KR101379621B1 - 다성분 핵산 효소 및 이의 사용 방법 - Google Patents

다성분 핵산 효소 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다성분 촉매 핵산 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 MNA자임은 하나 이상의 MNA자임 조립 촉진 분자가 존재할 때 자체 조립되어 촉매 활성 구조를 형성하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분들을 포함한다. 본 발명은 또한 MNA자임 제조용 조성물과 MNA자임의 수집체도 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 하나 이상의 표적을 검출, 동정 및/또는 정량하기 위하여 MNA자임을 사용하는 방법도 제공한다. 본 발명의 방법은 용액 내에서 수행되는 검정법이나, 하나 이상의 반응 성분들이 지지체 구조에 부착되어 존재하는 경우에 수행되는 검정법으로 실시될 수 있다. 본 발명의 방법을 통해, 하나의 반응에서 다수의 표적을 검출하는 MNA자임 검출법을 복합적으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 제조하는 키트와, 본원에 제공된 방법을 수행하기 위한 키트도 제공한다.

Description

다성분 핵산 효소 및 이의 사용 방법{MULTICOMPONENT NUCLEIC ACID ENZYMES AND METHODS FOR THEIR USE}
관련 출원에 관한 상호 참조 문헌
본 출원은 각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는, 2005년 10월 13일 출원된 미국 가 명세서 특허 출원 제60/726,291호 및 2005년 10월 7일 출원된 미국 가 명세서 특허 출원 제60/724,567호의 우선권의 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 다성분 촉매 핵산 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 자체 조립성 다성분 핵산 효소를 포함하는 조성물, 이러한 조성물을 제조하는 방법 및 이러한 조성물을 사용하는 방법 예를 들어, 상기 다성분 핵산 효소에 의해 기질의 촉매에 의한 변형 여부를 검출함으로써, 표적 예를 들어, 조립 촉진 인자 및 기타 인자들을 검출, 동정 및/또는 정량하는 방법에 관한 것이다.
특허, 공표된 출원, 과학 논문 및 학계 논문을 포함할 수 있는 다양한 문헌들을 본 명세서 전체를 통해 괄호 안에 넣어 언급하였으며, 본 명세서 말미에 각 문헌에 대한 출처를 전체적으로 명시하였다. 언급된 문헌들은 각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 것이다.
핵산 분자는 효소 활성 또는 촉매 활성을 부여할 수 있는 2차 구조의 형태를 가질 수 있다. 시험관 내 생성 기술을 통해, 다양한 반응 예를 들어, 핵산의 절단(Carmi외 다수, 1996; Raillard and Joyce, 1996; Breaker, 1997; Santoro and Joyce, 1998), 핵산의 결찰(Cuenoud and Szostak, 1995), 포피린의 금속화(Li and Sen, 1996), 그리고 탄소-탄소 결합의 형성(Tarasow외 다수, 1997), 에스테르 결합의 형성(Illangasekare외 다수, 1995) 또는 아미드 결합의 형성(Lohse and Szostak, 1996)을 촉진할 수 있는 이러한 촉매 핵산(종종 "DNA자임" 또는 "리보자임"이라 칭함)의 발견 및 개발이 촉진되어 왔다.
특히, DNA자임 및 리보자임은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 혼성화한 이후에 각각의 핵산 서열을 특이적으로 절단하는 것으로서 특성 규명되었다. DNA자임은 RNA 분자(Breaker and Joyce, 1994; Santoro and Joyce, 1997) 또는 DNA 분자(Carmi외 다수, 1996) 중 어느 하나를 절단할 수 있다. 촉매성 RNA 분자(리보자임)은 또한 RNA 서열(Haseloff and Gerlach, 1988) 및 DNA 서열(Raillard and Joyce, 1996)을 절단할 수도 있다. 대부분의 핵산 효소의 촉매 절단 비율은 2가 금속 이온 예를 들어, Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, 및 Pb2+의 존부와 이 이온의 농도에 따라 달라진다(Santoro and Joyce, 1998; Brown외 다수, 2003).
촉매 핵산 예를 들어, 망치 머리형 리보자임(hammerhead ribozyme) 및 10:23 DNA자임 및 8:17 DNA자임은 다수의 도메인을 가진다. 이 핵산은 기질과 특이적으로 결합하는 서열 부위인 비-보존형 기질 결합 도메인("혼성화 팔(hybridizing arm)") 2개가 측접하여 존재하는 보존형 촉매 도메인(촉매 중심 부분)을 가진다. 핫셀로프(Haseloff)와 게를라흐(Gerlach)는 이 망치 머리형 리보자임을 조작하였는데, 이와 같이 조작한 것을, 2개의 보존형 도메인들이 함께 촉매 중심 부분을 형성하는 줄기-고리 구조(stem-loop structure)라 명명하였다[Haseloff and Gerlach, 1988]. 상기 "10:23" DNA자임 및 "8:17" DNA자임은 특정 RNA 포스포디에스테르 결합에 있는 핵산 기질을 절단할 수 있는 것이다[Santoro and Joyce, 1997]. 상기 10:23 DNA자임은 2개의 기질 인식 팔(substrate-recognition arm)이 측접하여 존재하는, 15개의 데옥시리보뉴클레오티드로 이루어진 촉매 도메인을 가진다. 상기 8:17 DNA자임은 2개의 기질 인식 팔이 측접하여 존재하는, 14개의 데옥시뉴클레오티드로 이루어진 촉매 도메인을 가진다.
촉매 핵산은 적어도 요구 조건을 만족시키는 표적 서열과 핵산 기질을 절단할 수 있다. 기질 서열은 촉매 핵산의 혼성화 팔에 실질적으로 상보성이어야 하며, 기질은 절단 위치에 특정 서열을 함유하여야 한다. 절단 위치에 존재하는 특정 서열의 조건으로서는 예를 들어, 10:23 DNA자임에 의한 절단에 있어서는 퓨린:피리미딘 리보뉴클레오티드 서열이 존재해야 한다는 것(Santoro and Joyce, 1997)과, 망치 머리형 리보자임에 있어서는 우리딘:X 서열이 존재해야 한다는 것(Perriman외 다수, 1992)[여기서, X는 A, C 또는 U일 수 있으나, G일 수는 없음]을 포함한다.
촉매 핵산은 촉매 중심 부분을 형성하는 영역 내 임의의 변형에 대해서만 관용하는 것으로 파악되었다[Perreault외 다수, 1990; Perreault외 다수, 1991; Zaborowska외 다수, 2002; Cruz외 다수, 2004; Silverman, 2004]. DNA자임의 촉매 활성에 관여하는 서열의 예를 표 1에 나열하였다.
몇몇 활성 DNA자임 및 이의 기질에 대한 대표적인 서열들
DNA자임 유형 DNA자임 서열 기질 서열
8:17 (N)XTNNNAGCNNNWCGK(N)X (N')X(rN)XG(N')X
10:23 (N)XGGMTMGHNDNNNMGD(N)X (N')XrRrY(N')X

N은 A, C, T, G 또는 임의의 유사체이고; N'는 N에 상보성인 임의의 뉴클레오티드이며; (N)X 또는 (N')X는 임의의 갯 수의 뉴클레오티드이고; W는 A 또는 T이며; K는 A, G 또는 AA이며; rN은 임의의 리보뉴클레오티드 염기이고; r(N)X는 임의의 갯 수의 뉴클레오티드이며; rR은 A 또는 G이고; rY는 C 또는 U이며; M은 A 또는 C이고; H는 A, C 또는 T이며; D는 G, A 또는 T임.
임의의 조건 하에서, 공지의 리보자임 내 임의의 리보뉴클레오티드에 대한 임의의 데옥시리보뉴클레오티드의 치환이 시도된바 있다[McCall외 다수, 1992]. DNA로 완전히 전환된 리보자임은 RNA와 DNA의 형태상의 차이로 인하여 활성을 갖지 않는다(Perreault외 다수, 1990). 이 연구를 통해서, RNA 효소는 리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드로 치환하기만 해서는 작동성 DNA 효소로 변형될 수 없음이 입증되었다.
치료용 동종 이량체성 리보자임 또는 이종 이량체성 리보자임을 개발하고자 하는 연구가 적잖이 행하여졌다[Kuwabara외 다수, 1999; Kuwabara외 다수, 2000; Oshima외 다수, 2003]. 이러한 연구를 통해서, 리보자임의 촉매 중심 부분은 리보뉴클레오티드만으로 이루어졌다는 사실을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, DNA자임이 이량체형 또는 다량체형으로서 작용을 할 수 있는 능력에 대해서는 고려된 바 없으며, 또한 이량체 DNA자임이 형성할 수 있는 구조와 이 구조로부터 발생하는 활성의 관점에서, 이량체 리보자임에서 이량체 DNA자임의 구조와 활성을 유추해내는 방법에 관한 정보도 제공된 바 없다.
촉매 핵산은 검출 가능한 신호 발생 수단으로서 시험관 내 증폭 프로토콜과 함께 사용되어 왔으며, 그 결과, 증폭된 핵산 표적 서열을 실시간으로 관찰할 수 있게 되었다[Todd외 다수, 2000][미국 특허 제6,140,055호; 미국 특허 제6,201,113호; WO 99/45146; PCT/IB99/00848; WO 99/50452]. 자이모겐 검출법(Zymogene detection)[미국 특허 제6,140,055호; 미국 특허 제6,201,113호; WO 99/45146; PCT/IB99/00848; WO 99/50452]은 DzyNA 검출법으로서 당 업계에 알려져 있는 방법으로서(Todd외 다수, 2000), 이 방법을 통해 표적과 신호를 동시에 증폭시킬 수 있다. 이것이 가능한 이유는, 촉매 DNA자임 또는 리보자임은 표적 서열과 함께 증폭되어, 전복(turnover)을 다수 회 수행할 수 있는 진정한 효소로서 작용하는 앰플리콘(amplicon)을 생산할 수 있기 때문이다. 그러므로, 각각의 촉매 핵산 앰플리콘은 다수의 리포터 기질을 절단하게 되는 것이다. DNA자임과 리보자임은 5'번 말단부의 태그가 불활성이고, 촉매 핵산의 안티센스 서열인, 프라이머를 사용함으로써 앰플리콘에 도입된다. 이러한 서열들이 시험관 내 증폭시 복제될 때, 촉매 활성 센스 서열은 표적 서열과 함께 증폭된다. 촉매 신호 증폭 과정은 표적 증폭 방법 예를 들어, PCR(중합 효소 연쇄 반응), 가닥 치환 증폭("SDA"), 또는 회전 환 증폭(rolling circle amplification; "RCA"), DNA자임 앰플리콘 형성; 및 핵산 서열 기반 증폭("NASBA"), 자기 부양 서열 복제(self-sustained sequence replication; "3SR"), 또는 전사 매개 증폭("TMA")과 같은, 리보자임 앰플리콘 생산 증폭 방법과 연계되어 있기 때문에, 자이모겐/DzyNA 연구는 매우 융통성이 있다. 또한, 다양한 촉매 활성을 가지는 다수의 촉매 핵산 분자가 발견되었거나 생성되었기 때문에, 자이모겐 연구법에서는 검정 결과에 관한 정보가 핵산 기질의 절단 이외에 화학적 변형에 따라서 달라지는 경우, 핵산 이외에도 리포터 기질을 사용할 수 있다. 자이모겐/DzyNA(Todd외 다수, 2000) 또는 NASBA/리보자임(WO 00/58505) 연구법은 정밀하고 유용한 것으로 간주될 수 있으나, 프라이머 서열의 증폭으로 인한 노이즈(noise)가 발생할 우려가 있다.
NASBA는, 프라이머에 태깅된 안티센스 서열로서 도입되어 복사되는, 망치 머리형 리보자임의 촉매 중심 부분의 한 구획(GAArA)과 표적 핵산을 함유하는 RNA 앰플리콘을 생산하는데 사용되고 있다(WO 00/58505). 촉매 활성에 필요한 추가 서열(CUrGANrGrA)은 형광단과 켄처(quencher)로 표지되었고, 리포터 기질로서 사용되는 제2의 분자에 센스 서열로서 도입되었다. 리보뉴클레오티드 염기 중 임의의 것(상기 rN)은 리보뉴클레오티드로서 잔류하여야 하는데, 그렇지 않을 경우 촉매 리보자임 활성을 잃게 된다. DNA만으로 이루어진 2개의 분자는 촉매 활성 이종 이량체 효소를 형성할 수 없는 것으로 간주되었다(WO 00/58505).
촉매 핵산은 또한 단일 뉴클레오티드 다형성("SNP")의 검출용으로서 사용되고 있다. 촉매 핵산 결합 팔과 기질 사이의 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 대한 엄격한 요구 조건을 통해서, 밀접하게 관련된 짧은 서열까지도 구별할 수 있는 방법을 개발할 수 있게 되었다. DNA자임과 리보자임은 1개의 염기가 상이한 2개 서열조차도 구별할 수 있는 것으로 파악되었다[Cairns외 다수, 2000][WO 99/50452].
DNA자임은 임의의 시험관 내 사용시 리보자임에 비하여 유리한 특성을 보유한다. DNA는 본질적으로 RNA보다 안정하므로, 사용 가능 기간도 길며 견고하다. DNA는 용액 중에서나 동결 건조된 형태로서 실온에서 장시간 동안 보관될 수 있다. DNA자임은 또한 예를 들어, 증폭시 고온에 노출되면 비가역적으로 변성되지 않기 때문에, 임의의 분야에서 대다수의 단백질 효소에 비하여 바람직하기도 하다.
그러므로, 바람직하게는 DNA자임 및/또는 리보자임을 주성분으로 하는 촉매 핵산을 제공하는 핵산 서열과 기타 물질을 검출, 동정 및 정량하는, 간단하고 신속하며, 비용면에서도 효율적인 방법이 현재 요망되고 있다.
발명의 개요
본 발명의 제1 측면에 따르면, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하는 조성물이 제공되는데, 여기서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 MNA자임 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하며, 상기 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 기질 팔 부분, 촉매 중심 부분 및 센서 팔 부분을 포함하고;
이들 성분이 자체 조립되면, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 센서 팔 부분은 MNA자임의 센서 팔로서 작용하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 팔 부분은 MNA자임의 기질 팔로서 작용을 하며, 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 MNA자임의 촉매 중심으로서 작용하고;
상기 MNA자임의 센서 팔은 상기 MNA자임 조립 촉진 인자와 상호 작용하여, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 인접한 위치로 유지시켜 상기 성분들 각각의 촉매 중심 부분을 결합시키며, 그 결과, MNA자임의 촉매 중심(즉, 하나 이상의 기질을 변형시킬 수 있는 촉매 중심 부분)가 형성되고, 상기 MNA자임의 기질 팔은 기질과 계합하여, 상기 MNA자임의 촉매 중심이 상기 기질을 변형시킬 수 있게 된다.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진 인자 또는 기질 중 하나 이상은 DNA 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
조립 촉진 인자는 동정, 검출 또는 정량되는 표적일 수 있다. 이 표적은 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리(pre)- 및 프라이(pri)-마이크로 RNA, 기타 비암호화 RNA, 리보좀 RNA, 이의 유도체, 앰플리콘 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 리보좀 RNA는 16S 리보좀 RNA일 수 있다.
핵산 공급원은 합성물, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 기타 이것의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산은 증폭될 수 있다. 증폭 방법은 다음과 같은 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 루프 매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 회전 환 증폭(RCA), 전사 매개 증폭(TMA), 자기 부양 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 또는 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR).
본 발명의 조성물은 또한 상기 기질 팔 부분 또는 센서 팔 부분 중 하나 이상을 안정화시키는 작용을 하는 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조립 촉진 인자, 상기 올리고뉴클레오티드 성분들 또는 기질 또는 이의 조합 중 하나 이상은 하나 이상의 분자로 이루어질 수 있다.
제1 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 서열 번호 149∼서열 번호 153, 서열 번호 155∼서열 번호 157, 서열 번호 159 및 서열 번호 161을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으며, 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 서열 번호 166∼서열 번호 170 및 서열 번호 172를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 상기 MNA자임의 자체 조립에 대한 하나 이상의 억제제를 추가로 포함할 수도 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들 또는 조립 촉진 인자 또는 기질 또는 이의 조합 중 하나 이상은 또한 하나 이상의 앱타머(aptamer) 또는 이의 일부를 포함할 수도 있다. 상기 앱타머 또는 이의 일부는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 이의 유도체나 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 상기 MNA자임의 자체 조립에 대한 하나 이상의 억제제를 포함할 수도 있다.
상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 조립 촉진 인자 또는 상기 기질 중 하나 이상은 또한 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 자기 상보성 서열의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다. 상기 헤어핀 구조는 상기 MNA자임의 자체 조립을 억제할 수 있다. 자체 조립 억제 현상은 앱타머와 표적이 접촉하게 되면 차단될 수 있다. 상기 앱타머 또는 이의 일부는 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이의 임의의 유도체, 일부 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 표적과 결합할 수 있다.
상기 기질은 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 표지된 핵산, RNA, DNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 잠금 핵산(locked nucleic acid), 펩티드-핵산 키메라, 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 항체, 폴리펩티드, 당단백질, 지단백질 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 기질은 또한 하나 이상의 나노 입자 또는 마이크로 입자 또는 이의 조합을 포함할 수도 있다. 상기 기질은 불용성 지지체에 부착될 수 있거나, 또는 용액 중에 유리되어 존재할 수도 있다. 상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처 부분을 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 기질이 상기 MNA자임에 의해 변형되면, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공되는 검출 가능 효과(detectable effect)은 증가하거나 감소한다.
상기 기질 팔은 상보성 염기쌍 형성을 통해 상기 기질과 계합할 수 있다.
상기 MNA자임에 의해 상기 기질이 변형되면, 검출 가능 효과가 나타날 수 있다. 상기 기질의 변형으로서는 절단, 결찰, 포피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합의 형성, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 분석법, 광도 측정법, 신티그램 조영법, 전자적 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 또는 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다. 검출 가능 효과는 측정될 수 있는데, 이때, 그 측정 결과는 표적의 존재량에 대한 지표가 된다.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 상기 조립 촉진 인자 또는 상기 기질 중 하나 이상은 DNA, RNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 조립 촉진 인자 및 상기 기질은 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 적어도 일부분과 완전 상보성 또는 부분 상보성인 핵산을 포함할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 상기 조립 촉진 인자 또는 상기 기질 중 하나 이상은 4-아세틸시티딘, 5-(카복시하이드록실메틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디하이드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실큐에오신, 2'-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우리딘, 큐에오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘, 베타 D-아라비노실 티미딘을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환 또는 부가를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 하나 이상의 추가 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어 하나 이상의 촉매 활성 추가 MNA자임을 형성하는, 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 추가로 포함하는데, 여기서, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분은 각각 기질 팔 부분, 촉매 중심 부분 및 센서 팔 부분을 포함하고;
적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분이 자체 조립되면, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분의 센서 팔 부분은 상기 하나 이상의 추가 촉매 활성 MNA자임의 센서 팔을 형성하고, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 팔 부분은 상기 하나 이상의 추가 촉매 활성 MNA자임의 기질 팔을 형성하며, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 상기 하나 이상의 추가 촉매 활성 MNA자임의 촉매 중심을 형성하고;
상기 하나 이상의 추가 MNA자임의 센서 팔은 상기 하나 이상의 추가 조립 촉진 인자와 상호 작용하여, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분과 상기 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 인접한 위치로 유지시켜, 상기 성분들 각각의 촉매 중심 부분을 결합시키며, 그 결과, 상기 하나 이상의 추가 MNA자임의 촉매 중심(즉, 하나 이상의 추가 기질에 작용할 수 있는 촉매 중심 부분)가 형성되고, 상기 하나 이상의 추가 MNA자임의 기질 팔은 하나 이상의 추가 기질과 계합하여, 상기 하나 이상의 추가 MNA자임의 촉매 중심이 상기 하나 이상의 추가 기질에 작용할 수 있게 된다.
상기 추가 기질은 각각 동일하거나, 상이하거나 또는 이의 조합일 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 하나 이상의 조립 촉진 인자의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 하나 이상의 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는 것인 단계;
(b) 하기의 조건 (1) 및 (2) 하에서, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분과 조립 촉진 인자를 함유하는 것으로 추정되는 시료를 접촉시키는 단계:
(1) 상기 하나 이상의 촉매 활성 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건, 및
(2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 가질 수 있는 조건; 및
(c) 상기 하나 이상의 MNA자임의 촉매 활성의 존재를 측정하는 단계로서, 이때, 상기 촉매 활성의 존재는 상기 하나 이상의 조립 촉진 인자가 존재함을 나타내는 것인 단계.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들 또는 조립 촉진 인자 중 하나 이상은 DNA 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
상기 조립 촉진 인자는 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 표적일 수 있다. 상기 표적은 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로 RNA, 기타 비암호화 RNA, 리보좀 RNA, 이의 유도체, 앰플리콘 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 리보좀 RNA는 16S 리보좀 RNA일 수 있다.
핵산 공급원은 합성물, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 기타 이것의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 조립 촉진 인자를 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 증폭 단계는 다음과 같은 반응 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 회전 환 증폭(RCA), 전사 매개 증폭(TMA), 자기 부양 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 또는 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR).
상기 조립 촉진 인자, 상기 올리고뉴클레오티드 성분들 또는 기질 또는 이의 조합 중 하나 이상은 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 과정 중 또는 이후에 상기 촉매 활성을 가지는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
MNA자임의 자체 조립에는 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 어느 하나 또는 둘 다와 조립 촉진 인자를 접촉시키는 단계를 필요로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 어느 하나 또는 둘 다의 적어도 일부와 접촉하여 MNA자임을 자체 조립시키는, 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계를 포함할 수도 있다. 상기 제3 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 측면에 따르면, 하나 이상의 조립 촉진 인자의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 적어도 제1 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 적어도 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는 것인 단계;
(b) 상기 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 적어도 제1 기질을 제공하는 단계로서, 상기 MNA자임에 의한 기질의 변형을 통해서는 검출 가능 효과가 나타날 수 있는 것인 단계;
(c) 하기의 조건 (1) 및 (2) 하에서, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분과 상기 적어도 제1 조립 촉진 인자를 함유하는 것으로 추정되는 시료를 접촉시키는 단계:
(1) 상기 적어도 제1 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건; 및
(2) 상기 적어도 제1 MNA자임이 촉매 활성을 가질 수 있는 조건; 및
(d) 상기 검출 가능 효과를 확인하는 단계.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진 인자 또는 기질 중 하나 이상은 DNA 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
상기 조립 촉진 인자는 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 표적일 수 있다. 상기 표적은 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로 RNA, 기타 비암호화 RNA, 리보좀 RNA, 이의 유도체, 앰플리콘 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 리보좀 RNA는 16S 리보좀 RNA일 수 있다.
핵산 공급원은 합성물, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 기타 이것의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 증폭 단계는 다음과 같은 방법 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 중합 효소 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭(SDA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 회전 환 증폭(RCA), 전사 매개 증폭(TMA), 자기 부양 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 또는 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR).
상기 조립 촉진 인자, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 제2 올리고뉴클레오티드 성분 또는 기질 또는 이의 조합 중 하나 이상은 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 상기 증폭 과정 중 또는 이후에, 상기 검출 가능 효과를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 검출 가능 효과는 상기 조립 촉진 인자가 존재함을 나타내는 지표가 될 수 있다. 상기 검출 가능 효과는 정량적 또는 정성적으로 측정될 수 있다.
상기 기질은 핵산 또는 단백질일 수 있다. 핵산은 표지된 핵산, RNA, DNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 항체, 폴리펩티드, 당단백질, 지단백질 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 상기 기질은 또한 나노 입자 또는 마이크로 입자 또는 이의 조합 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 상기 기질은 블용성 지지체에 부착될 수 있거나 용액 중에 유리되어 존재할 수도 있다.
상기 기질은 핵산을 포함할 수 있으며, 상기 기질 팔은 상보성 염기쌍 형성에 의해 상기 기질과 계합할 수 있다.
상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처 부분을 포함할 수 있는데, 상기 기질이 MNA자임에 의해 변형되면, 검출 가능 부분에 의해 제공되는 검출 가능 효과는 증가하거나 감소하게 된다. 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 분석법, 광도 측정법, 신티그램 조영법, 전자적 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 또는 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 검출 가능 효과 증폭 케스케이드를 이용하여 검출 가능 효과를 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 검출 가능 효과 증폭 케스케이드로서는 리보자임/리가제 케스케이드, 환형 핵산 효소 케스케이드, 단백질 효소 케스케이드, 또는 지지체에 부착된 하나 이상의 효소, 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 기질의 변형법으로서는 절단, 결찰, 포피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합의 형성을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 추가 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 하나 이상의 추가 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있으며,
하나 이상의 추가 기질은 시료 중에 존재하고, 상기 추가 기질은 추가 MNA자임에 의해서 변형될 수 있으며, 상기 변형을 통해서 상기 추가 검출 가능 효과가 나타난다.
하나 이상의 추가 검출 가능 효과는 독립적으로 검출할 수 있다.
각각의 추가 기질 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착되어 존재하다가, 상기 추가 기질이 상기 추가 MNA자임에 의해 변형될 때, 추가 기질의 검출 가능 부분과 켄처 부분 중 단 하나만이 지지체에 부착된 채 잔류할 수 있는 것이다.
하나의 추가 기질이 하나 이상의 불용성 지지체에 부착되어, 상기 기질에 대한 각각의 MNA자임에 의해 이 기질이 변형될 때 검출 가능 효과가 발생할 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 의하면, 하나 이상의 표적의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:
(a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분들을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 적어도 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 상기 표적 존재 하에 자체 조립되어, 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성할 수 있으며; 또한 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상은 또한 하나 이상의 앱타머 부분을 추가로 포함하는 것인 단계;
(b) 하기의 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 올리고뉴클레오티드 성분들과 하나 이상의 표적을 함유하는 것으로 추정되는 시료를 접촉시키는 단계:
(1) 상기 앱타머 부분과 상기 표적이 결합할 수 있는 조건, 및
(2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 가질 수 있는 조건; 및
(c) 상기 MNA자임의 촉매 활성의 존재를 측정하는 단계로서, 상기 촉매 활성의 존재는 상기 표적이 존재함을 나타내는 것인 단계.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들 중 하나 이상은 고체 지지체에 부착될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들 중 하나 이상은 DNA 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
상기 표적은 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 것일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분과 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분과 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 추가 표적 존재 하에 자체 조립되어, 하나 이상의 추가 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있고,
상기 제3 올리고뉴클레오티드 성분 또는 제4 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상은 상기 하나 이상의 추가 표적에 결합하는 하나 이상의 추가 앱타머 부분을 포함한다.
본 발명의 제5 측면에 의하면, 하나 이상의 표적의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 상기 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 조립 촉진 인자 및 상기 하나 이상의 표적 존재 하에 자체 조립되어, 하나 이상의 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성할 수 있으며; 또한 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분, 또는 상기 하나 이상의 조립 촉진 인자 중 하나 이상은 하나 이상의 앱타머 또는 이의 일부를 추가로 포함하고, 상기 표적은 상기 하나 이상의 앱타머 또는 이의 일부와 결합할 수 있는 것인 단계;
(b) 상기 MNA자임의 자체 조립을 억제하는 하나 이상의 억제제를 제공하는 단계;
(c) 하기의 조건 (1)∼(3) 하에서, 하나 이상의 표적을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진 인자 및 상기 억제제를 접촉시키는 단계:
(1) 상기 하나 이상의 앱타머 또는 이의 일부와 상기 표적이 결합할 수 있는 조건;
(2) 상기 하나 이상의 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
(3) 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립이 억제되는 것을 막는 조건; 및
(d) 상기 MNA자임의 촉매 활성의 존재를 측정하는 단계로서, 상기 촉매 활성의 존재는 상기 표적이 존재함을 나타내는 것인 단계.
하나 이상의 표적은 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 물질, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온, 핵산 또는 이의 임의의 유도체, 일부 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진 인자 또는 억제제 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진 인자, 앱타머 또는 앱타머의 일부 중 하나 이상은 상기 억제제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 제2 올리고뉴클레오티드 성분 또는 조립 촉진 인자 중 하나 이상은 또한 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 자기 상보성 서열의 일부를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 헤어핀 구조는 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립을 억제할 수 있다.
상기 앱타머 또는 이의 일부는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 이의 유도체나 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립 억제 현상은, 표적과 상기 앱타머 또는 앱타머의 일부가 접촉하면 차단될 수 있다.
상기 억제제는 상기 앱타머 또는 이의 일부를 포함하는 군 중 하나 이상과 결합할 수 있다.
상기 억제제는 RNA, DNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 상기 MNA자임에 의해 변형되어, 검출 가능 효과를 나타낼 수 있는 기질을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 변형으로서는 절단, 결찰, 포피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합의 형성을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 기질은, 상기 조립 촉진 인자 및 상기 표적이 존재하지 않을 때, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 제2 올리고뉴클레오티드 성분 각각에 의하거나, 또는 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분 둘 다에 의해 변형되지 않을 수 있다.
상기 기질은 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 표지된 핵산, RNA, DNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 상기 단백질은 항체, 폴리펩티드, 당단백질, 지단백질 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 기질은 또한 하나 이상의 나노 입자 또는 마이크로 입자 또는 이의 조합을 포함할 수도 있다.
검출 가능 효과가 검출된다는 것은 곧, 상기 촉매 활성 MNA자임의 촉매 활성에 대한 지표가 될 수 있으며, 여기서, 상기 촉매 활성은 상기 표적에 대한 지표가 된다. 검출 가능 효과는 정량적 또는 정성적으로 측정될 수 있다. 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 분석법, 광도 측정법, 신티그램 조영법, 전자적 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 또는 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다.
상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처 부분을 포함할 수 있는데, 상기 기질이 상기 MNA자임에 의해 변형되면, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공되는 검출 가능 효과는 증가 또는 감소된다.
본 발명의 제6 측면에 의하면, 하나 이상의 표적의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 적어도 제1 조립 촉진 인자 및 상기 적어도 제1 표적 존재 하에 자체 조립되어, 적어도 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성할 수 있는 것인 단계;
(b) 적어도 제1 기질을 제공하는 단계로서, 상기 제1 기질은 상기 적어도 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있고, 상기 MNA자임에 의해 기질이 변형되면, 검출 가능 효과가 나타나는 것인 단계;
(c) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 적어도 제1 조립 촉진 인자 또는 상기 적어도 기질 중 하나 이상은 앱타머를 추가로 포함하고, 상기 표적은 상기 앱타머의 적어도 일부와 결합하여, 상기 표적 부재 하에 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립을 억제할 수 있는, 적어도 제1 억제제를 제공할 수 있는 것인 단계;
(d) 하기의 조건 (1)∼(3) 하에서, 상기 표적을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 상기 조립 촉진 인자, 상기 기질 및 상기 억제제를 접촉시키는 단계:
(1) 상기 앱타머와 상기 표적이 결합할 수 있는 조건;
(2) 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립이 억제되는 것을 막는 조건; 및
(3) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
(e) 상기 검출 가능 효과가 나타나는 것을 측정함으로써, 상기 표적의 존재를 검출하는 단계.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들 또는 조립 촉진 인자 중 하나 이상은 DNA 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명의 앱타머 또는 이의 일부는 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 물질, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온, 또는 이의 임의의 유도체, 일부 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 표적과 결합할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진 인자, 기질 또는 억제제 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진 인자, 앱타머 또는 앱타머의 일부 중 하나 이상은 또한 상기 억제제를 포함할 수도 있다.
본 발명의 앱타머 또는 이의 일부는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 유도체나 조합을 포함할 수 있다.
상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분, 조립 촉진 인자 또는 기질 중 하나 이상은 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 자기 상보성 서열의 일부를 포함할 수도 있다. 상기 헤어핀 구조는 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립을 억제할 수 있다. 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립은, 상기 앱타머 또는 앱타머의 일부와 표적이 접촉하게 되면 억제되지 않을 수 있다.
상기 억제제는 상기 앱타머 또는 이의 일부를 포함하는 군 중 하나 이상과 결합할 수 있다. 상기 억제제는 RNA, DNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 기질은 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 표지된 핵산, RNA, DNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 항체, 폴리펩티드, 당단백질, 지단백질 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 기질은 하나 이상의 나노 입자 또는 마이크로 입자 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수도 있다.
상기 검출 가능 효과를 확인함으로써 상기 표적의 존재를 확인할 수 있다. 상기 검출 가능 효과는 정량적 또는 정성적으로 측정될 수 있다. 상기 검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 분석법, 광도 측정법, 신티그램 조영법, 전자적 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 또는 이의 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다.
상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처 부분을 포함할 수 있는데, 상기 기질이 상기 MNA자임에 의해 변형되면, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공되는 검출 가능 효과는 증가 또는 감소된다. 상기 변형은 절단, 결찰, 포피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합 형성을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수도 있는데, 여기서, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 추가 조립 촉진 인자 및 하나 이상의 추가 표적 존재 하에, 자체 조립되어 하나 이상의 추가 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있으며,
여기서, 하나 이상의 추가 기질은 시료 중에 존재하고, 상기 추가 기질은 추가 MNA자임에 의해 변형될 수 있으며, 상기 변형은 추가의 검출 가능 효과를 나타내고; 또한
상기 제3 올리고뉴클레오티드 성분 또는 제4 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 추가 조립 촉진 인자 또는 상기 추가 기질 중 하나 이상은, 상기 하나 이상의 추가 표적에 결합하는 하나 이상의 추가 앱타머를 추가로 포함할 수도 있으며;
하나 이상의 추가 억제제의 분자는 상기 추가 앱타머의 일부와 접촉함으로써, 상기 추가 표적 부재 하에 상기 촉매 활성 추가 MNA자임의 자체 조립을 억제하고;
하나 이상의 추가 조립 촉진 인자는 상기 추가 올리고뉴클레오티드 성분의 적어도 일부와 접촉하게 된다.
하나 이상의 추가 검출 가능 효과는 독립적으로 검출될 수 있다.
상기 추가 기질은 각각 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합일 수 있다.
각각의 추가 기질 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착되어 존재하다가, 상기 추가 기질이 상기 추가 MNA자임에 의해 변형될 때, 상기 기질의 검출 가능 부분과 켄처 부분 중 어느 하나만이 지지체에 부착된 채로 잔류할 수 있다.
본 발명의 제7 측면에 의하면, 하나 이상의 핵산 서열 변이체의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 핵산의 서열 변이체가 존재할 때 자체 조립되어, 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는 것인 단계;
(b) 상기 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 하나 이상의 기질을 제공하는 단계로서, 상기 MNA자임에 의한 상기 기질의 변형은 검출 가능 효과를 제공하는 것인 단계;
(c) 하기의 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 서열 변이체를 포함하는 것으로 추정되는 시료와 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계:
(1) 상기 촉매 활성 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건; 및
(2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
(d) 상기 검출 가능 효과의 존재를 측정함으로써, 상기 하나 이상의 서열 변이체의 존재를 검출하는 단계.
상기 서열 변이체는 단일 염기 다형, 다중 염기 다형, 삽입, 결실, 중복, 전위, 프레임쉬프트 서열 변이체, 넌센스 서열 변이체 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 서열 변이체는 DNA 또는 RNA 중에 존재할 수 있다.
상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 어느 하나 또는 둘 다는 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다.
상기 서열 변이체를 포함하는 시료는 바이설파이트 변형 메틸화 또는 비메틸화 DNA, 바이설파이트 변형 메틸화 또는 비메틸화 RNA, 바이설파이트 변형 메틸화 또는 비메틸화 DNA의 하나 이상의 앰플리콘, 바이설파이트 변형 메틸화 또는 비메틸화 RNA의 하나 이상의 앰플리콘 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
다성분 핵산 효소의 자체 조립에는 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 어느 하나 또는 둘 다의 적어도 일부와, 상기 서열 변이체를 포함하는 핵산을 접촉시키는 과정을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 상기 서열 변이체를 포함하는 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 증폭 단계는 다음과 같은 방법 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 회전 환 증폭(RCA), 전사 매개 증폭(TMA), 자기 부양 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 또는 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR). 본 발명의 방법은 또한 상기 증폭 과정 중 또는 이후에 상기 핵산 서열 변이체의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 분석법, 광도 측정법, 신티그램 조영법, 전자적 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 또는 이의 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다.
상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처 부분을 포함할 수 있는데, 상기 기질이 상기 MNA자임에 의해 변형되면, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공되는 검출 가능 효과는 증가 또는 감소된다.
상기 기질은 불용성 지지체에 부착될 수 있거나 용액 중에 유리되어 존재할 수 있다.
상기 변형은 절단, 결찰, 포피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합 형성을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 다음과 같은 단계들을 추가로 포함할 수도 있다:
(a) 하나 이상의 추가 핵산 서열 변이체가 존재할 때 자체 조립되어, 하나 이상의 추가 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성할 수 있는, 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분과 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계;
(b) 상기 하나 이상의 추가 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 하나 이상의 추가 기질이 존재할 때, 하나 이상의 추가 핵산 서열 변이체를 포함하는 것으로 추정되는 시료와, 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계로서, 다음과 같은 (1) 및 (2)의 조건 하에서, 상기 하나 이상의 추가 기질의 변형은 하나 이상의 추가 검출 가능 효과를 제공하는 것인 단계:
(1) 하나 이상의 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건; 및
(2) 하나 이상의 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
(c) 상기 하나 이상의 추가 검출 가능 효과를 확인하여, 상기 하나 이상의 추가 서열 변이체의 존재를 확인하는 단계.
하나 이상의 추가 검출 가능 효과는 독립적으로 검출될 수 있다.
상기 추가 기질은 각각 동일하거나, 상이하거나 또는 이의 조합일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 상기 기질이 부착되어 있는 불용성 지지체를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
각각의 추가 기질 중 하나 이상은 불용성 지지체에 부착되어 존재하다가, 상기 추가 기질이 상기 추가 MNA자임에 의해 변형될 때, 추가 기질의 상기 검출 가능 부분과 켄처 부분 중 오로지 하나만이 상기 지지체에 부착된 채 잔류할 수 있게 된다.
본 발명의 제8 측면에 의하면, 핵산의 서열 변이체의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 핵산이 존재할 때 자체 조립되어, 적어도 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성할 수 있는, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계;
(b) 상기 적어도 제1 MNA자임에 의해 변형 가능한, 적어도 제1 기질이 존재할 때, 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계로서, 상기 기질은 하기의 조건 (1) 및 (2) 하에서, 이 기질이 상기 적어도 제1 MNA자임에 의해 변형될 때 적어도 제1 검출 가능 효과를 나타낼 수 있는 검출 가능 부분을 포함하는 것인 단계:
(1) MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건; 및
(2) MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
(c) 촉매 활성의 부재는 상기 핵산 내에 서열 변이체가 존재함을 나타내는 것인 단계.
본 발명의 제9 측면에 의하면, 하나 이상의 메틸화된 핵산의 존재를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 메틸화된 핵산이 존재할 때 자체 조립되어, 하나 이상의 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는 것인 단계;
(b) 상기 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 적어도 제1 기질을 제공하는 단계로서, 상기 MNA자임에 의해 기질이 변형되면 적어도 제1 검출 가능 효과가 나타나는 것인 단계;
(c) 하기의 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 메틸화된 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계:
(1) 상기 촉매 활성 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건; 및
(2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
(d) 상기 하나 이상의 검출 가능 효과의 존재를 측정함으로써, 상기 하나 이상의 메틸화된 핵산의 존재를 검출하는 단계.
상기 조건으로서는 또한 상기 MNA자임과 상기 메틸화된 핵산의 혼성화는 촉진하되, 비메틸화 핵산과의 혼성화는 촉진하지 않는 온도를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 검출 가능 효과 증폭 케스케이드를 이용하여, 검출 가능 효과를 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 검출 가능 효과의 증폭 케스케이드로서는, 리보자임/리가제 케스케이드, 환형 핵산 효소 케스케이드, 단백질 효소 케스케이드, 또는 지지체에 부착된 하나 이상의 효소가 관여하는 케스케이드 중 하나 이상, 또는 이의 임의의 병행 케스케이드를 포함한다.
상기 메틸화된 핵산의 공급원은 합성물, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
메틸화된 핵산은 메틸화된 RNA 또는 메틸화된 DNA를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다성분 핵산 효소의 자체 조립에서는, 메틸화된 핵산과 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 어느 하나 또는 둘 다의 접촉을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 상기 기질 또는 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 제2 올리고뉴클레오티드 성분, 또는 이의 조합 중 하나 이상이 부착되어 있는 불용성 지지체를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
검출 가능 효과는 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 분석법, 광도 측정법, 신티그램 조영법, 전자적 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 또는 이의 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다.
상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처 부분을 포함할 수 있는데, 상기 기질이 상기 MNA자임에 의해 변형되면, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공되는 검출 가능 효과는 증가 또는 감소된다.
상기 변형은 상기 변형은 절단, 결찰, 포피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합 형성을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분과 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수도 있는데, 여기서, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분과 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 메틸화된 추가 핵산이 존재할 때 자체 조립되어, 하나 이상의 추가 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있으며;
상기 하나 이상의 추가 기질은 시료 중에 존재하고, 상기 추가 기질은 상기 추가 MNA자임에 의해 변형될 수 있고, 이와 같이 변형되면 추가 검출 가능 효과가 나타난다.
하나 이상의 추가 검출 가능 효과는 독립적으로 검출될 수 있다.
추가 기질은 각각 동일하거나 상이할 수 있으며, 또는 이의 조합일 수도 있다.
상기 추가 기질 중 하나 이상이 불용성 지지체에 부착되어 있다가, 이 추가 기질이 상기 추가 MNA자임에 의해 변형될 때, 상기 추가 기질의 추가 검출 가능 부분과 추가 켄처 부분 중 오로지 하나만이 지지체에 부착된 채로 잔류하게 될 수 있다.
본 발명의 제10 측면에 의하면, 다음의 단계들을 포함하며, 증폭 케스케이드를 이용하여 하나 이상의 조립 촉진 인자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 적어도 제1 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 적어도 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는 것인 단계;
(b) 상기 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 적어도 제1 기질이 부착된 불용성 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 제1 기질은 상기 제1 MNA자임에 의해 상기 제1 기질이 변형될 때 방출되는, 적어도 제1 촉매 활성 효소를 포함하는 적어도 제3 분자를 포함하는 것인 단계;
(c) 하기의 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 제1 기질이 부착된 상기 불용성 지지체가 존재할 때, 상기 조립 촉진 인자를 함유하는 것으로 추정되는 시료와 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계:
(1) 상기 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건; 및
(2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건;
(d) 적어도 제2 기질이 부착된 불용성 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 제2 기질은 상기 제1 촉매 활성 효소에 의해 절단될 수 있고, 상기 제2 기질은 또한 상기 제1 효소에 의해 상기 제2 기질이 변형될 때 방출되는 적어도 검출 가능 부분을 포함하는, 적어도 제4 분자를 포함하는 것인 단계; 및
(e) 상기 제1 촉매 활성 효소가 상기 제2 기질 다수 개를 변형시켜, 검출 가능 부분을 다수 개 방출하는 단계;
(f) 상기 제1 촉매 활성 효소에 의해 상기 제2 기질을 변형시킨 후, 상기 검출 가능 부분을 검출할 수 있는 단계; 및
(g) 상기 검출 가능 부분이 검출됨은 상기 조립 촉진 인자가 존재함을 나타내는 것인 단계.
상기 검출 가능 부분은 상기 제1 기질을 변형시킴으로써 추가 촉매 활성 효소를 방출시킬 수 있는, 추가의 제2 촉매 활성 효소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제1 촉매 활성 효소 또는 상기 제2 촉매 활성 효소 중 하나 이상은 MNA자임, DNA자임, 리보자임, 가수분해 효소(hydrolytic enzyme), 제한 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 프로테아제, 프로테이나제, 하이드롤라제(hydrolase), 라이티카제(lyticase), 펩티다제, 디펩티다제, 에스터라제, 카스파제, 카텝신, 탈황화수소 효소, 아미다제 및 글리코시다제를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 조립 촉진 인자는 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 표적을 포함할 수 있다. 상기 표적은 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온, 핵산 또는 이의 임의의 유도체, 일부 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로 RNA, 기타 비암호화 RNA, 리보좀 RNA, 이의 유도체, 앰플리콘 또는 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제11 측면에 의하면, MNA자임 매개 신호 증폭 케스케이드를 이용하여 표적을 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 상기 표적 존재 하에 자체 조립되어, 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는, 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계;
(b) 제1 기질 및 제2 기질이 부착되어 있는 불용성 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 제1 기질 및 제2 기질은 상기 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있으며, 상기 제1 기질 및 제2 기질은 각각 제2의 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있는 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하고, 상기 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분은 상기 제1 기질 및 제2 기질이 상기 제1 MNA자임에 의해 변형됨에 따라서 방출되는 것인 단계;
(c) 제3 기질 및 제4 기질이 부착되어 있는 불용성 기질을 제공하는 단계로서, 상기 제3 기질 및 제4 기질은 상기 제2 MNA자임에 의해 변형될 수 있고, 상기 제3 기질 및 제4 기질은 각각 제3의 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있는 적어도 제5 올리고뉴클레오티드 성분 및 제6 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하며, 상기 제5 올리고뉴클레오티드 성분 및 제6 올리고뉴클레오티드 성분은 상기 제2 MNA자임에 의해 상기 제3 기질 및 제4 기질이 변형됨에 따라서 방출되는 것인 단계;
(d) 상기 제2 MNA자임 및 상기 제3 MNA자임의 조립을 촉진할 수 있는 조립 촉진 인자를 제공하는 단계;
(e) 상기 제2 MNA자임에 의해 변형되어 검출 가능 효과를 나타낼 수 있는 제5 기질을 제공하는 단계;
(f) 다음과 같은 (1) 및 (2)의 조건 하에서, 상기 조립 촉진 인자 존재 하에, 그리고 상기 제1 기질, 제2 기질, 제3 기질 및 제4 기질이 부착되어 있는 상기 불용성 지지체가 존재할 때, 상기 표적을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계:
(1) 상기 제1 MNA자임, 제2 MNA자임 및 제3 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건; 및
(2) 상기 제1 MNA자임, 제2 MNA자임 및 제3 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건;
(g) 상기 제3 MNA자임이 상기 제1 기질 및 제2 기질을 변형시킴으로써, 상기 제2 MNA자임을 추가로 제공하는 단계로서, 상기 제2 MNA자임은 상기 제3 기질, 제4 기질 및 제5 기질 중 하나 이상을 추가로 변형시켜 상기 제3 MNA자임을 추가로 제공하고, 이로써, 상기 검출 가능 효과도 추가로 나타나는 것인 단계; 및
(h) 상기 검출 가능 효과가 검출됨은 상기 표적이 존재함을 나타내는 것인 단계.
상기 표적은 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 것일 수 있다. 상기 표적은 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온, 핵산 또는 이의 임의의 유도체, 일부 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로 RNA, 기타 비암호화 RNA, 리보좀 RNA, 이의 유도체, 앰플리콘 또는 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 제5 기질은 상기 제1 기질, 제2 기질, 제3 기질 또는 제4 기질 중 임의의 것과 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 제1 기질, 제2 기질, 제3 기질 또는 제4 기질은 각각 동일한 고체 지지체 또는 상이한 고체 지지체 상에 존재하거나 또는 이것의 임의의 조합일 수 있다.
상기 제1 기질, 제2 기질, 제3 기질 또는 제4 기질 중 하나 이상을 변형 시키면 검출 가능 효과가 나타날 수도 있다.
본 발명의 제12 측면에 의하면, 각각 하나 이상의 조립 촉진 인자를 인식하고 기질을 변형시키는, 다수의 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 조립 촉진 인자를 다수 제공하는 단계;
(b) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 디자인하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하고, 또한 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 각각 기질 팔 부분, 촉매 중심 부분 및 센서 팔 부분을 포함하며,
이들 성분이 자체 조립되면, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 센서 팔 부분은 MNA자임의 센서 팔을 형성하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 팔 부분은 MNA자임의 기질 팔을 형성하며, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 MNA자임의 촉매 중심을 형성하고;
상기 MNA자임의 센서 팔은 조립 촉진 인자와 상호 작용하여, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 인접한 위치로 유지시켜, 상기 성분들 각각의 촉매 중심 부분을 결합시키며, 그 결과, 상기 MNA자임의 촉매 중심(즉, 하나 이상의 기질에 작용할 수 있는 촉매 중심 부분)가 형성되고, 상기 MNA자임의 기질 팔은 기질과 계합하여, MNA자임의 촉매 중심이 상기 기질을 변형시킬 수 있게 되는 것인 단계;
(c) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 팔 부분과 촉매 중심 부분은 불변 상태로 두고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상의 센서 팔 부분은 다른 다수의 조립 촉진 인자를 인식하는 것에 적합하도록 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 변형시키는 단계; 및
(d) 다수의 조립 촉진 인자 각각에 대하여 상기 변형 단계를 반복하는 단계.
본 발명의 제13 측면에 의하면, 각각이 다수의 표적 중 하나 이상과 상응하는, 다수의 MNA자임을 조립하도록 디자인된 다수의 올리고뉴클레오티드 성분과, 하나 이상의 기질을 포함하는, 다수의 표적의 존재를 검출하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 제14 측면에 의하면, 다수의 조립 촉진 인자와, 각각이 다수의 각 조립 촉진 인자에 상응하는 다수의 MNA자임을 조립하도록 디자인된 다수의 올리고뉴클레오티드 성분들 그리고 하나 이상의 기질을 포함하는, 다수의 MNA자임을 조립하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 제15 측면에 의하면, 표적에 상응하는 MNA자임을 조립하도록 디자인된 다수의 올리고뉴클레오티드 성분들과 기질을 포함하는, 표적을 검출하기 위한 키트가 제공된다.
도면의 간단한 설명
이제부터, 본 발명의 바람직한 구체예를 다음과 같은 첨부 도면들을 참고로 하여, 오로지 예시적인 차원에서 설명할 것이다.
도 1: MNA 자임의 디자인
도 1은 MNA자임의 예시적인 디자인을 도시한 것으로서, 여기서, 파트자임(partzyme) A 및 B의 기질 팔 부분(A)은 형광 태그(좌) 및 켄처(우)에 부착된 리포터 기질과 계합한다. 촉매 중심 부분(C)는 기질 팔 부분(A)과 센서 팔 부분(B) 사이에 위치하고 있다. 센서 팔 부분(B)이 표적에 결합할 때, 상기 리포터 기질은 MNA자임 절단 위치에서 절단되어 형광도가 증가하게 된다.
도 2: MNA 자임 매개 표적 검출 기법
도 2는 MNA자임을 사용하여 표적을 검출하는 방법을 예시적으로 나타낸 흐름도이다. MNA자임은 (1) 직접 검출법; (2) 예를 들어, 증폭 시 또는 증폭 후, PCR, SDA, LAMP, RCA, TMA, 3SR 또는 NASBA에 의해 생성된 앰플리콘을 검출하는 방법; 및 (3) 신호 증폭 케스케이드를 개시하는 방법에 사용될 수 있다.
도 3: MNA 자임 및 고정된 일반 기질을 사용하는 표적 검출 방법
도 3은 지지체에 부착되어 있는 기질을 절단하는 MNA자임을 사용하여, 표적을 검출하는 방법과 이에 사용되는 대표적인 MNA자임을 도시한 것이다. 이 구체예에 있어서, MNA자임은 조립 촉진 인자(표적)가 존재할 경우에만 형성된다. MNA자임이 형광단과 켄처 사이에 고정된 기질을 절단할 때, 신호가 발생한다. 본 도면에 나타낸 바와 같이, 형광단 F와 켄처 Q 사이가 절단되면, 형광도가 증가하게 된다. 일반적으로, 이 방법은 절단되기까지는 형광단 F 또는 켄처 Q가 지지체에 부착된 상태로 남아있도록 디자인될 수 있다. 패널 (i): 여기에 나타낸 지지체에는 오로지 하나의 기질만이 부착되어 있다. 패널 ( ii ): 여기에서는 다수의 기질이 상이한 위치에 고정되어 있을 수 있다. 각각의 기질은 특정 MNA자임 조립 촉진 분자가 존재할 때 형성된 MNA자임에 의해서만 절단될 수 있는데, 이 경우, 표적 1과 표적 2는 MNA자임 1과 MNA자임 2의 자체 조립을 각각 촉진한다. 그러므로, 본 구체예에서는, 표적 1이 존재할 때 MNA자임 1만이 자체 조립되어 기질 1만을 절단하는 것이다. 이와 유사하게, MNA자임 2는 오로지 표적 2가 존재할 때에만 자체 조립되어 기질 2만을 절단한다. 신호는, 표면상에 기질을 배치하여 상이한 조립 촉진 인자를 특이적으로 검출할 수 있게 만듦으로써 국소화될 수 있다.
도 4: 표적 검출을 위한 대표적인 방법
도 4는 표적 피분석물(An) 예를 들어, 단백질이나 소분자를 검출하기 위하여 MNA자임을 사용하는 방법을 예시한 것이다. 본 구체예는 형광단(F) 및 켄처(Q)로 표지된 기질을 MNA자임으로 절단함으로써 신호가 발생하는 과정을 도시한 것이다. 일반적인 디자인을 다른 형태로 활용할 수 있는데, 이로써, 신호는 절단 이외의 변형에 의해 발생되고/발생되거나, 신호의 판독 결과가 형광성을 띠지 않는 경우에는 예를 들어, 비색 방식이나 방사능에 의해 측정할 수 있다. 본 도면에는 3가지의 일반적인 기법이 도시되어 있다. (i) 표적 피분석물과 결합하는 앱타머가 하나의 파트자임에 결합되어 있는 경우(앱타-파트자임; apta-partzyme). 이 분자는 자기 상보성(self-complementarity)을 가지며, 표적 피분석물이 존재하지 않을 경우에는 활성 MNA자임을 조립할 수 없다. 제2 파트자임, 기질 및 조립 촉진 인자도 제공된다. 특정 표적 피분석물이 앱타머 도메인에 결합할 때, 이 앱타-파트자임 내에 존재하는 상보성 염기들은 분리되어, 상기 앱타-파트자임이 일정한 형태를 취할 수 있도록 만들어 주며, 그 결과, 활성 MNA자임이 조립될 수 있게 할 수 있다. 상기 활성 MNA자임은 기질을 절단하여 형광을 발생시킬 수 있다. ( ii ) 표적 피분석물에 결합하는 앱타머는 조립 촉진 인자에 결합된다. 이 분자는 자기-상보성을 가지며, 또한 표적 피분석물이 존재하지 않을 때에는 파트자임들을 정렬시켜 활성 MNA자임이 조립되도록 유도할 수도 없다. 2개의 파트자임과 기질도 제공된다. 특정 표적 피분석물이 앱타머 도메인에 결합할 때, 상기 조립 촉진 인자 내에 존재하는 상보성 염기들은 분리되어, 상기 조립 촉진 인자가 일정한 형태를 취할 수 있도록 만들어 주며, 그 결과, 활성 MNA자임이 조립될 수 있게 할 수 있다. 상기 활성 MNA자임은 기질을 절단하여 형광을 발생시킬 수 있다. ( iii ) 각각 앱타머 일부를 함유하는 2개의 앱타-파트자임들은 기질이 존재하는 조건에서 항온 처리된다. 표적 피분석물이 존재하지 않을 때, 2개의 앱타-파트자임은 활성 MNA자임을 형성하도록 조립할 수 없다. 특정 표적 피분석물이 존재하여, 앱타머 일부를 함유하는 도메인 둘 다와 결합할 때, 2개의 앱타-파트자임은 근접하게 되며, 그 결과, 활성 MNA자임으로 조립될 수 있게 된다. 활성 MNA자임은 기질을 절단하여 형광을 발생시킬 수 있다.
도 5: 마이크로 RNA의 PCR 증폭법 및 MNA 자임을 이용한 검출 방법
도 5는 짧은 서열들 예를 들어, 마이크로-RNA(miR) 종을 증폭 및 검출하기 위한 MNA자임 기법을 도시한 것이다. 이 방법에서는 miR의 3' 말단부에 결합하고, 5' 말단부에 관련성 없는 연장 서열(점선 박스 안에 도시함) 즉, 줄기-고리 구조를 형성할 수 있거나((i) 및 (ii) 부분, 고리 프라이머, 좌측), 또는 이 구조를 형성할 수 없는((iii) 및 (iv) 부분, 태깅된 프라이머, 우측) 연장 서열을 가지는 3' 프라이머를 사용한다. 상기 3' miR은 역전사 효소의 존재 하에서 연장된 후((i) 및 (iii) 부분), 3' 말단에는 miR 특이 서열을 가지고 5' 말단에는 관련성 없는 연장 서열을 가지는 5' 및 3' 프라이머를 사용하는 PCR을 통해 증폭된다((ii) 및 (iv) 부분)). 상기 앰플리콘은, 이 앰플리콘 예를 들어, 5' 및 3' 프라이머 사이의 부위에 혼성화하는 MNA자임에 의해 검출될 수 있다. MNA자임 센서 팔과 표적 핵산의 상보성이 엄격하므로, 밀접하게 관련된 서열들도 구별할 수 있는 것이다. F: 형광단; Q: 켄처.
도 6: 효소 매개 신호 증폭 과정과 연계된 MNA 자임 검출 방법
도 6은 신호 증폭 케스케이드를 개시하는 MNA자임을 도시한 것이다. 본 구체예에서, MNA자임은 신호 발생의 하류 케스케이드를 촉발하는데, 여기서, (좌 → 우, 상부 패널) MNA자임은 표적이 존재할 경우에만 형성된 후, 지지체에 고정되어 있던 효소를 방출시킨다. 하부 패널에 도시한 바와 같이, 이후 유리된 효소는 형광 기질 분자를 절단한다. 형광 기질은 검출이 용이하다. F: 형광단; Q: 켄처.
도 7: MNA자임 및 신호 증폭 과정을 이용하는 피분석물의 검출
공간적으로 분리되어 있는 DNA자임을 이용하여 형성된 MNA자임은 케스케이드를 촉발할 수 있다. 일련 번호를 메겨 도시한 단계에 나타낸 바와 같이, 표적이 존재할 경우에만 일어나는 초기의 MNA자임 절단 현상을 통해, 고정되어 있던 기질을 절단할 수 있으며, 이로써, 고정되어 있던 제1 DNA자임 A("A")을 방출할 수 있다(단계 1∼3). DNA자임 A가 일단 유리되면, 고정되어 있던 제2 DNA자임 B("B")(형광단으로 표지됨)를 절단 및 방출시키고(단계 4∼6), 그 다음에는, 추가의 DNA자임 A를 절단 및 방출하여(단계 7∼8), 케스케이드를 개시한다. 신호가 기하 급수적으로 증폭되면, 후속되는 케스케이드에서 형광단이 DNA자임 B와 함께 방출됨을 용이하게 측정할 수 있게 된다. F: 형광단; Q: 켄처.
도 8: RPLPO 표적에 대한 MNA 자임 디자인: 패널 (i): MNA자임에 대한 디자인 1(상부 패널) 및 디자인 2(하부 패널)의 대표적인 서열들; 패널 ( ii ): MNA자임에 대한 디자인 1(상부 패널) 및 디자인 2(하부 패널)에 의해 리포터 기질이 표적 의존적 방식으로 절단된 결과. N = A, G, C, T 또는 임의의 유사체; N' = N에 상보성인 임의의 뉴클레오티드; (N 또는 N')X = 임의의 수의 뉴클레오티드 또는 유사체; K = A, G 또는 AA; W = A 또는 T; rN = 임의의 리보뉴클레오티드 및/또는 임의의 수의 리보뉴클레오티드; * = 와블 염기(wobble base).
도 9: RPLPO 표적에 대한 MNA 자임 디자인: 패널 (i): MNA자임에 대한 디자인 3의 대표적인 서열; 패널 ( ii ): 리포터 기질의 표적 의존적 방식으로 절단된 결과. 여기에 도시된 대조군 반응물은 표적 비포함 대조군, 혼성화 대조군, 2개의 표적 유리 대조군(off-target contol) 그리고 파트자임 A 및 파트자임 B 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 함유하되, 둘 다를 동시에 함유하지는 않는 반응물을 포함한다. N = A, G, C, T 또는 임의의 유사체; N' = N에 상보성인 임의의 뉴클레오티드; (N 또는 N')X = 임의의 수의 뉴클레오티드 또는 유사체; K = A, G 또는 AA; W = A 또는 T; rN = 임의의 리보뉴클레오티드 및/또는 임의의 수의 리보뉴클레오티드; * = 와블 염기.
도 10: RPLPO 표적에 대한 MNA 자임 디자인: 패널 (i): MNA자임에 대한 디자인 4의 대표적 서열; 패널 ( ii ): 디자인 3 및 디자인 4의 표적 의존적 절단 효율. 표적 RPLPO 올리고뉴클레오티드를 함유하는 반응물 및 표적을 함유하지 않는 대조군에 대한 반응의 결과를 도시하였다. N = A, G, C, T 또는 임의의 유사체; N' = N에 상보성인 임의의 뉴클레오티드; (N 또는 N')X = 임의의 수의 뉴클레오티드 또는 유사체; K = A, G 또는 AA; W = A 또는 T; rN = 임의의 리보뉴클레오티드 및/또는 임의의 수의 리보뉴클레오티드; * = 와블 염기.
도 11: 밀접하게 관련된 서열들을 구별하는데 있어서 MNA 자임의 사용
패널 (i): 도 11 및 도 12에 나타낸 실험에서 표적 서열로서 사용된 DNA 서열로서, hsa-miR-20 및 관련 miR 서열에 상동성인 DNA 서열을 도시하였다. D-20과 관련 D-miR 간 차이가 있는 서열에는 밑줄을 그어 표시하였다. 굵게 표시된 세로 점선은 2개의 센서 팔에 의해 인식되는 올리고뉴클레오티드 부위들을 구분하는 선이다. 패널 ( ii ): miR-20 검출용인 MNA자임에 대한 디자인 4의 대표적인 서열을 도시한 것이다. 패널 ( iii ): 리포터 기질의 D-20 MNA자임 표적 의존적 절단 결과이다. 대조군 반응물: "표적 외(off-target)" 올리고뉴클레오티드(D-17-5p, D-106a, D-106b, D-93) 및 "표적 비포함(no-target)"(dH2O) 대조군 반응물.
도 12: MiR -20 MNA 자임 시스템의 MgCl 2 최적화:
본 도면은 miR-20 검출용 대표적 디자인 4 MNA자임 시스템을 사용하여 얻어진 결과를 나타낸 것이다. 리포터 기질의 표적(D-20)-의존적 절단. "표적 외" 서열(D-17-5p, D-106a, D-106b, D-93)을 함유하는 대조군 반응물 또는 "표적 비포함 "(dH2O) 대조군 반응물을 각각 (i) 5 mM, (ii) 25 mM 또는 (iii) 100 mM의 MgCl2를 함유하는 반응물로서 나타내었다.
도 13: RPLPO 표적에 대한 MNA 자임 디자인: 패널 (i): MNA자임에 대한 디자인 5 또는 디자인 6의 대표적인 서열. 패널 ( ii ): 디자인 5 및 디자인 6과, 이의 "표적 비포함" 대조군을 사용하는 리포터 기질의 표적 의존적 절단 결과. N = A, G, C, T 또는 임의의 유사체; N' = N에 상보성인 임의의 뉴클레오티드; (N 또는 N')X = 임의의 수의 뉴클레오티드 또는 유사체; R = A 또는 G; Y = C 또는 U; rN= 리보뉴클레오티드 염기.
도 14: PCR 증폭된 RPLPO 의 검출:
본 도면은 인간 RPLPO 유전자를 표적화하는 디자인 4 MNA자임 시스템에 의해, 다양한 대조군 반응물 및 리포터 기질이 표적 의존적으로 절단된 결과를 나타낸 것이다. RPLPO MNA자임 반응물은 (i) 대조군 RPLPO 올리고뉴클레오티드, (ii) RPLPO 유전자에 상보성인 프라이머를 이용하여 인간 게놈 DNA(100ng)를 증폭시킴으로써 생산된 RPLPO PCR 앰플리콘(5㎕), (iii) 게놈 DNA를 함유하지 않는 "표적 비포함" RPLPO PCR 반응물, 또는 (iv) 비 증폭 인간 게놈 DNA(500ng)를 포함한다.
도 15: 증폭된 짧은(22 올리고머 ) 서열의 검출: 패널 (i): 인간 miR-20 서열을 표적화하는 디자인 4 MNA자임 시스템에 의한 리포터 기질의 표적 의존적 절단 결과. MiR-20 MNA자임 반응물은 (i) 대조군 D-20 표적 올리고뉴클레오티드(증폭되지 않음)의 1012(1E+12)개의 복사체; (ii) miR-20 서열에 상보성인 프라이머를 이용하여, D-20 표적 올리고뉴클레오티드의 2×107(2 E+7)개의 복사체를 증폭시켜 생산된 PCR 앰플리콘(5 ㎕); (iii) D-20 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는 "표적 비포함" PCR 반응물; (iv) D-20 표적 올리고뉴클레오티드(증폭되지 않음)의 108(1E+8)개의 복사체; 및 (v) "표적 외" 대조군 D-17-5p 표적(2×107(2 E+7)개의 복사체(PCR에 의해 증폭됨)). 패널 ( ii ): D-20 표적 서열과 표적 외 서열 D-17-5p의 비교. 이 D-17-5p 올리고뉴클레오티드는 D-20 표적 서열에 비하여, PCR 프라이머 결합 부위 내에 하나의 미스 매치가 발생하였는데, 이 부위(상기 프라이머들 사이의 부위)에 일어난 하나의 미스 매치는 MNA자임의 센서 팔에 의GO 신호가 보내어진다.
도 16: 증폭된 miR-20 앰플리콘의 검출: PCR 증폭 후 MNA자임을 사용하여 앰플리콘을 종말 점 검출(end point detection)한 결과를 예시한 것이다. PCR은 인간 흉선 세포로부터 유래하는 총 RNA 내에 존재하는 mir-20 마이크로 RNA를 증폭하는데 사용되었고, MNA자임을 사용하는 검출법에 사용되었다. 증폭된 시료 및 대조군을 나타냈다.
도 17: MNA 자임 디자인 6에 의한 RPLPO 엑손 5의 정량적 실시간 PCR 분석:
본 도면은 MNA자임 방법을 이용하는 실시간 검출법 및 정량법의 예를 도시한 것으로서, 상기 RPLPO 유전자는 MNA자임을 사용하여 RPLPO의 엑손 5의 축적 여부를 관찰하기 위해 검출되었다. 패널 (i): MNA자임 디자인 6; 패널 ( ii ): 상이한 양의 주형에 대한 실시간 PCR 결과를 나타내는 형광도 신호; 패널 (iii): 증폭된 물질의 표준 곡선 및 정량 결과. 결과를 통해, PCR로써 증폭된 인간 게놈 DNA의 MNA자임 검출법에 따른 형광도는 경시적으로 증가함을 알 수 있다. R2 = 0.995; 기울기 = -3.698.
도 18: 다수의 표적에 대한 대표적인 복합적 분석법의 개요:
각각 하나의 MNA자임에 특이적인 2개 이상의 기질을 사용하여 2개 이상의 표적을 동시에 검출할 수 있다. 기질은 상이한 형광단으로 표적화하는 것이 바람직하다. 본 구체예에서, 표적 1은 FAM 형광도 증가 여부를 관찰함으로써 검출될 수 있고, 표적 2는 JOE 형광도 증가 여부를 관찰함으로써 검출될 수 있다. Q: 켄처; FAM, JOE: 형광단.
도 19: RPLPO 및 D-20 서열의 단일 표적 검출 및 복합적 검출:
JOE-표지된 기질을 사용하여 RPLPO를 검출한 결과를 관찰하였으며, FAM-표지 기질을 사용하여 D-20 표적 서열을 검출한 결과를 관찰하였다. 패널 (i): MNA자임 디자인 6은, RPLPO(상부 패널) 또는 D-20(하부 패널) 중 어느 하나에 대한 오로지 하나의 MNA자임 시스템만의 파트자임을 포함한다. 패널 ( ii ): MNA자임 디자인 6은 RPLPO와 D-20 둘 다를 표적화하는 MNA자임에 대한 파트자임을 함유한다.
도 20: 앱타머를 사용하는, 표적의 MNA 자임 검출:
표적의 검출을 위한 하나의 대표적인 기법을 도시하였다. 본 기법에 있어서, 앱타머 서열은 파트자임(앱타-파트자임)의 말단부에 일정한 형태로서 통합되며, 그 결과, 활성 MNA자임은 표적이 존재하는 경우에만 형성된다. 도시된 MNA자임 검출 기법에 필요한 올리고뉴클레오티드 성분으로서는 다음의 것들을 포함한다: (a) 표준 파트자임; (b) 앱타머가 한쪽 말단부에 통합되어 있는 파트자임인 앱타-파트자임; (c) (표적 존재 하에) 활성 MNA자임의 조립을 가능하게 만드는 파트자임과 앱타-파트자임 둘 다와 결합하는 조립 촉진 인자; (d) 리포터 프로브 기질; 및 (e) 파트자임 서열의 기질 결합 팔의 적어도 일부와 앱타머 서열의 적어도 일부에 걸쳐 확장되어 있는 부위에 존재하는 앱타-파트자임에 혼성화하는 조립 억제제. 표적 피분석물이 존재하지 않는 경우(패널 (i)), 상기 조립 억제제는 앱타-파트자임과 결합하여 리포터 프로브 기질의 결합(및 절단)을 차단한다. 표적 피분석물이 존재하는 경우(패널 (ii)), 표적은 앱타-파트자임의 앱타머 서열과 결합하여 조립 억제제와의 결합을 억제하고, 리포터 프로브 기질과 계합하여 이를 절단할 수 있도록 만든다. 그러므로, MNA자임은 표적 존재 하에서만 형광 신호를 형성하여 이를 발생시킬 수 있다.
도 21: 앱타머를 사용하는, 소분자의 MNA 자임 검출:
표적, 구체적으로는 ATP를 검출하는데 MNA자임을 사용하는 것에 관한 일례를 도시하였다. 도 20에 도시한 기법은 소분자인 ATP를 검출하는 것을 예로 들어서 설명하였다. 패널 (i): ATP의 검출에 사용되는 올리고뉴클레오티드 성분의 서열을 나타냄. 이 성분으로서는 파트자임, 앱타파트자임(ATP 결합용 앱타머가 통합됨), 앱타머/MNA자임 조립 억제제, 리포터 기질 및 조립 촉진 인자를 포함한다. 패널 (ii): SubBi-1-FB 절단 분석 결과를 나타낸 것으로서, ATP와 기타 뉴클레오티드의 존재 또는 부재 하에서 올리고뉴클레오티드 성분을 항온 처리한 이후에 얻어진 결과이다. ATP와 dATP가 존재할 때에는 시간이 경과 함에 따라서 형광도가 증가하였으나, GTP 또는 CTP가 존재할 때에는 그렇지 않았다. 뿐만 아니라, 어떠한 표적도 존재하지 않을 경우(물 만을 함유하는 대조군)에는 형광도가 증가하지 않았다.
도 22: MNA 자임을 사용하는, 단일 염기 미스 매치 검출
단일 염기 미스 매치의 검출을 위하여 MNA자임을 사용하는 것에 관한 일례를 도시하였다. 패널 (i): RPLPO 엑손 5 표적 서열 내 단일 염기의 미스 매치를 검출하기 위하여 사용된 올리고뉴클레오티드 성분의 서열을 도시함. 도시된 올리고뉴클레오티드는 2개의 파트자임을 포함하였는데(A5 및 B6), 이들 파트자임은 MNA자임 디자인 7(예를 들어, 실시예 20) 및 리포터 기질을 주성분으로 한다. 파트자임 B 센서 팔에 존재하는 세 번째 염기(X)는 표적 서열과 매치되거나 미스 매치된다. X가 G일 때, 파트자임 및 표적은 완전히 매치된다. X가 C일때, 센서 팔과 표적 RPLPO 사이에는 미스 매치가 발생한다. 패널 ( ii ): RPLPO 표적과 관련하여 완전히 매치되거나 또는 미스 매치되는 파트자임 B를 함유하는 반응물 중에서 PCR 증폭 및 실시간 검출을 한 이후에 얻어진 결과.
도 23: SNP 검출을 위한 MNA 자임 기법 및 검출 결과:
본 방법은 SNP의 한 형태와 완전히 매치되는 절단형 파트자임 B 센서 팔과, 완전히 매치된 표적 존재 하에 MNA자임 조립을 촉진하는 안정화 올리고뉴클레오티드(stabilizer oligonucleotide)를 사용한다. 파트자임 B 센서 팔과 표적 핵산이 엄격하게 상보적이라는 조건으로 말미암아, 밀접하게 관련된 서열들을 구별할 수 있게 된다. 패널 (i): 완전히 매치된 5-염기 센서 팔 및 안정화 올리고뉴클레오티드; 패널 ( ii ): 미스 매치된 5-염기 센서 팔 및 안정화 올리고뉴클레오티드; 패널 (iii): 안정화 대조군 부재시; 패널 ( iv ): 표적 대조군 부재시; 패널 (v): 완전히 매치된 표적, 미스 매치된 표적을 사용하고, 안정화 대조군과 표적 대조군이 존재하지 않을 경우의 MNA자임 SNP 검출 결과.
도 24: 색 변화 반응을 발생시키는 MNA 자임 검출법의 적용:
본 방법은 가교 올리고뉴클레오티드(bridging oligonucleotide)에 의해 결합할 때 청색 응집체를 형성하며, 올리고뉴클레오티드가 부착된 나노 입자 규모의 금 입자를 사용한다(패널 i). 가교 올리고뉴클레오티드는 기질 서열을 통합한다. 표적 존재 하에(패널 ii), MNA자임은 조립하여 기질 서열을 절단하고, 그 결과, 각각의 금 입자를 방출시키며, 이로써 육안으로 관찰할 수 있는 색상 변화(즉, 청색 → 적색)가 발생한다.
도 25: 고정된 파트자임을 사용하는 MNA 자임 케스케이드의 예:
MNA자임은 본 도해에 나타낸 바와 같이, 신호 증폭 케스케이드를 개시하는데 사용될 수 있다. 이 반응에는 다음의 성분들이 관여한다: (i) 용액 중에서 유리된 상태로 존재하는, MNA자임1에 대한 파트자임; (ii)용액 중에서 유리된 상태로 존재하거나(도시된 바와 같음) 또는 기질 Sub1에 의해 불용성 지지체에 고정되어 존재하는, MNA자임 2 및 3에 대한 조립 촉진 인자(동일한 센서 팔 보유); (iii) 기질 Sub1에 의해 불용성 지지체에 고정되어 있는, MNA자임 2에 대한 파트자임[Sub1은 MNA자임 1(표적이 존재하는 경우) 또는 MNA자임 3(조립 촉진 인자가 존재하는 경우)에 의해 절단될 수 있으며, 절단 결과, MNA자임 2에 대한 파트자임이 용액 중으로 방출됨]; (iv) 기질 Sub2에 의해 불용성 지지체에 고정되어 있는, MNA자임 3에 대한 파트자임[Sub2는 MNA자임 2(조립 촉진 인자가 존재하는 경우)에 의해 절단되며, 절단 결과, MNA자임 3에 대한 파트자임이 용액 중으로 방출됨]; (v) Sub2와 동일한 서열을 가지되, 용액 중에서는 유리된 상태로 존재하고, 또한 형광단(F)과 켄처(Q)로 이중 표지되는 Sub2-FQ[Sub2-FQ는 MNA자임 2에 의해 절단되어, 형광 신호를 발생할 수 있음]. 표적이 존재하는 경우, 용액 중에 유리된 상태로 존재하던 파트자임으로부터 활성 MNA자임 1이 형성된다. MNA자임 1은 이것의 Sub1을 절단하므로, MNA자임 2에 대한 파트자임을 방출시킨다. 일단 유리되면, 이들 파트자임은 조립 촉진 인자와 혼성화되어 MNA자임 2를 형성하고, 이 MNA자임 2는 유리 Sub2-FQ를 절단하거나(그 결과, 형광 신호 발생), 또는 고정되어 있던 Sub2를 절단한다(그 결과, MNA자임 3에 대한 파트자임이 방출됨). MNA자임 3는 MNA자임 1의 기질 팔과 동일한 기질 팔을 가지므로, 이 MNA자임 3는 또한 부착된 Sub1을 절단할 수 있으며, 그 결과, MNA자임 2에 대한 파트자임을 더욱 많이 방출하게 된다. 이로써, 더욱 많은 효소(MNA자임)에 대한 성분(파트자임)의 효소 생산 케스케이드와 이에 동반되는 신호 증폭 케스케이드가 진행된다.
정의
본원에서는 다음과 같이 제시된 의미를 갖는 용어들이 사용된다.
"~를 포함하는"이란 용어는, "주로 ~를 포함하되, 반드시 ~만을 포함하는 것은 아닌" 경우를 의미하는 것이다. 더욱이, "~를 포함하는"의 변형어 예를 들어, "포함하다" 및 "포함한다"는 그에 상응하는 다양한 의미를 갖는다.
"폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 호환하여 사용될 수 있는 것으로서, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 사슬 중합체 또는 이중 사슬 중합체, 또는 이의 유사체, 유도체, 변이체, 단편 또는 이의 조합 예를 들어, DNA, 메틸화된 DNA, 알킬화된 DNA, RNA, 메틸화된 RNA, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 프리- 및 프라이-마이크로 RNA, 기타 비암호화 RNA, 리보좀 RNA, 이들의 유도체, 이들의 앰플리콘 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것이다. 비 제한적인 예를 들면, 핵산의 공급원은 합성물, 포유동물, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
"올리고뉴클레오티드" 및 "프라이머"란 용어는 통상적으로, DNA나 DNA-함유 핵산 분자, 또는 RNA나 RNA-함유 분자의 분절, 또는 이들의 조합을 의미하는 것이다. 올리고뉴클레오티드의 예로서는 핵산 표적; 기질 예를 들어, MNA자임에 의해 변형될 수 있는 기질; 프라이머 예를 들어, PCR과 같은 방법에 의해 시험관 내 표적 증폭에 사용되는 프라이머; 그리고 MNA자임의 성분을 포함한다. 임의의 구체예에서, MNA자임 조립 촉진 인자는 본원에 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 파트자임은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
"폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 달리 언급되지 않는 한, 임의의 특정 서열과 이에 상보성인 서열에 대한 참고 기준을 포함하는 의미이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 4-아세틸시티딘, 5-(카복시하이드록실메틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디하이드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실큐에오신, 2'-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우리딘, 큐에오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 와이부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘, 베타 D-아라비노실 티미딘을 포함하는 군중 하나 이상의 추가 또는 치환을 포함할 수 있다.
"촉매 핵산 분자", "촉매 핵산", "핵산 효소" 및 "촉매 핵산 서열"이란 용어는 본원에서 호환되어 사용되었으며, 이는 기질을 인식하고 이 기질의 변형을 촉진할 수 있는, DNA 분자나 DNA-함유 분자(당 업계에서는 "DNA 효소", "데옥시리보자임" 또는 "DNA자임"이라고도 함), 또는 RNA나 RNA-함유 분자(당 업계에서는 "RNA 효소" 또는 "리보자임"이라고도 함), 또는 이들의 조합(DNA-RNA 하이브리드 분자)를 의미하는 것이다. 촉매 핵산 내에 존재하는 뉴클레오티드 잔기들은 A, C, G, T 및 U와, 이의 유도체 및 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 뉴클레오티드에 관하여 사용될 때 "유도체"라는 용어에는, 임의의 기능상-동등한 핵산 또는 뉴클레오티드 예를 들어, (예를 들어, 재조합 방법에 의해) 완전히 갖추어져 생산되거나, (예를 들어, 화학적 수단에 의해) 합성 후 부가되는 임의의 융합 분자가 포함된다. 이러한 융합체로서는, RNA 또는 DNA가 부가되었거나, 또는 폴리펩티드(예를 들어, 퓨로마이신 또는 기타 폴리펩티드), 소분자(예를 들어, 소랄렌) 또는 항체가 컨쥬게이트화된, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
핵산이나 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때 "유사체"란 용어에는, DNA 또는 RNA 분자 또는 잔기와 관련된 물리적 구조를 가지는 화합물을 포함하며, 또한 이는 DNA 또는 RNA 잔기 또는 이의 유사체와 수소 결합을 형성할 수 있으나(즉, DNA나 RNA 잔기 또는 이의 유사체와 어닐링되어 염기쌍을 형성할 수 있으나), 이러한 결합은 상기 "유사체"라는 용어에 포함될 상기 화합물에 반드시 필요한 것은 아니다. 이러한 유사체는 이것과 구조적으로 관련되어 있는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기와 상이한 화학적 특성 및 생물학적 특성을 가질 수 있다. 이 유사체의 예로서는 메틸화, 요드화, 브롬화 또는 비이오틴화된 잔기가 있다. 뉴클레오티드 유사체 예를 들어, 데옥시이노신, C-5-이미다졸 데옥시우리딘, 3-(아미노프로피닐)-7-디아자-dATP, 2'-O-메틸 RNA, 2'-O-메틸 캡을 함유하는 활성 DNA자임에 관하여는 문헌[Warashina외 다수, 1999; Cairns외 다수, 2003; Schubert외 다수, 2004; Sidorov외 다수, 2004]에 기술되어 있다. 기타 유사체도 DNA자임의 촉매 활성을 갖는다. 예를 들어, 하나의 염기를 다른 염기로 치환하거나, 하나의 유사체를 다른 염기로 치환하거나, 또는 당 성분 또는 포스포디에스테르 골격을 변형시킴으로 인한 촉매 핵산 서열의 변형은 당 업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 변형은 합성시 이루어질 수 있거나, 아니면, 합성 후 특정 염기를 변형시킴으로써 이루어질 수 있다. 변형 예를 들어, 염기 변이를 도입하거나 또는 염기 유사체를 통합시킨 촉매 핵산을 실험에 의해 테스트함으로써, 변형된 서열 또는 특정 유사체가 촉매 활성에 미치는 영향력을 평가할 수 있다. 염기 A, C, G, T 및 U의 유사체에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 이의 하위 군을 이하 표 2a∼표 2b에 나열하였다.
본원에 유용한 뉴클레오티드 유사체의 예
약어 명칭
ac4c 4-아세틸시티딘
chm5u 5-(카복시하이드록실메틸)우리딘
Cm 2'-O-메틸시티딘
Cmnm5s2u 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘
D 디하이드로우리딘
Fm 2'-O-메틸슈도우리딘
Galq 베타, D-갈락토실큐에오신
Gm 2'-O-메틸구아노신
l 이노신
i6a N6-이소펜테닐아데노신
m1a 1-메틸아데노신
m1f 1-메틸슈도우리딘
m1g 1-메틸구아노신
M11 1-메틸이노신
m22g 2,2-디메틸구아노신
m2a 2-메틸아데노신
약어 명칭
m2g 2-메틸구아노신
m3c 3-메틸시티딘
m5c 5-메틸시티딘
m6a N6-메틸아데노신
m7g 7-메틸구아노신
mam5u 5-메틸아미노메틸우리딘
mam5s2u 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘
Manq 베타, D-만노실메틸우리딘
mcm5s2u 5-메톡시카보닐메틸우리딘
Mo5u 5-메톡시우리딘
Ms2i6a 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신
Ms2t6a N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌
Mt6a N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌
Mv 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르
o5u 우리딘-5-옥시아세트산 (v)
Osyw 와이부톡소신
P 슈도우리딘
Q 큐에오신
s2c 2-티오시티딘
s2t 5-메틸-2-티오우리딘
s2u 2-티오우리딘
s4u 4-티오우리딘
T 5-메틸우리딘
t6a N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌
Tm 2'-O-메틸-5-메틸우리딘
Um 2'-O-메틸우리딘
Yw 와이부토신
X 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, (acp3)u
AraU 베타 D-아리비노실우리딘
AraT 베타 D-아라비노실티미딘
핵산과 관련하여 사용될 때 "단편"이란 용어는, 핵산의 구성 성분을 의미하는 것이다. 통상적으로, 상기 단편은 핵산과 성질상 공통적인 생물 활성을 가지나, 반드시 그러한 것은 아니다. 핵산 단편은 생물 활성을 보유하는 폴리펩티드를 반드시 암호화할 필요는 없다. 오히려, 핵산 단편은 예를 들어, 혼성화 프로브 또는 PCR 올리고뉴클레오티드와 같이 유용할 수 있다. 단편은 본 발명의 핵산으로부터 유래할 수 있거나, 또는 기타 수단 예를 들어, 화학 합성법에 의해 합성될 수 있다.
본원에 사용된 "변이(체)"란 용어는, 실질적으로 유사한 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미하는 것이다. 일반적으로, 서열 변이체는 성질상 공통적인 생물 활성을 가진다. 뿐만 아니라, 이러한 서열 변이체는 서열 동일성이 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있다. 상기 "변이(체)"란 용어에는 통상적으로 상이한 종으로부터 유래하되, 본원에 개시된 상응하는 폴리펩티드 또는 핵산과 실질적으로 동일한 생물 기능 또는 생물 활성을 공유하는 폴리펩티드 또는 핵산인 상동체도 포함된다.
본원에 사용된 "고도의 엄중도"란 용어는, 2개의 핵산이 혼성화될 수 있는 조건을 의미하는 것으로서, 예를 들어, 용액 중 염 및/또는 세제의 농도, 2개의 핵산이 혼성화될 때 사용되는 용액의 온도, 그리고 혼성화 시간을 포함할 수 있다. 그러므로, 본원에 사용된 "고도의 엄중도"라는 용어는, 이와 같이 핵산의 상보성이 높은 수준인 경우에만 2개의 핵산이 혼성화되는, 용액 중의 조건을 의미하는 것이다. 상보성 수준으로서는 예를 들어, 약 50∼99%를 포함한다. 그러므로, "고도의 엄중도" 조건으로서는, 예를 들어, 광범위한 온도를 적용시키고, 세제, 염 및 2가 양이온을 다양한 농도로 포함하는 완충액을 사용하는 경우를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "조립 촉진 분자", "조립 촉진 인자", "MNA자임 조립 촉진 분자", "촉진 인자" 및 "MNA자임 조립 촉진 인자"라는 용어는, 구성 파트자임이 자체 조립되는 것을 촉진하여 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있는 물질을 의미하는 것이다. 바람직한 구체예에서, 조립 촉진 인자는 MNA자임의 자체 조립에 필요하다. 몇몇 구체예에서, 조립 촉진 인자는 표적 예를 들어, 핵산 또는 비-핵산 피분석물을 포함한다. 조립 촉진 분자는 "MNA자임"의 성분 또는 이의 일부를 구성하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 "파트자임"과 쌍을 이룰 수 있거나 이것과 결합할 수 있는, 하나 이상의 부위 또는 분자를 포함할 수 있다. 조립 촉진 인자는 각각의 구성 파트자임 또는 올리고뉴클레오티드와 상호 작용하거나, 쌍을 이루거나 또는 결합할 필요는 없지만, MNA자임을 구성하는 파트자임 중 하나 이상과 상호 작용하거나, 이것과 쌍을 이루거나 또는 결합한다. 본원에 사용된 MNA자임 조립 촉진 분자는 MNA자임의 자체 조립을 촉진할 수 있는 광범위한 구성 성분을 포함하는 의미이다. 몇몇 구체예에서, 조립 촉진 인자는 핵산을 포함할 수 있다. 기타 구체예에서, 조립 촉진 인자는 임의의 세포 또는 이것의 임의의 일부 예를 들어, 임의의 진핵 생물 또는 원핵 생물 세포, 바이러스, 프리온, 효모 또는 진균, 또는 기타 임의의 분자 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 조립 촉진 인자는 바이러스, 프리온, 효모 또는 진균이나, 기타 임의의 분자 예를 들어, 당단백질, 지질, 지단백질, 전체 유기체, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이의 임의의 유도체, 일부 또는 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "표적"이라는 용어에는, 특정 MNA자임에 의해 검출, 동정 또는 정량하고자 하는 임의의 천연 물질 또는 합성 물질, 구성 성분 또는 피분석물을 포함한다. 그러므로, 표적으로서는 정밀한 검출, 동정 및/또는 정량이 필요한 경우, 광범위한 검출 가능 물질, 구성 성분 또는 피분석물을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 표적은 조립 촉진 인자를 포함한다. 몇몇 대표적인 표적으로서는 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 전체 유기체, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 효모, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이것들의 임의의 유도체, 일부분 또는 조합을 포함한다. 기타 표적도 본원에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "기질", "기질 분자" 및 "화학 기질"이라는 용어에는, 촉매 분자에 의해 인식될 수 있으며, 이 촉매 분자와 작용할 수 있거나, 또는 이 촉매 분자에 의해 화학적으로 변형될 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 기질은 효소에 의해 인식 및 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 기질은 촉매 핵산 분자에 의해 인식 및 변형될 수 있다. 기질의 화학적 변형 여부는 변형 반응 생성물의 생성 여부, 증가, 또는 변형 반응 기질의 소멸 여부 또는 감소를 통해서 측정될 수 있다. 특정 촉매 분자는 하나 이상의 상이한 기질 분자를 인식할 수 있지만, 단, 각각의 기질 분자는 촉매 분자에 의한 촉매 활성을 인식할 수 있는 적어도 최소 구조를 가진다.
본원에 사용된 "리포터 기질", "리포터 프로브" 또는 "리포터 프로브 기질"이란, 촉진된 반응과 관련된 생성물의 생성 또는 기질의 소멸 중 어느 하나의 측정을 용이하게 하도록 특별히 채택되는 기질을 의미한다. 리포터 기질은 용액 중에 유리된 상태로 존재할 수 있거나, 아니면 예를 들어, 표면이나 다른 분자에 결합(또는 "고정")되어 존재할 수 있다. 리포터 기질은 다양한 수단 예를 들어, (하나 이상의 추가 성분 예를 들어, 켄처를 포함하거나 포함하지 않는) 형광단, 방사성 표지, 바이오틴에 의한 표지(예를 들어, 바이오틴화) 또는 화학 발광 표지 중 임의의 수단에 의해 표지될 수 있다. 촉매 핵산에 대한 리포터 기질로서는 예를 들어, 이것들의 말단부에 공유 결합된 단백질이나 핵산 효소도 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "일반적인" 또는 "보편적인" 기질로서는 예를 들어, 각각이 상이한 표적을 인식할 수 있는 다수의 MNA자임에 의해 인식되며, 이것에 의해 촉매 활성화되는 리포터 기질과 같은 기질이 있다. 이러한 기질을 사용하면, 전부가 보편적 기질을 인식하는, 구조적으로 관련된 MNA자임들을 사용하여, 다양한 표적을 검출, 동정 또는 정량하기 위한 개별 검정법의 진행이 촉진된다. 이와 같은 보편적 기질은 각각 독립적으로 하나 이상의 표지로 표지될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 독립적으로 검출 가능한 표지는 하나 이상의 일반적 기질을 표지하여 편리한 시스템을 형성하는데 사용되며, 그 결과, MNA자임을 사용하여 다수의 표적들을 독립적으로 또는 동시에 검출할 수 있게 된다.
본원에 사용된 "파트자임", "구성 파트자임" 및 "구성 올리고뉴클레오티드"란 용어는, MNA자임 조립 촉진 분자가 존재하는 경우에만 2개 이상이 함께 모여 "MNA자임"을 형성할 수 있는, DNA-함유 올리고뉴클레오티드 또는 RNA-함유 올리고뉴클레오티드, 또는 DNA-RNA-함유 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 임의의 바람직한 구체예에서, 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 구성 파트자임은 다음과 같은 3개의 부위 또는 도메인을 포함할 수 있다: "촉매" 도메인(화학 변형을 촉진하는 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 도메인); "센서 팔" 도메인(조립 촉진 인자(예를 들어, 표적)과 회합 및/또는 결합할 수 있는 도메인); 및 "기질 팔" 도메인(기질과 회합 및/또는 결합할 수 있는 도메인). 이와 같은 부위 또는 도메인에 관하여는 예를 들어, 도 1에서 살펴볼 수 있다. 파트자임은 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 파트자임은 하나 이상의 추가 성분 예를 들어, 앱타머를 포함할 수 있다(본원에서는 이를 "앱타-파트자임"이라 칭함). 파트자임은 또한 예를 들어, 도 25에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 기질을 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 "MNA자임"이란 용어는, MNA자임 조립 촉진 분자(예를 들어, 표적)가 존재할 경우에만 기질을 촉매에 의해 변형시킬 수 있는 활성 핵산 효소를 형성하는, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 서열(예를 들어, 파트자임)을 의미하는 것이다. 파트자임 A와 파트자임 B를 포함하는 대표적인 MNA자임을 도 1에 도시하였다. 도 1을 참고하였을 때, DNA 파트자임 A 및 B는 각각 표적에 결합한다(예를 들어, 핵산 표적과의 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의함). MNA자임은 파트자임 A 및 B의 센서 팔이 표적 상에 각각 인접하여 혼성화될 때에만 형성된다. 파트자임 A 및 B의 촉매 도메인의 상호 작용에 의해 형성된 MNA자임의 촉매 중심에 의해 촉진되는 절단 생성물인 MNA자임의 기질 팔은 리포터 기질과 계합한다. 상기 MNA자임은 형광단과 켄처 염료 쌍 사이에 있는 기질을 절단하여 신호를 발생시킨다. DNA/RNA 키메라(리포터 기질)의 절단 과정에 대하여는 도면에 도시되어 있다. "다성분 핵산 효소" 및 "MNA자임"이란 용어는, 본원에서 호환되어 사용되는 것으로서, 2개의 분자로 이루어진 이원성 구조물, 또는 3개의 핵산 분자로 이루어진 3 원성 구조물, 또는 예를 들어, 4개 이상의 핵산 분자에 의해 형성된 다원성 구조물을 포함한다. MNA자임은 또한 조립 촉진 인자 또는 기질과 상호 작용함으로써 MNA자임의 안정성을 제공하는 안정화 올리고뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. MNA자임의 형성시에는 촉매 활성이 검출될 수 있도록, 적어도 파트자임 성분과 조립 촉진 인자를 조립하는 단계와, 기질이 결합하는 단계가 필요하며, 이와 같은 성분들 중 임의의 성분이 존재하지 않으면 촉매 활성도 가질 수 없다는 것은 명백한 사실이다.
본원에 사용된 "앱타머"는, 하나 이상의 리간드를 인식하는 능력을 가지는 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인식 과정에는 앱타머의 고 차원적 구조 예를 들어, 3-차원 결합 도메인 또는 포켓과 같은 구조로 인하여, 높은 수준의 특이성이 필요할 수 있다. 그러므로, 앱타머는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이것들의 임의의 유도체, 일부분 또는 조합, 또는 기타 임의의 물질과 결합할 수 있다. 본원에 있어서 바람직한 앱타머는 흡착, 회수 및 재증폭으로 이루어진 반복적 과정에 의해 합성 핵산의 복합 라이브러리로부터 분리될 수 있는, 짧은 단일 사슬 DNA 또는 RNA 올리고머를 포함할 수 있다. 그러므로, 앱타머는 거의 모든 임의의 표적 예를 들어, 소분자 예를 들어, 아미노산, 또는 항생제로부터 단백질 및 핵산 구조물에 이르기까지의 것에 대해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 "케스케이드"란 용어는, 연속 단계로 진행되는 임의의 연속 과정 또는 작동들을 의미하는 것으로서, 각 단계는 통상적으로 선행 단계의 진행 여부에 의존하여 진행된다. 그러므로, 케스케이드는 효소에 의한 케스케이드 또는 임의의 기타 신호 전달 케스케이드를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 케스케이드는 MNA자임의 촉매 활성으로 인한 신호의 증폭 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 증폭 케스케이드는 신호의 반복적이고도 주기적인 증폭 단계를 포함할 수 있는데, 여기서, 제1 MNA자임의 촉매 활성으로 말미암아 제2 MNA자임의 촉매 활성에 필요한 분자를 얻을 수 있게 되고, 또한 제1 MNA자임의 촉매 활성에 필요한 분자도 얻을 수 있게 되는 것이다. 몇몇 구체예에서, 상기 필요한 분자로서는 파트자임, 효소, 조립 촉진 인자, 기질, 표적, 이것들의 일부 또는 단편 또는 조합을 포함할 수 있다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 케스케이트는 축적된 효과를 나타낼 수 있으므로, 신호를 검출 가능한 수준으로 발생시켜 소량으로 존재하던 표적을 검출할 수 있게 된다. 기타 구체예에서, 2개 이상의 촉매화 단계가 사용될 수 있다. 케스케이드는 직렬적일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 케스케이드는 지수적일 수 있다.
본원에 사용된 "억제제" 또는 "조립 억제제"란 용어에는, 예를 들어, 본원에 정의된 MNA자임의 하나 이상의 성분과 상호 작용하거나, 기질이나 조립 촉진 인자와 상호 작용하여, MNA자임의 조립을 억제하는, 임의의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산, RNA, DNA, 핵산 유사체, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이것들의 임의의 유도체, 일부 또는 조합, 또는 기타 임의의 물질 또는 분자가 포함된다. "억제제" 또는 "조립 억제제"는 MNA자임과 물리적으로 인접하여 존재할 필요는 없으나, 예를 들어, MNA자임의 구성 부분, 기질 또는 조립 촉진 인자와 경쟁적으로 결합할 수 있어서, 이러한 구성 부분이 MNA자임 조립에 사용될 수 없도록 만들 수 있다. 이러한 결합에는 예를 들어, MNA자임의 구성 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 상보성인 억제 핵산이 관여할 수 있다.
본원의 명세서 전반을 통해 다음과 같은 약어가 사용되고 있다:
MNAzyme : 다성분 핵산 효소 또는 다원성 핵산 효소;
DNAzyme : 데옥시리보핵산 효소;
RNAzyme : 리보핵산 효소 또는 리보자임;
PCR : 중합 효소 연쇄 반응;
SDA: 가닥 치환 증폭;
LAMP : 루프 매개형 등온 증폭;
RCA : 회전 환 증폭;
TMA : 전사 매개 증폭;
3 SR : 자기 부양 서열 복제;
NASBA : 핵산 서열 기반 증폭;
dH 2 O : 탈이온 증류수;
LNA : 잠금 핵산;
PNA : 펩티드 핵산;
bDNA : 분지형 DNA 검정법;
FCS : 형광도 상관 분광 분석법;
TSA : 티라미드 신호 증폭법;
An: 피분석물 또는 표적;
F: 형광단;
Q: 켄처;
miR : 마이크로RNA;
N = A, C, T, G, 또는 이의 임의의 유사체;
N' = N에 상보성이거나 N과 쌍을 이룰 수 있는 임의의 뉴클레오티드;
(N) x : 임의의 갯 수의 N;
( N' ) x : 임의의 갯 수의 N';
W: A 또는 T;
K: A, G, 또는 AA;
rN : 임의의 리보뉴클레오티드 염기;
( rN ) x : 임의의 갯 수의 rN;
rR : A 또는 G;
rY : C 또는 U;
M: A 또는 C;
H: A, C, 또는 T;
D: G, A, 또는 T;
JOE 또는 6- JOE : 6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인;
FAM 또는 6- FAM : 6-카복시플루오레세인;
BHQ1 : 블랙홀 켄처 1;
BHQ2 : 블랙홀 켄처 2;
M- MLV RT (H-): 몰로니 쥣과 동물 백혈병 바이러스 역전사 효소, RNase H 마이너스;
shRNA : 짧은 헤어핀 RNA
siRNA : 짧은 간섭 RNA
mRNA : 메신저 RNA
tRNA : 운반 RNA
snoRNA : 소형 인 RNA
stRNA : 소형 일시 RNA
smRNA : 소형 조정 RNA
pre - microRNA : 전구체 마이크로 RNA
pri - microRNA : 1차 마이크로 RNA
예시적 구체예에 대한 상세한 설명
본원에 제공된 도면과 실시예들은 본 발명과 다양한 변형예를 예시하기 위한 것이지 이것들을 한정하기 위한 것은 아니라는 사실을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 따르면, 조성물, 방법 및 키트는 표적을 검출, 동정 및/또는 정량하기 위해 제공된다. 본 발명의 방법은 일반적으로 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어 활성 핵산 효소를 형성하는 다수의 핵산 성분에 의해 바람직하게 형성되는, 다성분 또는 다원성 핵산 효소를 포함하는 조성물을 사용하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 조립 촉진 인자는 표적이므로, 상기 다성분 핵산 효소는 상기 표적이 존재하는 경우에만 형성된다.
1. 조성물- MNA 자임
다성분 핵산 효소(Multi-component Nucleic Acid enzyme)(본원에서는 다원성 핵산 효소(multipartite nucleic acid enzyme) 또는 "MNA자임"이라고도 칭함)는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분들(본원에서는 파트자임이라고도 칭함)로부터 자체 조립될 수 있다. 상기 파트자임 올리고뉴클레오티드는 MNA자임 자체 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어 MNA자임을 형성한다. 그러므로, MNA자임은 촉매 활성 핵산 효소이다. 몇몇 구체예에서, MNA자임의 존재 여부를 확인할 수 있는데, 이 MNA자임은 조립 촉진 인자를 포함하는 표적이 존재할 때에만 형성되므로, 이 MNA자임이 존재한다는 것은 곧, 표적이 존재한다는 지표가 된다. 전술한 기본 원리들을 바탕으로 하는 다양한 검정법이 본원에 제공되어 있다. MNA자임을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 다양한 서열로 이루어진 MNA자임을 포함하는 조성물도 본원에 제공되어 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 성분들, 조립 촉진 인자 또는 기질 중 하나 이상은 또한 표적과 결합할 수 있는 앱타머를 포함/함유할 수도 있다.
바람직한 구체예에서, MNA자임 구조물은 하나 이상의 DNA자임 및/또는 리보자임을 주성분으로 한다. 더욱 바람직하게, 상기 MNA자임 구조물들은 특정 DNA자임 구조를 바탕으로 한다. 본 발명의 바람직한 구조물은 DNA자임 예를 들어, 10:23 DNA자임 및 8:17 DNA자임을 주성분으로 한다. 다양한 구체예에서, MNA자임은 리보뉴클레오티드 염기 및 데옥시리보뉴클레오티드 염기 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, MNA자임 구조물은 최소한 부분적으로나마 DNA자임의 구조를 바탕으로 한다. 기타 바람직한 구체예에서, MNA자임은 최소한 몇몇 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, MNA자임의 촉매 중심은 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체를 포함한다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체는 기질의 촉매화에 관여한다. 기타 구체예에서, 촉매 중심 부분에 있는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체는 촉매 활성을 개선한다. 또 다른 구체예에서, MNA자임의 촉매 중심에 있는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체의 촉매화가 측정 가능한 속도로 진행되는데 필요한 조건은, 데옥시리보뉴클레오티드 염기가 존재하지 않는 상당하는 MNA자임의 경우에 비하여, 매우 엄격하다.
본원에 제공된 바와 같이, MNA자임은 당 업자에게 널리 공지되어 있는, 하나 이상의 치환(체) 예를 들어, 유사체, 유도체, 변형 또는 변이된 염기, 리보뉴클레오티드, 당이나 인산 골격의 변이, 다양한 결실, 삽입, 치환, 중복 또는 기타 변형, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 변형, 치환, 결실 또는 삽입 등은 본원에 기술된 바와 같이, 센서 및/또는 기질 팔 및/또는 촉매 중심 부분에서 일어날 수 있으므로, 분자는 촉매 활성을 보유한다. 기질이나 조립 촉진 인자에 결합하는 팔에 대한 치환 및 변형은 널리 관용될 수 있으며, 실제로는, 분자를 상이한 기질/조립 촉진 인자로 조작할 수 있는 기초가 된다. 예를 들어, 센서 팔이 변형되면 상이한 조립 촉진 인자로 조작될 수 있는 반면에, 기질 팔이 변형되면 상이한 기질로 조작될 수 있을 것이다.
그러므로, 임의의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하거나 또는 임의의 변형/치환 등의 방법에 의해 데옥시리보뉴클레오티드로부터 유도되는, 촉매 활성을 가지는 MNA자임에 관한 것이다. 일반적으로, 전체 분자를 예를 들어, 리보뉴클레오티드로 치환하면 이 분자는 불활성화되는데, 그 이유는 분자의 활성이 어떤 중요한 데옥시리보뉴클레오티드에 미치는 활성에 의존적이기 때문이다. 이와 유사하게, 리보자임 내에 존재하는 몇몇 리보뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드로 치환될 수 있지만, 전체 분자를 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드로 치환하면 이 분자도 불활성화될 것이다.
당 업자는 MNA자임이 데옥시리보뉴클레오티드나 리보뉴클레오티드, 또는 둘 다를 포함한다는 사실을 알 것이다. 데옥시리보뉴클레오티드 구성 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상, 더욱 바람직하게는 전부를 포함하는 MNA자임이 바람직하다. MNA자임의 촉매 중심 내에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 이의 유사체를 포함하는 MNA자임도 바람직하다. 이러한 염기가 촉매 활성에 필수적인 경우가 더욱 바람직하다.
당 업자는 또한 다원성 DNA자임은 다원성 리보자임에 비하여, 예를 들어, 안정성과 사용의 용이함에 있어서 이점을 갖는다는 사실을 알 것이다. 그러므로, 본원에 제공된, 다성분 MNA자임은 다성분 리보자임에 대한 바람직한 대안으로서 제공될 수 있는데, 여기서, 상기 다성분 MNA자임은 또한 다양한 구체예에 따라서 제공되는 것이다. 임의의 구체예에서는, 오로지 하나의 기질만을 인식할 수 있는 단일 분자 핵산 효소 예를 들어, DNA자임에 비하여, MNA자임이 이점을 제공하는 반면에, 단일 MNA자임은 2개의 분자들 즉, 조립 촉진 인자(예를 들어, 표적)와 기질을 인식할 수 있다는 사실도 알 수 있다. 예를 들어, MNA자임의 이러한 특성들로 말미암아, 이 효소가 표적 검출법 예를 들어, 실험실 내, 생체 내 또는 시험관 내 검출법에 사용될 수 있게 된다.
2. MNA 자임을 사용하는 표적의 검출, 동정 또는 정량 방법
본 발명은 하나 이상의 표적을 검출, 동정 또는 정량하는데 하나 이상의 MNA자임을 사용하는 다양한 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 조립 촉진 인자를 함유하는 시료와 접촉할 때에만 자체 조립되는데, 이때 촉매 활성 MNA자임이 자체 조립된다는 사실은 곧, 조립 촉진 인자 즉, 표적이 존재한다는 것을 나타내는 지표가 된다. 예를 들어, 앱타머를 포함하는 다른 구체예에서, 조립 촉진 인자는 표적일 수 없으므로, MNA자임의 자체 조립에 필요한 요소만을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예 중 일부는 도면을 통해 더욱 잘 이해될 수 있다. 그러므로, 도면을 참고로 하고, 본원의 조성물과 방법에 의하면, 본 발명에서는 일반적으로, 단백질 효소 예를 들어, 중합 효소를 사용할 필요 없이, 핵산 효소(예를 들어, 도 1, 3, 4, 7∼13, 20, 21, 24 및 25)만을 사용하여 하나 이상의 표적을 검출할 수 있는, MNA자임계 방법이 제공된다. MNA자임과 함께 단백질 효소를 사용하는 것도 본원에 포함되지만, 본원의 임의의 구체예에서는, 단백질 효소를 포함시키는 것도 가능하며(심지어는 바람직하기까지 하며), 단백질 효소를 필요로 하지 않는 방법에 대한 반응 조건은 일반적으로 예를 들어, MNA자임 절단의 효율에 대해 덜 제한적이며, 더욱 용이하게 최적화된다. 일반적으로, 단백질 효소가 필요 없다면 시약 비용도 줄일 수 있다.
본원에 추가로 제공되는 바와 같이, 표적 검출에 MNA자임을 사용하는 몇몇 방법에서는 열 사이클 및/또는 표적의 변성 과정을 수행할 필요가 없다. 등온 방법은 열 사이클 과정을 필요로 하는 방법보다 더욱 융통성이 있을 뿐만 아니라, 단일 사슬 핵산 및 이중 사슬 핵산을 포함하는 표적들을 구별할 수 있도록 만들 수도 있다. 뿐만 아니라, 열 사이클 과정을 수행할 필요가 없으므로, 이 방법은 보다 용이하게 진행될 수 있으며, 그 비용도 절약할 수 있다. 본원의 방법에 따르면, 시료 중 목적으로 하는 표적(합성물이거나 천연의 것일 수 있음)을 검출하기 위한, 간편하고, 신속하며, 비용면에서 효율적이고, 등온 상태에서 진행되며, 또한 절차에 있어서도 융통성을 발휘할 수 있는 방법이 제공된다.
본원에 제공된 구체예 중 임의의 것에 의하면, MNA자임을 표적-특이적으로 조립함으로써 핵산 표적을 검출하면 예를 들어, 형광 리포터 기질이 MNA자임-매개 절단될 수 있음을 알 수 있다. 뿐만 아니라, MNA자임 분자의 성질로 인하여, 반응은 오로지 MNA자임의 조립과 사용된 기질의 촉매 변형(예를 들어, 절단)의 필요 여부에 따라서, 다양한 온도에서 진행될 수 있다.
MNA자임의 기본 구조를 도 1에 도시하였다. 도 1에 도시된 구조는 MNA자임 조립 촉진 분자(여기서는 간단히 표적으로 나타냄)와 염기쌍을 형성한 파트자임 A와 파트자임 B를 포함한다. 파트자임 A와 파트자임 B는 표적과 상호 작용을 함으로써, 이것들의 촉매 중심 부분이 근접하게 될 수 있다. MNA자임의 기질 팔은 기질(본원에서는 리포터 기질이라고 칭함)과 상호 작용하고 염기쌍을 형성한다. 그러므로, MNA자임은 자체 조립되는데, 이 과정은 MNA자임 조립 촉진 분자 표적이 존재함으로 인하여 촉진된다. 상기 표적이 존재하지 않으면, MNA자임은 형성되지 않을 것이다. 기질의 변형(이 경우에는 절단)은 수직 화살표로 나타낸, 기질 내에 존재하는 MNA자임 절단 위치에서, MNA자임의 촉매 중심에 의해 촉진된다. 본 발명의 이와 같은 특정 구체예에서, 기질은 검출 가능한 신호를 가지는 검출 가능 부분 예를 들어, 형광단 F와, 켄처 Q의 작용을 통해 검출 가능한 신호 F에 켄칭 효과를 나타내는 켄처 부분을 포함한다. MNA자임 절단 위치에서 절단이 일어나면, 용이하게 검출 또는 정량되는 검출 가능 신호(여기에서는 형광도)가 실질적으로 증가한다.
도 1은 또한, MNA자임을 사용하여 표적을 검출하는 기본적인 방법의 일례를 도시하는 것으로 이해할 수도 있는데, 몇몇 구체예에서는 조립 촉진 인자를 포함하기도 한다. 기법 1(도 2 참조)에서는 표적 예를 들어, DNA, RNA 및 단백질의 검출용으로서 적합한 MNA자임을 사용한다. 리포터 기질은 용액 중에 유리된 상태로 존재할 수 있거나(도 1), 아니면 지지체에 결합된 상태로 존재할 수 있다(도 3). 신호는 다양한 수단 예를 들어, 형광단 F와 켄처 Q 염료 쌍이 분리될 때 발생할 수 있다(도 1 및 도 3).
더욱 구체적으로, 파트자임 A와 파트자임 B를 도 1에 나타내었는데, 이 파트자임들은 각각 기질 팔 부분, 촉매 중심 부분, 그리고 센서 팔 부분을 포함한다. 표적 존재 하에, 파트자임 A 및 파트자임 B의 센서 팔 부분들은 표적 예를 들어, DNA 또는 RNA 서열의 상보성 부분에 혼성화되어 이 부분과 염기쌍을 형성하기 시작할 수 있다. 이러한 방식으로 표적과 접촉하면, MNA자임은 자체 조립되어, 기질 팔에 의해 결합된 기질을 변형시킬 수 있는 촉매 중심 부분을 형성한다. 바람직하게, MNA자임의 존재 여부는 그것의 촉매 활성을 검출 또는 측정함으로써 확인된다. 이와 같이 조립된 MNA자임의 기질 팔은, 기질 팔에 존재하는 상보성 서열과 기질의 상호 작용을 통해, 예를 들어, 도 1에 나타낸 리포터 기질과 같은 기질과 계합할 수 있다. 일단, 기질이 기질 팔과 결합하면, 촉매 중심 부분은 기질의 변형(예를 들어, 절단)을 촉진할 수 있으며, 이후 이 기질은 직접적으로 또는 간접적으로 측정 또는 검출될 수 있다.
도면들을 참고로 하였을 때, 도 2는 MNA자임 검정법의 몇몇 적용례를 개략적으로 나타낸 것이다. 기법 1은, 전술한 바와 같은 MNA자임 검정법의 기본적인 원리를 도시한 것이다. 표적과 기질 둘 다에 대한 인식 서열을 가지는 2개의 개별 올리고뉴클레오티드들로 구성된 MNA자임은, 이 올리고뉴클레오티드가 표적을 인식하여 표적과 결합할 때 형성된다. 기질 예를 들어, 리포터 기질은 MNA자임의 촉매 작용에 의해 변형되어, 직접적으로(기법 1), 표적 증폭시 또는 증폭 이후에(기법 2), 또는 신호 케스케이드를 통해(기법 3), 검출 가능 신호를 발생시킨다. 몇몇 구체예에서, 표적과 신호 둘 다는 동시에 증폭된다.
당 업자는, MNA자임이 광범위한 응용 분야에서 사용될 수 있는 조립 촉진 인자의 검출, 동정 또는 정량을 위한 기법에 사용될 수 있음을 알 것이다. 이와 같은 분야로서는 의료 분야, 수의학 분야, 농업 분야, 식품 공업 분야, 영상화 및 생물 테러 분야를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
당 업자는 또한 MNA자임이 용액 중에 존재하는 표적을 검출, 동정 및/또는 정량하는데 사용될 수 있음도 알 것이다. 예를 들어, 단일 기질을 사용하여 단일 표적을 검출, 동정 및/또는 정량하는 단계를 포함하는 기법이 이와 같은 검출에 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이 기법은 일반적 기질을 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 용액 중에 존재하는 다수의 표적들은 또한 일련의 일반적 기질을 변형시키는 다수의 MNA자임을 사용하여 검출될 수 있으며, 각각의 기질을 변형시키면, 명백한 검출 가능 신호 예를 들어, 상이한 형광을 발생시킬 수 있다.
3. 다수의 MNA 자임을 사용하는 방법
당 업자는 본원에 제공된 다양한 검정법이 일반적으로 반응이나 검정법 당 하나의 표적을 검출하거나, 또는 하나의 반응이나 검정법에서 다수의 표적을 검출하는데 사용될 수 있음을 알 것이다. 다수의 표적을 검출할 때, 검정법의 방식과 무엇이 검출될 것인가에 따라서 하나 이상의 MNA자임이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 MNA자임은 다수의 관련 구조물 예를 들어, 중요한 서열(MNA자임에 의해 인식되는 서열)을 공유하되 길이만 상이한 서열 군, 또는 중요 서열의 외부에 존재하는 다양한 서열을 검출하는 경우에 적합할 수 있다. 중요 서열을 가지는 임의의 서열이 검출될 수 있다. 하나의 뉴클레오티드만이 상이한 관련 서열들을 검출하는 경우, 또는 많이 상이한 표적이 검출되는 경우, 다수의 MNA자임이 유용할 것이며, 이때는 이들 각각의 존부를 아는 것이 바람직하다. 이와 유사하게, 몇몇 구체예에서는, 몇몇 표적들을 각각 검출하는데 하나의 기질이 적합할 것인 반면, 다른 구체예에서는 독특한 기질을 필요로 한다. 복합적 방법에 대한 몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 방법을 디자인하는 것을 돕기 위하여 각각의 기질에 대한 전혀 다른 신호 또는 독특한 검출 가능 신호를 사용할 필요가 있다. 각각의 기질에 대한 전혀 다른 신호 또는 독특한 검출 가능 신호는, 기질이 지지체(들)에 고정될 때에는 필요하지 않으며, 또한 지지체(들) 상에서 국소화 됨에 따라서 구별될 수 있다. 이와 같은 디자인의 특징은 당 업자에 의해 용이하게 이해될 것이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법을 통해, 하나의 반응물에 존재하는 상이한 유형의 표적 예를 들어, 핵산 표적 및 단백질을 검출할 수 있다.
4. 표적 증폭법을 이용하는 방법
당 업자는 본원에 기술된 방법에는 MNA자임 촉매 활성을 발생시키기 이전, 발생시키는 동안, 또는 발생시킨 후에, 표적을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다는 사실을 용이하게 알 수 있을 것이다. 이러한 표적 증폭 단계를 통해, 검출, 동정 또는 정량하고자 하는 표적의 양이 소량이어서 검출 가능 신호가 제공될 수 없는 경우, 본 발명의 구체예를 구체적으로 적용할 수 있다. 이러한 증폭법으로서는 다음과 같은 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 회전 환 증폭(RCA), 전사 매개 증폭(TMA), 자기 부양 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 또는 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR).
기법 2(도 2)는 핵산 표적의 시험관 내 증폭시 또는 증폭 후에, 앰플리콘이 축적되었는지 여부를 관찰하는데 적합한 MNA자임을 사용하는 것을 예시하고 있다. 핵산 서열의 시험관 내 증폭 기술에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 기술로서는, DNA 중합 효소에 의해 매개되는 기술 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응("PCR")(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호; 미국 특허 제4,683,195호; 미국 특허 제4,000,159호; 미국 특허 제4,965,188호; 미국 특허 제5,176,995호 참조)(Saiki외 다수, 1985; Chehab외 다수, 1987), 가닥 치환 증폭("SDA")(Walker외 다수, 1992), 회전 환 증폭("RCA")(Lizardi외 다수, 1998), 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 및 루프 매개 등온 증폭("LAMP")(Notomi외 다수, 2000; Nagamine외 다수, 2002)을 포함한다. 기타 표적 증폭 기술 예를 들어, 전사 매개 증폭("TMA")(Jonas외 다수, 1993), 자기 부양 서열 복제법("3SR")(Fahy외 다수, 1991) 및 핵산 서열 복제 기반 증폭법("NASBA")(Compton, 1991)은 RNA 중합 효소에 의해 매개된다.
PCR, RT-PCR, SDA, RCA 및 LAMP에 의해 생산된 증폭 생성물("앰플리콘")은 DNA로 구성되어 있는 반면에, RNA 앰플리콘은 TMA, 3SR 및 NASBA에 의해 생산된다.
본 발명의 몇몇 측면 중 하나를 이루는, 도 2에 도시된 기법 2를 참고하였을 때, 본 발명에서는 예를 들어, 전술한 바와 같은 PCR, RT-PCR, SDA, RCA, LAMP, TMA, 3SR 및 NASBA를 포함하는 표적 증폭법과 연계하여, MNA자임을 사용하는 방법이 제공된다. 실시예 4, 5, 6 및 9에는 PCR 앰플리콘의 검출 방법에 대해 기술되어 있다. 실시예 4, 5, 6 및 9에는, PCR 후속으로 행하여지는 종말점 분석법이 표적 핵산의 존부를 신속하게 측정할 수 있도록 돕는다고 기술되어 있다. 실시예 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 19, 및 20에는 PCR 증폭 결과를 실시간으로 관찰하여, 표적 핵산을 정량할 수 있는 방법에 대해 기술되어 있다. 프라이머를 불균형 또는 균형 비율로 사용하여 PCR에 의해 생산된 앰플리콘이 축적되었는지 여부는 MNA자임을 이용하여 관찰될 수 있다.
도 2(기법 2)에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 표적 핵산은 핵산(즉, DNA 또는 RNA)을 증폭시키기 위한 방법에 따라서 증폭된다. 바람직하게, 시험관 내 표준적인 증폭법이 사용된다. 증폭시 생성된 앰플리콘은 MNA자임에 대한 표적으로 사용되므로, MNA자임의 활성은 표적의 존재에 대한 지표가 된다. 당 업자는, 이러한 관찰이 증폭 및 MNA자임 조립이 이루어질 수 있고 촉매 활성을 띨 수 있는 조건 하에 단일 용기 내에서 수행될 수 있으며, 또한 이 MNA자임 검정법은 증폭 단계에 후속하거나, 또는 증폭이 진행되는 내내 각 시점에서, 증폭의 후반부 또는 증폭 진행 중에 시료를 제거함으로써 수행될 수 있음을 알 것이다.
뿐만 아니라, 표적 증폭법과 촉매 핵산 활성을 연계하는 방법 또는 프로토콜에는 구체적인 반응 조건이 필요할 수 있다. 바람직하게, 반응 조건은 중합 효소의 활성(증폭) 및 기질의 촉매 핵산 변형(검출) 둘 다에 적합하다. 예를 들어, PCR의 경우, 고온에서 촉매 활성과 중합 효소 활성 둘 다에 대한 조건을 결정하는 프로토콜을 DNA자임에 대하여 기술한바 있다[Impey외 다수, 2000]. 예를 들어, DNA자임 팔 길이, 완충액, 온도, 2가 이온 농도 및 부가물에 의한 효과를 비롯한 요인들의 영향력에 대해서 본 명세서에 기술되어 있다. DNA 효소는 시험관 내 증폭 기법과 함께 사용하기 적합하다. 예를 들어, DNA 효소는 증폭시 고온에 노출되면 가역적으로 변성된다.
5. 불용성 지지체 및 고체 지지체를 사용하는 방법
일반적으로 본 발명의 방법은, 그것이 복합적이건 그렇지 않건 간에, 용액 중에서 수행될 수 있거나, 또는 기질, 효소 또는 이의 일부, MNA자임 조립 촉진 인자 및/또는 표적 중 하나 이상이 결합, 부착 또는 고정되어 있는 불용성 지지체 또는 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 또한, 본원의 방법 및 본원에 예시된 변형예 및 작업 실시예에 제공된 검정 시스템의 특징은 일반적으로 당 업자에 의해 이해될 것이다. 그러므로, 본 발명은 본원에 교시된 바에 한정되는 것으로서 간주되어서는 안 될 것이며, 본원에 제공된 원리 및 교시 범위 그리고 당 업계의 상식에 따라서 변형 및 다양화될 수 있다.
도 3을 참고하였을 때, 패널 (i)에는 지지체에 고정된 기질과 MNA자임을 사용하여 표적을 검출하는 대표적인 방법이 도시되어 있다. 이 구체예에서, 기질은 바람직하게는 검출 가능 신호를 포함하는 검출 가능 부분 예를 들어, 형광단과, 검출 가능 신호를 감소시키거나 발생을 억제하는 켄처 부분을 가지는 기질로서, 이때, 상기 검출 가능 부분과 기질의 켄처 부분은 상기 기질이 예를 들어, 절단에 의해 변형될 때까지 인접하여 존재한다. 상기 기질은 지지체에 부착되어 있다. 바람직하게, 상기 지지체는 불용성 물질이거나, 또는 기질을 보유하고 있다가 다량의 반응 혼합물에서는 이 기질을 자유롭게 방출시키는 매트릭스이다. 이러한 지지체는 기질 예를 들어, 핵산 표적을 고정 또는 국소화하는 것으로서 당 업계에 공지되어 있다. 상기 지지체는 미세 검정법에 사용하기 편리한 비드와 같이 다양한 형태로서 사용되는, 다양한 매트릭스, 중합체, 그리고 반응 조건에 적합한 기타 물질로부터 선택될 수 있음을 당 업자는 알 것이다. 임의의 바람직한 구체예에서, 상기 지지체는 플라스틱 물질 예를 들어, 플라스틱 비드 또는 웨이퍼일 수 있거나, 또는 특정 검정법이 수행되는 웰이나 튜브일 수도 있다.
예를 들어, MNA자임에 의해 기질을 절단함으로 인한 변형이 수행될 때, 검출 가능 부분 또는 켄처 부분 중 (둘 다가 아닌) 어느 하나가 지지체에 부착된 상태로 남게 되면, 다른 하나는 부착된 채로 남아있던 부위로부터 떨어져 나와 다량의 반응 혼합물 중에서 자유롭게 이동하게 된다. 그러므로, 절단의 경우에 있어서, 상기 켄처 부분과 검출 가능 부분이 절단되어 분리되면, 검출 가능 신호는 상당 수준 증가하게 된다. 도 3에 나타낸 구체예에 있어서, 패널 (i)은 절단 후 형광단-함유 검출 가능 부분이 잔류하게 되는 경우를 도시하고 있다. 이 경우는, 지지체 상에 신호가 국소화될 수 있지만, 임의의 경우에는 상기 형광단(들)이 용액 중에 방출될 수도 있다는 이점을 갖는다. 예를 들어, 결찰이 발생하는 추가의 구체예에서, 켄처는 형광단에 결찰되어, 그 결과, 검출 가능 신호가 감소하게 될 수도 있는 것이다.
도 3을 참고로 하였을 때, 패널 (ii)에는, 상이한 표적에 특이적인 다수의 MNA자임(2개가 도시됨)을 생성하는데에 있어서 다수의 MNA자임 성분들이 관여하는 복합적인 방법이 도시되어 있다. 이 구체예는 특정의 공지된 위치에 기질을 포함하는 구조물 예를 들어, "칩"을 포함하는데, 여기서, 다수의 위치는 다수의 기질들 예를 들어, 기질 1 및 기질 2를 결합시키는데 사용될 수 있다. 각각의 기질의 검출 가능 부분의 위치가 추적될 수 있으며, 이 부분은 이와 같이 추적된 위치에 고정된다. 각각의 MNA자임 예를 들어, MNA자임 1, MNA자임 2에 있어서, 만일 표적 예를 들어, 표적 1 또는 표적 2가 예를 들어, 테스트 용액 중에 존재하면, 이 표적에 상응하며 이에 특이적인 MNA자임은 자체 조립되어, 상응하는 기질의 절단을 촉진할 수 있을 것이며, 그 결과, 이 위치에서 신호가 발생될 것이다. 그러므로, 검출 가능 신호의 위치를 통해, 어느 MNA자임이 그것의 기질을 절단하였는지, 그리고 어느 표적(들)이 테스트 용액 중에 존재하는지를 확인할 수 있을 것이다. 이 구체예에서, 상기 기질이 변형되면, 그것의 위치에 의해 확인 가능한 신호가 발생한다. 이 기질 예를 들어, 상이한 형광단은 독립적으로 검출 가능한 검출 기작을 필요로 하지 않으며, 당 업자는 이러한 예상이 본 발명의 범위 내에 속함을 알 것이다.
어레이나 마이크로어레이로서도 알려진 "칩"의 형태인 불용성 지지체를 포함하는 본 발명의 구체예는, 통상적으로, 이 칩에 커플링, 고정 또는 부착된 기질을 다수 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 상기 기질은 핵산을 포함한다. 다수의 핵산은, 상기 칩이 당 업계에 공지된 임의의 적당한 방법 예를 들어, 피펫팅, 잉크젯 인쇄, 밀착 인쇄 또는 사진 석판술에 의해 생산될 때 이 칩에 넣을 수 있다. 상기 칩은 각각 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 부품을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 부품은 동일한 서열의 핵산을 다수 개 포함할 수 있다. 이 칩에 포함된 부품은 임의의 수만큼 존재할 수 있으며, 다수의 부품이 칩에 배치되는 경우, 이 부품은 균일한 간격 또는 다양한 간격, 또는 적절히 조화된 간격으로 떨어져 배치될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 부품들은 무작위로 배치될 수 있으며, 이 경우, 각 부품의 각 위치는 이후에 결정된다. 상기 부품의 크기와 모양은 본 발명의 구체적인 용도에 따라서 달라질 것이며, 하나의 칩에 상이한 크기와 모양을 가지는 부품들이 함께 존재할 수도 있다. 이 칩의 표면은 실질적으로 평면일 수 있거나, 아니면 예를 들어, 함몰부 또는 돌출부와 같은 모양들을 가질 수도 있고, 또한 상기 부품들은 함몰부 안이나 돌출부 위에 배치될 수도 있다. 이러한 함몰부는 상기 부품이 침지될 용액을 담을 수 있으며, 상기 돌출부는 부품의 건조를 촉진할 수 있는 것이다. 예를 들어, 부품은 96 웰 평판의 각 웰에 배치될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 칩은 독특한 식별자 예를 들어, 지시자, 고주파 태그, 통합 장치 예를 들어, 마이크로프로세서, 바코드 또는 기타 표식자를 포함하여, 각각의 부품들을 확인할 수도 있다. 독특한 식별자는 상기 어레이 표면상에 존재하는 함몰부 또는 돌출부를 부가적으로 또는 대안적으로 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 독특한 식별자는 상기 칩의 올바른 방향을 제시하거나 또는 이 칩이 구별되도록 만들 수 있다. 독특한 식별자는 데이터 수집 장치 또는 광학 스캐너나 검출기를 통해 직접 판독될 수 있다.
6. 본 발명의 방법에 사용되는 리포터 기질 시스템
본 발명에는 디자인을 용이하게 바꾸어 상이한 표적들을 인식하는 새로운 MNA자임을 생성함으로써 검정법을 신속하게 진행시킬 수 있는, 일반적인 리포터 기질 시스템이 포함된다. 본원에 기술된 바와 같이, 새로운 표적에 필요한 하나 이상의 파트자임의 센서 팔 부분만이 바뀌고, 파트자임의 기질 팔 부분과 촉매 중심 부분은 변형되지 않은 채 잔류할 수 있다. 일반적 기질 서열이 제공되므로, 동일한 기질이 다수의 상이한 표적에 대한 검정법에 통합될 수 있다. 뿐만 아니라, 동일한 기질이 본원에 개시된 다양한 구체예에 따른 방법 예를 들어, 기질이 용액 중에 유리된 상태로 존재하거나 또는 지지체에 고정 또는 부착되어 존재하는 검정법에 사용될 수 있다. 일련의 일반적 기질은 다수의 표적을 동시에 검출할 수 있는 복합적인 반응에 사용될 수 있다.
일반적 기질을 사용하는 MNA자임 기법은 예를 들어, 각각의 새로운 표적에 특이적인 프로브와 디자인을 필요로 하는 기술인 택맨(TaqMan)® 또는 비콘스(Beacons)와 같은 기술에 비하여 상당한 이점을 제공한다.
7. 본 발명의 방법에 사용되는 기질
이하에 더욱 상세히 설명되어 있는 바와 같이, MNA자임은 보편적이거나 일반적 기질을 사용할 수 있는 임의의 구체예에서, 유리한 특성을 보유한다. 바람직한 형태를 가지는 이러한 기질을 도 1에 나타냈는데, 여기서, 상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처 부분 둘 다를 포함한다. 켄처 부분은 기질이 MNA자임에 의해 절단될 때까지 이 기질의 검출 가능 부분로부터 검출 가능 신호를 줄이거나 또는 발생하지 않도록 하는데 적합하다. 예를 들어, 켄처 부분은 "블랙홀 켄처 1"(Black Hole Quencher 1; BHQ1) 또는 "블랙홀 켄처 2"(BHQ2)를 포함할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 MNA자임은 검출 가능 부분와 켄처 부분 사이에 있는 기질을 절단하여, 이 두 부분이 용액 중에서 분리되게 만들고, 이로써, 켄처 부분이 검출 가능 부분의 국소 환경으로부터 격리되거나 또는 효과적으로 제거됨에 따라서, 검출 가능 신호가 나타나거나 또는 증가하도록 만들 수 있다.
MNA자임을 구성하는 파트자임을 디자인함으로써, 일반적이거나 보편적 기질을 사용할 수 있다. 파트자임의 기질 팔은 그대로 놔두고, 파트자임의 센서 팔만을 변형시키면, 모든 MNA자임이 보편적 기질을 이용하여 검출용으로 사용되도록, 다수의 표적 각각에 특이적인 다양한 MNA자임이 디자인될 수 있다. 이로써, 각각의 표적에 맞추어졌거나 이 표적 특유의 기질을 사용할 필요가 없다는 이점이 제공됨을 당 업자는 알게될 것이다. 각각의 새로운 표적에는 센서 팔 부분 중 하나 이상에 오로지 하나만의 변이 또는 그 이상의 변이가 일어날 필요가 있으며; 이 기질 팔 부분과 촉매 중심 부분은 변이되지 않은 채로 잔류할 수 있다. 그러므로, 단일 리포터 기질은 MNA자임을 이용하는 단일 표적과, 변형된 MNA자임을 이용하는 일련의 검정법의 다수의 표적에 사용될 수 있다. 다수의 리포터 기질은, 표적당 하나씩 작용하는, 다수의 MNA자임을 사용하는 단일 검정법에서, 다수 개의 표적들을 검출할 수 있도록 복합적으로 사용될 수 있다. 이와 같이 MNA자임을 이용하는 복합적 방법은 용액 중에서 용이하게 수행될 수 있거나(도 18), 아니면 지지체 시스템에 부착된 MNA자임을 사용하여 수행될 수 있다(도 3). 그러므로, 기질, MNA자임 파트자임 또는 조립 촉진 인자, 또는 추가의 효소 활성 인자들 중 하나 이상을 본원에 개시된 바와 같은 지지체에 부착시키는 단계를 포함하는 복합적 검정법이 상기 시스템에서 수행될 수 있음도 알 수 있다.
뿐만 아니라, 기질은 추가의 물질 예를 들어, 표지된 핵산, 나노 입자, 마이크로 입자, 단백질, 항체, RNA, DNA, 핵산 유사체, 단백질, 당단백질, 지단백질, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 또는 이의 임의의 조합와 통합될 수 있다. 예를 들어, 상기 나노 입자는 금 나노 입자일 수 있으며, 여기서, 상기 금 나노 입자는 다수의 표적 예를 들어, 핵산과 결합한다.
기질은 MNA자임에 의해 변형될 수 있으며, 이로써, 검출 가능 효과를 나타낼 수 있다. 검출 방법에 있어서, MNA자임에 의한 기질 변형법으로서는 예를 들어, 절단, 결찰, 포피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합의 형성을 포함할 수 있다. MNA자임에 의한 기질 변형의 결과로서, 검출 가능 효과가 나타나는 것이며, 이 효과의 크기는 곧, 측정해야할 표적의 양을 나타내는 지표가 될 수 있다. 검출 가능 효과는 다양한 방법 예를 들어, 형광 분광 분석법, 표면 플라스몬 공명법, 질량 분광 분석법, NMR, 전자 스핀 공명법, 편광 형광 분광 분석법, 원편광 이색성 분광 분석법, 면역 검정법, 크로마토그래피법, 방사 분석법, 광도 측정법, 신티그램 조영법, 전자적 방법, UV, 가시 광선 또는 적외선 분광 분석법, 효소법 또는 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다.
몇몇 연구팀이 핵산 표적 및 기타 피분석물을 비색 정보를 통해 검출하는 방법에 대해 보고한바 있다[Elghanian외 다수, 1997, Mirkin외 다수, 1996, and Liu and Lu, 2004]. 이 기법에는 금 나노 입자 1 회분을 제조하는 단계를 포함하는데, 여기서, 각각의 금 나노 입자의 표면에는 전혀 다른 DNA 올리고뉴클레오티드 서열이 부착되어 있다. 이후, 이 금 입자에 부착되어 있는 서열과 상보성인 "가교 올리고뉴클레오티드"를 부가함으로써 금 입자는 응집될 수 있다. 입자가 응집됨에 따라서 색도 적색에서 청색으로 바뀐다[Mirkin외 다수, 1996]. 보다 최근의 연구에 따르면, DNA자임 기질 서열을 가교 올리고뉴클레오티드에 포함시킬 경우, 금 입자의 응집을 역전시키는 기작을 제공할 수 있다는 것을 규명하였다[Liu and Lu, 2004]. DNA자임을 활성화하고, 이후에 기질/가교 올리고뉴클레오티드를 절단하면, 금 입자가 해리되고, 이에 따라서 색상도 청색에서 적색으로 바뀐다.
전술한 원리를 바탕으로 하는 간편한 첨단 검출 장치(즉, 촉매 활성을 유도하는 특정 DNA자임의 독립성을 이용함으로써 작동하는 장치)가 고안되었다. DNA자임은 금 입자를 응집시키는데 사용되는 가교 올리고뉴클레오티드를 절단하도록 디자인되었다[Liu and Lu, 2004]. 이와 유사하게, 아데노신에 특이적인 앱타머를 함유하는 앱타자임과, 아데노신이 존재할 때에만 가교 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 DNA자임은, 비색 방식으로 아데노신을 검출할 수 있다.
8. 방법의 최적화
당 업자는 본원에 개시된 방법이 다양한 실험 변수를 이용하여 최적화될 수 있으며, 그 결과, 표적의 검출, 동정 및/또는 정량을 최적화할 수 있다는 사실을 쉽게 알 수 있을 것이다. 최적화되는 구체적인 실험 매개 변수와, 이러한 최적화 수준은, 사용되고 있는 구체적인 방법과 검출, 동정 및/또는 정량하고자 하는 특정 표적에 따라서 달라질 것이다. 이러한 매개 변수로서는 시간 및 온도, 그리고 염, 세제, 양이온 및 기타 시약 예를 들어, 디메틸설폭시드(DMSO)의 농도와, 핵산의 길이, 상보성, GC 함량 및 용융점(Tm)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 구체예에서, 예를 들어, 서열 변이체의 검출 및/또는 메틸화된 DNA의 검출, 바람직하게는 본 방법이 수행되는 온도를 포함하는 실험 매개 변수를 고려한 방법은, MNA자임 구성 핵산이, 서열 변이체 또는 메틸화된 뉴클레오티드를 각각 포함하거나 포함하지 않는 표적 핵산에 결합하였는지 여부를 구별하도록 최적화될 수 있다. 이러한 방법이 수행될 수 있는 온도는 약 20∼약 96℃, 약 20∼약 75℃, 약 20∼약 60℃ 또는 약 20∼약 55℃일 수 있다.
하나의 바람직한 구체예에서, MNA자임을 이용하는 방법을 수행하기 위해 최적화된 반응이 본원에 제공된다. 이러한 최적화된 반응에 있어서, 촉매 활성은 최적화되지 않은 반응에 비하여 10%, 20% 또는 30% 이상까지 증가한다. 더욱 바람직한 반응 조건은 촉매 활성을 35% 이상 또는 40% 이상까지, 그리고 50% 이상까지 개선한다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 최적화된 반응의 촉매 활성은 50% 이상, 66% 이상, 75% 이상 또는 100% 이상까지 증가한다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 완전히 최적화된 반응법에서는 촉매 활성이 100%, 200% 또는 300% 이상까지 증가하게 될 것이다. 기타 바람직한 반응 조건은 촉매 활성을, 최적화되지 않은 반응 조건이 적용되는 방법에 비하여, 1000% 이상까지 개선할 수 있다. 본원에 제공된 방법을 최적화하는데 있어서 매우 바람직한 반응 조건에는 임의의 2가 양이온이 포함된다. 대부분의 핵산 효소의 촉매 활성은 2가 양이온의 농도에 의해 농도-의존적 방식으로 영향받을 수 있다. 바람직한 최적화 반응은 Ba2 +, Sr2 +, Mg2 +, Ca2 +, Ni2 +, Co2 +, Mn2+, Zn2 + 및 Pb2 + 중 하나 이상에 대해 최적화된다.
9. 앱타머를 사용하는 방법
당 업자는, 본원에 개시된 방법이 앱타머를 사용하여 수행될 수 있으며, 이때, 상기 앱타머는 핵산을 제외한 표적과 같은 표적의 검출, 동정 및/또는 정량을 촉진할 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.
도 4 및 도 20에는, 표적 예를 들어, 비-핵산 물질을 검출하는데 MNA자임을 사용하는 방법이 예시되어 있다. 이 방법에서는 하나 이상의 리간드를 인식할 수 있는 핵산 또는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드나, 이의 조합을 포함할 수 있는 앱타머를 이용한다. 앱타머는 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 전체 유기체, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이의 임의의 유도체, 일부 또는 이의 조합, 또는 기타 임의의 물질과 결합할 수 있다[Lee외 다수, 2004].
본원에 있어서 바람직한 앱타머는 흡착, 회수 및 재증폭 과정을 반복적으로 수행하여, 합성 핵산 또는 펩티드의 복합 라이브러리로부터 분리될 수 있는 짧은 단일 사슬 DNA 또는 RNA 올리고머나 펩티드를 포함할 수 있다. 그러므로, 앱타머는 소분자 예를 들어, 아미노산이나 항생체로부터 단백질 및 핵산 구조물에 이르는 임의의 표적들 대부분에 대해서 생성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 앱타머는 예를 들어, 생성 및 선택 기술에 의해 생성되는 것이 바람직한 핵산 결합 분자를 포함한다. 바람직하게, 앱타머는 DNA 또는 RNA 분자나, 이 DNA 및 RNA의 조합 예를 들어, 상기 표 2에 나열된 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
MNA자임과 앱타머를 함께 사용하는 기법을 도 4와 도 20에 도시하였다. 도 4의 패널 (i)을 참고로 하면, 이와 같은 MNA자임 검출 기법에 사용되는 핵산 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 성분들을 포함할 수 있다: (a) 표준 파트자임; (b) 앱타머(굵은 글씨로 나타낸 서열)와, 헤어핀 구조를 형성하여 MNA자임의 조립을 억제할 수 있는 상보성 서열이 통합된 파트자임인 앱타-파트자임; (c) 파트자임과 앱타-파트자임 둘 다와 결합하여, 활성 MNA자임이 조립될 수 있도록 만드는 조립 촉진 인자; 그리고 (d) 기질. 표적 피분석물(An)이 존재하지 않으면, 상기 앱타-파트자임은 헤어핀 구조를 취하며, 이로써 활성 MNA자임의 조립이 억제된다. 표적 피분석물이 존재하면, 이 표적 피분석물은 앱타-파트자임의 앱타머 도메인에 결합하며, 이로써, 헤어핀 구조가 파괴되고, 또한 이 앱타-파트자임은 활성 MNA자임의 조립에 관여할 수 있게 되는 것이다. 이후, 활성 MNA자임은 예를 들어, 형광 신호를 발생시키는 기질을 변형시킬 수 있다.
도 4의 패널 (ii)를 참고로 하였을 때, 이 MNA자임 검출 기법에 사용되는 핵산 올리고뉴클레오티드는 다음의 성분들을 포함할 수 있다: (a) 2개의 표준 파트자임; (b) 앱타머(굵은 글씨로 나타낸 서열)와, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 상보성 억제제 서열이 통합된 조립 촉진 인자; 그리고 (c) 기질. 표적 피분석물이 존재하지 않으면, 조립 촉진 인자는 헤어핀 구조를 취하며, 이로써 이와 같은 성분이 활성 MNA자임의 조립을 유도하지 못하도록 만든다. 표적 피분석물이 존재하면, 이 표적 피분석물은 조립 촉진 인자의 앱타머 도메인에 결합하며, 그 결과, 헤어핀 구조가 파괴되고, 또한 상기 성분은 활성 MNA자임의 조립을 유도할 수 있게 된다. 이후, 상기 활성 MNA자임은 예를 들어, 형광 신호를 발생시키는 기질을 변형시킬 수 있다.
당 업자는 상기 앱타머가 조립 촉진 분자(들)의 어느 한쪽 말단부에 통합될 수 있음을 알 것이다. 뿐만 아니라, 다수의 앱타머가 파트자임 올리고뉴클레오티드 성분들 중 하나 이상에 통합될 수 있다는 사실도 알 것이다. 도 4의 패널 (i) 및 (ii)에 도시된 기법에 있어서, 조립 촉진 인자는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기 유사체를 함유하는 DNA, RNA, LNA, PNA 또는 임의의 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 표적 An은 핵산이다. 이러한 구체예에서, 표적 핵산에 상보성인 서열은 도 4에 굵게 표시된 앱타머를 치환한다.
도 4의 패널 (iii)을 참고로 하였을 때, MNA자임 검출 기법에 사용되는 핵산 올리고뉴클레오티드는 2개의 앱타-파트자임을 포함할 수 있는데, 이 앱타-파트자임은 각각 앱타머의 일부를 함유한다. 표적 피분석물이 존재하지 않는 경우, 활성 MNA자임은 조립할 수 없다. 표적 피분석물이 존재하는 경우에는, 상기 표적 피분석물은 올리고뉴클레오티드 성분들을 함께 모아서 활성 MNA자임의 조립을 유도하는 조립 촉진 인자로서 사용된다. 이후, 상기 활성 MNA자임은 예를 들어, 형광 신호를 발생시키는 기질을 변형시킬 수 있다.
앱타머 결합과 MNA자임 조립을 연계시키는 관련 기법을 도 20에 도시하였다. 이 기법에 있어서, 앱타머 서열은 파트자임(앱타-파트자임)의 말단부에 일정한 형태로 통합되며, 이로 인하여, 활성 MNA자임은 표적 피분석물이 존재할 때에만 형성되게 되는 것이다. 도시된 MNA자임 검출 기법에 사용되는 올리고뉴클레오티드 성분들로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: (a) 표준 파트자임; (b) 앱타머가 한쪽 말단부에 통합되어 있는 파트자임인 앱타-파트자임; (c) (표적 존재 하에) 활성 MNA자임의 조립을 가능하게 하는 파트자임과 앱타-파트자임 둘 다와 결합하는 조립 촉진 인자; (d) 리포터 프로브 기질; 및 (e) 파트자임 서열의 기질 결합 팔의 적어도 일부와 앱타머 서열의 적어도 부분에 걸쳐 확장되어 존재하는 부위에 있는 앱타-파트자임에 혼성화하는 조립 억제제. 표적이 존재하지 않는 경우(좌측 패널), 상기 조립 억제제는 앱타-파트자임과 결합하여, 리포터 프로브 기질의 결합(및 절단)을 차단한다. 표적이 존재하는 경우(우측 패널), 표적은 앱타-파트자임의 앱타머 서열과 결합하여 조립 억제제와의 결합을 차단하고, 리포터 프로브 기질과 계합하여 이를 절단할 수 있도록 한다. 그러므로, MNA자임은 표적이 존재할 경우에만 형광 신호를 형성하여 이를 발생시킬 수 있다.
당 업자는 또한, 도 20에 도시된 기법이 도 4의 패널 (i)에 도시된 기법과 유사하되, 다만, 활성 MNA자임이 형성되는 것을 막는 상보성 억제제 서열이 올리고뉴클레오티드 파트자임 성분(도 4의 패널 (i)) 또는 개별 분자(도 20)에 통합된다는 점에서 차이가 난다는 사실을 알 것이다. 그러므로, 억제제 서열은 개별 분자일 수 있거나, 아니면 MNA자임 복합체 형성에 관여하는 성분 중 하나에 통합될 수 있다.
당 업자는 또한, 하나 이상의 앱타머가 올리고뉴클레오티드 성분들 중 임의의 것 예를 들어, 파트자임, 조립 촉진 인자 또는 기질에 통합될 수 있다는 사실도 알 것이다. 또한, 상기 앱타머는 이러한 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 말단부 중 어느 한 쪽에 통합될 수 있다.
본 발명은 앱타머/MNA자임 기법이 각각 소분자(ATP) 및 단백질(Taq 중합 효소)을 검출하는데 사용되는, 실시예 18 및 실시예 21을 참고로 하면 더욱 잘 이해될 수 있다.
10. 마이크로 RNA 의 검출, 동정 및 정량 방법
당 업자는, 마이크로 RNA의 검출, 동정 및/또는 정량이 본원에 개시된 방법에 관한 특정 구체예에 해당함을 알 것이다. 도 5에는, 짧은 핵산 서열(예를 들어, 마이크로 RNA(miR))의 증폭 기법과 MNA자임을 이용한 앰플리콘 검출 기법에 관하여 도시되어 있다.
짧은 핵산 서열 예를 들어, 마이크로 RNA(miR)와 같은 표적을 검출하는데에는 이 표적의 크기가 작기 때문에 추가의 단계를 반드시 필요로 한다. miR은 길이가 약 22 뉴클레오티드인 비암호화 RNA 분자이다. 이 miR은 클로닝이나 노던 블럿 분석법에 의해 검출될 수 있으나, 이와 같은 방법들은 인내를 요하는 작업이고, 또한 RT-PCR과 같은 기술에 비하여 전체 RNA도 다량 필요하다. miR의 크기는 작기 때문에, 이 miR 서열은 표준 상태로 디자인된 PCR 프라이머 2개를 수용하기에는 불충분하다. 뿐만 아니라, 심지어 miR가 증폭되면, 실제 사용될 앰플리콘과 프라이머-이량체를 크기(전기 영동에 의해 확인됨), 또는 형광도(비-특이적 염료 예를 들어, Sybr 그린이나 브롬화에티듐의 삽입에 의해 확인됨)로 구별하는 것이 어렵게 된다. 상기 miR 앰플리콘을 내부 혼성화 프로브 예를 들어, 택맨® 또는 비콘 브로브로 프로빙함으로써 이와 같은 한계점을 극복할 수는 있었으나, 앰플리콘의 크기가 작다는 점은 여전히 표준적으로 디자인된 프로브를 사용함에 있어서 장애가 되고 있다.
miR 분석을 위한 변형 택맨® RT-PCR 방법(Chen외 다수, 2005)은 miR 특이적 3' 말단부를 가지는 3' 프라이머와, 5' 말단부에서 줄기-고리 구조를 형성할 수 있는 추가의 비 관련 서열을 사용하는 역전사 단계가 개시된다. 생성된 cDNA는 miR 특이적 3' 말단부를 가지며 5' 말단부에는 추가의 비 관련 서열을 가지는 상기 3' 프라이머와 5' 프라이머를 사용하여 증폭된다. 증폭 여부는 프라이머에 의해 도입된 비 관련 서열과 miR 서열 둘 다와 결합하는 택맨® 프로브를 사용하여 실시간으로 관찰된다. 그러나, 프라이머 디자인과, 택맨® 프로브의 크기 및 위치로 인해, 특이적인 miR이 밀접하게 관련된 서열들을 구별할 수 없을 가능성은 여전히 남는다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본원에 사용된 방법에서는, 3' 말단부에서 miR과 결합하고, 5' 말단부에서는 줄기-고리 구조를 형성할 수 있거나 형성할 수 없으며, miR과 관련되지 않은 연장 서열을 가지는, 3' 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 도 5에 도시한 바와 같이, 프라이머의 비 관련 서열은 고리 구조를 형성할 수 있거나(도 5, 좌측) 또는 태그 구조만을 형성할 수 있다(도 5, 우측). 상기 2가지 중 어느 하나의 예에서, 3' miR 프라이머는 역전사 효소가 존재하는 경우에 연장되며, 이후, 3' 말단에 miR-특이 서열을 가지고 5' 말단에는 비 관련 연장 서열을 가지는, 5' 프라이머 및 3' 프라이머를 이용하는 PCR 증폭법에 의해 다시 연장된다. 앰플리콘은 5' 프라이머와 3' 프라이머 사이의 부위를 포함하는 앰플리콘을 인식하고 이에 혼성화되는 MNA자임에 의해 용이하게 검출된다. MNA자임 센서 팔과 표적 핵산 사이의 상보성에 대한 엄격한 조건으로 말미암아, 밀접하게 관련된 서열조차도 구별할 수 있게 된다. 이하 실시예들 중, 실시예 5와 실시예 10에는, 짧은 핵산 서열을 증폭함으로써 생성된 앰플리콘을 검출하기 위해 MNA자임을 사용하였을 때의 결과가 기술되어 있다(전술한 도 2의 기법 2 참조). 또한, 실시예 5에는, MNA자임을 사용하여 하나의 뉴클레오티드만이 상이한 2개의 서열을 구별하는 방법의 성과에 대해 기술되어 있다. 이를 통해, 증폭법이 밀접하게 관련된 서열을 구별할 수 없을 때조차도, 이 MNA자임이, 결과로 생성된 앰플리콘 내 적어도 서열 변이도 구별할 수 있다는 이점이 제공된다.
11. 케스케이드를 이용한 방법
당 업자는, 본원에 개시된 방법이 본원에 정의된 바와 같은 케스케이드를 수행하는데 사용될 수 있음을 알 것이다. 본원에 개시된 방법을 수행하는 것과 관련된 특정 구체예로서는, (1) 표적의 존재할 때에만 기질을 절단하는 MNA자임을 사용하는 방법으로서, 여기서, 상기 기질은 이후에 두 번째 단계 예를 들어, 도 6에 도시된 바와 같은 검출 가능 신호의 발생 단계[이때, 기질을 절단하면 이후 고정 인자를 절단할 수 있는 효소가 생성될 수 있게 됨]에 관여할 수 있게 되며, 이로써, 켄처로부터 형광 태그가 분리될 수 있는 것인 방법; 또는 (2) 표적 존재 하에서만 기질을 절단하는 MNA자임을 사용하는 방법으로서, 여기서, 상기 기질은 이후에 두 번째 단계에 관여할 수 있게 되며, 이로써, 이 두 번째 단계가 수행되면, 임의의 횟수만큼의 후속 단계에 관여하는 추가의 기질이 생성되고, 이 후속 단계는 다시 초기 단계를 수행하는데 관여하는 기질을 생성할 수 있도록 만들어, 도 7 및 도 25에 도시된 바와 같은 순환형 케스케이드[여기서, 이와 같은 순환형 케스케이드는 예를 들어, 표적이 소량 존재하므로 검출 가능 신호를 제공할 수 없는 경우에 신호를 증폭시키는데 사용될 수 있음]가 진행되는 것인 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
검출 가능 효과 증폭 케스케이드는 리보자임/리가제 케스케이드, 환형 핵산 효소 케스케이드, 단백질 효소 케스케이드, 또는 지지체에 부착된 하나 이상의 효소가 관여하는 케스케이드, 또는 이것들의 임의의 병행 케스케이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
도 2의 기법 3에는, 신호 케스케이드를 이용하여 신호를 증폭시키는, MNA자임의 사용 방법이 개략적으로 도시되어 있다. 이에 관하여는 도 6, 도 7 및 도 25에 더욱 상세히 도시되어 있다.
도 6에는, 효소 매개 신호 증폭법과 연계된, 표적의 MNA자임 검출법이 도시되어 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명은 MNA자임 검출법을 이용하여 표적을 증폭시키는 방법과, 발생한 신호를 증폭시키는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, MNA자임 기법과 신호 증폭 기법을 연계시키면, 몇몇 경우에 있어서 표적 증폭법과 신호 증폭법이 함께 적용될 수도 있지만, MNA자임 검정법과 표적 증폭법을 연계시킨 방법에 대한 대안이 제공된다. 신호를 증폭시키는 바람직한 방법에는 케스케이드 기구가 관여하는데, 여기서, 당 업자는 상기 기구가 생물 시스템에서 신호를 증폭시킬 때 관여하는 것임을 알 것이다.
촉매 핵산을 사용하는 증폭 케스케이드의 몇몇 예에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 또한 본원에 이용할 것이 고려된다. 결찰 케스케이드(Paul and Joyce, 2004)는 2개의 RNA 함유 올리고뉴클레오티드를 결찰시키는 제1 리보자임(A)을 사용하여 제2 리보자임(B)을 형성한다. 이후, 리보자임(B)은 2개의 기타 RNA 함유 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 새로운 제1 리보자임(A)을 형성함으로써, 케스케이드 반응을 촉발한다.
본원에 사용하기에 적합한 제2의 증폭 케스케이드에서는 환형 DNA자임/기질 분자를 사용한다[Levy and Ellington, 2003]. DNA자임(A)은 환형일 때에는 불활성이지만, 환형 DNA자임(A)을 절단하는 제2 DNA자임(B)에 의해 선형으로 되면 활성화된다. 이후, 활성 선형 DNA자임(A)은 환형 DNA자임(B) 분자를 절단하여, 이들 분자를 선형화 및 활성화한다. 각각 절단/선형화할 수 있는 2개의 DNA자임은 촉매 핵산 활성에 대한 케스케이드를 진행시킨다.
당 업자는 다른 연구법 예를 들어, 다양한 앱타머 및/또는 통상의 단백질 효소의 촉매 능을 가지는 DNA자임을 함께 사용하는 방법도 활용할 수 있음을 알 것이다[예를 들어, Zhang외 다수, 2005 참조]. 쟝(Zhang)외 다수의 방법에 의하면, 검출 가능 분자의 형성을 촉진함으로써 신호를 발생시켜 이를 증폭시킬 수 있는 단백질 효소가 방출된다. 쟝외 다수의 방법을 통해서, 정밀하게 검출할 수는 있지만, 이 방법은 각각의 검정 단계마다 정밀하게 맞춤 제작된 분자가 필요하므로 비용이 많이 든다. 펩티드를 핵산과 커플링시키는 방법 즉, DNA를 지지체 구조물에 부착시키는 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다[예를 들어, Cheng외 다수, 1993]. 예를 들어, 애셔(Asher; PCT/US96/02380)의 문헌에는, 불용성 지지체에 효소(리보자임)를 고정시키는 방법에 대해 기술되어 있는데, 이 방법에서는 상기 효소가 유리되면 기질을 절단하게 되고, 이로써, 공간적으로 분리된 2개의 리보자임을 이용하는 신호 증폭 과정이 개시된다고 한다.
신호를 증폭시키는 기타 시험관 내 방법에 대해서는 당 업계에 공지되어 있는데, 성공적인 것으로 판명된 기술과 유사한 기술을 사용하는 또 다른 기법을 통해서도 신호를 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 분지형 DNA 검정법(bDNA)(Urdea, 1993)에서는, 반응을 매개하는 표지된 프로브에 부착된 2차 리포터 분자(예를 들어, 알칼리성 포스파타제)를 사용함으로써 신호를 증폭시킨다. 형광 상관 분광 분석법(Fluorescence correlation spectroscopy; FCS)에서는 신호를 전자 공학적으로 증폭시킨다[Eigen and Rigler, 1994]. 티라미드 신호 증폭법(TSA)[Bobrow외 다수, 1989; Adams, 1992; Raap외 다수, 1995; van Gijlswijk외 다수, 1997]에서는, 단백질 내 티로신 잔기와 결합하여, 티라미시드를 활성 형태로 바꾸는 호오스래디쉬 퍼옥시다제를 사용한다. TSA는 다양한 세포 면역 화학 분야에서 사용된다. 침입 인자 검정법(Invader assay)[Hall외 다수, 2000]에서는, 시간이 경과 함에 따라서 뉴클레아제 절단에 의해 표적 분자당 1000개 이상의 절단 생성물을 생성할 수 있는 방식으로 표적 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 2개 사용하며, 이때 절단 반응물에는 형광 프로브를 커플링시킬 수 있다. 그러나, 공지의 신호 증폭법에는 한계가 있다. 예를 들어, bDNA 검정법은 표적 증폭법만큼 정밀하지 못하다.
그러므로, 도 6에는 신호 증폭 기법의 일환으로서, MNA자임에 의해 방출된 효소를 사용하는 방법의 일례가 도시되어 있다. 예를 들어, 형광단 부분과 켄처 부분 사이에 있는 기질을 효소로 절단하여 신호를 발생시킴으로써, 신호가 발생될 수 있다. 본원에 사용할 것으로 고려되는 효소로서는 DNA자임, MNA자임, 리보자임 및 활성을 측정할 수 있는 단백질 효소 예를 들어, 프로테아제, 제한 엔도뉴클레아제 및 기타 하이드롤라제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 표적으로서는 핵산 서열 예를 들어, 인간, 동물, 식물, 바이러스, 박테리아 DNA 또는 RNA가 있다. 기타 바람직한 표적으로서는 프리온, 효소 또는 진균, 또는 기타 임의의 분자 예를 들어, 당단백질, 지질, 지단백질, 전체 유기체, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온 또는 이의 임의의 유도체, 일부 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
도 6에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 본원에서 "효소"라고 명명되는 대표적인 효소는 절단 가능한 분자, 바람직하게는 핵산을 통해서 제1의 불용성 지지체에 부착되어 있다. 도 6의 예에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 효소 "효소"를 부착시키는 역할을 하는 절단 가능 분자는 일반적 또는 보편적 MNA자임 기질이다. 또한, 효소 "효소"에 대한 "절단 가능 고정" 기질은 제1의 불용성 지지체와 접촉하지는 않지만 불용성 지지체와는 부착되어 있다. "효소"는 활성을 검출할 수 있는 임의의 효소로서, 그 예로서는 전술한 바와 같은 MNA자임, DNA자임, 리보자임 또는 단백질 효소가 있다. 바람직한 구체예에서, MNA자임 또는 DNA자임이 특히 유용하다. 자체 조립되어 보편적 기질이나 일반적 기질을 절단할 수 있는 올리고뉴클레오티드 성분 또는 파트자임이 존재할 때, 그리고 MNA자임에 대한 표적 존재 하에, 상기 MNA자임이 형성되며, 이것이 지지체로부터 "효소"를 촉매 작용으로써 절단해 내고, 그 결과, 이 "효소"는 유리되어 "절단 가능 고정" 기질과 접촉할 수 있게 됨으로써 이 기질을 절단한다. "절단 가능 고정 인자"를 절단하면, 부착되어 있던 기질로부터 형광단이 방출된다. 이 형광단은 용이하게 검출 및 측정된다.
지지체에 고정 또는 부착되어 있는 것이 바람직한 기질로부터, 고정되어 있거나 부착되어 있는 효소를 물리적으로 분리하는 것을 본원에서는 "공간 분리(spatial separation)"라 칭한다. 하나 이상의 효소는 이 효소의 각 기질로부터 "공간 분리"될 수 있으며, 또한 상호 간도 "공간 분리"될 수 있다. 특히, 제1 효소에 대한 기질이 절단되어 제2 효소가 방출되는 신호 증폭 케스케이드에서는, 이후 제2 효소에 대한 기질이 절단됨으로 인하여 더욱 많은 제1 효소가 방출될 수 있다(도 7 참조).
바람직한 구체예에서, 상기 효소 "효소"에 대한 기질은, 도시된 바와 같이, 켄처 부분과 검출 가능 부분 둘 다를 포함하는 이 작용성 기질이다. 상기 효소 "효소"에 대한 기질이 절단되지 않은 상태에서는 검출 가능 신호를 나타내지 않는 분자이고, 이 기질이 절단됨에 따라서 검출 가능 신호가 1배∼다수 배 증가하는 구체예가 바람직하다.
도 7에는, MNA자임을 사용하는 검정법과 2개의 "공간 분리된" 효소를 사용하는 신호 증폭법에 관한 일례가 도시되어 있다. 신호 증폭 케스케이드는 또한 전술한 바와 같은 "공간 분리"된 DNA자임을 사용하여 진행될 수도 있다. 초기 MNA자임 절단 단계에서는 고정되어 있던 부착 기질이 절단되고, 그 결과, DNA자임이 방출된다. 이후, DNA자임 A는 제2 DNA자임 B가 고정되어 있는 제2 서열로 이동한다. DNA자임 A는 더욱 많은 DNA자임 A를 방출시키는 DNA자임 B를 방출시킨다. 신호가 증폭되는 케스케이드가 개시된다. 다양한 구체예에서, 상기 표적은 핵산 서열 예를 들어, 인간, 바이러스, 박테리아의 DNA 또는 RNA일 수 있거나; 또는 상기 표적은 단백질, 바이러스, 프리온, 항체, 전체 세포 또는 소분자일 수 있다.
구체적으로, 도 7에 나타낸 실시예를 통해, DNA자임 A는 DNA자임 B에 의해서도 절단될 수 있는 제1의 보편적 MNA자임 기질 또는 일반적 기질을 통해 지지체에 부착되어 있음을 알 수 있다. DNA자임 B는 DNA자임 A에 대한 기질인 제2의 일반적 기질을 통해 불용성 지지체에 부착되어 있다. 상기 두 개의 DNA자임들은 모두 잔류하고 있어서, 이 두 DNA자임에 대한 각각의 기질은 이 DNA자임에 접근할 수 없다. 자체 조립되어 보편적 기질을 절단하는 MNA자임을 형성하는 파트자임이 존재할 경우, 그리고 표적도 존재할 경우, MNA자임이 형성되어 DNA자임 A를 보유하고 있던 보편적 MNA자임 기질을 절단하고, 이로써, DNA자임 A가 방출된다. DNA자임 A는 제2의 일반적 기질로 이동할 수 있다. 상기 제2의 일반적 기질이 DNA자임 A에 의해 절단되면, DNA자임 B는 검출 가능 신호(본원에서는 형광단 F)와 함께 방출된다. 형광단 F는 보유하고 있던 켄처 부분 Q로부터 분리됨에 따라서 검출할 수 있게 된다. 기질에 접근할 수 있게 된 유리 DNA자임 B가 이 기질에 접근하면 제1의 일반적 기질을 절단하게 되고, 이로써, 추가의 DNA자임 A가 방출되며, 그 결과, 더욱 많은 DNA자임 B와 검출 가능 신호 F가 방출된다. 그러므로, 검출 가능 신호 F의 양이 기하 급수적으로 증가하여 강력한 신호 증폭 케스케이드가 확립된다.
고정된 파트자임을 사용하는 MNA자임 케스케이드에 대한 예는 도 25를 참고로 하였을 때 더욱 잘 이해할 수 있다. MNA자임은 본 도면에 도시된 바와 같이, 신호 증폭 케스케이드를 개시하는데 사용될 수 있다. 이 반응에는 다음과 같은 성분들이 관여한다:(i) 용액 중에서 유리된 상태로 존재하는, MNA자임 1에 대한 파트자임; (ii) 용액 중에 유리된 상태로 존재하거나(도시한 바와 같음) 기질 Sub1에 의해 불용성 지지체에 고정되어 있는, MNA자임 2와 MNA자임 3에 대한 조립 촉진 인자(동일한 센서 팔 보유); (iii) 기질 Sub1에 의해 불용성 지지체에 고정되어 있는, MNA자임 2에 대한 파트자임[여기서, 상기 Sub1은 MNA자임 1(표적 피분석물이 존재할 경우) 또는 MNA자임 3(조립 촉진 인자가 존재할 경우)에 의해 절단될 수 있으며, 절단 결과 MNA자임 2에 대한 파트자임이 용액에 방출됨]; (iv) 기질 Sub2에 의해 불용성 지지체에 고정되어 있는 MNA자임 3에 대한 파트자임[여기서, 상기 Sub2는 MNA자임 2(조립 촉진 인자가 존재할 경우)에 의해 절단될 수 있으며, 절단 결과 MNA자임 3에 대한 파트자임이 용액에 방출됨]; (v) Sub2와 동일한 서열을 가지되, 용액 중에서는 유리된 상태로 존재하고, 형광단(F)과 켄처(Q) 둘 다에 의해 이중으로 표지되는 Sub2-FQ[여기서, 상기 Sub2-FQ는 MNA자임 2에 의해 절단되어 형광 신호를 발생시킬 수 있음].
표적 피분석물이 존재할 경우, 활성 MNA자임 1은 용액 중에 유리된 상태로 존재하던 파트자임으로부터 형성된다. MNA자임 1은 이것의 Sub1을 절단하고, 이로써, MNA자임 2에 대한 파트자임을 방출시킨다. 일단 유리되면, 이 파트자임들은 조립 촉진 인자와 혼성화하여, 유리 Sub2-FQ를 절단하거나(이 경우, 형광 신호가 발생함), 또는 고정된 Sub2를 절단하는(이 경우, MNA자임 3에 대한 파트자임이 방출됨), MNA자임 2를 형성한다. MNA자임 3은 MNA자임 1과 동일한 기질 팔을 가지므로, 고정되어 있던 Sub1도 절단할 수 있으며, 따라서, MNA자임 2에 대한 파트자임을 더욱 많이 방출한다. 그 결과, 더욱 많은 효소(MNA자임)에 대한 성분(파트자임)이 효소에 의해 케스케이드식으로 발생하게 되고, 이에 따라서 신호 증폭 케스케이드도 진행되는 것이다.
12. 메틸화된 핵산의 검출, 동정 및 정량 방법
MNA자임 매개 신호 발생법을 수행함으로써, 완전히 매치되는 핵산 서열과 미스 매치를 포함하는 핵산 서열을 구별할 수 있다. 이러한 작용으로 말미암아, MNA자임을 메틸화된 핵산의 검출, 동정 및 정량하는데 사용할 수 있는 것이다.
질병 예를 들어, 암, 당뇨병, 자가 면역성 질병 및 정신 질환 발생시 메틸화 패턴은 종종 변형된다. 메틸화 분석용으로서 현재 사용되고 있는 대다수의 방법은, 게놈 DNA의 바이설파이트 변형 단계로 시작된다. 바이설파이트 변형법에서는 메틸화된 시티딘이 아닌, 비메틸화 시티딘을 우리딘으로 전환한다. 만일 이후에 바이설파이트 변형된 핵산이 예를 들어, PCR에 의해 증폭되면, 상기 우리딘은 티미딘으로 치환되고, 메틸화된 시티딘은 시티딘에 의해 치환된다. 변형된 앰플리콘은 (원래에는 매틸화되지 않은 C를 함유하는 위치에) T를 함유하는 서열과, (원래에는 메틸화된 C를 함유하는 위치에) C를 함유하는 서열을 구별할 수 있는 다수의 방법에 의해 분석될 수 있다.
밀접하게 관련된 서열 변이들을 구별하는 MNA자임의 능력으로 말미암아, 이 기술은 원래는 메틸화되었거나 또는 비메틸화 바이설파이트 변형 서열들을 구별하는데 매우 적합하다. 이러한 연구법은 실시예 11을 참고로 하였을 때 더욱 잘 이해할 수 있다.
또한, MNA자임은 바이설파이트 변형을 수행하지 않고서도, 메틸화된 DNA와 비메틸화 DNA를 직접 분석할 수 있는 새로운 방법을 제공할 수 있다. 이로써, 까다롭고 시간이 많이 소요되며 분석될 핵산을 파괴시킬 수도 있는 바이설파이트 변형법에 비하여 상당한 이점이 제공된다.
절단형 센서 팔을 가지는 파트자임과 안정화 인자(stabilizer)의 팔을 함께 사용하면, 조립 촉진 인자에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성을 확인할 수 있는 MNA자임의 기능을 입증할 수 있다(실시예 22). 이 실시예에 사용된 실험 조건 하에서, 절단형(5 염기) 센서 팔을 가지는 파트자임은 예상 용융 온도 이상의 온도에서 작용하였다. 안정화 인자 팔을 가지는 시스템과, 절단형 센서 팔을 가지는 파트자임은 표적에 발생하는 미세한 변이에도 매우 민감하게 반응하므로, 매우 엄격한 온도 조건 하에서 사용하기에 적합하다. 이와 같은 검출 기법은, 미리 바이설파이트 변형을 가할 필요 없이, 특정 시토신 잔기에서 메틸화되었거나 또는 비메틸화 표적들을 직접적으로 구별하는데 까지 그 적용 범위를 넓힐 수 있다.
5-메틸시토신(들)이 존재하면, DNA의 용융 온도는, 비메틸화 시토신(들)이 존재하는 경우에 비하여, 메틸화된 염기 당 1.3℃까지 증가한다. 파트자임, 안정화 인자 팔, 그리고 기질이 특정 온도 즉, 메틸화된 표적이 존재하는 경우 혼성화 및 활성 MNA자임 조립에 적당하되, 비메틸화 표적이 존재하는 경우에는 MNA자임 조립에 요구되는 온도보다 훨씬 높은 온도에서 항온 처리될 때, 신호는 메틸화된 표적이 존재하는 경우에만 발생할 것이다. 이로써, 암과 기타 질병에 대한 마커로서 메틸화 염기를 검출하는 방법을 제공할 수 있는, 메틸화 패턴에 관한 새로운 직접 분석 기법이 제공된다.
그러므로, 당 업자는, 본원에 기술된 바와 같이, 온도와 같은 실험 매개 변수를 최적화하는 것은 본 발명의 방법의 범위 내에 포함되며, 또한 이와 같은 최적화를, 특히 메틸화된 DNA를 직접적으로 검출하거나 바이설파이트 변형 이후에 검출하는 것과 관련된 방법을 수행하는데 적용할 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.
13. 핵산 서열 변이체의 검출 방법과 동정 방법
본 발명은 또한 MNA자임 매개 신호 발생으로 말미암아 완전히 매치되는 핵산 서열과 미스 매치 핵산을 포함하는 서열 간 구별이 가능하다는 사실을 기초로 하여, 서열 변이체의 검출 방법 및 동정 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 검출할 수 있는 서열 변이체로서는 부가, 결실, 치환, 전환, 중복, 전좌, 프레임쉬프트 서열 변이체, 넌센스 서열 변이체 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 방법은 핵산 서열 변이체를 검출 및/또는 동정하는 것이 바람직한 임의의 경우, 예를 들어, 질병이나 이 질병에 대한 예후를 진단하거나, 다형성을 동정하거나, 또는 핵산 복제의 신뢰성을 평가하는데 적용될 수 있다. 뿐만 아니라, 더욱 큰 규모의 변이 예를 들어, 다양한 유형의 암과 관련되어 있으며, 융합 전사체를 생성하는 전좌(translocation)도 검출될 수 있다. 이러한 융합 전사체는 백혈병에서 빈번하게 생성된다. 예를 들어, PML/RARα 융합 전사체는 급성 전골수성 백혈병과 관련되어 있고, bcr/abl 융합 전사체는 만성 과립구성 백혈병과 관련되어 있다.
MNA자임-매개 표적 검출법은 파트자임 센서 팔과 조립 촉진 인자의 왓슨-크릭 염기 인식을 통해 이루어질 수 있다. 상보성에 대한 조건은 작은 규모의 서열 변이체, 예를 들어, 파트자임 센서 팔과 조립 촉진 인자 간 단일 염기 미스 매치를 검출하는데 활용될 수 있다. 서열 변이체를 구별하는 능력은 실시예 5, 19 및 22를 참고로 하였을 때 더욱 이해가 잘 될 수 있다.
이러한 실시예들은 모두 센서 팔과 조립 촉진 인자가 완전히 매치되는 경우와, 적어도 염기 미스 매치 또는 다형성이 존재하는 경우를 구별하는 능력을 입증하고 있다.
단일 염기 미스 매치를 구별해 내는 능력은 몇몇 요인 예를 들어, (a) 온도, 염 농도 및 양 이온 농도와 같은 다수의 인자에 의해 영향받을 수 있는 반응 조건의 엄중도, (b) 미스 매치 유형, (c) 파트자임 팔의 내부에 존재하는 미스 매치의 위치, 그리고 (d) 파트자임 팔의 길이에 따라서 달라진다. 분야에 따라서, 반응의 엄중도는 비 관용 수준 또는 관용 수준으로 조정될 수 있는데, 즉, 센서 팔과 조립 촉진 인자 사이의 미스 매치가 일어난 정도로 조정될 수 있다. 엄중한 조건으로 인하여, 밀접하게 관련된 서열 변이체, 예를 들어, 단일 뉴클레오티드에 차이가 있는 변이체를 구별할 수 있다. 엄중도 조건이 낮으면, 밀접하게 관련된 서열을 가지는 조립 촉진 인자들을 구별할 수 없다. 그러므로, 이러한 특성은 하나의 반응에서, 하나의 MNA자임을 사용하여 밀접하게 관련된 서열 군을 동시에 검출하는데 활용될 수 있다.
하나의 뉴클레오티드 다형성은 절단형 센서 팔을 가지는 파트자임을 사용함으로써 더욱 잘 구별될 수 있다(도 23 및 실시예 22). 절단형 센서 팔은 안정화 인자 올리고뉴클레오티드 성분에 의해 안정화될 수 있는데, 이때, 별도의 분자는 그것과 인접하여 결합되어 있는 절단형 파트자임의 제2 성분으로서 간주될 수 있다.
14. 박테리아 및 바이러스의 검출, 동정 및/또는 정량에 사용되는 MNA 자임
본 발명은 예를 들어, 검출, 동정 및/또는 정량하고자 하는 미생물에 특이적인 임의의 분자 예를 들어, 핵산에 혼성화되기에 적합한 MNA자임 센서 팔을 디자인함으로써, 박테리아, 바이러스 또는 기타 임의의 미생물을 검출하는 방법을 포함한다. 부가으로 또는 대안적으로, 미생물 군 예를 들어, 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아가 검출될 수 있다. 당 업자의 기술 범위 내에 속하는 또 다른 변법으로서는, 검출, 동정 및/또는 정량하고자 하는 미생물에 독특한 단백질, 소분자, 세포, 세포 성분 또는 세포 생성물 예를 들어, 독소와 결합하는데 적합한 앱타머를 사용하는 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
박테리아와 바이러스는, MNA자임 기술을 이용하는, 신속하고 정밀한 동정, 검출 및/또는 정량에 사용될 주형을 제공할 수 있는 DNA 및/또는 RNA를 함유한다. 박테리아와 바이러스 종 및 균주 사이의 서열 변이는, 각각의 종과 균주를 미세한 수준으로 구별하는데 사용될 수 있다. 복합적 MNA자임 방법은 다수의 박테리아 또는 바이러스 종, 균주 또는 분리체를 동시에 검출하고/검출하거나 구별하는데 특히 바람직하다.
대안적으로, 박테리아 또는 바이러스 종 및 균주 간 서열 유사성을 가지는 부위는, 단일 MNA자임 검정법에서 각각의 종 및 균주 군 중 임의의 것의 존재 여부를 확인하는데 사용될 수 있다. 상기 후자의 방법은 실시예 15에 예시되어 있는데, 여기서, 박테리아 리보좀 16S 서열에서 살펴볼 수 있는 보존 부위는, 그램 박테리아 균주 테스트를 멸균성 및/또는 미코플라스마 오염 여부에 대한 신속한 방출 테스트로 대체하는 검정법의 기초로서 사용되었다.
HIV-1 바이러스 RNA를 검출 및 정량하기 위해 MNA자임을 사용하는 방법에 대해 기술하고 있는 실시예 16에는, 바이러스 검출 및 정량용으로서 감수성인 도구로서 MNA자임을 사용하는 방법에 관하여 기술되어 있다.
15. 키트
본 발명은 또한 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 통상적으로, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트는 본 발명의 방법을 수행하는데 필수적인 시약 전부를 함유한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 키트는 제1 파트자임 및 제2 파트자임을 포함하는, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 함유하는 제1 용기와, 기질을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 제1 파트자임과 제2 파트자임, 그리고 기질을 MNA자임으로 자체 조립함에 있어서는, 테스트 시료 중에 존재하는 조립 촉진 인자를 결합시킬 필요가 있다. 그러므로, 이러한 구체예에서, 제1 파트자임 및 제2 파트자임과 기질은 테스트 시료에 가하여질 수 있으며, 그 결과, 표적을 포함하는 조립 촉진 인자의 존부를 측정할 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 키트는 또한 예를 들어, 세척 시약 및/또는 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 기타 시약을 함유하는 하나 이상의 기타 용기들도 포함할 것이다.
본 발명의 내용에 있어서, 구획화된 키트는 별도의 용기에 시약이 담겨져 있는 임의의 키트를 포함하고, 작은 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱이나 종이로 만들어진 스트립을 포함할 수 있다. 이러한 용기는 하나의 구획에서 다른 구획으로 시약을 용이하게 운반할 수 있게 해주며, 이때, 시료와 시약이 서로 섞이지 않도록 해줄 뿐만 아니라, 각각의 용기에 있던 제제나 용액을 하나의 구획에서 다른 구획으로, 정량적 방식으로 첨가할 수 있게 해준다. 이러한 키트는 또한 테스트 시료를 담을 용기, 검정법에 사용될 시약을 담는 용기, 세척 시약을 담는 용기, 그리고 검출 시약을 담는 용기를 포함할 수도 있다. 통상적으로, 본 발명의 키트는 또한 적당한 방법을 수행하기 위한 키트의 부품 사용에 관한 지침도 포함할 것이다. 본 발명의 키트와 방법은 자동화된 분석 장치 및 시스템 예를 들어, 실 시간 PCR 장치와 함께 사용될 수 있다.
상이한 표적을 검출, 동정 또는 정량하기 위하여, 본 발명의 키트 하나를 사용할 수 있거나, 또는 예를 들어, 각각의 표적에 특이적인 시약을 함유하는 상이한 키트들도 사용할 수 있다. 본 발명의 방법과 키트는 임의의 물질을 검출, 동정 또는 정량하는데 사용하는 것이 바람직한 임의의 경우에 사용된다.
이하, 본 발명을 다음과 같은 특정 실시예들을 참고로 하여 더욱 상세히 기술할 것인데, 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든지 한정하는 것으로 해석되어서는 절대 안 될 것이다.
이하 실시예에서는, 10:23 DNA자임 또는 8:17 DNA자임 중 어느 하나의 촉매중심부를 나누는 것(splitting)에 바탕을 둔 몇몇 MNA자임 디자인을, 다양한 표적 핵산 및 기질에도 적용하였다(표 3 참조). 이와 같은 표적 기질 시스템은 다양한 반응 조건 하에서 테스트되었으며, 그 결과 견고함이 입증되었다.
이하 실시예에 사용된 대표적인 MNA자임 디자인과 특이적인 파트자임을 표 3에 나열하였다. 파트자임의 명칭(예를 들어, RO4A1/1)은, 표적 도메인에 대한 기준(예를 들어, RPLPO 엑손 4에 있어서는 RO4), MNA자임 촉매 활성에 필요한 도메인(예를 들어, A1), 그리고 기질 도메인(예를 들어, SubBi-1에 있어서는 1)을 참고로 하여 명명한다.
Figure 112008030855340-pct00001
Figure 112008030855340-pct00002
Figure 112008030855340-pct00003
Figure 112008030855340-pct00004
[▲ 표 3a∼표 3d: 작업 실시예에서 사용된 대표적인 MNA자임, 기질 및 특이적 파트자임]
실시예 1: 표적 핵산(인간 RPLPO 서열)을 직접 검출함에 있어서 MNA 자임의 사용
1.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
8:17 DNA자임을 바탕으로 한 MNA자임에 대한 4개의 디자인(도 8∼도 10)을 테스트하였다. 당 업자는 "N"이라 표시된 센서 팔(표적 결합) 서열이 임의의 핵산 표적에 대한 표적-특이적 서열로 치환될 수 있음을 알 것이다(도 8∼도 10). 리포터 기질과 계합하는 기질 팔 서열은 일반적인 것이어서 다수의 표적에 대해 사용될 수 있다. 당 업자는 "N"이라 표시된 기질 서열(도 8∼도 10)이 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 키메라 서열로 치환될 수 있으며, "r"이라 표시된 기질 서열들은 기타 리보뉴클레오티드 서열 및/또는 상이한 수의 리보뉴클레오티드 서열로 치환될 수 있음을 알 것이다.
도 8∼도 10에 도시된 바와 같이, RPLPO MNA자임의 촉매 활성을 측정하기 위해 수행된 실험에 있어서는, A 및 B 올리고뉴클레오티드 파트자임을 RPLPO 유전자의 엑손 4를 표적화하도록 디자인하였다. A 및 B 파트자임의 서열을 이하에 5'에서 3' 방향으로 나열하였는데, 여기서, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 활성 촉매 중심 부분의 적어도 일부를 형성하는 것이고, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적과 혼성화하는 것이며, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 것이다.
서열 번호 1: 파트자임 A1 RO4A1/1:
GCTGGTCATCCAGCA CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 2: 파트자임 A2 RO4A2/1:
GCTGGTCATCCAGCAG CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 3: 파트자임 B1 RO4B1/1:
CATCTCTTCT CCGTCGAA GTGTTCGACAATGGC
서열 번호 4: 파트자임 B2 RO4B2/1:
CATCTCTTCT CCG GTGTTCGACAATGGC
서열 번호 5: 파트자임 B3 RO4B3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC GTGTTCGACAATGGC
1.2. 리포터 기질
이중으로 표지된 핵산 리포터 기질을 절단하여 MNA자임 활성을 관찰한다. 이 기질 서열은 RNA 염기와 DNA 염기 둘 다를 함유하는 키메라 서열로서, 8:17 DNA자임 기질로서 사용되었던 서열이다[Li외 다수, 2000]. 본 실시예에서는, 리포터 기질을 SubBi-1-FB라 명명하였는데, 이는 내부 표지 즉, 6-카복시플루오레세인("6-FAM")이 RNA 염기의 5' 말단 뉴클레오티드에 부착되어 있고, 블랙홀 켄처 1("BHQ 1") 부분은 이 RNA 염기의 3' 말단 뉴클레오티드에 부착되어 있다. MNA자임으로 SubBi-1-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. SubBi-1-FB의 표지된 서열을 이하에 5'에서 3' 방향으로 나타내었는데, 여기서, 밑줄친 염기는 6-FAM과 BHQ1 부분의 위치를 나타내는 것이다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 6: SubBi-1-FB :
ACTCACTATaGGAAGAGATG
1.3. 대조군 MNA 자임 서열
촉매 중심 부분을 형성하는데 필수적인 A1 올리고뉴클레오티드 내 하나의 염기를 돌연 변이시킴으로써 혼성화 대조군(불활성 MNA자임)을 불활성화시켰다. 비록 리포터 기질과 표적 서열 둘 다는 MNA자임과도 결합할 수 있지만, 이 기질은 MNA자임의 촉매 중심이 변형되었기 때문에 절단될 수 없다. 리포터 기질과 파트자임 분자가 결합하면 그 자체로서, 혼성화에 따른 리포터 기질의 형태 변화로 인한 형광도를 측정할 수 있다. 돌연 변이된 A1 파트자임 분자(RO4A1mut)를 사용하는 대조군을 혼성화 대조군에 포함되도록 디자인하였다. 돌연 변이된 MNA자임 서열을 이하에 제시하였으며, T로 변이된 G 염기의 위치에는 밑줄을 그어 표시하였다.
서열 번호 7: 돌연 변이 파트자임 A
R04A1mut/1: GCTGGTCATCCAGCACGGTCTAAATAGTGAGT
1.4. 표적
본 실시예에 대한 표적 서열은 올리고뉴클레오티드, RO4/1 표적으로서, 이는 인간 RPLPO 유전자의 엑손 4 구획과 동일한 서열을 가지는 것이다. RO4/1 표적의 서열은 다음과 같다(5'→3').
서열 번호 8: R04/1 표적:
GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC
올바르지 못한 표적 서열이 존재할 때 신호가 검출될 수 없음을 확인하기 위하여, 3㎍의 람다 DNA(PROMEGA) 또는 비 관련 서열의 합성 네거티브 대조군 올리고뉴클레오티드(RO4/1mut 표적)를 사용하여 "표적 외(off-target)" 효과를 측정하였다.
서열 번호 9: R04/1mut 표적 :
CGACCATTAGGTCGTCCACAAGCTGTTACCG
1.5 반응 성분
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호의 증가 정도로써 표적 서열을 검출하였다. 반응은 기질을 첨가함으로써 시작되었으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 모든 반응을 온도 40℃의 스마트사이클러(SmartCycler)® 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid) 내에서 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도를 총 10분 동안 7초마다 판독하였다. 표 4의 모든 반응물은 1μM의 SubBi-1-FB(Tris HCl 중)(pH 9.0, 25℃)과 25 mM MgCl2의 다량의 혼합물을 포함하였다.
Figure 112008030855340-pct00005
[▲ 표 4: 핵산 검출용 반응 성분들]
실험 중 사용된 스마트사이클러® 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)의 웰에 담겨 있는 각각의 반응물을, 우선 이것의 형광도 백그라운드 수준에 대해 테스트하였는데, 그 이유는 웰 간 형광도는 매우 상이한 것으로 알려져 있기 때문이다. 다량의 혼합물 단독의 형광도를 판독함으로써 백그라운드 수준을 측정하였다. 이후, 상기 값을, 웰 간 비교가 가능하도록 웰 내에서 수행된 기타 모든 반응에 의한 형광도로부터 공제하였다.
1.6. 결과: SubBi -1- FB 리포터 기질의 절단 여부 검출
본 실험을 수행할 때에는 리포터 기질이 표적 의존적으로 절단된다는 미미한 증거가 디자인 1 및 디자인 2 MNA자임으로부터 발견되었다(도 8). 형광도는 표적 RPLPO 올리고뉴클레오티드 표적 존재할 때와 존재하지 않을 때의 반응의 형광도와 유사하였다. 표적 RPLPO 올리고뉴클레오티드를 첨가하면, 디자인 3에 대한 형광도(도 9 및 도 10)와 디자인 4에 대한 형광도(도 10)가 증가하였다. 이는, 표적 핵산이 존재할 경우 활성 MNA자임이 형성되면 형광단과 켄처 염료 쌍 사이에 있는 리포터 기질이 절단되며, 그 결과, 형광도가 증가한다는 사실과 일치하는 결과이다. 표적을 함유하지 않는 대조군의 형광도는 표적을 함유하는 반응물의 형광도보다 낮았으며, 대조군 반응에서는 시간이 경과함에 따라서 형광도가 증가하지 않았다(도 8∼도 10). 이로써, 표적-함유 반응에서 발생하는 형광도는, 이후 리포터 기질을 절단하는 촉매 활성 MNA자임의 표적 의존적 조립에 의해 증가함을 알 수 있다. 디자인 4의 절단 효율은 RPLPO 시스템에 있어서 디자인 3의 절단 효율보다 컸다(도 10).
표적 외, 혼성화 파트자임 A만을 포함하는 대조군 반응물과 파트자임 B만을 포함하는 대조군 반응물을 디자인 3으로서 나타내었다(도 9). 이 대조군의 형광도 수준은 표적을 함유하지 않는 반응물의 형광도 수준보다 낮거나 또는 이와 유사하였다. 대조군 반응에서는 시간이 경과함에 따라서 형광도가 증가하지 않았다. 이러한 결과를 통해, 리포터 기질의 절단은 활성 MNA자임의 조립에 필요한 파트자임 A 올리고뉴클레오티드 및 파트자임 B 올리고뉴클레오티드 둘 다의 존재에 의존적이라는 사실이 추가로 밝혀졌다.
실시예 2: miR -20 또는 miR -20에 상동성인 짧은 DNA 서열의 검출용인 MNA 자임.
2.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
MNA자임을 사용하는 검출법은 또한 miR을 분석하는데에도 사용될 수 있다. 본 실시예에서, MNA자임은 올바른 miR 서열이 존재할 때에만 형성된다. 이 MNA자임은 관련 miR 서열 예를 들어, hsa-miR-20과 hsa-miR-93을 구별할 수 있다.
도 11에 도시된 MNA자임의 촉매 활성을 측정하기 위해 수행된 실험에서, A 및 B 파트자임 올리고뉴클레오티드는 hsa-miR-20을 표적화하도록 디자인되었다. 파트자임 A 및 B 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 5'에서 3' 방향으로 제시하였다. 이 서열에 있어서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 10: 파트자임 A2 :
miR20A2/1: TACCTGCACTA CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 11: 파트자임 B3 :
miR20B3/1: CATCTCTTCT CCGAGC TAAGCACTTTA
2.2 리포터 기질
이중으로 표지된 핵산 리포터 기질을 절단함으로써 MNA자임 활성이 관찰된다. 본 실시예에 있어서 리포터 기질은 이하와 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-1-FB이다. 아래의 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 밑줄친 염기들 중 5' 말단 쪽은 6-FAM 부분의 위치를 나타내는 것이고, 3' 말단 쪽은 BHQ1 부분의 위치를 나타내는 것이다. FAM과 BHQ1 사이의 리보뉴클레오티드에 있는 SubBi-1-FB를 절단하여 형광도 변화를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다.
서열 번호 6: SubBi-1-FB:
ACTCACTATaGGAAGAGATG
2.3 표적
본 실시예의 표적 서열은 DNA 올리고뉴클레오티드 D-20으로서, RNA hsa-miR-20 종에 상동성인 서열을 가지는 것이었다(도 11(i)). D-20 표적 서열을 이하에 5'에서 3' 방향으로 제시하였다.
서열 번호 12: D-20 표적:
TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
2.4 대조군 서열
마이크로 RNA를 검출하도록 개발된 임의의 검정법은 원하는 miR 서열 예를 들어, hsa-miR-20을, 표적 miR과 하나 이상의 염기가 상이할 수 있는 관련 서열 예를 들어, hsa-miR-17-5p와 특이적으로 구별할 수 있어야 한다(도 11(i)). hsa-miR-20 관련 "표적 외" 17-5p, 93, 106a 및 106b miR 올리고뉴클레오티드는 또한 DNA로서 합성되었는데, 이를 이하에 5'에서 3' 방향으로 제시하였다.
서열 번호 13: D-17-5p 표적 :
CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT
서열 번호 14: D-93 표적:
AAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG
서열 번호 15: D-106a 표적:
AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGC
서열 번호 16: D-106b 표적:
TAAAGTGCTGACAGTGCAGAT
2.5 반응 조건
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호의 증가 여부에 의해 표적 서열을 검출하였다. 반응은 기질을 첨가함으로써 시작되었으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 모든 반응을 온도 40℃인 스마트사이클러® 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid) 내에서 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도를 총 4분 동안 7초마다 판독하였다. 표 5의 모든 반응물에는 1μM의 SubBi-1-FB(Tris HCl 중)(pH 9.0, 25℃)와 25 mM MgCl2의 다량의 혼합물을 포함하였다.
도 11에 나타낸 핵산 표적의 검출을 위한 반응의 반응물 성분
MNA자임 반응 주형 파트자임 A 파트자임 B
표적 1μM D-20 1μM miR 20A2/1 1μM miR 20B3/1
표적 비포함 H2O
표적 외 17-5p 1μM D-17-5p
표적 외 D-93 1μM D-93
표적 외 D-106a 1μM D-106a
표적 외 D-106b 1μM D-106b
A 파트자임 단독 함유 1μM D-20 1μM miR 20A2/1 -
B 파트자임 단독 함유 1μM D-20 - 1μM miR 20B3/1
본 실험 중 사용된 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)의 웰에 담겨 있는 각각의 반응물을, 우선 이것의 형광도 백그라운드 수준에 대해 테스트하였는데, 그 이유는 웰 간 형광도는 매우 상이한 것으로 알려져 있기 때문이다. 다량의 혼합물 단독의 형광도를 판독함으로써 백그라운드 수준을 측정하였다. 이후, 상기 값을, 웰 간 비교가 가능하도록 웰 내에서 수행된 기타 모든 반응에 의한 형광도로부터 공제하였다.
또한, 농도 5mM 및 100mM의 MgCl2 존재 하에서 표적-함유 반응, "표적 비포함" 및 "표적 외" 반응을 수행하고, 그 결과들을 25mM MgCl2와 비교하였다(도 12).
2.6 결과: SubBi -1- FB 리포터 기질의 절단 여부 확인
MNA자임의 파트자임 A 및 파트자임 B 올리고뉴클레오티드는 촉매 활성 MNA자임으로 조립하여, 표적 서열이 존재하는 경우에만 리포터 기질을 절단한다. 본 실시예에서, 표적 외 대조군은 센서 팔에 2개의 미스 매치된 염기들을 가진다(miR-20 표적 결합 서열). 상기 "표적 외" D-17-5p는 2개의 미스 매치된 염기들을 가지는데, 이들 중 하나만이 상기 miR-20 서열의 중간 부분에 위치하는 가장 독특한 부위에 존재한다. 표적 서열 D-20을 포함하는 절단 반응 결과, 표적이 함유되지 않은 대조군에 비하여, 신호가 26배 증가하였다(도 11 (iii)). 이는 표적 외 대조군 D-17-5p 및 D-106a와 비교되는 결과인데, 즉, 표적을 함유하지 않는 대조군에 비해서는 3.5배 증가하였으며, D-93 및 D-106b를 함유하는 경우에는 표적을 함유하지 않는 대조군에 비해 신호가 증가하지 않았다(도 11 (iii)). 그러므로, 관련 서열과 D-20의 차이점을 통해, MNA자임 시스템이 소수의 염기만 상이한 서열들을 구별하는 능력을 입증할 수 있다. 단일 분자 DNA자임을 사용하는 이전의 연구를 통해서는, DNA자임이 하나의 염기가 돌연 변이된 경우를 구별할 수 있는 능력을 가진다는 사실이 입증된바 있다[Impey외 다수, 2000]. MNA자임은 또한 하나의 염기만이 변이된 경우도 구별할 수 있다(이하, 실시예 5 참조).
"파트자임 A만을 함유하는" 대조군과 "파트자임 B만을 함유하는" 대조군은 백그라운드 형광도 수준과 유사한 수준의 형광도를 나타냈다(데이터는 제시하지 않음).
단백질 효소를 사용하는 반응에서는 기타 시약도 단백질 효소 활성에 최적인 농도만큼 필요하다. 예를 들어, DNA자임이 리포터 기질을 절단하는 것을 도와주는 금속 이온 보조 인자의 농도는 중합 효소와 같은 효소를 사용하는 방법에 있어서 최소 수준으로 유지된다. MNA자임을 사용하여 직접 검출하는 방법에서는 어떠한 단백질 효소도 필요하지 않으므로, 반응 조건은 신속한 기질 절단에 대해 최적화될 수 있다. 이 반응에서, 금속 이온 보조 인자 예를 들어, Mg2 +는 MNA자임 촉매화 비율을 최적화시키기 위해 증가할 수 있다. 도 12에서는, 어떻게 표적 검출 방법에서 일반적으로 관용될 수 없는 수준으로 MgCl2 농도가 증가할 수 있는지를 보여주고 있다. MgCl2가 고 농도(100mM)로 존재하면, MNA자임의 촉매 효율은 더욱 높아진다. 뿐만 아니라, D-20 표적을 검출할 때, MgCl2 농도가 증가하면 반응의 특이성에 영향을 미치지 않았는데, 그 이유는 D-20 표적은 여전히 관련 서열 D-17-5p, 표적 D-106a 표적, D-93 표적 및 D-106b 표적과 명백히 구별될 수 있기 때문이다.
실시예 3: 핵산 표적의 직접 검출용인 MNA 자임(디자인 5 및 디자인 6)
3.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
MNA자임에 대한 디자인 5 및 디자인 6(10:23 DNA자임을 바탕으로 함)을 촉매 활성에 대해 테스트하였다(도 13). 당 업자는 "N"이라 표시된 센서 팔(표적 결합) 서열은 공지된 임의의 핵산 표적에 대한 표적-특이적 서열에 의해 치환될 수 있음을 알 것이다. 리포터 기질과 계합하는 기질 팔 서열은 일반적인 것으로서, 다수의 표적에 대해 사용될 수 있다. 당 업자는 도 13에 "N"이라 표시된 기질 서열이 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 키메라 서열에 의해 치환될 수 있음도 알 것이다.
도 13에 도시된 RPLPO MNA자임의 촉매 활성을 측정하고자 실시된 본 실험에서, A 및 B 올리고뉴클레오티드 파트자임은 RPLPO 유전자의 엑손 5를 표적화하도록 디자인하였다. A 파트자임 및 B 파트자임의 서열을 이하에 5'에서 3' 방향으로 제시하였는데, 여기서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다. 서열 번호 17 및 서열 번호 18의 서열에 있어서, 밀줄 쳐지지도, 굵은 글씨로 표시되지도 않았거나 또는 이탤릭체로 나타내지도 않은 서열들은 줄기 구조 예를 들어, 도 13에 도시된 바와 같은 구조를 형성하는 것이 바람직하다(예를 들어, 디자인 5 참조).
서열 번호 17: 파트자임 A3 RO5A3/2:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCCGCACAACGA GAGGAAACCTT
서열 번호 18: 파트자임 B4 RO5B4/2:
TGCCCAGGGA GGCTAGCTGCGGTGGAGACGGATTACACCTTC
서열 번호 19: 파트자임 A4 RO5A4/2:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GAGGAAACCTT
서열 번호 20: 파트자임 B5 RO5B5/2:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT GTGGAGACGGATTACACCTTC
3.2. 리포터 기질
본 실시예에 있어서 리포터 기질은 다음과 같은 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-2이다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
3.3 표적 서열
본 실시예에 대한 표적 서열은 이하에 제시된 바와 같은 서열(5'→3')을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드 RO5/1 표적이었다. 이 표적 서열은 RPLPO 유전자의 한 구획인 엑손 5와 동일한 서열을 가진다.
서열 번호 22 RO5/1 표적:
GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
3.4. 반응 성분
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호의 증가 정도로써 표적 서열을 검출하였다. 반응은 기질을 첨가함으로써 시작되었으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 모든 반응을 온도 40℃의 스마트사이클러® 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid) 내에서 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도를 총 5분 동안 7초마다 판독하였다. 표 6의 모든 반응물은 1μM의 SubBi-2-FB(Tris HCl 중)(pH 9.0, 25℃)와 25 mM MgCl2를 포함하였다.
도 13에 나타낸 핵산 표적의 검출용 반응 성분들
디자인 파트자임 A
(1μM)		 파트자임 B MNA자임 반응 표적
5 RO5A3/2 RO5B4/2
(1μM)		 표적 함유 1μM RO5/1
표적 비포함 H2O
6 RO5A4/2 RO5B5/2 표적 함유 1μM RO5/1
표적 비포함 H2O
본 실험 중 사용된 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)의 웰에 담겨 있는 각각의 반응물을, 우선 이것의 형광도 백그라운드 수준에 대해 테스트하였는데, 그 이유는 웰 간 형광도는 매우 상이한 것으로 알려져 있기 때문이다. 다량의 혼합물 단독의 형광도를 판독함으로써 백그라운드 수준을 측정하였다. 이후, 상기 값을, 웰 간 비교가 가능하도록 웰 내에서 수행된 기타 모든 반응에 의한 형광도로부터 공제하였다.
3.5. 결과: 기질의 검출 및 절단
디자인 5 및 디자인 6의 MNA자임을 사용하는 표적-함유 반응 결과, 표적을 함유하지 않는 대조군(도 13 ii)(각각 상부 패널 및 하부 패널)에 비하여, 경시적 형광도는 증가하였음을 알 수 있었다. 이로써, 파트자임 올리고뉴클레오티드들은 촉매 활성 MNA자임으로 조립하여, 표적 서열이 존재하는 경우에만 리포터 기질을 절단한다는 것을 입증할 수 있다. 표적을 함유하지 않는 대조군에서는 형광도가 증가하지 않았는데, 이는 곧, 절단이 일어나지 않았음을 나타내는 것이다. 디자인 6에 대한 절단 속도는 디자인 5에 비하여 상당히 신속하였다.
실시예 4: MNA 자임을 사용하는, 핵산 서열의 시험관 내 PCR 증폭법으로 생성된 앰플리콘의 검출
4.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
MNA자임은 또한 시험관 내 증폭된 핵산 서열로부터 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수도 있다. 본 실시예에서, 앰플리콘 검출은 2개의 단계로 수행되되, 하나의 반응으로 진행된다. 본 경우에 있어서, 앰플리콘을 검출하는데 사용된 올리고뉴클레오티드는 인간 RPLPO 유전자를 검출하는 올리고뉴클레오티드 RO4A2/1 및 RO4B3/1을 사용하는 디자인 4에 바탕을 두었다(도 10). A 파트자임 및 B 파트자임 올리고뉴클레오티드를 이하에 제시하였다. 다음과 같은 서열에서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 2: 파트자임 A2 RO4A2/1:
GCTGGTCATCCAGCAG CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 5: 파트자임 B3 RO4B3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC GTGTTCGACAATGGC
4.2. 리포터 기질
본 실시예에 있어서 리포터 기질은 이하와 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-1-FB이다. 아래의 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 밑줄친 염기들 중 5' 말단 쪽은 6-FAM 부분의 위치를 나타내는 것이고, 3' 말단 쪽은 BHQ1 부분의 위치를 나타내는 것이다. SubBi-1-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다.
서열 번호 6: SubBi-1-FB:
ACTCACTATaGGAAGAGATG
4.3. PCR 에 의한 인간 RPLPO 유전자의 증폭을 위한 프라이머
본 실시예의 표적 서열을, 이하에 제시된 PCR 프라이머를 사용하여, K562(PROMEGA) 세포주로부터 추출된 인간 게놈 DNA로부터 유래하는 RPLPO 유전자의 엑손 4로부터 유래하는 서열을 시험관 내 PCR 증폭시켜 생산하였다.
서열 번호 23: 프라이머 5RO4/3:
CAAGACTGGAGACAAAGTG
서열 번호 24: 프라이머 3RO4/2:
GCAGAGTTTCCTCTGTGATA
4.4 대조군 표적 올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드를 합성하여, RPLPO 서열에 대한 포지티브 대조군으로서 사용하였다. 본 실험에서는 대조군 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭할 수 없었다.
서열 번호 8: R04/1 표적:
GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC
4.5. 반응 성분: RPLPO 유전자의 PCR 증폭법
총 반응물 부피 25㎕에서 RPLPO 유전자를 PCR 증폭하였다. 모든 증폭 반응은 진앰프(GeneAmp)® PCR 시스템 9700 열 사이클 반응기(Applied Biosystems) 내에서 수행되었다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 95℃, 7분 → 95℃, 5초 및 65℃ 30초(10회)(1 사이클당 온도는 1℃씩 증가) → 95℃, 5초 및 55℃, 30초(50회). 전 반응은 40nM 5R04/3 및 200nM의 3RO4/2, 3mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 1×이모완충액(Immobuffer; Bioline) 및 1 유닛의 이몰라제(Immolase; Bioline)을 함유하였다[500 ng의 K562 인간 게놈 DNA(PROMEGA)는 포함하거나 포함하지 않음].
4.6 반응 성분: 표적 서열의 검출
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생되는 형광 신호의 증가 정도로써 표적 서열을 검출하였다. 반응은 기질을 첨가함으로써 시작되었으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 모든 반응을 온도 40℃의 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid) 내에서 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도를 총 10분 동안 7초마다 판독하였다. 표 7의 모든 반응물은 1μM의 SubBi-1-FB(Tris HCl 중)(pH 9.0, 25℃)과 25 mM MgCl2의 다량의 혼합물을 포함하였다. 올리고뉴클레오티드 파트자임 A 및 B의 농도는 1μM이다.
시험관 내 PCR 이후 RPLPO DNA 앰플리콘 검출용 반응 성분들.
MNA자임 시스템에서는 디자인 4(RO4A2/1:RO4B3/1)를 사용하였음.
RPLPO MNA자임 반응 표적
표적-올리고(포지티브 대조군 RPLPO) 1012개의 복사체의 RO4/1 표적 올리고머
표적-PCR 생성물 RPLPO(테스트) RPLPO PCR 생성물 5㎕
(게놈 DNA 100ng과 동량)
표적 비포함(네거티브 대조군 RPLPO) 5㎕ H2O
증폭되지 않은 게놈 DNA(네거티브 대조군) 500ng의 게놈 DNA를 함유(5㎕)
본 실험 중 사용된 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)의 웰에 담겨 있는 각각의 반응물을, 우선 이것의 형광도 백그라운드 수준에 대해 테스트하였는데, 그 이유는 웰 간 형광도는 매우 상이한 것으로 알려져 있기 때문이다. 다량의 혼합물 단독의 형광도를 판독함으로써 백그라운드 수준을 측정하였다. 이후, 상기 값을, 웰 간 비교가 가능하도록 웰 내에서 수행된 기타 모든 반응에 의한 형광도로부터 공제하였다.
4.7. 결과: SubBi -1- FB 리포터 기질의 절단 여부 확인
PCR에 의해 표적 RPLPO 서열이 인간 게놈 DNA로부터 증폭되었을 때, RPLPO 검출용 MNA자임 디자인 4(엑손 4)는 경시적으로 형광도가 증가하였음을 알 수 있었다(도 14). RPLPO 앰플리콘에 대해 관찰된 형광도 증가율은 포지티브 대조군 RO4/1 표적 올리고뉴클레오티드 1012개의 복사체에 대해 관찰된 형광도 증가율과 유사하였다. 표적을 함유하지 않는 대조군의 형광도는 표적을 함유하는 반응물의 형광도보다 낮았으며, 네거티브 대조군 반응물은 어떠한 것도 경시적으로 형광도가 증가하지 않았다. 이로써, 표적-함유 반응물에서 발생한 형광도는, 이후에 리포터 기질을 절단할 촉매 활성 MNA자임이 표적 의존적 방식으로 조립됨에 따라서 증가한다는 사실이 입증되었다.
실시예 5: 짧은 핵산 서열의 시험관 내 PCR 증폭법에 의해 생산된 앰플리콘 을 검출함에 있어서 MNA 자임의 사용
5.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
MNA자임은 시험관 내 증폭된 핵산 서열로부터 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있다. 이 실시예에서, 증폭 및 검출은 3 단계 방법으로 수행되지만(도 5), 역전사, PCR 증폭 및 검출은 하나의 반응 튜브 내에서 동시에 수행될 수도 있었다. 본 실시예에 있어서, 앰플리콘을 검출하는데 사용된 올리고뉴클레오티드는, hsa-miR-20을 검출하도록 디자인된 디자인 4, miR 파트자임 A 및 B 올리고뉴클레오티드였다(도 11). MNA자임 파트자임 올리고뉴클레오티드를 이하에 제시하였는데, 여기서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 10: 파트자임 A2 miR20A2/1:
TACCTGCACTA CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 11: 파트자임 B3 miR20B3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC TAAGCACTTTA
5.2. 리포터 기질
본 실시예에 있어서 리포터 기질은 이하와 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-1-FB이다. 아래의 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 밑줄친 염기들 중 5' 말단 쪽은 6-FAM 부분의 위치를 나타내는 것이고, 3' 말단 쪽은 BHQ1 부분의 위치를 나타내는 것이다. SubBi-1-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다.
서열 번호 6: SubBi-1-FB:
ACTCACTATaGGAAGAGATG
5.3. 22 올리고머 D-20 올리고뉴클레오티드 표적 서열 증폭용 PCR 프라이머
본 실시예의 표적 서열은 이하에 제시한 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여, D-20 올리고뉴클레오티드를 시험관 내 증폭시켜 생산하였다.
서열 번호 25: 프라이머 5miR20/1:
ACGTGACGCTAAAGTGCT
서열 번호 26: 프라이머 3miR20/L1:
CGTCCGAATGACGTACCTGCAC
서열 번호 27: 프라이머 3miR20/P1:
CGAATGACGTACCTGCAC
5.4. 표적 서열 및 대조군
miR-20과 상동성인 DNA 서열(D-20 표적)을, PCR 및 MNA자임을 이용하여 짧은 서열을 증폭 및 검출할 수 있음을 입증하기 위한 주형으로서 사용하였다.
서열 번호 12: D-20 표적:
TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
뿐만 아니라, 잘못 증폭되었으며, 밀접하게 관련된 "표적 외" 서열이 miR-20 시스템으로 검출될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 대조군 표적 DNA 올리고뉴클레오티드 D-17-5p 표적도 miR-20 파트자임 A 및 B 올리고뉴클레오티드 시스템으로 테스트하였다.
서열 번호 13: D-17-5p 표적:
CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT
5.5 반응 성분: 표적 서열의 증폭
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열의 PCR 증폭을 수행하였다. 모든 증폭 반응은 진앰프(GeneAmp)? PCR 시스템 9700 열 사이클 반응기(Applied Biosystems) 내에서 수행되었다. 단계 1 및 단계 2(역전사 및 PCR)에 대한 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 42℃, 30분 → 95℃, 7분 → 95℃, 5초 및 30℃ 30초(10회)(1 사이클당 온도는 2℃씩 증가) → 95℃, 5초 및 50℃, 30초(50회). 반응은 처음에 10nM의 3miR20/L1만을 함유하였으나, 이후 42℃에서 30분 동안 상기 반응을 잠시 중단시키고, 여기에 30nM 3miR20/P1 및 200 nM의 5miR20/1을 첨가하였다. 초기의 반응 혼합물에는 3mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 1×이모완충액(Bioline) 및 1 유닛의 이몰라제(Bioline)를 함유하였으며, 또한 이외에도 a) 108개의 복사체만큼의 D-20 표적도 함유하였거나, 또는 b) 표적을 함유하지 않았거나(dH2O), 아니면 c) 108개의 복사체만큼의 표적 외 DNA(D-17-5p 표적)를 함유하였다.
5.6. 반응 성분: 표적 서열의 검출
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호의 증가 정도로써 표적 서열을 검출하였다. 반응은 기질을 첨가함으로써 시작되었으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 모든 반응을 온도 40℃의 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid) 내에서 수행하였다. 각 반응물에 대한 형광도를 총 10분 동안 7초마다 판독하였다. 표 8의 모든 반응물은 1μM의 SubBi-1-FB(Tris HCl 중)(pH 9.0, 25℃)와 25 mM MgCl2의 다량의 혼합물을 포함하였다. 파트자임 A 및 B의 농도는 1μM이었다.
시험관 내 증폭된 짧은(20∼25 올리고머) 핵산 서열 검출용 반응 성분.
MNA자임 시스템에서는 디자인 4(miR20A2/1:miR20B3/1)를 사용함.
MNA자임 반응 표적
miR-20 표적-올리고뉴클레오티드
(포지티브 대조군 miR20)		 1012개의 복사체만큼의 D-20 표적(5㎕)
(증폭되지 않음)
miR-20 표적-PCR 생성물
(테스트)		 D-20 PCR 생성물(25㎕의 반응물로부터 5㎕ 취함)
(PCR에 의해 증폭된 D-20 표적 2×107개 복사체
만큼과 동량임)
miR-20 표적-올리고뉴클레오티드
(대조군 비 증폭 D-20)		 108개의 복사체만큼의 D-20 표적(5㎕)
(증폭되지 않음)
표적 비포함
(네거티브 대조군 miR20)		 5㎕의 H2O
표적 외
(miR20에 대한 표적 외 대조군)		 D-17-5p PCR 생성물
(25㎕의 반응물로부터 5㎕ 취함)
(PCR에 의해 증폭된 D-17-5p 표적 2×107개 복사체
만큼과 동량임)
본 실험 중 사용된 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)의 웰에 담겨 있는 각각의 반응물을, 우선 이것의 형광도 백그라운드 수준에 대해 테스트하였다. 이후, 상기 값을, 웰 간 비교가 가능하도록 웰 내에서 수행된 기타 모든 반응에 의한 형광도로부터 공제하였다.
5.7. 결과: SubBi -1- FB 리포터 기질의 절단 여부 검출
miR-20을 검출하기 위한 MNAzyme 디자인 4의 경우, 사용된 표적 서열이 PCR에 의해 증폭된 D-20이었을 때, 시간이 경과 함에 따라서 형광도를 증가시켰음을 알 수 있었다(도 15(i)).
표적을 함유하지 않는 대조군의 형광도는 표적을 함유하는 반응물의 형광도보다 낮았으며, 네거티브 대조군의 경우에는 그 어느 것도, 시간이 경과함에 따라서 형광도가 증가하지 않았다. 이로써, 표적-함유 반응물에서 발생하는 형광도는, 이후에 리포터 기질을 절단할 촉매 활성 MNA자임이 표적 의존적으로 조립됨에 따라서 증가함이 입증되었다.
본 실시예에서의 표적 외 대조군(D-17-5p)도 miR-20 프라이머로 증폭시켰는데, 그 이유는 상기 대조군은 miR-20 프라이머와 혼성화하는 부위 내에 존재하는 말단부 위치에 오로지 하나의 미스 매치가 일어나기 때문이다. D-20 표적 및 D-17-5p 표적 둘 다가 증폭되었음이 전기 영동에 의해 확인되었다. 상기 두 앰플리콘은 말단부에 프라이머 서열이 통합되었으므로, 이 앰플리콘은 중간 부위의 염기 하나만이 상이하였다. MNA자임은 D-20 및 D-17-5p 앰플리콘 둘 다를 성공적으로 구별하였다. 이와 같이 구별될 수 있었던 이유는, 도 15(ii)에 도시된 바와 같이, 프라이머 사이에 존재하는 D-20 및 D-17-5p 앰플리콘의 특정 부위 중 하나의 뉴클레오티드가 상이하기 때문이다. MNA자임은 현존하는 프라이머 사이에 4개의 염기가 존재하여야 하며[이로써, 프라이머 이량체와 실제로 사용되는 앰플리콘이 구별 가능함], 이와 같은 4개의 염기들은 치환이 일어나지 않은 상태로 정확히 일치하여야 한다. 본 실시예를 통해,밀접하게 관련된 서열(오로지 하나의 뉴클레오티드만이 다형성을 가진다는 점에서 상이한 서열 포함)들을 상호 구별할 수 있는 MNA자임의 능력을 입증할 수 있다.
실시예 6: 총 RNA 의 시험관 내 PCR 증폭법에 의해 생산된 마이크로 RNA 앰플 리콘을 검출함에 있어서 MNA 자임의 사용
6.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
MNA자임은 시험관 내 증폭된 핵산 서열로부터 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 실시예에서는, 증폭 및 검출을 2-단계 방법으로 수행하였는데(도 5), 여기서, 역전사와 PCR 증폭은 제1 튜브에서 행해졌고, 이후, MNA자임 매개 검출은 제2 튜브 내에서 행해졌다. 본 실시예에 있어서, 앰플리콘을 검출하는데 사용된 올리고뉴는 디자인 4, miR 파트자임 A 및 B 올리고뉴클레오티드였는데(도 11), 이 올리고뉴클레오티드는 hsa-miR-20을 검출하도록 디자인된 것이다. MNA자임 파트자임 올리고뉴클레오티드를 이하에 제시하였으며, 여기서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 10: 파트자임 A2 miR20A2/1:
TACCTGCACTA CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 11: 파트자임 B3 miR20B3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC TAAGCACTTTA
6.2. 리포터 기질
본 실시예에서의 리포터 기질은 이하와 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-1-FB이다. 아래의 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 밑줄친 염기들 중 5' 말단 쪽은 6-FAM 부분의 위치를 나타내는 것이고, 3' 말단 쪽은 BHQ1 부분의 위치를 나타내는 것이다. SubBi-1-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다.
서열 번호 6: SubBi-1-FB:
ACTCACTATaGGAAGAGATG
6.3. hsa - miR -20 증폭용 PCR 프라이머
본 실시예의 표적 서열은, 이하에 나열된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머들을 사용하여 인간 흉선 총 RNA(앰비온; Ambion)의 시험관 내 증폭에 의해 생산되었다.
서열 번호 25: 프라이머 5miR20/1:
ACGTGACGCTAAAGTGCT
서열 번호 26: 프라이머 3miR20/L1:
CGTCCGAATGACGTACCTGCAC
6.4. 표적 서열 및 대조군
인간 흉선 총 RNA(앰비온)를, miR-20 증폭용 주형으로서 사용하였으며, 이후, MNA자임을 사용하여 앰플리콘을 검출하였다(섹션 6.6 참조).
miR-20과 상동성인 RNA 서열(R-20 표적)을 짧은 서열의 증폭 여부를 입증하고, 결과로 생성된 앰플리콘을 MNA자임을 사용하여 검출하기 위한 포지티브 대조군으로 사용하였다.
서열 번호 28: R-20 표적:
uaaagugcuuauagugcaggua
6.5 반응 성분들: 표적 서열의 증폭
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 유전자의 역전사 및 PCR 증폭을 수행하였다. 모든 증폭 반응은 진앰프® PCR 시스템 9700 열 사이클 반응기(Applied Biosystems) 내에서 수행되었다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 40℃, 30분 → 95℃, 7분 → 95℃, 5초 및 30℃ 30초(10회)(1 사이클당 온도는 2℃씩 증가) → 95℃, 5초 및 50℃, 30초(50회). 반응 혼합물은 40nM 3miR20/L1 및 200nM의 5miR20/1, 3 mM MgCl2, 각각의 dNTP 200μM, 10 유닛 Rnasin(Promega), 30 유닛 MMLV(-H) 역전사 효소(Promega), 1 x 이모완충액(Bioline) 및 0.5 유닛 이몰라제(Bioline)를 함유하였으며, 또한, 이외에도 a) 1㎍의 총 RNA도 함유하였거나, 또는 b) 표적을 함유하지 않았거나(dH2O), 아니면 c) 1014개의 복사체만큼의(5μM) R-20 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하였다.
6.6. 반응 성분들: 표적 서열의 검출
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호의 증가 정도로써 표적 서열을 검출하였다. 반응은 기질을 첨가함으로써 시작되었으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 모든 반응을 온도 40℃의 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid) 내에서 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도를 총 5분 동안 30초마다 판독하였다. 표 9의 모든 반응물은 1μM의 SubBi-1-FB, 1μM의 파트자임 A, 1μM의 파트자임 B, 50 mM Tris HCl(pH 9.0, 25℃), 25mM MgCl2 및 표적(표 9 참조)을 함유하였다.
시험관 내 증폭된 총 RNA의 검출용 반응의 반응물 성분들.
MNA자임 시스템에서는 디자인 4(miR20A2/1:miR20B3/1)을 사용하였음.
MNA자임 반응 표적
miR-20 표적-RNA
올리고뉴클레오티드
(포지티브 대조군 miR-20)		 R-20 표적 PCR-생성물
(25㎕의 반응물로부터 5㎕ 취함)
(증폭된 R-20 표적 올리고뉴클레오티드 2×1013개의
복사체 만큼과 동량임)
miR-20 표적-총 RNA(테스트) PCR 생성물
(25㎕의 반응물로부터 5㎕ 취함)
(증폭된 총 RNA 200ng과 동량임)
표적 RNA 비포함
(네거티브 대조군 miR20)		 PCR 생성물
(25㎕의 반응물로부터 5㎕ 취함)
(dH2O를 함유하는 "표적 비포함 대조군" 반응물로부터
유래)
증폭되지 않은 총 RNA
(네거티브 대조군 miR20)		 총 RNA(1㎍)(총 부피 5㎕)
스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)의 웰에 담겨 있는 각각의 반응물에 대한 백그라운드 수준을 측정하였다. 이후, 상기 값을, 웰 간 비교가 가능하도록 웰 내에서 수행된 기타 모든 반응에 의한 형광도로부터 공제하였다.
6.7: 결과: SubBi -1- FB 리포터 기질의 절단 여부 확인
사용된 표적 서열이 PCR에 의해 증폭된 총 RNA이었을 때, miR-20을 검출하기 위한 MNA자임 디자인 4에서는 시간이 경과 함에 따라서 형광도가 증가하였다(도 16).
RNA 표적을 함유하지 않는 대조군의 형광도는 RNA 표적을 함유하는 반응물의 형광도보다 낮았으며, 네거티브 대조군의 경우에는 그 어느 것도 시간이 경과함에 따라서 형광도가 증가하지 않았다. 이로써, 표적-함유 반응물에서 발생한 형광도는, 이후에 리포터 기질을 절단할 촉매 활성 MNA자임이 표적 의존적으로 조립됨에 따라서 증가함이 입증되었다. 이 실험은 2 단계로 수행되었는데(역전사/PCR → MNA자임 종말점 검출), 모든 단계들은 실 시간으로 반응을 관찰할 수 있도록 하나의 튜브에서 동시에 행하여질 수 있었다.
실시예 7: 핵산 신호 케스케이드와 연계된, MNA 자임에 의한 표적 검출법
7.1 MNA 자임에 의해 개시되는 신호 증폭 케스케이드
도 7에 도시한 바와 같이, 신호 증폭 케스케이드 반응과 MNA자임 검출법을 연계함으로써, 핵산 검출 시 한계점을 어느 정도 줄일 수 있다. MNA자임은 또한 케스케이드를 개시하기 위하여 고도로 특이적인 촉발 기작을 진행시킬 수 있다.
7.2. 공간적으로 분리된 DNA 자임 케스케이드
DNA자임은 다양한 방법 예를 들어, 바이오틴 표지된 DNA자임을 부착시킬 수 있도록 스트렙타빈으로 코팅된 플라스틱 웨이퍼에 부착시키는 방법을 이용하여 지지체에 부착될 수 있다. 이와 같이 부착시 사용되는 서열들은 또한 일반적 MNA자임/DNA자임 기질로서도 사용될 수 있다. 표적(예를 들어, 핵산 서열)은 활성 MNA자임을 형성시킬 수 있는 파트자임 서열에 혼성화시킴으로써 검출될 수 있다. 이후, MNA자임은 고정된 일반적 기질을 절단할 수 있으며, 그 결과, DNA자임 A가 방출될 수 있다. 이후, DNA자임 A는, DNA자임 B가 고정되어 있는 제2의 고체 표면에 존재하는 제2의 일반 서열로 이동할 수 있다. DNA자임 A는 제2의 일반 서열을 절단하여, 그 결과, DNA자임 B를 방출시킬 수 있다. 형광단/켄처 염료 쌍 사이의 기질을 절단하면, 형광도가 증가할 수 있다. 그러면, 방출된 DNA자임 B는 제1의 기질을 더욱 많이 절단할 수 있게 되고, 그 결과, 더욱 많은 DNA자임 A가 방출되어, 신호를 증폭시키는 신호 케스케이드가 개시될 수 있는 것이다(도 7).
본 실시예에는, 공간적으로 분리된 DNA자임을 사용하는 신호 케스케이드를 진행시키는 하나의 기작에 대해 기술하고 있으나, 촉매 핵산을 사용하여 신호를 증폭시킬 수 있는 또 다른 방법도 존재한다. 당 업자는 이와 같은 임의의 방법을 완벽하게 실핼할 수 있다는 사실을 알 것이지만, 다만, 부착 또는 물리적 분리 수단 중 임의의 수단에 의해서, 기질은 그것에 작용을 하는 효소에 "접근 불가능한" 상태로 존재하게 된다는 사실도 알 것이다. MNA자임에 의해 개시되는 반응과 연계하여 수행될 수 있는 핵산 신호 증폭법에 관한 기타 예로서는 결찰 케스케이드(Paul and Joyce, 2004) 및 순환 DNA자임 케스케이드(Levy and Ellington, 2003)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 각각의 케스케이드에는, 효소가 기질로부터 "분리"된 상태로 유지고 있다가, 효소 및 기질이 접촉할 때 직간접적으로 증폭된 신호 또는 신호 케스케이드 결과를 이 촉매 활성으로써 얻을 수 있다는 기본적인 원리가 포함되어 있다.
실시예 8: 핵산 표적을 정량함에 있어서 MNA 자임의 사용
8.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
시험관 내 표적 증폭 방법 예를 들어, PCR을 이용하여 실 시간으로 표적 핵산이 증폭되는지 여부를 관찰하는데 MNA자임을 사용할 수 있다. 뿐만 아니라, 실 시간 관찰을 통해, 반응물 내에 처음에 존재하던 표적의 양을 정량할 수 있다. 본 실시예에서, 증폭 및 검출은 하나의 단계로 이루어진 방법으로 수행되는데, 여기서, PCR 증폭과 MNA자임-매개 검출은 하나의 튜브 내에서 동시에 진행된다. 파트자임 올리고뉴클레오티드 A 및 B는 인간 RPLPO 유전자의 엑손 5에 상보성인 센서 팔을 보유하는 디자인 6을 사용하였다(도 17(i)). 파트자임 올리고뉴클레오티드를 이하에 제시하였으며, 여기서, "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3'이 인산화되었음을 나타내는 것이다.
서열 번호 29: 파트자임 A4 RO5A4/3-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GGTTGTGCTG-P
서열 번호 30: 파트자임 B5 RO5B5/3-P:
CGGTTGGTGA GGCTAGCT GTGGAGACGGATTACACCTTC-P
8.2. 리포터 기질
본 실시예에 사용되는 리포터 기질은 이하와 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-3이다. 본 실시예에서, SubBi-3-FB의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 말단 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하였다. SubBi-3-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 31: SubBi-3-FB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
8.3. RPLPO 엑손 5 증폭용인 PCR 프라이머
본 실시예의 표적 서열은 이하에 제시된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 인간 게놈 DNA를 시험관 내 증폭시켜 생산되었다.
서열 번호 32: 프라이머 5RO5/1:
CATTCTATCATCAACGGGTA
서열 번호 33: 프라이머 3RO5/1:
CAAAGGCAGATGGATCAG
8.4. 표적 서열
K562 세포주(Promega)로부터 추출된 인간 게놈 DNA를 RPLPO 유전자 증폭용 주형으로 사용하였다.
8.5. 반응 성분: 표적 서열의 증폭 및 정량
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열을 실시간 증폭 및 정량하였다. 모든 반응을 ABI7700 열 사이클 반응기(Applied Biosystems) 내에서 수행하였다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 95℃, 7분 → 95℃, 5초 및 60℃, 30초(10회)(1사이클당 온도는 1℃씩 낮아짐) → 95℃, 5초 및 50℃, 30초(50회). 반응물은 40nM 5RO5/1 및 200nM의 3RO5/1, 20OnM RO5A4/3-P 그리고 20OnM RO5B5/3-P, 200nM SubBi-3-FB, 10 mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 유닛의 Rnasin(Promega), 1×ROX 기준 물ㅈ지nv질rogen), 1×이모완충액(Bioline), 0.25 유닛의 이몰라제(Bioline)를 함유하였으며, 또한 이외에도, 게놈 DNA 주형(20,000pg, 4000pg, 800pg, 160pg, 32pg 및 6.4pg)도 포함하였거나, 아니면 표적을 함유하지 않았다(dH2O).
8.6. 결과: 표적의 증폭 및 SubBi -3- FB 리포터 기질의 절단
사용된 표적 서열이 PCR을 통해 증폭된 인간 게놈 DNA일 때, RPLPO 엑손 5의 실 시간 검출 및 정량용 MNA자임 디자인 6의 경우, 시간이 경과함에 따라서 형광도를 증가시켰음을 알 수 있었다(도 17(ii)).
DNA 표적을 함유하지 않는 대조군의 형광도는 DNA 표적을 함유하는 반응물의 형광도에 비하여 낮았으며, 이 형광도는 반응 중에 증가하지 않았다. 이는 곧, 표적을 함유하는 반응물에서 발생하는 형광도는 이후에 리포터 기질을 절단할, 촉매 활성 MNA자임의 표적 의존적으로 조립됨에 따라서 증가한다는 사실을 입증하는 것이다. 역치 사이클(threshold cycle)에 대한 DNA 농도의 로그 함수 그래프를 작성하여 표준 곡선을 얻었는데, 이를 통해, 상관 계수 0.995인 선형 그래프가 얻어졌다. 게놈 DNA 6.4pg을 함유하는 반응물에는, 약 10개의 복사체만큼의 표적이 존재하였다. 이 실시예를 통해, 본 연구법의 감수성이 높다는 사실을 알 수 있다.
실 시간 PCR을 이용하는 실험에 후속하여 실시된, 불균형 프라이머 비율을 적용한 본 실험을 통해, MNA자임 검출 결과가 균형 프라이머 비율을 적용하는 PCR에 따른 결과와 일치하였음을 알 수 있었다.
실시예 9: 다수의 표적을 동시에 표적화하는 , 다수의 MNA 자임을 사용하는 복합적 반응
9.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
다수의 표적은 다수의 독특한 MNA자임을 포함하는 하나의 복합 반응을 통해 동시에 검출될 수 있다. 각각의 MNA자임은 하나의 표적에 특이적인 센서 팔과, 일련의 일반 기질의 독특한 구성원에 특이적인 기질 팔을 가지는데, 이들 팔은 각각 상이한 형광단으로 표지된다(도 18). 이하 실시예에서, MNA자임은 2개의 상이한 표적(즉, RPLPO 및 D-20 서열)을 검출하도록 디자인되었다. 임의의 수의 표적은 본 방법에 따라서 사용될 수 있음을 알 것이다. 파트자임 A 및 파트자임 B의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'). 다음의 서열에 있어서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 29: 파트자임 A4 RO5A4/3-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GGTTGTGCTG-P
서열 번호 30: 파트자임 B5 RO5B5/3-P:
CGGTTGGTGA GGCTAGCT GTGGAGACGGATTACACCTTC-P
서열 번호 34: 파트자임 A4 miR20A4/2:
TACCTGCACTA ACAACGA GAGGAAACCTT
서열 번호 35: 파트자임 B5 miR20B5/2:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT TAAGCACTTTA
9.2. 리포터 기질
본 실시예에서 사용된 2개의 리포터 기질은 이하에 제시된 바와 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-2 및 SubBi-3였다. 이 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-3의 5' 말단에는 6-JOE 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-3-JB라 명명하였다.
SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰으며, 또한 SubBi-3-JB를 절단한 결과를 548㎚(JOE 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 520㎚(JOE 여기 파장)에서 여기시켰으며. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
서열 번호 36: SubBi-3-JB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
9.3. 표적 서열
본 실시예의 표적 서열은 이하의 서열들을 가지는(5'→3') 합성 올리고뉴클레오티드 RO5/1 표적 및 D-20 표적이었다. 상기 RO5/1 표적 서열은 RPLPO 유전자의 일부분, 엑손 5와 동일한 서열을 가지며, 상기 D-20 표적 서열은 RNA hsa-miR-20의 DNA 상동체이다.
서열 번호 22: RO5/1 표적:
GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
서열 번호 12: D-20 표적:
TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
9.4. 반응 조건
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호의 증가 정도를 관찰하여 표적 서열을 검출하였다. 반응은 기질을 첨가함으로써 시작되었으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 모든 반응을 온도 55℃의 스마트사이클러® 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid) 내에서 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도를 총 5분 동안 7초마다 판독하였다. 표 10의 모든 반응물은 PCRII 완충액(Applied Biosystems) 및 25mM MgCl2를 함유하였다.
2개의 상이한 핵산 표적의 동시 검출을 위한 반응의 반응물 성분
반응 유형 파트자임 A
(1μM)		 파트자임 B
(1μM)		 표적
단독 D-20 miR20A4/2 miR20B5/2 1μM D-20 표적
표적 비포함(dH2O)
단독 RPLPO RO5A4/3-P RO5B5/3-P 1μM RO5/1 표적
표적 비포함(dH2O)
복합 D-20 및
RPLPO		 miR20A4/2 및
RO5A4/3-P		 miR20B5/2 및
RO5B5/3-P		 1μM D-20 표적 및 1μM RO5/1 표적
표적 비포함(dH2O)
본 실험 중 사용된 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)의 웰에 담겨 있는 각각의 반응물을, 우선 이것의 형광도 백그라운드 수준에 대해 테스트하였는데, 그 이유는 웰 간 형광도는 매우 상이한 것으로 알려져 있기 때문이다. 다량의 혼합물 단독의 형광도를 판독함으로써 백그라운드 수준을 측정하였다. 이후, 상기 값을, 웰 간 비교가 가능하도록 웰 내에서 수행된 기타 모든 반응에 의한 형광도로부터 공제하였다.
9.5. 결과: 기질의 검출 및 절단
표적 D-20이나 RPLPO를 함유하는 단독 반응물에서는 표적을 함유하지 않는 대조군에 비하여, 시간이 경과함에 따라서 형광도가 증가하였음을 알 수 있었다(도 19(i)). 이로써, 파트자임은 촉매 활성 MNA자임으로 조립되며, 표적 서열이 존재할 경우에만 리포터 기질을 절단한다는 사실이 입증되었다. "표적 비포함"(dH2O) 대조군에서는 형광도가 증가하지 않았는데, 이는 곧, 표적이 존재하지 않으면 절단이 일어나지 않음을 말해주는 것이다. RPLPO와 D-20을 동시에 검출하는 복합 반응(도 19(ii))에서는, 각각의 표적에 대한 결과가 각 표적에 대한 단일 반응에서 관찰되는 결과와 유사하였다. "표적 비포함" 대조군 반응물의 경우는 형광도가 증가하지 않았다. 이러한 결과를 통해, 특이성을 잃지 않고, 하나의 반응에서 다수의 표적이 동시에 검출된다는 사실을 입증할 수 있다.
실시예 10: 마이크로 RNA 의 시험관 내 증폭에 의해 생산된 앰플리콘을 정량함에 있어서 MNA 자임의 사용
10.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
시험관 내 표적 증폭 방법 예를 들어, RT-PCR을 이용하여 실 시간으로 표적 핵산의 증폭 여부를 관찰하는데 MNA자임이 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 실 시간 관찰 결과, 반응물 중에 처음에 존재하던 표적의 양을 정량할 수 있다. 본 실시예에서는, 증폭 및 검출이 2 단계로 이루어진 방법으로 수행되었는데, 여기서, 제1 단계는 cDNA를 역전사를 통해 생산하는 단계이고, 이후 제2 단계는 cDNA를 PCR 증폭시킴과 동시에 MNA자임을 이용하여 검출하는 단계이다. 파트자임 올리고뉴클레오티드 A 및 B에서는 인간 마이크로 RNA hsa-let-7a에 상보성인 센서 팔을 가지는 디자인 6을 사용하였다. 파트자임 올리고뉴클레오티드를 이하에 제시하였는데, 여기서, "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산화되었음을 나타내는 것이다. 이하의 서열에서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 37: 파트자임 A4 PCR7aA4/2-P:
GACCGTGAGGTAGTA ACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 38: 파트자임 B5 PCR7aB5/2-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT GGTTGTATAGTTGTC-P
10.2. 리포터 기질
본 실시예에서 사용된 리포터 기질은 이하에 제시된 바와 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-2였다. 이 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 516㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 492㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
10.3. 표적 서열
합성 RNA 올리고뉴클레오티드 R-let7a(RNA hsa-let-7a 종에 상동성인 서열을 가짐)의 2 단계 RTPCR에 의해 본 실시예에 대한 표준 곡선을 작성하였다. R-let7a 서열은 다음과 같다(5'→3').
서열 번호 39: R-let7a:
ugagguaguagguuguauaguu
결장 세포(Ambion), K562 백혈병 세포, HeLa 자궁 경부암 세포(Ambion) 및 비장 세포(Clontech)로부터 유래하는 인간의 총 RNA 시료를 증폭시키고, 이것이 hsa-let-7a를 많이 가지고 있는지에 대해 분석하였다.
10.4. hsa - let -7a의 증폭용 PCR 프라이머
이하 프라이머는 hsa-let-7a를 증폭시키는데 사용되었다. 프라이머 3let7a는 역전사용으로 사용되었으며, 프라이머 5let7a 및 3PCR7a는 PCR 증폭용으로 사용되었다.
서열 번호 40: 프라이머 31et7a:
AGCGAAGCTGAGACAACTATACAA
서열 번호 41: 프라이머 51et7a:
CGACGTGACCGTGAGGTAG
서열 번호 42: 프라이머 3PCR7a:
CATGGCACAAGCGAAGCTGA
10.5. 반응 성분: 표적 서열의 역전사
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열을 역전사시켰다. 반응물을 20℃의 2720 열 사이클 반응기(Applied Biosystems)에서 20분 동안 항온 처리한 다음, 다시 30℃에서 20분 동안, 그리고 나서 40℃에서 20분 동안 항온 처리하였다. 이 반응물에는 10nM의 31et7a, 5 mM MgCl2, 300μM의 각 dNTP, 20 유닛의 Rnasin(Promega), 1×이모완충액(Bioline), 100 유닛의 M-MLV RT(H-) 및 5㎕의 R-let7a(6×1011개 복사체) 또는 인간 총 RNA[정상 결장(0.1㎍), K562(0.1㎍), HeLa(0.2㎍) 또는 비장(0.2㎍)으로부터 유래]를 포함하였다. 대조군 반응물에는 전술한 시약 모두를 포함하되, 다만, RNA 표적 대신 dH2O 5㎕만을 포함하였다.
10.6. 반응 성분: 표적 서열의 증폭 및 정량
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열을 실 시간 증폭 및 정량하였다. 모든 반응을 Mx3005P™ QPCR 시스템(Stratagene)에서 수행하였다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 95℃, 7분 → 95℃, 15초 및 40℃, 30초(1주기당 1℃씩 상승)(10회) → 95℃, 15초 및 50℃, 30초(50회). 반응물은 200nM의 3PCR7a와 40nM의 51et7a, 40OnM PCR7aA4/2-P 및 40OnM PCR7aB5/2-P, 200nM SubBi-2-FB, 10 mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 20 유닛의 Rnasin(Promega), 1×이모완충액(Bioline), 1 유닛의 이몰라제(Bioline) 및 5㎕의 R-let7a cDNA(5×108, 5×107, 5×106, 5×105, 5 ×104개 복사체 함유) 또는 인간 총 RNA 주형(정상 결장, 0.5㎍; K562, 0.5㎍; HeLa, 1㎍; 비장, 1㎍)을 포함하였거나, 또는 이 시약들을 모두 포함하되, 다만, 상기 cDNA나 RNA와 같은 표적은 포함하지 않았다(dH2O).
10.7: 결과: 표적 증폭 및 SubBi -2- FB 리포터 기질의 절단
사용된 표적 서열이 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 인간의 총 RNA로부터 생성된 cDNA였을 때, hsa-let-7a의 실 시간 검출 및 정량에 사용되는 MNA자임은 시간이 경과 함에 따라서, 형광도를 증가시켰음을 알 수 있었다. 표적을 함유하지 않는 대조군 반응물의 경우에는 신호가 검출되지 않았다(표 11). 이로써, 이후에 리포터 기질을 절단할 촉매 활성 MNA자임은 표적에 의존적으로 조립되기 때문에, 표적-함유 반응물에서 발생한 형광도는 증가함을 알 수 있다. 역치 사이클에 대한 초기 RNA 농도의 로그 함수를 그래프로 나타내어 표준 곡선을 작성한 결과, 상관 계수 0.999인 선형 그래프가 그려졌다. 4개의 인간 총 RNA 시료도 증폭시키고, 이 표준 곡선을 외삽하여 각각의 시료에 함유된 hsa-let-7a의 양을 추정하였다(표 11).
hsa-let-7a 앰플리콘의 증폭 및 검출을 위한 반응의 결과
시료 역치(Ct) -
2회 측정값의 평균		 복사체 수 -
공지의 표준(S)
또는
측정치(E)		 비고
표준 1 19.4 5×108(S) 표준 곡선
(2회 반응 실행 결과 얻어진 값의 평균)
R2 = 0.999
기울기 = -3.829
효율 = 83%
표준 2 23.1 5×107(S)
표준 3 26.9 5×106(S)
표준 4 30.9 5×105(S)
표준 5 34.7 5×104(S)
RNA 표적 비포함
대조군		 신호 발생하지 않음 0 신호 발생하지 않음
결장 RNA 20 4×108(E) 모든 테스트 시료에서
hsa-let-7a가 검출 및 정량됨.
K562 RNA 31 3.5×105(E)
HeLa RNA 22 1.3×108(E)
비장 RNA 22 7.6×107(E)
본 실시예를 통해, 인간 마이크로 RNA 종을 RT-PCR 증폭시켜 생성된 앰플리콘을 검출 및 정량할 수 있는 MNA자임의 능력을 입증하였다. 마이크로 RNA는 크기가 작아서(약 22개 염기) 증폭 및 검출이 어렵다. MNA자임은 이러한 용도에 적합하다.
실시예 11: DNA 메틸화 여부를 검출함에 있어서 MNA자임의 사용
11.1 파트자임 올리고뉴클레오티드
실시예 19에서는 실 시간 PCR 및 MNA자임 매개 신호 발생을 통해서, 완전히 매치된 핵산 서열과 C와 C가 미스 매치된 핵산 서열을 구별할 수 있음이 기술되어 있다. 이러한 능력은 MNA자임이 세포의 메틸화 상태를 분석하는데 사용될 수 있도록 만들어준다. 메틸화 패턴은 종종 암과 관련되었을 때 변이가 일어난다. 다수의 메틸화 분석 방법은, 비 메틸화된, 즉, 비메틸화 시티딘을 우리딘으로 전환시키는 게놈 DNA의 바이설파이트 변형 과정으로 시작된다. 이후, 변형된 DNA를 PCR 증폭하여, 우리딘을 티미딘으로 치환하고, 다양한 방법을 사용하여 T를 함유하는 서열(원래는 비메틸화 C) 및 C(원래는 메틸화된 C)를 함유하는 서열을 구별할 수 있다. 다음의 실시예에서, MNA자임은 바이설파이트 변형된 DNA에 존재하는 p16 유전자의 프로모터 부위 내 특정 CpG 이중체의 메틸화 상태를 측정하는데 사용되었다.
본 실시예에서, 파트자임은 메틸화된 p16 유전자의 바이설파이트 변형 이후에 생산된 서열에 매치되도록 디자인되었다. 이 파트자임의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3'). 이하 서열에서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 바이설파이트 변형된 표적과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 나타낸 염기들은 기질과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산화되었음을 나타내는 것이다.
서열 번호 43: 파트자임 A5 p16A5/3-P:
GCCCCCGCCTCCAAC TACAACGA GGTTGTGCTG-P
서열 번호 44: 파트자임 B6 p16B6/3-P:
CGGTTGGTGA GGCTAGC AACGCCCGCACCTC-P
11.2. 리포터 기질
본 실시예에서 사용된 리포터 기질은 SubBi-3이었다. 본 실시예에서, SubBi-3의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-3-FB라 명명하였다. SubBi-3-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 31: SubBi-3 -FB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
11.3. 바이설파이트 변형된 p16 의 증폭용 PCR 프라이머
본 실시예에서는, PCR 프라이머를 바이설파이트 변형 표적(처음부터 메틸화됨)과 매치되도록 디자인하였다. 이하에 나열한 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머(5'→3')를 사용하여, 본 실시예에 사용되는 표적 서열을 바이설파이트 변형 인간 게놈 DNA의 시험관 내 증폭에 의해 생산하였다.
서열 번호 45: 프라이머 5p16:
GTTGGTTACGGTCGCGGTTC
서열 번호 46: 프라이머 3p16:
CCGACCGTAACTATTCGATACG
11.4. 표적 서열 및 대조군
K562 세포주로부터 추출한 인간 게놈 DNA를 네거티브 대조군 게놈 DNA(메틸화되지 않은 p16 유전자 프로모터 함유)로서 사용하였다. 보편적 CpG 메틸화 게놈 DNA(Chemicon)를 메틸화된 p16 유전자 프로모터에 대한 대조군으로서 사용하였다. 제조자의 지침에 따라서, 게놈 DNA를 메틸이지 키트(MethylEasy kit; Human Genetic Signatures)를 사용하여 밤새도록 바이설파이트 변형시켰다. 이후, 메틸화된 DNA와 비메틸화 DNA를 연속으로 희석하여, p16 유전자 프로모터가 메틸화된 DNA를 다양한 비율로 함유하는(즉, 100%, 20%, 4%, 0.8%, 0.16% 및 0.032%) 시료를 만들었다. 게놈 DNA 대신, 핵산 분해 효소가 없는 dH2O를 표적 비포함 대조군으로서 사용하였다.
11.5. 반응 성분: 표적 서열의 증폭 및 정량
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열을 실 시간 증폭 및 정량하였다. 모든 반응을 Mx3005P™ QPCR 시스템(Stratagene)에서 수행하였다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 95℃, 7분 → 95℃, 15초 및 56℃, 30초(10회) → 95℃, 15초 및 52℃, 30초(50회). 반응물은 200nM의 5p16과 40nM의 3p16, 200nM의 p16A5/3-P 및 200nM의 p16B6/3-P, 200nM SubBi-3-FB, 7.5mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 유닛의 Rnasin(Promega), 1×이모완충액(Bioline), 1 유닛의 이몰라제(Bioline), 및 150ng의 바이설파이트-변형 게놈 DNA(100%, 20%, 4%, 0.8%, 0.16% 또는 0.032%의 메틸화된 DNA 함유)를 포함하였거나, 또는 이 시약들을 모두 포함하되, 표적은 포함하지 않고 dH2O만을 포함하였다(표적 비포함 대조군 반응). 모든 반응은 2회씩 실시하였다.
11.6. 결과: MNA 자임에 의한 메틸화 여부의 검출
표적 시료가 메틸화된 DNA를 100%에서 0.16%로 점점 적게 함유하게 되었을 때, 메틸화-특이적인 MNA자임은 시간이 경과함에 따라서 형광도를 증가시켰다(표 12). 이와는 대조적으로, 표적 시료가 메틸화된 DNA를 0.032%에서 0%로 점점적게 함유하게 되었을 때에는, 표적을 포함하지 않는 대조군에서 살펴볼 수 있는 바와 유사하게, 반응물의 형광도 수준은 낮았으며, 형광도는 시간이 경과함에 따라서 증가하지도 않았다. 메틸화된 표적의 비율이 낮아짐에 따라서, 반응 Ct는 증가하였으며, 표준 곡선을 그래프로 작성하였다[이때, R2값은 0.996]. 실험 결과를 이하 표 12에 요약하였다.
바이설파이트 변형된 게놈 DNA 시료 내 DNA 메틸화를 검출하기 위한 MNA자임의 사용
메틸화 % Ct(2회 실행 값의 평균) 비고
100 19.36 이러한 수치를 이용하여 작성된 표준곡선의 R2는 0.996이었고, 효율은 133%였으며, 기울기는 -2.72였음.
20 20.94
4 23.33
0.8 24.83
0.16 27.02
0.032 무Ct 검출되지 않음
0(100% 메틸화되지 않음) 무Ct 메틸화되지 않은 대조군에대한 신호는 발생하지 않음
표적 비포함 대조군 무Ct 표적을 포함하지 않는 대조군에 대한 신호는 발생하지 않음
메틸화된 p16-특이 프라이머와 MNA자임은, 본 실시예에 사용된 조건 하에서, 메틸화된 표적과 비메틸화 표적을 구별할 수 있었다. 또한, 이 시스템은 비메틸화 표적의 백 그라운드 중 메틸화된 표적 0.16%를 검출할 수 있었다. PCR 반응의 효율이 100%라 함은 곧, 각 사이클에서 2배가 된다는 의미를 갖는 것이다. 본 실험에서 관찰된 효율은 133%이었는데, 이는 곧, MNA자임의 촉매 활성에 의해, 표적 증폭(PCR에 의함)과 앰플리콘의 검출이 배가됨을 나타내는 것이다.
실시예 12: 헤어핀 구조를 형성하는 센서 팔을 가지는 파트자임으로부터 조립되는 MNA 자임
활성 MNA자임으로 조립될 수 있는 파트자임의 구조는 가변적이다. 본 실시예는 MNA자임 활성에 부합하는 추가 구조를 입증하고 있다.
12.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임 A, 또는 파트자임 B, 또는 이 파트자임 A와 파트자임 B 둘 다의 센서 팔 부분 뒤에 독자적인 헤어핀 서열이 올 때, MNA자임을 사용하는 검출법도 수행될 수 있다. 다음의 실험에서, 파트자임 A와 파트자임 B는 인간 마이크로 RNA, hsa-miR-143의 서열을 표적화하도록 디자인되었다. 파트자임 A 및 파트자임 B 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3'). 이하 서열에서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 중 표적과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 나타낸 염기들은 기질과 혼성화되는 염기를 나타내는 것고, 보통 글씨체로 나타낸 염기들은 헤어핀 구조를 형성하는 부분이다.
서열 번호 142: 파트자임 A2 miR143 A2/1:
TGAGCTACAGT CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 143: 파트자임 B3 miR143 B3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC GCTTCATCTCA
서열 번호 144: 파트자임 A2 miR143 A2H/1:
GGCACTAACGTGCCTGAGCTACAGT CGGTCGAA ATAGTGAGT
서열 번호 145: 파트자임 B3 miR143 B3H/1:
CATCTCTTCT CCGAGC GCTTCATCTCACGACGATAACGTCG
12.2. 리포터 기질
이중 표지된 핵산 리포터 기질을 절단함으로써 MNA자임 활성을 관찰하였다. 본 실시예에 사용된 리포터 기질은 이하에 5'에서 3' 방향으로 기재한 서열을 가지는 SubBi-1-FB였다. 아래 염기는 RNA를 나타내는 것이며, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 밑줄 친 염기는 5' 말단의 6-FAM 부분의 위치와, 3' 말단의 BHQ1 부분의 위치를 나타내는 것이다. FAM과 BHQ1 사이의 데옥시뉴클레오티드에 존재하는 SubBi-1-FB를 절단함으로 인한 형광도 변화를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다.
서열 번호 6: SubBi-1-FB:
ACTCACTATaGGAAGAGATG
12.3. 표적
본 실시예에 사용되는 표적 서열은 DNA 올리고뉴클레오티드, D-143 표적으로서, 이는 인간 마이크로 RNA인 hsa-miR-143에 상동성인 서열을 가진다. D-143 표적의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3').
서열 번호 146: D-143 표적:
TGAGATGAAGCACTGTAGCTCA
12.4. 반응 조건
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생하는 형광 신호 증가 여부에 의해, 표적 서열을 검출하였다. 기질을 첨가하여 반응을 개시하였으며, 이때의 모든 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 모든 반응을 온도 40℃의 스마트사이클러(SmartCycler)? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid) 내에서 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도를 총 10분 동안 7초마다 판독하였다. 표 13의 모든 반응물에는 1μM의 SubBi-1-FB, 10mM Tris HCl(pH 9.0, 25℃)과 25 mM MgCl2의 다량의 혼합물을 포함하였다.
핵산 표적의 검출을 위한 반응의 성분들
반응 유형 파트자임 A
miR143
(0.8μM)		 파트자임 B
miR143
(0.8μM)		 MNA자임 반응 주형
(D-143 표적)
어느 파트자임도
헤어핀 구조를
띠지 않음		 A2/1 B3/1 표적 0.1μM
표적 비포함 비포함(H2O만
함유)
하나의 파트자임 만이
헤어핀 구조를 포함함		 A2H/1 B3/1 표적 0.1μM
A2/1 B3H/1 표적 0.1μM
두 개의 파트자임이
헤어핀 구조를 포함함		 A2H/1 B3H/1 표적 0.1μM
표적 비포함 비포함(H2O만
함유)
실험 중 사용된 스마트사이클러? 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)의 웰에 담겨 있는 각각의 반응물을, 우선 이것의 형광도 백그라운드 수준에 대해 테스트하였는데, 그 이유는 웰 간 형광도는 매우 상이한 것으로 알려져 있기 때문이다. 다량의 혼합물 단독의 형광도를 판독함으로써 백그라운드 수준을 측정하였다. 이후, 상기 값을, 웰 간 비교가 가능하도록 웰 내에서 수행된 기타 모든 반응에 의한 형광도로부터 공제하였다.
12.5. SubBi -1- FB 리포터 기질의 절단 여부 확인
파트자임 A와 파트자임 B의 디자인의 다양한 조합은 모두 활성 MNA자임으로 조립될 수 있었다. 형광도 증가에 따라 확인되는 바와 같이, 이 MNA자임은 표적 서열이 존재할 때에만 리포터 기질을 절단하였다. 본 실시예에서, 파트자임들의 센서 팔은 헤어핀 구조를 형성하는 서열과 함께 증폭되었다. 헤어핀 구조를 포함하는 하나의 파트자임(파트자임 A 또는 파트자임 B)을 함유하거나, 또는 두 개의 파트자임(파트자임 A 및 파트자임 B)이 헤어핀 구조를 포함하는 반응에서는, 헤어핀 구조를 포함하지 않는 파트자임이 사용되었을 때 관찰되는 형광 신호와 유사한 형광 신호가 발생하였다. 표적을 포함하지 않는 대조군 반응 중 임의의 반응에서는 신호 증가가 관찰되지 않았다.
헤어핀 구조를 포함하는 파트자임 디자인은 짧은 서열 예를 들어, 마이크로 RNA를 검출하는데 적당한 수단을 제공한다. 본 실험에서 검출된 DNA 올리고뉴클레오티드는 22개의 염기로만 이루어져 있었다. 이 서열을, 헤어핀 구조를 포함하거나 포함하지 않는 파트자임으로 검출하였다. 이 헤어핀 디자인은 보다 안정적인 구조를 제공하였으며, 또한 MNA자임 조립과 촉매 활성에 부합하는 것으로 알려져 있는 파트자임을 디자인하는데에 융통성을 제공한다.
실시예 13: 실 시간 RT - PCR 을 통한 4개의 핵산 서열을 동시에 정량함에 있어서 MNA자임의 사용
13.1. 4중 RT - PCR 검정용인 파트자임 올리고뉴클레오티드
시험관 내 표적 증폭 방법 예를 들어, RT-PCR을 이용하여 다수의 표적을 실 시간으로 동시에 증폭시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 표적의 증폭은 하나의 복합 반응(다수의 독특한 MNA자임 관여)에서 실 시간으로 동시에 관찰될 수 있다. 각각의 MNA자임은 하나의 표적에 특이적인 센서 팔과, 일련의 일반 기질의 독특한 일원에 특이적인 기질 팔을 가지는데, 이들은 각각 상이한 형광단으로 표지된다(도 18). 본 실시예에서, MNA자임은 4개의 상이한 표적 즉, 인간 BCR, RPLPO, β-액틴 및 HPRT 전사체를 검출하도록 디자인되었다. 임의의 수의 표적들이 본 방법에 사용될 수 있음을 알 것이다. 각각의 표적에 대한 파트자임 A 및 파트자임 B의 서열을 이하에 나열하였다(5'→3'). 이하 서열에서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 51: 파트자임 A4 BaA4/2-P:
AGATCAAGATCATTGCTCC ACAACGA GAGGA A ACCTT-P
서열 번호 52: 파트자임 B5 BaB5/2-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT TCCTGAGCGCAAGTACTC-P
서열 번호 29: 파트자임 A4 RO5A4/3-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GGTTGTGCTG-P
서열 번호 30: 파트자임 B5 RO5B5/3-P:
CGGTTGGTGA GGCTAGCT GTGGAGACGGATTACACCTTC-P
서열 번호 55: 파트자임 A4 BCRA4/6-P:
AGTTCAAATCTGTACTGCACC ACAACGA GAGGCGTGAT-P
서열 번호 56: 파트자임 B5 BCRB5/6-P:
CTGGGAGGAA GGCTAGCT CTGGAGGTGGATTCCTTTGG-P
서열 번호 57: 파트자임 A4 HPRTA4/7-P:
ACTGAATAGAAATAGTGATAGAT ACAACGA GTGCCATGTTAA-P
서열 번호 58: 파트자임 B5 HPRTB5/7-P:
TATCACAGCCAA GGCTAGCT CCATTCCTATGACTGTAGATT-P
13.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 4개의 상이한 리포터 기질이 사용되었는데, 이 기질에는 각각 상이한 형광단으로 표지하였다. 이 기질의 서열을 이하에 5'에서 3' 방향으로 기재하였다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-JOE 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-JB라 명명하였다. 이 SubBi-2-JB를 절단하여 535㎚에서 여기 시키면서, 555㎚에서 관찰하였다. SubBi-3의 5' 말단에는 쿼사(Quasar) 670 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ2 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-3-Q6B2라 명명하였다. 이 SubBi-3-Q6B2를 절단하여, 635㎚에서 여기 시키면서, 665㎚에서 관찰하였다. SubBi-6의 5' 말단에는 텍사스 레드(Texas Red) 부분으로 말단 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ2 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-6-TRB2라 명명하였다. 이 SubBi-6-TRB2를 절단하여, 585㎚에서 여기 시키면서, 610㎚에서 관찰하였다. 제4의 기질인 SubBi-7의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-7-FB라 명명하였다. SubBi-7-FB를 절단한 결과를 492㎚에서 여기 시키면서, 516㎚에서 관찰하였다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 59: SubBi-2-JB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
서열 번호 60: SubBi-3-Q6B2:
CAGCACAACCguCACCAACCG
서열 번호 61: SubBi-6-TRB2:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
서열 번호 62: SubBi-7-FB:
TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA
13.3. 4개의 앰플리콘을 증폭시키기 위한 표적 서열과 PCR 프라이머
K562 백혈병 세포로부터 추출한 인간 총 RNA를, 표적 전사체 4개 모두를 시험관 내 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다. 앰플리콘은 이하에 나열된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여 RT-PC에 의해 생산하였다.
서열 번호 32: 5' 프라이머 5RO5/1:
CATTCTATCATCAACGGGTA
서열 번호 33: 3' 프라이머 3RO5/1:
CAAAGGCAGATGGATCAG
서열 번호 63: 5' 프라이머 5 박틴:
CATTGCCGACAGGATGCAGA
서열 번호 64: 3' 프라이머 3 박틴:
GAGCCGCCGATCCACACG
서열 번호 65: 5' 프라이머 5BCR14:
CACTCAGCCACTGGATTTAA
서열 번호 66: 3' 프라이머 3BCR15/6:
GCGCGTCTTTGCTTTATTC
서열 번호 67: 5' 프라이머 5HPRT/5:
CTTTGCTGACCTGCTGGATTA
서열 번호 68: 3' 프라이머 3HPRT/8:
CCTGTTGACTGGTCATTACAA
13.4. 반응 성분: 표적 서열의 증폭 및 정량
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열을 실 시간 증폭 및 정량하였다. 모든 반응을 Mx3005P™ QPCR 시스템(Stratagene)에서 수행하였다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 50℃, 30분 → 95℃, 7분 → 95℃, 15초 및 65℃, 30초(10회)(주기당 온도 1℃ 증가) → 95℃, 15초 및 54℃, 30초(40). 반응물은 40nM의 각 5' 프라이머 및 200nM의 각 3' 프라이머, 200nM의 각 파트자임 A 및 200nM의 각 파트자임 B, 200nM의 각 기질, 10nM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 유닛 Rnasin(Promega), 20 유닛 M-MLV RT(H-), 1×이모완충액(Bioline), 1.5 유닛의 이몰라제(Bioline), 그리고 총 RNA 주형(100ng, 20ng, 4ng, 800pg, 160pg 또는 32pg)을 포함하였거나, 또는 이 시약들을 모두 포함하되, 표적은 포함하지 않고 dH2O만을 포함하였다.
4개의 상이한 핵산 표적의 동시 검출용 반응의 반응물 성분
반응 유형 프라이머
5'(40nM)
3'(200nM)		 파트자임 A
(200nM)		 파트자임 B
(200nM)		 기질
(200nM)		 표적
복합 β-액틴
RPLPO
BCR
HPRT		 5 박틴
3 박틴		 BaA4/2-P BaB5/2-P SubBi-2-JB 인간의 총 RNA
100ng
20ng
4ng
800pg
160pg
32pg 또는
RNA 비포함
(H2O)
5RO5/1
3RO5/1		 RO5A4/3-P RO5B5/3-P SubBi-3-Q6B2
5BCR14
3BCR15/6		 BCRA4/6-P BCRA5/6-P SubBi-6-TRB2
5HPRT/5
3HPRT/8		 HPRTA4/7-P HPRTB5/7-P SubBi-7-FB
13.5. 결과: 4개의 상이한 리포터 기질의 절단을 통한 4개의 상이한 표적 서열의 동시 증폭 및 검출
β-액틴, RPLPO, BCR 및 HPRT 전사체의 실 시간 검출 및 증폭에 사용되는 4개의 MNA자임은, 사용된 표적 서열이 RT-PCR을 통해 증폭된 인간의 총 RNA이었을 경우에, 시간이 경과함에 따라서 형광도를 증가시켰음을 알 수 있엇다(표 15). 4개의 모든 반응물에 대한 RNA 표적 비포함 대조군의 형광도는, RNA 표적을 함유하는 반응물의 형광도보다 낮았으며, 또한 반응 중에도 증가하지 않았다(표 15). 이로써, 이후에 리포터 기질을 절단할 촉매 활성 MNA자임이 표적에 의존적으로 조립되기 때문에, 표적 함유 반응물에서는 형광도가 증가한다는 사실이 입증된다.
역치 사이클에 대한 RNA 농도의 로그 함수를 그래프로 나타냄으로써, 4개의 모든 표적에 대해 표준 곡선을 작성하였다(선형 그래프). 각각의 표준에 대한 역치(Ct)를 표 15에 나타내었다. 이 표 15에 나타낸 Ct 값은 2회 반응에서 얻어진 결과의 평균값이다. 각각의 표적에 대한 상관 계수(R2), 기울기 및 반응 효율도 표 15에 나타내었다.
4개의 상이한 핵산 표적의 동시 증폭 및 검출을 위한 반응의 결과
주형(총 RNA) 역치(Ct)
β-액틴 RPLPO
(쿼사 670)		 BCR
(텍사스 레드)		 HPRT
(FAM)
100ng 11.2 12.8 17.6 16.2
20ng 13.8 15.2 19.9 18.5
4ng 16.7 17.5 22.4 20.9
800pg 19.1 20.1 25.0 23.5
160pg 21.5 22.7 27.1 26.0
32pg 23.8 25.2 29.1 27.7
RNA 비포함 대조군 무 Ct 무 Ct 무 Ct 무 Ct
표준 곡선 R2 = 0.998
기울기 = -3.599
효율 = 90%		 R2 = 1.000
기울기 = -3.561
효율 = 91%		 R2 = 0.998
기울기 = -3.320
효율 = 100%		 R2 = 0.997
기울기 = -3.370
효율 = 98%
본 실시예의 MNA자임 RT-PCR 반응을 통해, 4개의 일반적 기질을 포함하는 하나의 복합 반응에서, 4개의 표적을 정량하기 위한 표준 곡선을 작성함과 동시에 검출도 수행하였다. 이와 같은 일반적 기질들은 단일 반응에서의 4개의 표적에 대한 기타 조합을 관찰하는데 적당하다.
실시예 14: 실 시간 복합 RT - PCR 에서 5개의 핵산 서열을 동시에 정량함에 있어서 MNA 자임의 사용
14.1. 5중 RT - PCR 검정용인 파트자임 올리고뉴클레오티드
시험관 내 표적 증폭법 예를 들어, RT-PCR을 이용하여, 다수의 표적들을 동시에 실 시간으로 증폭할 수 있다. 또한, 표적의 증폭은 다수의 독특한 MNA자임을 포함하는 하나의 복합 반응에서 실 시간으로 관찰될 수 있다. 각각의 MNA자임은 하나의 표적에 특이적인 센서 팔과, 일련의 일반 기질의 독특한 일원에 특이적인 기질 팔을 가지는데, 이들은 각각 상이한 형광단으로 표지된다(도 18). 본 실시예에서, MNA자임은 5개의 상이한 표적 즉, BCR, RPLPO 엑손 4, β-액틴, RPLPO 엑손 5 및 HPRT mRNA 서열을 검출하도록 디자인되었다. 표적 중 임의의 것들은 본 방법에 따라서 사용될 수 있음을 알 것이다. 파트자임 A와 파트자임 B를 이하에 5'에서 3' 방향으로 나열하였다. 이하 서열에서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이며, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 또한 이탤릭체로 표시된 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 69: 파트자임 A4 BaA4/7-P:
AGATCAAGATCATTGCTCC ACAACGA GTGCCATGTTAA-P
서열 번호 70: 파트자임 B5 BaB5/7-P:
TATCACAGCCAA GGCTAGCT TCCTGAGCGCAAGTACTC-P
서열 번호 71: 파트자임 A4 RO5A4/4-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GTGCGCCATG-P
서열 번호 72: 파트자임 B5 RO5B5/4-P:
TACTTCTCCCAA GGCTAGCT GTGGAGACGGATTACACCTTC-P
서열 번호 55: 파트자임 A4 BCRA4/6-P:
AGTTCAAATCTGTACTGCACC ACAACGA GAGGCGTGAT-P
서열 번호 56: 파트자임 B5 BCRB5/6-P:
CTGGGAGGAA GGCTAGCT CTGGAGGTGGATTCCTTTGG-P
서열 번호 75: 파트자임 A4 HPRTA4/2-P:
ACTGAATAGAAATAGTGATAGAT ACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 76: 파트자임 B5 HPRTB5/2-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT CCATTCCTATGACTGTAGATT-P
서열 번호 77: 파트자임 A4 RO4A4/3-P:
GCTGGTCATCCAGCAG ACAACGA GGTTGTGCTG-P
서열 번호 78: 파트자임 B5 RO4B5/3-P
CGGTTGGTGA GGCTAGCT GTGTTCGACAATGGC-P
14.2. 리포터 기질
본 실시예에서는, 5개의 상이한 리포터 기질을 사용하였는데, 이 기질은 각각 5개의 상이한 형광단 중 하나로 표지되었다. 기질 서열을 5'에서 3' 방향으로 기재하였다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 알렉사(Alexa) 350 부분으로 말단 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-A350B라 명명하였다. SubBi-2-A350B을 절단하여, 350㎚에서 여기 시키면서, 440㎚에서 관찰하였다. SubBi-3의 5' 말단에는 쿼사 670 부분으로 3' 말단에는 BHQ2 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-3-Q6B2라 명명하였다. 이 SubBi-3-Q6B2를 절단하여, 635㎚에서 여기 시키면서, 665㎚에서 관찰하였다. SubBi-6의 5' 말단에는 텍사스 레드 부분으로 말단 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ2 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-6-TRB2라 명명하였다. 이 SubBi-6-TRB2를 절단하여, 585㎚에서 여기 시키면서, 610㎚에서 관찰하였다. SubBi-7의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-7-FB라 명명하였다. SubBi-7-FB를 절단한 결과를 492㎚에서 여기 시키면서, 516㎚에서 관찰하였다. SubBi-4의 5' 말단에는 6-JOE 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-4-JB라 명명하였다. SubBi-4-JB를절단한 결과를 535㎚에서 여기시키면서, 555㎚에서 관찰하였다.
밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 79: SubBi-2-A350B:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
서열 번호 60: SubBi-3 -Q6B2:
CAGCACAACCguCACCAACCG
서열 번호 61: SubBi- 6-TRB2:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
서열 번호 62: SubBi-7-FB:
TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA
서열 번호 83: SubBi-4-JB:
CATGGCGCACguTGGGAGAAGTA
14.3. 표적 서열 및 5개의 mRNA 표적 서열의 증폭용 PCR 프라이머
K562 세포로부터 추출한 인간 총 RNA를, 5개 표적 모두의 시험관 내 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 이하에 나열된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여, 시험관 내 증폭시켜 앰플리콘을 생산하였다.
서열 번호 32: 5' 프라이머 5RO5/1:
CATTCTATCATCAACGGGTA
서열 번호 33: 3' 프라이머 3RO5/1:
CAAAGGCAGATGGATCAG
서열 번호 63: 5' 프라이머 5 박틴:
CATTGCCGACAGGATGCAGA
서열 번호 64: 3' 프라이머 3 박틴:
GAGCCGCCGATCCACACG
서열 번호 65: 5' 프라이머 5BCR14 :
CACTCAGCCACTGGATTTAA
서열 번호 66: 3' 프라이머 3BCR15/6:
GCGCGTCTTTGCTTTATTC
서열 번호 67: 5' 프라이머 5HPRT/5:
CTTTGCTGACCTGCTGGATTA
서열 번호 68: 3' 프라이머 3HPRT/8:
CCTGTTGACTGGTCATTACAA
서열 번호 84: 5' 프라이머 5RO4/3
CAAGACTGGAGACAAAGTG
서열 번호 85: 3' 프라이머 3R04/2:
GCAGAGTTTCCTCTGTGATA
14.4. 반응 성분: 표적 서열의 증폭 및 정량
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열을 실 시간 증폭 및 정량하였다. 모든 반응을 Mx3005P™ QPCR 시스템(Stratagene)에서 수행하였다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 50℃, 30분 → 95℃, 7분 → 95℃, 15초 및 65℃, 30초(10회)(주기당 온도 1℃ 증가) → 95℃, 15초 및 54℃, 30초(40회). 반응물은 40nM의 5 박틴, 5BCR14, 5HPRT/5 및 80nM 5RO4/3, 5RO5/1 및 200nM 3 박틴, 3BCR15/6, 3HPRT/8 및 400nM 3RO4/2 및 3RO5/1을 포함하였다. β-액틴, BCR, RPLPO 엑손 4, 및 HPRT에 대한 파트자임 A 및 파트자임 B는 각각 200nM이 있었으며, 또한 RPLPO 엑손 5에 대한 파트자임 A 및 파트자임 B는 각각 400nM이 있었다. 200nM의 SubBi-2-A350B, SubBi-3-Q6B2, SubBi-6-TRB2 및 SubBi-7-FB, 그리고 400nM의 SubBi-4-JB도 있었다. 뿐만 아니라, 10mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 유닛의 Rnasin(Promega), 20 유닛의 M-MLV RT(H-)(Promega), 1×이모완충액(Bioline), 2 유닛의 이몰라제(Bioline) 그리고 5㎕의 총 RNA 주형(100ng, 20ng, 4ng, 800pg, 또는 160pg)을 포함하였거나, 아니면 상기 시약들을 모두 포함하되 표적은 함유하지 않았다(dH2O).
Figure 112008030855340-pct00006
[▲ 표 16: 5개의 상이한 핵산 표적의 동시 검출을 위한 반응의 반응물 성분]
14.5. 결과: 5개의 상이한 리포터 기질의 절단을 통한 5개의 상이한 표적 서열의 동시 증폭과 검출
RPLPO 엑손 4, BCR, β-액틴, RPLPO 엑손 5 및 HPRT 내에 존재하는 RNA 서열의 실 시간 검출 및 정량에 사용되는 5개의 MNA자임은, 사용된 표적 서열이 RT-PCR에 의해 증폭된 인간 총 RNA이었을 때, 시간이 경과함에 따라서 형광도를 증가시켰다(표 17). 5개의 반응 모두에 대한 RNA 비포함 표적 대조군의 형광도는 RNA 표적 함유 반응의 형광도보다 낮았으며, 반응 동안에도 증가하지 않았다(표 17). 이로써, 이후에 리포터 기질을 절단할 촉매 활성 MNA자임이 표적 의존적으로 조립됨에 따라서, 표적-함유 반응에서 발생하는 형광도가 증가함을 알 수 있다.
역치 사이클에 대한 RNA 농도의 로그 함수를 그래프로 나타냄으로써, 5개의 모든 표적에 대해 표준 곡선을 작성하였다(선형 그래프). 각각의 표준에 대한 역치(Ct)를 표 17에 나타내었다. 이 Ct 값은 2회 반응에서 얻어진 결과의 평균값이다. 각각의 표적에 대한 상관 계수(R2), 기울기 및 반응 효율도 표 17에 나타내었다.
5개의 상이한 핵산 표적의 동시 증폭 및 검출을 위한 반응의 결과
역치(Ct)
β-액틴
(FAM)		 RPLPO 엑손5
(JOE)		 BCR
(텍사스 레드)		 HPRT
(알렉사 350)		 RPLPO 엑손4
(쿼사 670)
100ng RNA 13.8 13.7 17.2 21.4 17.2
20ng RNA 16.3 17.0 19.5 23.5 19.8
4ng RNA 19.0 20.8 22.0 25.8 23.2
800pg RNA 21.9 24.0 24.3 28.6 26.0
160pg RNA 24.1 26.8 26.8 30.8 28.8
RNA 비포함
대조군		 신호 발생하지 않음 신호 발생하지 않음 신호 발생하지 않음 신호 발생하지 않음 신호 발생하지 않음
표준 곡선 R2 = 0.998
기울기 = -3.729
효율 = 85%		 R2 = 0.997
기울기 = -4.750
효율 = 62%		 R2 = 1.000
기울기 = -3.425
효율 = 96%		 R2 = 0.997
기울기 = -3.440
효율 = 95%		 R2 = 0.999
기울기 = -4.192
효율 = 73%
본 실시예의 MNA자임 RT-PCR 반응을 통해, 5개의 일반적 기질을 포함하는 하나의 복합 반응에서, 5개의 표적을 정량하기 위한 표준 곡선을 표적 검출과 동시에 작성할 수 있었다. 이와 같은 일반적 기질들은 단일 반응에서의 5개의 표적에 대한 기타 조합을 관찰하는데 적당하다.
실시예 15: 박테리아 내 리보좀 16S를 정량함에 있어서 MNA 자임의 사용
그램 균주의 박테리아 테스트를 대체하기 위하여, MNA자임을, 박테리아 종에서 살펴볼 수 있는 보존 핵산 서열을 바탕으로 하는, 멸균성 및/또는 미코플라스마 오염에 대한 신속 방출 테스트용으로 사용할 수 있다. MNA자임은 RT-PCR과 같은 시험관 내 표적 증폭법을 이용하여, 실 시간으로 표적 박테리아 핵산의 증폭 여부를을 관찰하는데 사용될 수 있다. 이 실시예에서는, 박테리아 리보좀 16S 서열에서 살펴볼 수 있는 보존 부위가 사용되며, 여기서, 역전사, PCR 증폭 및 MNA자임-매개 검출법은 하나의 튜브 내에서 동시에 수행된다.
몇몇 박테리아 종 예를 들어, 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 와너리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 클로스트리디움 스포로제네스(Clostridium sporogenes), 아시네토박터 우피(Acinetobacter woffii), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에 공통적인 리보좀 16S 서열의 특정 부위를 표적화하도록 시스템을 디자인하였다.
15.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임 올리고뉴클레오티드 A 및 B는 박테리아 종들 중 보존된 부위와 상보성인 센서 팔을 가지는 디자인 7을 사용하였다. 이 파트자임 올리고뉴클레오티드를 이하 제시하였는데, 여기서, "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산화되었음을 나타내는 것이다. 이하 서열에서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 나타낸 염기들은 기질과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 86: 파트자임 A5 16S1A5/2-P:
GGTTGTCGTCAGCTCGTG TACAACGA GAGGA A ACCTT-P
서열 번호 87: 파트자임 B6 16S1B6/2-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGC TCGTGAGATGTTGGGTTAAG-P
15.2. 리포터 기질
본 실시예에서 사용된 리포터 기질은 이하에 제시된 바와 같은 서열을 가지는(5'→3') SubBi-2였다. 이 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 516㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 492㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
15.3. 박테리아 내 리보좀 16S의 증폭용인 PCR 프라이머
본 실시예에 사용되는 표적 서열은 이하 제시한 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 사용하여, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 시험관 내 증폭시켜 생산되었다.
서열 번호 88: 5' 프라이머 516S1-1:
TGGTGCATGGTTGTCGTC
서열 번호 89: 3' 프라이머 316S1-1:
TTGCGCTCGTTGCGGGA
15.4. 표적 서열 및 대조군
박테리아 리보좀 RNA를 바실러스 서브틸리스 세포로부터 추출하여, 이를 16S 부위를 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다. RNA 대신에, 핵산 분해 효소가 없는 dH2O를 표적 비포함 대조군으로서 사용하였다.
15.5. 반응 성분: 표적 서열의 증폭 및 정량
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열을 실 시간 증폭 및 정량하였다. 모든 반응을 Mx3005P™ QPCR 시스템(Stratagene)에서 수행하였다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 50℃, 30분 → 95℃, 7분 → 95℃, 15초 및 65℃, 30초(10회)(주기당 온도 1℃ 감소) → 95℃, 5초 및 55℃, 30초(40회). 반응물은 40nM의 516S1-1 및 200nM의 316S1-1, 200nM 16S1A5/2-P 및 200nM 16S1B6/2-P, 200nM SubBi-2-FB, 7.5 mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 유닛의 Rnasin(Promega), 1×이모완충액(Bioline), 1 유닛의 이몰라제(Bioline)와, RNA 주형(500ng, 50ng, 5ng 또는 500pg)를 포함하였거나, 아니면 상기 시약들을 모두 포함하되 표적은 함유하지 않았다(dH2O).
15.6. 결과: 표적의 증폭 및 SubBi -2- FB 리포터 기질의 절단
사용된 표적 서열이 RT-PCR에 의해 증폭된 박테리아 RNA이었을 때, 박테리아 리보좀 16S의 실 시간 검출 및 정량에 사용되는 MNA자임은 시간이 경과함에 다라서 형광도를 증가시켰다. 주형을 포함하지 않는 대조군의 형광도는 RNA를 함유하는 반응물의 형광도에 비하여 낮았으며, 반응 동안에도 증가하지 않았다. 이로써, 이후에 리포터 기질을 절단할 촉매 활성 MNA자임이 표적 의존적으로 조립됨에 따라서, 표적-함유 반응에서 발생하는 형광도가 증가함을 알 수 있다. 역치 사이클에 대한 초기 RNA 농도의 로그 함수를 그래프로 나타내어 표준 곡선을 작성한 결과, 상관 계수 0.992인 선형 그래프가 그려졌다.
박테리아 리보좀 16S 앰플리콘의 증폭 및 검출을 위한 반응의 결과
시료(pg) 역치(Ct)
(2회 측정의 평균값)		 결과
500,000 12.5 표준 곡선
(2회 측정의 평균 값)
R2 = 0.992
기울기 = -4.461
효율 = 68%
50,000 16.4
5000 20.5
500 26.0
RNA 표적 비포함
대조군		 신호 발생하지 않음 신호 발생하지 않음
본 실시예는 박테리아 리보좀 16S RNA를 RT-PCR 증폭하여 생산된 앰플리콘을 검출 및 정량할 수 있는 MNA자임의 능력을 입증하는 것이다. 본 실시예에 사용된 MNA자임은, 스타필로코커스 캐피티스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스타필로코커스 와너리), 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토코커스 피오제네스, 클로스트리디움 스포로제네스, 아시네토박터 우피, 프로피오니박테리움 아크네스, 슈도모나스 에어루기노사 및 슈도모나스 플루오레센스에 100% 보존된 박테리아 16S의 특정 부위를 표적화한다. 그러므로, 단일 MNA자임 및 리포터 기질은 상기 박테리아 중 임의의 것의 존부에 대해 시료를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 신호(예를 들어, FAM)가 검출됨은 곧, 시료 내에 상기 박테리아 종들 중 하나 이상이 존재함을 나타내는 것이다.
실시예 16: 단일-튜브 RT - PCR 을 통한 바이러스 RNA 를 검출 및 정량함에 있어서 MNA자임의 사용
MNA자임은 시험관 내 표적 증폭법 예를 들어, RT-PCR을 사용하여, 실 시간으로 표적 핵산의 증폭 결과를 관찰하는데 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 실 시간 관찰을 통해서는 처음에 반응물 내에 존재하는 정량하고자 하는 표적의 양을 관찰할 수 있다. 본 실시예는 HIV 바이러스 RNA를 검출 및 정량하는데 있어서 MNA자임을 사용하는 것에 대해 기술하고 있다. 역전사, PCR 증폭 및 MNA자임 검출은 하나의 튜브 내 반응에서 수행되었다.
16.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
HIV-1의 Nef 유전자를 특이적으로 표적화하도록 파트자임을 디자인하였다. 이하 서열에 있어서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 나타낸 염기들은 기질과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산화되었음을 나타내는 것이다.
서열 번호 90: 파트자임 A4 NefA4/6-P:
GAAGAGGCCAATAAAGGAGAG ACAACGA GAGGCGTGAT-P
서열 번호 91: 파트자임 B5 NefB5/6-P:
CTGGGAGGAA GGCTAGCT AACACCAGCTTGTTACACC-P
16.2. 리포터 기질
본 실시예에 사용된 리포터 기질은 이하에 나타낸 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-6이다. SubBi-6의 5' 말단에는 텍사스 레드 부분으로 말단 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ2 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-6-TRB2라 명명하였다. 이 SubBi-6-TRB2를 절단하여, 585㎚(텍사스 레드의 여기 파장)에서 여기 시키면서, 610㎚(텍사스 레드의 방사 파장)에서 관찰하였다. 이하 서열에서, 아래 염기는 RNA를 나타내는 것이며, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 61: SubBi-6-TRB2:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
16.3. 표적 서열
본 실험에 있어서는 HIV-1 바이러스 RNA를 RT-PCR 증폭시켜 표준 곡선을 작성하였다. 키아젠 울트라센스 바이러스 키트(QIAGEN Ultrasens Virus Kit) HIV-1을 사용하여, HIV-1이 감염된 인간 CEMT4 세포로부터 수집한 배지에서 바이러스 RNA를 분리하였다. 바이러스 RNA 대신, 핵산 분해 효소를 포함하지 않는(NF) 물을 표적 비포함 대조군으로 사용하였다.
16.4. HIV -1 Nef 전사체 증폭용 PCR 프라이머
HIV-1 Nef 전사체를 증폭하기 위해 다음과 같은 프라이머를 사용하였다. 3' 프라이머인 Nef/3PCR는 역전사에 사용되었으며, 이후 이 프라이머와 5' 프라이머인 Nef/5PCR는 PCR 증폭 과정을 촉진하였다.
서열 번호 92: 프라이머 Nef/3PCR:
CAGGGTCATCCATTCCATGCAG
서열 번호 93: 프라이머 Nef/5PCR:
GCTAGTACCAGTTGAGCCAG
16.5. 반응 성분: 표적 서열의 증폭 및 정량
총 반응물 부피 25㎕에서 표적 서열을 실 시간 증폭 및 정량하였다. 모든 반응을 Mx3005P™ QPCR 시스템(Stratagene)에서 수행하였다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 50℃, 30분 → 95℃, 7분 → 95℃, 15초 및 65℃, 30초(10회)(주기당 온도 1℃ 감소) → 95℃, 15초 및 55℃, 30초(50회). 반응물은 200nM의 3' 프라이머 Nef/3PCR 및 40nM의 5' 프라이머 Nef/5PCR, 20OnM의 파트자임 NefA4/6-P 및 20OnM의 파트자임 NefB5/6-P, 200nM의 SubBi-6-TRB2, 10mM의 MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 유닛 Rnasin(Promega), 1×이모완충액(Bioline), 0.5 유닛의 이몰라제(Bioline), 10 유닛 M-MLV RT(H-), 그리고 총 RNA 주형(45,000pg, 4,500pg, 450pg, 45pg, 4.5pg 또는 0.45pg)(5㎕)을 포함하였거나, 또는 이 시약들을 모두 포함하되, 표적은 포함하지 않고 물만을 포함하였다.
16.6. 결과: 표적의 증폭 및 SubBi -6- TRB2 리포터 기질의 절단
사용된 표적 서열이 RT-PCR에 의해서 증폭된 HIV-1 바이러스 RNA이었을 때, HIV-1 Nef 전사체를 실 시간 검출 및 정량하는데 사용된 MNA자임은 시간이 경과 함에 따라서 형광도를 증가시켰다. 표적을 포함하지 않는 대조군 반응(물만을 함유)에서는 신호가 증가하지 않았다. 이를 통해, 이후에 리포터 기질을 절단할 촉매 활성 MNA자임은 표적 의존적으로 조립됨에 따라서, 표적을 함유하는 반응물에서 발생하는 형광도는 증가하였음을 알 수 있다.
역치 사이클(Ct)에 대한 각 반응물 내 RNA 주형의 양에 관한 로그 함수를 그래프로 나타냄으로써 표준 곡선을 작성하였다(선형 그래프). 각각의 표준에 대한 Ct를 상관 계수(R2), 기울기 및 반응 효율과 함께 표 15에 나타내었다.
HIV Nef 전사체의 증폭 및 검출 결과
시료 역치 사이클(Ct)
(2회 측정의 평균값)		 HIV 바이러스 RNA
(pg)		 결과
표준 1 5.22 45,000 보정 곡선
R2 = 0.996
기울기 = -4.271
효율 = 71.4%
표준 2 9.96 4,500
표준 3 13.78 450
표준 4 17.22 45
표준 5 22.09 4.5
표준 6 27.15 0.45
표적 비포함 대조군 신호 발생하지 않음 0 신호 발생하지 않음
본 실시예는, 바이러스 서열 예를 들어, HIV-1의 검출 및 정량에 사용될 때 MNA자임의 성능에 대해 입증하는 것이다.
실시예 17: MNA 자임의 촉매 활성에 관한 서열 조건
17.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
원래 발견되었던 10:23 DNA자임의 촉매 중심 부분은 15개의 뉴클레오티드를 포함한다(Santoro & Joyce, 1997). 촉매 중심 부분 내에 존재하는 중요 염기에 관한 이후의 연구에서는, 임의의 특이적인 염기 치환을 통해서 촉매 활성이 상당 수준 감소된 반면, 그 외의 염기 치환들은 촉매 활성에 거의 영향을 미치지 않는다는 사실을 알 수 있었다(Zaborowska외 다수).
본 실시예에서, 일련의 파트자임을 명명하고, 2개의 파트자임의 중심부 중 일부에 발생한 서열 변이가 MNA자임 촉매 중심 부분의 활성에 영향을 미치는지 여부를 관찰하기 위해 이를 테스트하였다. 인간 RPLPO 유전자를 검출하는 MNA자임의 변형되지 않은 파트자임 A와 파트자임 B를 대조군으로서 사용하였으며, 이를 다양한 돌연 변이 파트자임 서열과 비교하였는데, 여기서, 상기 중심부 중 일부에는 염기 치환이 1회 발생하였다. 표적을 검출하기 위해 사용된 파트자임 올리고뉴클레오티드는 디자인 7을 바탕으로 하였으며(실시예 20 참조), 이를 이하에 5'에서 3' 방향으로 나열하였다. 이하 서열에 있어서, 밑줄 친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 밑줄 친 염기, 이탤릭체로 나타낸 염기 및 굵은 글씨로 나타낸 염기는 대조군의 중심 서열 중 일부(돌연 변이되지 않은 서열)에 비하여 돌연 변이된 염기를 나타내는 것이고, 또한 굵은 글씨로 나타낸 염기들은 표적과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 나타낸 염기들은 기질과 혼성화되는 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 94: 파트자임 A5 RO4A5/2:
GGGCTGGTCATCCAGCAG TACAACGA GAGGAAACCTT
서열 번호 95: 파트자임 A5 RO4A5/2-G14A:
GGGCTGGTCATCCAGCAG TACAAC A A GAGGAAACCTT
서열 번호 96: 파트자임 A5 RO4A5/2-A9T:
GGGCTGGTCATCCAGCAG T T CAACGA GAGGAAACCTT
서열 번호 97: 파트자임 A5 RO4A5/2-A12T:
GGGCTGGTCATCCAGCAG TACA T CGA GAGGAAACCTT
서열 번호 98: 파트자임 A5 RO4A5/2-A11T:
GGGCTGGTCATCCAGCAG TAC T ACGA GAGGAAACCTT
서열 번호 99: 파트자임 B6 RO4B6/2:
TGCCCAGGGA GGCTAGC GTGTTCGACAATGGCAGCA
서열 번호 100: 파트자임 B6 RO4B6/2-C7A:
TGCCCAGGGA GGCTAG A GTGTTCGACAATGGCAGCA
서열 번호 101: 파트자임 B6 RO4B6/2-T4C:
TGCCCAGGGA GGC C AGC GTGTTCGACAATGGCAGCA
17.2. 리포터 기질
본 실시예에 있어서 리포터 기질은 다음과 같은 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-2이다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
17.3. 표적 서열
본 실험에서는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드를 표적 주형으로서 사용했다. 표적 서열을 이하에 나타냈다(5'→3').
서열 번호 102: RO4/2 표적:
ATGCTGCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGCCCAA
17.4. 반응 조건
스마트사이클러 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)를 사용하여 다양한 파트자임 쌍의 촉매 활성을 분석하였다. 기질을 첨가하여 반응을 개시하였으며, 전체 반응물의 총 부피는 25㎕이었다. 각각의 반응물은 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystems), 10mM MgCl2, 0.2μM의 SubBi-2FB, 2μM의 RO4/2 표적과, 파트자임 A 및 파트자임 B 쌍(각각 2μM)을 포함하였다. 각각의 반응에 사용된 파트자임 쌍을 이하 표 20에 나타내었다.
핵산 표적 검출용 반응의 반응물 성분
반응물 파트자임 A 파트자임 B 복제 횟수
대조군(돌연 변이되지
않은) 파트자임 A 및 B		 RO4A5/2 RO4B6/2 6
돌연 변이된 파트자임 A(G14A) 및
대조군 파트자임 B		 RO4A5/2-G14A RO4B6/2 3
돌연 변이된 파트자임 A(A12T) 및
대조군 파트자임 B		 RO4A5/2-A12T RO4B6/2 3
돌연 변이된 파트자임 A(A11T) 및
대조군 파트자임 B		 RO4A5/2-A11T RO4B6/2 3
돌연 변이된 파트자임 A(A19T) 및
대조군 파트자임 B		 RO4A5/2-A9T RO4B6/2 3
대조군 파트자임 A 및
돌연 변이된 파트자임 B(C7A)		 RO4A5/2 RO4B6/2-C7A 3
대조군 파트자임 A 및
돌연 변이된 파트자임 B(T4C)		 RO4A5/2 RO4B6/2-T4C 3
반응물을 54℃에서 30분 동안 항온 처리한 다음, 12초 간격으로 형광 데이터를 수집하였다. 스마트사이클러 시스템 열 사이클 반응기 상 각각의 웰에서의 출발 형광도는 상이할 수 있으므로, 각 반응에 있어서 각 시점에서의 형광도로부터 처음 형광도 수치를 공제하여, 상이한 웰 내 반응을 비교할 수 있도록 하였다. 이후, 돌연 변이된 파트자임 A 또는 돌연 변이된 파트자임 B를 함유하는 복제 반응물의 형광도 평균값을 대조군 복제물에 대한 형광도의 비율로서 표시하였다.
17.5. 결과: SubBi -2- FB 리포터 기질의 절단 여부 검출
다양한 파트자임 쌍에 의해 기질을 절단한 결과를 시간이 경과 함에 따른 형광도 변화로 측정하였다. 이후, 각 반응에 대해 정규화된 형광도 수치를 동일한 시점에서의 대조군 반응물에서 관찰된 형광도의 비율로 나타내었다(표 21).
Figure 112008030855340-pct00007
[▲ 표 21: 다양한 파트자임 서열 변이(* 본 실시예)의 절단 활성 및 변이체 10:23 DNA자임(** Zaborowska)의 활성과의 비교]
본 실험을 통해, 파트자임 A 또는 파트자임 B 중 어느 하나의 촉매 중심 부분 중 일부에서 발생하는 다양한 치환들로 인해 활성 MNA자임이 형성되었음을 알 수 있다. 이와는 대조적으로, 기타 치환들은 잘 허용되지 않았으며, 또한 이러한 치환으로 인해서 촉매 활성을 거의 가지지 않는 구조물이 생성되었다. MNA자임을 사용하여 얻어진 결과를, 10:23 DNA자임 촉매 중심 부분 내에 발생한 동등한 치환으로 인해 얻어진 결과와 비교하였을 때(Zaborowska외 다수), 상기와 유사한 패턴이 관찰되었다(표 21). 예를 들어, 파트자임 A 내부 또는 10:23 중심부의 내부의 14번 위치에 있던 A를 G로 치환하면(G14A), 절단 활성은 90% 초과하여 상실된다. 이와는 반대로, 파트자임 A 내부 또는 10:23 중심부의 내부의 12번 위치에 있던 T를 A로 치환하면(A12T), 대조군 서열에 비하여, 절단 활성을 약 80% 보유하는 분자가 생성되었다.
그러므로, 기타 서열 치환(즉, DNA자임이 활서을 갖도록 하는 치환(예를 들어, 10:23 DNA자임 또는 8:17 DNA자임))에 관한 문헌에서 살펴볼 수 있는 정보를 통해, 동일한 서열 변이가 파트자임 중 어느 하나에 도입되었을 때 예상되는 촉매활성을 예측할 수 있었다. 뿐만 아니라, 당 업자는 활성 MNA자임인, 추가의 파트자임 촉매 중심 부분 서열 일부의 변이체를 동정하기 위하여 실험적으로 테스트할 수도 있었다.
실시예 18: 소분자 예를 들어, 아데노신 5'- 트리포스테이트를 포함하는 표적을 검출함에 있어서 MNA 자임의 사용
앱타머는 고도의 친화성과 특이성을 가지는 표적과 결합하는 능력을 가지도록, 다량의 무작위 서열 올리고뉴클레오티드 풀로부터 시험관 내 생성된 단일 사슬형 DNA 또는 RNA 분자이다. 앱타머는 다양한 유형의 표적들 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지질, 뉴클레오티드, 전체 세포 및 바이러스에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 선택되었다. 본 실시예에서, 앱타머 서열은 파트자임의 말단부에 일정한 형태로 통합되며(앱타-파트자임), 그 결과, 활성 MNA자임은 표적이 존재하는 경우에만 형성되게 된다. 이러한 목표를 달성하기 위한 방법이 여러 가지 존재하는데, 그 예로서는, 도 4에 개략적으로 도시된 기법과, 다음과 같은 실시예에 사용된 기법(도 20)이 있다.
도 20에 도시된 MNA자임 검출 기법에 필요한 핵산 올리고뉴클레오티드로서는 표준 파트자임을 포함하는데, 이 파트자임은 다음과 같은 성분들을 포함한다;
a) 앱타머가 양 말단부 중 어느 한쪽 말단에 통합되어 있는 파트자임인 앱타-파트자임;
b) 활성 MNA자임의 조립을 가능하게 하는 파트자임과 앱타-파트자임 둘 다와 결합하는 올리고뉴클레오티드인 조립 촉진 인자;
c) 리포터 프로브 기질; 및
d) 앱타머 서열의 적어도 일부와 파트자임 서열의 기질 결합 팔의 적어도 일부에 걸쳐 확장되어 있는 부위에 존재하는, 앱타-파트자임과 혼성화하는 억제 올리고뉴클레오티드.
앱타머에 결합하는 표적이 존재하지 않는 경우(도 20의 좌측 패널), 억제 올리고뉴클레오티드는 앱타-파트자임에 결합하므로, 리포터 프로브 기질이 결합(및 절단)하는 것이 차단된다. 앱타머에 결합하는 표적이 존재하는 경우(도 20의 우측 패널), 표적은 앱타-파트자임의 앱타머 서열과 결합하여, 억제 올리고뉴클레오티드가 결합하는 것을 막아주며, 그 결과, 리포터 프로브 기질의 결합 및 절단이 가능하게 된다. 그러므로, MNA자임은 표적이 존재하는 경우에만 형광 신호를 발생 및 유도할 수 있는 것이다.
이 기법은 소분자인 ATP를 검출함으로써 입증되었다. 본 실시예에 사용된 길이가 27개 뉴클레오티드인 앱타머 서열은 ATP 및 dATP의 결합에 매우 특이적인 것으로서 보고된 바 있다[Achenbach, 2005; Huizenga and Szostak, 1995].
18.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드, 조립 및 억제 올리고뉴클레오티드
본 실시예에서, ATP 앱타머 서열은 앱타-파트자임 A의 기질 팔에 인접하여 배치되었다(도 20). 앱타-파트자임 A와 파트자임 B의 센서 팔을 조립 촉진 인자와 결합하도록 디자인하였다. 앱타-파트자임 AtpA2/1 및 파트자임 Atp B3/1의 서열(도 21)을 이하에 나타내었다(5'→3'). 이하 서열에서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 조립 촉진 인자와 혼성화하는 것이며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 활성 촉매 중심 부분의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다. 뿐만 아니라, 파트자임 AtpA2/1 내 보통 글씨로 표시한 염기들은 ATP 또는 dATP와 결합하는 DNA 앱타머 서열들을 나타내는 것이다.
서열 번호 103: 앱타-파트자임 A2 AtpA2/1:
AACGTACACTGCACG CGGTCGAA ATAGTGAGTACCTGGGGGAGTATTGCGGA
GGAAGGT
서열 번호 104: 파트자임 B3 AtpB3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC GTCTGTACCGTGTAC
조립 촉진 인자의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3'):
서열 번호 105: 조립 촉진 인자 AtpC/1:
GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT
억제 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3'):
서열 번호 106: 억제제 AtpR/1:
CCAGGTACTCACTATTT
18.2. 리포터 기질
이중으로 표지된 핵산 리포터 기질을 절단하여 MNA자임 활성을 관찰하였다. 본 실시예에 사용된 리포터 기질은 이하의 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-1-FB이다. 아래 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 밑줄 친 염기는 5' 말단부의 6-FAM 부분의 위치와 3' 말단부의 BHQ1 부분의 위치를 나타내는 것이다. FAM과 BHQ1 사이에 있는 리보뉴클레오티드에서 이 SubBi-1-FB를 절단함으로써 유도되는 형광도 변화를 520㎚에서 관찰하였으며(FAM 방사 파장), 이때 490㎚에서 여기시켰다(FAM 여기 파장)
서열 번호 6: SubBi-1-FB :
ACTCACTATaGGAAGAGATG
18.3. 표적
본 실시예에 사용된 표적 분자는 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)와 데옥시아데노신 5'-트리포스페이트(dATP)였다. 구아노신 5'-트리포스페이트(GTP) 및 시토신 5'-트리포스페이트(CTP)는 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 모든 분자들은 바이오라인(Bioline)으로부터 구입하였다. 핵산 분해 효소를 포함하지 않는 물을 표적 비포함 대조군으로 사용하였다.
18.4. 반응 조건
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생되는 형광 신호의 증가 여부로써 표적을 검출하였다. 기질DMF 첨가하여 반응을 개시하였으며, 이때 총 반응물의 부피는 50㎕였다. 기질을 주입하기 전에, 모든 반응물을 60℃에서 5분 동안 예비 항온 처리하였다(2차 구조물이 생성되는 것을 줄이기 위함). 47℃의 플루오스타 옵티마(FLUOstar OPTIMA; BMG Biotech) 상에서 반응을 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도는 총 10분 동안 3초마다 판독하였다. 각각의 반응물은 최종 농도 200nM AtpA2/1, 200nM AtpB3/1, 200nM AtpC/1, 200nM AtpR/1, 200nM SubBi-1-FB, 25mM MgCl2, 50mM Tris HCl pH 7.5 및 2mM의 ATP, dATP, GTP 또는 CTP를 포함하였거나, 아니면, 위의 시약을 전부 포함하되 표적은 포함하지 않았다(물).
18.5. 결과: SubBi -1- FB 리포터 기질의 검출 및 절단
ATP 또는 dATP가 존재하지 않을 때, 형광도는 낮은 수준으로 관찰되었으며, 이때, 형광도는 시간이 경과함에 따라서도 증가하지 않았는데, 이는 곧, 억제 올리고뉴클레오티드가 활성 MNA자임의 조립을 억제할 수 있음을 입증하는 것이다(도 21). ATP 또는 dATP가 존재할 때, 형광 신호는 더욱 높았으며, 또한 시간이 경과함에 따라서도 증가하였다. 이는 곧, 억제 올리고뉴클레오티드가 dATP 및 ATP에 의해 치환되어, 활성 MNA자임이 형성되었음을 나타내는 것이다. GTP 및 CTP가 존재할 때의 형광 신호가, ATP 또는 dATP가 존재하지 않을 때 즉, 피분석물 물 대조군이 존재하지 않을 때의 형광 신호와 동일하였던 것으로 보아, MNA자임의 조립은 표적 의존적이었다. 이 실시예는, 표적에 대해 보다 특이적인 연구 방법에서 핵산 표적과 비 핵산 표적 둘 다를 포함하는 표적 검출시 MNA자임이 앱타머와 커플링될 수 있음을 입증하는 것이다.
당 업자는 이 기법의 디자인이 융통적일 수 있음을 알 것이다. 앱타머는 촉매 중심 서열 중 일부를 함유하는 2개의 파트자임 중 어느 하나의 양 말단 중 한쪽 말단(5' 말단 또는 3' 말단)에 통합될 수 있다. 그러므로, 억제 올리고뉴클레오티드는 앱타머 부위에 결합할 수 있으며, 또한 (리포터 기질과 계합하는) 기질 팔 또는 (조립 촉진 인자와 결합하는) 센서 팔 중 어느 하나와 결합할 수 있다. 전자의 디자인에 있어서(도 20; 본 실시예), 억제제는 리포터 기질의 결합을 차단한다. 후자의 디자인에 있어서, 억제제는 조립 촉진 인자가 파트자임과 결합하는 것을 막을 것이며, 이로써 활성 MNA자임이 형성되지 못할 것이다.
문헌에는, 다양한 유형의 표적을 검출할 수 있는 다수의 앱타머에 대한 서열이 개시되어 있다. 이러한 표적으로서는 단백질, 탄수화물, 지질, 프리온, 뉴클레오티드, 전체 세포 및 바이러스를 포함한다. 이와 같은 종류의 표적 모두에 대한 앱타머는 파트자임과 결합하여, 매우 다양한 분자들을 검출할 수 있었다. 표적과 앱타머의 결합(또는 표적과 앱타-파트자임의 결합)과, MNA자임에 의한 리포터 기질의 절단에 적합한 반응 조건들(완충액, 온도, 2가 양이온 농도 등)은 실험에 의한 테스트로써 측정될 수 있다. 뿐만 아니라, 앱타머는 연구자에 의해 선택되는 반응 조건 하에서 시험관 내 생성되므로, 앱타머가 MNA자임 절단에 적합한 조건 하에서 결합할 임의의 목적 표적으로 발달할 수 있도록, 분자의 생성을 조정하는 것도 가능할 것이다. MNA자임은 광범위한 조건에서 활성을 가지므로, 당 업자는 MNA자임 절단에 적합한 조건을 용이하게 결정할 수 있었다.
실시예 19: 단일 염기 미스 매치를 검출함에 있어서 MNA 자임의 사용
MNA자임은 시험관 내 표적 증폭법 예를 들어, PCR을 이용하여, 실 시간으로 표적 핵산을 검출 및 정량하는데 사용될 수 있다. MNA자임은 또한 예를 들어, 핵산 서열 내에서의 변이를 검출함으로써 분석 결과를 도출해 내는데 사용될 수도 있다. MNA자임-매개 표적은 센서 팔과 표적 서열의 왓슨-크릭 염기 인식을 통해 검출될 수 있다. 본 실시예에서, MNA자임은, 파트자임 센서 팔과 표적 핵산 서열 사이의 상보성에 대한 이와 같은 조건을 연구함으로써, 단일 염기 미스 매치를 검출하는데 사용된다.
19.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
파트자임 올리고뉴클레오티드를 표적 서열에 완전히 상보성이 되도록, 또는 표적 서열과 미스 매치되도록 디자인하였다(도 22(i)). 완전히 매치된 파트자임 A(RO5A5/2(22)-P), 완전히 매치된 파트자임 B(RO5B6/2(11G)-P), 그리고 미스 매치된 파트자임 B(RO5B6/2(11C)-P)의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'). 이하 서열에서, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 적어도 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다. 파트자임 RO5B6/2(11C)-P 내 미스 매치된 염기는 굵은 글씨에 밑줄을 그어 표시하였다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산화되었음을 나타내는 것이다.
서열 번호 107: 파트자임 A5 RO5A5/2(22)-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT TACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 108; 파트자임 B6 RO5B6/2(11G)-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGC GTGGAGACGGA-P
서열 번호 109: 파트자임 B6 RO5B6/2(11C)-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGC GT C GAGACGGA-P
19.2. 리포터 기질
본 실시예에 있어서 리포터 기질은 SubBi-2이다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. SubBi-2-FB의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'); 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
19.3. RPLPO 엑손 5 증폭용 PCR 프라이머
본 실시예에 사용되는 표적 서열은 이하 제시한 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머(5'→3')를 사용하여 인간 게놈 DNA를 시험관 내 증폭함으로써 생산하였다.
서열 번호 32: 프라이머 5RO5/1:
CATTCTATCATCAACGGGTA
서열 번호 110: 프라이머 3RO5/2:
AGCAGCCACAAAGGCAGA
19.4. 표적 서열 및 대조군
인간 K562 세포주로부터 추출한 인간 게놈 DNA를 RPLPO 유전자 증폭용 주형으로 사용하였다. 게놈 DNA 대신에, 핵산 분해 효소가 없는(NF) 물을 표적 비포함 대조군으로 사용하였다.
19.5. 반응 성분: 표적 서열의 증폭 및 검출
표적 서열의 실시간 증폭 및 정량을 총 반응물 부피 25㎕에서 수행하였다. 모든 반응을 ABI7700 열 사이클 반응기(Applied Biosystems) 내에서 수행하였다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 95℃, 7분 → 95℃, 15초 및 65℃, 30초(10회)(1 사이클당 온도는 1℃씩 낮아짐) → 95℃, 15초 및 47℃, 30초(50회). 반응물은 40nM 5RO5/1, 200nM의 3RO5/2, 200nM RO5A5/2(22)-P 및 200nM RO5B6/2(11G)-P 또는 200nM RO5B6/2(11C)-P, 200nM SubBi-2-FB, 10mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 10 유닛의 Rnasin(Promega), 1×ROX 기준 물질(Invitrogen), 1×이모완충액(Bioline), 1 유닛의 이몰라제(Bioline)와 100ng의 게놈 DNA 주형을 포함하였거나, 또는 상기 시약들을 모두 포함하되, 표적 대신 NF-물을 포함하였다.
19.6. 결과: MNA 자임을 이용한 단일 염기 미스 매치 검출
사용된 표적 서열이 PCR에 의해 증폭된 인간 게놈 DNA이었을 때, 완전히 매치되는 센서 팔 B를 포함하는 MNA자임은 시간이 경과함에 따라서 형광도를 증가시켰다(도 22(ii)). 이와는 반대로, 미스 매치되는 센서 팔 B를 포함하는 MNA자임은 게놈 표적과 함께 존재할 경우 형광도를 낮은 수준으로 나타냈는데, 이는 표적을 함유하지 않는(시간이 경과함에 따라서 형광도가 증가하지 않는) 대조군에서 관찰되는 결과와 유사하였다. 그러므로, 하나의 미스 매치된 3개의 염기들(파트자임 A 및 파트자임 B의 접속부 유래)은 활성 MNA자임의 형성을 막는데 충분하였다.
본 실시예는, MNA자임이 표적과 센서 팔 사이의 단일 염기 미스 매치를 검출하는데 사용될 수 있음을 입증하는 것이다. MNA자임은 하나의 염기가 변이된 것과 같이 미세한 변이까지도 검출할 수 있기 때문에, 당 업자는 MNA자임이 미세한 결실이나 미세한 삽입에 의해 차이가 나는 서열을 구별하는데에도 사용될 수 있음을 명확히 알 것이다. 뿐만 아니라, 규모가 보다 큰 변이 예를 들어, 다양한 암 류와 관련된 전좌(융합 전사체를 생성함)도 검출할 수 있었다. 이와 같은 변이는 종종 백혈병과 관련되어 발생하는데, 예를 들어, PML / RAR α 융합 전사체는 급성 전골수성 백혈병과 관련되어 있고, bcr / abl 융합 전사체는 만성 과립구성 백혈병과 관련되어 있다.
본 실시예를 통해, 하나의 미스 매치만으로도 활성 MNA자임의 조립을 방지하는데 충분할 수 있음을 알 수 있지만, 추가의 실험을 통해서 모든 단일 미스 매치가 모든 조건에서 MNA자임 조립을 완전히 파괴하지는 않는다는 사실도 입증되었다. 단일 염기 미스 매치를 구별할 수 있는 능력은 몇 가지 요인 예를 들어, a) 다수의 인자 예를 들어, 온도, 염 농도, 양이온 농도에 의해 영향받을 수 있는 반응 조건의 엄중도, b) 미스 매치 유형 예를 들어, G/T 미스 매치인지, 아니면, C/C 미스 매치인지, c) 파트자임 팔 내부에 발생한 미스 매치의 위치와, d) 파트자임 팔의 길이에 따라서 달라진다.
MNA자임이 단일 염기의 다형성을 검출할 수 있는 능력을 증가시키기 위하여 추가 기법이 사용될 수 있다. 이러한 기법으로서는 예를 들어, 실시예 22에 기술되어 있는 바와 같이, 절단형 파트자임 센서 팔을 사용하는 방법을 포함한다.
실시예 20: 10:23 촉매 중심 부분로부터 유래하는 변이체 촉매 중심 부분 서열의 일부를 함유하는 일련의 파트자임 쌍에 관한 MNA 자임 활성 테스트
시험관 내에서 생성시킨 다양한 DNA자임으로부터 유래하는 부분 서열을 통합하는 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 제조할 수 있다. 8:17 DNA자임 및 10:23 DNA자임으로부터 유래하는 부분적 서열을 주성분으로 하는 활성 MNA자임에 관하여는 이미 기술된 바 있다. 뿐만 아니라, 8:17 DNA자임 및 10:23 DNA자임을 주성분으로 하는 몇몇 대안적 파트자임 디자인[활성을 가지는 것(실시예 1 및 3, 도 9, 10 및 13) 또는 활성을 가지지 않는 것(실시예 1, 도 8)]도 도시 및 기술되어 있다. 본 실시예는 이러한 연구의 범위를 더욱 확대하여, 10:23 DNA자임으로부터 유래하는 촉매 중심 서열 일부를 주성분으로 하는 활성 및 불활성 파트자임 서열 둘 다를 동정한다. 또한, 본 실시예에서는, 촉매 중심 부분 서열을 나누는 최적 위치(들)를 동정하여, 촉매 중심 부분 서열 일부가 파트자임에 통합될 때, 기능상 활성인 MNA자임을 생산하는 단계에 대한 일반적인 프로토콜을 제공한다.
20.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
본 실시예의 방법은 10:23 촉매 중심 부분 서열 내 어느 위치가 촉매 중심 부분 서열의 일부 즉, 파트자임에 통합됨에 따라서 기능상 활성인 MNA자임을 생성하는 서열을 나누는데 적합한지를 연구하는데 사용되었다. 10:23 서열을 다양한 지점에서 나누었으며, 이후, 표적(인간 RPLPO 유전자)이 존재할 때 기질을 절단하도록 디자인된 일련의 파트자임 쌍들에 이 2개의 부분 서열들을 통합시켰다. 각각의 파트자임 쌍에 대하여 테스트된 촉매 중심 부분의 일부를, 10:23 DNA자임의 촉매 중심 부분 전체 서열을 참고로 하여, 표 22에 나타내었다(Santoro and Joyce, 1997).
Figure 112008030855340-pct00008
[▲ 표 22: 10:23 DNA자임의 염기와 위치, 및 중심부의 1∼15번 위치에 존재하는 염기가 2개의 파트자임 즉 파트자임 A 및 파트자임 B 사이에 상이하게 분포되어 있는, 일련의 변이체 파트자임 쌍의 염기와 위치]
* 상기 표 22에 있어서, 모든 서열은 5'→3' 방향으로 기재하였다. MNA자임 디자인과 파트자임의 명명법은 표 3에 적용된 방식을 그대로 적용하였으며, 상기 표 22는 중심부 내 나누어지는 위치를 동정하는 것에까지 범위를 확대하였다. 예를 들어, 디자인 6은 파트자임 A4와 파트자임 B5 디자인을 가지는 MNA자임으로부터 유래된 10:23으로서(A4:B5), 여기서, 중심부는 8번 위치의 T와 9번 위치의 A 사이에서 나누어졌다(T8-A9).
본 실험에서, 일련의 파트자임 쌍은 모두 인간 RPLPO 유전자의 엑손 5와 혼성화되도록 디자인된 센서 팔과, 기질 SubBi-2에 대해 생성된 기질 팔을 포함하도록 합성되었다. 본 실험에서 사용된 파트자임 쌍은 시그마-프로리고(Sigma-Proligo)에 의해 합성되었으며, 이것의 서열은 이하에 나타내었다(5'→3'). 이하 서열에서, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 적어도 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산화되었음을 나타내는 것이다.
RPLPO 파트자임 쌍 A4:B5 서열 번호 147: RO5A4/2-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 112: RO5B5 (16)/2-P
TGCCCAGGGA GGCTAGCT GTGGAGACGGATTACA-P
RPLPO 파트자임 쌍 A5:B6
서열 번호 107: RO5A5/2(22)-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT TACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 114: RO5B6(16)/2-P
TGCCCAGGGA GGCTAGC GTGGAGACGGATTACA-P
RPLPO 파트자임 쌍 A6:B7
서열 번호 115: RO5A6(22)/2-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 116: RO5B7(16)/2-P
TGCCCAGGGA GGCTAGCTACA GTGGAGACGGATTACA-P
RPLPO 파트자임 쌍 A7:B8
서열 번호 117: RO5A7(22)/2-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT CAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 118: RO5B8(16)/2-P
TGCCCAGGGA GGCTAGCTA GTGGAGACGGATTACA-P
RPLPO 파트자임 쌍 A8:B9
서열 번호 119: RO5A8(22)/2-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT CTACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 120: RO5B9(16)/2-P
TGCCCAGGGA GGCTAG GTGGAGACGGATTACA-P
RPLPO 파트자임 쌍 A9:B10
서열 번호 121: RO5A9(22)/2-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT GCTACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 122: RO5B10(16)/2-P
TGCCCAGGGA GGCTA GTGGAGACGGATTACA-P
20.2. 리포터 기질
본 실시예에 있어서 리포터 기질은 이하의 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-2이다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
20.3. 인간 RPLPO 유전자의 엑손 5 증폭용 PCR 프라이머
프라이머 서열을 이하에 5'→3' 방향으로 나타내었다.
서열 번호 123: 5' 프라이머 5RO5/2
GCTACCCAACTGTTGCATC
서열 번호 110: 3' 프라이머 3RO5/2
AGCAGCCACAAAGGCAGA
20.4. 표적 주형
K562 세포로부터 추출한 인간 게놈 DNA를 PCR 반응에서 주형으로 사용하였다.
20.5. 반응 조건
표적 서열의 실시간 증폭 및 파트자임 쌍의 촉매 활성 검출을 총 반응물 부피 25㎕에서 수행하였으며, 이때, 모든 반응은 ABI7700 열 사이클 반응기(Applied Biosystems) 내에서 진행시켰다. 사이클 매개 변수는 다음과 같았다: 95℃, 7분 → 95℃, 15초 및 65℃, 30초(10회)(1 사이클당 온도는 1℃씩 낮아짐) → 95℃, 15초 및 50℃, 30초(50회). 각각의 반응물은 0.04μM의 5RO5/1, 0.2μM의 3RO5/2, 10mM MgCl2, 50μM의 각 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1×이모완충액(Bioline), 0.2μM SubBi-2-FB, 1×ROX 기준 염료(Invitrogen), 10 유닛의 Rnasin(Promega) 및 1 유닛의 이몰라제 중합 효소(Bioline) 및 100ng의 게놈 DNA를 포함하였다. 뿐만 아니라, 각각의 반응물은 한 쌍의 파트자임 즉, 0.2μM의 파트자임 A 및 0.2μM의 파트자임 B를 포함하였다[RPLPO 파트자임 쌍 A4:B5 또는 A5:B6 또는 A6:B7 또는 A7:B8 또는 A8:B9 또는 A9:B10].
20.6. 결과
실 시간 MNA자임-PCR법을 이용하여, 6개의 RPLPO 파트자임 쌍 중 3개로부터 촉매 활성을 검출하였다. 파트자임 쌍 A4:B5와 A5:B6는 촉매 활성 수준이 높았는데, 그 결과, 22회 이하의 횟수로 순환시켰을 때 표적을 검출할 수 있었다(표 23). A7:B8 파트자임 쌍도 활성을 가졌으나, A4:B5 및 A5:B6보다는 활성이 낮았다. 본 실험 조건 하에서 파트자임 쌍 A6:B7, A8:B9 또는 A9:B10에서는 촉매 활성이 검출되지 않았다.
다양한 파트자임 쌍을 이용하여 얻은 역치 사이클(Ct)
중심부 나눔 형태
(본 실시예의
상기 표 22 참조)		 Ct 비고
A4:B5(T8-A9) 19.3 본 파트자임 내 촉매 중심 부분 서열 일부를 이와 같이 조합하였을 경우, 활성 MNA자임이 형성됨.
A5:B6(C7-T8) 21.6 본 파트자임 내 촉매 중심 부분 서열 일부를 이와 같이 조합하였을 경우, 활성 MNA자임이 형성됨.
A6:B7(A11-A12) 50회 사이클시
신호 발생하지 않음		 이러한 실험 조건 하에서, 본 파트자임 내 촉매 중심 부분 서열 일부를 이와 같이 조합하였을 경우, 활성 MNA자임은 형성되지 않음.
A7:B8(A9-C10) 31.7 본 파트자임 내 촉매 중심 부분 서열 일부를 이와 같이 조합하였을 경우, 활성 MNA자임이 형성됨.
A8:B9(G6-C7) 50회 사이클시
신호 발생하지 않음		 이러한 실험 조건 하에서, 본 파트자임 내 촉매 중심 부분 서열 일부를 이와 같이 조합하였을 경우, 활성 MNA자임은 형성되지 않음.
A9:B10(A5-G6) 50회 사이클시
신호 발생하지 않음		 이러한 실험 조건 하에서, 본 파트자임 내 촉매 중심 부분 서열 일부를 이와 같이 조합하였을 경우, 활성 MNA자임은 형성되지 않음.

상기 Ct값은, 최소 형광도 수준을 0.2로 설정하고 기준 백 그라운드 형광도는 제1 사이클 및 제14 사이클 사이의 형광도에서 공제하였을 때, 3회 실시된 반응의 평균값임
실시예 21: 단백질 표적을 검출함에 있어서 MNA자임의 사용
실시예 18에 기술된 바와 같이, MNA자임은 파트자임의 말단부에 앱타머 서열을 통합함으로써(앱타-파트자임), 표적을 검출하는데 사용할 수 있다. 본 실시예에서는, Taq 중합 효소와 고도의 특이성으로 결합하는 것으로 보고된 바 있는, 길이 46 뉴클레오티드인 앱타머 서열을 이용하여 단백질 Taq 중합 효소를 검출하는데 있어서, 동일한 MNA자임 검출 기법(도 20)을 사용하였다[Yakimovich, 2003]. 조립 촉진 인자 및 파트자임 B 올리고뉴클레오티드는, MNA자임을 사용하여 ATP를 검출하는 실시예 18에 사용된 것과 동일한 것이었다.
21.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드, 조립 올리고뉴클레오티드 및 억제 올리고뉴클레오티드
본 실시예에서, Taq 중합 효소 앱타머 서열은 앱타-파트자임 A의 기질 팔에 인접하여 위치하였다(도 20). 앱타-파트자임 A와 앱타-파트자임 B의 센서 팔을 조립 촉진 인자와 결합하도록 디자인하였다. 파트자임 TaqA2/1 및 파트자임 Atp B3/1의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3'). 이하 서열에서, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 조립 촉진 인자와 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 활성 촉매 중심 부분의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다. 뿐만 아니라, 파트자임 A2 TaqA2/1 내 보통 글씨로 표시한 염기들은 Taq 중합 효소에 결합하는 DNA 앱타머 서열들을 나타내는 것이다.
서열 번호 124: 앱타-파트자임 A2 TaqA2/1:
AACGTACACTGCACG CGGTCGAA ATAGTGAGTGCGGTCGGCTCGGGGCATTC
TTAGCGTTTTGCCCCGAGCCGACCGC
서열 번호 104: 파트자임 B3 AtpB3/1:
CATCTCTTCT CCGAGC GTCTGTACCGTGTAC
조립 촉진 인자의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3'):
서열 번호 105: 조립 촉진 인자 AtpC/1:
GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT
억제 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3'):
서열 번호 125: 억제제 TaqR/1:
TGCCCCGAGCCGACCGAACTCACTATTT
21.2. 리포터 기질
이중으로 표지된 핵산 리포터 기질을 절단하여 MNA자임 활성을 관찰하였다. 본 실시예에 사용된 리포터 기질은 이하의 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-1-FB이다. 아래 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 밑줄 친 염기는 5' 말단부의 6-FAM 부분의 위치와 3' 말단부의 BHQ1 부분의 위치를 나타내는 것이다. FAM과 BHQ1 사이에 있는 리보뉴클레오티드에서 이 SubBi-1-FB를 절단함으로써 유도되는 형광도 변화를 520㎚에서 관찰하였으며(FAM 방사 파장), 이때 490㎚에서 여기시켰다(FAM 여기 파장)
서열 번호 6: SubBi-1-FB :
ACTCACTATaGGAAGAGATG
21.3. 표적
본 실시예에 사용된 표적 분자는 Taq DNA 중합 효소(Amersham Biosciences)였으며, 클레노우 중합 효소(Klenow polymerase; Amersham Biosciences)는 네거티브 대조군으로 사용하였다. 핵산 분해 효소를 포함하지 않는 물은 "표적 비포함" 대조군으로 사용하였다.
21.4. 반응 조건
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생되는 형광 신호의 증가 여부로써 표적의 검출 여부를 확인하였다. 기질을 첨가하여 반응을 개시하였으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 50㎕였다. 40℃의 플루오스타 옵티마(BMG Biotech) 상에서 반응을 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도는 총 15분 동안 6초마다 판독하였다. 각각의 반응물은 최종 농도 200nM TaqA2/1, 200nM AtpB3/1, 200nM AtpC/1, 200nM TaqR/1, 200nM SubBi-1-FB, 25mM MgCl2, 25mM Tris HCl pH 6.8와, 5 유닛의 Taq DNA 중합 효소 또는 5 유닛의 클레노우 중합 효소를 포함하였거나, 아니면, 위의 시약을 전부 포함하되 단백질은 포함하지 않았다(물만 포함).
21.5. 결과: SubBi -1- FB 리포터 기질의 검출 및 절단
Taq 중합 효소가 존재하지 않을 때, 형광도는 낮은 수준으로 관찰되었는데(시간이 경과 함에 따라서 형광도는 약간만 증가하였을 뿐임), 이로써, 억제 올리고뉴클레오티드가 활성 MNA자임의 조립을 억제할 수 있었음을 알 수 있다. Taq 중합 효소가 존재할 때, 형광 신호는 높았으며, 시간이 경과 함에 따라서도 증가하였다. 이는 곧, 억제 올리고뉴클레오티드가 Taq 중합 효소에 의해 치환되었으며, 그 결과 활성 MNA자임이 형성됨을 말해주는 것이다. 클레노우 중합 효소가 존재할 때의 형광 신호와 Taq 중합 효소가 존재하지 않을 때, 즉, "표적 비포함" 물 대조군에서의 형광 신호가 유사하였으므로, MNA자임의 조립은 표적 의존적임을 알 수 있었다. 이는, Taq 중합 효소 앱타머 서열이 Taq 중합 효소에 특이적이며, 클레노우 중합 효소와는 결합하지 않는다는 사실을 규명한 야키모비치(Yakimovich) 외 다수에 의한 관찰 결과와 일치하는 것이다. 이와 같은 MNA자임 실시예를 통해서, MNA자임이 앱타머와 커플링되어, 특이적인 단백질을 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 22: 절단형 파트자임과 안정화 인자 올리고뉴클레오티드를 사용하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 검출
MNA자임-매개 표적은 파트자임 센서 팔과 표적 서열의 왓슨-크릭 염기 인식을 통해 검출될 수 있다. 실시예 19에서는, 상보성 조건을 이용하여 파트자임 센서 팔과 표적 핵산 서열 사이의 단일 염기 미스 매치를 검출하였다. 이하의 실시예에서도 역시 상보성 조건을 이용하여, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출하였는데, 여기서는, 안정화 인자 올리고뉴클레오티드에 의해 안정화될 수 있는 절단형 센서 팔을 포함하는 파트자임을 사용하는 기법을 이용하였다. 본 실시예에 사용된 MNA자임 검출 기법을 도 23에 도시하였으며, 여기서 사용된 올리고뉴클레오티드는 이하에 기술한 바와 같다:
a) 표준적 파트자임;
b) SNP의 하나의 형태와는 완전히 매치되되, 다른 것과는 매치되지 않도록 디자인된 절단형 센서 팔(예를 들어, 5 염기)을 가지는 파트자임;
c) 파트자임의 절단형 센서 팔에 인접하여 존재하는 표적과 혼성화하는 안정화 인자 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 15 염기)[여기서, 안정화 인자는 5개의 뉴클레오티드 센서 팔이 표적에 혼성화될 때 MNA자임 조립을 촉진하도록 디자인됨]; 및
d) 리포터 프로브 기질.
22.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드 및 안정화 인자 올리고뉴클레오티드
본 실시예에서, 파트자임 B의 센서 팔은 5개의 뉴클레오티드만으로 이루어져, 표적 올리고뉴클레오티드 내에서 형성된 SNP를 구별하도록 디자인되었다. 파트자임 B의 센서 팔은 SNP의 "T"형에 혼성화하되, SNP의 "C"형에는 혼성화하지 않도록 디자인되었다. 상기 파트자임 A와 파트자임 B의 서열과 안정화 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 표시하였다(5'→3'). 이하 서열에서, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 활성 촉매 중심 부분의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산화되었음을 나타내는 것이다.
서열 번호 126: 파트자임 A4 XdA4/2-P:
ACTGGATGTCCATCTGTCTG ACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 127: 파트자임 B5 XdB5/2-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT TATAC -P
서열 번호 128: 안정화 인자 XdF/2-P:
CTTCGTGAGGGTGAG -P
22.2. 리포터 기질
본 실시예에서 사용된 리포터 기질은 SubBi-2였다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 520㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 490㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. SubBi-2-FB의 서열을 이하에 제시하였다(5'→3'); 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
22.3. 표적
본 실시예에 사용된 표적 분자는 Xd 유전자로부터 유래하는 합성 올리고뉴클레오티드였다. 표적 중 하나는 SNP의 "T"형에 상응하는 것이었으며(XdC/2(52)), 파트자임 B 센서 팔과는 완전히 매치되었다. 다른 표적은 SNP의 "C"형에 상응하는 것이었으며, 파트자임 B 센서 팔과는 미스 매치되었다. 합성 올리고뉴클레오티드는 시그마-프롤리고로부터 구입하였으며, 핵산 분해 효소를 포함하지 않는 물은 표적 대신에 "표적 비포함" 대조군으로서 사용되었다. 두 개의 표적 서열을 이하에 기술하였는데(5'→3'), 여기서 SNP에는 밑줄을 쳐서 표시하였다.
서열 번호 129: 표적 XdC/2(52):
TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGTATACAGACAGATGGACATCCAGTTGGTGA
서열 번호 130: 표적(미스 매치) XdC/2(1M52):
TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGCATACAGACAGATGGACATCCAGTTGGTGA
22.4. 반응 조건
촉매 활성 MNA자임에 의해 리포터 기질을 절단함으로써 발생되는 형광 신호의 증가 여부로써 표적을 검출하였다. 기질을 첨가하여 반응을 개시하였으며, 이때 모든 반응물의 총 부피는 50㎕였다. 55℃의 플루오스타 옵티마(FLUOstar OPTIMA; BMG Biotech) 상에서 반응을 수행하였다. 각 반응에 대한 형광도는 총 5분 동안 2초마다 판독하였다. 모든 반응물은 200nM XdA4/2-P, 200nM XdB5/2-P, 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystem) 및 25nM MgCl2를 포함하였다. 또한, 반응물은 표 24에 나열된 올리고뉴클레오티드를 포함하였다.
MNA자임 반응에 있어서 첨가된 시약
반응 표적 안정화 인자
A 200nM의 XdC/2(52) 200nM의 XdF/2-P
B 200nM의 XdC/2(1M52) 200nM의 XdF/2-P
C 200nM의 XdC/2(52) 안정화 인자 비포함
D 표적 비포함 200nM의 XdF/2-P
22.5. 결과: SubBi -2- FB 리포터 기질의 검출 및 절단
완전히 매치된 SNP 주형이 사용되었을 때, MNA자임은 시간이 경과함에 따라서 형광도를 증가시켰다(반응 A: 도 23). 이와는 반대로, 주형이 미스 매치되었을 때(SNP 함유), 형광 신호는 시간이 경과하여도 증가하지 않았다(반응 B: 도 23), 이와 유사하게, 표적 올리고뉴클레오티드가 존재하지 않을 때에는 형광도가 증가하지 않았다(반응 D: 도 23). 안정화 올리고뉴클레오티드는 MNA자임 복합체를 안정화하는데 필수적인 것으로 파악되었다. 모든 반응 성분들 예를 들어, 완전히 매치되는 표적을 포함하되, 안정화 인자 올리고뉴클레오티드는 포함하지 않는 반응물의 경우에는 시간이 경과함에 따라서 형광도가 증가하지 않았다(반응 C: 도 23). 그러므로, 센서 팔의 5개의 염기는 안정한 MNA자임 복합체를 형성하는데 불충분하였지만, 여기에 안정화 인자 올리고뉴클레오티드가 첨가되면 파트자임 센서 팔의 길이가 짧음으로써(5 염기) 발생하는 문제를 보상할 수 있었으며, 그 결과, 엄중한 온도 조건(본 실시예에서는 55℃) 하에서 안정한 MNA자임이 형성될 수 있었다. 상기 안정화 인자 올리고뉴클레오티드는 MNA자임을 안정하게 형성하는데 필요하므로, 이 올리고뉴클레오티드는 본 시스템에서 제3의 파트자임으로 간주될 수 있다.
본 실시예를 통해서는, MNA자임이 SNP 정도가 상이한 두 개의 표적들을 구별하는데 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 절단형 센서 팔을 가지는 파트자임을 사용함에 있어서, 안정화 인자 올리고뉴클레오티드와 함께 사용된다는 사실도 알 수 있다.
실시예 23: 리보뉴클레오티드 치환이 발생한 MNA 자임의 촉매 활성
리보자임과는 달리, DNA자임은 천연에서는 발견되지 않는다. DNA자임은 대형 올리고뉴클레오티드 라이브러리로부터 시험관 내에서 생성되는 것이다. 임의의 조건 하에서, 공지의 리보자임 내 임의의 데옥시리보뉴클레오티드를 임의의 리보뉴클레오티드로 치환하는 것이 시도되어 왔다[McCall외 다수, 1992]. RNA와 DNA의 형태상의 차이로 인하여, DNA로 완전히 전환된 리보자임은 활성을 가지지 않는다[Perreault외 다수, 1990]. 이 연구를 통해, 리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴로 치환하는 것만으로는, RNA 효소는 작동성 DNA 효소로 변형될 수 없음을 알 수 있다. 리보뉴클레오티드를 데옥시리보뉴클레오티드로 치환하는 것에 대하여 MNA자임이 관용하는지를 관찰하기 위한 실험을 수행하였다.
23.1. 파트자임 올리고뉴클레오티드
본 실시예에서, 촉매 중심 부분의 일부를 구성하는 부위 내에서, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드로 치환된 다양한 파트자임이 합성되었다. 하나의 리보뉴클레오티드 치환을 가지거나, 또는 리보뉴클레오티드로 치환된 촉매 중심 부분의 일부만을 가지는 파트자임이 합성되었다. 파트자임 올리고뉴클레오티드 A 및 B는 인간 RPLPO 유전자의 엑손 4 부위에 상보성인 센서 팔을 가졌다. 파트자임 올리고뉴클레오티드를 이하에 나열하였다(5'→3'). 이하 서열에서, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다. 아래의 염기들은 DNA 염기로 치환된 RNA 염기를 나타내는 것이다.
서열 번호 131: 파트자임 A(대조군) RO4A5(18)/2-P
GGGCTGGTCATCCAGCAG TACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 132: 파트자임 B(대조군) RO4B6(19)/2-P
TGCCCAGGGA GGCTAGC GTGTTCGACAATGGCAGCA-P
서열 번호 133: 파트자임 A(리보-14g): RO4A5(18)/2-rG14-P
GGGCTGGTCATCCAGCAG TACAACgA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 134: 파트자임 A(리보-9a): RO4A5(18)/2-rA9-P
GGGCTGGTCATCCAGCAG TaCAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 135: 파트자임 A(리보×8): RO4rA5(18)/2
GGGCTGGTCATCCAGCAG uacaacga GAGGAAACCTT
서열 번호 136: 파트자임 B(리보×7): RO4rB6(19)/2
TGCCCAGGGA ggcuagc GTGTTCGACAATGGCAGCA
23.2. 리포터 기질
본 실시예에 있어서 리포터 기질은 이하의 서열(5'→3')을 가지는 SubBi-2였다. 본 실시예에서, SubBi-2의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-2-FB라 명명하였다. SubBi-2-FB를 절단한 결과를 530㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 485㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 이하의 서열에서, 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 21: SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
23.3. 표적 서열
본 실험에서는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드를 표적 주형으로 사용하였다. 이 표적의 서열을 이하에 나타내었다(5'→3').
서열 번호 8: R04/1 표적:
GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC
23.4. 반응 조건
스마트사이클러 시스템 열 사이클 반응기(Cepheid)를 사용하여 다양한 파트자임 쌍의 촉매 활성을 분석하였다. 전체 반응물의 부피는 25㎕이었으며, 각각의 반응물은 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystems), 10mM MgCl2, 0.2μM의 SubBi-2-FB, 2μM의 RO4/1 표적과, 파트자임 A 및 파트자임 B 쌍(각각 2μM)을 포함하였다. 각각의 반응에 사용된 파트자임 쌍을 이하 표 24에 나타내었다.
[표 24]
다양한 반응에서 사용된 파트자임
반응물 파트자임 A 파트자임 B 복제 횟수
대조군 파트자임 A 및 B
(DNA만 포함)		 RO4A5(18)/2-P RO4B6(19)/2-P 4
파트자임 A(리보-9a) 및
대조군 파트자임 B		 RO4A5(18)/2-rA9-P RO4B6(19)/2-P 3
파트자임 A(리보-14g) 및
대조군 파트자임 B		 RO4A5(18)/2-rG14-P RO4B6(19)/2-P 3
파트자임 A(리보×8) 및
대조군 파트자임 B		 RO4rA5(18)/2 RO4B6(19)/2-P 3
대조군 파트자임 A 및
파트자임 B(리보×7)		 RO4A5(18)/2-P RO4rB6(19)/2 3
파트자임 A(리보×8) 및
파트자임 B(리보×7)		 RO4rA5(18)/2 RO4rB6(19)/2 3
반응물을 54℃에서 20분 동안 항온 처리한 다음, 12초 간격으로 형광 데이터를 수집하였다. 스마트사이클러 시스템 열 사이클 반응기 상 각각의 웰에서의 출발 형광도는 상이할 수 있으므로, 각 반응에 대한 각 시점에서의 형광도로부터 처음 형광도 수치를 공제하여, 상이한 웰 내 반응을 비교할 수 있도록 하였다.
23.5. 결과: 파트자임 촉매 중심 부분 서열 일부에 리보뉴클레오티드 치환이 발생한 MNA 자임의 촉매 활성
다양한 파트자임 쌍으로 이루어진 MNA자임에 의한 기질의 촉매 절단 결과를 관찰하였다[경시적 형광도 변화](표 25).
다양한 파트자임 조합을 사용하였을 때 얻어진 결과
반응물 결과
DNA만을 포함하는 대조군 반응
파트자임 A 및 B		 형광도가 신속하게 증가함;
항온 처리 후 5분 경과시 형광도는 일정해짐
파트자임 A(리보-9a) 및
대조군 파트자임 B		 형광도가 증가함; 항온 처리후 20분 경과시에도
형광도는 일정해지지 않음
파트자임 A(리보-14g) 및
대조군 파트자임 B		 형광도가 신속하게 증가함;
항온 처리 후 5분 경과시 형광도는 일정해짐
파트자임 A(리보×8) 및
대조군 파트자임 B		 시간이 경과하여도 형광도는 증가하지 않음
대조군 파트자임 A 및
파트자임 B(리보×7)		 시간이 경과하여도 형광도는 증가하지 않음
파트자임 A(리보×8) 및
파트자임 B(리보×7)		 시간이 경과하여도 형광도는 증가하지 않음
본 실험을 통해, 파트자임의 촉매 중심 부분의 일부에 몇몇 리보뉴클레오티드가 치환되면 활성 MNA자임이 형성됨을 알 수 있었다. 이와 같은 조건 하에서, 하나의 치환체(파트자임 A(리보 14g))는 모든 DNA 파트자임과 유사한 활성을 나타냈으며, 대안적인 단일 치환체(파트자임 A(리보9a))는 여전히 활성 MNA자임을 형성하면서, 대조군보다 느린 속도로 기질을 절단하였다. MNA자임은 파트자임 A 및/또는 파트자임 B의 촉매 중심 도메인 일부에 존재하는 모든 뉴클레오티드의 치환을 관용하지 않았다.
실시예 24: 신호 증폭 케스케이드를 개시하는 기작으로서, 고정된 파트자임 을 방출시킴으로 인한 MNA 자임의 활성화
24.1. MNA 자임 매개 신호 증폭 케스케이드
MNA자임은 신호 증폭 케스케이드를 개시하는데 사용될 수 있다. 이러한 신호 증폭 케스케이드에 대한 하나의 기법을 도 25에 도시하였다. 표적 존재 하에, 활성 MNA자임 1이 용액 중에 유리되어 존재하던 파트자임으로부터 형성되었다. MNA자임 1은 고정된 기질인 Sub1을 절단하여, MNA자임 2에 대한 파트자임 성분을 방출시킨다. 일단 유리되면, 이와 같은 파트자임들은 조립 촉진 인자와 혼성화하여, 기질 Sub2를 절단하는 MNA자임 2를 형성한다. 이중으로 표지된 Sub2(용액 중에 유리되어 있음)는 MNA자임 2에 의해 절단되며, 그 결과 형광 신호가 발생하게 된다. 뿐만 아니라, MNA자임 2는 고정된 Sub2 방출 파트자임(MNA자임 2와 동일한 팔을 가지며, 조립 촉진 인자와 혼성화될 때 MNA자임 3을 형성함)을 절단한다. (조립 촉진 인자는 고정될 수 있거나 용액 중에 유리되어 존재할 수 있다). MNA자임 3은 MNA자임 1과 동일한 기질 팔을 공유하므로, 이것은 또한 고정된 Sub1을 절단할 수 있으며, 이에 따라서 MNA자임 2에 대한 파트자임을 더욱 많이 방출하게 된다. 그 결과, 더욱 많은 양의 효소(MNA자임)에 대한 성분(파트자임)을 효소에 의해 발생시킴과 동시에, 신호도 증폭시키는 케스케이드가 진행된다.
24.2. 형광 표지된 기질을 절단할 수 있는 고정 MNA 자임의 활성화
본 실시예는 도 25에 도시된 바와 같은 신호 증폭 케스케이드의 제1 단계에 관하여 기술하고 있다. 이와 같은 개시 단계에 있어서, 표적은 용액 중에 유리되어 존재하는 파트자임과 결합하여, 활성 MNA자임 1을 형성한다. 이 MNA자임 1은 고정된 기질 Sub1을 절단하여, MNA자임 2에 대한 파트자임 성분을 방출시킨다. 일단 유리되면, 이 파트자임들은 조립 촉진 인자와 혼성화하여, MNA자임 2를 형성한다. 용액 중에 유리되어 존재하는, 이중으로 표지된 Sub2-FQ(본 실시예에서는 구체적으로 SubBi-3-FB)는 MNA자임 2에 의해 절단되며, 이때, 형광 신호가 발생한다.
24.3. 파트자임 올리고뉴클레오티드
이하 서열에서, 밑줄친 염기들은 조립된 MNA자임의 촉매 중심의 일부를 형성하는 염기를 나타내는 것이고, 굵은 글씨로 표시한 염기들은 표적과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이며, 이탤릭체로 표시한 염기들은 기질과 혼성화하는 염기를 나타내는 것이다. 이탤릭체로 표시하면서 밑줄쳐 표시한 염기들은 고정될 파트자임과 커플링되는 기질 서열을 나타내는 것이다. "-P"는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산화되었음을 나타내는 것이며, "(바이오틴)"은 올리고뉴클레오티드가 바이오틴화되었음을 나타내는 것이다. 아래 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위의 염기는 DNA를 나타내는 것이다. 이하에 나열된 모든 서열들은 5'→3' 방향으로 표시하였다.
용액 중에서 유리되어 존재하는 MNA자임 1 파트자임은 인간 RPLPO 유전자의 엑손 5에 특이적으로 결합하도록 디자인하였고, 고정된 MNA자임 2 파트자임은 조립 촉진 인자와 혼성화하도록 디자인하였다.
서열 번호 147: 파트자임 A4 RO5A4/2-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCT ACAACGA GAGGAAACCTT-P
서열 번호 148: 파트자임 B5 RO5B5/2-P:
TGCCCAGGGA GGCTAGCT GTGGAGACGGATTACACCTTC-P
서열 번호 138: 고정된 기질 1/파트자임 A4 RO4A4/3-5b:
(바이오틴)AAAAAA AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA GCTGGTCATCCAGCAG
ACAACGA GGTTGTGCTG
서열 번호 139: 고정된 기질 1/파트자임 B5 RO4B5/3-3b:
CGGTTGGTGA GGCTAGCT GTGTTCGACAATGGC AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA AAAAAA(바이오틴)
24.4. 리포터 기질
본 실시예의 리포터 기질(Sub2; 도 25)은 이하의 서열을 포함하는(5'→3') SubBi-3이다. 본 실시예에서, SubBi-3의 5' 말단에는 6-FAM 부분으로 표지하였으며, 3' 말단에는 BHQ1 부분으로 표지하여, 이를 SubBi-3-FB라 명명하였다. SubBi-3-FB를 절단한 결과를 516㎚(FAM 방사 파장)에서 관찰하였는데, 이때 492㎚(FAM 여기 파장)에서 여기시켰다. 밑에 있는 염기는 RNA를 나타내는 것이고, 위에 있는 염기는 DNA를 나타내는 것이다.
서열 번호 31: SubBi-3 -FB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
24.5. 합성 인자 및 촉진 인자 서열
이하 서열에서, "(바이오틴)"은 올리고뉴클레오티드가 바이오틴화되었음을 나타내는 것이다.
서열 번호 140: 조립 촉진 인자 RO4/2-3b:
GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC-(바이오틴)
서열 번호 141: RPLPO 5 합성 표적(RO5):
GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
24.6. 바이오틴화된 파트자임의 스트렙타비딘 -코팅된 미세 역가 평판에의 부착
실온 및 총 반응물 부피 100㎕에서 바이오틴화된 파트자임과 조립 인자를 부착시켰다. 결합 혼합물은 암레스코 PBS 용액(Amressco PBS solution)(Ca+ 및 Mg+ 비포함) 중 200nM의 파트자임 RO4A4/3-5b, 20OnM의 파트자임 RQ4B5/3-3b 그리고 20OnM의 조립 촉진 인자 RO4/2-3b을 포함하였다. 결합 혼합물(100㎕)을 스트렙타비딘으로 코팅된 미세 역가 평판(Roche Diagnostics)의 각 웰에 분취하여 넣었다. 결합 시간은 30분이었으며, 이후 PBS를 사용하여 3회 세척하고, 세척하기 전 15분씩 각 웰을 항온 처리하였다.
24.7. 고정된 MNA자임의 절단 및 절단된 형광 표지 기질의 검출
형광 표지된 기질인 SubBi-3-FB를 플루오스타 옵티마 형광계(FLUOstar OPTIMA fluorometer; BMG LabTech) 상에서, 등온 상태로(55℃) 4분 동안 관찰하였다(총 반응물 부피 = 100㎕). 반응물은 200nM의 파트자임 RO5A4/2-P, 200nM의 파트자임 RO5B5/2-P, 200nM의 기질 SubBi-3-FB, 25 mM MgCl2, 1×PCR 완충액 II(Applied Biosystems)와, 200nM의 합성 RO5 표적을 포함하였다. "표적 비포함" 대조군에 대한 합성 RO5 표적 대신에, 핵산 분해 효소를 포함하지 않는 물을 사용하였다. 여기에 기질 SubBi-3-FB를 첨가하여 반응을 개시하였다.
24.8. 결과: RO5 표적 존재시 형광도 수준의 변화 대 "표적 비포함" 대조군의 형광도 수준의 변화
표적을 포함하지 않는 반응물(물 대조군)과 비교하였을 때, RO5 표적 존재 하에서는 형광도가 증가한다. 4분 경과시 형광도 변화는, 표적이 존재할 경우 약 36,000 유닛이었는데, 이는 표적을 포함하지 않는 대조군이 1,000 유닛 미만인 것과 비교되는 결과이다. 이로써, MNA자임 1(파트자임 RO5A4/2-P 및 RO5B5/2-P로 이루어짐)이, 부착된 기질을 절단하여 MNA자임 2를 구성하는 파트자임을 방출하는 능력이 입증된다. 또한, 일단 방출되면, 파트자임은 기질을 절단하여 신호를 발생시킬 수 있는 조립 촉진 인자와 함께 활성 MNA자임 복합체를 형성할 수 있다는 점이 입증된다.
실시예 25: DNA 내 메틸화된 시토신과 시토신 사이의 직접적인 구별
절단형 센서 팔을 가지는 파트자임과 안정화 팔을 함께 사용하면, 표적 조립 촉진 인자에 존재하는 단일 뉴클레오티드의 다형성(SNP)을 검출하는 MNA자임의 능력을 입증할 수 있었다(실시예 22). 상기 실시예 22에 적용된 실험 조건 하에서, 5개의 염기로 이루어진 센서 팔이 SNP에 대한 프로브로서 사용되었는데, 이때의 온도는 예상 용융 온도보다 높은 55℃였다. 안정화 인자 팔을 가지는 시스템과, 절단형 센서 팔을 가지는 파트자임은 표적에 발생하는 미세한 변화에도 매우 민감하다. 이러한 검출 기법은 또한 특정 시토신 위치에서 일어나는 메틸화된 표적 또는 비메틸화 표적들을 직접적으로 구별할 수 있는 경우까지 확대 수행될 수 있는데, 이 경우, 예비적으로 바이설파이트 변형을 시킬 필요는 없다(실시예 11 참조).
5-메틸시토신(들)이 존재하면, DNA의 용융 온도는, 비메틸화 시토신(들)이 존재하는 경우에 비하여, 메틸화된 염기 당 1.3℃씩 상승한다. 그러므로, 예를 들어, 길이가 5 뉴클레오티드인 센서 팔을 가지는 파트자임은 동일한 서열을 가지되 비메틸화 표적에 결합할 수 있는 경우보다 약 4℃ 높은 온도에서, 3개의 5-메틸시토신을 포함하는 표적과 결합할 수 있었다.
파트자임, 안정화 인자 팔, 그리고 기질이 일정한 온도 즉, 메틸화된 표적 존재 하에 혼성화 및 MNA자임 형성에 적합하되, 비메틸화 표적이 존재할 때에는 MNA자임이 형성되기에 너무 높은 온도에서 항온처리될 때, 신호는 메틸화된 표적이 존재할 때에만 발생할 것이다.
이로써, 암과 기타 질병에 대한 마커로서 메틸화된 염기가 존재하는지 여부를 검출하는 방법을 제공할 수 있는 메틸화 패턴 분석의 신규 기법이 제공된다.
실시예 26: 표적에 반응하여 색 변이를 유도함에 있어서 MNA 자임의 사용
비색계 방식으로 MNA자임을 시용하는 기법을 도 24에 도시하였다. 이 연구법에서, MNA자임 기질은 가교 올리고뉴클레오티드에 통합될 것이다. 가교 올리고뉴클레오티드는 금 입자에 부착된 올리고뉴클레오티드와 상보성을 가진다. 만일 조립 촉진 인자가 존재하지 않으면, 가교 올리고뉴클레오티드는 원 상태로 남을 것이고, 금 입자는 응집하여 청색으로 변할 것이다. 만일 조립 촉진 인자 예를 들어, 표적 핵산이 존재하면, 활성 MNA자임은 용액 중에 존재하던 파트자임으로부터 조립하여, 이 기질을 절단할 것이다(이와 같아서, 가교 올리고뉴클레오티드라고 칭함). 이로써, 금 입자 응집체가 분산되어 색상이 청색에서 적색으로 바뀔 것이다.
이와 같은 MNA자임 기법은 몇몇 일반적인 성분들을 통합시키는 시스템을 제공하므로, 임의의 새로운 표적에 신속하게 적용할 수 있는 방법을 제공하게 된다. 이로써, 더욱 복잡한 분자를 필요로 하고 DNA자임과 금 입자를 사용하는 기타 시스템에 비하여 더욱 많은 이점을 제공한다. 이와 같은 MNA자임 기법에서, 올리고뉴클레오티드가 부착된 MNA자임 기질과 금 입자는, 일반적인 것일 수 있으며 또한 임의의 핵산 표적의 분석에 사용될 수 있을 것이다. 새로운 분석 시스템은 오로지 새로운 표적에 상보성인 센서 팔을 가지는 새로운 파트자임을 합성할 필요가 있을 것이다. 뿐만 아니라, 비색 반응은 핵산, 단백질 또는 기타 표적에 의한 활성화에 민감한 MNA자임 시스템과 함께 사용될 수도 있다.
참고 문헌
특허 및 특허 공보:
PCT 국제 특허 출원 공보 WO 99/45146
PCT 국제 특허 출원 공보 IB99/00848
PCT 국제 특허 출원 공보 WO 99/50452
PCT 국제 특허 출원 공보 WO 00/58505
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기타 참고 문헌:
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Synthetic <400> 84 caagactgga gacaaagtg 19 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic <400> 85 gcagagtttc ctctgtgata 20 <210> 86 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 86 ggttgtcgtc agctcgtgta caacgagagg aaacctt 37 <210> 87 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 87 tgcccaggga ggctagctcg tgagatgttg ggttaag 37 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Synthetic <400> 88 tggtgcatgg ttgtcgtc 18 <210> 89 <211> 17 <212> DNA <213> Synthetic <400> 89 ttgcgctcgt tgcggga 17 <210> 90 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 90 gaagaggcca ataaaggaga gacaacgaga ggcgtgat 38 <210> 91 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 91 ctgggaggaa ggctagctaa caccagcttg ttacacc 37 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Synthetic <400> 92 cagggtcatc cattccatgc ag 22 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic <400> 93 gctagtacca gttgagccag 20 <210> 94 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 94 gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt 37 <210> 95 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 95 gggctggtca tccagcagta caacaagagg aaacctt 37 <210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 96 gggctggtca tccagcagtt caacgagagg aaacctt 37 <210> 97 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 97 gggctggtca tccagcagta catcgagagg aaacctt 37 <210> 98 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <400> 98 gggctggtca tccagcagta ctacgagagg aaacctt 37 <210> 99 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <400> 99 tgcccaggga ggctagcgtg ttcgacaatg gcagca 36 <210> 100 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <400> 100 tgcccaggga ggctagagtg ttcgacaatg gcagca 36 <210> 101 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <400> 101 tgcccaggga ggccagcgtg ttcgacaatg gcagca 36 <210> 102 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <400> 102 atgctgccat tgtcgaacac ctgctggatg accagcccaa 40 <210> 103 <211> 59 <212> DNA <213> Synthetic <400> 103 aacgtacact gcacgcggtc gaaatagtga gtacctgggg gagtattgcg gaggaaggt 59 <210> 104 <211> 31 <212> DNA <213> Synthetic <400> 104 catctcttct ccgagcgtct gtaccgtgta c 31 <210> 105 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic <400> 105 gtacacggta cagaccgtgc agtgtacgtt 30 <210> 106 <211> 17 <212> DNA <213> Synthetic <400> 106 ccaggtactc actattt 17 <210> 107 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (41)..(41) <400> 107 caaacgagtc ctggccttgt cttacaacga gaggaaacct t 41 <210> 108 <211> 28 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (28)..(28) <400> 108 tgcccaggga ggctagcgtg gagacgga 28 <210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (28)..(28) <400> 109 tgcccaggga ggctagcgtc gagacgga 28 <210> 110 <211> 18 <212> DNA <213> Synthetic <400> 110 agcagccaca aaggcaga 18 <210> 111 <400> 111 000 <210> 112 <211> 34 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (34)..(34) <400> 112 tgcccaggga ggctagctgt ggagacggat taca 34 <210> 113 <400> 113 000 <210> 114 <211> 33 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (33)..(33) <400> 114 tgcccaggga ggctagcgtg gagacggatt aca 33 <210> 115 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 115 caaacgagtc ctggccttgt ctacgagagg aaacctt 37 <210> 116 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 116 tgcccaggga ggctagctac agtggagacg gattaca 37 <210> 117 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (39)..(39) <400> 117 caaacgagtc ctggccttgt ctcaacgaga ggaaacctt 39 <210> 118 <211> 35 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (35)..(35) <400> 118 tgcccaggga ggctagctag tggagacgga ttaca 35 <210> 119 <211> 42 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (42)..(42) <400> 119 caaacgagtc ctggccttgt ctctacaacg agaggaaacc tt 42 <210> 120 <211> 32 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (32)..(32) <400> 120 tgcccaggga ggctaggtgg agacggatta ca 32 <210> 121 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (43)..(43) <400> 121 caaacgagtc ctggccttgt ctgctacaac gagaggaaac ctt 43 <210> 122 <211> 31 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (31)..(31) <400> 122 tgcccaggga ggctagtgga gacggattac a 31 <210> 123 <211> 19 <212> DNA <213> Synthetic <400> 123 gctacccaac tgttgcatc 19 <210> 124 <211> 78 <212> DNA <213> Synthetic <400> 124 aacgtacact gcacgcggtc gaaatagtga gtgcggtcgg ctcggggcat tcttagcgtt 60 ttgccccgag ccgaccgc 78 <210> 125 <211> 28 <212> DNA <213> Synthetic <400> 125 tgccccgagc cgaccgaact cactattt 28 <210> 126 <211> 38 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (38)..(38) <400> 126 actggatgtc catctgtctg acaacgagag gaaacctt 38 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (23)..(23) <400> 127 tgcccaggga ggctagctta tac 23 <210> 128 <211> 15 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (15)..(15) <400> 128 cttcgtgagg gtgag 15 <210> 129 <211> 52 <212> DNA <213> Synthetic <400> 129 tgccccctca ccctcacgaa ggtatacaga cagatggaca tccagttggt ga 52 <210> 130 <211> 52 <212> DNA <213> Synthetic <400> 130 tgccccctca ccctcacgaa ggcatacaga cagatggaca tccagttggt ga 52 <210> 131 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 131 gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt 37 <210> 132 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (36)..(36) <400> 132 tgcccaggga ggctagcgtg ttcgacaatg gcagca 36 <210> 133 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (25)..(25) <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 133 gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt 37 <210> 134 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (20)..(20) <220> <221> Phosphorylation <222> (37)..(37) <400> 134 gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt 37 <210> 135 <211> 37 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (19)..(26) <400> 135 gggctggtca tccagcagua caacgagagg aaacctt 37 <210> 136 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (11)..(17) <400> 136 tgcccaggga ggcuagcgtg ttcgacaatg gcagca 36 <210> 137 <400> 137 000 <210> 138 <211> 61 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Biotin <222> (1)..(1) <220> <221> RNA <222> (18)..(19) <400> 138 aaaaaaaagg tttcctcguc cctgggcagc tggtcatcca gcagacaacg aggttgtgct g 61 <210> 139 <211> 61 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (45)..(46) <220> <221> Biotin <222> (61)..(61) <400> 139 cggttggtga ggctagctgt gttcgacaat ggcaaggttt cctcguccct gggcaaaaaa a 61 <210> 140 <211> 31 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Biotin <222> (31)..(31) <400> 140 gccattgtcg aacacctgct ggatgaccag c 31 <210> 141 <211> 43 <212> DNA <213> Synthetic <400> 141 gaaggtgtaa tccgtctcca cagacaaggc caggactcgt ttg 43 <210> 142 <211> 28 <212> DNA <213> Synthetic <400> 142 tgagctacag tcggtcgaaa tagtgagt 28 <210> 143 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic <400> 143 catctcttct ccgagcgctt catctca 27 <210> 144 <211> 42 <212> DNA <213> Synthetic <400> 144 ggcactaacg tgcctgagct acagtcggtc gaaatagtga gt 42 <210> 145 <211> 41 <212> DNA <213> Synthetic <400> 145 catctcttct ccgagcgctt catctcacga cgataacgtc g 41 <210> 146 <211> 22 <212> DNA <213> Synthetic <400> 146 tgagatgaag cactgtagct ca 22 <210> 147 <211> 40 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (40)..(40) <400> 147 caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag aggaaacctt 40 <210> 148 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> Phosphorylation <222> (39)..(39) <400> 148 tgcccaggga ggctagctgt ggagacggat tacaccttc 39 <210> 149 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (2)..(2) <400> 149 tacaacga 8 <210> 150 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <400> 150 cggtcgaa 8 <210> 151 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic <400> 151 acaacga 7 <210> 152 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <400> 152 tacaacga 8 <210> 153 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <220> <221> RNA <222> (7)..(7) <400> 153 tacaacga 8 <210> 154 <400> 154 000 <210> 155 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <400> 155 tacaacaa 8 <210> 156 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <400> 156 ttcaacga 8 <210> 157 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <400> 157 tacatcga 8 <210> 158 <400> 158 000 <210> 159 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <400> 159 tactacga 8 <210> 160 <400> 160 000 <210> 161 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic <400> 161 caacga 6 <210> 162 <400> 162 000 <210> 163 <400> 163 000 <210> 164 <400> 164 000 <210> 165 <400> 165 000 <210> 166 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic <400> 166 ccgagc 6 <210> 167 <211> 8 <212> DNA <213> Synthetic <400> 167 ggctagct 8 <210> 168 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic <400> 168 ggctagc 7 <210> 169 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic <400> 169 ggctaga 7 <210> 170 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic <400> 170 ggccagc 7 <210> 171 <400> 171 000 <210> 172 <211> 9 <212> DNA <213> Synthetic <400> 172 ggctagcta 9

Claims (146)

  1. 적어도 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하는 조성물로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 MNA자임(MNAzyme) 조립 촉진 인자(assembly faciliator) 존재 하에 자체 조립되어, 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하며, 상기 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 각각 기질 팔 부분, 촉매 중심 부분 및 센서 팔 부분을 포함하고;
    이들 성분이 자체 조립되면, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 센서 팔 부분은 MNA자임의 센서 팔로서 작용하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 팔 부분은 MNA자임의 기질 팔로서 작용하며, 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 MNA자임의 촉매 중심으로서 작용하고;
    상기 MNA자임의 센서 팔은 상기 MNA자임 조립 촉진 인자와 상호 작용하여, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분을, 상기 성분 각각의 촉매 중심 부분이 회합하여 하나 이상의 기질을 변형시킬 수 있는 MNA자임의 촉매 중심을 형성하도록 근접하게 유지하며, 상기 MNA자임의 상기 기질 팔은 기질과 계합하여 상기 MNA자임의 촉매 중심이 상기 기질을 변형시킬 수 있도록 하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조립 촉진 인자가 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 표적인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 표적이 핵산인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 기질 팔 부분 또는 센서 팔 부분 중 하나 이상을 안정화시키는 작용을 하는 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 센서 팔 중 하나 이상이 2 이상의 분자로 이루어지는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 서열 번호 149∼153, 서열 번호 155∼157, 서열 번호 159 및 서열 번호 161을 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 서열 번호 166∼170 및 서열 번호 172를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 성분 또는 조립 촉진 인자 또는 기질 또는 이들의 조합 중 하나 이상이 하나 이상의 앱타머(aptamer) 또는 이의 일부분을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 앱타머 또는 이의 일부분은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 이들의 조합 중 하나 이상으로 이루어지는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 MNA자임의 자체 조립의 하나 이상의 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조립 촉진 인자가 핵산 또는 단백질인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 성분, 조립 촉진 인자, 기질 또는 억제제 중 하나 이상이 불용성 지지체에 부착되어 있는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처(quencher) 부분을 포함하며, 상기 기질이 상기 MNA자임에 의해 변형되면, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공되는 검출 가능 효과(detectable effect)가 증가 또는 감소되는 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 MNA자임에 의한 상기 기질의 변형은 검출 가능 효과를 제공하는 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 조성물은 하나 이상의 추가의 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어 하나 이상의 추가의 촉매 활성 MNA자임을 형성하는, 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 추가로 포함하며, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분은 각각 기질 팔 부분, 촉매 중심 부분 및 센서 팔 부분을 포함하고;
    적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분이 자체 조립되면, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분의 센서 팔 부분은 상기 하나 이상의 추가의 촉매 활성 MNA자임의 센서 팔을 형성하고, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 팔 부분은 상기 하나 이상의 추가의 촉매 활성 MNA자임의 기질 팔을 형성하며, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 상기 하나 이상의 추가의 촉매 활성 MNA자임의 촉매 중심을 형성하고;
    상기 하나 이상의 추가의 MNA자임의 센서 팔은 상기 하나 이상의 추가의 조립 촉진 인자와 상호 작용하여, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분과 상기 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분을, 상기 성분 각각의 촉매 중심 부분이 회합하여 하나 이상의 추가의 기질에 작용할 수 있는 상기 하나 이상의 추가의 MNA자임의 촉매 중심을 형성하도록 근접하게 유지하며, 상기 하나 이상의 추가의 MNA자임의 기질 팔은 하나 이상의 추가의 기질과 계합하여 상기 하나 이상의 추가의 MNA자임의 촉매 중심이 상기 하나 이상의 추가의 기질에 작용할 수 있도록 하는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추가의 기질은 각각 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합인 조성물.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 성분, 상기 조립 촉진 인자, 상기 기질 또는 억제제 중 하나 이상은 DNA, RNA, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 펩티드-핵산 키메라, 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  17. 하나 이상의 조립 촉진 인자의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 적어도 제1 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 적어도 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는 것인 단계;
    (b) 상기 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 적어도 제1 기질을 제공하는 단계로서, 상기 MNA자임에 의한 상기 기질의 변형은 검출 가능 효과를 제공하는 것인 단계;
    (c) 하기 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분과 상기 적어도 제1 조립 촉진 인자를 함유하는 것으로 추정되는 시료를 접촉시키는 단계:
    (1) 상기 적어도 제1 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건, 및
    (2) 상기 적어도 제1 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
    (d) 상기 검출 가능 효과를 검출함으로써, 상기 하나 이상의 조립 촉진 인자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 방법은 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 제4 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 적어도 제3 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제4 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 추가의 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 하나 이상의 추가의 촉매 활성 MNA자임을 형성할 수 있으며,
    하나 이상의 추가의 기질은 시료 중에 존재하고, 상기 추가의 기질은 추가의 MNA자임에 의해서만 변형될 수 있으며, 상기 변형은 추가의 검출 가능 효과를 제공하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 상기 기질은, 각각의 MNA자임에 의해 이 기질이 변형될 때 검출 가능 효과가 나타나도록 하나 이상의 불용성 지지체에 부착되는 것인 방법.
  20. 하나 이상의 표적의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (a) 기질과 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 적어도 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 상기 표적 존재 하에 자체 조립되어, 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성할 수 있으며; 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상은 하나 이상의 앱타머 부분을 추가로 포함하는 것인 단계;
    (b) 하기 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 올리고뉴클레오티드 성분과 하나 이상의 표적을 함유하는 것으로 추정되는 시료를 접촉시키는 단계:
    (1) 상기 표적이 상기 하나 이상의 앱타머 부분에 결합할 수 있는 조건, 및
    (2) 상기 MNA자임에 의해 상기 기질이 촉매적으로 변형될 수 있는 조건; 및
    (c) 상기 MNA자임에 의한 촉매적 변형의 존재를 판정하는 단계로서, 상기 촉매적 변형의 존재는 상기 표적의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  21. 하나 이상의 표적의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (a) 적어도 기질, 적어도 제1 조립 촉진 인자 및 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 상기 제1 조립 촉진 인자 및 상기 표적 존재 하에 자체 조립되어, 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성할 수 있고;
    상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드 성분 또는 상기 제1 조립 촉진 인자 또는 상기 기질 중 하나 이상은 앱타머 또는 이의 일부분을 추가로 포함하고, 상기 표적은 상기 앱타머 또는 이의 일부분의 적어도 일부분에 결합할 수 있으며;
    상기 기질은 상기 적어도 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있고;
    상기 MNA자임에 의한 상기 기질의 변형은 검출 가능 효과를 제공하는 것인 단계;
    (b) 상기 표적 부재 하에 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립의 억제할 수 있는 적어도 제1 억제제를 제공하는 단계;
    (c) 하기 조건 (1)∼(3) 하에서, 상기 표적을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 상기 올리고뉴클레오티드 성분, 상기 조립 촉진 인자, 상기 기질 및 상기 억제제를 접촉시키는 단계:
    (1) 상기 표적이 상기 앱타머 또는 이의 일부분에 결합할 수 있는 조건,
    (2) 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립의 억제를 해소하는 조건, 및
    (3) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
    (d) 상기 검출 가능 효과의 존재를 판정함으로써, 상기 표적의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 성분, 조립 촉진 인자, 앱타머 또는 앱타머의 일부분 중 하나 이상은 상기 억제제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 촉매 활성 MNA자임의 자체 조립의 억제는, 상기 앱타머 또는 앱타머의 일부분이 상기 표적과 접촉하게 되면 해소되는 것인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 억제제는 상기 앱타머 또는 이의 일부분 중 하나 이상에 결합할 수 있는 것인 방법.
  25. 제17항에 있어서, 상기 검출 가능 효과는 정량적 또는 정성적으로 측정되는 것인 방법.
  26. 하나 이상의 핵산 서열 변이체의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 핵산의 서열 변이체 존재 하에 자체 조립되어 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는 것인 단계;
    (b) 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 하나 이상의 기질을 제공하는 단계로서, 상기 MNA자임에 의한 상기 기질의 변형은 검출 가능 효과를 제공하는 것인 단계;
    (c) 하기 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 서열 변이체를 포함하는 것으로 추정되는 시료와 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계:
    (1) 상기 촉매 활성 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건, 및
    (2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
    (d) 상기 검출 가능 효과의 존재를 판정함으로써, 상기 하나 이상의 서열 변이체의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 서열 변이체는 단일 염기 다형, 다중 염기 다형, 삽입, 결실, 중복, 전위, 프레임쉬프트 서열 변이체, 넌센스 서열 변이체 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 MNA자임의 1 이상의 센서 팔은 2 이상의 분자로 이루어지는 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 서열 변이체를 포함하는 시료는 바이설파이트 변형 메틸화 또는 비메틸화 DNA, 바이설파이트 변형 메틸화 또는 비메틸화 RNA, 바이설파이트 변형 메틸화 또는 비메틸화 DNA의 하나 이상의 앰플리콘, 바이설파이트 변형 메틸화 또는 비메틸화 RNA의 하나 이상의 앰플리콘 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 핵산의 서열 변이체의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (a) 핵산 존재 하에 자체 조립되어, 적어도 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성할 수 있는, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계;
    (b) 상기 적어도 제1 MNA자임에 의해 변형 가능한 적어도 제1 기질 존재 하에, 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계로서, 상기 기질은 하기 조건 (1) 및 (2) 하에서, 이 기질이 상기 적어도 제1 MNA자임에 의해 변형될 때 적어도 제1 검출 가능 효과를 제공할 수 있는 검출 가능 부분을 포함하는 것인 단계:
    (1) MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건, 및
    (2) MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
    (c) 촉매 활성의 부재는 상기 핵산 내의 서열 변이체의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  31. 하나 이상의 메틸화된 핵산의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (a) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 메틸화된 핵산 존재 하에 자체 조립되어, 하나 이상의 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는 것인 단계;
    (b) 제1 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 적어도 제1 기질을 제공하는 단계로서, 상기 MNA자임에 의한 기질의 변형은 적어도 제1 검출 가능 효과를 제공하는 것인 단계;
    (c) 하기 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 메틸화된 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계:
    (1) 상기 촉매 활성 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건, 및
    (2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
    (d) 하나 이상의 검출 가능 효과의 존재를 판정함으로써, 상기 하나 이상의 메틸화된 핵산의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 조건은 상기 MNA자임과 상기 메틸화된 핵산과의 혼성화는 촉진하되, 비메틸화 핵산과의 혼성화는 촉진하지 않는 온도를 추가로 포함하는 것인 방법.
  33. 제17항 내지 제19항 또는 제21항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 가능 효과 증폭 케스케이드를 이용함으로써 검출 가능 효과를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제17항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기질은 검출 가능 부분과 켄처(quencher) 부분을 포함하며, 상기 기질이 상기 MNA자임에 의해 변형되면, 상기 검출 가능 부분에 의해 제공되는 검출 가능 효과가 증가 또는 감소되는 것인 방법.
  35. 제17항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변형은 절단, 결찰, 포피린 금속화, 탄소-탄소 결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합 형성을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 증폭 케스케이드를 이용하여 하나 이상의 조립 촉진 인자를 검출하는 방법으로서,
    (a) 적어도 제1 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어 적어도 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계;
    (b) 상기 MNA자임에 의해 변형될 수 있는 적어도 제1 기질이 부착되어 있는 불용성 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 제1 기질은 상기 제1 MNA자임에 의해 상기 제1 기질이 변형될 때 방출되는, 적어도 제1 촉매 활성 효소를 포함하는 적어도 제3 분자를 포함하는 것인 단계;
    (c) 하기 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 제1 기질이 부착되어 있는 상기 불용성 지지체 존재 하에, 상기 조립 촉진 인자를 함유하는 것으로 추정되는 시료와 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계:
    (1) 상기 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건, 및
    (2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건; 및
    (d) 적어도 제2 기질이 부착되어 있는 불용성 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 제2 기질은 상기 제1 촉매 활성 효소에 의해 절단될 수 있고, 상기 제2 기질은 상기 제1 효소에 의해 상기 제2 기질이 변형될 때 방출되는 적어도 검출 가능 부분을 포함하는, 적어도 제4 분자를 포함하는 것인 단계
    를 포함하며;
    (e) 상기 제1 촉매 활성 효소는 다수의 상기 제2 기질을 변형시켜, 다수의 검출 가능 부분을 방출하고;
    (f) 상기 제1 촉매 활성 효소에 의해 상기 제2 기질이 변형된 후, 상기 검출 가능 부분을 검출할 수 있으며;
    (g) 상기 검출 가능 부분의 검출은 상기 조립 촉진 인자의 존재를 나타내는 것인 방법.
  37. 증폭 케스케이드를 이용하여 하나 이상의 조립 촉진 인자를 검출하는 방법으로서,
    (a) 적어도 제1 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어 적어도 제1 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하는, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 적어도 제2 올리고뉴클레오티드 성분을 포함하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 제공하는 단계;
    (b) 적어도 제1 기질이 부착되어 있는 불용성 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 제1 기질은 상기 MNA자임에 의해 변형될 수 있고, 상기 제1 기질은 상기 제1 MNA자임에 의해 상기 제1 기질이 변형될 때 방출되는 적어도 제1 촉매 활성 효소를 포함하는 적어도 제3 분자를 포함하는 것인 단계; 및
    (c) 하기 조건 (1) 및 (2) 하에서, 상기 제1 기질이 부착되어 있는 불용성 지지체 존재 하에, 상기 조립 촉진 인자를 함유하는 것으로 추정되는 시료와 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 접촉시키는 단계:
    (1) 상기 MNA자임이 자체 조립될 수 있는 조건, 및
    (2) 상기 MNA자임이 촉매 활성을 나타낼 수 있는 조건
    를 포함하며;
    상기 MNA자임의 촉매 활성이 상기 하나 이상의 조립 촉진 인자의 존재를 나타내는 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 검출 가능 부분이, 상기 제1 기질을 변형시킴으로써 추가의 촉매 활성 효소를 방출시킬 수 있는, 추가의 제2 촉매 활성 효소를 추가로 포함하는 것인 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 촉매 활성 효소 또는 제2 촉매 활성 효소 중 하나 이상이 MNA자임, DNA자임, 리보자임, 가수분해 효소, 제한 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 프로테아제, 프로테이나제, 하이드롤라제, 라이티카제, 펩티다제, 디펩티다제, 에스터라제, 카스파제, 카텝신, 탈황화수소 효소, 아미다제 및 글리코시다제를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  40. 제20항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적이 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 것인 방법.
  41. 제20항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적이 핵산, 단백질, 당단백질, 지질, 지단백질, 세포, 바이러스, 박테리아, 고세균, 진균, 항체, 대사 산물, 병원체, 독소, 오염 물질, 독, 소분자, 중합체, 금속 이온, 금속염, 프리온, 핵산 또는 이들의 임의의 일부분 또는 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제26항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 서열 변이체를 포함하는 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 각각 하나 이상의 조립 촉진 인자를 인식하고 기질을 변형시키는, 다수의 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 제조하는 방법으로서,
    (a) 동정, 검출 또는 정량하고자 하는 다수의 조립 촉진 인자를 제공하는 단계;
    (b) 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 디자인하는 단계로서, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 조립 촉진 인자 존재 하에 자체 조립되어, 촉매 활성 다성분 핵산 효소(MNA자임)를 형성하고, 적어도 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분은 각각 기질 팔 부분, 촉매 중심 부분 및 센서 팔 부분을 포함하며;
    이들 성분이 자체 조립되면, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 센서 팔 부분은 MNA자임의 센서 팔을 형성하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 팔 부분은 상기 MNA자임의 기질 팔을 형성하며, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 촉매 중심 부분은 MNA자임의 촉매 중심을 형성하고;
    상기 MNA자임의 센서 팔은 조립 촉진 인자와 상호 작용하여, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분과 제2 올리고뉴클레오티드 성분을, 상기 성분 각각의 촉매 중심 부분이 회합하여 하나 이상의 기질에 작용할 수 있는 상기 MNA자임의 촉매 중심을 형성하도록 근접하게 유지하고, 상기 MNA자임의 기질 팔은 기질과 계합하여 MNA자임의 촉매 중심이 상기 기질을 변형시킬 수 있도록 하는 것인 단계;
    (c) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 기질 팔 부분과 촉매 중심 부분은 불변 상태로 두고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 성분 및 제2 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상의 센서 팔 부분은 다른 다수의 조립 촉진 인자를 인식하는 것에 적합하도록 상기 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 성분을 변형시키는 단계; 및
    (d) 다수의 조립 촉진 인자 각각에 대하여 상기 변형 단계를 반복하는 단계
    를 포함하는 방법.
  44. 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 상기 올리고뉴클레오티드를 다성분 핵산 효소(MNA자임) 기질로서 사용하는 것을 포함하고, 상기 MNA자임의 기질 팔은 상기 MNA자임 기질과 계합하여 상기 MNA자임 기질을 변형시키는 것인 방법.
  45. DNA자임으로부터의 부분 서열이 도입된 MNA자임의 제조 방법으로서,
    (a) 상기 DNA자임 서열 내의, 부분 촉매 중심 서열로 분할하기 위한 위치를 선택하는 단계;
    (b) 상기 부분 촉매 중심 서열을 파트자임으로 도입하는 단계; 및
    (c) 상기 파트자임 내의 상기 부분 촉매 중심 서열의 어느 조합이 활성 MNA자임을 형성하는지를 판정하기 위해 상기 파트자임 쌍의 촉매 활성을 검출하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  46. MNA자임 기질을 포함하는, 표적 물질을 검출, 동정 또는 정량하기 위한 조성물로서, 상기 기질이 제1항 내지 제13항 또는 제17항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 기재된 MNA자임의 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 성분의 적어도 일부에 완전히 또는 부분적으로 상보성인 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 기질이 보편적 기질인 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 상기 기질이 서열 번호 79, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62 또는 서열 번호 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 조성물.
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