KR20090098960A - 분자 스위치 및 이의 이용 방법 - Google Patents

분자 스위치 및 이의 이용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090098960A
KR20090098960A KR1020097009384A KR20097009384A KR20090098960A KR 20090098960 A KR20090098960 A KR 20090098960A KR 1020097009384 A KR1020097009384 A KR 1020097009384A KR 20097009384 A KR20097009384 A KR 20097009384A KR 20090098960 A KR20090098960 A KR 20090098960A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mnazyme
assembly
substrate
inhibitor
domain
Prior art date
Application number
KR1020097009384A
Other languages
English (en)
Inventor
앨리슨 베일리언 토드
엘리자 모카니
도날드 존 버켓
트램 비치 도안
크리스토퍼 로날드 레이드
Original Assignee
존슨 앤드 존슨 리서치 피티와이 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 존슨 앤드 존슨 리서치 피티와이 리미티드 filed Critical 존슨 앤드 존슨 리서치 피티와이 리미티드
Publication of KR20090098960A publication Critical patent/KR20090098960A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/337—Ribozyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/501—Ligase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/125—Sandwich assay format
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
    • C12Q2565/1015—Interaction between at least two labels labels being on the same oligonucleotide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 다성분 핵산(Multi-component Nucleic Acid; MNA) 복합체의 촉매 활성을 조작할 수 있는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은, 이와 같은 조성물을 사용하는 방법과, 자가 촉매성 자가 복제 캐스케이드 및 기타 반복 경로의 분자 센서, 분자 스위치 및/또는 조정자 또는 촉진자를 생성하는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 활성 및 불활성 다성분 핵산 복합체가 자가 조립될 수 있도록 만드는 조성물과, 이러한 조성물을 제조하는 방법, 그리고 이 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

분자 스위치 및 이의 이용 방법{MOLECULAR SWITCHES AND METHODS FOR THEIR USE}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 본 명세서에 그 전체 내용이 참고 인용되어 있는 2006년 10월 6일자로 출원된 미국 가 명세서 특허 출원 제60/828,451호의 우선권 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 다성분 핵산(Multi-component Nucleic Acid; MNA) 복합체의 촉매 활성의 조작을 허용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 조성물을 이용하는 방법 및 자가 촉매성(autocatalytic) 자가 복제 캐스케이드 및 기타 반복 경로의 분자 센서, 분자 스위치 및/또는 조정자(modulator) 또는 증식자(propagator)를 제조하는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 활성 및 불활성 다성분 핵산 복합체의 자가 조립을 허용하는 조성물, 이러한 조성물을 제조하는 방법, 그리고 이 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다.
핵산의 진화론상 최적화된 기능 이외에도, 핵산의 색다른 물리적 및 기능적 특성은 다수의 신규 생체 분자 디바이스 및 방법에 대한 가능성을 제공한다. 디자이너 핵산(designer nucleic acid)은, 치료적 실체, 바이오센서, 나노 규모의 디바 이스 및 분자 전산 도구로서 여겨지고 있다. 그 방법은 DNA 자가 조립, 전기 전도성, 정보 요소, 증폭, 스위칭(switching), 분자 검출 및 촉매 활성의 특징을 이용하고 있다. 또한, DNA가 단단하고, 안정적이며 그리고 열 안정성을 가지므로, 그것은 기계 또는 전산 디바이스의 분자 조작에 이상적인 물질을 제공한다.
단일 가닥 핵산 예를 들어, DNA 및 RNA는, 매우 특이적인 수용체(앱타머) 및 촉매(리보자임 및 DNA자임)으로서 작용할 수 있는 복잡한 3차원 구조로 폴딩(folding)될 수 있는 능력을 갖는다. 또한, 혼성화(hybridization)를 위한 핵산 가닥간 상보성은 표적 검출(예를 들어, 마이크로어레이 분석(microarray analysis), 노던 블럿팅(Northern blotting) 또는 서던 블럿팅(Southern blotting)), 및/또는 표적 증폭(예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응)을 허용하는 광범위한 기술에 대한 기초를 형성한다. 또한, 혼성화는 핵산의 나노 규모 구성 및 DNA 기초한 전산 기법에 대한 기초를 제공한다.
자가 복제는 개체가 그 자신을 복제(복사)할 수 있는 과정이다. 이와 같은 과정에서, 각 반응의 생성물은 구성 성분으로부터 유래한 개체의 새로운 복사체(레플리콘)의 형성을 유도한다. 핵산 서열의 자가 복제를 위한 광범위한 기술이 개발되었다.
표적 핵산 서열의 시험관내 복제(표적 증폭) 방법들은 해당 업계에 널리 공지되어 있다. 이들 방법 중 다수는, 합성을 유도하는 주형으로서 표적을 사용하는, DNA 중합 효소 또는 RNA 중합 효소에 의해 연장되어 새로운 표적 복사체(앰플리콘)를 생성할 수 있으며, 표적 DNA 또는 RNA와 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴 클레오티드 프라이머를 필요로 한다. 이러한 기술[Schweitzer and Kingsmore, 2001 참고]은, 중합 효소 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭, 회전 순환 증폭(rolling circle amplification), 그리고 루프-매개된 등온 증폭, 전사-매개된 증폭, 자가 유지된 서열 복제(self-sustained sequence replication) 및 핵산 서열 복제 기초한 증폭을 포함한다. 리가제 연쇄 반응("LCR: ligase chain reaction")으로도 알려진 대안적인 방법은, 핵산 표적을 증폭시키기 위해 단백질 리가제를 사용한다. 이 반응은, 각각의 라운드로부터 유래한 결찰 생성물이 표적의 새로운 복사체의 결찰을 유도하는 주형으로서 사용될 수 있는 능력에 의존한다[Barany, 1991].
상기의 것들과 같은 표적 증폭 기술들은, 연구 및/또는 임상 진단에 널리 사용되고 있다. 그러나, 이들 기술의 성능에도 불구하고, 각각은 고유한 단점을 갖는다. 이들은 모두 단백질 효소(예를 들어, DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 역 전사 효소 및/또는 리가제)를 사용해야 한다는 점이다. 그 단백질 효소의 포함은 시약 제조의 복잡성 및 비용을 증가시키고 그 시약을 함유하고 있는 키트의 수명을 감소시킨다. 기타 관련된 기술상 문제점은 잘못된 양성 신호 및/또는 프라이머 서열(프라이머-이량체)의 복제에 의해 유발된 배경 신호 또는 표적-독립성 결찰에 의해 유발된 배경을 발하는 이전 반응으로부터 유래한 레플리콘(표적 앰플리콘)에 의한 오염 포함한다.
지난 20년 동안, 효소 또는 촉매 활성을 가지는 다양한 핵산 분자가 발견되어 왔다. RNA 효소("리보자임")는 천연 생성되지만, 표적 RNA 기질을 특이적으로 인지하고 이를 변형하도록 조작될 수 있다[Haseloff and Gerlach, 1988]. 시험관내 진화 기술은 종종 "DNA 효소" 또는 "DNA자임"이라고 명명되기도 하는 데옥시리보핵산을 비롯한 다양한 보다 큰 촉매성 핵산의 발견 및 개발을 촉진하게 되었다[Emilsson and Breaker, 2002]. 시험관내 진화된 DNA자임 및/또는 리보자임 즉, 다양한 반응 예를 들어, 핵산의 절단 반응[Carmi et al., 1996; Raillard and Joyce, 1996; Breaker, 1997; Santoro and Joyce, 1998], 핵산의 결찰 반응[Cuenoud and Szostak, 1995, Prior et al., 2004], 포르피린 금속화 반응[Li and Sen, 1996], 및 탄소-탄소 결합[Tarasow et al., 1997], 에스테르 결합[Illangasekare et al., 1995] 또는 아미드 결합[Lohse and Szostak, 1996]의 형성 반응을 비롯한 광범위한 반응을 촉매화할 수 있는 능력 갖는 DNA자임 및/또는 리보자임이 발견되었다.
특히, DNA자임 및 리보자임은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 형성을 통하여 혼성화한 이후에 개별 핵산 서열을 특이적으로 절단하는 것을 특징으로 하였다. DNA자임은 RNA 분자(Breaker and Joyce, 1994; Santoro and Joyce, 1997) 또는 DNA 분자(Carmi et al., 1996) 중 어느 하나를 절단할 수 있다. 리보자임은 또한 RNA 표적 서열(Haseloff and Gerlach, 1988) 및 DNA 표적 서열(Raillard and Joyce, 1996)을 둘 다 절단할 수도 있다. 다수의 핵산 효소의 촉매성 절단 비율은 2가 금속 이온 예를 들어, Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, 및 Pb2+의 존재 및 농도에 따라 달라진다(Santoro and Joyce, 1998; Brown et al., 2003).
"10:23" 및 "8:17" DNA자임은 특이적 RNA 포스포디에스테르 결합에서 핵산 기질을 절단하여, 2',3'-시클릭 포스페이트 기 및 5'-하이드록실 기를 가지는 반응 생성물을 생성할 수 있다[Santoro and Joyce, 1997; Emilsson and Breaker, 2002]. 2',3'-시클릭 포스페이트 및 5'-하이드록실 생성물을 결찰시킬 수 있는 데옥시리보자임(DNA자임)의 예로서는, "7Z81" 리가제 및 "7Z48" 리가제를 포함한다[상동, 2004].
해머헤드 리보자임(hammerhead ribozyme), 10:23 DNA자임 및 8:17 DNA자임, 그리고 "7Z81" 리가제 및 "7Z48" 리가제를 비롯한 몇몇 촉매성 핵산은 다수의 도메인을 지닌 유사한 기본 구조를 가진다. 이러한 핵산 효소는, 기질을 특이적으로 인지하고 그 기질로 혼성화하는 2개의 비-보존적 기질-결합 도메인("아암(arm)")이 측접되어 있는 보존적 촉매 도메인(촉매 코어)을 갖는다. 이러한 핵산 효소가 진정한 다수의 턴오버 효소(turnover enzyme)로서 작용을 할 수 있는 경우, 각각의 효소는 단지 하나의 분자 즉, 그 효소가 촉매적으로 변형시킬 수 있는 기질을 인지하는 능력을 가진다.
촉매성 핵산은 촉매 코어를 형성하는 부위에서 일어나는 임의의 변형만을 허용하는 것으로 나타났다[Perreault et al., 1990; Perreault et al., 1991; Zaborowska et al., 2002; Cruz et al., 2004; Silverman, 2004]. 반응 조건의 엄중도에 따라, 어느 정도의 미스매치가 기질 아암 내에서 허용될 수 있다. 그러나, 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 대한 요건은 촉매성 핵산을 사용하여 밀접하게 관련된 서열의 구별을 용이하게 하는 프로토콜의 개발을 가능하도록 하기 위해서 충분히 엄격하다[Cairns et al., 2000][WO 99/50452].
"앱타머"는 고 차원적 구조 예를 들어, 3-D 결합 도메인 또는 포켓으로 인하여, 고도의 친화성 및 특이성으로 하나 이상의 리간드를 인지하는 능력을 갖는 DNA, RNA 또는 펩티드 서열이다. 수 많은 앱타머는, 예를 들어 핵산, 단백질, 프리온, 소형 유기 화합물 및/또는 전체 유기체를 비롯한 리간드에 결합하는 능력을 가지도록 시험관내에서 진화되었다. "앱타자임(aptazyme)"은 앱타머 서열과 촉매성 핵산 서열(리보자임 또는 DNA자임)을 둘 다 포함하는 서열을 가진다. 리간드에 대한 앱타머의 결합은 리보자임이나 DNA자임을 활성화하는 앱타자임의 형태 변화를 유도한다.
산도(Sando)와 그의 동료들(2003)은, 표적 감지 서열을 구성하는 다수의 도메인, DNA자임 도메인 및 인접 DNA자임에 대한 이중 표지화된 DNA/RNA 키메라 기질을 포함하는, 감지 분자(sensing molecule)(표적-보조 자가 절단(Target-Assisted Self Cleavage; TASC) 프로브)를 사용하는 신호 증폭 기법을 개발하였다. 이 방법이 단백질 효소의 사용을 피하고 있긴 하지만, 상기 TASC 프로브는 각각 새로운 표적마다 그에 맞추어야 하는 복잡하고 비싼 분자이다.
일부 그룹은 색도계 측정 해독에 의한 핵산 표적 및 기타 분석물의 검출을 보고한 바 있다[Elghanian et al., 1997, Mirkin et al., 1996, 및 Liu and Lu, 2004]. 이 기법은 올리고뉴클레오티드로 태깅된 나노스코픽(nanoscopic) 금 입자를 사용한다. 이어서, 그 금 입자는 "가교 올리고뉴클레오티드(bridging oligonucleotide)"의 첨가에 의해 응집될 수 있는데, 이는 적색에서 청색으로의 색상 변화를 일으킨다[Mirkin et al., 1996]. 리우(Liu) 및 루(Lu)(2004)는, DNA자임 기질을 가교 올리고뉴클레오티드 내에 혼입하여 그 기법을 확장시킴으로써, DNA자임의 활성화는 절단, 금 입자의 분산 및 청색에서 적색으로의 색상 변화를 형성하게 되었다. 이 연구 그룹은, 납 감수성 DNA자임을 사용하여 납을 검출하는 방법과, 앱타자임을 이용하여 아데노신을 검출하는 방법을 이용하였다.
촉매성 핵산을 사용하는 증폭 캐스케이드의 몇몇 예는 해당 업계에 공지되어 있다. 자이모겐/DzyNA 방법에서는 표적 증폭(예를 들어, PCR)과 DNA자임 복제를 조합한다. 표적과 함께 증폭되는 DNA자임은, 하나 이상의 표적의 일반적 검출을 허용하는 하나 이상의 보편적 리포터 기질(들)을 절단한다[미국 특허 제6,140,055호; 미국 특허 제6,201,113호; 미국 특허 제6,365,724호; WO 99/45146, Todd et al., 2000]. 증폭 과정을 매개하는 단백질 효소 대신에 촉매성 핵산을 사용하는 증폭 캐스케이드 기법이 고안되었다. 다른 방법에서, 신호 증폭 캐스케이드는, 교차 절단에 의해 선형화함으로써 서로 활성화될 수 있는 2개의 불활성 환형 10:23 DNA자임을 사용하였다. 문헌[Paul and Joyce(2004)]에는, 리가제 활성을 가지는 리보자임에 의해 매개된 복제 캐스케이드가 기술되어 있다. 이 반응에서, 제1 리보자임은 올리고뉴클레오티드를 함유하는 2개의 RNA를 결찰시켜 제2 리보자임을 형성시킨다. 이후, 상기 제2 리보자임은 올리고뉴클레오티드를 함유하는 2개의 다른 RNA를 결찰시켜 새로운 제1 리보자임을 형성하므로, 상기 제1 리보자임과 제2 리보자임의 새로운 복사체를 생성하는 복제 캐스케이드를 촉진한다.
핵산 캐스케이드는 일정 범위의 생물 공학 분야 특히, 진단 분야에서 고려되어 왔다. 상기 캐스케이드는 신호 증폭을 촉진함으로써 질병 진단용 단백질 및 핵 산을 검출할 수 있도록 하였다. 촉매성 핵산 및/또는 캐스케이드 반응은 진단 이외의 분야 예를 들어, 치료법에 사용될 수 있는 나노 규모의 디바이스 및 스위치에 관한 전산 분석 및 생체 분자 조작 분야에서 이용될 수 있다.
한정된 절차에 따라, 정보를 한 가지 형태에서 다른 형태로 전환할 수 있는 디바이스는 자동 장치(automata)라고 부른다. 단백질 효소(제한 엔도뉴클레아제 및 리가제) 및 이중 가닥 DNA를 사용하여, 전산 문제를 풀 수 있도록 프로그래밍 가능한 제한 자동장치가 개발되었다[Benenson et al., 2001]. 이 경우, 효소는 "하드웨어"로서 사용되고, DNA는 "소프트웨어"를 암호화하는 것이다. 입력(input)과 자동장치는, 적당한 DNA 소프트웨어를 선택함으로써 프로그래밍된다. 그 자동장치는 절단, 혼성화 및 결찰의 순환 캐스케이드를 통해 진행되는데, 이는 상기 자동장치의 최종 상태와 이로 인한 전산 결과를 암호화하는 검출 가능 출력 분자를 생성하게 된다.
입력 데이타로서 생물 분자를 사용하며 그리고 출력으로서 생물 활성자 분자를 사용하는, 간단한 분자 규모의 프로그램 가능 컴퓨터는 생물 공정의 논리적 제어를 위한 시스템을 형성하는데 사용될 수 있었다[Benenson et al., 2004]. 시험관내에서의 개념에 관한 증거로서, 베넨슨(Benenson) 등은, (i) 특이적 메신저 RNA 종의 존재도(abundance)를 측정할 수 있으며, 그리고 (ii) 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 단일 가닥 DNA 안티센스 분자를 방출시켜 응답할 수 있는 생체 분자 컴퓨터를 개발하게 되었다. 분자 규모의 논리 게이트를 생성시키는 DNA자임 네트워크를 사용한 기타 분자 자동장치는 "틱-택-토(tic-tac-toe)" 체계를 운영할 수 있 도록 프로그래밍되었다[Stojanovic and Stefanovic, 2003]. 최근 들어, 리가제 활성을 지닌 2원성 DNA자임은, 하나의 서열을 인지 및 혼성화("판독(read)")하고, 추후 PCR에 의해 증폭될 수 있는 별도의 각 서열을 결찰("기록(write)")하도록 조작하였다[Tabor et al., 2006].
DNA 전산과 생물학이 인터페이스 접촉되는 방법이 광범위하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 간단한 DNA 논리 게이트는 생리학적 신호 예를 들어, 고 혈당 또는 저 글루카곤의 조합에 기초하여 인슐린 방출을 조절할 수 있었다[Cox and Ellington 2001]. 아울러, 핵산에 관한 새로운 기능을 발견하는 과정은, 일련의 도구 예를 들어, 앱타머 및 촉매성 핵산, 그리고 새로운 나노 규모의 분자 "기기(machine)"의 구성 요소의 개발을 허용하는 새로운 구조적 구성 요소를 제공하였다.
몇 가지 방법 즉, (i) 분지 쇄 이동과, 2차 구조 형성, 예를 들어, 헤어핀 구조 형성에 의한 상보성 가닥 간의 혼성화의 억제를 포함하는 혼성화 단계, (ii) 제한 엔도뉴클레아제를 이용한 절단 단계, 그리고 (iii) 형태 변화 예를 들어, 중심 DNA 축을 기준으로 하는 회전, 수축/확장 및 번역 이동을 유도하는 단계를 포함하는 방법이, 자동장치와 나노 디바이스를 작동시키는데 사용되었다. 앱타머에 의한 단백질의 방출 제어를 위한 모듈 DNA 신호 번역자는 "입력"으로서 임의의 DNA 서열을 사용하였다[Beyer and Simmel, 2006].
그러므로, 표적을 검출하기 위한, 그리고 안정적인 핵산 성분을 사용하여 수행할 수 있는, 프로그래밍 가능한 디바이스를 비롯한 나노 규모의 디바이스를 조립 하기 위한, 간단하고, 신속하며 비용 효율적인 방법에 대한 필요성이 여전히 해당 기술 분야에 지속되고 있다.
발명의 개요
본 발명의 하나의 측면에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 파트자임을 포함하는 분자 스위치(molecular switch)가 제공되며, 여기서 상기 파트자임은 촉매 코어 부분, 센서 아암 부분 및 기질 아암 부분 중 하나 이상, 그리고 조립 촉진자 올리고뉴클레오티드, 기질 올리고뉴클레오티드, 활성 억제자 및 조립 억제자를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 올리고뉴클레오티드 성분 또는 이들의 임의 조합을 포함하며, 상기 분자 스위치는 다성분 핵산(MNA) 복합체를 형성할 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 스위치는 해체된 복합체, 부분 조립된 복합체, 완전 조립된 MNA자임, 또는 완전 조립된 촉매 불활성 MNA 복합체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 스위치는 MNAi를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자는 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상과 실질적으로 비-상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 파트자임 센서 아암, 파트자임 기질 아암, 조립 촉진자 올리고뉴클레오티드 및 기질 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상은 2개 이상의 분자들을 포함한다. 또한, 상기 파트자임 센서 아암, 파트자임 기질 아암, 조립 촉진자 올리고뉴클레오티드, 기질 올리고뉴클레오티드, 활성 억제자 또는 조립 억제자 중 하나 이상은 자기 상보성을 가지는 하나 이상의 부위를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 파트자임 센서 아암, 파트자임 기질 아암, 조립 촉진자 올리고뉴클레오티드 및 기질 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상은 하나 이상의 앱타머 및 하나 이상의 조립 억제자를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 스위치의 하나 이상의 성분은 상기 복합체의 입력 이벤트(input event)에 대한 감수성을 증가 또는 감소시키고/시키거나 출력 신호(output signal)의 강도를 변경시키도록 적응될 수 있다.
추가의 구체예에서, 상기 활성 억제자는 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 스위치는 하나 이상의 안정자 아암(stabilizer arm)을 추가로 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 스위치의 하나 이상의 성분은 핵산을 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 상기 스위치의 하나 이상의 성분은 하나 이상의 나노입자, 마이크로 입자 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 분자 스위치로서 MNA 복합체의 용도가 제공되며, 여기서, 상기 복합체는 입력 이벤트에 반응하여 불활성 MNA 복합체를 활성 MNA 복합체로 전환된다.
하나의 구체예에서, 상기 불활성 복합체는 해체된 복합체, 부분 조립된 복합체, 또는 완전 조립된 촉매 불활성 복합체를 포함할 수 있다. 또한, 촉매 불활성 MNA 복합체는 조립 억제자를 포함할 수 있다. 또한, 촉매 불활성 MNA 복합체는 MNAi일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 MNAi는 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함하는 활성 억제자를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 MNA자임으로의 전환은, 적어도 상기 활성 억제자 또는 활성 억제자 도메인의 MNAi로부터의 치환을 포함할 수 있다. 또한, 상기 치환은 상기 활성 억제자 도메인과 상기 활성자 조립 촉진자 도메인을 연결하는 절단 가능 기질의 절단을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 입력 이벤트는 억제자의 제거 또는 이 억제자의 억제 기능의 불활성화를 포함할 수 있다. 또한, 상기 입력 이벤트는 촉매 활성 MNA자임의 조립을 형성할 수 있다. 또한, 상기 입력 이벤트는 (i) 외부 공급에 의해 제공되거나, 또는 (ii) MNA 복합체의 환경에서의 반응 생성물인 활성자의 공급을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는, 분자 스위치로서 MNA 복합체의 용도가 제공되며, 여기서 상기 복합체는 입력 이벤트에 반응하여 활성 MNA 복합체로부터 불활성 MNA 복합체로 전환된다.
하나의 구체예에서, 상기 활성 복합체는 MNA자임일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 불활성 MNA 복합체로의 전환은 활성 MNA 복합체의 해체와 관련될 수 있다. 또한, 상기 불활성 MNA 복합체로의 전환은 불활성 MNA 복합체의 조립과 관련될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 입력 이벤트는 억제자의 부가 또는 이 억제자의 억제 기능의 활성화일 수 있다. 또한, 상기 입력 이벤트는 억제자의 결합일 수도 있다. 또한, 상기 억제자는 조립 억제자일 수도 있다. 또한, 상기 억제자는 활성 억제자 또는 활성 억제자 도메인일 수도 있다.
다른 구체예에서, 상기 불활성 MNA 복합체는 MNAi일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자 또는 조립 억제자는, (i) 외부 공급에 의해 제공될 수 있거나, 또는 (ii) 상기 MNA 복합체 환경에서의 반응 생성물일 수 있다.
전술한 2개의 측면 중 어느 하나에 관한 다른 구체예에서, 상기 전환은 출력 신호의 변화를 형성할 수 있다.
전술한 2개의 측면 중 어느 하나에 관한 다른 구체예에서, 상기 입력 이벤트는, 온도, 염 농도, 이온 세기, pH, 2가 양이온 존재 또는 부재, 종류 또는 농도, 전기 전하, 자기 전하(magnetic charge), 물리적 조작에서의 변화 및, MNA 또는 조정자 성분 또는 마이크로 환경의 성분에서의 농도 변화, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
전술한 2개의 측면 중 어느 하나에 관한 다른 구체예에서, 상기 출력 신호의 변화는 이전에 존재하지 않은 신호의 발생, 이전에 존재한 신호의 소멸, 또는 출력 신호의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다.
전술한 2개의 측면 중 어느 하나에 관한 다른 구체예에서, 상기 출력 신호는, 기질의 변형 정도에 따라 좌우되며, 여기서 상기 변형은 절단, 결찰, 포르피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합의 형성, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
전술한 2개의 측면 중 어느 하나에 관한 다른 구체예에서, 상기 출력 신호는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의 조합에 의해 측정될 수 있다. 또한, 상기 측정법은 출력 신호를 정량할 수 있는 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 입력 이벤트의 크기는 정량된 출력 신호로부터 측정될 수 있다. 또한, 상기 입력 이벤트 또는 출력 신호 중 어느 하나 또는 둘 다는 증폭될 수 있다. 또한, 상기 출력 신호 증폭은 신호 캐스케이드에 의해 발생될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는, 2 이상의 올리고뉴클레오티드 성분 및 하나 이상의 활성 억제자 분자를 포함하는 MNAi가 제공된다.
하나의 구체예에서, 상기 MNAi는 하나 이상의 조립 촉진자를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자는 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인, 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 및 리포터 도메인 중 2 이상은 활성 억제자의 개별 도메인 상에 위치할 수 있다. 또한, 상기 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 및 리포터 도메인 중 2 이상은 불안정 링커 또는 절단 가능 기질에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 기질은 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자는 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상에 실질적으로 비-상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 조립 촉진자는 표적일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리(pre)- 및 프라이(pri)-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 MNAi의 하나 이상의 성분은 앱타머를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분들을 포함하는 MNAi 조성물이 제공되며, 여기서 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 MNA 복합체 활성 억제자의 존재 하에서 자가 조립될 수 있으며, 상기 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 각각, 기질 아암 부분, 촉매 코어 부분, 및 센서 아암 부분을 포함하고; 자가 조립시, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 센서 아암 부분은 센서 아암으로서 작용을 하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 아암 부분은 기질 아암으로서 작용을 하며, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 코어 부분은 비-작용성 촉매 코어를 형성하고;
자가 조립시, 하나 이상의 센서 아암은 상기 활성 억제자와 상호 작용을 하며, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은, 각각의 촉매 코어 부분이 결합하여 비-작용성 촉매 코어를 형성하도록 근접하게 유지된다.
하나의 구체예에서, 상기 MNAi 조성물은 하나 이상의 조립 촉진자를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자는 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 및 리포터 도메인 중 2개 이상은 활성 억제자의 개별 도메인 상에 위치할 수 있다. 또한, 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 및 리포터 도메인 중 2개 이상은 불안정 링커 또는 절단 가능 기질에 의해 결합할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자는 기질일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자는 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상에 실질적으로 비-상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 복합체의 하나 이상의 성분은 하나 이상의 앱타머 또는 이의 부분을 함유할 수 있으며, 상기 앱타머 또는 이의 부분는, 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 리간드에 결합한다.
본 발명의 다른 측면에서, 제1 MNA자임, 실질적으로 촉매 불활성 형태로 초기에 존재하는 MNA 복합체(MNAi), 상기 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 활성 억제자를 포함하는 신호 캐스케이드를 사용하여, 검출 가능 효과(detectable effect)를 제공하는 조립 촉진자의 검출 방법이 제공되며, 여기서 상기 활성 억제자는 활성 억제자 및 잠재적인 기질이며;
상기 제1 MNA자임의 촉매 활성을 허용하는 조건 하에 상기 MNA자임에 대한 조립 촉진자와 파트자임의 결합은 상기 제1 MNA자임의 촉매 활성을 촉진함으로써, 상기 활성 억제자의 변형을 제공하여 활성자 조립 촉진자 도메인과, 상기 활성 억제자의 활성 억제자 도메인을 방출하고, 상기 방출은 검출 가능 효과를 제공하며;
상기 방출된 활성자 조립 촉진자 도메인은 상기 MNA 복합체의 성분으로부터 제2의 MNA자임의 조립을 촉진하고;
또한, 상기 제2 MNA자임의 촉매 활성은 상기 활성 억제자를 변형시켜, 추가 활성 억제자 도메인과 추가 활성자 조립 촉진자 도메인을 방출시키고, 상기 방출은 추가 검출 가능 효과를 제공하며;
상기 추가 활성자 조립 촉진자 도메인은 추가 제2 MNA자임의 조립을 촉진함으로써, 추가의 상기 촉매 활성 제2 MNA자임을 제공하고, 이로써, 상기 조립 촉진자의 존재를 나타내는 추가 검출 가능 효과를 제공한다.
하나의 구체예에서, 상기 활성 억제자는 리포터-억제자-촉진자일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자, 제1 MNA자임 또는 제2 MNA 복합체 성분 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자, 제1 MNA자임 또는 제2 MNA 복합체 성분 중 하나 이상은 용액 중에서 유리될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 활성 억제자는 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 활성 억제자는 검출 가능 부분 및 소광자(quencher)를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 제1 MNA자임 또는 제2 MNA자임에 의한 상기 활성 억제자의 변형시, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공된 검출 가능 효과는 증가 또는 감소하게 된다. 또한, 상기 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의 조합에 의해 검출될 수 있다. 또한, 검출 가능 효과는 측정될 있으며, 상기 측정의 크기는 조립 촉진자의 양을 나타낸다.
다른 구체예에서, 조립 촉진자는 표적일 수 있다. 또한, 상기 표적은, DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 제1 MNA자임 및/또는 제2 MNA 복합체의 성분 중 하나 이상은 앱타머를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 방법은 상기 앱타머에 결합하는 리간드의 검출을 제공한다. 또한, 상기 리간드는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체(entire organism), 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 조립 촉진자는 입력 이벤트로서 작용을 하는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
다른 구체예에서, 촉매 활성 MNA자임의 조립은 온도, 염 농도, 이온 세기, pH, 2가 양이온 존재 또는 부재, 종류 또는 농도, 전기 전하, 자기 전하, 물리적 조작에서의 변화 및, MNA 또는 조정자 성분 또는 마이크로 환경의 성분의 농도에서의 변화 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 입력 이벤트에 의해 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는, 캐스케이드를 이용하여 표적을 검출하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 캐스케이드는 상기 표적의 존재 하에 형성된 개시 MNA자임(initiating MNAzyme); 상기 개시 MNA자임의 생성물의 존재 하에 형성된 제1 MNA자임; 상기 제1 MNA자임의 생성물의 존재 하에 형성된 부가의 MNA자임을 포함하고, 상기 방법은 다음의 단계들:
(i) 상기 개시 MNA자임으로 제1 기질을 변형시켜, 제1 조립 촉진자를 발생시키는 단계;
(ii) 상기 제1 MNA자임과 상기 제1 조립 촉진자를 조립하는 단계;
(iii) 부가의 기질을 상기 제1 MNA자임으로 변형시켜, 상기 부가의 조립 촉진자를 발생시키는 단계;
(iv) 상기 부가의 MNA자임과 상기 부가의 조립 촉진자를 조립하는 단계;
(v) 상기 제1 기질을 상기 부가의 MNA자임으로 변형시켜, 상기 제1 조립 촉진자를 발생시키는 단계;
(vi) 상기 제1 MNA자임과 상기 (v) 단계로부터 방출된 상기 제1 조립 촉진자를 조립함으로써 증폭 캐스케이드를 형성시키는 단계
를 포함하며;
여기서 상기 제1 기질 또는 상기 부가 기질 중 하나 이상의 변형은 상기 표적의 존재를 나타내는 검출 가능 효과를 생성하게 된다.
하나의 구체예에서, 상기 제1 조립 촉진자 또는 상기 부가의 조립 촉진자 중 어느 하나 또는 둘 다는 활성자 조립 촉진자일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 제1 기질은 상기 제1 MNA자임의 활성 억제자일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 증폭 캐스케이드는 피드백 증폭 캐스케이드일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 부가의 기질은 상기 부가의 MNA자임에 대한 활성 억제자일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 제1 MNA자임 및/또는 상기 부가의 MNA자임은 하나 이상의 조립 촉진자의 존재 하에 촉매 활성이 되는 2개의 파트자임을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 제1 MNA자임 및/또는 상기 부가의 MNA자임은 2개 이상의 조립 촉진자 성분의 존재 하에 촉매 활성이 되는 2개의 파트자임을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 제1 MNA자임 및/또는 상기 부가의 MNA자임은 3개 이상의 조립 촉진자 성분의 존재 하에 촉매 활성이 되는 2개의 파트자임을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 표적은 검출, 동정 또는 정량하고자 하는 조립 촉진자 분자일 수 있다. 또한, 상기 표적은 핵산을 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 합성, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 기타 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 공급원으로부터 공급될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 MNA자임 중 하나 이상은 하나 이상의 앱타머를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 앱타머는 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있다. 또한, 상기 리간드는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 MNA자임 또는 상기 기질 중 하나 이상의 성분은 불용성 지지체에 부착될 수 있거나 또는 용액 중에 유리될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 기질 또는 기질들은 검출 가능 부분 및 소광 부분을 포함할 수 있으며, 상기 MNA자임 중 하나 이상에 의한 상기 기질의 변형시, 상기 검출 가능 부분은 검출 가능 효과를 제공한다.
다른 구체예에서, 상기 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의의 조합 중 하나 이상에 의해 검출될 수 있다. 또한, 검출 가능 효과는 측정될 있으며, 상기 측정의 크기는 표적의 양을 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에서, 신호 증폭 캐스케이드를 이용하여 표적을 검출하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 신호 증폭 캐스케이드는 제1 MNA자임에 대한 파트자임, 제1 기질, 제2 MNA자임에 대한 파트자임, DNA자임 리가제, 제2 기질, 부가의 MNA자임에 대한 부가의 파트자임 및 조립 촉진자 및 부가의 기질을 포함하고, 상기 방법은 다음의 단계들:
(i) 검출될 표적 분자의 존재하에 제1 MNA자임에 대한 상기 파트자임으로부터 상기 제1 MNA자임을 형성하는 단계;
(ii) 상기 제1 기질을 상기 제1 MNA자임으로 절단하여 다수의 절단 생성물을 발생시키는 단계;
(iii) 상기 DNA자임 리가제에 의해 상기 절단 생성물 중 하나 이상을 상기 제2 기질과 결찰시켜, 상기 부가의 MNA자임에 대한 결찰 파트자임을 발생시키는 단계;
(iv) 상기 절단 생성물 중 하나 이상과의 조립에 의해, 상기 제2 MNA자임에 대한 파트자임으로부터 상기 제2 MNA자임을 형성시키는 단계;
(v) 상기 제1 기질을 상기 제2 MNA자임으로 절단하여 추가의 상기 다수의 절단 생성물을 발생시키는 단계;
(vi) 추가의 상기 발생된 다수의 절단 생성물 중 하나 이상과의 조립에 의해, 추가의 상기 제2 MNA자임을 형성시키는 단계로서, 추가의 상기 제2 MNA자임의 조립은 증폭 캐스케이드를 형성하고, 추가의 상기 다수의 절단 생성물의 축적을 형성하며, 추가의 상기 발생된 다수의 절단 생성물 중 하나 이상은 상기 DNA자임 리가제에 대한 기질로서 작용을 하는 것인 단계;
(vii) 상기 부가 파트자임 및 상기 결찰된 파트자임에 의해, 그리고 더불어 상기 조립 촉진자에 의해, 상기 부가의 MNA자임을 형성시키는 단계;
(viii) 상기 부가의 기질을, 상기 부가의 MNA자임으로 변형시켜, 상기 표적의 존재를 나타내는 검출 가능 효과를 형성하는 단계
를 포함한다.
하나의 구체예에서, 증폭 캐스케이드는 피드백 증폭 캐스케이드일 수 있다.
다른 구체예에서, 제2 기질과 결찰된 절단 생성물은 3' 말단에서 2',3'-시클릭 포스페이트를 가질 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 절단 생성물 중 하나 이상은 활성자 조립 촉진자일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 표적은 검출, 동정 또는 정량하고자 하는 분자일 수 있다. 또한, 상기 표적은 핵산을 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 합성, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 공급원으로부터 공급될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 제1 MNA자임에 대한 파트자임, 제1 기질, 제2 MNA자임에 대한 파트자임, DNA자임 리가제, 제2 기질, 부가의 파트자임, 부가의 MNA자임에 대한 조립 촉진자, 및 부가의 기질 중 하나 이상은, 하나 이상의 앱타머를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 앱타머는 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있다. 또한, 상기 리간드는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 제1 MNA자임에 대한 파트자임, 제1 기질, 제2 MNA자임에 대한 파트자임, DNA자임 리가제, 제2 기질, 부가의 파트자임, 부가의 MNA자임에 대한 조립 촉진자, 및 부가의 기질 중 하나 이상은, 하나 이상의 나노 입자, 마이크로 입자 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 제1 MNA자임에 대한 파트자임, 제1 기질, 제2 MNA자임에 대한 파트자임, DNA 리가제, 제2 기질, 부가의 파트자임, 부가의 MNA자임에 대한 조립 촉진자, 그리고 부가의 기질 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착될 수 있거나, 또는 용액 중에 유리될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 기질 중 하나 이상은 검출 가능 부분 및 소광자 부분을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 MNA자임에 의한 상기 기질의 변형시, 상기 검출 가능 부분은 검출 가능 효과를 제공한다.
다른 구체예에서, 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의의 조합 중 하나 이상에 의해 검출될 수 있다. 또한, 상기 검출 가능 효과는 측정될 수 있으며, 상기 측정의 크기는 상기 표적의 양을 나타낸다.
전술한 측면 중 임의의 것에 관한 하나의 구체예에서, 상기 표적은 검출, 동정 또는 정량하고자 하는 분자이다. 상기 표적은 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 핵산은 합성, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 공급원으로부터 공급될 수 있다.
전술한 측면 중 임의의 것에 관한 하나의 구체예에서, 상기 방법 또는 조성물은 앱타머를 혼입할 수 있으며, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합(이들에 국한되는 것은 아님), 또는 임의의 다른 실체를 비롯한, 앱타머에 결합할 수 있는 리간드를 검출할 수 있다.
전술한 측면 중 임의의 것에 관한 하나의 구체예에서, MNA 복합체의 하나 이상의 성분은 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 표지화된 핵산, RNA, DNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 차단 핵산(locked nucleic acid), 펩티드-핵산 키메라, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 항체, 폴리펩티드, 당 단백질, 지단백질 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
MNA 복합체의 하나 이상의 성분은 하나 이상의 나노 입자 또는 마이크로 입자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 불용성 지지체에 부착될 수 있거나 또는 용액 중에 유리될 수 있다. 상기 기질 성분은 검출 가능 부분과 소광자 부분을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 MNA자임에 의한 상기 기질의 변형시ㅡ 상기 검출 가능 부분에 의해 제공된 검출 가능 효과는 증가 또는 감소한다.
전술한 측면 중 임의의 것에 관한 하나의 구체예에서, 상기 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다. 또한, 상기 검출 가능 효과는 측정될 수 있으며, 또한 상기 측정의 크기는 표적의 양을 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에서는, 다수의 MNA 복합체을 포함하는 전가산기(full adder)가 제공되며, 여기서, 상기 전가산기는 2개의 출력 신호의 4가지의 가능한 조합을 발생시키는 3개의 입력의 8가지 가능한 조합을 포함할 수 있고, 상기 4가지의 가능한 조합은, 비 출력(no output), 제1 출력, 제2 출력, 또는 제1 출력 및 제2 출력이다.
하나의 구체예에서, 입력이 존재하지 않으면 출력도 생성되지 않는다.
다른 구체예에서, 상기 전가산기는 임의의 정확한 1개 입력에 반응하여 제1 출력을 발생시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 전가산기는 임의의 정확한 2개 입력에 반응하여 제2 출력을 발생시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 전가산기는 3개 입력에 반응하여 제1 출력 및 제2 출력 둘 다를 발생시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 입력 중 하나 이상은 검출 가능 이벤트(detectable event)일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 출력 중 하나 이상은 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의의 조합 중 하나 이상에 의해 측정된 검출 가능 이벤트 또는 검출 가능 효과일 수 있다.
다른 구체예에서, 제1 출력 또는 제2 출력은 다른 전가산기에 대한 입력으로서 작용을 한다.
도면의 간단한 설명
이하, 첨부된 도면을 참고로 하여, 오로지 예시의 목적으로, 본 발명의 바람직한 구체예에 대해 기술하고자 한다.
도 1: 다성분 핵산(MNA자임)에 관한 하나의 예시적 디자인의 도시
예를 들어, MNA자임은 조립 촉진자의 존재 하에 자가 조립되는 2개의 파트자임(A 및 B)으로 이루어져 있다. 조립 촉진자의 존재 하에 2개의 파트자임이 조립될 때, 기질을 변형 예를 들어, 절단할 수 있는 촉매 활성 MNA자임이 형성된다. 상기 2개의 구성 파트자임들은 (i) 조립 촉진자에 결합하는 센서 아암, (ii) 기질과 결합하는 기질 아암, 그리고 (iii) 부분 촉매 코어 서열을 가진다.
도 2: 활성 MNA자임에 대한 추가의 예시적 디자인
패널 (i): 다수의 조립 촉진자 성분이 MNA자임 형성에 필요할 경우, MNA자임에 대한 예시적인 디자인 묘사. 이 디자인에 있어서, 조립 촉진자를 구성하는 하나의 성분(F1)은 파트자임 A 및 B 둘 다의 센서 아암 부위에 상보성인 반면에, 제2의 조립 촉진자 성분(F2)은, 오로지 파트자임 B(이 도면에 나타냄), 또는 오로지 파트자임 A와 상보성이다. 상기 2개의 조립 촉진자 성분은 함께, 기질을 변형(예를 들어, 절단)할 수 있는 활성 MNA자임의 조립을 유도한다.
패널 (ii): 조립 촉진자의 존재 하에 파트자임 A 성분과 2분형 파트자임 B 성분들이 조립되어, 기질을 변형(예를 들어, 절단)할 수 있는 활성 MNA자임을 생성하는 경우에 대한 예시적인 디자인 묘사. 이 도식에서, 파트자임 B는 제2의 성분(안정자 아암 성분(stabilized arm component)이라고 부름)(S)의 부재 하에, 안정한 MNA자임을 조립하기에는 불충분한, 절두형 센서 아암(T)을 가진다. 상기 안정자 아암이, 조립 촉진자가 상기 파트자임의 절두형 센서 아암에 인접하여 위치하는 곳에서 조립 촉진자와 혼성화될 경우, 활성 MNA자임이 조립될 수 있다.
도 3: 활성 및 불활성 다성분 핵산 복합체의 존재 하에 시간이 경과 함에 따른 출력 신호(형광도)의 변화
본 도면에서, 제1 파트자임(A)은 표준 디자인을 취하고 있다. 제2 파트자임(B)은 기질 아암을 포함하는 하나의 성분과, 부분 촉매 코어 및 절두형 센서 아암(T), 그리고 안정자 아암(S)으로서 사용되는 제2의 성분을 갖는다.
파트자임 A 및 B와 조립 촉진자의 모든 성분이 관여하는 반응 (i)에서는 형광도가 증가하는 것이 관찰되었다. 이는, 이 반응에 있어서 활성 MNA자임이 조립될 때와 기질이 절단될 때에도 마찬가지이다. 파트자임 B의 안정자 아암 부분을 제거하였을 경우(반응 (ii)), 시간이 경과하여도 신호는 증가하지 않았는데, 이는 곧, 이 성분이 본 시스템 내에서 활성 MNA자임의 조립에 필수적인 성분임을 말해주는 것이다. 조립 촉진자를 첨가하지 않은 대조 반응(반응 (iii))에서도 시간이 경과함에 따라 형광도는 증가하지 않았다.
도 4: MNAi(좌측 도면) 및 활성 MNA자임(우측 도면)에 대한 예시적인 디자인의 도시
파트자임 A 및 B가 조립 촉진자 성분 및 활성 억제자와 복합체를 형성할 때 MNAi가 형성된다(좌측 도면). 상기 MNAi는 기질과 상호 작용할 수는 있지만, 이를 촉매 작용에 의해 변형시킬 수는 없다. 몇몇 구체예에서, 활성 억제자는, 활성 억제자 내 2개 이상의 도메인을 구분할 수 있는 불안정 또는 절단 가능한 링커(점선 화살표로 표시함)를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 도메인은 예를 들어, (i) 파트자임 성분들과 실질적으로 비-상보성이며, 촉매 활성을 가지는 MNA자임을 형성하는데 필요한 2차 구조를 파괴함으로써 억제 효과를 나타내는, 활성 억제자 도메인, 그리고 (ii) 활성 억제자 도메인과 격리될 경우 조립 촉진자 성분으로서 작용하여, 활성 MNA자임의 조립을 유도할 수 있는 활성자 조립 촉진자 도메인을 포함할 수 있다.
도 5: 다양한 다성분 핵산 복합체의 촉매 활성에 관한 도시
모든 반응에 파트자임 A, 파트자임 B 및 형광 단 소광자 염료 쌍으로 표지화된 기질을 포함시킨다. 또한, 각각의 반응에는, (i) 조립 촉진자 F1/2, (ii) 성분 F1 및 F2를 포함하는 조립 촉진자(조립 촉진자 F1/2의 서열에 상응하는 서열), (iii) 조립 촉진자 부분인 F1과, 활성 억제자 도메인 및 F2와 동일한 서열을 가지는 도메인에 상응하는 2개의 도메인들이 서로 결합되어 있는 활성 억제자를 포함시키거나, 또는 (iv) 조립 촉진자나 활성 억제자를 포함시키지 않는다.
형광도 변화는, 시간이 경과 함에 따라서 활성 MNA자임 복합체에 의해 기질이 촉매 활성에 의해 절단되는 정도로써 관찰한다(도 5). 조립 촉진자 F1/2, 또는 조립 촉진자 F1 및 F2 중 어느 하나를 포함하는 반응에서는 형광도가 신속하게 증가하였는데, 이는 곧, 활성 MNA자임 1 및 2가 각각 형성되며, 이들 활성 MNA자임 1 및 2 둘 다는 기질을 절단할 수 있음을 말해주는 것이다. 이와는 대조적으로, F1과 활성 억제자를 포함하는 반응에서는 시간이 경과하여도 형광도가 증가하지 않았음을 관찰할 수 있었는데, 이는 곧, MNAi 복합체가 형성되었음을 말해주는 것이다. 조립 촉진자가 존재하지 않았을 때에는 형광도가 증가하지 않았다.
도 6: DNA를 이용하는 신호 캐스케이드(SCUD)에 관한 개요도
도시한 프로토콜은 다음과 같은 성분들을 포함한다:
(i) 다수의 도메인들을 포함하는 이중 표지화 RIF(리포터-억제자-촉진자) 성분;
a. 활성 억제자/리포터 도메인을 포함하고, 우선은 (RIF에 통합될 때) 활성 억제자로서 작용을 하고, 그 다음에는 RIF가 절단될 때 형광 출력 신호를 발생시키는 작용을 하는 것과 같이 이중 작용을 하는 RI 도메인,
b. 활성 MNA자임 2a 복합체가 조립될 때 필수적인 성분인 활성자 조립 촉진자 도메인 F2b, 그리고
c. MNA자임 1a 또는 MNA자임 2a 중 어느 하나에 의해 절단될 때 RI 및 F2b 도메인을 분리시키고, RI 및 F2b 사이에 위치하는 기질 서열,
(ii) 조립 촉진자 성분 F2a,
(iii) 다른 조립 촉진자(F1)(예를 들어, 테스트 시료 중에 존재하는 표적 핵산일 수 있음)가 존재할 경우에만 활성 MNA자임 1a 구조를 형성할 수 있는 파트자임 성분[여기서, 상기 활성 MNA자임 1a는 RIF를 절단할 수 있으므로, RI 도메인(이후 형광 및 출력 신호를 발생시킬 수 있음)을 제거하면 F2b 도메인을 유리시켜 이를 활성화할 수 있음],
(iv) F2a 도메인과 인접하여 존재하던 유리된 F2b 도메인과 파트자임 아암이 결합할 때에만 활성 MNA자임 2a를 형성할 수 있는 파트자임. 이후, 상기 MNA자임 2a는 더욱 많은 RIF를 절단하여 더욱 많은 F2b를 생성하므로, 자가 촉매 활성에 의한 MNA자임 2a의 자가 복제 캐스케이드를 진행시킬 수 있다. 비 변형 RIF가 존재할 경우, MNA자임 2a의 성분은 MNAi 2i 복합체로 조립된다.
F1이 존재하지 않을 경우, MNA자임 2a에 대한 파트자임은 비 변형 RIF와 함께 MNAi 2i 복합체를 형성한다. F1이 존재할 경우, 활성 MNA자임 1a는 RIF를 형성 및 절단하여, F2b를 생성하며, 이후, 이 F2b는 서로 자유롭게 결합하여 활성 MNA자임 2a의 조립을 촉진할 것이다. MNA자임 2a는 또한 더욱 많은 RIF를 추가로 절단할 수 있으므로, 신호 캐스케이드를 개시할 것이다. SCUD(도 6)는, 이 SCUD 기법을 앱타머-MNA자임 시스템과 연계시켰을 경우에, 핵산 표적(DNA 및/또는 RNA), 또는 기타 표적 분석물(단백질, 소분자 등) 중 어느 하나에 의해 개시될 수 있었다(도 7에 도시함).
도 7: MNA자임의 활성 조정에 관한 예시적인 기법
이 시스템에서 사용된 기법은, (i) 활성자 분자로서 리간드를 사용하여 MNA자임 활성을 제어하는 방법, 및/또는 (ii) 앱타-MNA자임을 사용하여 비-핵산 표적을 검출하는 방법 중 어느 하나로서 사용될 수 있다.
상기 예시적인 앱타-MNA자임 검출 기법에 포함된 핵산 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 것들을 포함한다:
a) 표준적인 파트자임;
b) 어느 한쪽 말단부에 앱타머가 통합된 파트자임인 앱타-파트자임;
c) 앱타-파트자임과, 활성 MNA자임의 조립을 가능하게 하는 파트자임 둘 다와 결합하는 올리고뉴클레오티드인 조립 촉진자;
d) 리포터 기질; 및
e) 앱타-파트자임 서열의 적어도 앱타머 서열 일부와 기질 결합 아암의 일부에 걸쳐 확장되어 존재하는 부위 내에서 앱타-파트자임과 혼성화하는 조립 억제자 올리고뉴클레오티드.
활성자 리간드가 존재하지 않을 경우(좌측 패널), 조립 억제자 올리고뉴클레오티드는 앱타-파트자임과 결합하므로, 리포터 기질과의 결합에 대해 경쟁하며 이를 차단하기도 한다. 활성자 리간드가 존재할 경우(우측 패널), 이 활성자 리간드는 앱타-파트자임의 앱타머 서열과 결합하여, 조립 억제자 올리고뉴클레오티드의 결합을 차단하므로, 리포터 기질을 결합 및 절단할 수 있도록 한다. 그러므로, MNA자임은 앱타머와 결합할 수 있는 리간드가 존재할 경우에만 형성되어 형광 신호를 발생시킬 수 있다. 이와 같은 방법은 MNA 시스템의 촉매 활성을 가동(turn on) 및 중지(turn off)할 수 있는 분자 스위치를 개발하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 이 방법은 또한 핵산 및 비-핵산 표적 리간드 둘 다를 검출할 때에도 사용할 수 있다.
당업자는 또한, 하나 이상의 앱타머가 올리고뉴클레오티드 성분 중 임의의 성분 예를 들어, 파트자임, 조립 촉진자 또는 기질에 통합될 수 있었음을 알 수 있을 것이다. 또한, 앱타머는 이와 같은 올리고뉴클레오티드 중 임의의 것의 어느 한쪽 말단에 통합될 수 있었다. 하나의 구체예에서, 앱타머는 파트자임의 하나 이상의 센서 아암에 부착된다. 다른 구체예에서, 앱타머는 파트자임의 하나 이상의 기질 아암에 부착된다.
도 8: DNA자임 리가제 및 MNA자임에 의해 매개되는 절단/결찰 캐스케이드의 예
올리고뉴클레오티드 예를 들어, 올리고 1/2는 MNA자임에 의하여 절단 생성물인 올리고 1 및 올리고 2로 절단될 수 있으며, 이를 통하여 2',3'-시클릭 포스페이트 및 5'-하이드록실 생성물이 생성되고, 이 생성물들은 추후의 결찰 반응에 관여할 수 있다. DNA자임 리가제 예를 들어, 7Z81(Prior et al., 2004)은 제1 올리고뉴클레오티드(올리고 1)을 제2의 올리고뉴클레오티드(올리고 2)에 결찰시켜, 올리고 1/2의 동일한 뉴클레오티드 서열과의 올리고뉴클레오티드 결찰 생성물을 형성할 수 있다.
도 9: MNA자임 및 MNAi 디자인에 대한 예시적인 구조
활성 MNA자임 구조물에 관한 몇몇 예들을 패널 A∼D(좌측 구조)에 도시하였다. 이 구조물들은 전부, 기질(S)를 절단할 수 있는 촉매 활성 효소를 형성할 수 있다. MNAi 구조의 예를 패널 A∼D에 도시하였다(활성 MNA자임의 우측 구조). 이러한 MNAi 구조물은 활성 MNA자임 내 조립 촉진자(F)가 점유하고 있는 위치에 결합하는 활성 억제자(I)를 함유한다. 본 도면은 하나의 조립 촉진자(F1)(패널 A), 2개의 조립 촉진자인 F1 및 F2(패널 B 및 D) 또는 3개의 조립 촉진자인 F1, F2 및 F3(패널 C)를 포함하는 MNA자임에 관한 도식을 포함한다. 패널 A에 나타낸 MNA의 예는 파트자임 센서 아암 내부의 자기 상보성 부위를 가지는 센서 아암을 포함한다. MNA 구조물은 또한 하나 이상의 안정자 아암(sA)을 포함할 수도 있다(패널 D). a∼h로 표시한 특이적 MNA자임 구조 및 MNAi 구조는 실시예 7∼10을 참고로 할 경우 이해가 더욱 쉬울 것이다.
도 10: 2개의 기질을 사용하는 캐스케이드에 관한 예시적인 기법
본 기법에서, 개시 MNA자임(Mt)은 표적(T)이 존재할 경우에 형성된다. 개시 MNA자임(Mt)은 제1 기질(S1)을 절단하여 제1 활성자 조립 촉진자 성분(S1f)을 생성하는데, 이 성분은 제1 MNA자임의 형성을 유도한다(캐스케이드 MNA자임(cascading MNAzyme); Mc1). 이 예에서, 제1 MNA자임(Mc1)은 2개의 파트자임과 3개의 조립 촉진자 성분(F1, F2 및 S1f)을 포함한다. Mc1은 부가의 기질(S2)을 절단하여, 부가의 활성자 조립 촉진자 성분(S2f)을 유리시킬 수 있는데, 이 S2f는 제2 MNA자임의 형성을 유도한다(캐스케이딩 MNA자임; Mc2). 이 예에서, 제2 MNA자임(Mc2)은 2개의 파트자임과 3개의 조립 촉진자 성분(F3, F4 및 S2f)을 포함한다. 이후, Mc2는 제1 기질(S1)을 더욱 많이 절단하여, 제1 활성자 조립 촉진자 성분(S1f)을 더욱 많이 생성시킬 수 있다. 이로써, 제1 MNA자임(Mc1)이 추가로 형성되고, 따라서, 증폭 캐스케이드를 구성할 수 있게 된다.
도 11: 개시 MNA자임을 이용한 신호 증폭 캐스케이드, SCUD 캐스케이드 증폭 및 DNA자임 리가제 매개 MNA자임 절단에 관한 정보 분석
본 도면에 도시된 기법은 다음과 같은 특징이 있다.
(i) 표적 핵산(F1)은 제1 기질(기질 A)을 절단하고, 제1 절단 생성물(생성물 Aa) 및 제2 절단 생성물(활성자 조립 촉진자)(생성물 Ab)을 생성하는 개시 MNA자임(MNA자임 1a)의 형성을 촉진하며, 제1 절단 생성물(생성물 Aa)는 반응 (ii)의 한 성분으로 사용되고, 제2의 절단 생성물(생성물 Ab)은 반응 (iii)의 한 성분으로 사용된다.
(ii) 제1 절단 생성물(생성물 Aa)은 그것의 3' 말단에 2',3'-시클릭 포스페이트를 가지며, 리가제 활성을 가지는 DNA자임 2a에 대한 기질로서 작용하기 적당하다. DNA자임 리가제 2a는 제1 절단 생성물(생성물 Aa)을 제2 기질(기질 B)에 결찰하여, 부가의 MNA자임(MNA자임 4a)에 대한 결찰형 파트자임을 생성한다.
(iii) 제2의 절단 생성물(생성물 Ab)은 제2 MNA자임(MNA자임 3a)의 형성을 유도하는 활성자 조립 촉진자 성분으로서 작용을 한다. 제2의 MNA자임(MNA자임 3a)은 추가로 제1 기질(기질 A)을 변형시켜, 추가의 제1 절단 생성물(생성물 Aa)과 제2 절단 생성물(생성물 Ab)을 생성한다. 이후, 추가의 제2 절단 생성물(생성물 Ab)은 추가의 제2 MNA자임(MNA자임 3a)의 형성을 유도한다. 그 결과, SCUD 자가 촉매성 자가 복제 피드백 증폭 캐스케이드가 진행된다. 이 SCUD 캐스케이드를 통하여, 더욱 많은 제2 MNA자임(MNA자임 3a)을 조립하는 기능을 가지는 추가의 제2 절단 생성물(생성물 Ab)가 추가로 축적되며, 그 결과, 반응 (ii)에서 DNA자임 2a에 대한 기질로서 작용을 하는 제1 절단 생성물(생성물 Aa)이 추가로 축적된다.
(iv) 제1 절단 생성물(생성물 Aa)과 제2 기질(기질 B)의 결찰에 의해 반응 (ii)에서 생성된 부가의 MNA자임에 대한 결찰형 파트자임은, 부가의 MNA자임(MNA자임 4a)에 대한 새로운 파트자임을 형성한다. 부가의 MNA자임(MNA자임 4a)은 촉진자 F4와 함께 형성되고, 또한 형광 단과 소광자 염료 쌍 사이에 있는 기질 C를 변형시켜, 표적 핵산 F1의 존재에 대한 지표가 되는 형광 신호를 증가시킨다.
도 12: MNA자임을 이용한 분자 전가산기
3개의 입력 데이터인 FAC1, FAC2 및 FAC3은 회색으로 표시되어 있으며, 음영 교차선("녹색(green)" 및 "청색(blue)")은 상이한 형광 단을 포함하는 기질을 나타내고, C 올리고뉴클레오티드는 검은 색으로 표시되어 있다. 파트자임도 검은 색으로 표시되어 있으며, 이것은 C 올리고뉴클레오티드 및 기질과 예비 복합체화된다.
정의
본원에 사용된 임의의 용어들은 이하에 제시한 의미를 가질 것이다.
"~를 포함하는"이란 용어는, "주로 ~를 포함하되, 반드시 ~만을 포함하는 것은 아닌" 경우를 의미하는 것이다. 더욱이, "~를 포함하는"의 변형어 예를 들어, "포함하다" 및 "포함한다"는 그에 상응하는 다양한 의미를 갖는다.
"폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 호환하여 사용될 수 있는 것으로서, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 사슬 중합체 또는 이중 사슬 중합체, 또는 이의 유사체, 유도체, 변이체, 단편 또는 이의 조합 예를 들어, DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 의미하는 것이다. 비 제한적인 예를 들면, 핵산은 합성되어 공급되거나, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 공급원으로부터 공급될 수 있다.
"촉매 핵산 분자", "촉매 핵산", "핵산 효소" 및 "촉매 핵산 서열"이란 용어는 본원에서 호환되어 사용되고 있으며, 이는 기질을 인지하고 이 기질의 변형을 촉진할 수 있는, DNA 분자나 DNA-함유 분자(해당 업계에서는 "DNA 효소", "데옥시리보자임" 또는 "DNA자임"이라고도 함), 또는 RNA나 RNA-함유 분자(해당 업계에서는 "RNA 효소" 또는 "리보자임"이라고도 함), 또는 이들의 조합(DNA-RNA 하이브리드 분자)을 의미하는 것이다. 촉매 핵산 내에 존재하는 뉴클레오티드 잔기들은 A, C, G, T 및 U와, 이의 유도체 및 유사체를 포함할 수 있다.
"다성분 핵산 복합체", "다성분 핵산", "MNA" 또는 "MNA 복합체"란 용어는, 예를 들어, 파트자임, 안정자 아암, 조립 촉진자, 기질 및 조정 성분 예를 들어, 활성 억제자, 조립 억제자 및 이의 성분을 포함하는 군으로부터 선택된 2개 이상의 성분들을 포함하는 복합체를 의미한다. 몇몇 구체예에서, 상기 MNA 복합체는 활성 MNA자임이다. 다른 구체예에서, 상기 MNA 복합체는 불활성 복합체 예를 들어, MNAi이며, 이 MNAi는 본원에서 다성분 핵산 불활성 효소원(proenzyme)(MNAi)이라고도 불릴수 있는 MNAi를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 MNA 복합체는 MNA자임에 의한 조립 및 촉매 과정에 필요한 성분들 예를 들어, 기질, 조립 촉진자, 안정자 아암 및 파트자임 또는 이들의 성분 중 하나 이상이 결여될 수 있다.
본원에 사용된 "MNA자임(MNAzyme)"이라는 용어는, MNA자임 조립 촉진자(예를 들어, 표적)가 존재할 경우에만 촉매 활성에 의해 기질을 변형시킬 수 있는 활성 핵산 효소 복합체를 형성하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 서열(예를 들어, 파트자임)을 의미한다. 파트자임 A 및 파트자임 B를 포함하는 예시적인 MNA자임을 도 1에 도시하였다. 도 1을 참고로 하였을 때, 파트자임 A 및 B는 각각 (예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍 형성을 통하여) 조립 촉진자와 결합한다. MNA자임은, 파트자임 A 및 B의 센서 아암이 조립 촉진자 상에 각각 인접하여 존재하는 위치에서 혼성화할 때에만 형성된다. MNA자임의 기질 아암은 기질과 결합하고, MNA자임의 촉매 코어에 의해 촉매화되는 변형(예를 들어, 절단)은 파트자임 A 및 B의 촉매성 도메인의 상호 작용에 의해 진행된다. DNA/RNA 키메라 리포터 기질의 절단 과정을 도면에 도시하였다. MNA자임은 형광 단과 소광자 염료 쌍 사이에 있는 기질을 절단하여, 신호를 발생시킨다. 본원에서 "다성분 핵산 효소" 및 "MNA자임"이라는 용어들은 호환되어 사용되고 있으며, 2개의 분자들로 이루어진 2원성 구조, 또는 3개의 핵산 분자들로 이루어진 3원성 구조, 또는 예를 들어, 4개 이상의 핵산 분자에 의해 형성된 기타 다원성 구조를 포함한다.
2개 이상의 분자들을 포함하는 MNA자임의 예를 도 2의 (ii)에 도시하였다. 파트자임은 다수의 성분들 예를 들어, 절두형 센서 아암을 가지는 파트자임 성분과, 안정자 아암 성분(조립 촉진자(도 2의 (ii)) 또는 기질 중 어느 하나와 상호 작용하여 MNA자임 구조를 안정화함)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "MNAi"란 용어는, 촉매 불활성 상태의 MNA 복합체를 의미하는 것으로서, 여기서, 촉매 활성은 본원에 정의된 "활성 억제자"에 의해 억제된다. 바람직한 구체예에서, MNAi는 활성 억제자 올리고뉴클레오티드(예를 들어, MNAi에 대한 예시적인 디자인을 나타내는 도 4 참고)와 결합하므로 촉매 불활성일 수 있다. 예를 들어, MNAi는, 파트자임 A, 파트자임 B, 조립 촉진자 및 활성 억제자가 결합하여 불활성 복합체를 형성할 때 형성될 수 있다. MNAi 구조에 관한 부가 예는 도 9에 도시하였다.
본원에 사용된 "촉매 불활성 MNA 복합체", "불활성 MNA 복합체", "촉매 불활성 MNA" 또는 "불활성 MNA"란 용어는, 촉매 활성 상태로 존재하지 않는, 다성분 핵산 복합체를 의미한다. 하나의 구체예에서, "불활성 MNA 복합체"는, 활성 억제자 올리고뉴클레오티드와 결합하므로 촉매 불활성일 수 있는 MNAi이다. 다른 구체예에서, "불활성 MNA 복합체"는, 촉매 MNA자임 활성에 필요한 성분 중 하나 이상의 성분이 MNA 복합체와 결합하고 있지 않은, 부분적으로 조립된 MNA 복합체 또는 부분적으로 해체된 MNA 복합체이다. 하나의 구체예에서, 반응 환경에 있을 때 MNA자임 활성을 나타내는데 필요한 하나 이상의 성분들이 존재하지 않으면, "불활성 MNA 복합체"가 형성될 수 있다. 다른 구체예에서, 마이크로 환경 예를 들어, 온도는 활성 MNA자임을 구성하는데 필요한 성분 모두가 결합하는 것과 양립할 수 없다. 다른 구체예에서, "불활성 MNA 복합체"는 활성 MNA자임을 구조적으로 형성하는데 필요한 모든 성분들을 포함할 수 있지만, "불활성 MNA 복합체"는, 촉매 작용에 필요한 하나 이상의 필수 성분 예를 들어, 2가 양이온이 존재하지 않으므로, 활성을 갖지 않는다. 다른 구체예에서, 불활성 MNA 복합체는 조립 억제자를 포함하므로 불활성일 수 있다.
본원에 사용된 "분자 스위치" 또는 "스위치"라는 용어는, 입력 이벤트에 반응하여 불활성 복합체에서 활성 복합체로 (또는 그 반대로) 전환될 수 있는 임의의 MNA 복합체를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 불활성 복합체는 촉매 불활성 복합체이다. 촉매 불활성 복합체는 해체된 복합체, 부분 조립된 복합체 또는 MNAi와 같은 복합체들, 또는 조립 촉진자를 가지는 복합체를 포함할 수 있다. 촉매 활성 복합체는 MNA자임일 수 있다.
본원에 사용된 "조립 촉진자 분자", "조립 촉진자", "MNA자임 조립 촉진자 분자", "촉진자(facilitator)", "MNA자임 조립 촉진자" 및 "활성자 조립 촉진자"라는 용어는, 파트자임 성분들이 자가 조립되는 것을 촉진하여, MNA자임의 센서 아암과 상호 작용함으로써 촉매 활성인 MNA자임을 형성할 수 있는 물질을 의미하는 것이다. 바람직한 구체예에서, 조립 촉진자는 MNA자임의 자가 조립에 필요하다. 하나의 구체예에서, 조립 촉진자는, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 "파트자임"의 센서 아암과 짝을 형성할 수 있거나 이와 결합할 수 있는, 하나의 분자 또는 성분(도 1), 또는 그 이상의 분자 또는 성분(도 2의 (i), 도 4∼6 및, 도 9 및 10)을 포함할 수 있다. 조립 촉진자들은 또한 촉매 활성을 가지지 않는 MNA 복합체들 예를 들어, MNAi 및 부분적으로 조립 또는 해체된 MNA 복합체와도 결합할 수 있다.
MNA 복합체의 성분들은 전체적으로 성분에 대해 별도의 기능을 가지는 도메인들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성자 조립 촉진자 도메인은 기타 성분 예를 들어, 활성 억제자 분자 내에 포함될 수 있으며, 이 경우, 상기 도메인은 예를 들어, 절단에 의해 특정 성분으로부터 유리될 때까지 활성 MNA자임 조립에 기여할 수 없는 상태로 존재한다. 본원에 사용된 "활성자 조립 촉진자" 또는 "활성자 조립 촉진자 성분"이란, 일단 다른 성분과 유리될 경우 또는 외부로부터 공급될 경우, 파트자임 성분들의 자가 조립을 촉진하여, MNA자임의 센서 아암과의 상호 작용을 통해 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있는 물질을 의미한다.
조립 촉진자 예를 들어, 활성자 조립 촉진자는 활성 MNA자임의 조립을 제어하거나, 또는 불활성 다성분 핵산 복합체로부터 활성 MNA자임으로의 전환을 촉진하는데 사용될 수 있다. 상기 다성분 핵산 복합체들은, 예를 들어, 활성 억제자가 존재할 경우, 예를 들어, MNAi와 같이 촉매 불활성일 수 있다.
본원에 사용된 "활성자"란, MNA자임을 활성화시키는 임의의 MNA 구조 올리고뉴클레오티드 성분 또는 조정자 올리고뉴클레오티드 성분, 임의의 "분자 효과 인자", "리간드", "표적" 또는 "이벤트"를 의미한다. 활성자 올리고뉴클레오티드로서는 조립 촉진자, 파트자임 또는 이의 구성 성분으로서의 기능을 가지는 올리고뉴클레오티드 예를 들어, 절두형 센서 아암 또는 기질 아암, 그리고 파트자임 안정자 아암 성분을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 활성자는 억제 효과를 나타내는 올리고뉴클레오티드를 제거하여 MNA자임을 활성화할 수 있다. 이와 같은 기작을 통해 활성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 예로서는, 억제자 성분 예를 들어, "활성 억제자" 또는 "조립 억제자"를 치환(제거)할 수 있는 조정자 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구체예에서, "활성자"는 MNA 복합체 성분중 앱타머 도메인과 상호 작용하는 리간드일 수 있으며, 이때, 이와 같은 상호 작용의 결과로써 MNA 복합체가 활성화되는 것이다.
본원에 사용된 "안정자 아암(stabiliser arm)"이란 용어는, 파트자임의 센서 아암에 인접한 위치에서 하나 이상의 조립 촉진자와 상호 작용하여, MNA 복합체 예를 들어, 활성 MNA자임의 조립을 가능하게 할 수 있는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 "표적"이라는 용어에는, 부가의 증폭 단계 예를 들어, MNA자임 증폭 프로토콜 예를 들어, "DNA 이용 신호 캐스케이드" 또는 "SCUD" 반응을 이용하거나 이용하지 않고, 특정 MNA자임에 의해 검출, 동정 또는 정량될 임의의 천연 또는 합성 물질, 구성 성분 또는 분석물을 포함한다. 그러므로, 표적으로서는, 정밀한 검출, 동정 및/또는 정량 방법이 바람직할 경우, 광범위한 검출 가능 물질, 구성 성분 또는 분석물을 포함한다. 몇몇 대표적인 표적으로서는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당 단백질, 지질, 지단백질, 전체 유기체, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 효모, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 표적도 본원에 사용될 수 있다. 상기 표적은 또한 조립 촉진자나 활성자일 수도 있음을 알게될 것이다.
본원에 사용된 "검출 가능 이벤트", 또는 "입력" 또는 "입력 이벤트"로서는, MNA 복합체 예를 들어, MNA자임 및/또는 불활성 MNA 복합체의 마이크로 환경에 일어나는 변화들을 포함한다. 상기 변화는 예를 들어, 온도, 염 농도, 이온 세기, pH 변화, 2가 양이온 존재 또는 부재, 종류 또는 농도, 전기 전하, 자기 전하, 물리적 조작에서의 변화 및, MNA 또는 조정자 성분 또는 마이크로 환경의 성분의 농도에서의 변화, 또는 이들의 임의 조합일 수 있다. 또한, "∼의 농도에서의 변화"란 용어에는, 농도의 증가 또는 감소를 포함할 뿐만 아니라, MNA 복합체 예를 들어, MNA자임 및/또는 불활성 MNA 복합체 예를 들어, MNAi의 마이크로 환경에 이전부터 존재하지 않았거나 검출할 수 없을 정도의 농도로 존재하던 물질이 생성되는 것을 포함한다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
마이크로 환경의 변화는 MNA 복합체의 촉매 활성을 조작하는데 사용될 수 있으므로, 검출 가능 이벤트를 나타내는 물질도 MNA자임의 촉매 활성에 대한 "활성자" 또는 "억제자"로서 사용될 수 있다. 그러므로, 이와 같은 물질들은, 예를 들어, 불활성 MNA 복합체로부터 활성 MNA자임으로의 전환, 또는 그 역순으로의 전환을 촉진함으로써, MNA자임의 촉매 활성을 "스위치-온(switch on)" 또는 "스위치-오프(switch off)"시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이와 같은 물질은 MNA자임의 조립 및 활성화를 촉진한다. 몇몇 구체예에서, 이와 같은 이벤트 또는 물질은 MNA자임의 해체 및 불활성화를 촉진한다. 다른 구체예에서, 이와 같은 이벤트 또는 물질은 MNAi 또는 기타 MNA 복합체의 조립 또는 해체를 유도할 수 있다. 바람직한 구체예에서, MNA자임 촉매 활성의 활성화 과정 또는 불활성화 과정은 가역적이다.
"활성 억제자"란 용어는, MNA 복합체를 구성하는 하나 이상의 성분들과 결합하여, 촉매 불활성 "MNAi"의 조립을 유도할 수 있는 임의의 물질을 의미한다(예를 들어, 도 4∼6 및 도 9∼11 참고). 활성 억제자에 의한 촉매 활성의 억제 과정은, 파트자임과 실질적으로 비-상보성인 "활성 억제자 도메인"("활성 억제자 성분", "억제자 도메인" 또는 "활성 억제자 도메인"이라고도 부름)에 의해 매개될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 활성 억제자는 명백한 기능성 도메인 예를 들어, 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인, 기질 도메인 및/또는 리포터 도메인으로부터 선택된 것들을 임의로 조합한 몇몇 기능성 도메인을 포함할 수 있다. 이와 같은 각각의 구조적 도메인은 활성 억제자 내에 존재하는 명백한 기능성 도메인 몇몇과 공존할 수 있거나 또는 공존할 수 없다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 활성 억제자는 파트자임 성분들과 실질적으로 비-상보성이고, 촉매 활성 MNA자임의 형성에 필요한 2차 구조를 파괴함으로써 억제 효과를 나타내는 활성 억제자 도메인을 포함할 수 있다. 활성 억제자가 존재함으로써, 기질과 상호 작용을 하되 이 기질을 촉매 활성에 의해 변형시키지는 MNAi 복합체의 조립이 유도된다. 몇몇 구체예에서, 활성 억제자는 조립 촉진자 도메인을 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 활성 억제자는, 활성 억제자 내에 존재하는 2개 이상의 도메인들 예를 들어, 활성 억제자 도메인과 활성자 조립 촉진자 도메인 사이에 위치할 수 있는, 불안정 또는 절단 가능한 링커 또는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 기질 또는 링커 위치에서 절단이 진행되면, 활성자 조립 촉진자 도메인으로부터 활성 억제자 도메인이 분리될 수 있으며, 이후, 이 활성자 조립 촉진자 도메인은 조립 촉진자 성분으로서 작용을 하여, 활성 MNA자임의 조립을 유도할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 상기 활성 억제자는 기타 물질과 접합할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 활성 억제자는 고주파 자장에 노출되는 금 나노 입자와 접합하므로, 원거리에서 전기력으로 혼성화가 제어될 수 있다. 이 방법에서, 고주파 자장은, 주위 분자들이 비교적 영향을 덜 받도록 하면서, 특정 올리고뉴클레오티드를 가역적으로 열 변성시킬 수 있는 안테나로서 작용을 하는 것이다. 몇몇 구체예에서, 활성 억제자는 바이오틴으로 표지화되어, 활성 억제자를 포착하는 과정과 이를 물리적으로 분리하는 과정을 촉진할 수 있다.
본원에 사용된 "조립 억제자"란 용어는, 예를 들어, 파트자임 성분 또는 조립 촉진자 또는 기질과의 결합과 같이, 활성 MNA자임 복합체의 필수 성분에 상보적으로 결합하는 과정에 의해 MNA자임 복합체의 조립을 억제하는 성분을 의미한다. 조립 억제자 서열과 제1 MNA자임 복합체 성분의 결합으로 인해서, 조립 억제자와 상기 제1 성분 사이의, 제2 MNA자임 복합체 성분과의 결합에 대한 경쟁이 일어난다. 예를 들어, 상기 조립 억제자는 (기질과 결합하는) 파트자임 기질 아암 또는 (조립 촉진자와 결합하는) 파트자임 센서 아암 중 어느 하나와 결합할 수 있다. 조립 억제자가 상기 기질 아암에 상보성일 때(상보성이어서 이 기질 아암과 결합할 때), 이 조립 억제자는 파트자임에 기질이 결합하는 것에 대해 이 기질과 경쟁을 한다(경쟁하여 차단한다)(도 7). 조립 억제자가 센서 아암에 상보성일 때(상보성이어서 이 센서 아암과 결합할 때), 이 조립 억제자는 파트자임에 조립 촉진자가 결합하는 것에 대해 이 조립 촉진자와 경쟁을 한다(경쟁하여 차단한다). 이러한 방식으로, 조립 억제자는 MNA자임 복합체의 조립을 차단하는 것이다. 조립 억제자 분자는 MNA자임의 조립을 제어하는데 사용될 수 있으며, 또한 이러한 특성을 이용하여, 비-핵산 표적 분석물 및 핵산 표적 분석물 둘 다를 검출하기 위한 기법을 개발할 수도 있다.
본원에 사용된 "기질", "기질 분자" 및 "화학 기질"이라는 용어에는, 분자 예를 들어, MNA 복합체에 의해 인지될 수 있거나, 이와 반응할 수 있거나 또는 이에 의해 화학적으로 변형될 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 기질을 변형시킴으로써, MNA 시스템의 활성을 관찰하기 위한 "출력" 신호 또는 "검출 가능 효과"가 제공된다. 특정 구체예에서, 기질은 효소에 의해 인지 및 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 기질은 촉매성 핵산 분자에 의해 인지 및 변형될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 기질은 MNA자임에 의해 인지 및 변형될 수 있다. 기질의 화학적 변형 여부는, 변형 반응 생성물의 생성 또는 증가, 또는 변형 반응 기질의 소멸 또는 감소에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 "리포터 기질", "리포터 프로브" 또는 "리포터 올리고뉴클레오티드"란, 촉진된 반응과 관련된 생성물의 생성 또는 기질의 소멸 중 어느 하나의 측정을 용이하게 하도록 특별히 채택되는 기질을 의미한다. 리포터 기질은 용액 중에 유리된 상태로 존재할 수 있거나, 아니면 예를 들어, 표면이나 다른 분자에 결합(또는 "고정")되어 존재할 수 있다. 리포터 기질은 다양한 수단 예를 들어, (하나 이상의 부가 성분 예를 들어, 소광자를 포함하거나 포함하지 않는) 형광 단, 방사성 표지, 바이오틴에 의한 표지화(예를 들어, 바이오틴화) 또는 화학 발광 표지 중 임의의 수단에 의해 표지화될 수 있다.
본원에 사용된 "일반적인" 또는 "보편적인" 기질로서는 예를 들어, 각각이 상이한 조립 촉진자를 인지할 수 있는 다수의 MNA자임에 의해 인지되며, 이것에 의해 촉매 활성화되는 리포터 기질과 같은 기질이 있다. 이러한 기질을 사용하면, 전부가 보편적인 기질을 인지하는, 구조적으로 관련된 MNA자임들을 사용하여, 다양한 조립 촉진자들을 검출, 동정 또는 정량하기 위한 개별 검정법의 개발이 촉진된다. 이와 같은 보편적인 기질은 각각 독립적으로 하나 이상의 표지로 표지화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 독립적으로 검출 가능한 표지는 하나 이상의 일반적 기질을 표지화하여 편리한 시스템을 형성시키는데 사용되며, 그 결과, MNA자임을 사용하여 다수의 조립 촉진자들을 독립적으로 또는 동시에 검출할 수 있게 된다. 몇몇 구체예에서, MNA자임에 의해 절단된 기질들은 DNA자임 리가제를 사용하여 재구성 즉, 재활용될 수 있다.
본원에 사용된 "조정자"란 용어는, MNA 시스템의 촉매 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 물질을 의미한다. 조정자는 MNA자임의 활성을 활성화 또는 스위치-온시키는 "활성자"일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 조정자로서는 "억제자" 예를 들어, "조립 억제자" 또는 "활성 억제자"가 있다.
본원에 사용된 "앱타머"는, 하나 이상의 리간드를 인지하는 능력을 가지는 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인지 과정에는, 앱타머의 고 차원적 구조 예를 들어, 3-차원 결합 도메인 또는 포켓과 같은 구조로 인하여, 높은 수준의 특이성이 필요할 수 있다. 그러므로, 앱타머는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당 단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의의 유도체, 부분 또는 조합, 또는 기타 임의의 실체와 결합할 수 있다. 본원에 있어서 바람직한 앱타머는 흡착, 회수 및 재증폭으로 이루어진 반복적 과정에 의해 합성 핵산의 복합 라이브러리로부터 분리될 수 있는, 짧은 단일 사슬 DNA 또는 RNA 올리고머를 포함할 수 있다. 그러므로, 앱타머는 거의 모든 임의의 표적 예를 들어, 소분자 예를 들어, 아미노산, 또는 항생제로부터 단백질 및 핵산 구조물에 이르기까지의 것에 대해 생성될 수 있다. 본 발명에 있어서, 앱타머는 분자 스위치를, 조립 억제자를 포함하는 MNA 시스템으로 구축하는데 사용된다. 활성자 리간드가 존재하면, MNA자임 활성을 스위치-온 시킬 수 있으며(도 7의 우측 도면), 이 활성자 리간드를 제거하면, MNA자임의 활성을 스위치-오프 시킬 수 있다(도 7의 좌측 도면). 또한, 본 발명에 있어서, 앱타머는 핵산 리간드와 비-핵산 리간드의 검출을 촉진하는데 사용되기도 한다. 리간드를 검출하는 방법은 또한, 증폭 캐스케이드 예를 들어, SCUD 증폭 캐스케이드를 촉진하는데 사용될 수도 있다.
본원에 사용된 "파트자임(partzyme)", "성분 파트자임", "파트자임 성분" 및 "성분 올리고뉴클레오티드"란 용어는, 본원에 정의된 MNA자임 조립 촉진자가 존재하는 경우에만 2개 이상이 함께 모여 "MNA자임"을 형성할 수 있는, DNA-함유 올리고뉴클레오티드 또는 RNA-함유 올리고뉴클레오티드, 또는 DNA-RNA-함유 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 임의의 바람직한 구체예에서, 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 구성 파트자임은 다음과 같은 3개의 부위 또는 도메인을 포함할 수 있다: "촉매" 도메인(화학 변형을 촉진하는 촉매 코어의 일부를 형성하는 도메인); "센서 아암" 도메인(조립 촉진자와 회합 및/또는 결합할 수 있는 도메인); 및 "기질 아암" 도메인(기질과 회합 및/또는 결합할 수 있는 도메인). 이와 같은 부위 또는 도메인에 관한 예는, 도 1에 도시되어 있다. 파트자임은 하나 이상의 부가 성분 예를 들어, 앱타머를 포함할 수 있다(본원에서는 이를 "앱타-파트자임"이라 칭함).
본원에 사용된 "전가산기(full adder)"란 용어는, 3개의 2진 입력 데이터를 바탕으로 작동하여, 2개의 유일한 2진 출력 값을 발생시키는 논리 요소를 의미한다. 전가산기 작동 방식은 다음과 같은 규칙을 따른다: i) 임의의 입력 데이터 및 정확히 하나의 입력 데이터가 존재할 경우에는 오로지 제1 출력 값만을 생성함; ii) 임의의 입력 데이터 및 정확히 2개의 입력 데이터가 존재할 경우에는 오로지 제2 출력 값만을 생성함; iii) 정확히 3개의 입력 데이터가 전부 존재할 경우에는 제1 출력 값과 제2 출력 값을 생성함; 그리고 iv) 3개의 입력 데이터 전부가 존재하지 않을 경우에는 출력 값도 생성하지 않음.
본원에 사용된 "캐스케이드"란 용어는, 연속 단계로 진행되는 임의의 연속 과정 또는 작동들을 의미하는 것으로서, 각 단계는 통상적으로 선행 단계의 진행 여부에 의존하여 진행된다. 그러므로, 캐스케이드는 효소에 의한 캐스케이드 또는 임의의 기타 신호 전달 캐스케이드를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 캐스케이드는 MNA자임의 촉매 활성으로 인한 신호의 증폭 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 증폭 캐스케이드는 신호의 반복적이고도 주기적인 증폭 단계를 포함할 수 있는데, 여기서, 제1 MNA자임의 촉매 활성으로 말미암아 제2 MNA자임의 촉매 활성에 필요한 분자를 얻을 수 있게 되고, 또한 부가의 제2 MNA자임의 촉매 활성에 필요한 활성자도 얻을 수 있게 되는 것이다. 몇몇 구체예에서, 상기 필요한 활성자로서는 파트자임, 효소, 조립 촉진자, 기질, 표적, 이것들의 일부 또는 단편 또는 조합체를 포함할 수 있다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 캐스케이드는 가중 효과를 나타낼 수 있으므로, 신호를 검출 가능한 수준으로 발생시켜 소량으로 존재하던 표적을 검출할 수 있게 된다. 기타 구체예에서, 2개 이상의 촉매화 단계가 사용될 수 있다. 캐스케이드는 직렬 방식일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 캐스케이드는 지수적일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 캐스케이드는 활성 억제자의 영향력을 없앰으로써 MNAi를 활성화시키는 과정을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, MNA 복합체 성분은 기타 MNA 복합체 성분을 절단함으로 인해서 생성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, MNA 복합체 성분은 예를 들어, DNA자임 리가제를 사용하여 기타 MNA 복합체 성분을 결찰시킴으로써 생성될 수 있다.
"올리고뉴클레오티드"란 용어는 통상적으로, DNA나 DNA-함유 핵산 분자, 또는 RNA나 RNA-함유 분자의 분절, 또는 이것들의 조합체를 의미하는 것이다. 올리고뉴클레오티드의 예로서는 핵산 표적; 기질 예를 들어, MNA자임 또는 DNA자임에 의해 변형될 수 있는 기질; 프라이머 예를 들어, PCR과 같은 방법에 의한 시험관내 표적 증폭에 사용되는 프라이머; 그리고 MNA 복합체의 성분을 포함한다. 임의의 구체예에서, MNA 복합체 성분들 예를 들어, 조립 촉진자, 조립 억제자, 활성 억제자, 아암 안정자 및/또는 기질은 본원에 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 파트자임은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
"폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 달리 언급되지 않는 한, 임의의 특정 서열과 이에 상보성인 서열에 대한 용어를 포함하는 의미이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 4-아세틸시티딘, 5-(카복시하이드록실메틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디하이드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실큐오신, 2'-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우리딘, 큐오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘, 베타 D-아라비노실 티미딘을 포함하는 군중 하나 이상의 부가 또는 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 뉴클레오티드에 관하여 사용될 때 "유도체"라는 용어에는, 임의의 기능상 동등한 핵산 또는 뉴클레오티드 예를 들어, (예를 들어, 재조합 방법에 의해) 완전히 갖추어져 생성되거나, (예를 들어, 화학적 수단에 의하여) 합성 후 부가되는 임의의 융합 분자가 포함된다. 이러한 융합체로서는, RNA 또는 DNA가 부가되었거나, 또는 폴리펩티드(예를 들어, 퓨로마이신 또는 기타 폴리펩티드), 소분자(예를 들어, 소랄렌) 또는 항체가 접합된, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
핵산이나 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때 "유사체"란 용어에는, DNA 또는 RNA 분자 또는 잔기와 관련된 물리적 구조를 가지는 화합물을 포함하며, 또한 이는 DNA 또는 RNA 잔기 또는 이의 유사체와 수소 결합을 형성할 수 있으나(즉, DNA나 RNA 잔기 또는 이의 유사체와 어닐링되어 염기쌍을 형성할 수 있으나), 이러한 결합은 상기 "유사체"라는 용어에 포함될 상기 화합물에 반드시 필요한 것은 아니다. 이러한 유사체는 이것과 구조적으로 관련되어 있는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기와 상이한 화학적 특성 및 생물학적 특성을 가질 수 있다. 이 유사체의 예로서는 메틸화, 요드화, 브롬화 또는 비이오틴화된 잔기가 있다. 뉴클레오티드 유사체 예를 들어, 데옥시이노신, C-5-이미다졸 데옥시우리딘, 3-(아미노프로피닐)-7-디아자-dATP, 2'-O-메틸 RNA, 2'-O-메틸 캡을 함유하는 활성 DNA자임에 관하여는 문헌[Warashina et al., 1999; Cairns et al., 2003; Schubert et al., 2004; Sidorov et al., 2004]에 기술되어 있다. 기타 유사체도 DNA자임의 촉매 활성을 갖는다. 예를 들어, 하나의 염기를 다른 염기로 치환하거나, 하나의 유사체를 다른 염기로 치환하거나, 또는 당 성분 또는 포스포디에스테르 골격을 변형시킴으로 인한 촉매 핵산 서열의 변형은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 변형은 합성시 이루어질 수 있거나, 아니면, 합성 후 특정 염기를 변형시킴으로써 이루어질 수 있다. 변형 예를 들어, 염기 변이를 도입하거나 또는 염기 유사체를 통합시킨 촉매 핵산을 실험에 의해 테스트함으로써, 변형된 서열 또는 특정 유사체가 촉매 활성에 미치는 영향력을 평가할 수 있다. 염기 A, C, G, T 및 U의 유사체에 관하여는 해당 업계에 공지되어 있으며, 이의 하위 군을 이하 표 1에 나열하였다.
본원에 유용한 뉴클레오티드 유사체의 예
축약어 명칭
ac4c 4-아세틸시티딘
chm5u 5-(카복시하이드록실메틸)우리딘
Cm 2'-O-메틸시티딘
Cmnm5s2u 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘
D 디하이드로우리딘
Fm 2'-O-메틸슈도우리딘
Galq 베타, D-갈락토실큐오신
Gm 2'-O-메틸구아노신
l 이노신
i6a N6-이소펜테닐아데노신
m1a 1-메틸아데노신
m1f 1-메틸슈도우리딘
m1g 1-메틸구아노신
M11 1-메틸이노신
m22g 2,2-디메틸구아노신
m2a 2-메틸아데노신
m2g 2-메틸구아노신
m3c 3-메틸시티딘
m5c 5-메틸시티딘
m6a N6-메틸아데노신
m7g 7-메틸구아노신
mam5u 5-메틸아미노메틸우리딘
mam5s2u 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘
Manq 베타, D-만노실메틸우리딘
mcm5s2u 5-메톡시카보닐메틸우리딘
Mo5u 5-메톡시우리딘
Ms2i6a 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신
Ms2t6a N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌
Mt6a N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌
Mv 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르
o5u 우리딘-5-옥시아세트산 (v)
Osyw 와이부톡소신
P 슈도우리딘
Q 큐오신
s2c 2-티오시티딘
s2t 5-메틸-2-티오우리딘
s2u 2-티오우리딘
s4u 4-티오우리딘
T 5-메틸우리딘
t6a N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌
tm 2'-O-메틸-5-메틸우리딘
Um 2'-O-메틸우리딘
Yw 와이부토신
X 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, (acp3)u
AraU 베타 D-아리비노실우리딘
AraT 베타 D-아라비노실티미딘
본원에 사용된 "엄중도"란 용어는, 2개의 핵산이 혼성화될 수 있는 조건을 의미하는 것으로서, 예를 들어, 용액 중 염 및/또는 세제의 농도, 2개의 핵산이 혼성화될 때 사용되는 용액의 온도, 그리고 혼성화 시간을 포함할 수 있다. 그러므로, 본원에 사용된 "고도의 엄중도"라는 용어는, 이러한 핵산이 고도의 상보성을 공유하는 경우에만 2개 핵산의 혼성화를 유도하는 용액 중의 조건을 의미한다. 상보성 정도로서는 일정 범위 즉, 약 50∼100%를 포함할 수 있다. 그러므로, "고도의 엄중도" 조건으로서는, 예를 들어, 광범위한 온도를 적용시키고, 세제, 염 및 2가 양이온을 다양한 농도로 포함하는 완충액을 사용하는 경우를 포함할 수 있다.
본원의 명세서 전반을 통하여 다음과 같은 약어가 사용되고 있다:
MNA: 다성분 핵산 또는 다원성 핵산;
MNA 복합체: 다성분 핵산 복합체 또는 다원성 핵산 복합체;
MNA자임: 다성분 핵산 효소 또는 다원성 핵산 효소;
MNAi: 다성분 핵산 불활성 효소원 복합체, 또는 다원성 핵산 불활성 효소원 복합체;
DNA자임: 데옥시리보핵산 효소;
PCR: 중합 효소 연쇄 반응;
LCR: 리가제 연쇄 반응;
LNA: 차단 핵산;
PNA: 펩티드 핵산;
An: 분석물 또는 표적;
F: 형광단;
Q: 소광자;
FAM 또는 6- FAM : 6-카복시플루오레세인;
BHQ1: 블랙홀 소광자 1;
BHQ2: 블랙홀 소광자 2;
shRNA: 짧은 헤어핀 RNA
siRNA: 짧은 간섭 RNA
mRNA: 메신저 RNA
tRNA: 운반 RNA
snoRNA: 소형 인 RNA
stRNA: 소형 임시 RNA
smRNA: 소형 조정 RNA
프리-microRNA: 전구체 마이크로RNA
프라이-microRNA: 1차 마이크로RNA
SCUD: DNA를 이용하는 신호 캐스케이드
TASC: 표적-보조 자가 절단
RIF: 리포터-억제자-촉진자
RI: 리포터-억제자 도메인
GTP: 구아노신 5'-트리포스페이트
CTP: 시토신 5'-트리포스페이트
dATP: 데옥시아데노신 5'-트리포스페이트
ATP: 아데노신 5'-트리포스페이트
LP: 결찰 생성물
CP: 절단 생성물
올리고: 올리고뉴클레오티드
예시적 구체예에 대한 상세한 설명
본원에 제공된 도면과 실시예들은 본 발명과 다양한 변형예를 예시하기 위한 것이지 이것들을 한정하기 위한 것은 아니라는 사실을 이해해야 할 것이다.
본 발명에 따르면, 조성물, 방법 및 키트는 MNA 복합체를 조정하기 위해 제공된다. 본 발명의 방법은 일반적으로, 조립 촉진자가 존재할 때 자가 조립되어 촉매 활성 또는 촉매 불활성 핵산 복합체를 형성하는 다수의 핵산 성분에 의해 바람직하게 형성되는, 다성분 또는 다원성 핵산 복합체를 포함하는 조성물을 사용하는 단계를 포함한다.
본 발명에 의하면, 표적 증폭 여부를 검출하는 결합 MNA자임 검출법(예를 들어, PCR)에 대한 대안으로서는, 바람직하게는 오로지 핵산 효소만을 이용하는 신호 증폭법과 이와 같은 결합 MNA자임 검출법을 연계시키는 방법이 있다. 이와 같은 신호 캐스케이드 반응은 표적 증폭 기술 예를 들어, PCR을 대체할 수 있었다. 또한, 임의의 단백질 효소를 필요로 하지 않아서 저비용으로 제조할 수 있으며, 유통 기한도 연장된 진단 프로토콜을 개발할 수 있다.
본 발명에 따라서, MNA자임은 반드시 사용하고, DNA자임은 사용하거나 사용하지 않는 신호 캐스케이드를 활용한 몇몇 기법을 개발하게 되었다.
1. 조성물 - MNA자임 및 불활성 MNA 복합체
다성분 핵산 효소(Multi-component Nucleic Acid enzyme)(본원에서는 다원성 핵산 효소(multipartite nucleic acid enzyme) 또는 "MNA자임"이라고도 칭함)에 관하여는, 미국 특허 출원 제60/726,291호(2005년 10월 13일) 및 동 제60/724,567호(2005년 10월 7일) 그리고 국제 특허 출원 PCT/AU2006/001473에 상세히 기술되어 있으며, 그 내용들은 모두 본원에 참고용으로 인용되어 있다. 본원에 정의된 바와 같이, MNA자임은 MNA 복합체 군이다. MNA자임은 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분들(본원에서는 파트자임이라고도 칭함)로부터 자가 조립될 수 있다. 상기 파트자임 올리고뉴클레오티드는 조립 촉진자가 존재할 때 자가 조립되어 MNA 복합체를 형성한다. 그러므로, MNA자임은 촉매 활성인 MNA 복합체이다. 몇몇 구체예에서, MNA자임의 존재 여부를 확인할 수 있는데, 이 MNA자임은 표적이 존재할 때에만 형성되므로, 이 MNA자임이 존재한다는 것은 곧, 표적이 존재한다는 지표가 된다[이때, 상기 표적은 조립 촉진자를 포함함]. 전술한 기본 원리들을 바탕으로 하는 다양한 검정법이 본원에 제공되어 있다. MNA자임을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 다양한 서열로 이루어진 MNA자임을 포함하는 조성물도 본원에 제공되어 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진자 또는 기질 중 하나 이상은 또한, 활성자나 표적과 결합할 수 있는 앱타머를 포함할 수 있다.
MNA자임에 관한 예시적인 디자인을 도 1에 도시하였다. 조립 촉진자 분자는, 조정 작용에 쉽게 영향을 받는 고도의 특이적 방식으로, 파트자임 성분들의 조립을 유도하는 "입력" 신호를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 조립 촉진자는 예를 들어, 테스트 시료 중에 존재하는 표적 핵산 서열일 수 있다. 기타 구체예에서, 상기 조립 촉진자는 예를 들어, 검출 가능한 물질 또는 이벤트가 존재 또는 발생하는 가운데 파트자임 성분들의 자가 조립을 유도할 때 관여하는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 조립된 MNA자임으로 기질을 변형시키면, 검출 및/또는 정량될 수 있는 "출력" 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 기질이 형광 단(F) 및 소광자(Q)로 이중 표지화될 때, 활성 MNA자임으로 기질을 절단하면 형광 단과 소광 인자가 분리되고, 이에 따라서, 형광도가 증가하게 된다.
전술한 MNA자임은 표적 분석물을 검출, 동정 및 정량하기 위한 것으로 간주하였다. 본 발명에는 MNA 복합체와 관련된 새로운 방법, 조성물 및 용도에 관하여 기술되어 있다. 본 발명에는 촉매 활성이 결여된 대안적 구조물 예를 들어, 해체되었거나 또는 부분 조립된 복합체를 형성함으로써, MNA자임의 활성을 조정하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 성분들을 제공하는 새로운 조성물에 관하여 기술되어 있다. 본 발명에는 또한, 적당한 조건 하에서는 활성 MNA자임으로 조립될 수 있지만, "활성 억제자"와 함께 조립될 때에 촉매 불활성인 복합체를 형성하는, 올리고뉴클레오티드 성분들을 포함하는 불활성 MNA 복합체 예를 들어, MNAi에 관하여도 기술되어 있다. 이와 같은 불활성 MNA 복합체를 본원에서 "MNAi"로 정의하며, 이러한 불활성은 활성 억제자에 의한 억제 영향력으로 인한 결과일 수 있다. MNAi는 파트자임 성분들의 기질 아암을 통하여 기질과 상호 작용할 수 있지만, 이 기질을 촉매 활성에 의해 변형시킬 수는 없다.
활성 억제자는 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 활성 억제자는 활성자 조립 촉진자 도메인과 활성 억제자 도메인을 포함할 수 있다. 활성 억제자는 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인 그리고 리포터 도메인을 포함할 수 있다. 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인, 기질 도메인 그리고 리포터 도메인 중 2개 이상은 활성 억제자의 각 도메인 상에 위치할 수 있다. 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 그리고 이 활성 억제자의 리포터 도메인 중 2개 이상은 불안정한 링커 또는 절단 가능 기질에 의해 결합할 수 있다.
활성 억제자 도메인은 하나 이상의 MNA 복합체 예를 들어, 파트자임과 실질적으로 비-상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
기질은 하나 이상의 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인 그리고 리포터 도메인 또는 이의 임의의 조합체를 포함할 수 있다.
활성 억제자는 하나 이상의 조립 억제자를 추가로 포함할 수 있다.
조립 촉진자 도메인은 활성자 조립 촉진자 도메인일 수 있다. 활성 억제자는 또한, 활성자 조립 촉진자 도메인과 활성 억제자 도메인을 포함할 수도 있다. 이와 같은 시나리오는 도 4에 도시한 바와 같은 활성 억제자에 의해 설명된다. 활성 억제자는 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인 및 리포터 도메인 예를 들어, RIF 분자(도 6 참고)를 포함할 수 있다. RIF 분자의 경우, 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 그리고 리포터 도메인 중 2개 이상은 활성 억제자의 각 도메인들 상에 위치할 수 있다.
도 6에 도시된 RIF 분자를 참고할 경우, 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 그리고 리포터 도메인 중 2개 이상은 불안정한 링커 또는 절단 가능 기질에 의해 결합한다.
본 발명에는 또한, 본원에 정의된 바와 같은 특정 이벤트 예를 들어, 활성자 예를 들어, 조립 촉진자의 존재, 또는 매개 변수의 변화 예를 들어, 온도, 파장, 압력, 염 농도, 세제 농도, 양이온 농도의 변화 또는 기타 매개 변수의 변화와 같은 이벤트들이 발생할 때, 촉매 활성을 억제하는 효과가 소멸할 수 있다고 기술되어 있다. 뿐만 아니라, MNA 성분들 예를 들어, 활성 억제자는, 물리적 수단에 의한 제거 작용을 촉진하는 부가의 물질들 예를 들어, 부착된 핵산, 나노 입자, 마이크로 입자, 단백질, 항체, RNA, DNA, 핵산 유사체, 바이오틴 기, 당 단백질, 지단백질, 펩티드 핵산, 차단 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 고 주파 부분 또는 이의 임의의 조합체를 통합할 수 있다. 촉매 불활성 MNA 복합체는 "오프(off)" 상태를 나타내는 반면에, 촉매 활성 MNA자임은 "온(on)" 상태를 나타낸다.
활성자는 활성 상태를 직접적으로나 간접적으로 유도할 수 있다. 예를 들어, 조립 촉진자 성분(활성자)이 파트자임과 상호 작용할 때 활성 상태가 직접 유도될 수 있다. 예를 들어, 억제자 도메인을 포함하는 활성 억제자 중 억제자 도메인과 조립 촉진자 도메인이 방출됨으로 인하여, 억제자가 활성 억제자를 제거하도록 만드는 제제를 활성자가 포함하거나, 또는 활성자가 이 제제로 이루어진 경우, 예를 들어, 하나 이상의 중간 물질의 작용(들)을 통하여 활성 MNA자임 상태가 간접적으로 유도될 수 있다. 다른 구체예에서, 활성자는 조립 억제자를 제거한다.
바람직한 구체예에서, MNA 복합체 예를 들어, MNA자임 및 불활성 MNA 복합체는 하나 이상의 DNA자임 및/또는 리보자임을 주성분으로 한다. MNA자임과 불활성 MNA 복합체의 더욱 바람직한 파트자임 성분들은 특정 DNA자임 구조를 바탕으로 한다. 본 발명에 있어서 바람직한 구조물은 DNA자임 예를 들어, 10:23 DNA자임 및 8:17 DNA자임을 주성분으로 한다. 다양한 구체예에서, MNA자임 및 불활성 MNA 복합체는 리보뉴클레오티드 염기 및 데옥시리보뉴클레오티드 염기 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, MNA자임 복합체 예를 들어, MNA자임 및 불활성 MNA 복합체는 최소한 부분적으로나마 DNA자임의 구조를 바탕으로 한다. 기타 바람직한 구체예에서, MNA 복합체 예를 들어, MNA자임과 불활성 MNA 복합체는 적어도 몇몇 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, MNA자임 및/또는 불활성 MNA 복합체로 조립된 파트자임의 촉매 코어 부분은 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체를 포함한다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체는 MNA자임에 의한 기질의 촉매화에 관여한다. 기타 구체예에서, 촉매 코어에 있는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체는 MNA자임의 촉매 활성을 개선한다. 또 다른 구체예에서, MNA자임의 촉매 코어에 있는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체의 촉매화가 측정 가능한 속도로 진행되는데 필요한 조건은, 일단, 활성 억제자의 억제력을 없앨 경우, 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하지 않는 상당 MNA자임의 경우에 비하여, 매우 엄격하다.
본원에 제공된 바와 같이, MNA 복합체 예를 들어, MNA자임 및 불활성 MNA 복합체는 당업자에게 널리 공지되어 있는, 하나 이상의 치환(체) 예를 들어, 유사체, 유도체, 변형 또는 변이된 염기, 리보뉴클레오티드, 당이나 인산 골격의 변형, 다양한 결실, 삽입, 치환, 중복 또는 기타 변형, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 변형, 치환, 결실 또는 삽입 등은 본원에 기술된 바와 같이, 센서 아암 및/또는 기질 아암 및/또는 촉매 코어 부분에서 일어날 수 있으므로, 분자는 촉매 활성을 보유 채로 유지된다. 기질이나 조립 촉진자에 결합하는 아암에 대한 치환 및 변형은 널리 관용될 수 있으며, 실제로는, 분자를 상이한 기질/조립 촉진자로 조작할 수 있는 기초가 된다. 예를 들어, 센서 아암이 변형되면 상이한 조립 촉진자로 조작될 수 있는 반면에, 기질 아암이 변형되면 상이한 기질로 조작될 수 있을 것이다. 다수의 일반적인 기질을 분석하면 다수의 "출력" 신호를 동시에 관찰할 수 있다.
임의의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하거나 또는 임의의 변형/치환 등의 방법에 의해 데옥시리보뉴클레오티드로부터 유도되는, 촉매 활성을 가지는 MNA자임에 관한 것이다. 일반적으로, 전체 분자를 예를 들어, 리보뉴클레오티드로 치환하면, 이 분자는 불활성화되는데, 그 이유는 분자의 활성이 어떤 중요한 데옥시리보뉴클레오티드에 미치는 활성에 의존적이기 때문이다. 이와 유사하게, 리보자임 내에 존재하는 몇몇 리보뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드로 치환될 수 있지만, 전체 분자를 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드로 치환하면 이 분자도 불활성화될 것이다.
당업자는 MNA 복합체 예를 들어, MNA자임 및 불활성 MNA 복합체가 데옥시리보뉴클레오티드나 리보뉴클레오티드, 또는 둘 다를 포함한다는 사실을 알 것이다. 하나 이상, 더욱 바람직하게는 모든 데옥시리보뉴클레오티드 구성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 MNA자임 및 불활성 MNA 복합체가 본 발명에 있어서 바람직하다. 또한, 파트자임 포함 MNA자임 및/또는 불활성 MNA 복합체의 부분 촉매 코어 중 하나 이상의 내부에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체를 포함하는 MNA자임 및 불활성 MNA도 바람직하다. 이러한 염기가 MNA자임의 촉매 활성에 필수적인 구체예가 더욱 바람직하다.
임의의 바람직한 구체예에서, MNA 복합체의 하나 이상의 성분은 임의의 조건 하에서 헤어핀 구조(hairpin structure)를 형성할 수 있는 자기 상보성 부위를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 자기 상보성 부위는 파트자임 센서 아암 중 어느 하나 또는 둘 다에 위치할 수 있다. 다른 구체예에서, 자기 상보성 부위는 파트자임 기질 아암 중 어느 하나 또는 둘 다에 위치할 수 있다. 다른 구체예에서, 자기 상보성 부위 또는 부위들은 조립 촉진자, 조립 억제자 또는 활성 억제자 성분 또는 이들의 임의의 조합체에 존재할 수 있다. 기타 구체예에서, MNA 복합체는 자기 상보성 부위를 함유하는 기질과 결합할 수 있다.
당업자는 또한, 다원성 DNA자임이 다원성 리보자임에 비하여, 예를 들어, 안정성과 사용의 용이함에 있어서 더욱 유리하다는 사실을 알 것이다. 또한, 임의의 구체예에서, MNA자임은 오로지 하나의 기질만을 인지할 수 있는 단일 분자 핵산 효소 예를 들어, DNA자임에 비하여 유리한 반면에, 단일 MNA자임(및/또는 불활성 MNA 복합체)은 2개의 분자들 즉, 조립 촉진자 및 기질을 인지할 수 있다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, MNA자임의 이와 같은 특성들은, "입력" 신호를 "판독"하여, "출력" 신호를 "기록"할 수 있는 성분들이 필요한 시스템 예를 들어, 논리 게이트(logic gate)를 사용하는 시스템에서 상기 MNA자임이 유용하게 사용될 수 있도록 만들어준다. 이와 같은 MNA자임의 특성은 정보의 변환 능력 예를 들어, 입력 신호를 받아들여 적당한 출력 반응을 나타내는 능력을 제공한다.
2. MNA 복합체의 촉매 활성을 조절하는 방법 및 이의 이용 분야
MNA 복합체의 조립 및 해체는 마이크로 환경의 변화에 의해 제어될 수 있다. 이와 같은 변화의 예로서는, 온도, 2가 양이온의 종류 및 농도, 염 농도, pH, 부가물 및 활성 MNA자임의 조립 및/또는 활성에 필수적인 중요 성분들의 존부를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
조립된 MNA자임은 "온" 상태를 나타내는 반면에, 이의 해체 또는 부분적으로 조립된 성분들은 "오프" 상태를 나타낸다. 조립 및 해체 여부는 온도에 의해 제어될 수 있다. "온" 상태는 MNA자임의 조립 및 촉매 활성 둘 다와 양립할 수 있는 범위 내의 온도로 온도를 변화시킴으로써 유도될 수 있다. 이와는 반대로, 상기 "오프" 상태는 MNA자임의 조립 및/또는 촉매 활성 중 어느 하나와 양립할 수 있는 범위 외의 온도로 온도를 변화시킴으로써 유도될 수 있다. MNA 복합체 성분들의 용융 온도는 제한된 온도 범위 내에서만 조립될 수 있는 정도로 맞출 수 있다. 본 발명의 측면에 특히 유용한 올리고뉴클레오티드로서는, 안정자 아암 성분, 절두형 센서 아암을 포함하는 파트자임 성분, 조립 촉진자 성분들 및/또는 조정자 올리고뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기본 디자인(도 1)을 이루는 성분들이 더욱 작은 구성 서브 유닛이나 부분들 예를 들어, 절두형 센서 아암 또는 안정자 아암 부분(도 2에 도시함)과, 용융점, 서열 구성 및 상보성과 관련하여 조작될 수 있거나, 다른 구성 올리고뉴클레오티드는 포함하지 않는 서열들로 쪼개졌을 때, MNA 복합체의 가요성(flexibility)은 많이 증가하게 된다. 도 2를 참고하였을 때, 당업자는, 절두형 파트자임 아암은 다음과 같은 것들 중 임의의 것일 수 있음을 알게될 것이다; 파트자임 A 센서 아암, 파트자임 B 센서 아암(도 2에 도시함), 파트자임 A 기질 아암 또는 파트자임 B 기질 아암 또는 이것들의 조합체.
온도에 대한 MNA자임의 감수성은 온도-센서 및 가감 저항기를 제작하는데 이용될 수 있다. 만일 온도가 구성 올리고뉴클레오티드의 조립(혼성화) 및/또는 촉매 활성을 나타내는데 있어서 너무 높거나 너무 낮으면, MNA자임 기질은 변형(예를 들어, 절단)되지 않을 것이다. 만일 온도가 MNA자임 활성을 허용하면, 기질은 변형되고 신호가 발생할 것이다. 온도가, MNA자임 활성과 양립할 수 없는 온도에서부터 MNA자임 활성과 양립할 수 있는 온도로 상승 또는 하강하는지 여부는, MNA자임에 의한 기질 변형 이후에 발생하는 신호에 의해 확인될 것이다. 그러므로, MNA자임은 온도 변화를 검출할 수 있는 기구가 될 수 있는 것이다. 당업자는, 온도를 감지하기 위하여 MNA자임을 이용하는 간단한 기구에 관한 본 발명이 다수의 산업 분야 예를 들어, 제약, 식품 및 농업 분야에 활용될 수 있음을 알게될 것이다.
다른 구체예에서, 자기력은 양이온 농도를 조절할 수 있으므로, MNA자임 활성을 "온" 상태 및 "오프" 상태로 조정하는 스위치를 제공할 수 있다. 양으로 하전된 양이온은 몇몇 MNA자임이 촉매 활성을 나타내는데 필요하다. 대안적으로, 자기력은 양으로 하전된 양이온 예를 들어, Mg2+로부터 음으로 하전된 파트자임 성분들을 물리적으로 격리시킴으로써, MNA자임의 활성을 스위치-오프시킬 수 있었다. 이후, 파트자임과 양이온을 다시 접촉시킴으로써 MNA자임을 다시 스위치-온시킬 수 있었다.
몇몇 구체예에서, 활성의 "온" 상태(MNA자임)는 활성과 양립할 수 있는 범위 내의 pH를 적용하여 유도할 수 있다. 이와는 반대로, "오프" 상태는 활성과 양립할 수 있는 범위 외의 pH를 적용하여 유도할 수 있다. pH는 불안정한 서열의 가수 분해를 유도함으로써 MNA 복합체의 활성을 제어하여, MNA자임 및/또는 불활성 MNA 복합체의 새로운 성분을 생성 또는 파괴하는데에도 사용될 수 있다.
MNA 복합체의 임의의 성분의 존부는 "온" 스위치 또는 "오프" 스위치 중 어느 하나를 제공할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 서열, 용융 온도 및/또는 농도를 변경함으로써 더욱 미세한 조절이 가능하다. MNA 복합체로 조립될 수 있는 성분들 예를 들어, 2부분 조립 촉진자 및/또는 2부분 파트자임 성분(절두형 센서 도메인과 안정자 아암을 포함함)을 다양하게 디자인함으로써, 혼성화가 허용될 수 있는 조건을 조작(미세 변조)하여 MNA 복합체 조립을 가능하게 할 수 있는 시스템에 융통성을 제공할 수 있다. 뿐만 아니라, MNA 복합체 내에서의 혼성화 세기와 특이 올리고뉴클레오티드의 결합 엄중도는, 다수의 인자들 예를 들어, 염 농도, 양이온 농도, 온도 및 부가물(예를 들어, DMSO)의 존부에 의해 영향을 받는다. 그러므로, 혼성화에 영향을 주는 물질들은 활성 MNA자임과 불활성 MNA를 포함하는 MNA 복합체의 조립 및 해체를 제어하는 도구를 제공할 수 있다.
성분들의 물리적 조작은 예를 들어, 부착된 부분들의 분자 "훅(hook)"으로서의 물리적 특성을 이용하고/이용하거나, 올리고뉴클레오티드의 고유 특성 예를 들어, 음 전하, 또는 서열 상보성을 이용함으로써 이루어질 수 있다. 다른 구체예에서, 부착된 부분은 올리고뉴클레오티드가 예를 들어, 바이오틴 기를 이용하여 선택적으로 포착될 수 있도록 한다. 다른 구체예에서, 상기 부분은 전기력에 의한 혼성화의 원거리 제어를 촉진하는 고 주파 자기장 방사선에 노출된다. 이와 같은 기술은, MNA 복합체 내에 존재하는 특정 올리고뉴클레오티드를 의도적으로 열 변성시켜, 구성 분자 자체가 활성자 서열인지 아니면 억제자 서열인지 여부에 따라서 효소 활성을 활성화 또는 억제함으로써, 구성 분자들을 선택적으로 제거할 수 있도록 디자인된다. 예를 들어, 활성 억제자는 MNAi 복합체로부터 선택적으로 변성되어, 이 복합체가 활성 MNA자임 상태로 전환되도록 만들 수 있다.
활성자 분자 또는 억제자 분자의 영향력을 소멸시켜, 활성 MNA자임 및 불활성 MNA 복합체의 조립 및 해체 과정을 촉진하기 위한 기타 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 말단부에서 일어나는 2개의 올리고뉴클레오티드간 혼성화는 DNA 분지 이동(DNA branch migration)을 유발하여 이중 사슬 핵산의 부위들을 풀어주는 역할을 할 수 있다. 하나의 구체예에서, 활성 억제자는, 분지 쇄가 이동함에 따라서 기능을 발휘하는 조정자 올리고뉴클레오티드에 의해, MNAi 복합체로부터 제거될 수 있다.
다른 구체예에서, 상보성 올리고뉴클레오티드는, 기타 성분들과의 경쟁에서 이김으로써, 올리고뉴클레오티드 성분들을 스위치 "오프"시키거나, 이 성분들의 기능을 중지시키는데 사용될 수 있는데, 이 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 성분들은 활성화 MNA 복합체(MNA자임) 또는 불활성화 MNA 복합체 예를 들어, MNAi 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 이러한 방법에 의하여 억제된 성분들은 MNA자임 또는 불활성 MNA 복합체의 활성자 성분 또는 억제자 성분을 포함할 수 있다.
활성자 조립 촉진자 도메인을 제거하거나 그 기능을 억제함으로써, 촉매 활성 MNA자임을 불활성 MNA 복합체 예를 들어, MNAi로 전환할 수 있다. 활성자 조립 촉진자 도메인을 제거하는 과정은, MNA자임으로부터 활성자 조립 촉진자 도메인과 활성 억제자를 치환하는 단계를 포함할 수 있다.
당업자는 본원에 제공된 다양한 방법들이, 하나의 반응이나 검정법에서 하나의 MNA 복합체 또는 다수의 MNA 복합체의 조립 또는 활성을 조정하는데 일반적으로 사용될 수 있음을 알게될 것이다.
3. 본 발명의 조성물의 분자 스위치로서의 용도
당업자는, 본 발명이, 본원에서 고려되는 분야에서 분자 차원의 "스위치" 또는 생물학적 "스위치"와 동등하게 취급될 수 있음을 알게될 것이며 또한 이해할 것이다. MNA자임 활성에 대한 스위치-온 및 스위치-오프 기작의 예를 이하 표 2에 나열하였다.
활성 및 불활성 MNA 상태 및 이 2가지 상태 간 스위칭 기작
유형 "온" 활성 상태 " 오프 " 불활성 상태 활성 상태와 불활성 상태 사이의 전환을 유도할 수 있는 기작의 예
MNA자임 복합체의 조립 및 해체 완전 조립됨 완전 또는 부분 해체됨 온도는 조립체를 물리적으로 제거하는 것 또는 성분들을 부가하는 것과 양립할 수 있거나 또는 양립할 수 없음
앱타-MNA자임 복합체 (조립 억제자 포함) 활성자 리간드가 존재함 활성자 리간드가 존재하지 않음 활성자 리간드는 조립 억제자를 제거함으로써 스위치를 제공함
조립 억제자가 제거됨 조립 억제자가 제공됨 예를 들어, 분지 쇄의 이동에 의한 조립 억제자의 제거, 치환 또는 변형
대안적 MNA 복합체 구조 MNA자임 MNAi 예를 들어, 분지 쇄의 이동 또는 절단에 의한 활성 억제자의 제거, 치환 또는 변형
촉매 억제 MNA자임 + 양이온 (예를 들어, Mg2 +) MNA자임 - 양이온 (예를 들어, Mg2 +) 예를 들어, 자기력을 이용하여, 음으로 하전된 DNA MNA 성분으로부터 양이온을 분리함
본 관점에서, 다성분 핵산 복합체를 구성하는 임의의 성분의 존부는 "활성자" 또는 "온" 스위치 중 어느 하나를 제공할 수 있거나, 또는 억제 "오프" 스위치를 제공할 수 있다.
몇몇 구체예에서는, 안정자 아암이 존재하거나 부가되면 "온" 스위치를 제공할 수 있다. 하나의 구체예에서는, 예를 들어, 활성 억제자 또는 임의의 기타 MNA 성분을 절단함으로써, 반응시 시스템 중에 새로운 안정자 아암이 생성될 수 있다. 기타 구체예에서, 안정자 아암의 부재, 변형 또는 제거를 통하여 "오프" 스위치를 제공할 수 있다.
몇몇 구체예에서는, 조립 촉진자, 또는 이의 성분이 존재하면 "온" 스위치를 제공할 수 있다. 몇몇 구체예에서는, MNA 복합체 성분들을 MNA자임으로 절단함으로써, 예를 들어, SCUD중 활성 억제자를 절단하거나, 또는 반응 중에 제공되는 기타 성분들을 변형함으로써, 새로운 조립 촉진자가 생성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 조립 촉진자는 서열 내에서 암호화된 특정 "입력" 신호 시스템을 제공할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 조립 촉진자는 인지 또는 "판독"될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 파트자임 센서 아암은 하나 이상의 단일 염기들만큼 차이가 있는 서열들을 포함하는 조립 촉진자 서열들을 "판독"할 수 있다. 기타 구체예에서, 조립 촉진자 또는 이의 성분이 존재하지 않거나 이를 제거할 경우, "오프" 스위치를 제공할 수 있다.
몇몇 구체예에서, MNA 복합체를 구성하는 성분들은 반응 환경에 존재하는 성분들을 결찰함으로써 생성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 파트자임은 올리고뉴클레오티드들을 결찰시켜 새로운 파트자임 성분을 생성함으로써 형성되는데, 여기서, 상기 새로운 파트자임 성분은 서로 결합하여 예를 들어, 활성 MNA자임을 형성할 수 있는 것이다. 몇몇 구체예에서, 조립 촉진자는, 올리고뉴클레오티드들을 결찰시켜 새로운 조립 촉진자 성분을 생성함으로써 형성되는데, 여기서, 상기 새로운 조립 촉진자 성분은 MNA 복합체의 조립을 촉진할 수 있는 것이다.
활성화 상태(MNA자임) 및 불활성화 상태(불활성 MNA) 사이에 변화를 줌으로써, 활성 형태 및 불활성 형태 간 교대에 의해 조절될 수 있는 분자 스위치를 형성하는 기작을 제공할 수 있다. 이와 같은 분자 스위치는 예를 들어, 핵산 복제 캐스케이드의 제어, 또는 자율 치료, 진단 및 분자 차원의 전산 기구의 조절에 적용될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 MNA자임 조립 촉진자 분자의 존재 하에 자가 조립하여 MNAi를 형성하는, 자가 조립 MNAi 복합체 성분들을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이 경우, 하나 이상의 조립 촉진자 분자는 활성 억제자를 포함한다.
본 발명은 도면들을 참고로 하였을 때 더욱 쉽게 이해할 수 있다. 도 1에는 조립 촉진자를 이용하여 MNA자임을 조립하는 기본적인 방법의 예가 도시되어 있다. 더욱 구체적으로는, 각각 (i) 센서 아암 부분, (ii) 기질 아암 부분, 그리고 (iii) 촉매 코어 부분을 포함하는 파트자임 A와 파트자임 B가 도 1에 도시되어 있다. 조립 촉진자의 존재 하에서, 파트자임 A와 파트자임 B의 센서 아암 부분은 조립 촉진자의 상보성 부분들 예를 들어, DNA 또는 RNA 서열과 혼성화되어 염기 쌍을 형성할 수 있다. 이러한 방식으로 조립 촉진자와 접촉하게 되면, MNA자임은 자가 조립하여, 기질 아암에 의해 결합되어 있는 기질을 변형시킬 수 있는 촉매 코어를 형성하게 된다. 바람직하게, MNA자임의 존재 여부는 이것의 촉매 활성의 검출 또는 측정을 통하여 확인된다. 이와 같이 조립된 MNA자임의 기질 아암은, 기질 아암과 기질 상에 존재하는 상보성 서열들의 상호 작용을 통하여, 기질 예를 들어, 도 1에 도시한 바와 같은 리포터 기질과 결합할 수 있다. 일단 기질이 기질 아암과 결합하게 되면, 촉매 코어는 이 기질의 변형(예를 들어, 절단)을 촉진할 수 있으며, 이후 이 기질의 변형 여부는 직접적으로 또는 간접적으로 검출 또는 확인될 수 있다. 대안적으로, MNA자임은 다양한 방법을 이용하여, 조립(스위치-온) 및 해체(스위치-오프)될 수 있다.
도 2에는, 활성 MNA자임에 대한 부가의 예시적인 디자인이 도시되어 있다. 하나의 MNA자임에 대한 예시적인 구조를 패널 (i)에 도시하였으며, 여기서, 다수의 조립 촉진자 성분들은 MNA자임을 형성하는데 필요한 성분들이다. 이와 같은 디자인에서, 하나의 조립 촉진자 성분(F1)은 파트자임 A 및 파트자임 B 둘 다의 센서 아암 부위에 상보성인 반면에, 제2의 조립 촉진자 성분(F2)은, 오로지 파트자임 B(도 2의 (i) 참고) 또는 오로지 파트자임 A와만 상보성이다. 상기 2개의 조립 촉진자 성분들은 함께 기질을 변형(예를 들어, 절단)할 수 있는 활성 MNA자임의 조립을 유도한다. 도 9(좌측 구조)에는 MNA자임의 조립을 위한 촉진자에 관한 기타 디자인이 도시되어 있다.
도 2의 패널 (ii)에는, 조립 촉진자의 존재 하에 파트자임 A와 2원성 파트자임 B 성분이 조립될 경우 기질을 변형(예를 들어, 절단)할 수 있는 활성 MNA자임을 생성하는 예시적인 디자인이 도시되어 있다. 이 디자인에서, 파트자임 B는 절두형 센서 아암(T)을 가지는데, 이 절두형 센서 아암은 제2의 성분(본원에서는 안정자 아암 성분(S)이라고 부름)이 존재하지 않을 때 안정한 MNA자임 조립체를 형성하기에는 불충분하다. 그러나, 안정자 아암 성분이 상기 파트자임의 절두형 센서 아암이 결합하는 위치와 인접한 위치에서 조립 촉진자와 혼성화되면, 활성 MNA자임이 조립될 수 있다.
조립 촉진자의 존재 하에, 파트자임 A 성분 및 파트자임 B 성분과, 절두형 센서 아암 및 안정자 아암 성분을 조립함으로써 형성된 활성 MNA자임은 "온" 상태를 나타낸다. 파트자임 안정자 아암 성분 또는 조립 촉진자 성분 중 어느 하나를 빼거나, 제거하거나 또는 변형하면, 촉매 활성은 "오프" 상태가 된다. 그러므로, MNA자임의 촉매 활성은 다양한 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재, 및/또는 이와 같은 올리고뉴클레오티드 성분들이 기능상 활성을 갖도록 하는 능력 예를 들어, 기타 올리고뉴클레오티드 성분들과 혼성화하여 안정한 MNA자임 복합체를 형성할 수 있는 능력에 의해 조절될 수 있다. 절두형 아암은, 안정자 아암 성분과 함께 동반되지 않는 한, 반응 조건 하에서 안정한 MNA자임 조립을 가능하도록 하기에 불충분하도록 디자인된다. 그러므로, 안정자 아암 성분과 조립 촉진자는 MNA자임 활성에 대한 "온" 스위치로서 작용을 할 수 있다.
도 3에 도시된 반응은 MNA 복합체에 있어서 2가지의 교류 상태들을 나타내는 것이다. 활성 MNA자임(반응 (i))은 "온" 상태를 나타낸다. 파트자임 안정자 아암 성분(반응 (ii)) 또는 조립 촉진자 성분(반응 (iii)) 중 어느 하나가 빠진 반응에서, 불활성 MNA 복합체는 "오프" 상태를 나타낸다. 그러므로, MNA자임의 촉매 활성은 다양한 올리고뉴클레오티드의 존부 및/또는 이와 같은 올리고뉴클레오티드 성분들이 기능상 활성을 띠게 되는 능력 예를 들어, 다른 올리고뉴클레오티드 성분과 혼성화하여 안정한 MNA자임을 형성하는 능력에 의해 조절될 수 있다. 절두형 아암은, 안정자 아암 성분과 함께 동반되지 않는 한, 반응 조건 하에서 안정한 MNA자임 조립을 가능하도록 하기에 불충분하도록 디자인된다. 상기 안정자 아암과 조립 촉진자는 MNA자임 활성에 대한 "온" 스위치로서 작용을 할 수 있다.
당업자는, 절두형 파트자임 아암이 다음과 같은 성분 중 임의의 것일 수 있음을 알게될 것이다: 파트자임 A 센서 아암, 파트자임 B 센서 아암(도시함), 파트자임 A 기질 아암 또는 파트자임 B 기질 아암.
당업자는, 자가 촉매성 자가 복제 캐스케이드와 기타 반복 과정에 있어서의 조정자 또는 촉진자를 생성하는 기술에 사용될 수 있음을 알게될 것이다. 잠재적인 응용 분야로서는, 의학, 수의학, 농업, 식품 공학, 영상화 및 생물 테러 분야를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 4를 참고하면, 파트자임 A와 파트자임 B가 조립 촉진자 및 활성 억제자와 복합체를 형성할 때 MNAi가 형성된다(좌측 패널). MNAi는 기질을 촉매 활성에 의해 변형시키는 것이 아니라, 이 기질과 상호 작용할 수 있는 것이다. 몇몇 구체예에서, 활성 억제자는 또한 불안정하거나 절단 가능한 링커를 추가로 포함할 수 있는데, 이 링커는 활성 억제자 내에서 2개 이상의 도메인들을 격리시킬 수 있는 것이다. 이러한 도메인들로서는 예를 들어, (i) 파트자임 성분들과 실질적으로 비-상보성이며, 촉매 활성 MNA자임을 형성하는데 필요한 2차 구조를 파괴함으로써 억제 효과를 나타내는 활성 억제자 도메인과, (ii) 억제자 도메인으로부터 분리되면 부가의 조립 촉진자 성분으로서 작용을 하여, 활성 MNA자임의 조립을 유도할 수 있는 활성자 조립 촉진자 도메인을 포함할 수 있다.
활성 MNA자임(도 4의 우측)은, 분자를 2분화하고, (i) 억제자 도메인과 (ii) 활성자 조립 촉진자 도메인이 분리되도록 하기 위하여 활성 억제자를 변형한 이후에, MNAi의 성분으로부터 유도될 수 있다. 이후, 방출된 활성자 조립 촉진자 도메인은 제1 조립 촉진자 성분과 함께 파트자임 성분 A 및 B를, 이 기질을 촉매 활성에 의하여 변형할 수 있는 활성 MNA자임으로 조립시킬 수 있는, 제2의 조립 촉진자 성분으로서 작용을 할 수 있다.
기타 MNAi에 대한 예시적인 구조를 도 9에 도시하였다.
MNAi와 촉매 활성 MNA자임은, 조립된 성분들의 2개의 교류 상태 즉, "오프" 상태와 "온" 상태를 나타낸다.
4. 조성물의 논리 게이트로서의 용도
당업자는, 본원에 기술된 MNA 복합체가 논리 게이트로서 사용될 수 있음을 알게될 것이다. "온" 상태의 것으로서는, 활성자 리간드의 존재 하에서 조립되어 촉매 활성을 갖게 된 MNA 복합체 예를 들어, MNA자임 또는 앱타-MNA자임을 포함한다. "오프" 상태의 것으로서는, 촉매 불활성 MNA 복합체 예를 들어, 완전히 또는 부분적으로 해체된 MNA 복합체, 활성자 리간드가 존재하지 않는 앱타-MNA 복합체, 그리고 MNAi를 포함한다. 그러므로, 본 발명의 하나의 측면에서는, 하나 이상의 불활성 MNA 복합체, 하나 이상의 입력 데이터 및 하나 이상의 출력 신호를 포함하는 MNA 복합체 논리 게이트가 제공되는데, 여기서, 상기 입력 데이터가 존재하면, 상기 불활성 MNA 복합체의 논리 게이트가 활성화되며, 이와 같이 활성화됨에 따라서 상기 출력 신호가 발생하게 된다. 상기 게이트는 2개 이상의 상이한 출력 상태일 수 있는데, 이때, 상기 상태들은 상기 불활성 MNA 복합체의 논리 게이트의 활성화 여부에 따라서 결정된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 상기 MNA 복합체 게이트는 2개 이상의 입력 데이터와 제1 출력 상태를 나타내는데, 이때, 상기 MNA 복합체는 불활성이며, 또한 제2 출력 상태를 나타낼 경우, 상기 MNA 복합체는 활성화된다. 상기 제1 출력 상태 즉, MNA 복합체가 활성화되지 않은 경우에는 논리적으로 오프 상태에 있는 것이며, 제2 출력 상태 즉, 상기 MNA 복합체가 활성화되는 경우에는 논리적으로 온 상태에 있는 것이다. 대안적으로, 상기 제1 출력 상태는 논리적으로 온 상태에 해당할 수 있고, 제2 출력 상태는 논리적으로 오프 상태에 해당할 수 있는 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 측면에서, MNA 복합체의 논리 게이트의 출력은, 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법 또는 효소적 방법 중 임의의 방법, 또는 이들 방법의 임의의 병행법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, MNA 복합체 논리 게이트는 2개의 입력 데이터를 포함할 수 있는데(논리적으로 AND 게이트임), 이때, 상기 MNA 복합체는 활성화됨에 따라서, 만일 제1 입력 데이터 및 제2 입력 데이터가 존재할 경우에만, 논리적으로 온의 상태에 해당하는 출력을 발생시킨다. 입력 데이터만이 존재하거나 또는 입력 데이터가 존재하지 않으면, MNA 복합체는 불활성 상태(논리적으로 오프인 상태)로 남게 된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, MNA 복합체 논리 게이트는 하나의 입력 데이터를 포함하며 논리 센서 게이트일 수 있는데, 이때, 상기 입력 데이터는 불활성인 MNA 복합체 논리 게이트를 활성화함으로써, 논리적으로 온 상태에 해당하는 출력을 발생시키며, 또한 상기 입력 데이터가 존재하지 않으면, 불활성인 MNA 복합체의 논리 게이트는 불활성 상태(논리적으로 오프인 상태)로 남게 된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, MNA 복합체 논리 게이트는 2개의 입력 데이터를 포함할 수 있는데(논리적으로 OR 게이트임), 이때, 상기 입력 데이터 중 어느 하나 또는 둘 다는 MNA 복합체의 논리 게이트를 활성화하고, 이로써, 논리적으로 온 상태에 해당하는 출력을 제공하게 되며, 또한 상기 입력 데이터가 존재하지 않으면, MNA 복합체의 논리 게이트는 불활성 상태(논리적으로 오프인 상태)로 남게 된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, MNA 복합체의 논리 게이트는 2개의 입력 데이터를 포함할 수 있는데(논리적으로 EX-OR(독점적-OR; Exclusive-OR) 게이트임), 이때, 상기 입력 데이터 중 어느 하나(둘 다는 아님)는 MNA 복합체 논리 게이트를 활성화함으로써, 논리적으로 온 상태에 해당하는 출력 신호를 제공하게 되며, 또한 상기 입력 데이터가 존재하지 않거나 상기 입력 데이터들이 둘 다 존재하면, MNA 복합체의 논리 게이트는 불활성 상태(논리적으로 오프인 상태)로 남게 된다.
또한, 당업자는, MNA자임의 해체 및 조립이 2개의 상태 즉, 온 상태와 오프 상태를 동등하게 제공할 수 있으며, 상기 2개의 상태 간 전환은 다수의 물질 및 이벤트에 의해 조정될 수 있음을 알게될 것이다. 이러한 상태들은 또한 전술한 바와 같은 방식과 유사한 방식으로 논리 게이트 시스템에 적용될 수도 있다.
전가산기 내에서의 논리 게이트의 용례를 도 12에 도시하였으며, 또한 이 용례는 실시예 12에 기술되어 있다.
5. 불용성 지지체 및 고체 지지체를 사용하는 방법
일반적으로 본 발명의 방법은, 그것이 복합적이건 그렇지 않건 간에, 용액 중에서 수행될 수 있거나, 또는 기질, MNA 복합체 성분 또는 이의 일부 중 하나 이상이 부착될 수 있는 불용성 지지체 또는 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 따라서, 파트자임 성분, 기질, 조립 촉진자, 조립 억제자 및/또는 활성 억제자 중 하나 이상은, 결합, 부착 또는 고정될 수 있다. 또한, 본원의 방법 및 본원에 예시된 변형예 및 작업 실시예에 제공된 검정 시스템의 특징은 일반적으로 당업자에 의하여 이해될 것이다. 그러므로, 본 발명은 본원에 교시된 바에 한정되는 것으로서 간주하여서는 안 될 것이며, 본원에 제공된 원리 및 교시 범위 그리고 해당 업계의 상식에 따라서 변형 및 다양화될 수 있다.
어레이(array)나 마이크로어레이(microarray)라고도 알려진 "칩(chip)" 형태의 불용성 지지체를 포함하는 본 발명의 구체예에서, 통상적으로, 이 칩에는 다수의 기질이 커플링, 고정 또는 부착되어 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 기질은 핵산을 포함한다. 다수의 핵산은 해당 업계에 공지된 임의의 적당한 방법 예를 들어, 피펫팅, 잉크젯 인쇄, 밀착 인쇄 또는 사진 석판술에 의해 상기 칩 상에 배치될 수 있다. 상기 칩은 각각 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 부품을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 부품은 동일한 서열의 핵산을 다수 개 포함할 수 있다. 이 칩에 포함된 부품은 임의의 수만큼 존재할 수 있으며, 다수의 부품이 칩에 배치되는 경우, 이 부품은 균일한 간격 또는 다양한 간격, 또는 적절히 조화된 간격으로 떨어져 배치될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 부품들은 무작위로 배치될 수 있으며, 이 경우, 각 부품의 각 위치는 이후에 결정된다. 상기 부품의 크기와 모양은 본 발명의 구체적인 용도에 따라서 달라질 것이며, 하나의 칩에 상이한 크기와 모양을 가지는 부품들이 함께 존재할 수도 있다. 이 칩의 표면은 실질적으로 평면일 수 있거나, 아니면 예를 들어, 함몰부 또는 돌출부와 같은 모양들을 가질 수도 있고, 또한 상기 부품들은 함몰부 안이나 돌출부 위에 배치될 수도 있다. 이러한 함몰부는 상기 부품이 침지될 용액을 담을 수 있으며, 상기 돌출부는 부품의 건조를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 부품은 96 웰 평판의 각 웰에 배치될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 칩은 독특한 식별자 예를 들어, 지시자, 고주파 태그, 집적 장치 예를 들어, 마이크로프로세서, 바코드 또는 기타 표식자를 포함하여, 각각의 부품들을 확인할 수도 있다. 독특한 식별자는 상기 어레이 표면상에 존재하는 함몰부 또는 돌출부를 부가으로 또는 대안적으로 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 독특한 식별자는 상기 칩의 올바른 방향을 제시하거나 또는 이 칩이 구별되도록 만들 수 있다. 독특한 식별자는 데이터 수집 기구 또는 광학 스캐너나 검출기를 통하여 직접 판독될 수 있다.
6. 본 발명의 방법에 사용되는 리포터 기질 시스템
본 발명에 의하면, 디자인을 용이하게 바꾸어 상이한 조립 촉진자들을 인지하는 새로운 MNA자임과 불활성 MNA 복합체를 생성함으로써 검정법을 신속하게 진행시킬 수 있는, 일반적인 리포터 기질 시스템이 제공된다. 본원에 기술된 바와 같이, 새로운 조립 촉진자에 필요한 하나 이상의 파트자임의 센서 아암 부분만이 바뀌고, 파트자임의 기질 아암 부분과 촉매 코어 부분은 변형되지 않은 채 유지될 수 있다. 일반적 기질 서열이 제공되므로, 동일한 기질이 다양한 분야에 사용되는 시스템 내에 통합될 수 있다. 뿐만 아니라, 동일한 기질이, 본원에 개시된 다양한 구체예에 따른 방법 예를 들어, 기질이 용액 중에 유리된 상태로 존재하거나 또는 지지체에 고정 또는 부착되어 존재하는 검정법에 사용될 수 있다. 일련의 일반적 기질은 다수의 조립 촉진자를 동시에 검출할 수 있는 복합적인 반응에 사용될 수 있다.
절단된 기질들은 DNA자임 리가제를 통해 재구성되어 재활용될 수 있다.
7. 본 발명의 방법에 사용되는 기질
이하에 더욱 상세히 설명되어 있는 바와 같이, MNA 복합체 예를 들어, MNA 자임 및 불활성 MNA 복합체들은, 보편적이거나 일반적 기질을 사용할 수 있는 임의의 구체예에서 유리한 특성을 보유한다. 바람직한 형태를 가지는 이러한 기질을 도 1에 나타냈는데, 여기서, 상기 기질은 검출 가능 부분과 소광자 부분 둘 다를 포함한다. 소광자 부분은, 기질이 MNA자임에 의해 절단될 때까지 이 기질의 검출 가능 부분으로부터 검출 가능 신호를 줄이거나 또는 발생하지 않도록 하는데 적합하다. 예를 들어, 소광자 부분은 "블랙홀 소광자 1"(Black Hole Quencher 1; BHQ1) 또는 "블랙홀 소광자 2"(BHQ2)를 포함할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 MNA자임은 검출 가능 부분와 소광자 부분 사이에 있는 기질을 절단하여, 이 두 부분이 용액 중에서 분리되게 만들고, 이로써, 소광자 부분이 검출 가능 부분의 국소 환경으로부터 격리되거나 또는 효과적으로 제거됨에 따라서, 검출 가능 신호가 나타나거나 또는 증가하도록 만들 수 있다.
MNA자임을 구성하는 파트자임을 디자인함으로써, 일반적이거나 보편적인 기질을 사용할 수 있다. 파트자임의 기질 아암은 그대로 놔두고, 파트자임의 센서 아암만을 변형시키면, 다수의 조립 촉진자 각각에 특이적인, 다양한 MNA자임과 불활성 MNA 복합체가 보편적인 기질을 사용하여 출력 신호를 나타낼 수 있도록, 이 MNA자임과 불활성 MNA 복합체를 디자인할 수 있다. 이로써, 각각의 입력 이벤트에 반응하도록 맞추어졌거나 이 입력 이벤트에 반응하는 특유의 기질을 사용할 필요가 없다는 이점이 제공됨을 당업자는 알게될 것이다. 각각의 새로운 조립 촉진자를 검출할 경우에는, 센서 아암 부분 중 하나 이상에 오로지 하나만의 변이 또는 그 이상의 변이가 일어날 필요가 있으며; 이 기질 아암 부분과 촉매 코어 부분은 변이되지 않은 채로 잔류할 수 있다. 그러므로, 단일 리포터 기질은 MNA 복합체 예를 들어, MNA자임을 이용하는 단일 조립 촉진자 또는 기타 입력 이벤트와, 변형된 MNA 복합체 예를 들어, MNA자임을 이용하는 일련의 시스템 내에서 작용하는 다수의 조립 촉진자용으로 사용될 수 있다. 다수의 리포터 기질들은 하나의 시스템 내에서 다수의 MNA 복합체와 MNA자임을 동시에 관찰할 수 있도록 해준다.
또한, 기질은 부가의 물질 예를 들어, 표지화된 핵산, 나노 입자, 마이크로 입자, 단백질, 항체, RNA, DNA, 핵산 유사체, 바이오틴기, 당 단백질, 지단백질, 펩티드 핵산, 차단 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 고 주파 자기장용 부분 또는 이의 임의의 조합체와 통합될 수 있다.
기질은 MNA자임에 의해 변형될 수 있으며, 이로써, "검출 가능 효과" 또는 "출력" 신호를 나타낼 수 있다. 검출 방법에 있어서, MNA자임에 의한 기질 변형법으로서는 예를 들어, 절단, 결찰, 포르피린 금속 첨가 반응, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합의 형성을 포함할 수 있다. MNA자임에 의한 기질 변형의 결과로서, 검출 가능 현상이 나타나는 것이며, 이 효과의 크기는 곧, 입력 신호의 양을 나타내는 지표가 될 수 있다. 검출 가능 현상은 다양한 방법 예를 들어, 형광도 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 또는, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법과 효소법을 임의로 병행하는 방법, 또는 상기 방법들의 임의의 병행법에 의해 검출될 수 있다.
몇몇 연구팀이 핵산 표적 및 기타 분석물을 비색 정보를 통해 검출하는 방법에 대해 보고한바 있다[Elghanian et al., 1997, Mirkin et al., 1996, 및 Liu and Lu, 2004]. 이 기법에는 금 나노 입자 1 회분을 제조하는 단계를 포함하는데, 여기서, 각각의 금 나노 입자의 표면에는 전혀 다른 DNA 올리고뉴클레오티드 서열이 부착되어 있다. 이후, 이 금 입자에 부착되어 있는 서열과 상보성인 "가교 올리고뉴클레오티드"를 부가함으로써 금 입자는 응집될 수 있다. 입자가 응집됨에 따라서 색도 적색에서 청색으로 바뀐다[Mirkin et al., 1996]. DNA자임 기질 서열을 가교 올리고뉴클레오티드에 포함시킬 경우, 금 입자의 응집을 역전시키는 기작을 제공할 수 있다[Liu and Lu, 2004]. 납을 첨가하여 납 의존성 DNA자임을 활성화하면 가교 올리고뉴클레오티드가 절단되고, 금 입자가 해리되며, 이에 따라서 색상도 청색에서 적색으로 바뀐다.
전술한 원리와 MNA 복합체 예를 들어, MNA자임을 사용하여, 변화를 관찰할 수 있는 간단한 검출 기구를 개발할 수 있었다. 온도 변화 또는 기타 물질 또는 이벤트의 발생을 통하여 MNA 복합체(들)를 활성화할 수 있으며, 그 결과, 가교 올리고뉴클레오티드를 절단하여 나노 입자의 해리와 색상 변화를 일으킬 수 있는 MNA자임(들)을 형성할 수 있었다.
8. 방법의 최적화
당업자는 본원에 개시된 방법이 다양한 실험 변수를 이용하여 최적화될 수 있다는 사실을 쉽게 알 수 있을 것이다. 최적화되는 구체적인 실험 매개 변수와, 이러한 최적화 정도는, 사용되고 있는 구체적인 방법 및/또는 검출될 특정 이벤트에 따라서 달라질 것이다. 이러한 매개 변수로서는 시간, 온도, 그리고 염, 세제, 양이온 및 기타 시약 예를 들어, 디메틸설폭시드(DMSO)의 농도와, 핵산의 길이, 상보성, GC 함량 및 용융점(Tm)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법이 수행될 수 있는 온도는 약 20∼약 96℃, 약 20∼약 75℃, 약 20∼약 60℃ 또는 약 20∼약 55℃일 수 있다. 이러한 온도는 일정하게 유지될 수 있거나, 또는 MNA자임의 조립 및 촉매 활성과 양립할 수 있는 온도와, 촉매 활성과 양립할 수 없는 온도 사이에서 순환될 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 매개 변수 및/또는 마이크로 환경의 변화는, MNA 복합체를 불활성 상태에서 활성 상태로 스위칭하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 마이크로 환경 하에서의 매개 변수는 본원에 정의된 바와 같은 "활성자" 예를 들어, 이벤트 예를 들어, 온도, 파장, 염 농도, 세제 농도, 양이온 농도의 변화와, 예를 들어, 조립 촉진자 또는 조립 촉진자 성분, 파트자임 또는 파트자임 성분, 기질, 조립 억제자, 활성 억제자 및 활성자 올리고뉴클레오티드 성분들을 포함하는 구조적 성분 및 조정 성분의 농도 변화를 포함할 수 있다. 그러므로, 이와 같은 매개 변수들 및/또는 마이크로 환경의 최적화는 MNA 복합체의 분자 스위치로서의 사용을 가능하도록 하는데 이용될 수 있다.
하나의 바람직한 구체예에서, MNA 복합체를 이용하는 방법을 수행하기 위해 최적화된 반응이 본원에 제공된다. 이와 같이 최적화된 반응에 있어서, 촉매 활성의 활성화는 최적화되지 않은 반응에 비하여 10%, 20% 또는 30% 이상까지 증가할 수 있다. 더욱 바람직한 반응 조건은 촉매 활성을 35% 이상 또는 40% 이상까지, 바람직하게는 50% 이상까지 개선할 수 있다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 최적화된 반응에 있어서, 촉매 활성의 활성화는 50% 이상, 66% 이하, 75% 이하 또는 100%까지 증가할 수 있다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 완전히 최적화된 반응법에서는 촉매 활성의 활성화가 100%, 200% 또는 300% 이상까지 증가할 수 있다. 기타 바람직한 반응 조건은 촉매 활성의 활성화를, 최적화되지 않은 반응 조건이 적용되는 방법에 비하여, 1000% 이상까지 개선할 수 있다. 본원에 제공된 방법을 최적화하는데 있어서 매우 바람직한 반응 조건에는 임의의 2가 양이온이 포함된다. 대부분의 핵산 효소의 촉매 활성은, 2가 양이온의 농도에 의해 농도-의존적 방식으로 영향받을 수 있다. 바람직한 최적화 반응은 Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+ 및 Pb2+ 중 하나 이상에 대해 최적화될 수 있다.
9. 앱타머를 사용하는 방법
도 7을 참고로 하였을 때, 이 도면에는 앱타-MNA자임의 활성을 스위치 "온" 또는 "오프"시키는데 활성자 리간드를 사용하는 방법이 도시되어 있다. 활성자가 부재할 때 앱타-MNA자임의 활성을 차단하기 위하여 조립 억제자를 사용하는 방법이 도시되어 있다. 이 방법에서는 하나 이상의 리간드를 인지할 수 있는 핵산 또는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드나, 이의 조합체를 포함할 수 있는 앱타머를 이용한다. 앱타머는 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당 단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합, 또는 기타 임의의 물질과 결합할 수 있다[Lee et al., 2004].
본원에 있어서 바람직한 앱타머는 흡착, 회수 및 재증폭 과정을 반복적으로 수행하여, 합성 핵산의 복합 라이브러리로부터 분리될 수 있는, 짧은 단일 사슬 DNA 또는 RNA 올리고머를 포함할 수 있다. 그러므로, 앱타머는 소분자 예를 들어, 아미노산이나 항생제로부터 단백질 및 핵산 구조물에 이르는 임의의 표적들 대부분에 대해서 생성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 앱타머는 예를 들어, 진화 및 선택 기술에 의해 생성되는 것이 바람직한 핵산 결합 분자를 포함한다. 바람직하게, 앱타머는 DNA 또는 RNA 분자나, 이 DNA 및 RNA의 조합체 예를 들어, 상기 표 1에 나열된 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
당업자는, 상기 앱타머가 조립 촉진자 분자 또는 분자들의 말단부 중 어느 한쪽 및/또는 활성 억제자에 통합될 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 앱타머 또는 다수의 앱타머들은 파트자임 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상에 통합될 수 있다는 것도 알 것이다. 또한, 앱타머 또는 다수의 앱타머들도 파트자임 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상에 통합될 수 있다는 것도 알 것이다. 도 7에 도시된 기법에 사용되는 조립 촉진자는 예를 들어, DNA, RNA, LNA, PNA 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기 유사체들을 함유하는 서열을 포함할 수 있다.
도 7에 도시한 기술에 있어서, 앱타머 서열은 파트자임(앱타-파트자임)의 말단부에 일정한 형태로 통합되므로, 활성 MNA자임은 오로지 활성자가 존재할 때에만 형성된다.
당업자는 또한, 올리고뉴클레오티드 성분 중 임의의 것 예를 들어, 파트자임, 조립 촉진자 또는 기질에 하나 이상의 앱타머가 통합될 수 있었음을 알게될 것이다. 뿐만 아니라, 상기 앱타머는 이와 같은 올리고뉴클레오티드 중 임의의 것의 한쪽 말단부에 통합될 수 있었다.
도 7에는, (i) 활성자 분자로서 리간드를 사용하여 MNA 복합체 활성을 제어하는 방법을 제공하고/제공하거나 (ii) 리간드 활성자와 접촉할 때 MNA자임을 형성하는 앱타-MNA 복합체를 사용하는 핵산 표적을 검출하는 방법을 제공하기 위한 기법이 도시되어 있다. 이와 같은 앱타-MNA자임 검출 기법에 사용되는 핵산 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 성분들을 포함할 수 있다:
a) 표준 파트자임;
b) 말단부 중 어느 한 쪽에 앱타머가 통합된 파트자임인 앱타-파트자임;
c) 활성 MNA자임을 조립할 수 있는 파트자임과 앱타-파트자임 둘 다와 결합하는 올리고뉴클레오티드인 조립 촉진자;
d) 리포터 기질; 그리고
e) 앱타머 서열의 적어도 일부분과 앱타-파트자임 서열의 기질 결합 아암의 일부분에 걸쳐서 확장되어 존재하는 부위 안에서 앱타-파트자임과 혼성화하는 조립 억제자 올리고뉴클레오티드.
활성자 리간드가 존재하지 않을 경우(좌측 패널), 조립 억제자 올리고뉴클레오티드는 앱타-파트자임과 결합하여, 리포터 기질과 결합에 대해 경쟁함으로써 이 리포터 기질의 결합을 차단하게 된다. 이와 같은 구조는 불활성 MNA 복합체를 나타낸다. 활성자 리간드가 존재할 경우(우측 패널), 이 활성자 리간드는 앱타-파트자임의 앱타머 서열과 결합하여, 조립 억제자 올리고뉴클레오티드의 결합을 차단하고, 이로써, 기질이 결합할 수 있게 되고, 추후 상기 시나리오에 따라서, 기질을 절단하는 촉매 활성 MNA자임이 형성되는 것이다. 그러므로, 촉매 활성 MNA자임은, 앱타머와 결합할 수 있는 활성자가 존재할 경우에만 형광 신호를 형성하여 이를 발생시킬 수 있게 된다.
몇몇 구체예에서, MNA자임의 활성은, 스위치 기작으로서, 비-핵산 표적 활성자 리간드 또는 핵산을 사용하여 조정될 수 있다. 다른 구체예에서, 조립 억제자 분자는 기타 수단에 의해 조작되며, 그 결과, 활성이 조정되는 것이다. 예를 들어, 조립 억제자는 몇몇 기법 예를 들어, 선택적 열 변성법 또는 결합에 대해 경쟁하는 올리고뉴클레오티드들을 사용하는 방법 및/또는 단편들을 치환하는 분지 쇄 이동 방법에 의해 제거될 수 있었다.
10. 캐스케이드를 이용하는 방법
당업자는, 본원에 기술된 방법이 본원에 정의된 캐스케이드를 수행하는데 사용될 수 있음을 알게될 것이다. 이와 같이 본원에 개시된 방법을 수행하는 특정 구체예로서는, (1) 불활성 MNA 복합체를 활성화하여 MNA자임을 형성하고, 이로써 표적이나 이벤트가 존재하거나 발생할 때에만 기질을 변형하는 방법으로서, 이때, 상기 기질은 추후 제2의 이벤트 예를 들어, 검출 가능한 신호를 발생시키는데 유용하도록 되는 것인 방법, 또는 (2) 불활성 MNA 복합체를 활성화하여 MNA자임을 형성하고, 이로써 표적이나 이벤트가 존재 또는 발생할 때에만 기질을 변형하는 방법으로서, 이때, 상기 기질은 추후 제2의 이벤트를 발생시키는데 유용하고, 상기 제2의 이벤트가 발생함에 따라서 임의의 수의 후속 이벤트를 발생시킬 추가의 기질이 사용될 수 있으며, 이로써, 초기 이벤트 발생시 이에 관여하여 기질을 유용하게 만듦으로써, 순환 캐스케이드 예를 들어, 도 6, 도 10 및 도 11의 (iii)에 도시된 캐스케이드가 진행되도록 하며, 이때, 이와 같은 순환 캐스케이드는 예를 들어, 표적이 소량 존재할 때, 예를 들어, 입력 이벤트가 낮은 정도로 발생할 경우, 신호를 증폭시키는데 사용될 수 있으며, 그렇지 않을 경우에는 검출 가능한 출력 신호를 제공할 수 없는 것인 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
표적 분석물을 검출하기 위하여 디자인된 MNA자임 복제 캐스케이드를 진행시키기 위한 한 가지 기작에서는 SCUD 캐스케이드 기법을 이용한다. 이 SCUD 기법은 예시한 바와 같이 다양한 디자인 예를 들어, 2개의 MNA 복합체들이 통합된 디자인(도 6); 3개의 MNA 복합체들이 통합된 디자인(도 10); 그리고 MNA 복합체들과 DNA자임 리가제 둘 다가 캐스케이드 반응에 통합된 디자인(도 11)으로 캐스케이드에 통합 운용될 수 있다.
상기 SCUD 방법은, 혼합물 중에 존재하는 구성 올리고뉴클레오티드들로부터 활성 MNA자임과 MNAi가 조립되는 것을 제어하는 능력에 달려있다. SCUD의 한 가지 형태를 도 6에 도시하였다. 이와 같은 SCUD에 관한 예에는, 신호 증폭에 대한 일반적인 방법이 도시되어 있다.
SCUD(DNA를 이용하는 신호 캐스케이드)(도 6 참고)라고 알려진 방법에 관한 하나의 구체예는 다음과 같은 성분들을 포함한다:
(i) 3개의 부위들을 함유하는 활성 억제자(예를 들어, 이중 표지화된 RIF(리포터-억제자-촉진자)(도 6에 도시);
a. RIF에 통합될 경우에는 활성 억제자로서의 기능을 하고(제1 기능), RIF가 절단될 때에는 형광 신호를 제공하는 기능을 하는(제2 기능) 것과 같이 이중의 기능을 가지는 활성 억제자/리포터(RI) 도메인,
b. MNA자임 2a의 필수 성분을 형성하는 활성자 조립 촉진자 성분 F2b, 그리고
c. MNA자임 1a 또는 MNA자임 2a 중 어느 하나에 의하여 절단될 수 있으며, RI 및 F2b 도메인 사이에 위치하는 기질 도메인
(ii) 조립 촉진자 성분 F2a;
(iii) 예를 들어, 테스트 시료 중에 존재하는 표적 핵산일 수 있는 조립 촉진자 F1이 존재할 경우에만 활성 MNA자임 1a 구조를 형성할 수 있는 파트자임으로서; 상기 MNA자임 1a는 RIF를 RI와 F2b 성분들로 절단하여, 형광을 발생시키고, MNA자임 활성 억제자 효과가 발생하는 것을 막음과 동시에, 새로운 활성자 조립 촉진자 성분 F2b를 생성할 수 있는 것인 파트자임; 그리고
(iv) 유리된 활성자 조립 촉진자 성분 F2b에 인접하여 존재하는 조립 촉진자 성분 F2a와 파트자임 아암이 결합할 때에만 활성 MNA자임 2a 복합체들을 형성할 수 있는 파트자임. 이후 상기 MNA자임 2a는 더욱 많은 RIF를 절단하여, 더욱 많은 RI와 F2b를 생성하게 되고, 이로써, MNA자임 2a의 자가 복제 캐스케이드가 진행될 뿐만 아니라, 이에 부수하여 형광 신호도 증폭될 수 있었다.
예를 들어, 표적 핵산일 수 있는 F1이 존재하지 않을 경우, MNA자임 2a에 대한 파트자임은 비 변형 RIF를 가지는 불활성 복합체인 MNAi 2i를 형성한다. 비 변형 RIF는 MNAi 2i 형성시 활성 억제자로서 작용을 한다. 표적 분석물이 존재할 경우, 활성 MNA자임 1a가 형성되면서 RIF가 절단고, 또한 활성자 조립 촉진자 성분 F2b가 유리되며, 이 F2b는 추후 자유롭게 결합하여 활성 MNA자임 2a의 성분이 될 것이다. MNA자임 2a는 또한 더욱 많은 RIF를 절단할 수 있으므로, 이는 복제/신호 증폭 캐스케이드를 개시할 것이다.
매 회 MNA자임 2a는 RIF 분자를 절단하고, 이에 따라서, 새로운 MNA자임 2a를 형성하는데 필요한 더욱 많은 성분들(활성자 F2b 조립 촉진자들)이 생성될 것이다. 상기 MNA자임 캐스케이드가 진행되면, MNA자임 2a의 촉매 활성에 의해 생성된 생성물들인 성분들을 이용하여, 모 MNA자임과 동일한 MNA자임 2a 복합체들이 조립된다. 그러므로, MNA자임 절단 생성물(F2b)은 자가 촉매 활성을 가지는 자가 복제 시스템 내에 새로운 (모) MNA자임 분자의 조립을 유도할 수 있다.
본원에 개시된 구조물 및 기타 분자 스위치들은 자가 복제 캐스케이드에 관여하는 캐스케이드 성분들을 형성할 수 있다.
도 10을 참고로 하였을 때, 이와 같은 캐스케이드는 예를 들어, 표적과의 상호 작용에 의해 표적을 검출하는데 활약하는 MNA 복합체를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 표적은 조립 촉진자로서 작용을 하는 것이며, 이에 따라서 개시 MNA자임의 형성을 촉진하여 이 캐스케이드를 개시한다. 이러한 개시 MNA자임(도 10의 Mt)은 기질을 변형시킬 수 있다. 이때의 변형은 예를 들어, 절단일 수 있다. 이 경우, 상기와 같은 변형이 이루어짐에 따라서, 제1 캐스케이드 MNA자임(cascading first MNA자임)(도 10의 Mc1) 형성시 제1의 조립 촉진자가 생성된다. 상기 제1 캐스케이드 MNA자임은 이후, 부가의 기질을 변형시켜, 부가의 MNA자임(도 10의 Mc2)의 형성을 유도하는 부가의 조립 촉진자를 생성하게 된다. 이후, 상기 부가의 MNA자임은 제1 기질을 변형시켜, 제1 캐스케이드 MNA자임에 대한 제1 조립 촉진자를 추가로 생성하고, 이 캐스케이드의 초기 단계로의 피드백(feedback)이 진행된다. 몇몇 구체예에서, 조립 촉진자는 활성자 조립 촉진자일 수 있다.
당업자는, 이러한 캐스케이드에서, 절단되지 않은 상태의 제1 기질이 제1 캐스케이드 MNA자임의 활성 억제자로서 작용을 할 수 있음을 알 것이다. 실제로, 상기 제1 캐스케이드 MNA자임은, 제1 기질이 개시 MNA자임에 의해 절단되어 제1 활성자 조립 촉진자를 생성하고, 이 제1 활성자 조립 촉진자가 상기 제1 캐스케이드 MNAi를, 제1 캐스케이드 MNA자임의 "오프" 상태에서 촉매 활성 "온" 상태로 스위칭하는 작용을 하게 될 때까지는, MNAi이다.
이와 유사하게, 당업자는, 절단되지 않은 상태의 부가 기질이 부가 MNA자임의 활성 억제자로서 작용을 할 수 있음을 알 것이다. 실제로, 상기 부가 MNA자임은, 부가 기질이 제1 캐스케이드 MNA자임에 의해 절단되어 부가 활성자 조립 촉진자를 생성하고, 이 부가 활성자 조립 촉진자가 상기 부가 MNA자임을 스위치-온시키는 작용을 하게 될 때까지는, MNAi이다.
당업자는, 도 10이 활성 MNA자임의 조립을 촉진하는데 필요한 3개의 조립 촉진자 성분을 나타낸다는 사실을 알 것이다. 다소의 조립 촉진자 성분은 유사한 방식으로 이용될 수 있다.
도 11을 참고하면, 본원에 개시된 구조 및 기타 분자 스위치는, 표적 분자가 제1 MNA자임의 형성을 촉진하고, 이에 따라서, 제1 기질을 절단하여 2개의 절단 생성물(Aa 및 Ab)을 생성하도록 만드는 신호 증폭 케스케이드를 형성할 수 있다. Aa는 결찰 단계(도 11의 박스 (ii))의 한 성분으로서 작용을 하고, Ab는 SCUD 증폭 단계(도 11의 박스 (iii))의 한 성분으로서 작용을 한다. Aa는 통상적으로 3' 말단에 2',3'-시클릭 포스페이트를 가지며, 이로써, 상기 2',3'-시클릭 포스페이트는 DNA자임 리가제에 대한 기질로서의 작용을 할 수 있다.
결찰 단계에 있어서, DNA자임 리가제는 Aa를 제2 기질에 결찰시켜, 부가의 MNA자임에 대한 파트자임을 형성한다(이 경우, 상기 부가의 MNA자임은 도 11의 박스 (iv)에 표시함).
SCUD 증폭 단계(도 11의 박스 (iii))에 있어서, Ab는 제1 기질을 변형시켜 Aa 및 Ab를 추가로 생성하는 제2 MNA자임의 조립 촉진자로서 작용을 한다. 상기 추가로 생성된 Aa 및 Ab는 결찰 단계 및 SCUD 증폭 단계에서 각각 사용되며, 이로써, Aa 및 Ab는 피드백 증폭 캐스케이드를 통해 축적된다.
결찰 단계의 결찰 생성물은 부가의 기질을 변형시켜, 표적의 존재에 대한 지표인, 검출 가능 효과를 나타내는, 부가의 MNA자임에 대한 파트자임이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 기질 중 하나 이상의 변형 여부는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 중 어느 하나, 또는 임의의 병행법에 의해 확인될 수 있다.
당업자는, 이 캐스케이드에서, 절단되지 않은 상태의 제1 기질이 제2 MNA자임의 활성 억제자로서 작용을 할 수 있다는 사실을 알 것이다. 실제로, 상기 제2 MNA자임은, 제1 기질이 제1 MNA자임에 의해 절단되어 조립 촉진자를 생성하고, 이후 이 조립 촉진자가 제2 MNAi를 스위치-온 할 때까지는, MNAi이다.
만일 상기 기법이 앱타-MNA자임 시스템과 연계될 경우, MNA자임 매개 증폭 캐스케이드는 핵산 표적(DNA/RNA) 또는 기타 표적 리간드(단백질 및 소분자 등) 중 어느 하나에 의해 개시될 수 있다. 이 반응은 리간드나 기타 입력 이벤트가 존재 또는 발생할 때에만 개시되므로, 표적 분석물을 검출 및/또는 동정하기 위한 기술이 된다. MNA자임 매개 증폭 캐스케이드는 다성분 핵산 복합체의 활성화를 바탕으로 한다. 표적 증폭 기술 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응 또는 리가제 연쇄 반응과는 달리, MNA자임 매개 증폭 및 신호 증폭에는, 이 과정을 촉진하는 단백질 효소를 필요로 하지 않는다. 이로써, 이와 같이 일반적으로 사용되어 왔던 프로토콜에 비하여 보다 많은 이점을 얻을 수 있다. 뿐만 아니라, 몇몇 올리고뉴클레오티드 성분들 예를 들어, 안정자 아암 성분 또는 조립 촉진자 성분을 사용하여 MNA자임의 촉매 활성을 제어 및 조절하는 능력은, MNA자임의 조립이 마이크로 환경 조건 및 이 마이크로 환경에 존재하는 성분들에 의해 엄격하게 조절되도록 만들 수 있다.
MNA자임 매개 증폭 캐스케이드는 일정 범위의 생물 공학 분야 특히, 진단학 분야에 적용될 수 있다. 이 캐스케이드는 신호 증폭 과정을 촉진함으로써, 질병 진단시 단백질 및 핵산을 검출할 수 있도록 한다. 촉매성 핵산 및/또는 캐스케이드 반응은 진단 분야 이외의 분야 예를 들어, 치료에 사용될 수 있는 스위치 및 나노 규모의 기구를 생체 분자 공학 분야와 전산 분석 분야에 활용될 수 있다.
11. 활성 억제자 또는 조립 촉진자와 같은 성분들을 제거함으로써, MNA 복합체를 활성 상태와 불활성 상태 사이에서 스위칭할 수 있는 방법
활성 MNA자임 및 불활성 MNA 복합체 사이의 전환, 또는 그 역의 상태의 전환은, MNA 복합체 성분들 예를 들어, 하나 이상의 활성 억제자, 조립 촉진자, 조립 억제자, 파트자임 또는 안정자 아암 또는 이것들의 일부를 제공하거나 또는 제거함으로써 이루어질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 활성 억제자는 활성 억제자 내에 존재하는 2개 이상의 도메인들 예를 들어, 활성 억제자 도메인 및 활성자 조립 촉진자 도메인 사이에 위치할 수 있는 불안정 또는 절단 가능 링커 또는 기질을 포함할 수 있다. 링커 위치에서 절단이 일어나면, 활성자 조립 억제자 도메인으로부터 활성 억제자 도메인이 분리될 수 있는데, 이후 상기 활성자 조립 도메인은 조립 촉진자 성분으로서 작용을 하여, 활성 MNA자임의 조립을 유도할 수 있다. 링커는 몇몇 방법들 예를 들어, MNA자임 절단법, 단백질 효소 절단법, 또는 pH 및/또는 온도 변화에 의해 유도되는 가수 분해법에 의해 절단될 수 있다.
대안적으로, 조립 억제자 및/또는 조립 촉진자는, 분지 이동 및/또는 구성 올리고뉴클레오티드에 대한 상보성과 관련된 방법을 이용하여 선택적으로 제거될 수 있었다. 상보성을 통하여 작동을 하는 조정자 올리고뉴클레오티드도, 이 조정자 올리고뉴클레오티드가 결합하는 올리고뉴클레오티드의 2차 구조를 바꾸어줌으로써 선택적으로 제거될 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 활성자 서열이 기타 성분들과 조립하여 활성 MNA자임을 형성할 수 있는 경우, 그 형태를 교호적으로 바꿀 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 조정자 올리고뉴클레오티드는, 분자 내 구조 예를 들어, 활성자 분자를 비-작용성 형태로 제한하는 헤어핀 구조의 파괴를 유도할 수 있다.
몇몇 구체예에서, MNA 성분 예를 들어, 억제자 예를 들어, 활성 억제자 또는 조립 억제자는, 기타 물질들과 접합할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이 성분은 고 주파 자기장에 노출되는 금 나노 입자에 접합한다. 이로써, 특정 올리고뉴클레오티드를 가역적으로 열 변성시킬 수 있는 안테나로서 작용을 하는, 고 주파 자기장에 의하여, 혼성화를 원거리에서 전기력으로 제어할 수 있으며, 이때, 주변에 있는 분자들은 이 자기장에 비교적 영향을 받지 않는다. 몇몇 구체예에서, 성분의 포착 및 물리적 분리를 촉진하기 위해, 상기 성분을 바이오틴으로 표지화할 수 있다.
12. 키트
본 발명은 또한 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 통상적으로, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트는 본 발명의 방법을 수행하는데 필수적인 시약 전부를 함유한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 키트는 불활성 MNA 복합체 예를 들어, MNAi를 포함하는 제1 용기를 포함할 수 있는데, 여기서, MNA자임을 형성하기 위해 상기 불활성 MNA 복합체를 활성화할 경우에는, 불활성 MNA 복합체를 활성자에 노출시킴으로써 촉매 활성이 억제되는 것을 막을 필요가 있으며, 또한 상기 활성자는 억제자의 억제력을 없애준다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 키트는 별도의 용기 내에서 불활성 MNA 복합체를 형성하기 위한 하나 이상의 성분들을 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 키트는 불활성 MNA 복합체에 대한 성분들을 함유하는 제1 용기를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 MNA자임을 형성하기 위해 상기 MNA 복합체를 활성화할 경우에는, 본원에 개시된 방법에 의하여 MNA 복합체를 활성자에 노출시킴으로써 촉매 활성을 활성화할 필요가 있다.
통상적으로, 본 발명의 키트는 또한 예를 들어, 세척 시약 및/또는 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 기타 시약을 함유하는 하나 이상의 기타 용기들도 포함할 것이다.
본 발명의 내용에 있어서, 구획화된 키트는 별도의 용기에 시약이 담겨져 있는 임의의 키트를 포함하고, 작은 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱이나 종이로 만들어진 스트립을 포함할 수 있다. 이러한 용기는 하나의 구획에서 다른 구획으로 시약을 용이하게 운반할 수 있게 해주며, 이때, 시료와 시약이 서로 섞이지 않도록 해줄 뿐만 아니라, 각각의 용기에 있던 제제나 용액을 하나의 구획에서 다른 구획으로, 정량적 방식으로 첨가할 수 있게 해준다. 이러한 키트는 또한 테스트 시료를 담을 용기, 검정법에 사용될 시약을 담는 용기, 세척 시약을 담는 용기, 그리고 검출 시약을 담는 용기를 포함할 수도 있다. 통상적으로, 본 발명의 키트는 또한 적당한 방법을 수행하기 위한 키트의 부품 사용에 관한 지침도 포함할 것이다. 본 발명의 키트와 방법은 자동화된 분석 장치 및 시스템 예를 들어, 실 시간 PCR 기기와 함께 사용될 수 있다.
상이한 표적 또는 이벤트를 검출, 동정 또는 정량하기 위하여, 본 발명의 키트 하나를 사용할 수 있거나, 또는 예를 들어, 각각의 표적에 특이적인 시약을 함유하는 상이한 키트들도 사용할 수 있다. 본 발명의 방법과 키트는 임의의 물질 또는 이벤트를 검출, 동정 또는 정량하는데 사용하는 것이 바람직한 임의의 경우에 사용된다.
이하, 본 발명을 다음과 같은 특정 실시예들을 참고로 하여 더욱 상세히 기술할 것인데, 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든지 한정하는 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.
실시예 1: 파트자임 B가 2개의 분자를 포함하는 MNA 자임의 예
본 발명에서는 MNA자임의 기본 디자인에 다양한 변형을 가하는 것을 생각해 볼 수 있다. 본 실시예에서는, 2개의 성분들 즉, 절두형 센서 아암을 포함하는 하나의 파트자임 성분과, 안정자 아암으로서 작용을 하는 하나의 성분을 포함하는, 파트자임 B와 파트자임 A로부터 유래하는 조립 촉진자의 존재 하에서 MNA자임을 조립하였다. MNA자임 조립은, 파트자임 센서 아암과 조립 촉진자 서열의 왓슨-크릭 염기 인지 작용을 통하여 일어난다. 이하 실시예에서는, 절두형 파트자임 아암과 안정자 아암을 사용하는 것에 관하여 기술되어 있다.
본 실시예에서 사용된 MNA자임 검출 기법은 도 2(패널 (ii))와 도 3에 도시되어있다.
필요한 올리고뉴클레오티드를 이하에 기술되어 있다:
a) 표준 파트자임 A;
b) 기질 아암, 부분 촉매 코어 및 절두형 센서 아암을 포함하는 제1 성분; 그리고, 파트자임의 절두형 센서 아암에 인접하여 존재하며, 조립 촉진자에 혼성화하는 제2 안정자 아암 성분[여기서, 상기 안정자 아암은 파트자임의 절두형 센서 아암이 조립 촉진자와 혼성화될 때 MNA자임의 조립을 촉진하도록 디자인됨]을 포함하는 파트자임 B; 및
c) 기질 예를 들어, 리포터 프로브 기질.
활성 MNA자임 조립시에는 또한, 조립 촉진자가 존재해야 한다.
1.1 파트자임 올리고뉴클레오티드 및 안정자 아암
본 실시예에서, 파트자임 B의 절두형 센서 아암의 길이는 5개의 뉴클레오티드에 불과하였다. 파트자임 A 성분과 2개의 파트자임 B 성분들의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'). 이하 서열에 있어서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 조립 촉진자와 혼성화하는 것이며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 코어의 일부를 형 성하는 것이고, 또한 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 것이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3'-인산화를 나타내는 것이다.
서열 번호 1: 파트자임 A4 Xd-P:
ACTGGATGTCCATCTGTCTG ACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 2: 파트자임 B5 Xd-P 성분 1:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT TATAC-P
서열 번호 3: 파트자임 B 안정자 아암 성분 XdS-P:
CTTCGTGAGGGTGAG-P
1.2 리포터 기질
본 실시예에 사용된 리포터 기질은 5' 말단을 6-FAM 부로 말단 표지화한 SubBi-2와, 3' 말단을 BHQ1 부로 말단 표지화한 SubBi-2FB였다. SubBi-2-FB를 절단하고 그 결과를 520㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 490㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. SubBi-2-FB의 서열을 이하에 나열하였는데(5'→3'); 여기서, 소 문자 염기는 RNA를 나타내고, 대문자 염기는 DNA를 나타낸다.
서열 번호 4: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
1.3. 조립 촉진자 분자
조립 촉진자로 사용된 합성 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나열하였다(5'→3'). 이와 같은 조립 촉진자는 파트자임 B 센서 아암과 완전히 매칭되었다. 표적 조립 촉진자 대신에 핵산 분해 효소를 포함하지 않는 물("표적 불포함" 대조 군)을 사용하였다.
서열 번호 5: 조립 촉진자 Xd-T:
TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGTATACAGACAGATGGACATCCAGTTGGTGA
1.4 반응 조건
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호가 증가하였음을 근거로 하여 조립 촉진자가 존재함을 확인하였다. 반응은 기질을 첨가함으로써 시작되었으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 50㎕이었다. 반응은 55℃의 플루오스타 옵티마(FLUOstar OPTIMA; BMG Biotech) 상에서 진행시켰다. 각 반응에 대한 형광도를 총 5분 동안 2초마다 판독하였다. 모든 반응물은 200nM A4Xd-P, 200nM B5Xd-P, 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystem) 및 25mM MgCl2을 포함하였다. 뿐만 아니라, 반응물은 표 3에 나열한 올리고뉴클레오티드를 포함하였다.
MNA자임 반응에 포함되는 부가의 시약들
반응 조립 촉진자 안정자 아암
(i) 200nM Xd-T 200nM XdS-P
(ii) 200nM Xd-T 안정자 아암 불포함
(iii) 조립 촉진자 불포함 (물 대조군) 200nM XdS-P
1.5 결과: 파트자임 및 조립 촉진자 존재 시 활성 MNA 자임의 조립
조립 촉진자와 파트자임 안정자 아암 성분 둘 다가 본 반응(도 3의 반응 (i))에 포함될 때, 시간이 경과함에 따라서, 활성 MNA자임은 조립되어 기질을 절단하여, 형광도를 증가시켰다. 이와는 대조적으로, 조립 촉진자가 존재하지 않을 경우(도 3의 반응 (iii))에는 형광도가 증가하지 않았다. 뿐만 아니라, 안정자 아암은 활성 MNA자임을 형성하는데 필수적임을 알 수 있었다. 모든 반응 성분들 예를 들어, 조립 촉진자를 포함하되, 안정자 아암 성분은 포함하지 않는 반응의 경우에는, 시간이 경과함에 따라서 형광도는 증가하지 않았다(도 3의 반응 (ii)). 그러므로, 파트자임 B의 센서 아암을 이루는 5개의 염기들은 안정한 MNA자임 복합체를 형성하기에는 불충분하였지만, 안정자 아암 성분이 존재함으로 인하여 이 파트자임 센서 아암의 짧은 길이(절두)를 보완할 수 있고, 또한 엄중한 온도 조건 하에서(본 실시예에서는 55℃) 안정한 MNA자임을 형성할 수 있었다. 그러므로, 상기 안정자 아암은, 절두형 센서 아암을 가지는 파트자임을 이용하는 시스템에서 활성 MNA자임의 조립에 필수적인 올리고뉴클레오티드이다.
또한, 파트자임 센서 아암과 하나의 뉴클레오티드가 미스매치되는 대안적인 조립 촉진자가, 파트자임 A와 2개의 파트자임 B 성분들을 포함하는 반응에 포함되었을 때, 형광 신호는 시간이 경과함에 따라서 증가하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
본 실시예는, 특정 실험 조건 하에서, 완전히 매칭되는 조립 촉진자가 존재할 경우에만 MNA자임이 형성될 수 있었다는 사실을 입증한다. 당업자는, 완전히 매칭되는 조립 촉진자 또는 미스매칭되는 조립 촉진자를 공급함으로써, 활성 MNA자임과 불활성 MNA 복합체 사이의 전환이 조절될 수 있음을 알 것이다. 뿐만 아니라, 본 실시예는, 절두형 센서 아암을 포함하는 제1 분자와, 제2 안정자 아암 분자를 포함하는, 2 성분 파트자임을 이용하였을 때의 결과를 보여주는 것이다. MNA자임의 조립을 조절할 수 있는 다른 도구를 제공하기 위해서는, 이와 같은 시스템에 안정자 아암이 존재하여야 한다.
다수의 올리고뉴클레오티드 성분들 즉, 용융 온도, 서열 조성 및 다른 구성 올리고뉴클레오티드와 상보성을 가지는지 여부에 따라서 조작될 수 있는 서열을 포함하는 MNA 시스템에 의해 융통성이 증가할 수 있다. 길이가 짧은 서열 예를 들어, 절두형 아암, 안정자 아암, 그리고 조립 촉진자 성분을 가지는 파트자임 성분들은 본 발명의 이와 같은 측면에 특히 유용하다.
실시예 2: 온도를 이용한 MNA 복합체의 조립 및 해체의 조절과, 온도 감지용 DNA 나노 규모 기구의 구성에 있어서 이와 같은 조절의 적용
MNA자임의 조립과 해체는 또한, 온도에 의해 제어될 수도 있다. 온도의 상승 또는 하강을 통하여, MNA자임의 촉매 활성을 "온" 및 "오프"로 스위칭하는 기작을 제공할 수 있다. MNA자임의 온도 감수성은 온도 센서 및 가변 저항기를 구축하는데 이용될 수 있다.
만일 온도가 구성 올리고뉴클레오티드들을 조립(혼성화)하고/하거나, MNA자임의 촉매 활성을 나타내는데 너무 높거나 너무 낮으면, 기질을 변형(예를 들어, 절단)할 수 있는 활성 복합체는 형성되지 않을 것이다. 만일 온도가 MNA자임의 조립 및/또는 활성을 진행 및/또는 나타낼 수 있으면, 기질은 변형될 것이며, 또한 신호가 발생할 것이다.
염기 조성 및/또는 올리고뉴클레오티드의 길이를 변경함으로써, 구성 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 파트자임 예를 들어, 안정자 아암 성분 및/또는 조립 촉진자)의 용융 온도가 바뀔 수 있는 특성으로 인하여, MNA자임 시스템을 미세하게 변조시킬 수 있는 시스템을 구축할 수 있다. 이로써, MNA자임은 완전히 "온" 또는 완전히 "오프" 상태가 될 수 있을 뿐만 아니라, 가변 저항 시스템에 활용되기 적당하도록 이 MNA자임의 활성을 단계적으로 변화시킬 수 있다. 뿐만 아니라, MNA자임 반응이 일어나는 온도 범위를 조정할 수도 있다.
온도가, MNA자임 활성과 양립할 수 없는 온도에서 MNA자임 활성과 양립할 수 있는 온도로 상승 또는 하강하는 것은, MNA자임에 의해 기질이 변형됨에 따라서 발생하는 신호에 의해 검출될 것이다. 그 결과는 예를 들어, 형광도 또는 비색도일 수 있었다.
MNA자임 복합체는, 금 나노 입자를 응집시키는데 관여하는 가교 올리고뉴클레오티드를 절단함으로써, 온도 변화에 반응할 수 있었다. 이로써, 온도 변화를 검출할 수 있는 간단한 비색 장치를 개발할 수 있다. 당업자는, MNA자임을 이용한, 온도 감지용의 간단한 장치를 발명하여, 다수의 산업 분야 예를 들어, 제약 분야, 식품 산업 분야 및 농업 분야에 사용할 수 있음을 알 것이다.
한 가지 장치로서는, MNA자임 온도-센서와 온도 감수성 약물 또는 기타 화합물이 함께 포장된 장치를 포함할 수 있다. 만일 상기 포장이 적당한 온도 조건하에(예를 들어, 냉장) 보관되지 않으면, MNA자임이 형성되어 신호를 발생할 수 있으며, 또한 이 경우, 화합물은 제 구실을 하지 못할 것으로 파악된다. 이와 유사하게, 온도 제한 세트 내로 유지할 필요가 있는 식품 예를 들어, 냉동 식품은, 보관 중 어느 시기에 녹은 음식을 분별할 수 있는, MNA자임 온도-센서에 의해 모니터링될 수 있었다.
이와 같이 MNA자임의 촉매 활성을 제어하기 위해 온도를 이용하는 예를 통하여, MNA자임의 촉매 활성을 온 상태 및 오프 상태로 스위칭하는 일반적인 기술을 설명할 수 있다. 그러므로, MNA자임의 조립 및 해체는 촉매 속도에 영향을 미칠 수 있는 요인 중 다수의 요인들에 의해 제어될 수 있었다. 이와 같은 요인의 예로서는, 구성 파트자임 또는 조립 촉진자의 존부, 염 농도, pH, 2가 양이온의 종류 및 농도, 부가물의 존부, 그리고 온도를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 3: 활성 MNA자임 또는 MNAi 의 조립을 촉진 및 억제하는 기작
MNA자임은 하나 이상의 조립 촉진자 성분이 존재할 때 조립되어, 활성 효소를 형성하는 파트자임들로 이루어져 있다[예를 들어, 도 1, 2 및 4(우측 패널), 도 5의 (i) 및 (ii) 및 도 9(좌측 구조)]. 파트자임 센서 아암에 결합하는 조립 촉진자(들)는 표적 분석물일 수 있거나, 또는 반응 혼합물에 첨가되어 MNA자임의 조립을 유도하는 합성 핵산 분자(들)일 수 있다. 활성 MNA자임 조립에 기여하는 상기 조립 촉진자의 능력에 더하여, 파트자임은 "활성 억제자" 분자와 혼성화될 때 불활성이며 비-촉매성인 MNAi 복합체로 조립될 수 있다[도 4(좌측 패널), 도 5 및 도 9(MNA자임 구조의 우측 구조)]. 다수의 대안적 올리고뉴클레오티드 서열들을, 이것들이 활성 MNA자임 복합체 또는 MNAi 중 어느 하나를 조립하는 것을 조절하는 능력을 가지는지 여부에 대해 테스트하였다.
본 실시예에서(도 4 및 도 5에 도시함), MNA자임의 조립 여부는 (i) 단일 분자(조립 촉진자 F1/2), 또는 (ii) 구성하는 서열들이 모두 촉진자 F1/2에 존재하는 서열들을 포함하는, 2개의 분자들(조립 촉진자 성분 F1과 조립 촉진자 성분 F2)의 존재 하에 관찰될 수 있었다. 촉진자 F2는 하나의 파트자임의 전체 센서 아암과 결합하며, 또한 서로 중첩하여 제2의 파트자임의 센서 아암을 구성하는 4개의 염기 쌍들과 결합하기도 한다. 다른 반응에 있어서, 촉진자 F2의 서열을 포함하는 서열과 부가의 활성 억제자 도메인을 가지는 "활성 억제" 분자를, 이 분자가 MNAi 복합체를 조립하는 반응을 진행시킬 수 있는 능력을 가지는지 여부에 대해 테스트하였다.
3.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
이하 서열에 있어서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 조립 촉진자와 혼성화하는 염기들을 나타내는 것이며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 코어의 일부를 형성하는 염기들을 나타내는 것이고, 또한 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 염기들을 나타내는 것이다. 여기서, "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 인산화를 나타내는 것이다.
서열 번호 6: 파트자임 A RO5A4/2-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 7: 파트자임 B RO5B5/2-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT GTGGAGACGGATTACACCTTCCCACTTGC-P
3.2 리포터 기질
본 실시예에 사용된 리포터 기질은 다음과 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-2-FB이다. SubBi-2-FB를, 이것의 5' 말단에는 6-FAM으로 말단 표지화하고, 이것의 3' 말단에는 BHQ1 부로 표지화하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였으며, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 소문자로 표시한 염기들은 RNA를 나타내는 것이고, 대문자로 표시한 염기들은 DNA를 나타낸다.
서열 번호 4 SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
3.3 조절 인자 올리고뉴클레오티드
본 실시예에서는 몇몇 분자들이 MNA자임 및/또는 MNAi의 조립을 조절하는 능력을 가지는지 여부에 대해 테스트하였다. 조립 촉진자 F2를 구성하는 서열은 또한 촉진자 F1/2와 활성 억제자의 서열 내에 포함되어 있으며, 이것은 굵은 글씨와 밑줄을 쳐서 나타내었다.
서열 번호 8: 조립 촉진자 F1/2:
GCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCT CCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
서열 번호 9: 조립 촉진자 F1:
GCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCT
서열 번호 10: 조립 촉진자 F2:
CCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
서열 번호 11: 활성 억제자 분자:
AAGGTTTCCTCGTCCCTGGGCA CCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
3.4 반응 성분 및 MNA자임 활성의 모니터링
BMG 랩테크 플루오스타 형광 분석기(BMG LabTech F1uoStar fluorometer) 상에서 MNA자임 활성을 실시간 모니터링하였다(반응물의 총 부피 = 50 ㎕). 같은 온도(55℃)에서 4분 동안 반응을 모니터링하였다. 형광 기질인 SubBi-2-FB(1μM 용액중 10㎕)를, 1× PCR 완충액 II(Applied Biosystems), 25mM MgCl2, 200nM의 파트자임 A RO5A4/2-P, 200nM의 파트자임 B RO5B5/2-P를 포함하고, (i) 400nM의 조립 촉진자 F1/2, 또는 (ii) 400nM의 조립 촉진자 성분 F1 및 400nM의 조립 촉진자 성분 F2, 또는 (iii) 400nM의 활성 억제자와 400nM의 조립 촉진자 성분 F1을 함유하는 반응 혼합물을 함유하는 반응 혼합물, 또는 이들 성분 중 (iv) 조립 촉진자를 함유하지 않는 반응 혼합물에 주입하여 반응을 개시하였다.
3.5 결과:
다양한 조절 구성 올리고뉴클레오티드 또는 구조적 구성 올리고뉴클레오티드를 병용한 실험 결과를 도 5에 나타내었다. 형광 신호가 급속하게 증가하였는데, 이는 곧, 조립 촉진자 F1/2(도 5(i)), 또는 조립 촉진자 성분 F1 및 F2(도 5(ii)) 중 어느 하나를 포함하는 반응의 경우 MNA자임의 절단 활성이 높은 수준으로 상승하였음을 나타내는 것이다. 조립 촉진자가 존재하지 않을 때에는 시간이 경과하여도 형광도는 증가하지 않았음을 알 수 있었다(도 5(iv)). 이는 곧, 조립 촉진자는 항상 절단되지 않은 상태의 올리고뉴클레오티드이어야 할 필요는 없고, 오히려 파트자임의 센서 아암 중 하나 상에 서로 인접하여 정렬되어 있는 다수의 짧은 조립 촉진자 성분들로 쪼개질 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
활성 억제자와 촉진자 F1을 포함하는 반응에 있어서도, 시간이 경과함에 따라서 형광 신호는 증가하지 않았음을 알 수 있었다(도 5(iii)). 활성 억제자 분자는 조립 촉진자인 F2의 서열을 포함하기 때문에, 촉진자인 F2와 결합된 부가의 비-상보성 억제자 서열은 MNAi 복합체를 조립시키는 요소가 된다. 상기 MNAi는 기질에 결합할 수 있지만, 촉매 활성에 의해 그것을 변형시킬 수는 없다. 결과적으로, MNAi 복합체가 존재할 경우에는 기질은 절단되지 않았고, 시간이 경과함에 따라서 형광도도 증가하지 않았다(도 5(iii)). 조립 촉진자 성분인 F1 및 F2를 사용하는 반응들(도 5(ii))을, 조립 촉진자 F1과 활성 억제자(F2 서열을 통합함)를 함유하는 반응(도 5(iii))과 비교하였을 때, 활성 억제자내에 억제자 도메인이 존재하면, MNAi 복합체를 조립시키고 활성 MNA자임이 형성되는 것을 막아줌으로써 효소 활성을 조절하는 도구를 제공할 수 있음이 입증되었다.
그러므로, 조립 촉진자 F1/2이 존재할 때 형성되도록 디자인된 MNA자임은 형광을 발생하였다. 이와 같은 예를 통하여, 조립 촉진자 F1/2는 2개의 부분들(조립 촉진자 성분 F1 및 F2)로 나누어져, 촉매 활성인 MNA자임의 조립을 유도하는 능력을 보유할 수 있음을 알 수 있었다. 이 조립 촉진자 성분들이 파트자임 센서 아암 상에서 서로 인접하여 결합되어 있을 경우, 상기 2개의 조립 촉진자 성분들은 함께 활성 MNA자임을 안정적으로 형성하고 형광을 발생시킬 수 있다. 동일한 반응 조건 하에서 실시된 추후 실험을 통하여, 조립 촉진자 성분인 F2만이 존재할 경우에는 시간이 경과 하여도 형광도가 증가하지 않았음을 알 수 있었다(데이터는 제시하지 않음). 그러므로, 이 실시예는, 파트자임이 활성 MNA자임으로 조립될 경우에는 다수의 구성 조립 촉진자들이 존재하여야 함을 입증하는 것이다. 다성분 조립 촉진자들이 필요할 때, 이들 성분 중 하나 이상의 존재 여부는, 활성 MNA자임의 조립을 제어하여 이것들을 스위치-온 및 스위치-오프하는데 이용될 수 있다.
또한, 활성 억제자 분자는 파트자임과 혼성화하여, 2개의 조립 촉진자 성분의 접합부에서 파트자임 센서 아암 상 효소 활성을 나타내는데 필요한, 2차 구조를 파괴함으로써, MNA자임이 조립되는 것을 막을 수 있었다는 사실도 발견하였다(예를 들어, 도 4 및 5 참고). 당업자는, 억제자 분자가 파트자임 A 또는 파트자임 B와 혼성화되거나, 파트자임의 센서 아암 또는 기질 아암 중 어느 하나와 혼성화되도록 디자인될 수 있었음을 알 수 있었다.
분자 예를 들어, 활성 억제자, 파트자임 안정자 아암 성분 그리고 조립 촉진자나 이것들의 성분은, 활성 MNA자임과 불활성 MNA자임 예를 들어, MNAi의 조립을 조절하는데 사용될 수 있다. 활성화 상태(MNA자임)와 불활성화 상태(예를 들어, MNAi) 사이의 전환은, 활성 형태와 불활성 형태 사이를 번갈아 변형시킴으로써 조절될 수 있는 분자 스위치를 형성하는 기작을 제공할 수 있다. 이와 같은 분자 스위치는 핵산 복제 캐스케이드의 제어(도 6, 실시예 4), 또는 자율 치료용, 진단용 그리고 전산용의 분자 규모 기구의 조절에 활용될 수 있었다. 특정 올리고뉴클레오티드 성분의 해체를 유도하는데 사용될 수 있는 다양한 프로토콜에 관하여는 본 명세서 전반에 걸쳐 기술되어 있다.
실시예 4: DNA를 이용하는 신호 캐스케이드( SCUD )
표적 분석물 검출용으로 디자인된 MNA자임 복제 캐스케이드를 진행시키기 위한 하나의 기작에서는, SCUD 캐스케이드 기법을 이용한다. 상기 SCUD 기법은 예를 들어, 2개의 MNA 복합체가 캐스케이드 반응에 통합되는 도 6; 3개의 MNA 복합체가 캐스케이드 반응에 통합되는 도 10; 그리고 MNA 복합체와 DNA자임 둘 다가 캐스케이드 반응에 통합되는 도 11에 도시된 바와 같은 다양한 디자인으로 캐스케이드에 통합될 수 있다.
상기 SCUD 방법은, 혼합물 중에 존재하는 구성 올리고뉴클레오티드로부터 활성 MNA자임과 MNAi가 조립되는 것을 제어하는 능력에 달려있다. SCUD의 한 가지 형태를 도 6에 도시하였다. 이와 같이 SCUD에 관한 실시예에는 신호 증폭을 위한 일반적인 방법이 기술되어 있다.
도 6에 도시된, SCUD(DNA를 이용한 신호 캐스케이드)라고 알려진 방법에는 다음과 같은 성분들이 사용된다:
(i) 3개의 부위들을 함유하는 이중 표지화 RIF(리포터-억제자-촉진자);
a. RIF에 통합될 경우에는 활성 억제자로서의 기능을 하고(제1 기능), RIF가 절단될 때에는 형광 신호를 제공하는 기능을 하는(제2 기능) 것과 같이 이중의 기능을 가지는 활성 억제자/리포터(RI) 도메인,
b. MNA자임 2a의 필수 성분을 형성하는 활성자 조립 촉진자 성분 F2b, 그리고
c. MNA자임 1a 또는 MNA자임 2a 중 어느 하나에 의하여 절단될 수 있으며, RI 및 F2b 도메인 사이에 위치하는 기질 도메인
(ii) 조립 촉진자 성분 F2a;
(iii) 예를 들어, 테스트 시료 중에 존재하는 표적 핵산일 수 있는 조립 촉진자인 F1을 형성할 수 있는 파트자임으로서; 상기 활성 MNA자임 1a는 RIF를 RI와 F2b 성분들로 절단하여, 형광을 발생시키고, MNA자임 활성 억제자 효과가 발생하는 것을 막음과 동시에, 새로운 활성자 조립 촉진자 성분 F2b를 생성할 수 있는 것인 파트자임; 그리고
(iv) 유리된 활성자 조립 촉진자 성분 F2b에 인접하여 존재하는 조립 촉진자 성분 F2a와 파트자임 아암이 결합할 때에만 활성 MNA자임 2a 복합체들을 형성할 수 있는 파트자임. 이후 상기 MNA자임 2a는 더욱 많은 RIF를 절단하여, 더욱 많은 RI와 F2b를 생성시키고, 이로써, MNA자임 2a의 자가 복제 캐스케이드가 진행될 뿐만 아니라, 이에 부수하여 형광 신호도 증폭된다.
예를 들어, 표적 핵산일 수 있는 F1이 존재하지 않을 경우, MNA자임 2a에 대한 파트자임은 비 변형 RIF와 함께 불활성 복합체인 MNAi 2i를 형성할 것이다. 표적 분석물이 존재할 경우, 활성 MNA자임 1a가 형성되어 RIF를 절단하고, 이에 따라서 활성자 조립 촉진자 성분인 F2b가 유리되는데, 이 F2b는 이후 자유롭게 결합하여 활성 MNA자임 2a의 성분이 될 것이다. 또한, MNA자임 2a는 더욱 많은 RIF를 절단할 수 있으므로, 복제/신호 증폭 캐스케이드를 개시할 것이다.
매 회 MNA자임 2a는 RIF 분자를 절단하고, 이에 따라서 새로운 MNA자임 2a를 형성하는데 필요한 더욱 많은 성분들(활성자 F2b 조립 촉진자들)이 생성될 것이다. 상기 MNA자임 캐스케이드가 진행되면, MNA자임 2a의 촉매 활성에 의해 생성된 생성물들인 성분들을 이용하여, 모 MNA자임과 동일한 MNA자임 2a 복합체들이 조립된다. 그러므로, MNA자임 절단 생성물(F2b)은 자가 촉매 활성을 가지는 자가 복제 시스템 내에 새로운 (모) MNA자임 분자의 조립을 유도할 수 있다.
만일 SCUD 기법이 앱타-MNA자임 시스템과 연계될 경우, 상기 SCUD는 핵산 표적(DNA/RNA) 또는 기타 표적 분석물(단백질 및 소분자 등)에 의해 개시될 수 있다. 이 반응은 VYWJR 분석물이 존재할 때에만 개시되므로, 표적 분석물의 검출 및/또는 동정 기술이 된다. 이 방법은 다성분 핵산 복합체의 불활성화 상태와 활성화 상태간 전환을 바탕으로 한다. 표적 증폭 기술 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응 또는 리가제 연쇄 반응과는 달리, SCUD에 의한 MNA자임 복제 및 신호 증폭에는, 이 과정을 촉진하는 단백질 효소를 필요로 하지 않는다. 뿐만 아니라, 몇몇 올리고뉴클레오티드 성분들 예를 들어, 안정자 아암 성분 또는 조립 촉진자 성분을 사용하여, MNA자임의 촉매 활성을 제어 및 조절하는 능력은, MNA자임의 조립이 마이크로 환경 조건 및 이 마이크로 환경에 존재하는 성분들에 의해 엄격하게 조절되도록 할 수 있다.
실시예 5: 소분자 예를 들어, 아데노신 5'-트리포스페이트를 포함하는 비-핵산 분석물을 검출하는데 있어서 MNA자임의 용도
앱타머는 고도의 친화성과 특이성으로 표적 분석물과 결합하는 능력을 가지는, 랜덤한 순서의 올리고뉴클레오티드의 다량 풀로부터 시험관내 진화된 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자이다. 앱타머는 다수의 유형의 분석물 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지질, 뉴클레오티드, 전 세포 및 바이러스에 특이적으로 결합하는 능력을 기준으로 선택되었다. 본 실시예에서, 앱타머 서열은 파트자임 말단부에 일정한 형태로 통합되었으며(앱타-파트자임), 이로써, 활성 앱타-MNA자임은 활성자 리간드가 존재할 때에만 형성되었다. 이러한 목적을 달성하기 위한 몇 가지 방법 예를 들어, 이하 실시예에 사용된 기법이 존재한다(도 7 참고).
이와 같은 예시적인 앱타-MNA자임 검출 기법에 포함된 핵산 올리고뉴클레오티드를 도 7에 도시하였으며, 이는 다음과 같은 성분들을 포함한다;
a) 표준 파트자임;
b) 말단부 중 어느 한 쪽에 앱타머가 통합된 파트자임인 앱타-파트자임;
c) 활성 MNA자임을 조립할 수 있는 파트자임과 앱타-파트자임 둘 다와 결합하는 조립 촉진자;
d) 리포터 기질; 그리고
e) 앱타머 서열의 적어도 일부분과 파트자임 서열의 기질 결합 아암의 일부분에 걸쳐서 확장되어 존재하는 부위 안에서 앱타-파트자임과 혼성화하는 조립 억제자 올리고뉴클레오티드.
활성자 리간드가 존재하지 않을 경우(도 7의 패널 (i)), 조립 억제자 올리고뉴클레오티드는 앱타-파트자임과 결합하여, 그것이 기질과 결합하는 것을 막아준다. 활성자 리간드가 존재할 경우(도 7의 패널 (ii)), 이 활성자 리간드는 앱타-파트자임의 앱타머 서열과 상호 작용하여, 조립 억제자의 결합을 차단하고 활성 앱타-MNA자임이 조립될 수 있도록 만든 후, 상기 기질과 결합하여 이를 절단하게 된다. 그러므로, 앱타-MNA자임은, 활성자 리간드가 존재할 경우에 형성되어 형광 신호를 발생시킬 수 있는 것이다.
소분자인 ATP를 검출하는 것을 이용한 기법이 기술되었다. 본 실시예에 사용된 길이 27 뉴클레오티드의 긴 앱타머 서열은, ATP 및 dATP와의 결합시 매우 특이적이라는 사실이 이미 보고된 바 있다[Achenbach, 2005, Huizenga and Szostak, 1995].
5.1 파트자임 올리고뉴클레오티드, 조립 촉진자 및 억제 올리고뉴클레오티드
본 실시예에서는, ATP 앱타머 서열을 파트자임의 기질 아암에 결합시켜, 앱타-파트자임 분자를 생성하였다(도 7). 상기 앱타-파트자임 및 표준 파트자임의 센서 아암은, 표적 또는 조절 분석물이 존재할 때 MNA자임의 조립을 유도하는 반응에 사용되는, 합성 조립 촉진자와 결합하도록 디자인하였다. 앱타-파트자임 AtpA2/1 및 파트자임 AtpB3/1의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'). 이하 서열에서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 조립 촉진자와 혼성화하는 것이고, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 코어의 일부를 형성하는 것이며, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질에 혼성화하는 것이다. 또한, 파트자임 AtpA2/1에서 보통 글씨로 표시한 염기들은, ATP 또는 dATP와 결합할 수 있는 DNA 앱타머 서열을 나타내는 것이다.
서열 번호 12: 앱타-파트자임 A2 AtpA2/1:
AACGTACACTGCACG CGGTCGAA ATAGTGAGTACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT
서열 번호 13: 파트자임 B3 AtpB3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC GTCTGTACCGTGTAC
조립 촉진자의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3').
서열 번호 14: 조립 촉진자 AtpC/1:
GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT
"조립 억제자" 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3').
서열 번호 15: 조립 억제자 AtpR/1: CCAGGTACTCACTATT
5.2 리포터 기질
이중 표지화된 핵산 리포터 기질을 절단하여 앱타-MNA자임 활성을 모니터링하였다. 본 실시예에 사용된 리포터 기질은 이하와 같은 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-1-FB이다. 소문자 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 대문자 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 밑줄친 염기들은 5' 말단 쪽의 6-FAM 부 위치와 3' 말단 쪽의 BHQ1 부 위치를 나타내는 것이다. FAM 및 BHQ1 사이의 리보뉴클레오티드에서 SubBi-1-FB를 절단하면 형광도가 변한다는 사실이 관찰되었는데, 이와 같은 형광도의 변화를 520㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하고, 이때, 490 ㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다.
서열 번호 16: SubBi-1-FB: ACTCACTATaGGAAGAGATG
5.3 표적 또는 조절 분석물과 대조군 분자
본 실시예에서 사용된 활성자 리간드는 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)와 데옥시아데노신 5'-트리포스페이트(dATP)였다. 구아노신 5'-트리포스페이트(GTP)와 시토신 5'-트리포스페이트(CTP)는 음성 대조군 분자로서 사용하였다. 모든 분자들은 바이오라인(Bioline)으로부터 구입하였다. 핵산 분해 효소를 포함하지 않는 물을, 분석물을 포함하지 않는 대조군으로 사용하였다.
5.4 반응 조건
촉매 활성 앱타-MNA자임에 의하여 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호가 증가하는지 여부에 의해서, 활성자 리간드의 존부를 확인하였다. 기질을 첨가하여 반응을 개시하였는데, 이때 반응물의 총 부피는 50㎕였다. (2차 구조가 형성되는 것을 줄이기 위하여) 기질을 주입하기 전에, 반응물 전부를 60℃에서 5분 동안 예비 항온 처리하였다. 플루오스타 옵티마(BMG Biotech)를 사용하여 47℃에서 반응을 진행시켰다. 각각의 반응에 따른 형광도를 총 10분 동안 3초마다 판독하였다. 각각의 반응물은 최종 농도 200nM AtpA2/1, 200nM AtpB3/1, 200nM AtpC/1, 200nM AtpR/1, 200nM SubBi-1-FB, 25mM MgCl2, 50mM Tris HCl pH 7.5 및 2mM의 ATP, dATP, GTP, 또는 CTP를 함유하였거나 또는 분석물을 함유하지 않았다(물 대조군).
5.5 결과: SubBi-1-FB 리포터 기질의 검출 및 절단
ATP 또는 dATP가 존재하지 않을 때, 형광도는 시간이 경과하여도 증가하지 않고 낮은 수준으로 유지되었는데, 이는 곧, ATP가 존재하지 않으면, 조립 억제자는 활성 앱타-MNA자임/기질 복합체의 조립을 억제한다는 것을 입증해주는 것이다. ATP 또는 dATP가 존재할 경우에는, 형광 신호는 높았을 뿐만 아니라, 시간이 경과함에 따라서도 증가하였다. 이는 곧, 억제자 올리고뉴클레오티드가 dATP 및 ATP에 의해 치환되고, 활성 앱타-MNA자임이 형성되었음을 나타내는 것이다. 앱타-MNA자임의 조립은 리간드에 의존적이었다. GTP 또는 CTP가 존재할 경우, 형광도는 낮은 수준이었는데, 이 형광도 수준은 시간이 경과하여도 증가하지 않았다. GTP 또는 CTP가 존재할 때 관찰된 형광도는 ATP 또는 dATP가 존재하지 않을 때(즉, 리간드 물 대조군 이 존재하지 않을 때) 관찰된 형광도와 유사하였다. 상기 예로써, MNA자임은, 표적 분석물에 대한 특이성이 큰 분석물을 검출하는 방법에 사용되는 앱타머와 커플링될 수 있음을 알 수 있다. 상기 예로써, 조립 억제자 분자는 앱타-MNA자임의 조립을 제어하는데 사용될 수 있으며, 이 시스템에서 ATP가 활성자 리간드 또는 분자 조절 인자로서 사용될 수 있다는 사실을 알 수 있다.
당업자는, 이 기법을 디자인함에 있어서 유동적일 수 있음을 알 것이다. 상기 앱타머는 부분적으로 촉매 활성을 가지는 중심 서열을 함유하는 2개의 파트자임 중 어느 하나의 어느 한쪽 말단(5' 말단 또는 3' 말단)에 통합될 수 있다. 그러므로, 상기 조립 억제자는 상기 앱타머 부위와, (기질과 결합하는) 기질 아암이나 (조립 촉진자와 결합하는) 센서 아암 중 어느 하나와 결합할 수 있다. 첫 번째 디자인(도 7 및 본 실시예)에 있어서, 억제자는 기질의 결합을 차단한다. 두 번째 디자인에 있어서, 억제자는, 조립 촉진자와 앱타-파트자임의 결합을 막으므로, 활성 MNA자임의 조립도 막아줄 것이다.
문헌에는, 다양한 유형의 분석물을 검출할 수 있는 다수의 앱타머에 관한 서열들이 개시되어 있다. 이와 같은 앱타머의 예로서는, 단백질, 탄수화물, 지질, 프리온, 뉴클레오티드, 전 세포 및 바이러스를 포함한다. 이와 같은 유형의 분석물 전부에 대한 앱타머는 파트자임에 결합되어, 다양한 종류의 분자들을 검출할 수 있다. 분석물과 앱타머(또는 앱타-파트자임)의 결합과, MNA자임에 의한 리포터 기질의 절단을 허용하는 반응 조건들(완충액, 온도, 2가 양이온 농도 등)은 실험에 의한 테스트로써 결정될 수 있다.
MNA자임 활성은 조립 억제자의 제거 또는 부가에 의해 조정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 바꾸면, 용융 온도 및/또는 농도를 더욱 섬세하게 조절할 수 있다. MNA 내에 존재하는 조립 억제자의 혼성화는 다양한 인자들 예를 들어, 염 농도, 양이온 농도, 온도 및 부가물(예를 들어, DMSO)의 존부에 의해 영향을 받는다. 그러므로, 혼성화에 영향을 주는 물질들은 MNA 복합체의 조립 및 해체를 제어하는 도구가 될 수 있다.
예를 들어, 부착된 부위들의 물리적 특성(분자 "후크"로서의 특성)을 이용하고/이용하거나, 올리고뉴클레오티드의 고유의 특성 예를 들어, 음 전하성, 또는 서열 상보성을 이용함과 같이, 조립 촉진자, 조립 억제자 또는 기타 MNA 성분들은 물리적인 조작에 의하여 제거될 수 있다.
실시예 6: 리가제 활성을 가지는 DNA자임과 절단 활성을 가지는 MNA자임을 이용하는 분자 스위치
2개의 DNA 효소들의 촉매 활성을 이용하는 분자 스위치를 도 8에 개략적으로 도시하였다. 제1 반응은, RNA 함유 올리고뉴클레오티드를 2',3'-시클릭 포스페이트 및 5'-하이드록실 생성물로 절단할 수 있는 MNA자임에 의해 매개된다. 제2 반응은, 2',3'-시클릭 포스페이트 및 5'-하이드록실 생성물을 결찰할 수 있는 DNA자임 리가제에 의해 매개된다. 이러한 DNA자임의 예에 관하여는 해당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, "7Z81" 리가제 및 "7Z48" 리가제를 포함한다[Prior et al., 2004].
가장 간단한 형태인 올리고 1/2는, MNA자임에 의해 절단 생성물인 올리고 1과 올리고 2로 절단되어, 후속 결찰 반응에 관여할 수 있는 2',3'-시클릭 포스페이트와 5'-하이드록실 생성물을 다시 생성할 수 있다. 이후, DNA자임 리가제는 결찰용 기질로서 절단 생성물을 이용할 수 있다. DNA자임은 제1 올리고뉴클레오티드 생성물(올리고 1)과 제2 올리고뉴클레오티드 생성물(올리고 2)을 결찰시켜, 올리고 1/2와 동일한 서열을 가지는 결찰 생성물을 생성할 수 있다.
다중체 형태일 경우, 몇몇 올리고뉴클레오티드 예를 들어, 4개의 올리고뉴클레오티드는, MNA자임에 의해 2',3'-시클릭 포스페이트와 5'-하이드록실 말단을 가지는 생성물로 절단될 수 있었다. 이 생성물들은 16개의 DNA자임 리가제 세트에 의해 16개의 독특한 신규 결찰 생성물(즉, 올리고뉴클레오티드 1, 2, 3 및 4의 각 조합체)로 결찰될 수 있었다
부가의 MNA자임은, MNA자임 절단에 최소한으로 필요한 서열 조건이 충족되면, 올리고뉴클레오티드 1, 2, 3 및/또는 4 사이의 원래 접합부 이외의 위치(들)에서, 16개의 결찰 생성 올리고 중 하나 이상을 절단할 수 있었다. 예를 들어, 실시예 1의 MNA자임은 기질 내 절단 위치에 퓨린 피리미딘 리보뉴클레오티드가 존재하여야 한다.
MNA자임 세트는 일반적인 조립 촉진자를 사용할 수 있고/있거나, 상기 MNA자임은 이전의 결찰 라운드에서 생성된 결찰 생성물을 조립 촉진자로서 사용할 수 있다. 그러므로, 올리고뉴클레오티드의 결찰에 의해 생성된 새로운 정보(입력) 데이터는 MNA자임에 의해 "판독"된 것임을 알 수 있다. 이후, MNA자임은 "기록" 신호를 절단하여, 새로운 출력 생성물 및/또는 정보를 만들어낼 수 있다. MNA자임이 입력 결찰 생성물을 판독할 수 있는 시스템은 이후, 원래부터 출발 분자 풀에 존재하던 생성 올리고 이외의 올리고로 절단되어, 새로운 출력 서열을 다시 기록하거나 또는 다시 암호화하는데 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서, DNA자임에 의한 결찰은 예를 들어, 새로운 조립 촉진자 또는 이의 성분들을 만듦으로써, 입력 데이터를 "기록"할 수 있다. MNA자임은, 파트자임 센서 아암을 이용하여 조립 촉진자 내에 암호화된 정보에 관해 응답 지령 신호를 보냄으로써 이 데이터를 "판독"할 수 있다. 이후, 상기 MNA자임은 데이터 예를 들어, 새로운 서열(절단 생성물)을 "기록"하여, 추후 (DNA자임 리가제에 대한 기질로서의 역할을 하는 MNA자임 절단 생성물의 적합성을 확인하여) DNA자임 리가제에 의해 "판독"될 수 있는 새로운 출력 데이터를 발생시킨다.
그러므로, 이와 같은 MNA자임/DNA자임 리가제 캐스케이드는 자동 장치를 형성할 수 있다. 이와 같은 장치들은, 상기 정의된 절차에 따라서, 정보를 하나의 형태에서 다른 형태로 전환할 수 있다. 이 경우, 상기 절차는 MNA자임 및 DNA자임 리가제의 센서 아암 및/또는 기질 아암에 의해 계획 및 유도된다.
DNA 및 단백질 효소(제한 엔도뉴클레아제 및 리가제)를 사용하여 전산상의 문제를 해결할 수 있는 자동 장치가, 베넨슨과 그의 동료들(2001)에 의해 개발되었다. 캐스케이드 반응에서, 제한 엔도뉴클레아제는 이중 사슬 DNA를 절단하고, 단백질 리가제는 절단 생성물들을 결찰시킨다. 단백질 효소는 "하드웨어"로서 사용되는 것이고, DNA는 "소프트웨어"를 암호화하는 것이다. 적당한 DNA 소프트웨어 서열들을 선택함으로써 입력 데이터와 자동 장치를 프로그래밍하였다. 자동 장치는 제한 엔도뉴클레아제 절단, 혼성화 및 결찰의 순서로 순환하는 캐스케이드를 통하여 작동되며, 그 결과, 자동 장치의 최종 상태를 암호화하여 전산 결과를 도출해내는, 검출 가능한 출력 분자가 생성된다[Benenson et al., 2001].
MNA자임/DNA자임 리가제 캐스케이드는 베넨슨과 그의 동료들(2001)에 의해 이용된 캐스케이드와 유사한 방식으로 사용되어, 전산상의 문제점들을 해결할 수 있는 장치를 제공할 수 있었다. 베넨슨의 장치와는 달리, MNA자임/DNA자임 리가제 캐스케이드는, 단백질 효소를 사용하지 않더라도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 베넨슨의 장치는 이중 사슬 DNA에 의해 프로그래밍되었던 반면에, MNA자임/DNA자임 리가제 캐스케이드는 다양한 서열들 예를 들어, 초기 입력 올리고뉴클레오티드(들), MNA자임의 기질 아암 및/또는 센서 아암, 그리고 DNA자임 리가제의 기질 아암에 의해 암호화되었다.
다른 구체예에서, 상기 MNA자임/DNA자임 리가제 캐스케이드는 또한, 분자 라이브러리를 구성하고/구성하거나 이 라이브러리의 다양성을 증가시키는 방법에서와 같이, 올리고뉴클레오티드 서열을 "셔플링(shuffling)"하는데 이용될 수도 있었다.
하나의 구체예에서, DNA자임 리가제는 MNA자임의 성분들과 불활성 MNA들을 생성 또는 파괴하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 리가제는 "활성 억제자"를 "조립 촉진자 성분"에 부착시켜, MNAi의 조립체("오프" 상태)를 생성할 수 있었다. 대안적으로, DNA자임 리가제는, 도 11의 (ii) 및 (iv)에 도시한 바와 같이 조립을 촉진함으로써, 파트자임 성분에 센서 아암 또는 기질 아암을 부착시켜, MNA자임에 대한 "온" 스위치를 형성할 수 있었다. 다른 구체예에서, DNA자임 리가제는 예를 들어, 바이오틴 기를 사용하여, 올리고뉴클레오티드를 선택적으로 포착할 수 있도록 하는 부분으로 표지화된 서열을 부착할 수 있었으며, 아니면, 상기 부분은 고 주파 자기장 전파를 받아들여, 전기력에 의해 원거리에서 혼성화가 제어될 수 있었다. 이와 같은 방법은, 효소 활성을 활성화 또는 억제할 수 있는 구성 분자들을 선택적으로 제거할 수 있을 것이다. 예를 들어, 활성 억제자는 MNAi 복합체로부터 선택적으로 변성되어, MNA자임을 활성 상태로 전환할 수 있다.
몇몇 구체예에서, DNA자임에 의한 결찰은 예를 들어, 새로운 조립 촉진자 또는 이의 구성 성분들을 생성시켜, 입력 데이터를 "기록"할 수 있다. MNA자임은, 파트자임 센서 아암을 이용하여 조립 촉진자 내에 암호화된 정보에 관해 응답 지령 신호를 보냄으로써, 이 데이터를 "판독"할 수 있는 것이다. 이후, 상기 MNA자임은 데이터 예를 들어, 새로운 서열(절단 생성물)을 "기록"하여, 이후 MNA자임 절단 생성물이 기질로서 사용되기에 적합한지를 확인함으로써 부가의 DNA자임 리가제에 의해 "판독"될 수 있는 새로운 출력 데이터를 도출할 수 있다.
실시예 7: MNA자임 및 MNAi 분자 스위치에 대한 하나의 예시적 구조
활성 MNA자임 형성에 필요한 조립 촉진자는 2개 이상의 구성 올리고뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 활성 억제자 올리고뉴클레오티드의 존부는 MNAi 구조의 형성을 촉진할 수 있다. 당업자는, 이와 같은 MNA자임과 MNAi에 대한 디자인이 다수 존재함을 알 것이다. 활성 MNA자임 구조에 관한 몇몇 예를 도 9(패널 A∼D; 좌측 구조)에 나타내었다. MNAi 구조의 예는 도 9(패널 A∼D; 활성 MNA자임의 우측 구조)에 나타내었다. 본 실시예는, 도 9의 패널 B에 도시된 구조들 즉 구조 c(MNA자임) 및 d(MNAi)에 관하여 기술하고 있다.
본 실험에 사용된 MNA자임은, 2개의 올리고뉴클레오티드인 조립 촉진자 1(FAC2) 및 조립 촉진자 2(d6p-1)에 의해 조립이 유도되도록 한 후, 리포터 기질인 SubBi-2-FB를 절단하도록 디자인된, 파트자임 RO5A4/2 및 5FAC2B5(6)/2(16)을 포함하였다. 이 실험은 또한, 활성 억제자를 포함하는 복합체가 형성되면 MNAi 복합체가 생성된다는 사실을 보여주기도 한다.
7.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
이하 서열에서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적 핵산(또는 조립 촉진자) 서열(들)과 혼성화하는 것이며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 코어의 일부를 형성하는 것이고, 또한 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질에 혼성화하는 것이다.
서열 번호 17: 파트자임 A RO5A4/2:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GAGGAAACCTT
서열 번호 18: 파트자임 B 5FAC2B5(6)/2(16):
TGCCCAGGGA GGCTAGCT CTGTCCGAGGCGTGAT
7.2 리포터 기질
본 실시예에 사용된 리포터 기질은 이하와 같은 서열(5'→3')을 포함하는 SubBi-2-FB이었다. 상기 SubBi-2-FB의 5' 말단은 6-FAM 부로 말단 표지화하였으며, 그것의 3' 말단은 BHQ1 부로 말단 표지화하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방출 파장)에서 모니터링하였으며, 이때 485㎚(FAM 여기파장)에서 여기시켰다. 소문자의 염기들은 RNA를 나타내는 것이고, 대문자의 염기들은 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 4: SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
7.3 촉진자 및 활성 억제자 올리고뉴클레오티드
사용된 조립 촉진자 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'). 소문자의 염기들은 RNA를 나타내는 것이고, 대문자의 염기들은 DNA를 나타내는 것이다. 일반적으로 조립 촉진자 2와 활성 억제자 사이의 서열은 굵은 글씨로 나타내었다.
활성 억제자 SubBi-6-TRB의 5' 말단에는 텍사스 레드 부로, 그리고 그것의 3' 말단에는 BHQ2 부로 말단 표지화하였다.
서열 번호 19: 조립 촉진자 2(F2) d6p-1 : ATCACGCCTCg
서열 번호 20: 조립 촉진자 1(F1) FAC2:
GACAGAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
서열 번호 21: 활성 억제자 SubBi-6-TRB:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
7.4 반응 성분들 및 MNA자임 활성의 모니터링
총 반응 부피 25㎕인 스마트사이클러(SmartCycler; Cepheid) 상에서 MNA자임 활성을 실시간으로 모니터링하였다. 30분 동안 온도를 일정하게 유지시키면서(52℃) 반응을 모니터링하였다. 반응 혼합물에 형광 기질인 SubBi-2-FB(1μM 용액 5㎕)를 주입하여 반응을 개시하였다. 상기 반응 혼합물은 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystems), 50mM MgCl2, 200nM의 각 파트자임 RO5A4/2 및 5FAC2B5(6)/2(16), 200nM의 촉진자 FAC2를 포함하였으며, 또한 200nM의 조립 촉진자 2(d6p-1)나 200nM의 활성 억제자(SubBi-6-TRB)를 추가로 포함하였다..
7.5 결과:
본 실시예에서, 조립 촉진자는 2개의 올리고뉴클레오티드 성분들을 포함한다. 도 9에서는 MNA에 의해 형성된 구조 즉, 활성 MNA자임(패널 B의 구조 c)과 MNAi(패널 B의 구조 d)를 도식적으로 나타내었다. MNA자임의 조립을 위해서는 2개의 조립 촉진자들(F1 및 F2)과 2개의 파트자임들이 필요하다. 대안적으로, 활성 억제자(I)는 파트자임에 결합하여, MNAi 구조를 형성할 수 있다.
본 실험에서, 파트자임과 2개의 조립 촉진자들 F1 및 F2를 항온 처리하면, 활성 MNA자임이 형성되며, 이 활성 MNA자임은 리포터 기질을 절단하여, 시간이 경과함에 따라 형광도를 약 500 유닛만큼(400 유닛에서 900 유닛으로) 증가시킨다. 이와는 반대로, 파트자임과 하나의 조립 촉진자(F1) 및 하나의 활성 억제자(I)를 함께 항온 처리한 결과, MNAi 구조가 형성되었는데, 이 구조는 리포터 기질을 절단할 수 없었다. 결과적으로, 시간이 경과 함에 따라서 형광도는 백 그라운드 수준과 같이 낮은 정도로만 증가하였는데, 즉, 기준선으로부터 약 20 유닛 정도로만(390 유닛에서 410 유닛으로) 증가하였다. 조립 촉진자(F2)와 활성 억제자(I)는 공통된 서열을 함유하므로, 파트자임의 동일한 부위에 결합한다. 그러나, 활성 억제자에는 존재하지만, 조립 촉진자 F2에는 존재하지 않는 부가의 억제 서열은 MNAi 구조를 형성한다. 활성 억제자로부터 이와 같은 부가의 억제 서열을 제거함으로써, 활성자 조립 촉진자 F2가 생성될 수 있다. 그러므로, 억제 서열을 부가 또는 제거함으로써, 활성 MNA자임에서 MNAi로 또는 그 반대로 스위칭시키는 기작을 제공할 수 있다.
실시예 8: MNA자임 및 MNAi 분자 스위치
활성 MNA자임 형성에 필요한 조립 촉진자는 2개 이상의 구성 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 활성 억제자 올리고뉴클레오티드의 존부는 MNAi 구조의 형성을 촉진할 수 있다. 당업자는, 이러한 MNA자임과 MNAi 복합체에 대한 디자인이 다수 존재함을 알 것이다. 활성 MNA자임 구조의 예를 도 9에 나타내었다(패널 A∼D; 좌측 구조). MNAi 구조의 예를 도 9에 나타내었다(패널 A∼D; 활성 MNA자임의 우측 구조). 본 실시예에는, 도 9의 패널 C의 구조 e(MNA자임)과 f(MNAi)에 도시된 구조에 관하여 기술되어 있다.
본 실험에서 생성된 MNA자임은, 2개의 파트자임(FACA4/6(22) 및 5FAC2B5(2)/6(33))과 3개의 조립 촉진자 성분(촉진자 1(F1), 촉진자 2(F2) 그리고 촉진자 3(F3))으로 조립되었다. 이 실험을 통하여, 활성 억제자(SubBi-2-FB)와 촉진자들 1 (F1) 및 (F3)을 포함하는 복합체를 형성하면, MNAi 복합체를 생성할 수 있음을 알 수 있다.
8.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
이하 서열에 있어서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적 핵산(또는 조립 촉진자) 서열(들)과 혼성화하는 것을 나타내며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 코어의 일부를 형성하는 것을 나타내고, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질에 혼성화하는 것을 나타낸다.
서열 번호 22: 파트자임 A FACA4/6(22):
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GAGGCGTGAT
서열 번호 23: 파트자임 B 5FAC2B5(2)/6(33):
CTGGGAGGAA GGCTAGCT CTGTCCGAGGAAACCTTCGTCGTCCAGACTGCG
8.2 리포터 기질
본 실시예에 사용된 리포터 기질은 이하에 기술된 서열(5'→3')을 포함하는 SubBi-6-TRB였다. SubBi-6-TRB의 5' 말단은 텍사스 레드 부로, 그리고 3' 말단은 BHQ2 부로 말단 표지화하였다. SubBi-6-TRB를 절단한 결과를 610㎚(텍사스 레드의 방사 파장)에서 모니터링하였으며, 이때, 585㎚(텍사스 레드의 여기 파장)에서 여기시켰다. 소문자 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 대문자 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-6-TRB: ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
8.3 촉진자 및 활성 억제자 올리고뉴클레오티드
사용된 조립 촉진자 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'). 조립 촉진자 F2와 활성 억제자 사이의 공통 서열은 굵은 글씨로 나타내었다. 소문자 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 대문자 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 활성 억제자 SubBi-2-FB의 5' 말단에는 6-FAM 부로, 그리고 3' 말단에는 BHQ1 부로 말단 표지화하였다.
서열 번호 24: 조립 촉진자 F1 STAB: CGCAGTCTGGACGACG
서열 번호 25: 조립 촉진자 F2 d2p-1: AAGGTTTCCTCg
서열 번호 4: 활성 억제자 SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
서열 번호 20: 조립 촉진자 F3 FAC2:
GACAGAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
8.4 반응 성분 및 MNA자임 활성의 모니터링
총 반응 부피 25㎕인 스마트사이클러(Cepheid) 상에서 MNA자임 활성을 실시간으로 모니터링하였다. 30분 동안 온도를 일정하게 유지시키면서(52℃) 반응을 모니터링하였다. 반응 혼합물에 형광 기질인 SubBi-6-TRB(1μM 용액 5㎕)를 주입하여 반응을 개시하였다. 상기 반응 혼합물은 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystems), 50mM MgCl2, 200nM의 각 파트자임 FACA4/6(22) 및 5FAC2B5(2)/6(33), 200nM의 촉진자 F1 STAB, 200nM의 촉진자 F3 FAC2를 포함하였으며, 또한 200nM의 조립 촉진자 F2(d2p-1)나 200nM의 활성 억제자(SubBi-2-FB)를 추가로 포함하였다.
8.5 결과:
본 실시예에서, 조립 촉진자는 3개의 올리고뉴클레오티드 성분들로 이루어져 있다. 도 9에서는 MNA 복합체에 의해 형성된 구조 즉, 활성 MNA자임(패널 C의 구조 e)과 MNAi(패널 C의 구조 f)를 도식적으로 나타내었다. 촉매 활성 복합체의 조립을 위해서, MNA자임은 3개의 조립 촉진자들(F1, F2 및 F3)과 2개의 파트자임들을 필요로 한다. 대안적으로, 활성 억제자(I)는 파트자임에 결합하여, MNAi 구조를 형성할 수 있다.
본 실험에서, 파트자임과 3개의 조립 촉진자들 F1, F2 및 F3를 항온 처리하면, 활성 MNA자임이 형성되며, 이 활성 MNA자임은 리포터 기질을 절단하므로, 시간이 경과함에 따라 형광도가 약 330 유닛만큼(140 유닛에서 470 유닛으로) 증가하였다. 이와는 반대로, 파트자임과 2개의 조립 촉진자(F1 및 F3) 그리고 하나의 활성 억제자(I)를 함께 항온 처리한 결과, MNAi 구조가 형성되었는데, 이 구조는 리포터 기질을 절단할 수 없었다. 결과적으로, 시간이 경과 함에 따라서 형광도는 백 그라운드 수준과 같이 낮은 정도로만 증가하였는데, 즉, 기준선으로부터 약 40 유닛 정도로만(80 유닛에서 120 유닛으로) 증가하였다. 조립 촉진자 성분(F2)과 활성 억제자는 공통된 서열을 함유하므로, 파트자임의 동일한 부위에 결합한다. 그러나, 활성 억제자에는 존재하지만, 조립 촉진자 성분인 F2에는 존재하지 않는 부가의 억제 서열은 MNAi 구조를 형성한다. 활성 억제자로부터 이와 같은 부가의 억제 서열을 제거함으로써, 활성자 조립 촉진자 F2 성분이 생성될 수 있다. 그러므로, 억제 서열을 부가 또는 제거함으로써, 활성 MNA자임에서 MNAi로 또는 그 반대로 스위칭시키는 기작을 제공할 수 있다.
실시예 9: 기타 MNA자임 및 MNAi 분자 스위치
활성 MNA자임을 형성하는데 필요한 조립 촉진자는 2개 이상의 구성 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 활성 억제자 올리고뉴클레오티드의 존부는 MNAi 구조의 형성을 촉진할 수 있다. 당업자는, 이와 같은 MNA자임과 MNAi 복합체에 관한 다수의 디자인이 존재함을 알 것이다. 활성 MNA자임 구조의 예를 도 9(패널 A∼D; 좌측 구조)에 도시하였다. MNAi 구조의 예를 도 9(패널 A∼D; 활성 MNA자임의 우측 구조)에 도시하였다. 본 실시예에서는, 도 9의 패널 D, 구조 g(MNA자임) 및 구조 h(MNAi)에 도시한 구조에 관하여 기술하고자 한다.
본 실험에 사용된 MNA자임은 2개의 조립 촉진자 성분인 F1과 F2가 존재할 때 조립되어, 리포터 기질인 SubBi-2-FB를 절단하도록 디자인된 파트자임들을 포함하였다. 파트자임 중 어느 하나(4SYNTB6/2(8))의 센서 아암을 절두하여 8개의 염기들을 만들었다. 다른 올리고뉴클레오티드, 안정자 아암 sA(B6/tag(13))는, 파트자임(4SYNTB6/2(8))의 절두형 센서 아암에 인접하여 존재하는 조립 촉진자 F1에 혼성화하여 MNA자임 복합체를 안정화한다. 조립 촉진자는 2개의 성분들 즉, F1과 F2를 갖는다.
9.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
이하 서열에 있어서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적 핵산(또는 조립 촉진자) 서열(들)과 혼성화하는 것을 나타내는 것이며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 코어의 일부를 나타내는 것이고, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 것을 나타내는 것이다.
서열 번호 26: 파트자임 A 4SYNTA5/2(22):
CAAACGAGTCCTGGCCTTCGAG TACAACGA GAGGAAACCTT
서열 번호 27: 파트자임 B 4SYNTB6/2(8):
TGCCCAGGGA GGCTAGC GAAACCTT
9.2 리포터 기질
본 실시예에 사용된 리포터 기질은 이하에 기술된 서열(5'→3')을 포함하는 SubBi-2-FB였다. SubBi-2-FB의 5' 말단은 6-FAM 부로, 그리고 3' 말단은 BHQ1 부로 말단 표지화하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM의 방사 파장)에서 모니터링하였으며, 이때, 485㎚(FAM의 여기 파장)에서 여기시켰다. 소문자 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 대문자 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 4: SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
9.3 촉진자, 활성 억제자 및 안정자 아암 올리고뉴클레오티드
사용된 조립 촉진자 성분의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'). 소문자 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 대문자 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 조립 촉진자 1 및 활성 억제자 사이의 공통 서열은 굵은 글씨로 표시하였다.
서열 번호 28: 조립 촉진자 F2(RO5/cA(18)): AAGGCCAGGACTCGTTTG
서열 번호 29: 조립 촉진자 F1(r2p-SYNT/cB(25):
GGGAAGGTGTAATAAGGTTTCCTCg
서열 번호 30: 활성 억제자(2-SYNT/cB(25)):
GGGAAGGTGTAATAAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
서열 번호 31: 안정자 아암 sA(B6/tag(13)): ATTACACCTTCCC
9.4 반응 성분 및 MNA자임 활성의 모니터링
총 반응 부피 50㎕인, BMG 랩테크 플루오스타 형광 분석기 상에서 MNA자임 활성을 실시간으로 모니터링하였다. 3분 동안 온도를 일정하게 유지시키면서(40℃) 반응을 모니터링하였다. 반응 혼합물에 형광 기질인 SubBi-2-FB(1μM 용액 10㎕)를 주입하여 반응을 개시하였다. 상기 반응 혼합물은 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystems), 25mM MgCl2, 200nM의 각 파트자임 4SYNTA5/2(22) 및 4SYNTB6/2(8), 200nM의 안정자 아암 B6/tag(13), 200nM의 촉진자 F2 RO5/cA(18)를 포함하였으며, 또한 200nM의 조립 촉진자 F1(r2p-SYNT/cB(25))이나 활성 억제자(2-SYNT/cB(25))를 추가로 포함하였다.
9.5 결과:
본 실시예에서, 조립 촉진자는 2개의 올리고뉴클레오티드 성분들을 포함한다. 도 9에서는 MNA에 의해 형성된 구조 즉, 활성 MNA자임(패널 D의 구조 g)과 MNAi(패널 D의 구조 h)를 도식적으로 나타내었다. 촉매 활성 복합체의 조립을 위해서, MNA자임은 2개의 조립 촉진자들(F1 및 F2), 2개의 파트자임들, 그리고 하나의 안정자 아암을 필요로 한다. 대안적으로, 활성 억제자(I)는 파트자임에 결합하여, MNAi 구조를 형성할 수 있다.
본 실험에서, 2개의 파트자임과 2개의 조립 촉진자 성분들인 F1 및 F2와, 하나의 안정자 아암을 항온 처리하면, 활성 MNA자임이 형성되며, 이 활성 MNA자임은 리포터 기질을 절단하여, 시간이 경과함에 따라 형광도를 약 28,000 유닛만큼(12,000 유닛에서 40,000 유닛으로) 증가시킨다. 이와는 반대로, 파트자임과 하나의 조립 촉진자(F2), 하나의 안정자 아암 그리고 하나의 활성 억제자(I)를 함께 항온 처리한 결과, MNAi 구조가 형성되었는데, 이 구조는 리포터 기질을 절단할 수 없었다. 결과적으로, 시간이 경과 함에 따라서 형광도는 백 그라운드 수준과 같이 낮은 정도로만 증가하였는데, 즉, 기준선으로부터 약 1,500 유닛 정도로만(12,000 유닛에서 13,500 유닛으로) 증가하였다. 조립 촉진자 성분(F1)과 활성 억제자(I)는 공통된 서열을 함유하므로, 파트자임과 안정자 아암의 동일한 부위와 결합한다. 그러나, 활성 억제자에는 존재하지만, 조립 촉진자 F1에는 존재하지 않는 부가의 억제 서열은 MNAi 구조를 형성한다. 활성 억제자로부터 이와 같은 부가의 억제 서열을 제거함으로써, 활성자 조립 촉진자 F1 성분이 생성될 수 있다. 그러므로, 억제 서열을 부가 또는 제거함으로써, 활성 MNA자임에서 MNAi로 또는 그 반대로 스위칭시키는 기작을 제공할 수 있다.
실시예 10: SCUD 캐스케이드
표적 분석물을 검출하기 위해 디자인된 MNA자임 복제 캐스케이드를 진행시키기 위한 한 가지 기작에서는, SCUD 캐스케이드 기법을 이용한다. 상기 SCUD 기법은 예를 들어, 2개의 MNA 복합체가 캐스케이드 반응에 통합된 도 6; 3개의 MNA 복합체가 캐스케이드 반응에 통합된 도 10; 그리고 MNA 복합체와 DNA자임 둘 다가 캐스케이드 반응에 통합된 도 11에 도시한 바와 같이 다양한 다지인으로 캐스케이드에 통합될 수 있다.
SCUD 방법은 혼합물 중에 존재하는 구성 올리고뉴클레오티드들로부터 활성 MNA자임 및 MNAi의 조립을 제어하는 능력에 의존적이다. SCUD 캐스케이드에 관한 일례를 도 10에 도시하였다. 이와 같은 기법에서, 개시 MNA자임(Mt)은 표적(T)가 존재할 경우에 형성된다. 이와 같은 개시 MNA자임은 기질(S1)을 절단하여, 캐스케이드 MNA자임 1(Mc1)의 형성에 필요한 활성자 조립 촉진자 성분(S1f) 중 하나를 생성한다. 이후, MNA자임 1은 기질(S2)을 절단하여, 캐스케이드 MNA자임 2(Mc2)의 형성에 필요한 부가의 활성자 조립 촉진자 성분을 생성한다. 이후, MNA자임 2는 기질(S1)을 절단하여, 캐스케이드 반응을 개시한다.
이하 실험 예에는, 표적이 존재할 경우에, 개시 MNA자임(Mt)이 기질(S1)을 2개의 단편으로 절단하는 능력에 관하여 기술되어 있다. 또한, 개시 MNA자임(Mt)은 S1 기질을 단편들로 절단할 수 있으며, 이들 단편 중 하나(S1f)는, 2개의 기타 촉진자 성분(F1 및 F2)과 함께 MNA자임 Mc1을 형성할 수 있는 활성자 조립 촉진자 성분으로서 작용을 할 수 있으며, 이 MNA자임 Mc1은 제2의 기질(S2)을 절단할 수 있다.
본 실험에서, 개시 MNA자임인 Mt는, 인간 RPLPO 유전자(RO5 표적)의 한 구획을 검출하여, S1 기질인 SubBi-2h-FB를 절단하도록 디자인된 파트자임 RO5A5/2-P 및 RO5B6/2-P을 포함하였다. F1 및 F2 조립 촉진자 성분인 FAC5 및 FAC6와 함께 절단된 SubBi-2h-FB(S1f) 단편은, 파트자임 CasA4(2h)/6 및 CasB5(2h)/6를 포함하는 Mc1 캐스케이드 MNA자임 1의 센서 아암과 결합한다. 완전 조립된 활성 캐스케이드 MNA자임 1은 기질 SubBi-6-TRB를 절단하도록 디자인되었다.
10.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
이하 서열에서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적 핵산(또는 조립 촉진자) 서열(들)과 혼성화하는 것을 나타내는 것이며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 코어의 일부를 형성하는 것을 나타내는 것이고, 이탤릭체로 나타낸 염기들은 기질에 혼성화하는 것을 나타내는 것이다. 상기 "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3'이 인산화되었음을 나타낸다.
서열 번호 51: 파트자임 A RO5A5/2-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT TACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 32: 파트자임 B RO5B6/2-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGC GTGGAGACGGATTACACCTTC-P
서열 번호 33: 파트자임 A CasA4(2h)/6:
GTATCGTGTGTTCTTGCCCTCGTGCCC ACAACGA GAGGCGTGAT
서열 번호 34: 파트자임 B CasB5(2h)/6:
CTGGGAGGAA GGCTAGCT AGGGACGCACTCCTACCTCTA
10.2 리포터 기질
본 실시예에 사용된 S1과 S2 리포터 기질은, 이하의 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-2h-FB 및 SubBi-6-TRB이었다. SubBi-2h-FB의 5' 말단에는 6-FAM 부로 말단 표지화하고, 이것의 3' 말단에는 BHQ1 부로 내부 표지화하였다. SubBi-6-TRB는 그것의 5' 말단에 텍사스 레드 부로 말단 표지화하고, 그것의 3' 말단에는 BHQ2 부로 표지화하였다. 밑줄친 염기들은 형광 단의 위치를 나타내는 것이다. SubBi-2h-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 모니터링하였으며, 이 경우, 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. SubBi-6-TRB를 절단한 결과를 610㎚(텍사스 레드 방사 파장)에서 모니터링하고, 이 경우, 585㎚(텍사스 레드의 여기 파장)에서 여기시켰다. 소문자의 염기들은 RNA를 나타내는 것이고, 대문자의 염기들은 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 35: SubBi-2h-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCACACGAGG
서열 번호 21: SubBi-6-TRB: ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
10.3 촉진자 올리고뉴클레오티드
본 실시예에서는 파트자임 CasA4(2h)/6 및 CasB5(2h)/6의 센서 아암과 혼성화하는 2개의 분자들을 조립 촉진자 성분으로 사용하였다. 상기 F1 및 F2 조립 촉진자 FAC5 및 FAC6의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3').
서열 번호 36: 조립 촉진자 F1 FAC5: GCAAGAACACACGATAC
서열 번호 37: 조립 촉진자 F2 FAC6: TAGAGGTAGGAGTGCG
10.4 표적 서열
본 실시예에 사용된 표적 서열은 이하에 제시된 서열(5'→3')을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 RO5 표적이었다. 이 표적 서열은 인간 RPLPO 유전자의 한 구획인 엑손 5와 동일한 서열을 가진다.
서열 번호 38 RO5 표적:
GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
10.5 반응 성분들과 MNA자임 활성의 모니터링
총 반응 부피 25㎕인 스마트사이클러(Cepheid) 상에서 MNA자임 활성을 실시간으로 모니터링하였다. 12분 동안 온도를 일정하게 유지시키면서(50℃) 반응을 모니터링하였다. 반응 혼합물에 형광 기질인 SubBi-2h-FB 및 SubBi-6-TRB(각 기질의 최종 농도는 0.5μM인, 2.5μM 용액 5㎕)를 주입하여 반응을 개시하였다. 상기 반응 혼합물은 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystems), 25mM MgCl2, 500nM의 각 파트자임 RO5A5/2-P, RO5B6/2-P, CasA4(2h)/6 및 CasB5(2h)/6, 500nM의 각 촉진자 성분 FAC5 및 FAC6를 포함하였으며, 또한 100nM의 RO5 표적을 추가로 포함하였거나, 또는 표적을 포함하지 않았다(H2O 대조군).
10.6 결과:
RO5 표적 서열이 존재할 경우, 파트자임 RO5A5/2-P 및 RO5B6/2-P는 개시 MNA자임인 Mt를 생성하였는데, 이 Mt는 S1 기질을 SubBi-2h-FB로 절단하여, FAM 형광도를 약 1250 유닛만큼(1200 유닛에서 2450 유닛으로) 증가시켰다. S1 기질을 절단한 결과, S1f 촉진자 단편이 생성되었는데, 이 단편은 이후 F1 및 F2 촉진자 성분인 FAC5 및 FAC6와, 파트자임 CasA4(2h)/6 및 CasB5(2h)/6과 함께 작용을 하여, Mc1 캐스케이드 MNA자임 1을 형성하였다. 이후, 상기 MNA자임 1은 제2의 S2 기질인 SubBi-6-TRB를 절단하였으며, 그 결과, 텍사스 레드에 의한 형광도는 900 유닛만큼 증가하였다(250 유닛에서 1150 유닛). 그러므로, FAM과 텍사스 레드 둘 다에 의한 형광도가 증가하였음은 곧, 본 MNA자임 캐스케이드 반응에 표적 서열이 관여한다는 것을 나타내는 것이다.
RO5 표적 서열이 존재하지 않을 경우, FAM에 의한 형광도는 시간이 경과하여도 증가하지 않았으며, 형광도는 시간이 경과함에 따라 텍사스 레드에 대한 형광도는 백 그라운드 수준과 같이 낮은 정도로만 증가하였는데, 즉, 기준선으로부터 약 100 유닛 정도만큼만 증가하였다(240 유닛에서 340 유닛). 표적이 존재하지 않을 때, 파트자임 RO5A5/2-P 및 RO5B6/2-P는 개시 MNA자임인 Mt를 형성할 수 없었으므로, S1 기질인 SubBi-2h-FB는 절단되지 않고, 또한 FAM 형광도도 증가하지 않는다. 절단된 S1 기질이 존재하지 않을 경우, Mc1 캐스케이드 MNA자임 1의 형성을 유도하는 S1f 촉진자 단편도 존재하지 않았다. 절단되지 않은 S1 기질 SubBi-2h-FB는 여전히, 촉진자 FAC5 및 FAC6와, 파트자임 CasA4(2h)/6 및 CasB5(2h)/6를 포함하는 복합체와 결합할 수 있는데, 이로써, S2 기질인 SubBi-6-TRB를 절단할 수 없는 MNAi 구조가 형성된다. 결과적으로, 텍사스 레드의 형광도는 낮은 수준으로 유지된다. FAM과 텍사스 레드 둘 다의 형광도가 거의 증가하지 않음은 곧, 이 MNA자임 캐스케이드 반응에 표적 서열이 관여하지 않음을 말해주는 것이다.
실시예 11: 개시 MNA자임 이벤트를 발생시킨 후, SCUD 피드백 캐스케이드 증폭 반응과 DNA자임 리가제 매개 MNA자임 절단 판독 결과를 이용하여 표적을 검출하는 방법
본 실시예에서 사용된 기법은 도 11에 도시되어 있다. 본 실시예에는 도 11의 (i)∼(iv) 섹션에 도시된 바와 같은 기법에 관하여 기술되어 있다.
(i) 표적 핵산(F1)은, 기질 A를 절단하여 2개의 절단 생성물, 즉, 결찰 반응(섹션 ii)에서 하나의 성분으로서 사용되는 생성물 Aa와, 섹션 (iii)에 나타낸 측면에 활성자 조립 촉진자로서 사용되는 제2의 생성물을 생성시키는, MNA자임 1a의 형성을 유도한다.
(ii) 생성물 Aa는 그것의 3' 말단에 2',3'-시클릭 포스페이트를 가지므로, 리가제 활성을 가지는 DNA자임 2a에 대한 기질로서 작용하기 적당하다. DNA자임 리가제 2a는 섹션 (i)의 측면에서 생성된 생성물 Aa를 다른 올리고뉴클레오티드 결찰 기질 B에 결찰하여, MNA자임 4a에 대한 새로운 파트자임을 생성한다.
(iii) 상기 생성물 Ab는, 파트자임 성분들로부터 활성 MNA자임 3a가 형성되는 것을 유도하는 활성자 조립 촉진자로서 작용을 한다. MNA자임 3a는 기질 A를 절단하여 2개의 생성물인 Aa와 Ab를 생성한다. 이후, 생성물 Ab는, 활성이 더욱 강한 MNA자임 3a의 형성을 유도하는 활성자 조립 촉진자로서 작용을 할 수 있다. 이와 같은 MNA자임 3a 시스템은, SCUD 자가 촉매성 자가 복제 피드백 증폭 캐스케이드를 진행시킨다. 이 SCUD 캐스케이드를 통하여, MNA자임 3a에 대한 활성자 조립 촉진자로서 작용을 할 수 있는 Ab가 추가로 축적되며, DNA자임 2a에 대한 기질로서 작용을 할 수 있는 Aa가 축적된다.
(iv) Aa와 기질 B를 결찰하여 생성된 결찰 생성물은 MNA자임 4a에 대해 새로 결찰된 파트자임을 형성한다. 촉진자 F4와 함께 MNA자임 4a가 생성되며, 이와 같이 생성된 생성물은 형광 단과 소광 염료 쌍 사이에 있는 기질 C를 절단하여, 표적 핵산 F1의 존재에 대한 지표가 되는 형광 신호를 증가시킨다.
본 실시예의 (i), (ii) 및 (iii) 측면들은 동일한 온도의 하나의 튜브 내에서 동시에 일어나는 것이다. 판독 결과 분석 단계((iv) 측면)는 반응에 추가의 시약들을 첨가한 후 수행하였다. 본 실시예에 사용된 DNA자임 리가제는, 2',3'-시클릭 포스페이트 및 5'-하이드록실 기로 2'-5' 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 RNA를 결찰시키는 것으로 이미 보고된 바 있다[Silverman외 다수]. 2',3'-시클릭 포스페이트 말단을 가지는 5' 기질이 필요하다는 점은 논외로 하고, 본 실시예에 사용된 DNA자임 리가제는 또한, 결찰 접합부에 특이적인 서열 모티프(UA*G(A 또는 G))(여기서, *는 결찰 위치를 나타냄)를 필요로 한다.
11.1 DNA자임 리가제 B
DNA자임 리가제로서 작용을 하는 DNA 올리고뉴클레오티드 서열을 이하에 나열하였다.
서열 번호 39: DNA자임 리가제 7Z81-10/10:
CCTCTCGTTGACGGCGGAGTGATTGGGAGGTTAGCTCTAGTGAGTGC
11.2 파트자임 올리고뉴클레오티드
이하 서열에 있어서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적 핵산 서열과 혼성화하는 것을 나타내는 것이며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 코어의 일부를 형성하는 것을 나타내는 것이고, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질에 혼성화하는 것을 나타내는 것이다.
이하, MNA자임 1a의 성분들을 형성하는 파트자임 서열을 제시하였다:
서열 번호 40: 파트자임 A miR20A2/1:
TACCTGCACTA CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 41: 파트자임 B miR20B3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC TAAGCACTTTA
이하 서열은, 결찰 생성물/파트자임과 결합하여, MNA자임 4a의 성분을 형성하는, 파트자임에 해당하는 서열이다.
서열 번호 42: 파트자임 B STB5/2(21):
TGCCCAGGGA GGCTAGCT CTGTCGTCGGAGTGGTCGTCG
이하, SCUD MNA자임 3a의 성분을 형성하는 파트자임의 서열을 나열하였다:
서열 번호 43: 파트자임 A 4SYNTA2/li-10HP:
GGATGGGCACTAACGTGCCCATCCCATCTC CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 44: 파트자임 B 4SYNTB3/li-12HP:
CATCTCTTCT CCGAGC TTCCCATCTCACGACGATAACGTCGTGAGATG
11.3 MNA자임 기질 A(MNA자임 1a 및 3a에 대한 기질)
이하 서열에 있어서, 소문자의 염기들은 RNA를 나타내는 것이고, 대문자의 염기들은 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 45: preSub5:
CTGTAGCACTCACTAuaGGAAGAGATG
11.4 DNA자임 리가제 기질 B
이하 서열에 있어서, 소문자의 염기들은 RNA를 나타내는 것이고, 대문자의 염기들은 DNA를 나타내는 것이다. 이하 서열과 5' 하이드록실기를 포함하도록 3' DNA자임 리가제 기질을 합성하였다:
서열 번호 46 preSub3:
gGAACAACGAGAGGAAACCTT
11.5 MNA자임 기질 C(MNA자임 4a에 대한 형광 리포터 기질)
본 실시예에 사용된 리포터 기질은 SubBi-2였다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부로 말단 표지화하고, 이것의 3' 말단에는 BHQ1 부로 표지화하여, 이를 SubBi-2-FB라 명하였다. SubBi-2-FB를 절단하여 520㎚(FAM 방사 파장)에서 모니터링하고, 이때, 490㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. SubBi-2-FB 서열을 이하에 나열하였다(5'→3'): 소문자의 염기들은 RNA를 나타내는 것이고, 대문자의 염기들은 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 4: SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
11.6 MNA자임 1a에 대한 표적 서열 F1
MNA자임 1a에 의해 인지된 표적 서열은, 인간 마이크로RNA miR-20 RNA 서열과 상동성인 합성 DNA 올리고뉴클레오티드였다. 이 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열을 가졌다:
서열 번호 47: D-20 표적(MNA자임 1a 표적):
TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
11.7 MNA자임 4a에 대한 조립 촉진자
MNA자임 4a 형성에 필요한 조립 촉진자 F4는 다음과 같은 서열을 가지는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드였다:
서열 번호 48: MNA자임 4a에 대한 조립 촉진자 F4:
CGACGACCACTCCGACGACAGTCCTATAGTGAGTGCTACAG
11.8 반응 조건
이하에 기술된 바와 같이, 모든 반응은 하나의 스마트사이클러® 스마트캡 튜브(Cepheid) 내에서 수행되었다. MNA자임 1a 절단, DNA자임 2a 결찰 및 SCUD MNA자임 3a 캐스케이드 증폭 단계(각각 (i), (ii) 및 (iii)의 단계)를, 초기 단일 반응 부피 15㎕에서 동시에 수행하였으며, 이때, 스마트사이클러® 열 순환 시스템(Cepheid) 상에서 일정한 온도로(40℃) 2시간 동안 항온 처리하였다. 반응물은 200nM 프리Sub5, 100nM 프리Sub3, 100nM의 DNA자임 리가제 7Z81-10/10, MNA자임 1a에 대한 파트자임(50nM miR20A2/1 및 300nM miR20B3/1), MNA자임 3a에 대한 파트자임 20nM(파트자임 A 4SYNTA2/li-10HP 및 파트자임 B 4SYNTB3/li-12HP), 150mM NaCl, 2mM KCl, 50mM Tris HCl(pH 9.0, 25℃) 그리고 50mM MgCl2를 포함하였으며, 아울러 여기에 100nM의 D-20 표적, 또는 100pM의 D-20 표적, 또는 100fM의 D-20 표적을 포함시켰거나, 아니면 표적을 포함시키지 않았다(dH2O만의 대조군).
대조군 반응물은 SCUD MNA자임 3a 파트자임 성분들을 포함하지 않은 채로, (i), (ii) 및 (iv) 단계만을 수행하였다. 이와 같은 반응물은 200nM preSub5, 100nM preSub3, 100nM의 DNA자임 리가제 7Z81-10/10, MNA자임 1a에 대한 파트자임(50nM miR20A2/1 및 300nM miR20B3/1), 150mM NaCl, 2mM KCl, 50mM Tris HCl(pH 9.0, 25℃) 및 50mM MgCl2을 포함하였으며, 또한 여기에 100nM의 D-20 표적, 또는 100pM의 D-20 표적, 또는 100fM의 D-20 표적을 포함시켰거나, 아니면 표적을 포함시키지 않았다(dH2O만의 대조군).
SCUD와 대조군 반응물을 항온 처리한 후, 10㎕의 검출 시약 분취액을 스마트캡 시스템 튜브에 첨가하여, 각 성분의 최종 농도를 다음과 같이 맞추었다: 300nM의 파트자임 STB5/2(21), 100nM의 MNA자임 4a에 대한 조립 촉진자 F4, 150mM NaCl, 2mM KCl, 50mM Tris HCl(pH 9.0, 25℃), 50mM MgCl2 및 100nM의 기질 SubBi-2-FB(총 반응 부피 = 25㎕). 반응을 90회 열 순환시키고[55℃→80℃(55℃에서 80초, 80℃에서 20초)], 55℃의 스마트사이클러®(Cepheid) 상에서 형광도를 모니터링하였다.
MNA자임 기질 C(SubBi-2-FB)가 절단되었기 때문에, 시간이 경과 함에 따라서, SCUD 및 대조군 반응물의 형광도는 증가하였음을 알 수 있었다. 형광도의 최소 수준은, 100 유닛의 형광도로 설정하였으며, 최소 형광도 수준에 도달하는데 필요한 각각의 반응 시간을 측정하였다.
11.9 결과
초기 등온 단계(대조군 반응에 있어서는 (i) 및 (ii) 단계, 그리고 SCUD 증폭 캐스케이드를 포함하는 반응에 있어서는 (i), (ii) 및 (iii) 단계)를 거쳐 열 순환 단계((iv) 단계)가 진행되는 동안, 형광도를 측정하였다. SCUD 캐스케이드 성분들과 10OnM의 표적을 포함하는 반응에 있어서, 1 순환하는 동안 최소 형광도에 도달하였으며, 10 순환할 때까지 이 형광도는 일정하게 유지되었다(표 4). SCUD 캐스케이드 성분들과 1OOpM의 표적을 포함하는 반응에 있어서는 19번째 순환시 최소 형광도에 도달하였으나, 80 순환이 지날 때까지 이 형광도는 일정한 수준에 도달하지 못하였다. SCUD 캐스케이드 성분들과 100fM의 표적을 포함하는 반응에 있어서는, 18 순환시 최소 형광도에 도달하였으며, 80 순환이 지날 때까지 이 형광도는 일정한 수준에 도달하지 못하였다.
이와는 대조적으로, SCUD 캐스케이드 성분들은 포함하지만, 표적은 포함하지 않는 반응의 경우, 열 순환이 80회 반복되었을 때조차도 형광도는 최소 값에도 도달하지 못하였다. 그러므로, 최소 형광도에 도달하였음은 곧, 이 반응에 표적 핵산이 존재한다는 것을 말해주는 지표가 된다.
최소 형광도에 도달하는 시간
최소 형광도인 100 유닛에 도달하는데 걸린 시간(분) (NS = 최소 형광도 이상의 신호가 발생하지 않음)
초기 농도 SCUD 대조군
100nM 1 순환 1 순환
100pM 19 순환 59 순환
100fM 18 순환 NS
표적 불포함 NS NS
SCUD 캐스케이드 성분들은 포함하지 않지만, 100nM의 표적을 함유하는 대조군 반응에 있어서는, 1 순환이 지나기 이전에 최소 형광도에 도달하였으며, 이후 34 순환시에도 이 형광도는 일정하게 유지되었다(표 4). 100pM의 표적을 포함하는 대조군 반응에 있어서, 59 순환시 최소 형광도에 도달하였으며, 이후 80 순환 후에는 이 형광도가 일정하게 유지되지 않았다. 100fM의 표적을 포함하는 대조군 반응에 있어서, 80 순환후에는 최소 형광도에 도달하지 않았다. 이와 유사하게, 표적을 포함하지 않는 대조군 반응의 경우에는 80 순환 이후에도 최소 형광도에 도달하지 못하였다. 그러므로, 최소 형광도에 도달하였음은 곧, 이 반응에 표적 핵산이 존재함을 나타내는 지표가 된다. 상기 관찰 결과는, (i), (ii), (iii) 및 (iv) 단계에 관여하는 모든 성분들을 포함하는 반응에 있어서 효소 증폭 단계를 수행한 이후의 결과와 일치하였다(도 11). 우선, MNA자임 1a은 F1 특이 표적(D-20)의 존재 하에 기질 A를 절단하여, 2개의 단편들(Aa 및 Ab)((i) 단계)을 생성한다. 상기 Aa 단편은 2',3'-시클릭 포스페이트 말단부를 가지는 5' 단편(CTGTAGCACTCACTAua)(서열 번호 49)이었다. 그 다음, Ab 생성물은, 활성 MNA자임 3a의 형성을 유도하는 활성자 조립 촉진자 성분으로서 작용한다. MNA자임 3a는 기질 A를 절단하여, 2개의 생성물 즉, Aa 및 Ab를 생성한다. 이후, 생성물 Ab는 활성이 더욱 큰 MNA자임 3a의 형성을 유도하는 촉진자로서 작용을 할 수 있다. 그러므로, MNA자임 3a 시스템은 SCUD 자가 촉매성 자가 복제 피드백 증폭 캐스케이드((iii) 단계)를 진행시킨다. 이 SCUD 캐스케이드는 또한 Aa를 추가로 축적시키는데, 이 Aa는 DNA자임 2a에 대한 기질로서 작용을 할 수 있다. 세 번째로, 5' 단편 Aa는 반응 혼합물 중에 존재하는 제2 리가제 기질 B를 결찰하여, 서열 CTGTAGCACTCACTAuagGAACAACGAGAGGAAACCTT(서열 번호 50)(여기서, 대문자는 DNA 염기들을, 소문자는 RNA 염기들을 나타냄)을 가지는 새로운 올리고뉴클레오티드(결찰 생성물 Aa/B)를 형성한다((ii) 단계). 이와 같은 결찰 생성물은 MNA자임 4a에 대한 파트자임 성분으로서 작용한다. 마지막으로, 상기와 같이 새로이 생성된 파트자임은 제2의 파트자임(STB 5/2(21)) 및 F4 조립 촉진자와 결합하여, MNA자임 4a를 생성한다(단계 (iv)). 이후, MNA자임 4a는 MNA자임 기질 C(SubBi-2-FB)를 절단하여, 형광 단과 소광 염료 쌍을 분리하고, 그 결과, 형광도를 증가시킨다.
상기 (i), (ii) 및 (iv) 단계의 성분들만을 포함하는 대조군 반응에 있어서(도 11), 상기와 같은 관찰 결과는 후속 이벤트에서도 마찬가지다. 우선, MNA자임 1a는 F1 특이 표적(D-20)이 존재할 경우 MNA자임 기질 A를 절단하여, 2개의 단편(Aa 및 Ab)을 생성한다((i) 단계). Aa 단편은, 2',3'-시클릭 포스페이트 말단을 가지는 5' 단편(CTGTAGCACTCACTAua)(서열 번호 49)이다. 상기 5' 단편 Aa는 반응 혼합물 중에 존재하는 제2 리가제 기질 B와 결찰되며, 그 결과, 새로운 올리고뉴클레오티드(결찰 생성물 (Aa/B))가 형성된다((ii) 단계). 이후, 이와 같은 결찰 생성물은 MNA자임 4a에 대한 파트자임 성분으로서 작용을 한다. 마지막으로, 상기 새로 생성된 파트자임은 제2 파트자임(STB5/2(21)) 및 F4 조립 촉진자와 결합하여, MNA자임 4a를 생성한다((iv) 단계). 이후, MNA자임 4a는 MNA자임 기질 C(SubBi-2-FB)를 절단하고, 그 결과, 형광 단 소광 염료 쌍이 분리가 되면서, 형광도가 증가하게 된다.
표적을 포함하지 않았던 반응을 통하여, SCUD MNA자임 성분을 포함하거나 또는 포함하지 않는 반응에 있어서 형광 신호의 발생 여부는, 표적 핵산의 존재에 의존적이었음을 알 수 있다. SCUD MNA자임 성분은 포함하되, 표적은 포함하지 않는 반응에 있어서는, 촉진자 단편인 Ab가 형성되지 않았으며, 이에 따라서, 비 변형 기질 A는 MNA자임 3a에 대한 파트자임과 결합하였고, MNAi 복합체가 형성되었다. 도 9에는, SCUD MNA 복합체에 의해 형성된 구조 즉, 활성 MNA자임 3a(패널 A, 구조 a)와 MNAi(패널 A, 구조 b)에 의해 형성된 구조가 도시되어 있다. MNA자임은 기질을 절단하였을 때 생성될 수 있는 조립 촉진자(F1, 패널 A, 구조 a, 도 9); 또는 활성자 조립 촉진자(도 11 (iii) 단계의 Ab)를 필요로 한다. 비 변형 기질은 MNAi 구조와 결합하여, 활성 억제자(I)로서 작용을 할 수 있다(도 9의 패널 A, 구조 b). MNA자임 3a를 생성하기 위하여 본 실험에 사용된 파트자임은 양 파트자임의 말단에 자기 상보성 부위를 포함하는 센서 아암을 보유하였다. 조립 촉진자는 상보성 부위 사이에 있는 부위에 결합한다(도 9의 패널 A 구조 a, 및 도 11(iii) MNA자임 3a).
SCUD MNA자임 성분을 포함하거나 포함하지 않는 반응의 검출 한계를 비교해보면, SCUD 성분들이 존재할 경우 소량의 표적도 검출할 수 있는 신호가 증폭된다는 것을 알 수 있다. SCUD MNA자임 3a 파트자임 성분을 포함하지 않는 반응의 검출 한계는 1×109개(10OpM 출발 농도)의 분자이다. 이에 비하여, SCUD 성분들을 함유하는 반응의 경우에는 1×106개(10OfM 출발 농도)의 분자를 검출할 수 있었다. 뿐만 아니라, MNA자임 3a에 대한 SCUD 파트자임 성분들을 포함하지 않는 반응에 대해 59회 반복 수행한 경우에 비하여, SCUD 성분들을 포함하는 반응에서 19회 반복 수행한 경우에, 1×109개의 분자에 대해 최소 치 이상의 신호가 검출되었다. 그러므로, 개시 MNA자임(1a)과 함께 SCUD 성분들(MNA자임 3a에 대한 파트자임)이 존재하면, 활성자 조립 촉진자 성분인 Ab가 생성되어, 검출 시간과 검출 한계 둘 다 낮출 수 있었다. 이 기작은 더욱 많은 MNA자임 3a에 대해 더욱 많은 촉진자들을 생성하여 신호 증폭 기작을 제공하는, 각각의 SCUD MNA자임 3a가 관여하는 피드백을 바탕으로 한다(도 11, (iii) 단계). 이와 같은 SCUD 신호 증폭법은, 핵산 효소의 촉매 활성에만 의존적이고, 단백질 효소 예를 들어, 기타 핵산 표적 증폭법 예를 들어, PCR에 사용된 단백질 효소의 촉매 활성에는 의존적이지 않는 기작에 의해 신호를 증폭시킬 수 있다. 뿐만 아니라, SCUD 증폭은 실험의 제1 단계가 진행되는 동안 등온 조건에서 진행되었으며, 이 경우 시약들은 40℃에서 항온 처리되었다. 결과적으로, SCUD는 자가 촉매성 자가 복제를 수행하여, 등온 조건 하에서 신호를 증폭시킬 수 있다. SCUD는 단백질 효소를 필요로 하지 않는 방식으로 검출 감수성과 검출 속도를 증가시킬 수 있다.
실시예 12: MNA 복합체를 이용한 전가산기
MNA자임을 비롯한 MNA 복합체는 분자 차원의 전가산기를 개발하는데 이용될 수 있다. MNA자임을 바탕으로 하는 전가산기가 어떻게 구성될 수 있었는지를 설명해주는 하나의 예시적인 디자인 모식도를 도 12에 제시하였다.
이하 표 5에 따르면, 전가산기는 3개의 채널(A, B, C)을 통하여 입력 데이터를 받아서, 이 입력 데이터를 바탕으로 2개의 출력 온 채널(X, Y)을 만든다.
입력 A 입력 B 입력 C 출력 X 출력 Y
온 온
온 온
온 온
온 온 온
온 온 온
온 온 온
온 온 온 온 온
명확히 하기 위하여, 미스 신호(missing signal)(또는 "오프" 신호)는 상기 표에 빈 칸으로 표시하였다. 요약하면, 출력 X는 정확히 하나 또는 3개 입력 데이터 전부가 존재할 때 "온" 상태가 되고, 출력 Y는 2개 또는 3개의 입력 데이터가 존재할 때 "온" 상태가 된다. 반면에, 전가산기는 보통 전기 신호(입력 및 출력)를 이용하여 회로 논리에 따라서 작동되며, 이 시스템은, 검출 가능 이벤트로서 표시되는 입력 데이터와, 검출 가능 이벤트 또는 검출 가능 효과로 표시되는 출력 신호가 관여하는 생체 경로를 통해 운영된다.
상기 표에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 아무것도 입력하지 않은 경우(입력 데이터가 없는 경우) 이외에, 입력 데이터에서 나올 수 있는 경우의 수는 7이다. 이중 3은 정확히 하나의 입력 데이터가 존재하는 경우이고(논리 언어 NANDNAND로 표시됨), 3은 2개의 입력 데이터가 존재하는 경우이며(논리 언어 AND로 표시됨), 나머지 하나는 3개의 입력 데이터 전부가 존재하는 경우이다(논리 언어 ANDAND로 표시됨).
도 12에 도시된 하나의 시스템에서, 7개의 논리 게이트들은 하나의 테스트 튜브 내에서 적용하도록 디자인하였기 때문에, 이 튜브에 가하여진 입력 데이터들을 임의로 조합하면 예상한 대로의 결과(예를 들어, 형광도)를 얻을 것이다. 이 게이트들은 모두 반응 용기에 가하여지기 이전에 별도로 구성한다. 도 12에 있어서, 흑색 올리고뉴클레오티드는 게이트가 풀링되기 이전에 예비로 복합체를 형성하고, 실제 게이트를 포함하며, 청색 및 녹색 기질은 상이한 형광 단이 부착된 기질을 나타낼 뿐만 아니라, 2개의 출력 신호들을 포함하고, 또한 FAC("촉진자") 분자는 입력 데이터를 구성한다. 각 게이트의 파트자임은 독특한 서열을 포함하는데, 다만, 리포터와 센서 아암이 둘 다 동일한 기질 및 FAC 또는 C 올리고뉴클레오티드와 결합하는 경우에는 예외이다. 이와 같은 경우에 있어서, 동일한 파트자임은 2개의 개별 게이트 예를 들어, AND 게이트 2 및 3의 B 파트자임, NANDNAND 게이트 2 및 3의 B 파트자임, 그리고 NANDNAND 게이트 1과 ANDAND 게이트의 B 파트자임을 구성하는데 사용될 수 있다(도 12). FAC1 및 FAC2 올리고뉴클레오티드는 조립 촉진자로서 작용을 하는 반면에, FAC3은 아암 안정자로서의 작용을 하고, 다만, 이와 같은 흐름에서, 모든 FAC 올리고뉴클레오티드들은 동일한 목적 즉, 논리 게이트를 활성화/불활성화하고자 하는 목적을 수행한다. "C" 올리고뉴클레오티드(C1, C2, C3)는 이것과 상응하는 FAC 올리고뉴클레오티드에 상보성이며, 파트자임과 예비적으로 복합체를 형성한다. 이 C 올리고뉴클레오티드를 반응 용기에 가할 때, 상기 FAC는 분지 이동 과정 즉, 상보성 C 올리고뉴클레오티드를 포함하는 게이트를 불활성화시키는 과정을 통해 이것의 상보성 C 올리고뉴클레오티드를 해리시킬 것이다. 이러한 과정은, 상기 C 올리고뉴클레오티드와 이의 상응하는 FAC 올리고뉴클레오티드를 연장시켜, 분지가 이동을 시작할 수 있는 유리 서열을 제공함으로써 진행될 수 있다.
이 디자인에 있어서, 임의의 FAC 하나 그리고 유일한 FAC 하나를 첨가하면, 첫번째 형광 색이 나타날 것이며(이 실시예에서는, 도 12의 "청색" 형광), 2개의 FAC를 임의로 조합하면, 두 번째 형광 색이 나타날 것이고(도 12의 "녹색" 형광), 또한 3개의 FAC가 전부 반응 용기에 가하여지면, 상기 두 가지 형광 색(도 12의 "청색" 및 "녹색")이 나타날 것이다.
이하, 도 12를 참고로 하여 설명하고자 한다. 예를 들어, 만일 FAC 분자가 존재하지 않으면, 모든 복합체는 불활성인 상태로 유지될 것인데, 이 경우, 각각의 복합체를 활성인 상태로 만드는데 필요한 모든 성분들이 다 유용한 것은 아니다. 형광은 발생하기 않을 것이다.
예를 들어, FAC1이 유일한 입력이라면,
* FAC1이 예비적으로 복합체를 형성한 파트자임들, C2 및 C3 올리고뉴클레오티드들, 그리고 기질과 결합할 때, 이 FAC1은 첫 번째 NANDNAND 게이트를 활성화하여(도 12), 청색 형광을 나타낸다. 이 FAC1은 또한 FAC2와 FAC3가 활성 MNA자임을 형성할 수 없기 때문에 어떠한 경우에도 불활성 상태인 두 번째 및 세 번째 NANDNAND 게이트의 C1 올리고뉴클레오티드를 해리시키기도 한다.
* 오로지 FAC1만이 유용할 때, ANDAND 및 AND 게이트는 활성화를 진행시키는데 있어서 다른 FAC 분자들을 필요로 하므로, 이 게이트들은 활성을 갖지 않게 된다.
예를 들어, 만일 FAC1 및 FAC2가 입력 데이터이면, 이하의 현상들이 발생할 것이다:
* 필요한 올리고뉴클레오티드들이 둘 다 활성 MNA자임을 형성할 수 있기 때문에, 도 12의 세 번째 AND 게이트는 활성을 갖게 되며, 이로써 녹색 형광이 나타나게 된다.
* 나머지 2개의 AND 게이트(도 12)는 FAC3을 필요로 하기 때문에 활성화되지 않을 것이다.
* 필요한 FAC 분자 중 2개만을 사용할 수 있으므로, ANDAND 게이트는 활성을 갖지 않을 것이다.
* FAC1 및 FAC2는 도 12의 첫 번째 및 두 번째 NANDNAND 게이트를 각각 조합할 수 있다. 그러나, FAC1은 두 번째 NANDNAND 게이트(도 12)에 있어서 이의 상보성 C1 올리고뉴클레오티드를 해리시킬 것이므로, 활성을 가지지 않을 것이다. FAC2는 첫 번째 NANDNAND 게이트(도 12)에 있어서 상보성 C2 올리고뉴클레오티드를 해리할 것이므로, 활성을 가지지 않을 것이다. 세 번째 NANDNAND 게이트는 FAC3를 필요로 하기 때문에(그리고, C1 및 C2는 각각 FAC1 및 FAC2에 의해 해리될 것이기 때문에), 활성을 가지지 않는다.
* 그러므로, 어떠한 게이트로부터도 청색 형광은 나타나지 않는다.
* 관련된 AND 게이트만이 녹색 형광을 나타낸다.
예를 들어, 만일 3개의 FAC 올리고뉴클레오티드들이 전부 존재하면:
* AND 게이트와 ANDAND 게이트는 활성화되어, 각각 녹색 형광 및 청색 형광을 나타낸다.
* "C" 올리고뉴클레오티드들이 이것들의 각각의 FAC 올리고뉴클레오티드에 의해 해리될 것이라는 사실로 보았을 때, NANDNAND 게이트는 활성화될 것이다.
당업자는, FAC 올리고뉴클레오티드(들)를 기타 임의로 조합하는 것과 유사한 방식으로, 이러한 과정이 적용될 수 있음을 알 것이다.
또한, 당업자는, 하나의 전가산기로부터 나온 출력 신호가 다른 전가산기의 입력 데이터로서 사용될 수 있음도 알 것이다.
참고 특허 및 특허 출원 공보
PCT 국제 특허 출원 공보 WO 99/45146
PCT 국제 특허 출원 공보 WO 99/50452
미국 특허 제6,140,055호
미국 특허 제6,201,113호
미국 특허 제6,365,724호
기타 참고 문헌
Figure 112009027273992-PCT00001
Figure 112009027273992-PCT00002
Figure 112009027273992-PCT00003
Figure 112009027273992-PCT00004
SEQUENCE LISTING <110> JOHNSON & JOHNSON RESEARCH PTY LIMITED <120> MOLECULAR SWITCHES AND METHODS FOR THEIR USE <130> 780920C <140> <141> <150> 60/828,451 <151> 2006-10-06 <160> 51 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (38) <223> Phosphorylated thymine <400> 1 actggatgtc catctgtctg acaacgagag gaaacctt 38 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (23) <223> Phosphorylated cytosine <400> 2 tgcccaggga ggctagctta tac 23 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (15) <223> Phosphorylated guanine <400> 3 cttcgtgagg gtgag 15 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 aaggtttcct cguccctggg ca 22 <210> 5 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 tgccccctca ccctcacgaa ggtatacaga cagatggaca tccagttggt ga 52 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (40) <223> Phosphorylated thymine <400> 6 caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag aggaaacctt 40 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (47) <223> Phosphorylated cytosine <400> 7 tgcccaggga ggctagctgt ggagacggat tacaccttcc cacttgc 47 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 gcaagtggga aggtgtaatc cgtctccaca gacaaggcca ggactcgttt g 51 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 gcaagtggga aggtgtaatc cgtct 25 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 ccacagacaa ggccaggact cgtttg 26 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 aaggtttcct cgtccctggg caccacagac aaggccagga ctcgtttg 48 <210> 12 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 aacgtacact gcacgcggtc gaaatagtga gtacctgggg gagtattgcg gaggaaggt 59 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 catctcttct ccgagcgtct gtaccgtgta c 31 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 gtacacggta cagaccgtgc agtgtacgtt 30 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 ccaggtactc actatt 16 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 actcactata ggaagagatg 20 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag aggaaacctt 40 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 tgcccaggga ggctagctct gtccgaggcg tgat 34 <210> 19 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 atcacgcctc g 11 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 gacagagaca aggccaggac tcgtttg 27 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 atcacgcctc gutcctccca g 21 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag aggcgtgat 39 <210> 23 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 ctgggaggaa ggctagctct gtccgaggaa accttcgtcg tccagactgc g 51 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 cgcagtctgg acgacg 16 <210> 25 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 aaggtttcct cg 12 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 caaacgagtc ctggccttcg agtacaacga gaggaaacct t 41 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 tgcccaggga ggctagcgaa acctt 25 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 aaggccagga ctcgtttg 18 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gggaaggtgt aataaggttt cctcg 25 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 gggaaggtgt aataaggttt cctcguccct gggca 35 <210> 31 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 attacacctt ccc 13 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (38) <223> Phosphorylated cytosine <400> 32 tgcccaggga ggctagcgtg gagacggatt acaccttc 38 <210> 33 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 gtatcgtgtg ttcttgccct cgtgcccaca acgagaggcg tgat 44 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 ctgggaggaa ggctagctag ggacgcactc ctacctcta 39 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 aaggtttcct cguccctggg cacacgagg 29 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 gcaagaacac acgatac 17 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 tagaggtagg agtgcg 16 <210> 38 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gaaggtgtaa tccgtctcca cagacaaggc caggactcgt ttg 43 <210> 39 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 cctctcgttg acggcggagt gattgggagg ttagctctag tgagtgc 47 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 tacctgcact acggtcgaaa tagtgagt 28 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 catctcttct ccgagctaag cacttta 27 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 tgcccaggga ggctagctct gtcgtcggag tggtcgtcg 39 <210> 43 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ggatgggcac taacgtgccc atcccatctc cggtcgaaat agtgagt 47 <210> 44 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 catctcttct ccgagcttcc catctcacga cgataacgtc gtgagatg 48 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ctgtagcact cactauagga agagatg 27 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 ggaacaacga gaggaaacct t 21 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 taaagtgctt atagtgcagg ta 22 <210> 48 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 cgacgaccac tccgacgaca gtcctatagt gagtgctaca g 41 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 ctgtagcact cactaua 17 <210> 50 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 ctgtagcact cactauagga acaacgagag gaaacctt 38 <210> 51 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (41) <223> Phosphorylated thymine <400> 51 caaacgagtc ctggccttgt cttacaacga gaggaaacct t 41

Claims (116)

  1. 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 파트자임을 포함하는 분자 스위치(molecular switch)로서, 상기 파트자임은 촉매 코어 부분, 센서 아암 부분 및 기질 아암 부분 중 하나 이상, 그리고 조립 촉진자 올리고뉴클레오티드, 기질 올리고뉴클레오티드, 활성 억제자 및 조립 억제자를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 올리고뉴클레오티드 성분 또는 이들의 임의 조합을 포함하고, 상기 분자 스위치는 다성분 핵산(Multicomponent Nucleic Acid; MNA) 복합체를 형성할 수 있는 것인 분자 스위치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스위치는 해체된 복합체, 부분 조립된 복합체, 완전 조립된 MNA자임 또는 완전 조립된 촉매 불활성 MNA 복합체를 포함하는 것인 분자 스위치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스위치는 MNAi를 포함하는 것인 분자 스위치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 활성 억제자는 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상과 실질적으로 비-상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 분자 스위치.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 파트자임 센서 아암, 파트자임 기질 아암, 조립 촉진자 올리고뉴클레오티드 및 기질 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상은 2개 이상의 분자를 포함하는 것인 분자 스위치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 파트자임 센서 아암, 파트자임 기질 아암, 조립 촉진자 올리고뉴클레오티드, 기질 올리고뉴클레오티드, 활성 억제자 또는 조립 억제자 중 하나 이상은 자기 상보성(self-complementarity)을 갖는 하나 이상의 부위를 포함하는 것인 분자 스위치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 파트자임 센서 아암, 파트자임 기질 아암, 조립 촉진자 올리고뉴클레오티드 또는 기질 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상은 하나 이상의 앱타머 및 하나 이상의 조립 억제자를 추가로 포함하는 것인 분자 스위치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스위치의 하나 이상의 성분은 입력 이벤트(input event)에 대한 복합체의 감수성을 증가 또는 감소시키고/시키거나, 출력 신호(output signal)의 강도를 변경시키도록 적응할 수 있는 것인 분자 스위치.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 억제자는 조립 촉 진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것인 분자 스위치.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 안정자 아암(stabiliser arm)을 추가로 포함하는 분자 스위치.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스위치의 하나 이상의 성분은 핵산을 포함하는 것인 분자 스위치.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스위치의 하나 이상의 성분은 하나 이상의 나노 입자, 마이크로 입자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 분자 스위치.
  13. 분자 스위치로서 MNA 복합체의 용도로서, 상기 복합체는 입력 이벤트에 반응하여 불활성 MNA 복합체에서 활성 MNA 복합체로 전환되는 것인 용도.
  14. 제13항에 있어서, 상기 불활성 복합체는 해체된 복합체, 부분 조립된 복합체 또는 완전 조립된 촉매 불활성 MNA 복합체를 포함하는 것인 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 불활성 복합체는 조립 억제자를 포함하는 것인 용도.
  16. 제14항에 있어서, 상기 촉매 불활성 MNA 복합체가 MNAi인 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 MNAi는 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함하는 활성 억제자를 포함하는 것인 용도.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 활성 MNA자임으로의 전환은 적어도 상기 활성 억제자 또는 활성 억제자 도메인의 MNAi로부터의 치환을 포함하는 것인 용도.
  19. 제18항에 있어서, 상기 치환은 상기 활성 억제자 도메인과 상기 활성자 조립 촉진자 도메인을 연결하는 절단 가능 기질의 절단을 포함하는 것인 용도.
  20. 제13항에 있어서, 상기 입력 이벤트가 억제자의 제거 또는 그 억제자의 억제 기능의 불활성화인 용도.
  21. 제13항에 있어서, 상기 입력 이벤트는 촉매 활성 MNA자임의 조립을 형성하는 것인 용도.
  22. 제13항에 있어서, 상기 입력 이벤트는 (i) 외부 공급에 의해 제공되거나, 또 는 (ii) MNA 복합체의 환경에서의 반응 생성물인 활성자의 공급을 포함하는 것인 용도.
  23. 분자 스위치로서 MNA 복합체의 용도로서, 상기 복합체는 입력 이벤트에 반응하여 활성 MNA 복합체에서 불활성 MNA 복합체로 전환되는 것인 용도.
  24. 제23항에 있어서, 상기 활성 복합체가 MNA자임인 용도.
  25. 제23항에 있어서, 상기 불활성 MNA 복합체로의 전환은 활성 MNA 복합체의 해체와 관련되어 있는 것인 용도.
  26. 제23항에 있어서, 상기 불활성 MNA 복합체로의 전환은 불활성 MNA 복합체의 조립과 관련되어 있는 것인 용도.
  27. 제23항에 있어서, 상기 입력 이벤트가 억제자의 부가 또는 그 억제자의 억제 기능의 활성화인 용도.
  28. 제23항에 있어서, 상기 입력 이벤트가 억제자의 결합인 용도.
  29. 제28항에 있어서, 상기 억제자가 조립 억제자인 용도.
  30. 제28항에 있어서, 상기 억제자가 활성 억제자 또는 활성 억제자 도메인인 용도.
  31. 제23항에 있어서, 상기 불활성 MNA 복합체가 MNAi인 용도.
  32. 제27항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 억제자 또는 상기 조립 억제자는 (i) 외부 공급에 의해 제공되거나, 또는 (ii) MNA 복합체의 환경에서의 반응 생성물인 것인 용도.
  33. 제13항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전환은 출력 신호의 변화를 형성하는 것인 용도.
  34. 제13항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 입력 이벤트는 온도, 염 농도, 이온 세기, pH, 2가 양이온 존재 또는 부재, 종류 또는 농도, 전기 전하, 자기 전하(magnetic charge), 물리적 조작에서의 변화 및, MNA 또는 조정자 성분 또는 마이크로 환경의 성분의 농도에서의 변화 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  35. 제33항에 있어서, 상기 출력 신호의 변화가 이전에 존재하지 않은 신호의 발 생, 이전에 존재한 신호의 소멸, 또는 출력 신호의 증가 또는 감소인 용도.
  36. 제33항에 있어서, 상기 출력 신호는 기질의 변형 정도에 의존하고, 상기 변형은, 절단, 결찰, 포르피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합의 형성, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  37. 제33항에 있어서, 상기 출력 신호는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의 조합에 의해 측정되는 것인 용도.
  38. 제37항에 있어서, 상기 측정은 출력 신호를 정량할 수 있는 방식으로 수행되는 것인 용도.
  39. 제38항에 있어서, 상기 입력 이벤트의 크기는 정량된 출력 신호로부터 측정되는 것인 용도.
  40. 제33항에 있어서, 상기 입력 이벤트 또는 출력 신호 중 어느 하나 또는 둘 다는 증폭되는 것인 용도.
  41. 제40항에 있어서, 상기 출력 신호 증폭은 신호 캐스케이드에 의한 것인 용도.
  42. 2 이상의 올리고뉴클레오티드 성분 및 하나 이상의 활성 억제자 분자를 포함하는 MNAi.
  43. 제42항에 있어서, 하나 이상의 조립 촉진자를 추가로 포함하는 MNAi.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 활성 억제자는 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것인 MNAi.
  45. 제44항에 있어서, 상기 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 및 리포터 도메인 중 2 이상은 활성 억제자의 개별 도메인 상에 위치하는 것인 MNAi.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 및 리포터 도메인 중 2 이상은 불안정 링커 또는 절단 가능 기질에 의해 결합되어 있는 것인 MNAi.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기질은 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것인 MNAi.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 억제자는 상기 2 이상의 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상과 실질적으로 비-상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 MNAi.
  49. 제43항에 있어서, 상기 조립 촉진자가 표적인 MNAi.
  50. 제49항에 있어서, 상기 표적이 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리(pre)- 및 프라이(pri)-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 핵산인 MNAi.
  51. 제42항 또는 제43항에 있어서, MNAi의 하나 이상의 성분은 앱타머를 추가로 포함하는 것인 MNAi.
  52. 2 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하는 MNAi 조성물로서,
    적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 하 나 이상의 MNA 복합체 활성 억제자의 존재 하에 자가 조립할 수 있고, 상기 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 각각 기질 아암 부분, 촉매 코어 부분 및 센서 아암 부분을 포함하며;
    자가 조립시, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 센서 아암 부분은 센서 아암으로서 작용을 하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 아암 부분은 기질 아암으로서 작용을 하며, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 코어 부분은 비-작용성 촉매 코어를 형성하고;
    자가 조립시, 하나 이상의 센서 아암은 상기 활성 억제자와 상호작용을 하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 이들의 각 촉매 코어 부분이 결합하여 비-작용성 촉매 코어를 형성하도록 근접하게 유지되는 것인 MNAi 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 하나 이상의 조립 촉진자를 추가로 포함하는 MNAi 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 상기 활성 억제자는 활성자 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것인 MNAi 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 및 리포터 도메인 중 2 이상은 활성 억제자의 개별 도메인 상에 위치하는 것인 MNAi 조성물.
  56. 제54항 또는 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 억제자 도메인, 활성자 조립 촉진자 도메인 및 리포터 도메인 중 2 이상은 불안정 링커 또는 절단 가능 기질에 의해 결합되어 있는 것인 MNAi 조성물.
  57. 제52항에 있어서, 상기 활성 억제자가 기질인 MNAi 조성물.
  58. 제52항에 있어서, 상기 활성 억제자는 상기 2 이상의 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상과 실질적으로 비-상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 MNAi 조성물.
  59. 제52항에 있어서, 상기 복합체의 하나 이상의 성분은 하나 이상의 앱타머 또는 이의 부분를 함유하고, 상기 앱타머 또는 이의 부분는 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 리간드에 결합하는 것인 MNAi 조성물.
  60. 제1 MNA자임, 실질적으로 촉매 불활성인 형태로 초기에 존재하는 MNA 복합체(MNAi), 상기 제1 MNA자임에 의해 변형되어 검출 가능 효과를 제공할 수 있는 활성 억제자를 포함하는 신호 캐스케이드를 이용하여 조립 촉진자를 검출하는 방법으로서,
    상기 활성 억제자는 활성 억제자 및 잠재적인 기질 둘 다이고;
    상기 제1 MNA자임의 촉매 활성을 허용하는 조건 하에서 상기 제1 MNA자임에 대한 파트자임과의 상기 조립 촉진자의 결합은 상기 제1 MNA자임의 촉매 활성을 촉진함으로써 상기 활성 억제자의 변형을 제공하여 활성자 조립 촉진자 도메인 및 상기 활성 억제자의 활성 억제자 도메인을 방출하고, 상기 방출은 상기 검출 가능 효과를 제공하며;
    상기 방출된 활성자 조립 촉진자 도메인은 상기 MNA 복합체의 성분으로부터 제2 MNA자임의 조립을 촉진하고;
    상기 제2 MNA자임의 촉매 활성은 상기 활성 억제자를 변형시켜 추가 활성 억제자 도메인 및 추가 활성자 조립 촉진자 도메인을 방출하고, 상기 방출은 추가 검출 가능 효과를 제공하며;
    상기 추가 활성자 조립 촉진자 도메인은 부가 제2 MNA자임의 조립을 촉진함으로써 추가의 상기 촉매 활성 제2 MNA자임을 제공하고, 이로써, 상기 조립 촉진자의 존재를 나타내는 추가 검출 가능 효과를 제공하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 활성 억제자가 리포터-억제자-촉진자인 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 활성 억제자, 제1 MNA자임 또는 제2 MNA 복합체 성분 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착되어 있는 것인 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 억제자, 제1 MNA자임 또는 제2 MNA 복합체 성분 중 하나 이상은 용액 중에 유리되어 있는 것인 방법.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 억제자는 조립 촉진자 도메인, 활성 억제자 도메인, 리포터 도메인, 기질 도메인 또는 이들 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 억제자는 검출 가능 부분 및 소광자(quencher)를 포함하고, 상기 제1 MNA자임 또는 상기 제2 MNA자임에 의한 상기 활성 억제자의 변형시, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공된 검출 가능 효과는 증가하거나 또는 감소하는 것인 방법.
  66. 제60항에 있어서, 상기 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정 법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의 조합에 의해 검출되는 것인 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 검출 가능 효과는 측정되고, 상기 측정의 크기는 조립 촉진자의 양을 나타내는 것인 방법.
  68. 제60항에 있어서, 상기 조립 촉진자가 표적인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 표적이 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 핵산인 방법.
  70. 제60항에 있어서, 상기 제1 MNA자임 및/또는 제2 MNA 복합체의 성분 중 하나 이상은 앱타머를 추가로 포함하며, 상기 방법은 상기 앱타머에 결합하는 리간드의 검출을 제공하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 리간드는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함하는 것인 방법.
  72. 제60항에 있어서, 상기 조립 촉진자가 입력 이벤트로서 작용하는 합성 올리고뉴클레오티드인 방법.
  73. 제60항에 있어서, 상기 촉매 활성 MNA자임의 조립은, 온도, 염 농도, 이온 세기, pH, 2가 양이온 존재 또는 부재, 종류 또는 농도, 전기 전하, 자기 전하, 물리적 조작에서의 변화 및, MNA 또는 조정자 성분 또는 마이크로 환경의 성분의 농도에서의 변화 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 입력 이벤트에 의해 조절되는 것인 방법.
  74. 캐스케이드를 이용하여 표적을 검출하는 방법으로서,
    상기 캐스케이드는 상기 표적의 존재 하에 형성된 개시 MNA자임(initiating MNAzyme); 상기 개시 MNA자임의 생성물의 존재 하에 형성된 제1 MNA자임; 상기 제1 MNA자임의 생성물의 존재 하에 형성된 부가 MNA자임을 포함하고, 상기 방법은 다음의 단계들:
    (i) 상기 개시 MNA자임으로 제1 기질을 변형시켜 제1 조립 촉진자를 발생시키는 단계;
    (ii) 상기 제1 MNA자임과 상기 제1 조립 촉진자를 조립하는 단계;
    (iii) 부가 기질을 상기 제1 MNA자임으로 변형시켜 부가 조립 촉진자를 발생 시키는 단계;
    (iv) 상기 부가 MNA자임과 상기 부가 조립 촉진자를 조립하는 단계;
    (v) 상기 제1 기질을 상기 부가 MNA자임으로 변형시켜 상기 제1 조립 촉진자를 발생시키는 단계;
    (vi) 상기 제1 MNA자임과 상기 (v) 단계로부터 방출된 상기 제1 조립 촉진자를 조립함으로써 증폭 캐스케이드를 형성하는 단계
    를 포함하며;
    상기 제1 기질 또는 상기 부가 기질 중 하나 이상의 변형은 상기 표적의 존재를 나타내는 검출 가능 효과를 생성하는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 제1 조립 촉진자 또는 상기 부가 조립 촉진자 중 어느 하나 또는 둘 다가 활성자 조립 촉진자인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 제1 기질이 상기 제1 MNA자임의 활성 억제자인 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 증폭 캐스케이드가 피드백 증폭 캐스케이드인 방법.
  78. 제74항에 있어서, 상기 부가 기질은 상기 부가 MNA자임에 대한 활성 억제자인 방법.
  79. 제74항에 있어서, 상기 제1 MNA자임 및/또는 상기 부가 MNA자임은 하나 이상의 조립 촉진자의 존재 하에 촉매 활성이 되는 2개의 파트자임을 포함하는 것인 방법.
  80. 제74항에 있어서, 상기 제1 MNA자임 및/또는 상기 부가 MNA자임은 2 이상의 조립 촉진자 성분의 존재 하에 촉매 활성이 되는 2개의 파트자임을 포함하는 것인 방법.
  81. 제74항에 있어서, 상기 제1 MNA자임 및/또는 상기 부가 MNA자임은 3 이상의 조립 촉진자 성분의 존재 하에 촉매 활성이 되는 2개의 파트자임을 포함하는 것인 방법.
  82. 제74항에 있어서, 상기 표적이 검출, 동정 또는 정량하고자 하는 조립 촉진자 분자인 방법.
  83. 제74항에 있어서, 상기 표적은 핵산을 포함하는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 핵산의 공급원은 합성, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  86. 제74항에 있어서, 상기 MNA자임 중 하나 이상은 하나 이상의 앱타머를 추가로 포함하는 것인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 앱타머는 하나 이상의 리간드에 결합하는 것인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 리간드는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 전체 유기체(entire organism), 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  89. 제74항 내지 제88항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 MNA자임 또는 상기 기질 중 하나 이상의 성분은 불용성 지지체에 부착되거나 또는 용액 중에 유리되어 있는 것인 방법.
  90. 제74항에 있어서, 상기 기질 또는 기질들은 검출 가능 부분 및 소광자 부분을 포함하고, 상기 MNA자임 중 하나 이상에 의한 상기 기질의 변형시, 상기 검출 가능 부분은 검출 가능 효과를 제공하는 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의 조합 중 하나 이상에 의해 검출되는 것인 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 검출 가능 효과는 측정되고, 상기 측정의 크기는 표적의 양을 나타내는 것인 방법.
  93. 신호 증폭 캐스케이드를 이용하여 표적을 검출하는 방법으로서,
    상기 신호 증폭 캐스케이드는 제1 MNA자임에 대한 파트자임, 제1 기질, 제2 MNA자임에 대한 파트자임, DNA자임 리가제, 제2 기질, 부가 MNA자임에 대한 부가 파트자임 및 조립 촉진자 및 부가 기질을 포함하고, 상기 방법은 다음의 단계들:
    (i) 검출하고자 하는 표적 분자의 존재하에 상기 제1 MNA자임에 대한 파트자임으로부터 상기 제1 MNA자임을 형성하는 단계;
    (ii) 상기 제1 기질을 상기 제1 MNA자임으로 절단하여 다수의 절단 생성물을 발생시키는 단계;
    (iii) 상기 DNA자임 리가제에 의해 상기 절단 생성물 중 하나 이상을 상기 제2 기질과 결찰시켜, 상기 부가 MNA자임에 대한 결찰된 파트자임을 생성시키는 단계;
    (iv) 상기 절단 생성물 중 하나 이상과의 조립에 의해, 상기 제2 MNA자임에 대한 파트자임으로부터 상기 제2 MNA자임을 형성시키는 단계;
    (v) 상기 제1 기질을 상기 제2 MNA자임으로 절단하여 추가의 상기 다수의 절단 생성물을 발생시키는 단계;
    (vi) 추가의 상기 발생된 다수의 절단 생성물 중 하나 이상과의 조합에 의해, 추가의 상기 제2 MNA자임을 형성하는 단계로서, 추가의 상기 제2 MNA자임의 조립은 증폭 캐스케이드를 형성하고, 추가의 상기 다수의 절단 생성물의 축적을 형성하며, 추가의 상기 발생된 다수의 절단 생성물 중 하나 이상은 상기 DNA자임 리가제에 대한 기질로서 작용을 하는 것인 단계;
    (vii) 상기 부가 파트자임 및 상기 결찰된 파트자임에 의해 그리고 더불어 상기 조립 촉진자에 의해 상기 부가 MNA자임을 발생시키는 단계;
    (viii) 상기 부가 기질을 상기 부가 MNA자임으로 변형시켜 상기 표적의 존재를 나타내는 검출 가능 효과를 나타내는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 증폭 캐스케이드가 피드백 증폭 캐스케이드인 방법.
  95. 제93항에 있어서, 상기 제2 기질과 결찰된 절단 생성물은 그것의 3' 말단부에서 2',3'-시클릭 포스페이트를 갖는 것인 방법.
  96. 제93항에 있어서, 상기 절단 생성물 중 하나 이상이 활성자 조립 촉진자인 방법.
  97. 제93항에 있어서, 상기 표적이 검출, 동정 또는 정량하고자 하는 분자인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 표적은 핵산을 포함하는 것인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로RNA, 기타 비-코딩 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘 또는 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 핵산의 공급원은 합성, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  101. 제93항에 있어서, 상기 제1 MNA자임에 대한 파트자임, 제1 기질, 제2 MNA자임에 대한 파트자임, DNA자임 리가제, 제2 기질, 부가 파트자임, 부가 MNA자임에 대한 조립 촉진자 및 부가 기질 중 하나 이상은 하나 이상의 앱타머를 추가로 포함하는 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 앱타머는 하나 이상의 리간드에 결합하는 것인 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 리간드는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이들의 임의 유도체, 부분 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  104. 제93항에 있어서, 상기 제1 MNA자임에 대한 파트자임, 제1 기질, 제2 MNA자임에 대한 파트자임, DNA자임 리가제, 제2 기질, 부가 파트자임, 부가 MNA자임에 대한 조립 촉진자 및 부가 기질 중 하나 이상은 하나 이상의 나노 입자, 마이크로 입자 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
  105. 제93항에 있어서, 상기 제1 MNA자임에 대한 파트자임, 제1 기질, 제2 MNA자임에 대한 파트자임, DNA자임 리가제, 제2 기질, 부가 파트자임, 부가 MNA자임에 대한 조립 촉진자 및 부가 기질 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착되어 있거나 또는 용액 중에 유리되어 있는 것인 방법.
  106. 제93항에 있어서, 상기 기질 중 하나 이상은 검출 가능 부분 및 소광자 부분을 포함하고, 상기 MNA자임에 의한 상기 기질의 변형시, 상기 검출 가능 부분은 검출 가능 효과를 제공하는 것인 방법.
  107. 제93항에 있어서, 상기 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의 조합 중 하나 이상에 의해 검출되는 것인 방법.
  108. 제93항에 있어서, 상기 검출 가능 효과가 측정되고, 상기 측정의 크기는 조립 촉진자의 양을 나타내는 것인 방법.
  109. 다수의 MNA 복합체를 포함하는 전가산기(full adder)로서, 상기 전가산기는 2개의 출력의 4가지의 가능한 조합을 발생시키는 3개의 입력의 8가지의 가능한 조합을 포함하고, 상기 4가지의 가능한 조합이 비 출력(no output), 제1 출력, 제2 출력, 또는 제1 출력 및 제2 출력인 전가산기.
  110. 제109항에 있어서, 입력이 존재하지 않으면 출력도 생성되지 않는 것인 전가산기.
  111. 제109항에 있어서, 상기 전가산기는 임의의 정확한 1개의 입력에 반응하여 제1 출력을 발생시키는 것인 전가산기.
  112. 제109항에 있어서, 상기 전가산기는 임의의 정확한 2개의 입력에 반응하여 제2 출력을 발생시키는 것인 전가산기.
  113. 제109항에 있어서, 상기 전가산기는 3개의 입력에 반응하여 제1 출력 및 제2 출력을 발생시키는 것인 전가산기.
  114. 제109항에 있어서, 상기 입력 중 하나 이상이 검출 가능 이벤트인 전가산기.
  115. 제109항에 있어서, 상기 출력 중 하나 이상이 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 측정법, 광도 측정법, 신티그래피법, 전자 공학적 방법, UV, 가시선 또는 적외선 분광 분석법, 효소적 방법 또는 이들 방법의 임의 조합 중 하나 이상에 의해 측정된 검출 가능 이벤트 또는 검출 가능 효과인 전가산기.
  116. 제109항에 있어서, 상기 제1 출력 또는 제2 출력 중 하나는 다른 전가산기에 대한 입력으로서 작용을 하는 것인 전가산기.
KR1020097009384A 2006-10-06 2007-10-05 분자 스위치 및 이의 이용 방법 KR20090098960A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US82845106P 2006-10-06 2006-10-06
US60/828,451 2006-10-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20090098960A true KR20090098960A (ko) 2009-09-18

Family

ID=39268069

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097009384A KR20090098960A (ko) 2006-10-06 2007-10-05 분자 스위치 및 이의 이용 방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9127311B2 (ko)
EP (1) EP2066817B1 (ko)
JP (1) JP5688507B2 (ko)
KR (1) KR20090098960A (ko)
CN (1) CN101600808B (ko)
AU (1) AU2007304837B2 (ko)
BR (1) BRPI0718137B1 (ko)
CA (1) CA2663164C (ko)
DK (1) DK2066817T3 (ko)
ES (1) ES2520023T3 (ko)
IL (1) IL197543A (ko)
MX (1) MX2009003193A (ko)
WO (1) WO2008040095A1 (ko)
ZA (1) ZA200901742B (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006302729B2 (en) * 2005-10-07 2011-02-03 Speedx Pty Ltd Multicomponent nucleic acid enzymes and methods for their use
WO2008054834A2 (en) * 2006-02-03 2008-05-08 Columbia University Binary deoxyribozyme probes for nucleic acid analysis
CN101600808B (zh) 2006-10-06 2014-07-09 强生研究有限公司 分子开关及其使用方法
ES2425066T3 (es) * 2007-04-05 2013-10-11 Speedx Pty Ltd Enzimas y complejos de ácidos nucleicos y métodos para su uso
WO2012034130A2 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Qiagen Methods and compositions for nucleic acid detection
US9862990B2 (en) * 2010-11-19 2018-01-09 Speedx Pty Ltd Signal amplification
CA2847697C (en) 2011-09-09 2020-04-21 Speedx Pty Ltd Nucleic acid enzyme substrates
JP2015508655A (ja) * 2012-02-14 2015-03-23 コーネル ユニバーシティー 組み合わせたヌクレアーゼ反応、連結反応、およびポリメラーゼ反応を用いて核酸配列、発現、またはコピー変化を相対的に定量するための方法
CN104245958B (zh) * 2012-02-20 2018-05-22 斯比戴克斯私人有限公司 核酸的检测
AU2013202354A1 (en) * 2012-06-18 2014-01-16 Speedx Pty Ltd Target detection and signal amplification
JP2016522807A (ja) * 2013-04-18 2016-08-04 バル・イラン・ユニバーシティＢａｒ Ｉｌａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 分子計算のための非免疫原性及び核酸分解酵素耐性核酸折り紙デバイスを含むシステム
CN105763200B (zh) * 2016-02-05 2018-10-16 大连大学 基于dna链置换的4-10译码器设计方法
CN105954957B (zh) * 2016-05-02 2018-10-23 福建医科大学 基于金纳米团簇固相复合物的nand逻辑门及其构建方法
WO2019030383A1 (en) 2017-08-10 2019-02-14 Katholieke Universiteit Leuven ENZYME SENSOR OF NUCLEIC ACIDS
CA3108430A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Speedx Pty Ltd Multiplex detection of nucleic acids
KR102239459B1 (ko) * 2019-09-16 2021-04-12 한국화학연구원 산화 그래핀, DNAzyme 및 PNA를 포함하는 온도 센서용 조성물 및 이를 이용한 온도 센싱 방법
CN112501260B (zh) * 2020-11-27 2021-06-29 广东省科学院生态环境与土壤研究所 一种双酚a的检测方法、荧光检测试剂盒及其应用
CN112630439A (zh) * 2020-12-11 2021-04-09 郑州轻工业大学 基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4000A (en) * 1845-04-16 Combined lock and latch
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5176995A (en) 1985-03-28 1993-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of viruses by amplification and hybridization
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
RO114469B1 (ro) 1987-12-15 1999-04-30 Gene Shears Pty Ltd Compus oligoribonucleotidic, procedeu de preparare si metoda de inactivare
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
WO1994013833A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 Innovir Laboratories, Inc. Ribozyme amplified diagnostics
US5876924A (en) 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US7141665B1 (en) 1998-04-29 2006-11-28 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US5545729A (en) * 1994-12-22 1996-08-13 Hybridon, Inc. Stabilized ribozyme analogs
AU697317B2 (en) 1995-02-27 1998-10-01 Intelligene Ltd. Detection of biomolecules
CN1261920A (zh) 1997-04-29 2000-08-02 斯克里普斯研究学院 酶促dna分子
DE69939896D1 (de) 1998-03-05 2008-12-24 Johnson & Johnson Res Pty Ltd Methoden zur detektion von nukleinsäuren unter verwendung von zymogenen und dazugehörige kits
AU3276599A (en) * 1998-03-12 1999-09-27 Japan As Represented By Director General Of Agency Of Industrial Science And Technology Nucleic acid enzyme showing allosteric rna-cleaving activity on target rna
DE19811618C1 (de) * 1998-03-17 2000-08-31 Andreas Jenne Ribozym codierende DNA und ein Oligonucleotidsubstrat enthaltende Zusammensetzung und Verfahren zur Messung von Transkriptionsraten
IL136443A (en) 1998-03-27 2005-06-19 Johnson & Johnson Res Pty Ltd Catalytic nucleic acid-based diagnostic methods
DE19915141C2 (de) 1999-03-26 2002-11-21 Artus Ges Fuer Molekularbiolog Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten
EP1263947A2 (en) 2000-03-06 2002-12-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sensor molecules
WO2003089650A2 (en) 2001-11-05 2003-10-30 Sirna Therapeutics, Inc. Allosteric nucleic acid sensor molecules
JP3595843B2 (ja) * 2000-10-13 2004-12-02 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｒｎａ分子を認識することにより他の特定の標的ｒｎａに対する切断活性を獲得する核酸酵素
WO2005051174A2 (en) 2003-11-21 2005-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleic acid aptamer-based compositions and methods
WO2005073405A2 (en) 2004-01-29 2005-08-11 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Catalytic polynucleotide and its use for determination of analytes
US7553945B2 (en) * 2005-08-03 2009-06-30 Bowling Green State University RNA complexes and methods of their production
AU2006302729B2 (en) * 2005-10-07 2011-02-03 Speedx Pty Ltd Multicomponent nucleic acid enzymes and methods for their use
CN101341260B (zh) * 2005-10-07 2014-02-12 强生研究有限公司 多组分核酸酶及其使用方法
CA2631881C (en) * 2005-12-07 2015-03-24 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Methods, plasmid vectors and primers for assessing hiv viral fitness
WO2008054834A2 (en) * 2006-02-03 2008-05-08 Columbia University Binary deoxyribozyme probes for nucleic acid analysis
CN101600808B (zh) 2006-10-06 2014-07-09 强生研究有限公司 分子开关及其使用方法
ES2425066T3 (es) 2007-04-05 2013-10-11 Speedx Pty Ltd Enzimas y complejos de ácidos nucleicos y métodos para su uso
AU2008235527B2 (en) 2007-04-06 2014-02-20 Speedx Pty Ltd Respiratory syncytial virus (RSV) viral load detection assay
WO2009022125A1 (en) 2007-08-13 2009-02-19 University Of Strathclyde Identification of nucleic acid sequences
WO2010017246A1 (en) 2008-08-04 2010-02-11 University Of Maryland Probes and methods for detecting analytes

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200901742B (en) 2010-06-30
CA2663164A1 (en) 2008-04-10
JP2010505394A (ja) 2010-02-25
AU2007304837B2 (en) 2011-09-29
EP2066817A4 (en) 2011-02-09
EP2066817A1 (en) 2009-06-10
AU2007304837A1 (en) 2008-04-10
BRPI0718137A2 (pt) 2013-11-05
EP2066817B1 (en) 2014-07-30
CN101600808B (zh) 2014-07-09
ES2520023T3 (es) 2014-11-11
CN101600808A (zh) 2009-12-09
WO2008040095A1 (en) 2008-04-10
IL197543A (en) 2016-10-31
DK2066817T3 (da) 2014-10-13
MX2009003193A (es) 2009-08-13
US20100136536A1 (en) 2010-06-03
CA2663164C (en) 2016-07-12
IL197543A0 (en) 2009-12-24
US9127311B2 (en) 2015-09-08
BRPI0718137B1 (pt) 2016-05-10
JP5688507B2 (ja) 2015-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5688507B2 (ja) 分子スイッチおよびそれらの使用のための方法
KR101583834B1 (ko) 핵산 효소 및 복합체 및 이의 사용 방법
EP3417078B1 (en) Molecular programming tools
KR101379621B1 (ko) 다성분 핵산 효소 및 이의 사용 방법
Zhang et al. DNA-mediated homogeneous binding assays for nucleic acids and proteins
JP6641397B2 (ja) 核酸酵素基質
JP6092114B2 (ja) シグナル増幅
Tram et al. Lighting up RNA-cleaving DNAzymes for biosensing
McManus et al. Making sense of catalysis: the potential of DNAzymes as biosensors

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application