后MNAzyme 4a切割MNAzyme底物C(SubBi-2-FB)使得荧光团与淬灭剂染料对分离，导致荧光增加。
缺乏靶标的反应表明，在含有或没有SCUD MNAzyme组分的反应中，荧光信号的发生依赖于靶标核酸的存在。在含有SCUDMNAzyme组分，但缺少靶标的反应中，不会形成易化子片段Ab，因此完整的底物A与MNAzyme 3a的部件酶结合，形成MNAi复合体。图9显示SCUD MNA复合体所形成的结构，即活性MNAzyme 3a(插图A中的结构a)和MNAi(插图A中的结构b)的示意图。MNAzyme需要组装易化子(图9插图A结构a中的F1)；或者活化剂组装易化子(图11(iii)方面中的Ab)，它们可以由切割底物而产生。完整底物可以结合到MNAi结构上，作为如图9插图A结构b所示的活性抑制剂(I)。用于本实验产生MNAzyme 3a的部件酶有着这样的感应臂，其在两种部件酶的末端均有自身互补区域。组装易化子结合在互补区域之间的区域上(图9插图A结构a和图11(iii)MNAzyme 3a)。
比较含有或缺少SCUD MNAzyme组分的反应的检测极限，表明SCUD组分的存在造成信号的放大，从而可以检测到少量的靶标。缺少SCUD MNAzyme 3a部件酶组分的反应，其检测限度是1x109分子(100pM的起始浓度)。相比之下，含有SCUD组分的反应能够检测1x106分子(100fM的起始浓度)。此外，对于1x109分子，在含有SCUD组分的反应中，19个循环后能够检测到阈值以上的信号；与之相比，缺少MNAzyme 3a的SCUD部件酶组分的反应需要59个循环。这样，SCUD组分(MNAzyme 3a的部件酶)联合起始MNAzyme(1a)能够产生活化剂组装易化子组分Ab，从而使检测时间和检测极限均被降低。这个机制依赖于这样的反馈，即每个SCUD MNAzyme 3a产生更多MNAzyme 3a所需的更多易化子，从而提供了信号放大的机制(图11(iii)方面)。这种SCUD信号放大方法允许信号放大借助这样的机制，所述机制完全依赖于核酸酶类而非在其他核酸靶标扩增方法(比如PCR)中使用的蛋白质酶类的催化活性。此外，SCUD放大在试剂于40℃温育时，等温地发生在实验的第一阶段。总之，SCUD能够在等温状态下，自主催化自身复制，导致信号放大。SCUD在不需要蛋白质酶类的方式中，使灵敏度和检测速度提高。
实施例12：利用MNA复合体的全加器
MNA复合体，包括MNAzyme可以被利用于开发分子全加器。图12展示了关于如何在MNAzyme的基础上构建全加器的一个示例性设计方案。
按照以下表5，全加器在三种通道(A、B、C)接收输入，然后在输入的基础上在两种通道(X，Y)产生输出。
输入A 输入B 输入C 输出X 输出Y
开 开
开 开
开 开
开 开 开
开 开 开
开 开 开
开 开 开 开 开
为了清楚起见，缺失(或“关”)信号用表中的空格表示。总之，在有正好一种或者全部三种输入的情况下，输出X是开，在有两种或三种输入的情况下，输出Y是开。虽然全加器通常是采用电信号作为输入和输出以电路逻辑工作的，该系统可以利用生物过程来执行，其中输入以可检测性事件表示，输出以可检测事件或可检测效果来表示。
正如可以从表中看出的，无效的情形(没有输入)之外，输入有7种可能的组合。其中三种情形是恰好有一种输入(以逻辑与非与非(NANDNAND)表示)，三种是有两种输入(以逻辑与(AND)表示)，一种是存在全部三种输入(以逻辑与与(ANDAND)表示)。
在图12示意的一个系统中，这七种逻辑门被设计成在单个试管中使用，加入试管的任何输入组合均藉此产生预期的结果(例如，荧光)。这些门都是在加入反应容器前各自构建的。图12中，在把门汇集起来之前，黑色的寡核苷酸已经预先复合体化，包含实际的门。蓝色和绿色的底物代表附着了不同荧光团的底物，包含两种输出信号，FAC(‘易化子’)分子构成输入。除了报告分子和感应臂均与相同的底物、FAC或C寡核苷酸结合的情况，每个门的部件酶各自包含独特的序列。在这些情形中，相同的部件酶可以用于构建两种单独的门，比如图12所示与门2和3的B部件酶，与非与非门2和3的B部件酶，以及与非与非门1和与与门的B部件酶。FAC1和FAC2寡核苷酸作为组装易化子，而FAC3作为臂稳定剂，但是在这个方案中，所有FAC寡核苷酸均用于同样的目的，即对逻辑门进行活化/失活。‘C’寡核苷酸(C1、C2、C3)与其相对应的FAC寡核苷酸互补，并且已经与部件酶做了预先复合体化。当加入反应容器时，FAC通过分枝迁移过程脱下它们的互补C寡核苷酸，使含有互补C寡核苷酸的门失活。为了产生游离序列以便在此引发分枝迁移，将C寡核苷酸及其对应FAC寡核苷酸进行延伸就使这个过程可行了。
就这个设计而言，加入任何一种并且只有一种FAC就会提供第一种荧光色彩(在本实施例中，如图12所示的“蓝色”荧光)，任何两种FAC的组合会产生第二种荧光色彩(图12的“绿色”荧光)，将所有三种FAC引入反应容器时，两种荧光色彩都会产生(图12的“蓝色”和“绿色”)。
参考图12提供了以下解释。如果，例如没有FAC分子的情况下，因为每个复合体具有活性所需要的组分不是都存在，所有复合体都将保持失活状态。就没有荧光。
例如，如果输入只有FAC1
●当FAC1与预复合的部件酶、C2和C3寡核苷酸以及底物结合时，FAC1活化图12中的第一个与非与非门，产生蓝色荧光。FAC1还脱去第二和第三与非与非门的C1寡核苷酸，它们任何情况都是失活的因为没有FAC2和FAC3来形成活性的MNAzyme。
●当只有FAC1时，与与和与门都没有活性，因为它们的活化需要其他FAC分子。
如果，例如FAC1和FAC2是输入，就会发生以下情形：
●因为形成活性MNAzyme所需的两种寡核苷酸都存在，图12的第三与门就有活性，产生绿色荧光。
●图12的其他两种与门因为还需要FAC3，所以不会被活化。
●与与门没有活性，因为所需的FAC分子中只存在两种。
●FAC1和FAC2对于图12中的第一和第二与非与非门复合体分别都是存在的。但是FAC1会脱去其在图12中第二与非与非门的互补C1寡核苷酸，所以没有活性。FAC2会脱去其在图12中第一与非与非门的互补C2寡核苷酸，所有没有活性。第三种与非与非门没有活性，因为它还需要FAC3(而且因为C1和C2还会分别被FAC1和FAC2剥落掉)。
●因此，所有门都没有蓝色荧光。
●只有相关的与门提供绿色荧光。
如果，例如所有三种FAC寡核苷酸都在
●与门和与与门均被活化，分别产生绿色和蓝色荧光。
●因为“C”寡核苷酸会被其各自的FAC寡核苷酸剥落，与非与非门不会被活化。
本领域技术人员会认识到，这样的方案可以类似的方式应用于FAC寡核苷酸或寡核苷酸的任何其他组合。
本领域技术人员明白，来自一个全加器的输出可以作为另一个全加器的输入。
参考文献
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PCT国际公开号WO 99/45146
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<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>22
caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag aggcgtgat                   39
<210>23
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>23
ctgggaggaa ggctagctct gtccgaggaa accttcgtcg tccagactgc g     51
<210>24
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>24
cgcagtctgg acgacg                                            16
<210>25
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子：合成寡核苷酸的描述
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>25
aaggtttcct cg                                                12
<210>26
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>26
caaacgagtc ctggccttcg agtacaacga gaggaaacct t                  41
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>27
tgcccaggga ggctagcgaa acctt                                    25
<210>28
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>28
aaggccagga ctcgtttg                                            18
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子：合成寡核苷酸的描述
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>29
gggaaggtgt aataaggttt cctcg                                    25
<210>30
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子：合成寡核苷酸的描述
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>30
gggaaggtgt aataaggttt cctcguccct gggca                     35
<210>31
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>31
attacacctt ccc                                             13
<210>32
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(38)
<223>磷酸化胞嘧啶
<400>32
tgcccaggga ggctagcgtg gagacggatt acaccttc                  38
<210>33
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>33
gtatcgtgtg ttcttgccct cgtgcccaca acgagaggcg tgat           44
<210>34
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>34
ctgggaggaa ggctagctag ggacgcactc ctacctcta                 39
<210>35
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子：合成寡核苷酸的描述
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>35
aaggtttcct cguccctggg cacacgagg                                      29
<210>36
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>36
gcaagaacac acgatac                                                   17
<210>37
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>37
tagaggtagg agtgcg                                                    16
<210>38
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>38
gaaggtgtaa tccgtctcca cagacaaggc caggactcgt ttg                      43
<210>39
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>39
cctctcgttg acggcggagt gattgggagg ttagctctag tgagtgc    47
<210>40
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>40
tacctgcact acggtcgaaa tagtgagt                         28
<210>41
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>41
catctcttct ccgagctaag cacttta                          27
<210>42
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>42
tgcccaggga ggctagctct gtcgtcggag tggtcgtcg             39
<210>43
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>43
ggatgggcac taacgtgccc atcccatctc cggtcgaaat agtgagt    47
<210>44
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>44
catctcttct ccgagcttcc catctcacga cgataacgtc gtgagatg    48
<210>45
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子：合成寡核苷酸的描述
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>45
ctgtagcact cactauagga agagatg                           27
<210>46
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子：合成寡核苷酸的描述
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>46
ggaacaacga gaggaaacctt                                  21
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>47
taaagtgctt atagtgcagg ta                                22
<210>48
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>48
cgacgaccac tccgacgaca gtcctatagt gagtgctaca g           41
<210>49
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子：合成寡核苷酸的描述
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>49
ctgtagcact cactaua                                      17
<210>50
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子：合成寡核苷酸的描述
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<400>50
ctgtagcact cactauagga acaacgagag gaaacctt               38
<210>51
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：合成寡核苷酸的描述
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(41)
<223>磷酸化胸腺嘧啶
<400>51
caaacgagtc ctggccttgt cttacaacga gaggaaacct t          41

Claims (18)

1.分子开关，其包含至少一种寡核苷酸部件酶和至少一种另外的寡核苷酸组分，其中所述部件酶包含催化核心部分、感应臂部分和底物臂部分中的至少一种，所述另外的寡核苷酸组分选自组装易化子寡核苷酸、底物寡核苷酸、活性抑制剂和组装抑制剂、或其任意组合，其中所述分子开关能形成多组分核酸(MNA)复合体，并且其中所述开关包含解组装的复合体、部分组装的复合体、或完全组装的无催化活性MNA复合体。 
2.如权利要求1所述的开关，其中所述开关包含MNAi，所述MNAi包含活性抑制剂寡核苷酸，所述活性抑制剂寡核苷酸含有与MNAi的至少一种感应臂杂交的组装易化子结构域和与MNAi不互补的活性抑制剂结构域。 
3.如权利要求1所述的开关，其中所述活性抑制剂包含核苷酸序列，所述核苷酸序列含有能与至少一种感应臂部分杂交的组装易化子结构域和与MNA复合体基本上不互补的活性抑制剂结构域。 
4.如权利要求1所述的开关，其中所述部件酶感应臂、所述部件酶底物臂、所述组装易化子寡核苷酸和所述底物寡核苷酸中的一种或多种包含至少两种分子。 
5.如权利要求1所述的开关，其中所述部件酶感应臂、所述部件酶底物臂、所述组装易化子寡核苷酸、所述底物寡核苷酸、所述活性抑制剂或组装抑制剂中的一种或多种包含至少一种自身互补区。 
6.如权利要求1所述的开关，其中所述部件酶感应臂、所述部件酶底物臂、所述组装易化子寡核苷酸或所述底物寡核苷酸中的一种或多种还包含至少一种适体和至少一种组装抑制剂。 
7.如权利要求2所述的开关，其中所述活性抑制剂还包含报告分子结构域或底物结构域中的至少一种。 
8.如权利要求1所述的开关，还包含至少一种稳定因子臂。 
9.如权利要求1至8中任一项所述的开关，其中所述开关的至少一种组分包含核酸。 
10.如权利要求1所述的开关，其中所述开关的至少一种组分还可包含至少一种纳米颗粒、微粒、或其组合。 
11.MNAi组合物，其包含至少两种或多种寡核苷酸组分和活性抑制剂，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在所述活性抑制剂存在的情况下能自组装，其中所述至少第一和所述第二寡核苷酸组分各自包含底物臂部分、催化核心部分和感应臂部分；其中当自组装时，所述第一和第二寡核苷酸组分的所述感应臂部分作为感应臂，所述第一和第二寡核苷酸组分的所述底物臂部分作为底物臂，所述第一和第二寡核苷酸组分的所述催化核心部分形成非功能的催化核心； 
其中所述活性抑制剂包含活化剂组装易化子结构域和活性抑制剂结构域，并且所述活化剂组装易化子结构域与至少一种感应臂杂交，所述活性抑制剂结构域包含与所述两种或多种寡核苷酸组分中的至少一种不互补的核苷酸序列；并且 
其中当自组装时，至少一种感应臂与所述活性抑制剂相互作用，且所述第一和第二寡核苷酸组分保持接近使它们各自的催化核心部分结合以形成非功能的催化核心。 
12.如权利要求11所述的MNAi组合物，其还包含至少一种组装易化子。 
13.如权利要求11所述的MNAi组合物，其中所述活性抑制剂包含报告分子结构域、底物结构域中的至少一种，或其任意组合。 
14.如权利要求11所述的MNAi组合物，其中所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种位于所述活性抑制剂的不同结构域。 
15.如权利要求13或14所述的MNAi组合物，其中所述活性抑制剂结构域、所述活化剂组装易化子结构域和所述报告分子结构域中的至少两种由不稳定的连接子或可切割的底物连接。 
16.如权利要求11所述的MNAi组合物，其中所述活性抑制剂是底物。 
17.如权利要求11所述的MNAi组合物，其中所述活性抑制剂包含与所述两种或多种寡核苷酸组分中的至少一种不互补的核苷酸序列。 
18.如权利要求11所述的MNAi组合物，其中所述复合体的至少一种组分包含至少一种适体或其部分，其中所述适体或其部分结合选自如下的配体：核酸、蛋白、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐或朊。 
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